JPH02104289A - 新しい着色したモノマー及びポリマー、該ポリマーの製造方法並びに該ポリマーを使用して生物学的に活性な物質を分離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新しい着色しなモノマー（ｏｌｏｒｅｄｍｏ
ｎｏ＋ｍｅｒ）に関するものであり、この七ツマ−から
いくつかの生物学的に活性な分子に対して特別の反応性
を示し、その池の分子に対しては該反応性を示さない新
しいポリマーを得ることができ。

ｄ良反応性は、ｎＩＩ記ＴＪＩＬいポリマーが、前記分
子・を、それらの間の混合物がら分離するのにとりわけ
有効である。この分離は、これらの生物学的に活性な！
１ｌＪａの分別、精１↓’Ｊ　、　１１’、　ｌ１ｌｌ
ｔ、等のいがなる公知の手順によっても行われ得るもの
である。

とりわ番フ、本発明は新しいモノマー及びポリマーに関
し、該ポリマーは−続きの七ツマ−Ｊい位によって構成
され、該モノマー単位ｉ位の各々は着色しないモノマー
（ｕｎｃｏｌｏｒＣｄ　＋ａｏｎｏｍｅｒ　）と結合し
た染料又は染料誘導体によって形成される。また、本発
明は、前記着色したモノマー単位と前記染料誘導体から
のこれらのポリマーの製造に関し、また特にそれらに限
定されるものではないが、蛋白質、ペプチド、ホルモン
、酵素、成長及び形質転換因子、核酸及びヌクレオチド
のような生物学的に活性な物質を含有する物質をいずれ
かの既知の方法により抽出し、濃縮し、分離し、単離し
、そして精製するためのこれらのポリマーの適用に関す
る。これらの方法の中で特別な例は、クロマトグラフィ
ーであり、また前記分計で、アフィニティークロマトグ
ラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇ−ｒ
ａｐｈｙ　）である。

また、本発明は、在来のモノマーと結合された染料及び
／又は染料誘導体、並びに結局その他の化学物質と結合
された染料及び／又は染料誘導体によって構成されるこ
れらの新しいポリマーの部分を形成するモノマー嘆位に
関し、この単位はこのあとに着色したモノマーとして示
される。

使用される「染料又はその誘導体」の用語は、在来の着
色及び染色工程において染料として使用されるとき染色
力の値それ自体の如何を問わず染色力を存する任意の化
合物を指す。

１吸Δ１１ 生物学的に活性な分子を含む物質の精製は、最近の生物
工学の主な問題の一つである。この数年間に開発された
新しい方法、例えば、遺伝子工学によるこれらの物質の
き成は、当該分子が、多かれ少なかれ該分子に伴う他の
型の分子と混じって得られるという欠点を有する。また
、これらの分子の多くは、得られるべき分子の特性と同
様な特性を示し、これはこれの分子の分離を困難にする
。

したがって、生物学的に活性な物質、特に蛋白質のその
多くの不純物からの完全な分離は、面倒であり、また困
難であり、通常それを得ることを可能にする合成法より
も大きな困難を示す。

他方では、この精製の要求は、製造される生物学的に活
性なすべての物質に共通であるが、しかしそれは人間用
の製薬として使用される物質、例えばインシュリン又は
インターフェロンの場合において一層大きい。

その結果として、多少入組んだ種々の技術が、開発され
、当該物質をその他の物質又は該物質に伴う不純物から
分離することに向けられた１通常使用される技術は、特
に分別結晶、液−液抽出（ｌｉｑｕｉｄ−１ｉｑｕｉｄ
　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）　、ペーパークロマトグラフ
ィー、薄層クロマトグラフィー又はカラムクロマトグラ
フィー（Ｌｈｅ　ｐａｐｅｒ、　ｔｈｉｎ　１ａｙｅｒ
　ｏｒｃｏｌｕｍｎ　ｅｈｒｏｍａｔｏｌｌｒａｐｈｉ
ｅｓ）　、ｉＪ々の電気泳動法及びイオン交換、高性能
液体（ＩＩＩ’ＬＣ）　（ｔｈｅ　１ｏｎｉｃｅｘａｈ
ａＢｅ、　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１ｉｑ
ｕｉｄ）及びさらに最近は、アフィニティークロマトグ
ラフィー及び分子排除クロマトグラフィー（Ｌｈｅ　ａ
［１ｎｉｔｙａｎｄ　　輪ｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｅｘｃ
ｌｕｓｉｏｎ　　ｃｌ＋ｒｏｍａＬｏｇｒａｈｉｅｓ）
　　である。

これらの技術群の中には、該関連物質と適切な試薬の間
の相互作用に基くものがあり、その相互作用は、存在す
る他の物質又は不純物と同試薬の間では起るものではな
い、したがって関連物質は、前記試薬に固定され、一方
、他の物質又は不純物は該試薬に付かない、関連物質と
試薬の生成物（ｔｂｅ　　ｐｒｏｄｕｃｔ　　５ｕｂｓ
ｔａｎｃｅ　　ｏｆ　　１ｎｔｅｒｅｓｔ／ｒｅｕｇｅ
ｎｔ）は、次に、該試薬に付加されないその他の物質又
は不純物から分離される。その後、適切な処理により、
試薬はその関連の物質から分離され、がくして当該関連
物質を、他の物質又は不純物を有する初期の混合物にお
ける当該関連物質の純度よりもずっとまさった純度で得
る。

この発明に包含される生成物は、この関連物質と試薬の
特別な反応に基づくすべてのこれらの物質の精製プロセ
スにおいて適用されるために本質的に有効であり、これ
らのプロセスにおける重要な改良を疑いなく、可能にす
るものである。

これらの技術の中で、通常、クロマトグラフィー技術が
卓越しており、これは、また、単離、精製等が行われる
べき単一又はＩｖｌの物質の状態により、また選択され
た技術において影響を及ぼすか又は介在する前記物質の
単一又は複数の特性により種々の変形を有する。例えば
、分子排除クロマトクラフィーは単離されるか又は精製
されるべき溶質の寸法及び形態に基づき、一方イオン交
換クロマトグラフィーは、溶質の電荷及び酸−塩基特性
（ａｃｉｃｌｂａｓｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）に基づ
く。

いわゆるアフィニティークロマトグラフィー（ヘイ及び
ディーン（ｆｌａｙ　＆　Ｄｅａ口）、化学と工業（Ｃ
Ｉ＋ｅ＋＊、　ａｎｄ　Ｉｎｄ、）　、１９８１年、７
２６頁）に、クロマトクラフィーカラムを構成する粒子
、分子又はマトリックスの間に位置させられる他の分子
（結合（ｂｏｎｄ）　）と溶質の特別の連合（ｕｎ　ｉ
ｏｎ　）又は結合（ｂｏｎｄ）　　（非共有相互作用）
がある。例えはある種の酵素は、その特定の補酵素と、
非共有相互作用的仕方で強力に結合させられる。

この特性は、酵素を、分離されるが又は精製される酵素
の特定の補酵素又は補助因子（ＮＡＤ、ΔＮ）））を、
クロマトグラフィーのカラムの支持体を形成する粒子（
「スペーサーアーム又は基（ａｐａｃｅｒａｒｍｓ　ｏ
ｒビｒｏｕｐｓＬ＋　）の表面におかれる適当な官能基
と共有結合的に結合させ、その後自由な配位子（ｆｒｅ
ｅ　ｌｉｇａｎｄ）の溶液（補酵素）によって溶出する
アフィニティークロマトグラフィーにたよって酵素を溶
雪がら（ずなわち他の溶質から）羊雛するために使用さ
れる。同じ原理が、阻害剤、抗原、抗体、レクチン等の
ようなそめ他の結合の適用に基礎を与える。

支持体の材料として、アガロース、デキストロース（例
えば、セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　＞又はセフ
ァデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）と称される市販の製
品等）又はポリアクリル誘導体（例えばバイオゲル（［
１ｉｏ−にｅｌ　）　、）リスアクリル（Ｔｒｙｓａｃ
ｒｙｌ　）、ウルトロゲル（Ｕ巨ｒｏｇｅｌ）と称され
る市販の製品等）のようなある種の多糖が使用される。

一般に支持体の材料は選択された配位子を例えば臭化シ
アンで固定する操作の前に活性化される。それは、概し
て、クロマトグラフィーカラムにおける高い固定能力（
ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ）を達成するため
に、活性化因子（ａｃＬｉｖａｆｒ）−支持体の最もお
こり得る関係を適用する場合である９ 最近、アフィニティークロマトグラフィーカラムの分解
能が、「スペーサーアーム又は基」を適用することによ
って向上させられ、該スペーサーアーム又は基は、生物
学的に活性な当該分子の形状及び／又は形態から生した
立体障害を補償することに向けられた。該スペーサーア
ーム（例えば１乃至１７個の炭素原子のポリメチレン鎖
のような脂肪族基）は、支持粒子の表面から突出するた
れさがっている基（ｐｅｎｄｉＢ　ｇｒｏｕｐｓ）であ
り、その自由端（ｆｒｅｅ　ｅｎｄ）に配位子の基（ｌ
ｉｇａｎｄｌ（ｒｏｕｐｓ　）が結合される（（ラウェ
　シー　アール）（Ｌｏｖｅ、　Ｃ，Ｒ１）　）　、酵
素及び発酵生物工学（ｌＥｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　Ｆｅｒ
！６ｅｎｔａｔｉｏｎ　１ｌｉｏｔｅｃｌ＋ｎｏｌｏＨ
ｙ）における問題、第５版、ワイズマン　ニー（Ｗ　ｉ
　ｓｅ＋ａａｎ　、＾）：エリス　ホー、ウッド（Ｅｌ
ｌｉｓ　ｌｌｏｒｗｏｏｄ）　、チチェスター（Ｃｈｉ
ｃｈｅｓｔｅｒ）　、１９８１年、２章）。

アフィニティークロマトグラフィーの分解能が、染料と
生物学的に活性な分子、特に蛋白質の間の高い親和力の
発見により思いがけなく向−ヒさせられ、この発見かも
ととなって、支持体及び／又は着色したマトリックスを
使用してアフィニティークロマトグラフィーによってこ
れらの生物学的に活性な分子が分別された。この発見に
ついては、ヨーロッパ特許ＥＰ　６５２８６の解決法（
ボエリンガ−　マンハイム有限責任会ＬＬ　（Ｂｏｅｌ
＋ｒｉｎｇｅｒＮａｎｎｈｅｉｍ　Ｇｍｂｈ）　） ヨーロッパ特許Ｅｌ＋　１８３１９８の解決法（アサヒ
化学工業株式会社（＾５ａｈｉ　Ｃｂｅｍｉｃａｌ　Ｉ
ｎｄ、　Ｃｏ、　Ｌｔｄ、　）ＰＣＴ国際公開−０８４
／４３０９の解決法（ファーマシア　ニービー（Ｐｌ＋
ａｒｍａｃｉａ　ＡＢ）　）ヨーロッパ特許ＥＰ　９４
６７２の解決法（トーレ工業株式会社（Ｔｏｒａｙ　Ｉ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）　）ヨーロッパ特許
ＥＰ　２７２８２の解決法（デュポンド　ネモアス　イ
ー　アイ株式会社（Ｄｕｐｏｎｔ　ｄｅＮｅｍｏｕｒｓ
　Ｅ、１．　ａｎｄ　Ｃｏ、）　）ソヴイエト社会主義
共和国連邦Ｓ０１１６８５６４　　（全連邦応用微生物
学科学研究所（＾ＩＩ　Ｕｎｉｏｎ　５ｅｉｅｎｔ１１
ｉｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｌ＋　Ｉｎｓ、、　ｏｆ　ａｐｐ
ｌｉｅｄ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏＨｙ）ドイツ（西）Ｄ
Ｄ２０４（ドクトル学位保持者の自然科学アカデミ−（
＾Ｋａｄｅ＋ａｉｅ　ｄｅｒ　Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆ
ｔｅｎ　ｄｅｒ　ＤＤｒ）　） ヨーロッパ特許Ｅｌ’　６４３７８の解決法（公衆衛生
試験局（Ｐｕｂｌｉｃ　ＩＩｅａｌｔｌ＋　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ　［１ｏａｒｔｌ）ソヴイ
エト社会主義共和国連邦Ｓ０９７９３６４　（ピロボッ
　エヌ　アイ（［’ｉｒｏｇｏｖ、　Ｎ、１．）　：モ
スクワ国立医学協会（Ｍｏｓｃｏｗ　５ｔａｔｅ　Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　１ｎｓｔ、）　）英国（：８１６０２Ｃ１
２（連合王国原子両局（ＵｎｉｔｅｄＫｉＢｄｏｍ　　
八ｔｏｍｉｃ　　Ｅｎｅｒｇｙ　　ＡｕＬｂｏｒｉｔｙ
）　　）英国Ｕに特許口Ｃ２０５３９２６の解決法ＵＳ
　４５４６１ｆ３１（連合王国の国防大臣） ヨーロッパ特許ＥＰ　２０９２８４の解決法くインペリ
アル化学工業（Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃｂｅｍｉｃａｌ　
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）　）に開示されている通りであ
る。

したがって、以前の技術は、ある種の染料の、及びそれ
に付加された染料を有するある種のマトリックスの、蛋
白質、ペプチド、ホルモン、酵素、成長及び形質転喚因
子、核酸及びヌクレオチドのような生物学的活性を有す
る物質との親和性を開示した。この親和性は、カラムま
たはマトリックスをｊ吏ってこれらの物質を分別、精製
するために適用され、その場合において、染料分子は本
来１！！（着色のマトリックス（アガロース、デキスト
ラン、ポリアクリレート又はポリアクリルアミド等及び
それらの組合せ及び変形で形成された）に、直接に、又
は［スペーサーアーム又は基」　くラウェ（１，ｏｗｅ
）著作参照）の中間位’ｊｌｌ　（１ｎｔｅｒｐｏｓｉ
ｔｉｏｎ）と−緒に付加される。これらのスペーサーア
ームは配位子の付近におけるより大きな立体的自由（９
ｔｅｒｉｃ　ｆｒｅｅｄｏｍ）を可能にする。

ｕＬ１札 本発明は、染料又はその誘導体に前もって結合されてい
る在来のポリマー及び結局同様に染料とモノマーの一部
分（ｍｏｉｅｔｙ）の間に位置させられる「スペーサー
アーム」又はその他の化学基（Ｃ）１ｅｍｉｃａｌ　ｇ
ｒｏｕｐｓ）に前もって結合されている在来のモノマー
を重合させることが可能であることに基づく。

これらの着色したモノマーの重合は、それらの化学構造
中に、初めの七ツマー中に存在する染料を含む製品を生
じさせる。

これは、染料と前もって形成されている無着色のポリマ
ーの結合に基づく、今まで知られているすべてのものと
の大きな差を構成する。

着色したモノマーは、特定の特性を有する共重合体を得
るためにその他のアクリル又はビニル又はアリル型モノ
マーと共重合させることもできる。

該ポリマーは、不溶性網状の着色したポリマーを得るよ
うに架橋剤（例えば２機催アクリル誘導体）と共同して
得られる。

また一方では、種々の在来のモノマーに、及び種々の染
料に基づく混合ポリマーが得られるように種々の着色し
たモノマーが混合されても良く、かくして得られる最終
製品の特性を任意に変えることができる。

したがって、その構造が染料又はその誘導体と化学的に
結合されている重合性機能（ｐｏ　ｌ　ｙｍｅｒ　１ｚ
ｕｂｌｅ　ｒｔ＋ｎｃＬｉｏｎ）を含む構造を有する新
しいモノマー（着色したモノマーと称する）が本発明の
内容である。

本発明のもう一つの内容は、精製されるべき当該物質と
の親和性を有する、染料又はその誘導体からの新しい着
色したモノマーである。

本発明のもう一つの課題は重合させられた着色したモノ
マーを含む着色したポリマーである。

本発明のもう一つの目的は、当該物質に対する最終ポリ
マーの親和性を高める「スペーサーアーム又は基」又は
その池の構造又は化学機能の着色したモノマーへの結合
である。

本発明のさらに別の目的は、生物学的に活性な物質との
選択された反応のために特に有効な着色したポリマーを
形成する、これらの着色したモノマーの重合方法である
。

本発明のもう一つの目的は、上記着色したポリマーが介
在している生物学的活性を有する物質の分留、精製、屯
離等の方法である。これらの方法は、ｆ＋￥製されるべ
き物質の着色したポリマーとのＬσ接の物理的混合から
、アフィニティークロマトクラフィーの最も複雑な技術
までのすでに公知の技術のいずれでも良い。

」−記生物学的活性を有する物質の中で、次のもの、す
なわち、蛋白質及びペプチド、ホルモン、酵素、成長及
び形質転換因子、核酸及びヌクレオチドがｔνに適切で
ある。

本発明において、１染料」の概念は、すべての公知の染
料を含み、カラーインテックスに含まれているものもい
ないものも含み、またそのすべての誘導体を含む。

「モノマー」の概念は、ビニルモノマー（酢酸ビニル、
ジビニルベンゼン、スチレン等）、アクリルモノマー（
アクリ酸又はメタクリル酸及びそのアルキルエステル、
アクリルアミド、特にＮ−（２−ヒドロキシ−１，１−
ビス（ヒドロキシメチルエチル）−２−プロペンアミド
（Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１−ｂ　ｉ　ｓ（ｈ
ｙｄｒｏｘｙｍｅＬｈｙ　ｌ　−２−ｐｒｏｐｅｎａ＋
ｎ　１ｄｅ）　　（Ｃへ５ｌｔＮ　１３８８０−０５−
２　＞及びＮ、Ｎ−メチレンビス２−プロペンアミド＞
　（Ｎ、Ｎ−＋肉ｅＬｌ＋ｙｌｅｎｅｂｉｓ（２−ｐｒ
ｏｐｅｎｎｍｉｄｅ）　（ＣＡＳ　ＨＮ　１１０−２６
−９　＞のようなＮ−ｉ換アクリルアミド、アリルモノ
マー（１又は２機能（ｎ。

ｎｏ−ｏｒ　１）１１ｏｎｃｔｉｏｎａｌ）のもの）及
びその他のすべての公知のモノマーのような公知の単独
又は共単合物質のいずれをも含む。

ｎｉｒ記のことによって、着色したモノマーにおいて、
染料又はその誘導体は、着色しない、即ち無着色のモノ
マーに直接に結合されるか、又は［スペーサーアームＪ
を通して又はいずれかの他の化学基を通して結合されて
も良いことが理解される。

これらの１−スペーサーアーム」及びその他の化学基は
、着色したモノマー分子の他の位置に存在しても良く、
さもなければ着色したモノマーの重合中に着色ｊ−たモ
ノマーに組入れられても良い。

重合のために、一種の着色したモノマーかさもなければ
一種以上の着色した七ツマ−が使用でき、単独で、又は
他の種類の製品、例えば無着色の在来のモノマー、スペ
ーサーアームを作ることができる物質、又は一般にいず
れかの他の化学物質によって伴われるかのいずれであっ
ても良い。

また、最終製品く着色したポリマー）は、単独で使用さ
れるか、又はその濃度が混合物又は配合ｉ１ｚ　（ｃｏ
ｍ）＋１ｎｕｔｉｏｎ）全体の０．１％以下ではないと
いう唯一の条件の下で、他のマトリックス、化学物質、
又は不活性な又は活性な材料と結合され、配合又は希釈
されてず「た川されても良い。

本発明によって得られる着色したモノマーの重合は、常
用の技術によって確立される方法に従う。

重合法、即ち乳化重合、溶液■「合（水性又は有機相）
、縮重合、ランダム重合又はフロック重合等（各場合に
ついて適切な触媒と開始剤を用いる）の選択は、明らか
にｊｘ択される着色したモノマーに依存する。また重合
法は、多孔性、剛性等の得られるマトリックスについて
望まれる特性に本質的に依存する。

１弊へ１鮭Ｉｔ肌 本発明の面（ｌｓｐｅｃｔａ）の一つは、アクリルモノ
マーによって形成される着色したモノマー、反応性ブル
ー（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｂｌｕｅ）　２及び／又は反応
性レッド（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｒｅｄ＞　１２０の染料
の誘導体によって形成される着色したモノマーに言及す
る。

これらの着色したモノマーは、単独で、又は他のモノマ
ーの存在下で重合される。得られる着色したポリマーの
最終の特性は、試薬の相応する割合、他のモノマー、「
スペーサーアーム」等の存在又は不存在、及び各場外に
３ｍ用される！Ｉ【合条件に関連するものである。なお
、これらの特性は、試薬による処理か又は得られるポリ
マーに都合のよい方法によって変えることができる。

反応性ブルー２は式： この式において、Ｉｔは２．３又は４の位置、好ましく
は２の位置のＳＯ，Ｎａ基である、を有する染料である
。

この染料について受は入れられている伝統的な式は、メ
タとバラの位：ｒＣにリングＡの硫酸基を有する異性体
の混合物に相当することがその点で指摘されるべきであ
る。現在、実際、染料が前記の式で示された、すなわち
、オルトの位置の硫酸基を有する構造に相当することが
Ｊ２められている。

しかしこれらの異性体及びその混合物のいずれも通常「
反応性ブルー２」我々がそれらの存在に関して採用した
名称で称される。

また一方では、反応性レッド１２０は、次の式： の通り、その分子内に二つのトリアジン基を含むアゾ染
イ゛１である。

これらの二種の染料は、科学文献に、マトリックス又は
着色した製品の使用による生物学的活性を有する物質の
精製の特別の利用について今まで最も言及されているも
のである。すべてのこれらの場合において、存在する文
献は、まざりけのない又は適切な塩に添加した染料及び
その誘導体の利用に言及しているが、しかしこの特許に
包合される新規なこと、すなわち前記染料及びその誘導
体が着色したモノマーの部分を形成することができ、該
着色しなモノマーから生物学的活性を有する分子の精製
に特に適したポリマー及びその誘導物質が得られること
は、かつて予知されなかったことである。

本発明に包含される着色したポリマーは、生物学的活性
を有する物質（分子）、特に蛋白質及びペプチド、ホル
モン、酵素、及び成長及び形質転換因子、核酸及びヌク
レオチドを吸着させ、固定させる着色したポリマーの能
力及び当該物質に対する特異性（ｓｐｅｃ１１ｉｃｉｔ
ｙ）で卓越しており、当該物質は、最終の着色したポリ
マーの上記化合物を規制することによって得られる。こ
の吸着及び固定能力及びこの特異性は今まで公知のシス
テム、物質又は機構のいずれかを使用して得られるもの
よりもまさっている。

したがって、例えは、適切なマトリックス（ラウェ著作
参照）に染料を固定させること（ｄｙｅ　１ｎｎｏｂｉ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）によって作成される在来のアフイニ
ティークロマトタラフィーカラノ、は、相当する着色し
たモノマーの重罰によって得られる非常に似た組成のマ
トリックスよりもＡ’　Ｌ　＜劣った能力を有する。

一 【し７１２岨妃伝↓」ト姐んｔ瞑しｋよノーてニー０冷
」唄 調製は中間化合物（１）から始められ、次のように進む
。

（以下、余白） Ａ　中間化合物（ＩＩ）の合成 ２５００　ｒｍｌの水に溶解された０、２モルの中間化
合物（１）の溶液に、微細に分割された粉末の形態の０
．２２モルのｐ−アミノアセトアニリドが、機械的攪拌
をしながら室温で添加される。Ｐ　）Ｉは、１時ｔｍの
間２０％炭酸ナトリウム溶液の集合体（ａＢｒＢａＬｃ
）で７に保たれる１次いでそれは、機械的攪拌を継続し
て、かつ常に上記のようにｐ　Ｉ−１を７に調節して４
０℃に加熱される。

化学反応の達成は、中間化合物（１）のないことについ
て、ペーパークロマトグラフィーによって確認される。

Ｂ、中間化合物（ＩＩＩ）の合成 中間化合物（ｎ）の上記溶液に、ｐ　Ｈ１３まで濃水酸
化ナトリウム溶液が加えられ、次いで９５°Ｃに加熱さ
れ、−時間の間開温度に維持される。

反応の終点はシリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（
ｔｌ＋ｉｎ　１ａｙｅｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ）によって決定され、中間ｆヒ合物（１りがないこと
を確かめる。

中間化合物（Ｉ［ｌ　）は、ＰＨを７に調節し、溶液を
５〜ｌＯ度Ｃに冷却し、沖過して栄離される。

得られる濾過ケークは中間化合物（＋１）を含み、これ
は、７５℃で炉において直接に乾燥される。

Ｃ１中間化合物（ＩＶ）の合成 ２５００　ｍｌの水中の０．２モルの中間化１　（１）
の０，２モルに粉末の形態の０．２モルの中間化合物（
Ｉｌｌ）が加えられる。この混合物は、５０〜６０℃で
加熱され、Ｐ　Ｈは、２０％炭酸すトリウム水溶液を徐
々に添加して７に保たれる。

反応が完了すると、ｐ　Ｈは安定する。遊１＠シた中間
化合物（１）及び（ａｌ）のいずれもないことが薄層ク
ロマトグラフィーによって確かめられる。

この反応混合物は、単離なしに次の段トド？において使
用される。

Ｄ、中間化合物（Ｖ）の合成 前の中間化合’Ｍ　（ＩＶ　）の溶液に　、１モルのへ
キサメチレンジアミンと０．２モルのピリジンが加えら
れる。この混合物は、−時間の間８０℃で加熱され、中
間化α物（ＩＶ）のないことは、シリカゲル板上の薄層
クロマトグラフィーによ−１て１ｉＹｔかめられる。

得られる中間ｆヒ合物（Ｖ）は、ｐ　Ｉ（を７に調節し
た後、５〜１０度Ｃで冷却し、濾過して単離される。良
好な純度の状態の中間化合物（Ｖ）を含む濾過ケークは
、直接に７５℃で乾燥される。

Ｅ、アクリルトシル無水物（八ｃｒｙｌｉｃ　Ｔｏｓｙ
ｌ＾ｎｈｙｄｒｉｄｅ）の入手 アクリル酸カリウム（又はアクリル酸リチウム、アクリ
ル酸ナトリウム又はアクリル酸アンモニウム）のジメチ
ルホルムアミド溶液と塩化トシルのジメチルホルムアミ
ド溶液が調節され、それらの溶質の等モル比で室温で混
合される。アクリルトシル無水物の溶液は直接に得られ
る。

同じ結果が、等モル比で混合されるトシル酸カリウム（
又はトシル酸リチウム、Ｉ・シル酸ナトリウム又はトシ
ル酸リチウム）のジメチルホルムアミド溶液と塩化アク
リロイル（ａｃｒｙｌｏｙｌ　ｃｈｌｏｉｉｄｅ）のジ
メチルホルムアミド溶液から出発して得られる。

Ｆ、着色したモノマー（Ｖｌ）の合成 水２５００　＋ａｌ中（７）　０．２モルノ中間化合！
ｔｌｖ）の溶液か調製され、ｐ　）Ｉが充分な量のトリ
エチルアミンを加えることによって９．５に調製され、
次いで溶液は０〜５℃で冷却される。

この溶液に、前記説明Ｅに従って得られたアクリルトシ
ル 滴下される。ｐＨが、必要ならばいくらかの量のトリエ
チルアミンを加えることによって９〜９．５に維持され
る。薄層クロマトグラフィーによる反応の制御が最初の
溶液中に中間化α物（Ｖ）がないことを示すとき、アク
リルトリエチルアミン無水物の添加は終えられる。

生成物（■）の単離は、酢酸でＰ　Ｉ［を５に調節し、
５％塩化カリウムを添加し、次いで溶液を遠心分離機に
かけることによって行われる。

得られる沈殿物は、アセトンの存在下で遠心作用によっ
て二度洗浄され、次いで室温において直空内で乾燥され
る。

得られる生成物は、本発明において特許請求された着色
したモノマーの一つであり、それが一部を形成ずろポリ
マーは１本発明の他の１求の範囲を構成する。

例１ 梢り色上」ζ−ヱ」Σり工しクニ久久−訓−１（２０℃
の１０　ｍｌの蒸留水中に、例１により調製された４０
０　＋ｌ＋８の着色したモノマーが溶解されろ。

そのｌ容ン疲（こ８７３＋ｎどのＮ−（２−ヒドロキシ
−１゜１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）−２−プ
ロペンアミｌ＜　（ＣＡＳ　ＲＮ　１３８８０−５−２
＞及び２７＋ｎｇのＮ、Ｎ−メチレンビス（２−プロペ
ンアミド）（ＣＡＳ　ｌｔＭ　１１０−２６−９）が溶
解される。

充分な溶解が得られたら、１０％ｌｌ／１１で０．２５
【１）１の過硫酸アンモニラｌ＼が加力られ、！］ヨ合
がＯ乃至５０°Ｃの間の温度で自然に進むにまかせて、
加ｒ二する。重合か終了したら、得られた１勿質は、蒸
留水で洗浄され、ＩＭのＮａＣｆ！で洗浄され、最後に
エタノール−水混合物（ｅｔｈａｎｏｌ−ｗａｔｅｒ　
ｍ１ｘｔｕｒｃ）で洗浄されろ。かくして得られた三次
元７トリツクスは水に不水溶で＋Ｆ）す、多孔の形７１
を有し、各マトリックスのｍ１！につき　１０　ｍｇ以
」二の染料を含む。

λ１ 上記例において得られた着色した７トリツクスを用いて
、クロマトグラフィーカラムが形成される。１０　ｍｌ
の燐酸塩緩衝塩水中の４００…ビの卵アルブミン溶液が
、前記クロマトグラフィーカラムを通し′Ｃ循環させら
れる。蛋白質の吸着が終わると、カラムは燐酸塩Ｍ街塩
水（又は酢酸緩街液）によって洗浄され、未結合のアル
ブミンが除かれる。着色したマトリックスが高濃度の臨
水溶液によって洗浄され、吸着された卵アルフミンが溶
離され、マトリックスがら分離される。可逆的に吸着さ
れな卵アルブミンの量か決定される。各７トリツクスの
ミリリフ１〜ルについて１０〜２０＋ｎ（（のアルフミ
ンが可逆的に吸着された。

クロマトグラフィーカラムの製作、精製されるべき液体
の循環、着色した７トリツクスからの吸着された蛋白の
分離及びその通宝は、この１ｆ門におい′ζ曲用される
通常の技術及び方法を適用ずろことによって行われる（
例えば［アフィニティークロマトクラフィー１インデユ
　バリク（１ｎｄｕ　ｌ’ａｒｉｋ１１）及びペドロ　
クアトレカサス（１’ｅｄｒｏ　ＣｕａＬ　ｒ　ｅ　ｃ
　ａ　！（ｕ・ｌ）、ケミカル　アンド　エンジニアリ
ンク　ニュース（Ｃ１１ｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ＥｎＨ
ｉｎｅｅｒｉＢ　Ｎｅｕｓ）、［ｉ：Ｊ　＠　、　１９
８５年８月２６１］、１７〜３２−１丁、さもなければ
「アフィニティークロマトグラフィー」ラウェ　シー　
アールはｏｕ＋ｅ、Ｃ，ｌｉ）及びデイーン　ビー　デ
イ−ジー（Ｉｌｅａｎ　Ｐ、［１，Ｇ、）による、ウィ
リー国際化学（Ｗｉｌｅｙ−１ｎＬｅｒｓｃｉｃｎｃｅ
）　、ロンドン、１９７４年、さもなければ［蛋白質及
び酵素技術における反応性染料（Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄ
ｙｅＳｉｎ　ｐｒ。

ｊｅｉｎ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｔｅｃｎｏｌｏＨｙ
）りｌコニス　ワイプイー　（Ｃ１ｏｎｉｓ　Ｙ、Ｄ、
）　、アトキンンンテイー（八ｔｋｉ！３ｏｎ　Ｔ、）
、ブルドン　シー　ジエ−（１ｌｒｕＬｏｎ　Ｃ。

Ｊ）及びラウェ　シー　アール（Ｌａｌ１ｅ　Ｃ，Ｉｔ
、　）による、マクミラン　ブレス株式会社（Ｌｈｅ　
Ｍ！Ｉｃｍ１ｌｉｕ＋１１’ｒｅｓｓ　ｌ、ｊｄ、）　
、Ｔ７ンドン、１９８７年を参［Ｋ（せよ）。

例ＺＬ ４００悄ビの反応性ブルー２（Ａ）が４０℃のジメチル
ホルムアミド溶液め１０　＋ｎｌ中に溶解され、２７０
　ｍＨのへキサメチレンジアミン及び４０ｒｎＨのピリ
ジンが添加され、次いで温度が７５°Ｃにされ、４乃至
６時間保たれる。

次いで、０．５〜０．８＋Ｍｌ！の１０　Ｎ　ｃ７）　
ＮＩＩＮが、ｐトＩ＝２に達するまで添加される。溶液
は１０分間の間攪拌され、次いで４０ＩＴ１１の蒸留水
中に溶解されたＮａｃｅの９ｇが加えられる。染料沈殿
物が濾過される。

濾過ケークが、７０℃の蒸留水中にｐ１１２で再懸濁さ
れ、再び枦通されて、過剰のへキサメチレンジアミンが
除かれる。得られた中間化合物は７（）・〜８０’Ｃで
乾燥される。この中間化合物は：＋ｍｌのトリエチルア
ミンの存在下に１０　ｍｌのジメチルホルムアミド中に
溶解され、温度が３０℃に調節され、次いで１００　ｍ
Ｈの塩化アクリロイルが加えられ、その後、２時間の間
攪拌される。中間化合物のアクリル化が完了すると、Ｎ
ａＣｅの飽和溶液の３５＋ｅ／が加えられる。混合物は
１５分１ｍ攪拌される。次いで１０　Ｎの１１０１の３
．５　ｍｌが加えられ、次いで溶液は更に１５分間攪拌
される。

得られた生成物は濾過され、５０℃で乾燥される。

このようにして、ブルーの着色したモノマーが得られ、
これはこの特許において特許請求されたものに相当する
。

注・同じ着色しなモノマーか、実施例１のＦにおいて述
べられた条件により、アクリルトシル無水物との直接反
応−によって上記中間化合才物から得られる。

例−１ ηノ諭：ゆ隨−色↓たマトリックｖ１でリマーの１井糞
−曲の例により調１畏された着色したモノマーかへ出発
して、着色したマトリックスポリマーが調製され、実施
例２において示されたように続ける。

マトリックスのｍｌあたり少なくともｆｌｍｇの染ｒ１
を陰むポリマーが得られる。

例コＬ 前の例によって得られたマトリックスを用いて、例３に
示したように続ける。最後にポリマーの各マトリックス
１１Ｉｅあたり　１０〜２０＋ｎＨのヒト１１１１清ア
ルブミンが固定されることが見い出された。

代　　理　　人 弁理士　弐　ｒｆｌ　　ＬＩＥ　　彦 弁理士　　滝　　口　　昌　　−Ｉｌｌ弁理士　　　中
　　里　　浩　　−

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）染料に化学的に結合されている重合性部分又は基
   によって構成されていることを特徴とする新しいモノマ
   ー。
2. （２）重合性部分又は基が、直接の方法で染料に化学的
   に結合されていることを特徴とする請求項１に記載の新
   しいモノマー。
3. （３）重合性部分又は基が、スペーサーアームを通して
   染料に化学的に結合されていることを特徴とする請求項
   １に記載の新しいモノマー。
4. （４）重合性部分又は基が、アクリルアミド及びそのＮ
   −置換誘導体、メチル又はエチルのアクリレート又はメ
   タクリレート、アクリロニトリル（ａｃｒｙｌｎｉｔｒ
   ｉｌ）、Ｎ−（（２−ヒドロキシ−１、１−ビス（ヒド
   ロキシ−メチル）エチル）−２−プロペンアミド又はＮ
   、Ｎ−メチレンビス（２−プロペンアミド）のようなア
   クリル誘導体に相当することを特徴とする請求項１乃至
   ３のいずれか一項に記載の新しいモノマー。
5. （５）重合性部分又は基がアクリル誘導体の混合物に相
   当することを特徴とする請求項４に記載の新しいモノマ
   ー。
6. （６）前記染料が、次の化学構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （この式において、Ｒは、２、３又は４の位置、好まし
   くは２の位置のＳＯ＿■Ｎａ基である）を有する反応性
   ブルー２及びその誘導体であることを特徴とする請求項
   １乃至３のいずれか一項に記載の新しいモノマー。
7. （７）前記染料が、 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の反応性レッド１２０又はその誘導体であることを特徴
   とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の新しいモ
   ノマー。
8. （８）請求項１乃至７に記載の少なくとも一種のモノマ
   ーの重合によって得られるポリマー。
9. （９）少なくとも一種の異なる着色したモノマーを包含
   することを特徴とする請求項８に記載の新しいポリマー
   。
10. （１０）少なくとも一種の着色してないアクリルモノマ
    ーと少なくとも一種の着色したモノマーを包含すること
    を特徴とする請求項８に記載の新しいポリマー。
11. （１１）着色したモノマー中に存在する重合性部分又は
    基が、アクリル誘導体であることを特徴とする請求項８
    乃至１０のいずれか一項に記載の新しいポリマー。
12. （１２）着色したモノマー中に存在する重合性部分又は
    基が、アクリル誘導体の混合物であることを特徴とする
    請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の新しいポリマ
    ー。
13. （１３）着色したモノマー中に存在する染料が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （この式において、Ｒは２、３又は４の位置、好ましく
    は２の位置にあるＳＯ＿３Ｎａ基である）の反応性ブル
    ー２及びその誘導体であることを特徴といする請求項８
    乃至１２のいずれか一項に記載のポリマー。
14. （１４）着色したモノマー中に存在する染料が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の反応性レッド１２０及びその誘導体であることを特徴
    とする請求項８に記載の新しいポリマー。
15. （１５）少なくとも一種の着色したモノマーの分子中に
    、１乃至１０の炭素原子のアルキル鎖によつて構成され
    、結局置換されるスペーサーアームが存在することを特
    徴とする請求項８に記載の新しいポリマー。
16. （１６）着色したモノマーを重合することを特徴とする
    、請求項８乃至１５のいずれか一項に記載の組成と同様
    な組成の線状、架橋、粒状のいずれかの形態のポリマー
    を製造する方法。
17. （１７）着色しないモノマーの存在下に着色したモノマ
    ーを重合することを特徴とする請求項８乃至１５のいず
    れか一項に記載の組成と同様な組成のポリマーを製造す
    る方法。
18. （１８）精製される物質を前記着色したポリマーと接触
    させ、該着色したポリマーに固定された前記物質を単離
    することを特徴とする、請求項８乃至１５に記載の生物
    学的活性を有する物質、特に蛋白質及びペプチド、ホル
    モン、酵素、成長及び形質転換因子、核酸及びヌクレオ
    チドを他の精製しない物質から分離する方法。
19. （１９）着色したポリマーが、アフィニティー吸着剤（
    クロマトグラフィー又は電気泳動）の部分を形成するこ
    とを特徴とする、請求項８に記載の生物学的活性を有す
    る物質を分離する方法。
20. （２０）いずれかのプロセス又は化学的又は物理化学的
    反応における、請求項１乃至７に記載の新しいモノマー
    と請求項８乃至１５に記載の新しいポリマーの使用。