CN101250512A - 内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，属于生物技术领域。本发明包括如下步骤：(1)对氨基苯磺酸和L－色氨酸通过三氯三氮嗪活化连接到基础层析介质上制备亲和分离材料；(2)将纤维素酶粗品与所述亲和分离材料接触，内切木聚糖酶结合到亲和分离材料上，未结合物质被洗出后，内切木聚糖酶再用洗脱缓冲液从柱中专一洗脱下来，得到纯内切木聚糖酶。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高纯度的内切木聚糖酶。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的规模化制备方法，特别是一种内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法。
背景技术
β-1，4-内切木聚糖酶(亦称之为β-1，4-木聚糖水解酶，EC 3.2.1.8)是一种能够降解生物质原料中半纤维素组分生成聚合度大大降低的寡聚木糖，直至三聚木糖、二聚木糖和单分子木糖，在造纸工业、动物饲料行业、面包制作、饮料和酿酒工业、以及正在发展的生物质绿色化工和生物质能源行业都有重要用途。
经对现有技术的文献检索发现，Damiano等人发表在《Appl BiochemBiotechnol》(《应用生物化学和生物技术》，2006年129-132卷289-302页)上发表了题为“Purification and characterization of two xylanases fromalkalophilic and thermophilic Bacillus licheniformis 77-2”(“耐碱嗜热细菌中两种木聚糖酶的纯化和鉴定”)的论文，提出如下内切木聚糖酶制备的技术方案：细菌培养液首先过G-75凝胶过滤处理、再依次过CM-sephadex和Qsepharose离子交换层析操作，最终获得内切-β-1，4-D-木聚糖酶。与文献报道的其它内切木聚糖酶纯化方法类似，该方法采用多种分离方法组合，操作步骤多，生产过程长且复杂，消耗人力、试剂、能源大，设备利用率低；尤其是使用凝胶过滤操作每个循环处理量少，效率低、难于规模化制备。因此需要发展先进高效纯化生产方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，能够简捷、批量纯化制备内切木聚糖酶。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以内切木聚糖酶专用亲和分离材料作为基础，其步骤如下：
第一步，制备仿生亲和分离材料
仿生亲和分离材料是通过三氮嗪结构骨架作为间臂依次固定对氨基苯磺酸和L-色氨酸两个基团，首先用三氯三氮嗪活化的基础层析介质(二氯三氮嗪-介质)与对氨基苯磺酸反应得到胺对苯磺酸一氯三氮嗪-介质，再与L-色氨酸反应，得到胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质，称为仿生亲和分离材料，这种仿生亲和分离材料的关键是对氨基苯磺酸和L-色氨酸两个基团通过三氮嗪结构骨架组合到基础层析介质上；
所述反应得到胺对苯磺酸一氯三氮嗪-介质，其反应温度为50℃。
所述再与L-色氨酸反应，其反应温度为95℃。
所述基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖-N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚分离材料、甲基丙烯酸聚合分离材料、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖凝胶，琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺—琼脂糖复合物珠、纤维素珠或涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
所述的仿生亲和分离材料，其配体结构含对胺基苯磺酸结构和L-色氨酸结构。
第二步，用仿生亲和分离材料纯化纤维素酶粗品
将内切木聚糖酶粗品直接上样至用结合缓冲液预平衡的装有仿生亲和分离材料的层析柱中，清洗去除未结合杂质组分，再用洗脱缓冲液从柱中洗脱内切木聚糖酶，获得内切木聚糖酶纯品。
所述结合缓冲液pH5.0-10.0。
所述洗脱缓冲液pH2.0-10.0，含NaCl 0.0-1.0M NaCl。
所述的内切木聚糖酶，其原料为天然微生物发酵，或通过基因工程技术改造的微生物发酵液，或菌体破碎液，包括Hypocrea jecorina发酵液。
本发明的仿生亲和分离材料上的化学基团能够与内切木聚糖酶分子发生高度特异的非共价和可逆的识别和结合，内切木聚糖酶与分离材料接触时，能够与该化学基团结合吸附在分离材料上，未结合的杂质被平衡缓冲液清洗被除去。再用不同缓冲液条件，如盐种类、浓度、酸碱度将吸附在分离材料上的内切木聚糖酶特异解离洗脱，从而制备高纯度的内切木聚糖酶。
本发明克服了现有内切木聚糖酶纯化技术中操作步骤多，生产过程长且复杂，消耗人力、试剂、能源大，设备利用率低的缺点，实现了步骤少、生产周期短、效率高、成本低的优势，能够快速、简便、批量纯化制备内切木聚糖酶。
具体实施方式
以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
取NH2-交联琼脂糖珠1000ml，依次用5倍介质体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽去多余水分后转移至5L玻璃烧瓶中，然后加入1000ml冰水，在冰水浴中搅拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪300g，其后用饱和NaHCO3调节和维持反应系统的pH在6.0-7.0之间，反应4小时后取出，依次用3×10倍介质体积的水/丙酮(体积比分别为0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗涤，得到二氯三氮嗪-介质，共950ml。
取对氨基苯磺酸80g用1000ml饱和NaHCO3溶解，加入二氯三氮嗪-介质800ml中混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时，反应结束后，将介质用10倍介质体积蒸馏水充分洗涤，得到胺对苯磺酸一氯三氮嗪-介质700ml，待用。
取L-色氨酸90g用800ml饱和NaHCO3溶解，加入胺对苯磺酸一氯三氮嗪-介质600ml中混匀，置于温度100℃中搅拌反应24小时，反应结束后，将介质依次用10倍介质体积乙醇，用10倍介质体积蒸馏水充分洗涤，得到胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质500ml，用30％乙醇保存，待用。
将Hypocrea jecorina发酵液上清液pH调至7.0，取1.5ml上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(2ml)中，用5ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.0)洗去未结合的物质，再用2ml 0.1M醋酸(pH2.0)洗脱，收集得到内切木聚糖酶。取20μl加至180μl含1％木聚糖的0.1M pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液中混匀，55℃反应30min。再加200μl DNS显色剂(称取6.5g 3，5-二硝基水杨酸溶解于少量热dH2O中，再加入26g NaOH、45g甘油，用dH2O定容至1000ml，磁力搅拌器上充分搅拌混匀，棕色瓶避光保存备用)沸水中孵育5min显色。测光吸收A546nm，对照木糖标准浓度的光吸收A546nm计算反应体系每分钟生成还原糖μmol量(酶活力单位)，总酶活力单位0.53U。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析内切木聚糖酶纯度75.8％。
实施例2
将Hypocrea jecorina发酵液上清液调pH至8.5，取150ml上样至预先用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(50ml)中，用100ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)洗去未结合杂质后，再用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)含0.6M NaCl洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到120U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到95％。
实施例3
将Hypocrea jecorina发酵液上清液调pH至6.0，取6ml上样至预先用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH6.0)平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(2ml)中，用10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH6.0)洗去未结合杂质后，再用乙酸钠缓冲液(0.10M乙酸-乙酸钠，pH3.0)洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到1.18U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到86％。
实施例4
将Hypocrea jecorina发酵液上清液调pH至9.5，取8ml上样至预先用50mM Tris.HCl缓冲液pH9.5平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(2ml)中，用10ml 50mM Tris.HCl缓冲液pH9.5平衡洗去未结合杂质后，用0.1M氯化铵-氢氧化铵缓冲器溶液(pH 10)洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到1.56U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到90％。
实施例5
将Hypocrea jecorina发酵粗品溶液调pH至8.5，取150ml上样至预先用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(50ml)中，用100ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)洗去未结合杂质后，再用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)含1.0M NaCl洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到150U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到90％。
实施例6
将Hypocrea jecorina发酵液干燥粗品溶液上清液调pH至8.5，取150ml上样至预先用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(50ml)中，用100ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)洗去未结合杂质后，再用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8.5)含0.3M NaCl洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到90U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到98％。
实施例7
将Hypocrea jecorina发酵液上清液调pH至10.5，取10ml上样至预先用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH10.5)平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(2ml)中，用100ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH10.5)洗去未结合杂质后，再用0.1M乙酸-乙酸钠(pH2.4)洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到0.8U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到82％。
实施例8
内切木聚糖酶粗品溶液调pH至10.5，取10ml上样至预先用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH10.5)平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(2ml)中，用100ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH10.5)洗去未结合杂质后，再用0.1M乙酸-乙酸钠(pH4.0)洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到0.85U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到92％。
实施例9
内切木聚糖酶粗品溶液调pH至5.0，取8ml上样至预先用50mM Tris.HCl缓冲液pH5.0平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(2ml)中，用10ml 50mM Tris.HCl缓冲液pH5.0平衡洗去未结合杂质后，用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH9.5)含0.6M NaCl洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到1.0U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到86％。
实施例10
内切木聚糖酶粗品溶液调pH至8.0，取8ml上样至预先用50mM Tris.HCl缓冲液pH8.0平衡的胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质的层析柱(2ml)中，用10ml 50mM Tris.HCl缓冲液pH8.0平衡洗去未结合杂质后，用50mM Tris.HCl缓冲液pH7.0含0.6M NaCl洗脱，分步收集，按照实施例1中的方法测定内切木聚糖酶活力，总活达到1.3U；SDS-PAGE分析蛋白组成内切木聚糖酶纯度达到76％。
本发明的上述各个实施例从上样至获得高纯内切木聚糖酶操作简单，只需要一步层析操作，生产成本低。利用分离材料与内切木聚糖酶之间的高度专一的相互作用实现纯化的目的，不受生产规模的影响，因此很容易放大进行批量生产。
Claims (9)
1、一种内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：
第一步，制备仿生亲和分离材料
首先用三氯三氮嗪活化的基础层析介质与对氨基苯磺酸反应得到胺对苯磺酸一氯三氮嗪-介质，再与L-色氨酸反应，得到胺对苯磺酸-L色氨酸三氮嗪-介质，即仿生亲和分离材料；
第二步，用仿生亲和分离材料纯化内切木聚糖酶
将内切木聚糖酶粗品调节pH至上样条件，上样至用结合缓冲液预平衡的装有仿生亲和分离材料的层析柱中，清洗去除未结合杂质组分，再用洗脱缓冲液从柱中洗脱内切木聚糖酶，获得内切木聚糖酶纯品。
2、根据权利要求1所述的内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述反应得到胺对苯磺酸一氯三氮嗪-介质，其反应温度为50℃。
3、根据权利要求1或2所述的内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述再与L-色氨酸反应，其反应温度为95℃。
4、根据权利要求1所述的内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖-N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚分离材料、甲基丙烯酸聚合分离材料、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖凝胶，琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺-琼脂糖复合物珠、纤维素珠或涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
5、根据权利要求1所述的内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料，其配体结构含对胺基苯磺酸结构和L-色氨酸结构。
6、根据权利要求1所述的内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，第所述的结合缓冲液pH为5.0-10.0。
7、根据权利要求1所述的内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的洗脱缓冲液pH为2.0-10.0。
8、根据权利要求1或7所述的内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的洗脱缓冲液含NaCl浓度为0.0-1.0M。
9、根据权利要求1所述的内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的内切木聚糖酶粗品，为天然微生物发酵，或通过基因工程技术改造的微生物发酵液，或菌体破碎液，包括Hypocrea jecorina发酵液。
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