WO1995011966A1 - Preparation de proteine c humaine activee et son procede de production - Google Patents

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Yoichi Ogata
Toshinobu Nouchi
Shinji Nakahira
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Definitions

  • the present invention relates to humans with high specific activity, derived from plasma or produced by genetic recombination techniques, and produced through the step of activating human unactivated protein C with thrombin or equivalent protease. For activated protein C preparations. Furthermore, the present invention relates to a method for activating human protein C and a method for purifying human activated protein C with high purity.
  • Protein C (hereinafter abbreviated as PC) is one of the vitamin K-dependent proteins synthesized in the liver, and is composed of L chain (molecular weight 21,000) and H chain (molecular weight 41,000). ) Is a zymogen having a molecular weight of 62,000 consisting of two chains. In vivo, protein C undergoes limited degradation by thrombin-to-mouthlet thrombomodulin complex in which thrombin binds to thrombomodulin on the vascular endothelial cell membrane, releasing 12 peptides from the amino terminus of the H chain to activate protein C (A cti V ated Protein C: hereinafter abbreviated as APC).
  • APC cti V ated Protein C
  • APC is a type of serine protease that exerts anticoagulant activity by specifically degrading and inactivating blood coagulation factors V and VIII (primarily active Va and Villa). Is expected to be developed as a pharmaceutical because it has the function of promoting the release of plasminogen and activator from
  • the APCs themselves which are the subject of the present invention, are well known in the art.
  • Protein C derived from plasma or prepared by genetic engineering techniques can be converted into thrombin or thrombin-thrombomodulin complex in Vit. Activated by ro (Blood Blood, p. 115-121 (1984), Journal Noleob Clinical Investigation, J. Clin. Invest., 64, p. 76, 769 (1979), Journal Clinical Investigation J. Clin. Invest., 79, p. 918-925 (1987)) or those obtained by direct expression as APC by genetic recombination technology are known. (Japanese Unexamined Patent Publication No. Sho 61-205584, JP-A-Heisei 1-2338, JP-A-Heisei 1-85084). .
  • Activation methods for protein C include trypsin, RVV-X, thrombin, and thrombin-thrombomodulin.
  • An activation method using an immobilized gel is known (Journal of Biological Chemistry, J. Biol. Chem., 251, 3052-3056 (1976), Biochemistry, Biochemistry, 1 ⁇ , 4893-4900). (1976), Biochemistry,, 5824-5831 (1977), Journal of Clinical Investigation J. Clin. Invest., 64, 761--769 (1977), Noku Biochemical Biophysical Research Communication Biochems Biophys. Res. Commun., 94, 340-347 (1980). Journal of Clinical Investigation J. Clin. Invest., 77, 416-425 (1986). The above methods are not satisfactory in industrial mass production. In order to activate a large amount of protein c, it is preferable to treat a high concentration of protein c with a small amount of an activator, but this has not been satisfied.
  • the present invention has been devised to solve the above-mentioned problems, and as a result of intensive studies by the present inventors, activation of protein C at a high concentration enables efficient activation with a small amount of tombin.
  • Contacting the activated protein C-containing solution after activation with a cation exchanger, once adsorbing activated protein C with thrombin or an equivalent protease, to obtain a suitable salt concentration It is even more surprising that the method of eluting only activated protein C under conditions results in a human activated protein C preparation substantially free of thrombin or equivalent proteinase and Z or unactivated protein C.
  • an object of the present invention is to provide a human activated protein c preparation which exhibits high specific activity and substantially does not contain thrombin or equivalent protease and / or inactivated protein C, and a method for producing the same. I do.
  • FIG. 1 SDS-PAGE results of the preparation of the present invention and the conventional preparation.
  • the human activated protein C preparation of the present invention has an activity unit based on a unit defined as an amount that doubles the activated thromboplastin time (APTT) of normal human plasma by 3500 units / "mg. It shows a higher specific activity and is substantially free of thrombin or equivalent protease and / or unactivated protein C.
  • APTT activated thromboplastin time
  • the preparation after activation with thrombin or equivalent protease A solution containing human activated protein C is brought into contact with a cation exchanger at a pH of 5.0 to 6.0 and a NaC 1 concentration of 80 mM or less to adsorb thrombin and activated protein C, and a salt concentration of 0.1 to 0.35 M
  • a cation exchanger at a pH of 5.0 to 6.0 and a NaC 1 concentration of 80 mM or less to adsorb thrombin and activated protein C, and a salt concentration of 0.1 to 0.35 M
  • thrombin When activating protein C with thrombin or an equivalent protease, thrombin was converted to thrombin Z protein C 1-20 (U / mg) in a solution containing protein C with a protein C concentration of 0.5 to 8.0 mg / ml. Activate a large amount of protein C efficiently by adding at a ratio and activating at pH 6.0-8.0 be able to. Furthermore, in the step of removing the activator following this step and purifying the APC, the activated APC-containing solution is brought into contact with a cation exchanger at a pH of 5.0 to 6.0 and a NaCl concentration of 8 OmM or less. Then, thrombin and APC are adsorbed, and then only activated protein C is eluted under the condition of a salt concentration of 0.1 to 0.35M.
  • protein C can be efficiently activated with a small amount of tombin by activating protein C at a high concentration. This has the advantage of reducing protein C degradation during activation and facilitating subsequent thrombin removal.
  • the thrombin concentration in the eluate can be reduced to 0.001 unit or less, and APC can be quantitatively recovered.
  • concentrated APC can be obtained.
  • the APC preparation recovered by the method of the present invention has a much higher specific activity than the preparation obtained by the conventional method.
  • the specific activity of the human activated protein C preparation means the ratio of mg of APC active protein, and one unit of APC activity means the activated thromboplastin time (APTT) of normal human plasma. Is defined as the amount to extend twice. Therefore, the actual measurement of APC activity is to add the diluted sample to normal human plasma, measure the APTT (seconds), and determine the dilution factor when the value is twice that of the control. Value.
  • origin of APC which is the main component of the preparation of the present invention
  • protein C which is the starting material of the production method of the present invention
  • the activation step in the above-described step of the present invention proceeds in the following procedure.
  • the reaction solution treated in the above activation step is subjected to pH adjustment and salt concentration adjustment as required, and then subjected to a positive ion exchanger treatment to purify APC.
  • This cation exchanger treatment removes thrombin and further removes contaminating proteins such as unactivated protein C.
  • any insoluble carrier having a cation exchange group for example, a sulfo group or a carboxyl group
  • a cation exchanger commonly used in the art can be used.
  • Cation exchangers for example, S-Sepharose (trade name), SP-Sephadex (trade name) (all manufactured by Pharmacia), SP-Toyopearl (trade name), D3 gel 3 P-5 PW ( Examples thereof include cation exchange resins such as (trade name) (both manufactured by Tosoh Corporation), and SP-Sephadex and SP-Toyopearl are preferred embodiments.
  • This method can be performed by either the column method or the batch method, but it is preferable to use the column method from the viewpoint of the efficiency of removing contaminating proteins.
  • the activation reaction solution is brought into contact with a cation exchanger to adsorb thrombin and APC, and only activated protein C is eluted under a salt concentration of 0.1 to 0.35 M.
  • the APC preparation prepared by such a purification method is substantially free of contaminating proteins such as thrombin or equivalent protease and / or inactivated protein C, and has a specific activity related to APC activity of 3500 single-position Zmg or more. And extremely high.
  • the inventors of the present invention repeated a series of steps for preparing APC having a desired high specific activity from the protein C fraction, and as a result of studying to make up for the disadvantages of the conventional method, there were several useful improvement methods. To further enhance the effects of the present invention. I got it.
  • Protein C was purified by adsorption and precipitation with barium citrate, ammonium sulfate fractionation, and protein C purified by DEAE-Sephadex column chromatography, followed by polyacrylamide gel electrophoresis, dextran sulfate agarose chromatography, and And a method using a gel on which an antibody against protein C is immobilized (Journal of Biological Chemistry J. Biol. Chem., 251, 355-). 363 (1976), Journal of Clinical Investigation, J. Clin. Invest, 64, 761-769 (1979). Blood, 54, 1272- (1979) ⁇ FEBS LETTERS, 191, 75-81 (1985). Journal of Biological Chemistry J. Biol.
  • the present invention it has been found that by eluting protein C using a citrate buffer instead of ED ⁇ which is a strong chelating agent, it is possible to reduce the antibody against protein C which is eliminated from the gel. Further, the obtained protein C-containing solution was adsorbed to an anion exchanger under the condition of pH 7.0 to 9.0, and after removing a slight amount of antibody to protein C, the salt concentration was 0.3. Most protein C antibodies can be removed by eluting protein C under the conditions of ⁇ 1.0 M.
  • the present invention provides an industrial scale A method for preparing improved activated protein c is provided.
  • a solution containing human protein C is adsorbed to an anion exchanger, and then eluted to prepare a human protein C fraction having a G1a domain.
  • a solution containing human protein C is adsorbed to an adsorbent bound to an insoluble carrier with an antibody specifically recognizing protein C bound to calcium ions in the presence of calcium, and a citrate buffer And dissolve the protein C using
  • thrombin When activating human protein C using thrombin or an equivalent protease, thrombin was added to a solution containing human protein C under the conditions of pH 6.0 to 8.0. 1 to 2 O CUZmg) to activate human protein C.
  • the activated human protein C-containing solution after activation is brought into contact with a cation exchanger under conditions of pH 5.0 to 6.0 and a salt concentration of 8 OmM or less to convert thrombin and activated protein C.
  • Adsorb then elute and collect only human activated protein C under the conditions of salt concentration of 0.1-0.35M.
  • a virus derived from the raw material eg, hepatitis virus, HIV, etc.
  • Inactivation is required. Measures to prevent viral infection in blood products include screening of raw materials, membrane filtration, adsorption, column chromatography, removal by sedimentation, solvent determination, ⁇ -propiolactone, heat treatment, and electromagnetic wave irradiation. Activation is performed in a combined form, but virus removal and inactivation are performed without denaturing proteins, reducing physiological activity, and reducing recovery. It's difficult.
  • virus removal of virus by membrane filtration using a virus removal membrane and freeze-drying heating using albumin of 0.5 to 1 O ⁇ CWZV) as a stabilizer removes and inactivates the activated Protein C formulation.
  • albumin of 0.5 to 1 O ⁇ CWZV albumin of 0.5 to 1 O ⁇ CWZV
  • the present inventors have studied an efficient purification method and a method for activating protein C, and also a measure for preventing virus infection when used for medical use, and found that affinity chromatography using an anti-protein C antibody was effective.
  • Method using citrate buffer for elution, activation of protein C at high concentration, and adsorption and purification of activated protein C using a cation exchanger should be effective in the purification of protein C I found
  • Preparation is performed using these purification methods, virus removal by a virus removal membrane, and virus inactivation by freeze-drying and heating, resulting in efficient, high-yield, high-purity medical treatment.
  • the APC preparation according to the present invention not only has a low degree of contamination with contaminating proteins, but also has been prepared by the conventional method described above, for example, the method disclosed in Biochemistry, 16, 582 4-5831 (1977). It has a great feature in having a higher specific activity (mg of APC active protein) than APC and the like. In fact, the activity of the APC preparation of the present invention is 1.5 to 2 times that of the conventional preparation. . Although the main cause of the increase in specific activity still needs to be examined, removal of contaminating proteins (degraded products of APC, inactivated protein C or aggregated protein, etc.) that could not be achieved by conventional methods is also important. It is presumed that this is one of the factors.
  • examples will be given to describe the present invention in more detail, but the present invention is not limited to these examples.
  • a plasma-derived protein C preparation solution protein C 8.7 mg / ml, pH 7.5, electric conductivity 34.3 msZcm
  • 2 OmM potassium citrate 0.1 M sodium chloride buffer pH 6.0
  • Human thrombin was added to a final concentration of 60 UZm1, and heated at 37 ° C for 5 hours to activate protein C.
  • the activated solution is diluted twice with 2 OmM citrate buffer (pH 6.0) to remove thrombin, and a column of cation exchanger (SP-Toyopar) is used.
  • SP-Toyopar column of cation exchanger
  • the pH was fixed at 6.0 and the salt concentration was changed to examine the degree of APC adsorption.At a salt concentration of 0.15 M, not only APC but also some of the thrombin used for activation passed Expanded into fractions. At a salt concentration of 0.1 M, most of the APC is adsorbed as described above, but not enough and a part of it elutes into the fraction. Thus, when the salt concentration was reduced to 8 OmM or less, suitable adsorption of APC to the chromatographic carrier was confirmed.
  • the elution condition is preferably a NaC1 concentration of less than 0.35M.
  • the protein C preparation solution (protein C 8.7 mg / m 1, pH 7.5, electric conductivity 34. SmsZcm) was dialyzed against 5 OmM Tris-HC 1 / 0.1 5 M sodium chloride buffer (pH 8.0), It was diluted to a protein C concentration of 0.7 mg / ml. Thrombin was added to this solution to a final concentration of 1 OUZm 1 and heated at 37 ° C for 5 hours to activate protein C. After activation, the reaction solution was washed with 5 OmM Tris-HC'l / 0.15 M sodium chloride buffer (pH 8.0) and added to a column of cation exchanger (SP-Toyopearl) equilibrated. . Thus, thrombin was adsorbed, and the activated protein C in the flow-through fraction was recovered. The specific activity of the activated protein in this solution was 3259.6 UZmg.
  • Example 2 The specific activity of the activated protein in this solution was 3259.6 UZm
  • Example 1 The preparations described in Example 1 and Reference Example 1 were compared from the viewpoints of specific activity, purity using electrophoresis, and the like.
  • the activity of activated protein C was measured by the following method.
  • APC activity measurement method the amount that doubles the activated tombo plastin time (A PTT (seconds)) of normal human plasma. Therefore, in the APC activity measurement method, the APTT (second) is measured by adding a diluted sample to normal human plasma, and the dilution ratio when the value is twice the value of the control (buffer) is determined by the APC activity of the sample.
  • the value of X! Determined from is defined as the APC activity (unit 1) of the sample.
  • the concentration of activated protein C was quantified based on the measurement of absorbance A280. That is, it is based on the basis that A 28 Q at a concentration (1 OmgZm 1) of APC 1% (WZV) is estimated to be 14.5 from the amino acid composition of APC (Journal of Clinical Investigation J. Clin. Invest. ,, 761-769 (1979)). Therefore, the concentration of activated protein C is calculated by the following equation.
  • the specific activity (UZmg) of APC used in the present invention was calculated based on the APC activity measured value and the APC concentration described above.
  • the APC specific activities before and after the cation chromatography treatment of the present invention were compared using various samples.
  • the results are summarized in Table 2.
  • the preparations of the present invention all have an APC specific activity (UZmg) of 4500 or more, and increase about 1.5 times before and after the chromatographic treatment.
  • UZmg APC specific activity
  • removal of contaminating proteins such as degraded products of APC, inactivated protein C, or aggregated protein
  • bands of a high-molecular fraction and a low-molecular-weight fraction band are removed from APC.
  • the band corresponding to APC was sharper in the fraction adsorbed and eluted at pH 6.0, and probably unactivated protein C was removed. It seems to be.
  • the flow-through fraction obtained by the conventional method is not completely removed, although a small decrease in the band of the fraction of the high molecular fraction and the fraction of the fraction in the low molecular weight region is observed, but not completely.
  • One of the causes of the increase in the specific activity of the high specific activity APC according to the present invention was considered to be a decrease in the content of unactivated protein C in the preparation. Therefore, the content of unactivated protein C in the APC preparation of the present invention and the preparation by the conventional method was measured.
  • an ELISA measuring system using a monoclonal antibody specific to unactivated protein C was applied, and the surgical procedure was in accordance with a conventional method. Table 3 summarizes the results.
  • APC inactivated protein C material Specific activity U / mg
  • Content %: WZW
  • Preparation of the present invention 1 5750.5 0.47
  • the well was washed thoroughly with 1 buffer wave (pH 8.0) and eluted with a 0.3 M glycine buffer (pH 7.0) containing 0.4 M sodium chloride.
  • the protein C obtained at this stage is SDS-PA GE confirmed it as a single band.
  • the protein C solution purified by the above method is diluted to a protein C concentration of 4 mg / ml with 2 OmM citrate buffer (pH 6.0). Thrombin was added to this solution to a final concentration of 6 OU / ml, and heated at 37 ° C for 5 hours to activate protein C.
  • the activated solution was diluted twice with 2 OmM citrate buffer (pH 6.0) to remove the thrombin, and the solution was diluted with a positive ion exchanger (SP-Toyopar). Added to the column. Wash thoroughly with 2 OmM citrate buffer (pH 6.0) containing 6 OmM sodium chloride, and elute activated protein C with 2 OmM citrate buffer (pH 6.0) containing 0.35 M sodium chloride Let me know. Under these conditions, thrombin is not eluted and only activated protein C is eluted and thrombin is removed. The obtained activated protein C solution was filtered through a virus removal membrane (Branova 35N manufactured by Asahi Kasei Corporation). The specific activity of activated protein C in this solution was 5392.7 UZmg, and the residual thrombin concentration was 0.001 unit Zm 1 or less.
  • the filtrate was used to give a final concentration of 0.7% sodium chloride (WZV), 0.5% glycine (W / V), 0.6% sodium citrate (WZV), human albumin 2.5% (W / V), protein C activity 600 units Adjusted to be 1.
  • the prepared activated protein C solution was subjected to aseptic filtration, freeze-dried, and dried and heated at 65 C for 96 hours to inactivate the virus, and finally activated protein C that could be used for medical purposes was obtained.

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Description

明 細 書
ヒ ト活性化プロテイン C調製物及びその製法 技術分野
本発明は、 血漿から誘導されたかまたは遺伝子組換え技術により製造さ れ、 トロンビンまたは等価なプロテアーゼによるヒ 卜の未活性化プロティ ン Cの活性化工程を経て製造される高い比活性を有するヒ ト活性化プロテ イン C調製物に関する。 さらに、 ヒトプロテイン Cの活性化法、 ヒ ト活性 化プロティン Cの高純度精製方法にも関する。
背景技術
プロテイン C(P r o t e i n C: 以下、 P Cと略記することがある） は肝臓で合成されるビタミン K依存性蛋白質の一つであり、 L鎖（分子量 21, 000)と H鎮 (分子量 41, 000)の 2本鎖よりなる分子量 62, 000の酵素前駆体である。 プロティン Cは生体内では血管内皮細胞膜上 のトロンボモジュリンにトロンビンが結合したトロンビン一ト口ンボモジュ リン複合体により限定分解を受け H鎖のアミノ末端より 12個のぺプチド を遊離し活性化プロテイン C(A c t i V a t e d Pro t e i n C: 以下、 APCと略記することがある）となる。 APCはセリンプロテア一 ゼの一種であり、 血液凝固第 V、 第 VIII因子（主として活性型の Va， Villa) を特異的に分解し失活させることにより抗凝固活性を発揮し、 また、 血管 壁からのプラスミノーゲン ·ァクティベータ一の放出を助長し、 線溶系を 促進させる働きを有していることか'ら医薬品としての開発が期待されてい る
本発明の対象である A P C自身は当該技術分野で周知であり、 血漿から 誘導されたかまたは遺伝子組換え技術により調製されたプロテイン Cを、 トロンビンまたはトロンビン一トロンボモジユリン複合体で i n V i t r oで活性化したもの（ブラッ ド Blood, p. 115-121(1984)、 ジャーナ ノレ ォブ クリニカル インべスティゲーシヨン J. Clin. Invest. , 64， p. 76卜 769(1979)、 ジャーナル ォブ クリニカル インべスティゲーシヨン J. Cli n. Invest.， 79, p. 918-925(1987))、 あるいは遺伝子組換え技術によって直 接 A P Cとして発現させることにより得られるものなどが知られている（特 開昭 6 1 - 2 0 5 4 8 7号、 特開平 1 - 2 3 3 8号、 特開平 1 - 8 5 0 8 4 号)。 .
ところが、 A P Cを調製していく過程において、 とりわけ血漿よりプロ ティン Cを分画し、 活性化工程を経て当該目的蛋白質を調製する場合、 A P Cと物理化学的性質のよく似た夾雑蛋白質を効率的に除去し、 A P Cの みを高度に精製し所望の高比活性を有する A P Cを得るためには克服すベ き種々の問題がある。 例えば、 プロテイン Cから A P Cへの効率的な活性 化、 それに続く活性化剤の除去、 さらに A P Cの精製方法にはなお、 多く の検討課題が残っている。
プロテイン Cの活性化方法としてはトリプシン、 R V V— X、 トロンビ ン、 トロンビン一トロンボモジュリンによる活性化ゃセファロースに R V V— Xを固定化したゲルを用いた活性化方法、 トロンビン一トロンボモジュ リン複合体を固定化したゲルを用いた活性化方法等が知られている（ジャ ーナル ォブ バイオロジカル ケミストリ一 J. Biol. Chem. , 251, 3052-3056 (1976)、 バイオケミストリー Biochemistry, 1^, 4893-4900(1976)、 バイオ ケミストリ一 Biochemistry, , 5824-5831(1977)、 ジャーナル ォブ クリ 二カル インべスティゲーヽシヨン J. Clin. Invest. , 64, 761- 769(1977)、 ノく' ィォケミカル バイオフィジカル リサーチ コミュニケニシヨン Biochem. Biophys. Res. Commun. , 94, 340-347(1980). ジャーナルォブクリニカル ィ ンべスティゲーシヨン J. Clin. Invest.， 77, 416-425(1986))。 し力、し、 上記の方法は工業的な大量生産においては満足できるものでは ない。 また、 大量のプロテイン cを活性化するには高濃度のプロテイン c を少ない量の活性化剤で処理することが好ましいが、 これを満足するにも 至っていない。
また、 活性化後の活性化プロテイン cの精製では S P -セフアデックス クロマトグラフィーにより、 A P Cを素通り画分に展開し活性化の際に添 加したトロンビン.を吸着除去する方法が知られている（バイオケミストリ 一 Biochemistry, 16, 5824-5831 (1977) ジャーナル ォブクリニカル イン べスティゲ一シヨン J. Clin. Invest.，^, 761-769(1979)、 ジャーナル ォ ブ バイオロジカル ケミストリ一J. Biol. Chem.， 251, 3052-3056(1976), く' ィォケミストリー Biochemistry, ^, 2156-2161(1981))。 しかし、 活性化 の際に添加したトロンビンを陽イオン交換体を用いて臨床に適応できるレ ベルまで除去することは難しく、 さらに、 実際上この操作の後に A P Cの 濃縮操作が不可欠であり、 濃縮時の A P Cの自己分解を避けることが困難 であった。 従って、 現状においては各種の蛋白質の夾雑のない、 高純度で 高い生物活性を有する A P C調製物を得るまでには至っていない。
発明の開示
本発明は上記の課題を解決すべく創案されたもので、 本発明者らが鋭意 検討を重ねた結果、 プロテイン Cを高濃度で活性化することにより少量の ト口ンビンで効率良く活性化することが可能であること、 活性化後の活性 化プロテイン C含有溶液を陽イオン交換体に接触させ、 一旦トロン'ビンま たは等価なプロテアーゼと活性化プロテイン Cを吸着させ、 好適な塩濃度 の条件で活性化プロテイン Cのみを溶出する方法により、 トロンビンまた は等価なプロテア一ゼおよび Zまたは未活性化プロテイン Cを実質的に含 んでいないヒト活性化プロテイン C調製物が得られること、 さらに驚くベ きことに、 かく して得られたヒ ト活性化プロテイン C調製物が従来法で得 られたヒ ト活性化プロテイン Cに比べて極めて高い比活性を有することを 見いだして完成されたものである。 即ち、 本発明は、 高い比活性を示しト ロンビンまたは等価なプロテアーゼおよび/または未活性化プロティン C を実質的に含んでいないヒ ト活性化プロテイン c調製物並びにその製法を 提供することを目的とする。
図面の簡単な説明
図 1. 本発明の調製物及び従来の調製物の S D S - P A G Eの結果を 示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明のヒト活性化プロテイン C調製物は、 正常ヒ ト血漿の活性化トロ ンボプラスチン時間（APTT)を 2倍に延長する量として定義される単位 に基づく活性単位を指標として、 3500単位/" mgより高い比活性を示 し、 トロンビンまたは等価なプロテアーゼおよび または未活性化プロテ イン Cを実質的に含んでいない。 また、 本発明の該調製物の調製に際して、 トロンビンまたは等価なプロテアーゼによる活性化後、 ヒ ト活性化プロテ イン C含有溶液を pH5.0〜6.0、 NaC 1濃度 80 mM以下の条件で 陽イオン交換体に接触させ、 トロンビンと活性化プロテイン Cを吸着させ、 塩濃度 0.1〜0.35Mの条件でヒ ト活性化プロテイン Cのみを溶出させ ることにより、 高度精製ヒ ト活性化プロテイン Cを回収することができる。 上記プロテイン C含有溶液中のプロテイン Cをトロンビンまたは等価な プロテアーゼを用いて活性化するに際しては、 プロテイン C濃度 0.5〜 8. Omg/m 1のプロティン C含有溶液に対しトロンビンをトロンビン Zプロテイン C 1~20(U/mg)の割合で添加し、 pH6.0〜8.0 の条件で活性化することにより効率よく大量のプロテイン Cを活性化する ことができる。 さらに、 この工程に続く活性化剤の除去、 A PCの精製ェ 程においては、 活性化後の A P C含有溶液を pH 5.0〜6.0、 Na C 1 濃度 8 OmM以下の条件で陽イオン交換体に接触させてトロンビンと AP Cを吸着させ、 ついで塩濃度 0.1〜0.35Mの条件で活性化プロテイン Cのみを溶出させる。
本発明のヒ トプロテイン C活性化法では、 プロテイン Cを高濃度で活性 化することにより少量のト口ンビンで効率良く活性化することが可能であ る。 このことは活性化中のプロテイン Cの分解を少なく し、 またその後の トロンビン除去を容易にするという利点を持つ。 その後の A P Cの精製ェ 程では、 溶出液中のトロンビン濃度を 0.001単位 Zm 1以下にするこ とができ、 定量的に AP Cを回収できる。 また、 APCを吸着させてから 溶出するため、 濃縮された APCを得ることができる。 さらに、 本発明の 方法によって回収された A P C調製物は従来の方法によって得られる調製 物に比して極めて高い比活性を有する。
本明細書においてヒ ト活性化プロテイン C調製物の比活性とは、 APC 活性 蛋白質 mgの比率を意味し、 また APC活性の 1単位とは、 正常ヒ ト血漿の活性化トロンボプラスチン時間（APT T)を 2倍に延長する量と して定義する。 従って、 実際の APC活性の測定は、 希釈したサンプルを 正常ヒト血漿に加えて A PTT (秒）を測定し、 その値が対照の値の 2倍と なる時の希釈倍率を、 サンプルの APC活性値とする。
本発明に係る調製物の主成分'である A PC、 および本発明に係る製法の 出発原料であるプロテイン Cの由来は特に制約はないが、 ヒ ト血漿に由来 するものが好適に適用され得る。
上述の本発明の工程における活性化工程は以下の手順で進められる。 プ 口ティン C濃度 0.5~8. Omg m 1のプロテイン C含有溶液に対しト ロンビンをトロンビンノプロテイン C 1〜2 O(UZmg)の割合で添加 し、 pH6.0〜8.0、 塩濃度 0.1~0.15 Mの条件下、 好適な条件、 例えば 37°Cで 5〜6時間反応させる。
上記の活性化工程により処理された反応液は必要に応じて、 pH調整、 塩濃度調整を施された後に、 陽ィォン交換体処理に付して A P Cの精製が なされる。 この陽イオン交換体処理により、 トロンビンが除去されさらに 未活性化プロテイン C等の夾雑蛋白質が除かれる。 使用される陽イオン交 換体としては陽イオン交換基（例えば、 スルホ基、 カルボキシル基）を有す る不溶性担体であればいずれも使用することができ、 より具体的には、 当 分野で慣用の陽イオン交換体、 例えば、 S-セファロ一ス（商品名）、 SP- セフアデックス（商品名）（いずれもフアルマシア社製）、 S P -トョパール（商 品名）、 丁3 ゲル3 P-5 PW (商品名）（いずれも東ソ一社製）等の陽ィォ ン交換樹脂が例示され、 S P—セフアデックス、 S P-トヨパールは好ま しい態様である。 本方法はカラム法、 バッチ法のいずれの方法でも可能で あるが、 夾雑蛋白質の除去効率の面からカラム法で行なうのが好ましい。 本発明の AP Cの精製工程においては、 活性化反応溶液を陽イオン交換 体に接触させ、 トロンビンと APCを吸着させ、 塩濃度 0.1〜0.35M の条件で活性化プロティン Cのみを溶出することに大きな特徴を有する。 かかる精製法によって調製された AP C調製物はトロンビンまたは等価な プロテアーゼおよび/または未活性化プロテイン C等の夾雑蛋白質を実質 的に含ん おらず、 APC活性に係る比活性も 3500単'位 Zmg以上と 極めて高い。
さらに、 本件発明者らはプロテイン C画分より所望の高比活性の A P C を調製する一連の工程のなかで、 従来法の欠点を補うべく検討を重ねた結 果、 いくつかの有用な改善方法を創案し、 本発明の効果をさらに増長させ 得るに至った。
プロテイン Cの精製法としてはクェン酸バリゥム吸着沈殿、 硫安分画、 D E A E -セフアデックスカラムクロマトグラフィーで精製したプロティ ン Cを、 さらに、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 デキストラン硫酸ァ ガロースクロマトダラフィ一等の方法により精製する方法や、 プロティン Cに対する抗体を固定化したゲルを用いて精製する方法などが知られてい る（ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリ一 J. Biol. Chem. , 251， 35 5 - 363(1976)、 ジャーナル ォブ クリニカル インべスティゲーシヨン J. C lin. Invest , 64, 761-769(1979). ブラッ ド Blood, 54, 1272-(1979)^ フエ ブス レターズ FEBS LETTERS, 191, 75-81(1985). ジャーナル ォブバイオ ロジカル ケミストリー J. Biol. Chem. , 261, 11097-11105(1986))ο しかし、 上記の方法は実験室レベルのものであり、 収率、 作業効率等を考えるとェ 業的な大量精製には不向きである。 また、 プロテイン Cに対する抗体を固 定化したゲルを用いた精製では、 溶出に強力なカオトロピックイオンや酸 性 ρ Ηを用いたり、 E D T Aのような強力なキレート剤を用いるが、 溶出 液中にゲルより脱離したわずかな量のプロテイン Cに対する抗体が含まれ ることが問題となる。
本発明では強力なキレート剤である E D Τ Αの代わりにクェン酸緩衝液 を用いてプロテイン Cを溶出することによりゲルより脱離するプロティン Cに対する抗体を低減できることを見い出した。 さらに、 得られたプロテ ィン C含有溶液を陰イオン交換体に p H 7 . 0〜9 . 0の条件で吸着させ、 僅かに含まれるプロテイン Cに対する抗体を除去した後に、 塩濃度 0. 3 〜1 . 0 Mの条件でプロテイン Cを溶出することで殆どのプロテイン Cに 対する抗体を除去することができる。
上記の知見に基づき、 本発明によって下記の工程で示される工業スケー ルでの改善された活性化プロテイン cの調製方法が提供される。
( 1 )ヒ トプロテイン Cを含有する溶液を陰イオン交換体に吸着させた後、 溶出させ、 G 1 a ドメインを有するヒ トプロテイン C画分を調製し、
( 2 )ヒ トプロテイン Cを含有する溶液を、 カルシウムイオンと結合したプ 口ティン Cを特異的に認識する抗体を不溶性担体と結合した吸着体にカル シゥム存在下で吸着させ、 クェン酸緩衝液を用いて当該プロテイン Cを溶 出し、
( 3 )プロテイン C含有溶液を陰イオン交換体に吸着させた後、 溶出させて 上記プロテイン C含有溶液より抗プロテイン C抗体を除去し、
( 4 )ヒ トプロテイン Cをトロンビンまたは等価なプロテアーゼを用いて活 性化する際に、 ヒトプロテイン Cを含有する溶液に p H 6. 0〜8. 0の条 件でトロンビンをトロンビンノプロテイン C 1〜2 O CUZm g )の量比 で添加してヒ トプロテイン Cを活性化し、 ついで
( 5 )活性化後のヒ ト活性化プロテイン C含有溶液を p H 5. 0〜6. 0、 塩 濃度 8 O mM以下の条件で陽イオン交換体に接触させてトロンビンと活性 化プロテイン Cを吸着させ、 ついで塩濃度 0. 1〜0. 3 5 Mの条件でヒト 活性化プロテイン Cのみを溶出させ回収する。
精製された活性化プロテイン Cを医療用に使用する場合には、 とりわけ ヒト血漿を原料とする場合、 原料由来のウィルス（例えば肝炎ウィルス、 H I Vなど）による感染の危険性があり、 ウィルスの除去、 不活化が必要 となる。 血液製剤におけるウィルス感染防止対策としては原料'のスクリー ニング、 膜濾過、 吸着、 カラムクロマトグラフィー、 沈殿分画による除去、 ソルベントデタージヱント法、 β -プロピオラク トン、 '加熱処理、 電磁波 照射による不活化等を組み合わせた形で行なわれるが、 蛋白質の変性、 生 理活性の低下、 回収率の低下等を伴わずにウィルスの除去、 不活化を行な うことは難しい。 本発明では、 ウィルス除去膜を用いた膜濾過によるウイ ルスの除去および 0. 5〜1 O ^CWZV)のアルブミンを安定剤とする凍 結乾燥加熱が活性化プロティン C製剤のウイルス除去、 不活化に対して有 効であることを見い出した。 本方法を用いれば活性化プロティン Cの変性、 生理活性の低下、 回収率の低下が無く効率良くウィルスの除去、 不活化が 可能である。
本発明者らは、 効率の良い精製方法およびプロテイン Cの活性化方法、 更には医療用に使用する場合のウイルス感染防止対策を検討したところ、 抗プロテイン C抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィ一でのプロ ティン Cの精製において溶出にクェン酸緩衝液を用いる方法、 高濃度での プロテイン Cの活性化方法、 陽ィォン交換体を用いて活性化プロティン C を吸着させ精製する方法が有効であることを見い出した。 そして、 これら を軸とする精製方法を用いて調製を行ない、 ゥィルス除去膜によるウィル スの除去および凍結乾燥加熱によるウイルス不活化を施すことにより、 効 率良く高収率で高純度の医療用に使用しうる活性化プロテイン Cを大量生 産できる技術を確立した。
本発明に係る A P C調製物は、 夾雑蛋白質の混入の程度が低いのみなら ず、 前述の従来の方法、 例えばバイオケミストリー Biochemistry, 16， 582 4-5831(1977)で開示された方法で調製された A P C等よりも高い比活性（A P C活性ノ蛋白質 m g )を有することに大きな特長があり、 実際、 本発明 の A P C調製物の活性は従来の調製物の 1 . 5〜2倍の比活性を示す。 比 活性の上昇の主因についてはなお検討を要するところであるが、 従来の方 法では達成することのできなかった夾雑タンパク質（A P Cの分解物、 未 活性化プロテイン Cあるいは凝集タンパク質等）の除去も主要な要因の一 つであろうと推察される。 以下、 本発明をより詳細に説明するため、 実施例を挙げるが、 本発明は これらの実施例になんら限定されるものではない。
実施例 1
1.1 高比活性活性化プロテイン c調製物の調製
血漿由来のプロテイン C調製物溶液（プロテイン C 8.7mgノ ml、 p H7.5、 電気電導度 34.3msZcm)を 2 OmMクェン酸ノ 0.1M塩 化ナトリウム 緩衝液（pH6.0)に透析後、 プロテイン C濃度 4mgZm 1に希釈した。 この溶液にヒ ト トロンビンを最終濃度 60 UZm 1になる ように添加し、 37°Cで 5時間加温してプロテイン Cを活性化した。 活性化後、 トロンビンの除去を行なう為に活性化後の溶液を 2 OmMク ェン酸緩衝液（pH6.0)で 2倍に希釈し、 陽イオン交換体（SP—トヨパ ール）のカラムに添加した。 6 OmMの塩化ナトリウムを含む 2 OmMク ェン酸緩衝液（pH6.0)で充分に洗浄し、 0.3Mの塩化ナトリウムを含 む 2 OmMクェン酸緩衝液（pH6.0)で活性化プロテイン Cを溶出させ た。 この条件ではトロンビンの溶出はなく活性化プロテイン Cのみが溶出 された。 残存トロンビン濃度は 0.001単位 Zm 1以下であった。 得ら れた A PC調製物の比活性は 4750.9U/mgであった。
1.2 活性化後の陽イオンクロマトグラフィーにおける A PCの吸着 *溶 出条件の検討
1) 吸着条件
2 OmMクェン酸緩衝液を用いて、 APCの安定性の観点から現実的な pH6.0〜7.0、 塩濃度 0.0〜0.15 Mの範囲での A P Cの吸着条件 を検討した。 117.0、 塩濃度0.11^では ( は殆ど吸着しなぃ。 p H6.5、 塩濃度 1Mでは A PCは一部分吸着するものの、 大部分は素 通り画分に展開される。 pH6.0、 塩濃度 0.1Mでは大部分の A PCは クロマト担体に吸着された。
この結果を基に pHを 6.0に固定し、 塩濃度を変化させて APCの吸 着の度合を検討したところ、 塩濃度 0.15 Mでは A PCのみならず活性 化に使用したトロンビンの一部も素通り画分に展開された。 塩濃度 0.1 Mでは前述のように大部分の A P Cは吸着されるが、 充分ではなく一部が 素通り画分に溶出する。 そこで、 塩濃度を 8 OmM以下にしたところ、 A P Cのクロマト担体への好適な吸着が認められた。
2)溶出条件
6 OmMNa C 1を含む 2 OmMクェン酸緩衝液（p H 6.0)で平衡化 した後に、 60mM〜0.5M NaC 1濃度でグラジェント溶出を行なつ た。 NaC 1濃度が 0.1M程度から除々に A PCの溶出が始まり、 0.3 5M以上ではトロンビンの混入が観られる。 従って、 溶出条件としては 0. 35 M未満の N a C 1濃度が好ましい。
参考例 1
(従来法に基づく活性化プロテイン C調製物の調製）
前記プロテイン C調製物溶液（プロテイン C 8.7mg/m 1 , pH7. 5、 電気電導度 34. SmsZcm)を 5 OmM Tr i s -H C 1/0.1 5M塩化ナトリウム 緩衝液（pH8.0)に透析後、 プロテイン C濃度 0. 7mg/m 1に希釈した。 この溶液にトロンビンを最終濃度 1 OUZm 1 になるように添加し、 37 °Cで 5時間加温してプロテイン Cを活性化した。 活性化後、 反応溶液を 5 OmM T r i s -H C' l /0.15M塩化ナトリ ゥム 緩衝液（pH8.0)で洗浄 ·平衡化した陽イオン交換体（SP—トヨ パール）のカラムに添加した。 かく してトロンビンを吸着させ、 素通り画 分の活性化プロテイン Cを回収した。 この溶液中の活性化プロテインじの 比活性は 3259.6UZmgであった。 実施例 2
(本発明の調製物と従来の調製物との比較）
実施例 1及び参考例 1に記載の調製物を用いて、 比活性並びに電気泳動 を用いた純度等の観点から比較した。
2.1 活性化プロテイン Cの活性測定
本発明において、 活性化プロテイン Cの活性測定は、 以下の方法により 実施した。
A P C活性 1単位は正常ヒ ト血漿の活性化ト口ンボプラスチン時間（A PTT (秒））を 2倍に延長する量と定義する。 従って、 APC活性測定法 は、 希釈した試料を正常ヒ ト血漿に加えて APTT (秒）を測り、 その値が 対照 (緩衝液）の値の 2倍となるときの希釈倍率を試料の A P C活性値とす
(操作法）
試料を 1%HS A添加べロナール緩衝液で、 例えば 400、 500、 8 00、 1000倍になるように希釈する。 37°Cで、 対照（緩衝液）または 試料の各希釈液の各々 100 / 1に、 正常ヒ ト血漿（例えば、 サイ トロー ル* I：国際試薬） 100/1 1、 APTT試薬 (例えば、 ァクチン：国際試薬） 100 Z〗を 15秒間隔で加えて混和し、 2分後、 0.025MC a C l 2 100 1を加え凝固時間を測定する。
(活性の計算）
対照及び試料の各希釈倍率（X)での APTTの値（Y)から、 103ZX と Yの直線回帰式と相関係数を求める。
Y = A (10VX) + B
対照の APTT (秒）の 2倍の値を として、
Figure imgf000014_0001
から求めた X!の値を、 試料の AP C活性（単位 1 )とする。
(タンパク質定量）
活性化プロティン Cの濃度は吸光度 A 280の測定に基づいて定量した。 即ち、 AP C 1%(WZV)の濃度（1 OmgZm 1 )の A28Qが、 APCの アミノ酸組成より 14.5と推測されるという根拠に基づく（ジャーナル ォブクリニカル インべスティゲーシヨン J.Clin. Invest.， ， 761-769(19 79))。 従って、 活性化プロテイン Cの濃度は以下の式により算出される。
活性化プロテイン Cの濃度（mg/m 1 ) = A28o測定値 1.45 上述の APC活性測定値及び APCの濃度を基に本発明において使用さ れる A PCの比活性（UZmg)を算出した。
2.2 活性化条件の差異による APC比活性への影響
活性化直後の試料を用いて活性化条件の差異による比活性への影響を検 討した。 活性化後の A PC活性の測定では、 測定前において、 試料 1ml に対しアンチトロンビン- III、 へパリンを各々 1 U、 10U添加後、 37 °Cで 30分加温し、 トロンビンを不活性化して測定した。 結果を表 1に示 す。 従来法（pH8.0、 NaC 1濃度 0.15M)と比較して、 本発明の 活性化条件（pH 6.0、 NaC 1濃度 0.1M)は、 比活性に対する影響 はない。
従 来 法 本 発 明
蛋白濃度（mgZm 1 ) 0.72 1.38
活 性（UZml) 2069.9 4133.4 比 活 性（UZmg) 2885.9 3089.3
2.3 陽イオンクロマト処理前後での比活性の比較
種々の試料を用いて、 本発明の陽イオンクロマト処理前後での APC比 活性の比較を行なった。 結果を表 2にまとめる。 従来法では比活性の上昇 は殆ど認められないが、 本発明の調製物はいずれも A P C比活性（UZm g)4500以上であり、 クロマト処理の前後で約 1.5倍に上昇している。 この比活性の上昇の主因についてはなお検討を要するところであるが、 従 来の方法では達成することのできなかった夾雑タンパク質（AP Cの分解 物、 未活性化プロテイン Cあるいは凝集タンパク質等）の除去も本発明の 調製物の完成に寄与しているものと推察される。
表 2
比活性（UZmg) 上昇率 試 料 クロマ小前 クロマト後 (倍） 本発明 1 3089.3 4750.9 .54 本発明 2 3108.3 5750.5 .85 本発明 3 3869.5 5107.8 .32 従来調製物 2885.9 3259.6 3 2.4 陽イオンクロマト処理前後での電気泳動による比較
従来法においては陽イオンクロマト工程で、 pH8.0で A PCを素通 りさせていたが、 本発明では pH6.0で AP Cをいつたん吸着させてか ら溶出させる。 図 1に、 両方法での SD S-PAGEの結果を示す。
本発明で実施される pH 6で A PCを吸着させ、 未活性化プロテイン C を素通りさせる方法では、 APCより高分子の画分及び低分子領域の画分 のバンドが除去される。 また、 pH 8.0で素通りさせた画分に比較して、 pH6.0で吸着 ·溶出させた画分では A PCに該当するバンドがシヤー プになっており、 おそらく未活性化プロティン Cが除去されているものと 思われる。 一方、 従来法によって得られる素通り画分は、 APCより高分 子の画分及び低分子領域の画分のバンドの多少の量的な減少が認められる ものの完全には除去しきれていない。
2.5 AP C調製物中の未活性化プロテイン Cの含量
本発明による高比活性 APCの比活性上昇の原因の一つとして、 調製物 中の未活性化プロテイン C含量の低下が考慮された。 そこで、 本発明の A P C調製物並びに従来法による調製物中の未活性化プロティン C含量を測 定した。 測定は未活性化プロテイン Cに特異的なモノクロ一ナル抗体を用 いた EL I S Aの測定系を適用し、 術式は常法に従った。 結果を表 3にま とめる。
表 3
APC 未活性化プロテイン C 料 比活性（U/mg) 含量（％:WZW) 本発明調製物 1 5750.5 0.47
本発明調製物 2 5107.8 1.22
本発明調製物 3 4457.1 0.36 従来調製物 1 2661.7 5.41
従来調製物 2 3286.2 5.83
従来調製物 3 2470.4 3.93 比活性の低い従来調製物では 4〜 6 %の未活性化プロティン Cが含まれ ているのに対し、 比活性の高い本発明の調製物では 0.4〜1.2%しか含 有されていなかった。 確かに従来法の調製物中の未活性化プロテイン C含 量は高いが、 この含量は僅かであり調製物の比活性に直接影響していると は考え難い。 そこで、 この点を確認するため、 最も未活性化プロテイン C 含量の低い本発明調製物 3に、 最終濃度が 5 %となるように未活性化プロ ティン Cを添加して A P C活性（A P T T)を測定したところ、 未活性化プ 口ティン Cを添加しない場合に比較して、 APT T測定値に変化は認めら れなかった（表 4)。 従って、 未活性化プロテイン C含量の低下が本発明の 調製物にみられる A PC比活性の上昇の主たる原因とは考えられない。 表 4
APC 比活性（UZmg)
料 プロテイン C未添加 5%プロテイン C添加 本発明調製物 3 5077.9 5173.7 従来調製物 3 2726.0 2725.7 実施例 3
(活性化プロテイン C製剤の調製）
工業スケールのヒ ト新鮮凍結血漿 100Lを冷融解し、 生じた沈殿物を 遠心分離した上清を陰ィォン交換体（D EAE-セフアデックス A-50)に添 加し、 0.1Mの塩化ナトリウムを含む 2 OmMクェン酸緩衝液（pH 7. 0)にて充分に洗浄を行ない、 0.5Mの塩化ナトリウムを含む 2 OmMク ェン酸緩衝液（pH 7.0)にて Gl aドメインを有するヒ トプロテイン C 画分を溶出した。
この溶液に 3 OmMの塩化カルシウムを加えた後に抗プロテイン C抗体 を用いたァフィ二ティークロマトグラフィ一のカラムに添加し、 0.15 Mの塩化ナトリウム、 2 mMの塩化カルシウムを含む 5 OmM T r i s- HC 1 緩衝液（pH8.0)にて充分洗浄し、 0.15Mの塩化ナトリウム を含む 2 OmMクェン酸緩衝液（pH6.0 )でプロテイン Cを溶出した。 この溶液を 0.1N水酸化ナトリウムで pH8.0に調整'した後に陰ィォ ン交換体（Q-セファローズ Fast Flow)のカラムに添加し、 0.15 Mの 塩化ナトリウムを含む 5 OmM Tr i s -H C 1緩衝波（p H 8.0 )で充 分に洗浄し、 0.4Mの塩化ナトリウムを含む 0.3Mグリシン緩衝液（p H 7.0)にて溶出した。 この段階で得られたプロテイン Cは SDS- PA GEでは一本のバンドとして確認された。
活性化に際して、 上記の方法により精製されたプロテイン C溶液を、 2 OmMクェン酸緩衝液（pH6.0)にてプロテイン C濃度 4mg/m 1に 希釈する。 この溶液にトロンビンを最終濃度 6 OU/m 1になるように添 加し、 37°Cで 5時間加温してプロテイン Cを活性化した。
活性化後、 トロンビンの除去を行なう為に活性化後の溶液を 2 OmMク ェン酸緩衝液（ p H 6.0 )で 2倍に.希釈し、 陽ィォン交換体（ S P—トヨパ ール）のカラムに添加した。 6 OmMの塩化ナトリウムを含む 2 OmMク ェン酸緩衝液（pH 6.0)で充分に洗浄し、 0.35 Mの塩化ナトリウムを 含む 2 OmMクェン酸緩衝液（pH6.0 )で活性化プロテイン Cを溶出さ せた。 この条件ではトロンビンは溶出されず活性化プロティン Cのみが溶 出されトロンビンが除去される。 得られた活性化プロテイン C溶液はウイ ルス除去膜（ブラノバ 35N旭化成 (株)製）による濾過を行なった。 なお、 この溶液中の活性化プロテイン Cの比活性は 5392.7UZmg、 残存 トロンビン濃度は 0.001単位 Zm 1以下であつた。
この濾液を最終濃度が 0.7%塩化ナトリウム (WZV)、 0.5%グリシ ン (W/V)、 0.6%クェン酸ナトリウム（WZV)、 ヒトアルブミン 2.5 %(W/V), プロテイン C活性 600単位ノ m 1になるように調整した。 調製された活性化プロテイン C溶液は無菌濾過、 凍結乾燥後、 ウィルス不 活化の為に 65 C、 96時間の乾燥加熱を行ない最終的に医療用に使用し うる活性化プロテイン Cを得た。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 正常ヒ ト血漿の活性化トロンボプラスチン時間（A P T T)を 2倍に延 長する量として定義される単位に基づく活性単位を指標として、 3 5 0 0 単位/ m gより高い比活性を示し、 トロンビンまたは等価なプロテアーゼ および Zまたは未活性化プロテイン Cを実質的に含んでいないヒ ト活性化 プロテイン C調製物。
2. 比活性が 4 0 0 0単位 Zm g以上である請求項 1記載のヒ ト活性化プ 口ティン C調製物。
3. トロンビンまたは等価なプロテアーゼによるヒ 卜の未活性化プロティ ン Cの活性化によって製造される請求項 1または 2に記載のヒ ト活性化プ 口ティン C調製物。
4. トロンビンまたは等価なプロテアーゼによる活性化後、 ヒ ト活性化プ 口ティン C含有溶液を p H 5. 0〜6. 0、 塩濃度 8 O mM以下の条件で陽 イオン交換体に接触させ、 トロンビンとヒ ト活性化プロテイン Cを吸着さ せ、 塩濃度 1〜0. 3 5 Mの条件でヒ ト活性化プロテイン Cのみを溶出 させることを特徴とするヒ ト活性化プロテイン Cの精製法。
5. 以下の諸工程を含むことを特徴とする、 請求項 1記載のヒト活性化プ 口ティン C調製物の調製法：
( 1 )ヒ トプロテイン Cを含有する溶液を陰ィォン交換体に吸着させた後、 溶出させ、 G 1 a ドメインを有するヒ トプロテイン C画分を調製し、
( 2 )ヒ トプロ'ティン Cを含有する溶液を、 カルシウムイオンと結合したプ 口ティン Cを特異的に認識する抗体を不溶性担体と結合した吸着体にカル シゥム存在下で吸着させ、 クェン酸緩衝液を用いて当該プロティン Cを溶 出し、
( 3 )プロテイン C含有溶液を陰イオン交換体に吸着させた後、 溶出させて 上記プロティン C含有溶液より抗プロテイン C抗体を除去し、
(4)ヒ トプロテイン Cをトロンビンまたは等価なプロテア一ゼを用いて活 性化する際に、 ヒトプロテイン Cを含有する溶液に pH6.0〜8.0の条 件でトロンビンをトロンビン プロテイン C 1〜2 O(UZmg)の量比 で添加してヒ トプロテイン Cを活性化し、 ついで
(5)活性化後のヒト活性化プロテイン C含有溶液を pH5.0〜6.0、 塩 濃度 8 OmM以下の条件で陽イオン交換体に接触させてトロンビンと活性 化プロテイン Cを吸着させ、 ついで塩濃度 0.：!〜 0.35Mの条件でヒ ト 活性化プロテイン Cのみを溶出させ回収する。
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