JPH06501394A - アズラクトン官能性の高分子担体に共有結合で固定化した生理活性物質とその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アズラクトン官能性の高分子担体に共有結合で固定化した生理活性物質とその製 法 発明の分野 本発明はアズラクトン官能性の高分子担体に共有結合で固定化した生理活性物質 の結合比生物学的活性を高めるための、緩衝化された水性媒体中の無機および有 機のポリアニオン性の塩の使用に関する。

発明の背景 広範囲な化学反応が固体担体上にタンパク質を固定化するのに提案されている。

固体担体上にタンパク質を共有結合で固定化する場合３つの重要な条件がある。

共有結合的な固定化の速度は処理条件を容易にする。担体上の固定化タンパク質 の密度は次の反応に利用できる可能性のあるタンパク質の量を決定する。固定化 されたタンパク質の結合活性は次の反応で実際に利用できるタンパク質の量を決 める。

いくつかの活性化された高分子担体が高度にイオン性の固定化条件下でより多く のタンパク質を結合することは当該技術で知られている。例えばハンニバルーフ リードリッヒ等はオキシランーアクリルビースへのアルブミンおよびγ−グロブ リンの結合はｐＨ７，６の１，０モルのリン酸カルシウム水溶液の存在下で最大 となることを報告する。しかし固定化は最低で５時間を要する。（ハンニバルー フリードリッヒ等、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング、２ ２巻（１９８０）１５７ページ以下。）多くの有用なタンパク質の共有結合固定 化は硫酸イオンの存在下に増大することも知られている。この効果はオキシラン 官能性メタクリレート共重合体およびヒドロキシルエチルメタクリレート重合体 に関して最初に認められた。（スマラ等、バイオテクノロジー・アンド・アプラ イド・バイオケミストリー、１０巻（１９８８）、２１ページ） その技術は固定化方法の効能を明らかにするため担体上に固定化されたタンパり 質の密度と担体上に結合された活性量を報告している。

生理活性物質が高価でなく、製造および取扱いが容易なら、担体上に固定化した 生理活性物質の密度を最大にすることにより結合生物学的活性を最大にすること ができるであろう。その処理レジタは経済的な考慮を無視できる。

経済的に考慮すべき事柄には固定化処理が遅いこともある。オキシラン（エポキ シド）、プロモノアン、活性化チオール、アルデヒドおよびヒドラジッド等の活 性化された担体へのタンパク質のカンブリングは少くとも５時間、そして７２時 間もの固定化を必要とする。コールマン等、ジャーナル・オブ・クロマトグラフ ィ、５１．２（１９９０）、３６０ページの引用文献１９〜２４を参照せよ。例 えば０．５〜４０時間の反応時間で大いに普遍的で可能であると記載されている が、米国特許第４．７７５．７１４号（バーマン等）に報告された各実験は少く とも５時間固定化を必要とする。かくして固定化中に存在する硫酸アンモニウム または硫酸ナトリウムのような無機塩を用いると、担体へのタンパク質の共有結 合カップリングは受容できるタンパク質密度および結合生物学的活性をもたらす かも知れないが固定化処理は遅い。

他のものは２段階反応で高濃度の多価アニオンを使用して固体の非反応性担体上 へのタンパク質の固定化を教示する。米国特許第４．８３９．４１９号（クラエ マ−等）は非反応性担体ヘタンパク質を吸着するため硫酸塩、リン酸塩、ビロリ ン酸塩、炭酸塩、クロム酸塩、クエン酸塩および酒石酸塩を使用し、次に担体に 吸着されたタンパク質を固定化するためのグルタルアルデヒド等の試薬による架 橋を教示する。他の方法では反応性担体を使用し、タンパク質の架橋二穆の必要 を省く。実施例３および４はエポキシ官能基を有するビープの担体を用いてそれ ぞれ７２時間および８時間続く酵素固定化についてそれぞれ５５％および６１％ の結合生物学的活性および活性収率を報告する。

米国特許第４．７３７．５６０号および同第４．８７１．８２４号並びに欧州特 許公開第０３９２７３５号（すべてバイルマン等）に記載されたようなアズラク トン官能性の共重合体ピースは相当な結合生物学的活性を保持しながら、タンパ ク質を密に固定するための大きいキャパシティを有する。このキャパシティは１ 〜３ＩＩｌｅｑ／ｇビーズ質量の範囲内でアズラクトン官能性の度合とは独立で ある。さらにバイルマン等の特許または上に示した公表に記載されているように 、水性媒体におけるアズラクトン官能性の高分子担体のタンパク質との付着反応 は非常に早く、典型的には反応開始後約５分以内にカップリングの最大量の半分 に達し、３時間以下以内に完了する。

各バイルマン等の特許および上に示した保父に報告された固定化反応は、生理学 的濃度の無機のモノアニオン性塩の存在または存在なしに低濃度（例えば２５ミ ル）のリン酸緩衝液を使用して固定化を行う。固定化は３時間以下で完了する。

タンパク質固定化の場合慣用的であるように／＼イルマン等の方法での固定化の 後に、エタノールアミン等のアズラクトンクエンチャ−との反応により高分子担 体上の残存アズラクトン基のクエンチングを行う。

発明の要約 本発明は生理活性物質の共有結合固定化中の結合比生物学的活性を経済的にかつ 素早（保持する方法を提供する。

結合生物学的活性と結合比生物学的活性間の相違は固定化技術の経済にとって重 要である。

“結合生物学的活性”は担体上に固定化された後にさらなる反応のために活性の まま残り利用できる生理活性物質の量を記述する。結合生物学的活性は担体の質 量または体積当りの活性の単位で表す。

”結合比生物学的活性“は固定化された生理活性物質の全量の函数として、結合 した生物学的活性の量を記述する。結合比生物学的活性は固定化された全ての生 理活性物質のモルまたは質量に対する活性な生理活性物質のモルまたはユニット の比として表す。

結合比生物学的活性は固定化方法の効率および固定化された生理活性物質の品質 を見分ける。本発明は生物学的活性を保持しない固定化するための生理活性物質 の無駄を最小にするために、固定化の効率を最適にする方法を用いる。本発明は 固定化した生理活性物質の品質を最適にする方法を用いる。

先行技術では固定化の有用性を示すために、密度および結合生物学的活性の本当 の量を強調している。本発明は従来技術で報告されているのと同じ結合生物学的 活性が先行技術で必要であったのより小さい固定化密度で達成できることを見出 した。より重要なことには結合比生物学的活性が最適化されると、先行技術で用 いたのと同じ密度の固定化によってより大きい結合生物学的活性を達成できる。

最適の結合比生物学的活性は生理活性物質をアズラクトン官能性の高分子担体上 に緩衝された水性媒体中のポリアニオン性の塩の存在下に共有結合的に固定する ことにより達成される。アズラクトン官能性の高分子担体は早くそして容易な処 理条件下で反応するので、本発明の方法は生理活性物質の経済的な無駄なしに上 述した共有結合固定化の３つの重要な条件を満足させる生物学的に活性な担体を 製造する。

アズラクトン官能性の高分子担体上への生理活性物質の共存結合固定化方法が提 供される。その方法は生理活性物質を高度にイオン性の緩衝化された塩溶液に溶 解して生理活性物質の溶液を作り：その生理活性物質の溶液をアズラクトン官能 性の高分子担体と混合して、生理学的濃度の緩衝化された食塩溶液で形成された 生物学的に活性なアダクト担体より少くとも１０％大きい結合比生物学的活性を 有する生物学的に活性なアダクト担体を３時間以内に形成することよりなる。

高度にイオン的な緩衝化された塩溶液は約０．５Ｍからそのポリアニオン性塩の おおよそ溶解性限界までの濃度を有するポリアニオン性塩を含んでなる。

本発明は、式 （式中、 Ｒ１は水素またはメチルであり Ｒ２およびＲ３は、独立に１〜１４個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１４ 個の炭素原子を有するンクロアルキル基、５〜１２個の環原子を有するアリール 基、６〜２６個の炭素原子と０〜３個のＳ、Ｎおよび非過酸物のＯヘテロ原子を 有するアレニル基であるか、またはＲ２およびＲ３はそれらが結合する炭素原子 と一緒になって４〜１２個の環原子を有する炭素環式の環を形成し、ｎは０また は１の整数であり、 Ｘは一〇−１−Ｓ−１−ＮＨ−１またＮＲ’（式中、Ｒ４はアルキルまたはアリ ールである。）であり、そして Ｇは生理活性物質の残基であって、生理学的濃度の緩衝化された食塩溶液中で形 成され該式の生物学的に活性なアダクト担体より少くとも１０％大きい結合比生 理活性を有する。）の単位を有する生物学的に活性なアダクト担体を生じる。

本発明の一態様では水性媒体中でポリアニオン性の塩を用いてアズラクトン官能 性の高分子担体に生理活性物質を共有結合的に固定化し、最適の結合比生物学的 活性を与える。ポリアニオン性の塩は無機であってもよくまたは有機であっても よい。

本発明の第二の態様では水性媒体中で無機のポリアニオン性塩または有機のポリ アニオン性塩およびアズラクトンクエンチャ−を用いてアズラクトン官能性の高 分子担体上に生理活性物質を共有結合的に固定化する。

活性なサイトに関してタンパク質と競合するクエンチャ−が存在しても、予期し ないことに最適の密度および最適の結合比生物学的活性が見出された。

本発明の両態様は非常に早く容易な固定化を行うためにポリアニオン性の塩を用 いることよりなる。

本発明はアズラクトン官能性でない活性な担体を用いるという問題を、非常に早 い、そして達成された結合比生物学的活性を最適にする固定化方法を提供するこ とにより解決する。

本発明はまたアズラクトン官酷性の高分子担体を用いる技術を、共有結合的に固 定化した生理活性物質についての結合比生物学的活性を最適にする方法を提供す ることにより前進させる。

本明細書において： “アズラクトン官能性高分子担体“とはアズラクトン官能性の高分子または米国 特許第４．．８７１．８２４号および欧州特許公開第０３９２７３５号に記載さ れたような基材の少くとも一つの表面にコートされたアズラクトン官能性の高分 子を含んでなる物品を意味する。それの特許の開示は本明細書の一部を構成する （以後バイルマン等と総称する）。

“アズラクトン“とは式Ｉの２−オキサゾリン−５−オン基または式Ｈの２−才 キサジン−６−オン基を意味する。

“生理活性物質”とはタンパク質、抗体、抗原性物質、酵素、補足因子、レクチ ン、ホルモン、レセプター、凝固因子、ヒストン、細胞表面マーカーおよびそれ らと相互作用する物質等の生化学的に、免疫化学的に、生理学的におよび／また は薬学的に活性な物質を言う。

“無機ポリアニオン性塩”とは無機のポリ酸およびアルカリ金属、アルカリ土類 金属およびアンモニウム塩としての硫酸塩、リン酸塩、ビロリン酸塩、ピロ硫酸 塩、ヒ酸塩、ホウ酸塩等の固定化反応に用いられる水性緩衝媒体に溶解するその 塩をいう。

“有機ポリアニオン性塩”とは有機ポリ酸および無機ポリアニオン性塩と同じカ チオンのクエン酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、ＥＤＴＡ、およびこはく酸塩等の 固定化反応に用いる水性緩衝媒体中に溶解するその塩をいう。

“ポリアニオン性塩“とは少くとも一つの無機ポリアニオン性塩または少くとも 一つの有機ポリアニオン性塩をいう。

“高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液”とは水に溶解した少くとも一つの無 機または有機ポリアニオン性塩および緩衝剤をいう。

“アズラクトンクエンチャ−”とはアズラクトン官能性の高分子担体とも反応す るアミン含有、アルコール含有またはチオール含有化合物をいう。

本発明を図面を参照しながら次の本発明の実施態様によりさらに記述する。

図面 図１は無機ポリアニオン性塩の存在下に共有結合的に固定化されたプロティンＡ の量と達成された結合比生物学的活性のグラフである。

本発明の態様はバイルマン（特に米国特許第４，８７１．８２４号または欧州特 許公開第０３９２７３５号）に開示されたアズラクトン官能性高分子担体のいず れをも用いることができる。アズラクトン官能性担体に関して本出願では：“ア クリロイル”とは１−オキソ−２−プロペニルのみならずメタクリロイル化反応 より生ずる１−オキソ−２−メチル−２−プロペニルをも意味し、“アルキル” とは１〜１４個の炭素原子を有する飽和の直鎖または分枝の炭化水素から一個の 水素原子が除去された後に残る一価の残基を意味し、“アリール”とはＳ、Ｎ、 および非過酸化物Ｏから選択される３個までのへテロ原子を含んでもよい、５〜 １２個の環原子を有する一つの環または二つの融合した環または鎖状の環よりな る芳香族または複素芳香族化合物から一個の水素原子を除去した後に残存する一 価の残基を意味し、その炭素原子は３個までのハロゲン原子、０１〜Ｃ４アルキ ル、０１〜Ｃ４アルコキシ、Ｎ、Ｎ−ジ（Ｃ，ＳＣ，アルキル）アミノ、ニトロ 、シアノ、およびＣ１〜Ｃ４アルキルカルボン酸エステルにより置換されてもよ く、 “アレニル“とは６〜２６個の炭素原子とへテロ原子（ヘテロ原子は３個までの Ｓ、Ｎおよび非過酸化物Ｏである）を有するアルキルおよびアリールの両方を含 む炭化水素のアルキル部分から一個の水素原子を除去した後に残る一価の基を意 味し、 “部”とは特記しない限り重量部を意味し、“カルボキンレート”とは （式中、Ｍは水素、アンモニウムまたはＬｉ５Ｎａまたはに等のアルカリ金属で ある。）を意味し、 “マクロポーラス”とは、架橋剤または二官能性上ツマ−のレベルが２０部以上 である架橋したポリマーを意味し、 そして“ゲルタイプとは架橋剤また二官能性モノマーのレベルが２０部以下であ る架橋したポリマーをいう。

かっこの間に示した構造および式はポリマーの部分的構造である。

本発明はその表面の少（とも一つに式Ｖ：（式中、 Ｒ１は水素またはＣＨ３であり Ｒ２およびＲ３は独立に１〜１４個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１４個 の炭素原子を有するンクロアルキル基、５〜１２個の環原子を有するアリール基 、６〜２６個の炭素原子および０〜３個のＳ、Ｎおよび非過酸化物Ｏヘテロ原子 を有するアレニル基であるか、Ｒ２およびＲ３はそれらが結合する炭素原子と一 緒になって４〜１２個の環原子を含む炭素環式の環を形成してもよ（、ｎはＯま たは１の堅数である。） の単位を有するアズラクトン官能性の高分子担体を用いる。

これらの担体は架橋したアズラクトン官能性の高分子ビーズであってもよ（、ま たはその少くとも一つの表面にアズラクトン官能性のポリマーの層でコートされ た固体の基材でもよい。この層は１ナノメーターから５鉗の範囲の厚みを有する 。有用な固体の基材にはガラス、セラミックス、金属および非金属の酸化物、ク レー、ゼオライト等の無機固体および有機ポリマーがある。本発明による共有結 合固定化は次式 （式中、 Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３およびｎは前に定義したとおりであり、Ｘは一〇−１−Ｓ−１ −ＮＨ−１またはＮＲ４（Ｒ’はアルキルまたはアリールである。）であり、そ して Ｇは吸着、コンプレックス化、触媒、分離またはアダクト担体の試薬作用を行う ＨＸＧの残基である。） を有するアダクト担体を生ずる。

ＨＸＧは生理活性物質である。

バイルマン等に開示された様々なアズラクトン官能性の高分子担体の中で、上の 式Ｉに示したアズラクトン官能性を有する高分子ビーズが望ましい。バイルマン 等に開示された様々なアズラクトン官能性高分子ビーズの中では、ビニルジメチ ルアズラクトン（ＶＤＭ）とメチレン−ビス−アクリルアミド（ＭＢＡ）の約２ ０．８０のＶＤＭ：ＭＢＡ〜約５９５のＶＤＭ：ＭＢＡの範囲の共重合体のビー ズが現在好ましい。

アズラクトン官能性高分子担体はバイルマン等に開示された方法のいずれかに従 って製造される。

本発明により用いられるアズラクトン官能性高分子担体はいくつかの方法のうち の一つによって提供される。

方法工： ２段階逆相懸濁重合 本発明の方法Ｉの高分子およびアダクト担体は下の化学式１に示す方法により提 供される。

Ｎ−アクリロイルアミノ酸の塩 ■ カルボキルレート官能性担体 ■ アズラクトン官能性高分子担体 生物学的に活性なアダクト担体 ■ 式Ｖの架橋した親水性のアズラクトン官能性ポリマービーズは２工程で調製する 。第１の工程では次のグループの七ツマ−をフリーラジカル重合反応させる。

１）０〜８９モル部の少くとも一つの水溶性モノマー。

１１）１〜９９９モル部の少（とも一つのＮ−（メタ）アクリロイルアミノ酸の 水溶性塩：および ｆｆ１）０．１〜９９モル部、好ましくは７〜９９、より好ましくは１０〜９９ 、最も好ましくは３０〜９９モル部の少くとも一つの架橋性モノマー。

上の重合反応の生成物は架橋した親水性の式■のカルボキシレート官能性の担体 である。本方法の第２の工程はカルボキシレート官能性の担体を環化剤で処理し てアズラクトン官能性の高分子担体を形成することよりなる。

いく分かの親水性が、架橋剤により、および開環のアズラクトン／親核試薬の義 したＨＸＧ）により作られた官能基、すなわちアミド−アミド、アミド−エステ ルまたはアミド−チオールエステルにより与えられるが、高分子担体の親水性の 度合は用いた水溶性モノマーの量により大きく左右される。それ放水溶性モノマ ーを加えることは任意である。適当な水溶性モノマーは１００部の水中に少くと も３部の溶解度を示す。好ましいモノマーにはビニル基含有およびアクリロイル 基含有化合物がある。そのようなモノマーの代表的なリストはアクリルアミド、 メタアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルア ミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−アクリル アミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびその塩、Ｎ−（３−メタアクリル アミドプロピル）−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−トリメチルアンモニウム塩、Ｎ、Ｎ−ジメ チルアミノエチルメタアクリレート、アクリル酸、メタアクリル酸、イタコン酸 、およびそれらの組み合わせがある。好ましい水溶性モノマーはＮ、Ｎ−ジメチ ルアクリルアミドおよびＮ−ビニルピロリドンである。

Ｎ−アクリロイルアミノ酸塩モノマーは式■のＮ−アクリロイルアミノ酸のアン モニウム、ナトリウム、カリウム、およびリチウム塩を含み、等モル量の例えば 水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化リチウ ムと式■の化合物の水溶液を混合する（３０℃以下で）ことにより調製する。

（式中、Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３およびｎは前に定義した通りである。）Ｎ−アクリロ イルアミノ酸化合物はよく知られており、容易に合成できる。ｎ＝０である式■ の化合物については、適当なアミノ酸のナトリウム塩を例えばツーブナ−等、マ クロモレクユラーレ・ヘミ−１１１巻、１０９ベーノ（１９７０）に従ってアク リロイル化するか、またはより効率的にはケトンのＮ−アクリロイルアミノ酸へ のワンポット変換よりなる米国特許第４．６９４，１０３号に記載の方法により アクリロイル化する。ｎ＝１である式■の化合物については有用な製法はディー ・アイ・ホウク等、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス：ポリマー・ケミ ストリー・エディジョン、１０巻、３３１１ページ（１９７２）に開示された３ 、３−二置換アクリル酸の変換である。

不溶化は担体（例えばビーズ）の系からの容易な除去のために必要な条件である 。

これは、多数の重合可能な基を含み、その重合反応への参加がポリマー骨格の物 理的結合すなわち架橋をもたらすモノマーを加えることにより達成される。架橋 はポリマー支持物質においても望ましい。何故なら力学的な安定性が一般に実質 的に高められ、ビーズの大きさのコントロールの度合は架橋のレベルの取り扱い によって行われるからである。すなわち一般にある重合条件の場合、架橋剤量が 多いとビーズの大きさは少い。架橋度は主に担体物質の意図する用途による。す べて場合にそのポリマーはすべての溶媒に不溶であり、本質に無限大である分子 量を有する。かなり大きいキャパシティを必要とし、膨潤した高分子担体に拡散 できる比較的小さい溶質の反応パートナ−を含む多くの応用の場合、低度ないし した膨潤可能な担体（“ゲルタイプ”ポリマーと呼ぶ）は多官能性モノマーを１ 〜２０部加えることにより生じる。膨潤による低度の物理的拡張を必要とし、小 さいキャパシティを許すある応用の場合には（クロマトグラフカラムまたはカラ ムリアクター等のコンファインドフロー７ステム中で行われるある操作における ように）、２０部以上の多官能性モノマーの共重合により生ずる高度に架橋した 疎水性のシステムが利用される。これらは非膨潤性であると一般的に見なせるい わゆる“マクロポーラス“なポリマーであって溶質／担体の反応は溶媒／担体の 界面で王に起る。これらの担体の応用には、その大きいサイズのためポリマーの 網目に拡散できない大きい溶質、例えば生体高分子を含む。

水性の緩衝化された媒体中で低膨潤の状態を達成するために上に記載したいわゆ る非膨潤性の疎水性のマクロポーラスな樹脂で通常用いられる２０部より実質的 に高濃度の多官能性モノマーが必要である。これは水中のこれらの親水的な担体 の利用と多官能性モノマー自体により与えられる高度の親水性の結果である。

何故ならそれらは高度に極性の官能基より大部分なるからである。

アズラクトン官能性の高分子担体を調製するため疎水性コモノマーと親水性架橋 剤を用いてもよい。このように作られたビーズの膨潤は存在する多官能性架橋剤 の量と逆に変化する。低度の膨潤性（非膨潤体積の３倍以下）を有する高分子担 体（例えば−しょに詰めたビーズ）は実質的に２０部以上の二官能性架橋剤を必 要とする。

驚くべきことに５モル％以上の架橋剤を用いて（親水的なシステム中で）ポリマ ービーズの水中での比較的低度の膨潤性と高い結合能力がなおある。そのような ビーズはコンプレックス化剤、触媒、高分子試薬、クロマトグラフの担体並びに 酵素、他のタンパク質および他の生体高分子を担持する担体として用いられる。

低膨潤度を有するポリマービーズを達成しなお高結合能を維持するために、実質 的により多量の架橋剤が親水性のシステム中では必要である。そのようなポリマ ービーズはクロマトグラフ的応用およびカラムリアクターで特に有用である。

適当な多官能性架橋用モノマーには、エチレンンアクリリレート、エチレンノメ タクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレートおよびトリメタクリレ ート等のエチレン性不飽和（α７β〜不飽和）エステル、メチレンビス（アクリ ルアミド）、メチレンビス（メタアクリルアミド）、Ｎ、Ｎ’−ジアクリロイル −１，２−ジアミノエタン、Ｎ、　Ｎ’−ジメタアクリロイル−１，２−ジアミ ノエタン並びに式■および■： ■ ■ によって表されるような２−アルケニルアズラクトンと短鎖のジアミンの反応生 成物等のα、β−不飽和アミドがある。

架橋用モノマーは水に少くともわずかに溶解すべきであるが、水溶性モノマー成 分について記載した程には水溶性である必要はない。これはゲルタイプのポリマ ーの製造についての問題では一般的にない。何故なら比較的少量の架橋性七ツマ −が比較的大量の水溶媒と共に用いられ、水溶性のモノマー成分、特にＮ、Ｎ’ −ジメチルアクリルアミドおよびＮ−ビニルピロリドン、は架橋用モノマーの溶 解を促進するであろうからである。しかし架橋剤濃度が２０部より大きいマクロ ポーラスポリマーの場合には架橋性モノマーの溶解を促進するコソルベントを加 えることが必要かも知れない。適当なコソルベントにはＮ、Ｎ−ジメチルホルム アミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンおよびジメチル スルホオキサイドがある。

方法工で用いる重合技術はしばしば“逆相”または“逆”懸濁重合と呼ばれ、こ の技術の一般的な議論はシー・イー・シルデクネヒトおよびアイ・スカイストに より編集された“ポリメリゼーンヨン・プロセス”ウィリー・インターサイエン ス、ニューヨーク、１２３〜１２４Ｐ（１９７７）中のエム・ムンツアー等の“ サスペン／コン・ポリメリセーノヨン・フロム・ノンエクィアス・メディア”に より開示されている。通常の懸濁重合技術（水が通常の懸濁用媒体である）の逆 転が必要である。何故なら本発明のモノマーが水溶性であり、それ放水と混ざら ない懸濁用媒体を必要とするからである。

懸濁用媒体の主な目的は、重合可能な相の分散のための不活性媒体として働きの 外に、重合反応中にでる熱を放射することである。懸濁用媒体の重要な特徴はそ の密度である。均一な大きさの球形のポリマービーズを得るために、ビーズは一 度作られると懸濁用媒体中で沈みまたは浮く傾向を示すべきでない。それ故懸濁 用媒体および水相はおおよそ同じ密度であるべきである。

実際の重合は溶解したモノマーと開始剤を含む個々の水滴中で起る。水滴が懸濁 用媒体中で激しい撹拌により生じ維持され、生じたビーズの大きさおよび個別性 （すなわち凝集のないこと）は疎水性部と親水性部の両方を一般に有する表面活 性剤分子である様々な懸濁剤の添加によりコントロールされる。

本発明の方法工の工程２はカルボキシレート官能性のビーズをアズラクトン官能 性のビーズに変換することよりなる。これは環化剤（ＣＡ）を用いて行われる一 環化剤はカルボキシレート官能性のビーズと反応して、アミドカルボニル基によ り分子内攻撃を受けて化学式ＩＡによりアズラクトン基を生成する中間的な付加 物を生成する試薬である。この感受性はカルボニルにょる親核的な攻撃のための 良好な脱離基（下の一〇（ＣＡ））を形成することにより生に達成される。

（式中、Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３およびｎは上に定義した通りである。）（丸かっこの 間に示した構造および式は、環化反応に積極的に参加する側鎖を示すポリマーの 部分的な構造である。角かっこの使用は化学的な中間物又は活性錯合体という通 常の意味を有する。点線は部分的な結合を示し、δは部分的なイオン性のチャー ジを示す。） カルボキンレート官能性の担体の変換用の有用な環化剤には、例えば、無水酢酸 、無水トリフルオロ酢酸、メチル、エチルおよびイソプロピルクロロホルメート 等のアルキルクロロホルメート等がある。Ｎ、　Ｎ’−ンンクロヘキシル力ルポ ンイミド等のカルボジイミドは効果的に用いることができるが、カルポキンレー ト官能性担体を酸性化して、カルボジイミド試薬を用いてアズラクトン官能性担 体に環化することができるカルボキシル官能性の担体を作る更なる工程を必要と する。環化工程の理解を促進するために、上述の環化剤を用いることにより生じ る中間体を下に説明のために示す。

環化反応の進行は高分子担体の赤外スペクトルを調べることにより容易にモニタ ーできる。１８２０ｃｒ’におけるカルボニル伸縮吸収の出現がアズラクトン基 の証拠である。実際アズラクトン基がポリマーへの付加のための結合として有用 である一つの理由は、この赤外吸収の観測（アズラクトン官能性担体合成におけ るその出現あるいは官能性物質との後の反応におけるその消失）により反応をモ ニターする能力である。この吸収は強く、アズラクトンに非常に特徴的であり、 本質的に他の共通の吸収が認められない赤外スペクトルの領域に位置する。これ がこれらのユニークな特徴をそれらの赤外スペクトルにおいて欠いているクロロ メチルフェニルおよびオキシラン等の他の結合用官能基に優る本発明の明確な利 点である。付着反応をモニターする便利な分析法はこれらの後の基については存 在しない。

低コスト、利用し易さ、環化温度で液体状態であることのために、無水酢酸は好 ましい環化剤である。典型的にはカルボキンレート官能性の担体を無水酢酸でお おい、混合物を４０〜１００°Ｃ１好ましくは８０〜１００℃の温度で２〜２４ 時間暖める。環化反応後その高分子担体を濾過する。無水酢酸を特に好ましくす るものは環化の副生物（酢酸のアルカリ金属塩）が無水酢酸によく溶け、アズラ クトン官能性担体から容易に除去できるということである。その担体は次に直接 乾燥するか、あるいはしばしば行われるように乾燥前にアセトン、トルエン、酢 酸エチル、ヘプタンおよびクロロホルム等の非反応性有機溶媒による一連の洗浄 操作を受けさせる。

方法■・ 一工程逆相懸濁重合 方法Ｈの高分子担体は下の化学式■に示す方法により提供される。

化学式■（方法■） アルケニルアズラクトン アズラクトン官能性担体 この方法は方法Ｉて用いたそれと同じ重合技術１こより行われ、同じ水溶性モノ マーと架橋剤を用いる。王な相違はＮ−アクリロイアミノ酸塩■で１よなくアル ケニルアズラクトンモノマーＸを用いることにある。反応物の量１まアズラクト ンがＮ−（メタ）アクリロイルアミノ酸の塩にとって代る点を除くと方法■（二 つＬＸでと同じである。この方法は方法Ｉの二工程法と異なり単一の工程でアズ ラクトン官能性ポリマー担体を提供する。この方法のいくつかの面は驚くべきこ とに先行技術に照らされている。第一にアルケニルアズラクトンＸ＋を懸濁用媒 体Ｃ＝よく溶；す、なお高分子担体（例えばビーズ）に重合方法への悪し＼影響 なし１：容易４こ導入される。

第二にアズラクトン環はこの重合反応中に水相中の水により加水分解されなＬＮ ０重合反応の後にピースを例えば濾過により単離し、所望（：より一連の洗浄工 程を受けさせ、乾燥する。

有用なアズラクトンモノマーとその合成は米国特許第４．．３７８．４１１号お よび“ポリアズラクトズエンサイクロペディア・オブ・ポリマー・サイエンス・ アンド・エンジニアリング、１１巻、第２版、ウィリー、ニューヨーク、１９８ ８．５５８〜５７１ページに記載されている。両者を本明細書に導入し、その例 としては２−ヒニルー４．４−ツメチルー２−オキサゾリン−５−オン、２−イ ソプロペニル−４，４−ツメチル−２−オキサゾリン−５−オン、２−ビニル− ４，４−ジエチルー２−オキサゾリンー５−オン、２−ビニル−４−エチル−４ −メチル−２−オキサゾリン−５−オン、２−ビニル−４−ドデンルー４−メチ ルー２−オキサゾリン−５−オン、２−ビニル−４，４−ペンタメチレン−２− オキサゾリン−５−オン、２−ビニル−４−メチル−４−フェニル−２−オキサ シリン−５−オン、２−イソプロペニル−４−ベンジル−４−メチル−２−オキ サゾリン−５−オンおよび２−ビニル−４，４−ジメチル−１，３−オキサジン −６−オンが挙げられる。

好ましいアズラクトンモノマーは２−ビニル−４，４−ジメチル−２−オキサゾ リン−５−オン（これは５ＮＰＥ社、プリンストン、ニューシャーシーから商業 的に入手出来る）、２−イソプロペニル−４，４−ジメチル−２−オキサゾリン −５−オンおよび２−ビニル−４，４−ジメチル−１，３−オキサジン−６−オ ン分散重合 方法■の高分子担体は“分散重合“と呼ばれる重合方法、特には有機溶媒中の分 散重合により提供される。方法■に幾分似ているこの方法ではモノマーおよび溶 媒は最初均一である。重合開始後短時間に、ポリマーは粒子として分離し、重合 は次に不均一な方法て進む。高分子の“分散剤”または“安定化剤”を重合反応 中のポリマー粒子の凝集を防ぐために用いる。非水媒体における分散重合の技術 は当技術分野でよく知られており、例えばケエー・イー・ジェー・パレットによ る“ディスパーンョン・ポリメリゼージョン・イン・オーガニック・メディア” ウィリー、ニューヨーク、１９７５に詳細に記載されている。方法■のアズラク トン官能性の高分子担体の製造に有利であることがわかった分散重合技術はブイ ・アルモグ等、ブリティソンユ・ポリマー・ジャーナル、１９８２．１３１頁に 記載されているそれであり、本明細書に導入する。

一般に式Ｖのアズラクトン官能性高分子担体は次のグループのモノマー・ｉ）１ 〜１００モル部の少くとも一つの式Ｘのアルケニルアズラクトン：１ｉ）０〜９ ９モル部の少くとも一つの架橋用モノマー：およびｆｆ１）０〜９９モル部の少 くとも一つのコモノマー、をフリーラジカル重合反応させることにより方法■に より製造する。

この重合方法における使用のための適切なモノマーは方法Ｉおよび■に有用なも のである。しかし水溶性は分散重合における基準ではなく分散媒中の溶解性が基 準であるので、例えばジビニルベンゼン等のンビニル化合物のような他の架橋剤 を用いてもよい。

方法■による担体の製造に有用なコモノマーは方法Ｉおよび■で有用な水溶性コ モノマーを含むが、水溶性でない更なるコモノマーをも含む。事実上すべてのフ リーラジカル的に重合できるモノマーもそれが分散媒中で最初の溶解性を有する という要求を条件としてコモノマーとして利用してよい。

例としてはスチレン、α−メチルスチレン、２−および４−ビニルケトンン等の ビニル芳香族モノマー：アクリル酸、メタアクリル酸、イタコン酸、マレイン酸 、フマール酸、クロトン酸等のα、β−不飽和カルボン酸；メチルメタクリレー ト、ブチルメタクリレート、２−エチルへキシルメタクリレート、エチルアクリ レート、ブチルアクリレート、イソ−オクチルアクリレート、オクタデシルアク リレート、シクロへキンルアクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレー ト、フェニルアクリレート、フェネチルアクリレート、ペンシルメタアクリレー ト、α−ンアノエチルアクリレート、無水マレイン酸、ジエチルイタコネート、 アクリルアミド、メタアクリロニトリル、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミドおよ びＮ−ブチルアクリルアミド等のα、β−不飽和カルボン酸誘導体：酢酸ビニル 、およびビニル２−エチルヘキサノエート等のカルボン酸のビニルエステル、塩 化ビニルおよびヒニリデンクロライド等のビニルハライド１メチルビニルエーテ ル、２−エチルヘキシルビニルエーテル、およびブチルビニルエーテル等のビニ ルアルキルエーテル：エチレン等のオレフィン：Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ −ビニルカルバゾール等のＮ−ビニル化合物：メチルビニルケトン等のビニルケ トン、およびアクロレインおよびメタアクロレイン等のビニルアルデヒドがある 。

分散重合の当業者によく知られているように、モノマーまたはモノマー混合物を 溶かすが、それが生じた時ポリマーを沈澱させる不活性な希釈剤または分散媒を 選択しなければならない。これは架橋したポリマーを作る場合特有の問題を提供 する。何故なら架橋したポリマーはすべての溶媒に不溶性であるからである。

それ故架橋したマスの生成よりむしろ重合反応中に個別的な粒子の分離を促す分 散媒体を選択しなければならない。分散媒を決定しあるいは個々の媒体中で分散 重合する適当なモノマー混合物を選択する上での助けとなる概念は溶解度パラメ ーターの概念である。この概念およびその分散重合との関係は上のパレット（４ 章）により詳細に議論されている。多（の溶媒およびい（つかのポリマーについ ての溶解度パラメーター値の表ならびにポリマーおよびコポリマーについての溶 解度パラメーター値の評価の方法はポリマー・ハンドブック、ジェー・ブランド ランプおよびイー・エッチ・イムマーガツト編、第２版、ウィリー、ニューヨー ク、１９７５、■−３３７ｆｆに見出すことができる。一般にうまく分散重合を 行うためには分散媒および生成するポリマーの溶解度パラメーターが少なくとも 約１〜１．５溶解度パラメーターユニット、好ましくは１．５〜２溶解度パラメ ーターユニット以上異るべきである。それ散大部分の七ツマー混合物の場合、分 散媒として有用な溶媒にはペンタン、ヘキサン、石油エーテル、シクロヘキサン およびトルエン等の非極性溶媒、並びにメタノール、エタノール、インプロパツ ールおよびｔ−ブタノールのような極性の、ＯＨ性の溶媒がある。

方法■に有用な開始剤には分散媒中に溶解するすべてフリーラジカル開始剤があ る。開始剤の選択は該技術でよく知られるように、重合を行う温度に依存する。

５０℃または以上のような高温で有用な開始剤にはアゾビスイソブチロニトリル 等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、ｔ−ブチ ルヒドロパーオキサイドおよびクメンハイドロパーオキサイド等の過酸化物また はハイドロパーオキサイドがある。低温反応の場合、例えば室温では、例えば３ 級アミンと組合せた過酸化物またはヒドロパーオキサイド等のレドックス開始剤 を用いる。そのようなレドックス系の一つはベンゾイルパーオキサイド／Ｎ、Ｎ −ジメチルアニリンである。開始剤はモノマー組成物の０１〜１０重量％、好ま しくは０５〜２．０重量％の範囲の量で存在することができる。

上述したようにアルマグ等の分散重合方法は方法■によるアズラクトン官能性の 担体の製造に効果的Ｉこ使用されている。この方法は分散媒としてアルコールを 、開始剤としてはアゾビスイソブチロニトリルを用いる。ポリビニルピロリドン 、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリアクリル酸またはポリエチレンイミン等 の高分子の安定剤をコサーファクタントとしてアリコート３３６（ヘンケル社） と組合せて用いる。再度この方法の驚くべきそして予期しない結果はアズラクト ン官能性の高分子担体（架橋したもの架橋しないもの両方）がこの水酸基性媒体 中で一工程でアルコール溶媒のアズラクトンとの反応なしに製造できるというこ とである。

里離は間車な濾過、所望により洗浄、および乾燥よりなる。

上記した３つの方法により製造したビーズはすべてそれらの表面でアズラクトン 官能性を示すが、それらの物理的性質はそれらの製造に用いる方法に依存して広 く変る。逆相懸濁重合により製造したビーズは、大きい表面積およびボア体積を 有し非常にポーラス（すなわち１０〜９０容積％のボイド、好ましくは２０〜７ ５容積％のボイド）であり、高密度の反応性基を有する。これらのピースは、結 合能が反応のカイネティックより比較的により重要である用途に用いる。他方分 散重合により製造したビーズは一般にサイズが小さくポーラス性が少く、ある場 合には事実上ノンポーラスである。これらのビーズを用いる払戻応力イネテイッ クは非常に早く、高度なスループットな速度を必要とするもののようなある応用 に特に有用である。

方法■ 架橋しないアズラクトンポリマーによるコーティング固体担体上に示したように アズラクトン官能性高分子担体はピースの形であることができる。これは担体が 、特にクロマトグラフカラム等の用途への、大きい利用性を有する物理的な形で ある。しかしながらその新規な物質はビーズという物理的な形に制限されない。

我々はある可溶性アズラクトンポリマー（非架橋）を多くの基材上にコートする 二とができ、それらはビーズとして示したのと同じ反応性アズラクトンの官能性 をその形で示すことを見出した。かくしてこれらの基材は官能性物質との反応に 用いてもよい。例えばナイロン濾過膜およびガラス表面を、コートされるべき対 象物をポリマーの溶液に浸し、浸した対象物を乾燥させることにより、本発明の アズラクトンポリマーでコートすることができる。同様にセラミックス（例えば ンルコニウムオキサイド）等の微粒子物質またはポリエチレンの粒子等の非反応 性ポリマーをアズラクトン官能性ポリマーでコートすることができる。該技術で よく知られる他の溶液コート方法、例えばスプレーコーティングおよびナイフコ ーティング等を基材の物理的な形に応じて用いてもよい。

ンリカビーヅをアズラクトン官能性ポリマーでコートする基材として用いた場合 同様な結果が得られる。この種のビーズはクロマトグラフカラムにおけるバッキ ングとして一般に用いられる。同様にコントロールされたポアサイズを有するガ ラスピーズを用いて、アズラクトン官能性のコーティングを用いた場合明瞭に改 良されたタンパク質結合および共有結合が見出された。方法■のアズラクトン官 能性高分子担体の特有の利点はそれらの非圧縮性とほとんど完全に膨潤しないこ とである。

固体の基材上にコーティングを作るために有用なアズラクトン官能性のポリマー は当該技術でよく知られており、あるいはよく知られた技術により製造できる。

これらのポリマーは一般的に一以上のアルケニルアズラクトンの、任意的に一以 上のフリーラジカルで重合可能なエチレン性不飽和のコモノマーとのフリーラジ カル重合により当該技術分野で一般的な重合方法を用いて作られる。適当なアズ ラクトン含有ポリマーおよびコポリマーは例えばヒユーブナ−等、アンゲバンテ ・マクロモノキュラーレ・ヘミ−１１９７０年、１１巻、１０９頁および米国特 許第４，３７８．４１１号に記載されている。固体担体上へのコーティングの製 造に特に適したアズラクトン官能性ポリマーは上記アズラクトン含有ホモポリマ ーまたはコポリマーのアズラクトン基の一部を低級アルキルアミンまたはアルコ ールと反応させることにより得られる。

他の方法がアズラクトン官能性高分子担体を製造するのに用いることができる。

一つの方法はアルケニルアズラクトンを担体に塗布しく任意的に他のコモノマー と共に）、そこでそのモノマーを重合することである。重合方法には当該技術で 良く知られた光重合（適当な光開始剤を用いて）がある。

アズラクトン官能性高分子担体は今や生成し、“官能性”の基を有する生理活性 物質との反応の準備ができた。本発明において用いる“官能性”基にはヒドロキ シ、−級アミン、二級アミンおよびチオールを含む。これらの基は適当な触媒の 存在下または不存在下に下式（２）に示す親核付加反応によりアズラクトンと反 応する。

（式中、ＲＩＳＲ４、Ｒ３、ｎＳＸおよびＧは前に定義した通りである。）官能 性物質に存在する官能基によっては効果的な付着反応速度を達成するために触媒 が要求されるかもしれない。−級アミン官能基は触媒を必要としない。トリフル オロ酢酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸等の酸触媒がヒドロキシおよ び二級アミン官能基について効果的である。

現在好ましいアズラクトン官能性の共重合体ピースの場合には方法Ｈによりビー ズを作るのが好ましい。

生理活性物質 アズラクトン基はアミン、チオールおよびアルコールにより親核的な攻撃を受け る。かくして少くとも一つのアミン、チオールまたはアルコール基をその上に有 する生理活性物質はアズラクトン官能性高分子担体への共有結合固定化の候補者 である。

生理活性物質の中でタンパク質、酵素および抗原性物質が共有結合固定化に望ま しい。タンバグ質、酵素および抗原性物質の非限定的な例には、天然のおよび組 換えプロティンＡ（ＰｒｏｔＡ）、ラット（ｒ　Ｉ　ｇＧ　）、ヒト（ｈｌｇＧ ）、牛（ｂｌｇＧ）、ラビット（ｒｂＩｇＧ）およびマウス（ｍ　Ｉ　ｇＧ）等 のイムノグロブリン、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳ Ａ）、チログロブリン（ＴＧ）、アポフェリチン（Ａｆ）、リゾチーム（Ｌｙ） 、カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）、並びにバクテリアルアンチゲン（Ｂ　 Ａ）がある。固定化されたタンパク質、酵素および抗原性物質の使用はバイルマ ン等に記載されている。

現在好ましい生理活性物質は生分離における使用のその多数さの故にＰｒｏｔＡ タンパク質をアズラクトン官能性の高分子担体に共有結合的に固定するために水 性の緩衝された媒体中で無機のポリアニオン性塩を用いると、バイルマン等で用 いたＮａＣ１等の無機のモノアニオン性塩の使用と比べた時、生理活性物質の結 合比生物学的活性は２倍以上になる。

固定化のこの高められた効率は非常に早い容易な反応で達成される。予期しない ことに高濃度の無機ポリアニオン性塩を用いることは、常温で達成できる非常に 早い共有結合固定化等のアズラクトン官能性高分子担体を使用する他の価値ある 面を妨害しない。

無機ポリアニオン性塩の中で、水性媒体中での無機ポリアニオンのモル濃度と比 べて結合比生物学的活性が増加する故に硫酸塩が好ましい。ｐＨ約４〜約９に緩 衝された水性媒体中でタンパク質（金属カチオンにより活性が影響されない）を 共有結合的に固定化する時、現在のところＮａ２　Ｓ　Ｏ４の使用が好ましい。

アズラクトン官能性高分子担体上に共有結合的に固定化された生理活性物質の同 じ密度を達成するためにリン酸塩より低モル濃度の硫酸塩ですむので硫酸塩がリ ン酸塩より好ましい。この利点の証拠はコールマン等、ジャーナル・オブ・クロ マトグラフィ、５１２巻（１９９０）、３４５〜３６３ベーン中に見出され、本 明細書の一部を構成する。

有機ポリアニオン性塩 有機ポリ酸およびその塩は無機ポリアニオン性塩よりアズラクトン官能性高分子 担体への生理活性物質のより生産的なそしてより効率的な共有結合固定化を提供 することができる。有機ポリアニオン性塩はたいていの共有結合固定化が行われ るｐＨ７〜９のｐＨ範囲において無機ポリアニオン性塩より一貫してイオン性で ある。かくして有機ポリアニオン性塩はポリアニオンのモル当りより大きいイオ ン強度を有する。その結果としてより少ないモルの有機塩しか共有結合固定化の ためにしばしば必要でない。さらに無機ポリアニオン性塩よりもバラエティに富 んだ有機ポリアニオン性塩は共有結合固定化に用いる緩衝化された水性媒体に十 分に溶解する。かくして有機ポリアニオン性塩は現在のところ無機ポリアニオン 性塩より好ましい。

有機ポリ酸の候補の中で二酸、三酸および四散またはその塩が望ましい。そのよ うな酸の塩の非限定的な例はマロン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸二酸アルカリ金 属塩、クエン酸三酸およびニトリロ−トリー酢酸（ＮＴＡ）アルカリ金属塩、お よびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）四散アルカリ金属塩を含む。現在 のところ好ましい有機ポリアニオン性塩はクエン酸ナトリウムである。

水性媒体並びに生理活性物質、ポリアニオン性塩および緩衝剤の量生理活性物質 は緩衝化した水性媒体中に溶解または分散させる。

水性媒体の緩衝剤は酢酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ホウ酸塩およびグツドを 構成する）に開示された緩衝剤等の当業者に知られた他のものである。

水性媒体中のｔＩ＃剤の濃度は約２５１Ｍ〜約７５ｆ）＋Ｍ、望ましくは約ｌｏ ｏｍＭ〜５００ｍＭの範囲である。緩衝剤の現在のところ好ましい濃度は、共有 結合固定化のために選ばれたポリアニオン性塩および生理活性物質の他の濃度に よるが、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭの間である。

水性の緩衝化された媒体中のポリアニオン性塩の濃度は最低で有用な量から緩衝 媒体中での塩の溶解限界までである。この範囲はポリアニオン性塩を含む水性媒 体中の生理活性物質の溶解限度によっても影響される。説明のためにのみいえば ］、５ＭのＮａ、Ｓｏ４濃度がＰｒｏｔＡについての使用では受容できるのに対 し、ｈＩｇＧについてはその沈澱を防ぐために領７５Ｍ濃度を使用すべきである 。

望ましくは様々な水性の緩衝化された媒体についてのポリアニオン性塩の濃度は 、生理活性物質の濃度を考慮に入れて、約０．ＩＭから、（ＮＨ４）２５０４の 場合には４Ｍといった緩衝化された媒体中の塩の溶解限度までである。

水性緩衝媒体で有用なポリアニオン性塩の現在のところ好ましい濃度範囲は約０ ．５ｋｉから、緩衝化された水性媒体中の塩の溶解度限界または近傍までである 。

緩衝剤、ポリアニオン性塩、および水の組合せは生理活性物質を加える高度にイ オン性の緩衝化された塩の溶液を構成する。

選ばれた高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液に加えるべき生理活性物質の量 は、アズラクトン官能性高分子担体上に共有結合的に固定化されるのが望ましい 生理活性物質の量、および望ましい生理活性物質の結合比生物学的活性に依存す る。生理活性物質は一般に少（て高価であるので、生理活性物質の密度および最 大結合比生物学的活性が本発明に用いるべき生理活性物質の適当な量を決定する 。

大まかに言えば生理活性物質は、高度にイオン性の緩衝化した塩溶液に、最低有 用量から、高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液中の生理活性物質の溶解限界 まで溶解または分散させる。

望ましくは生理活性物質は高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液中に、高度に イオン性の緩衝化された塩の溶液１ｔｓｌ当り約０．１１９から、その溶解限界 または近傍の範囲の量存在する。

高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液における生理活性物質の現在のところ好 ましい量は高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液のＩｓ／当り約１ｍｗからお およそその溶解限度までの範囲である。

高度にイオン性の緩衝化された塩溶液中の生理活性物質の共有結合固定化は約ｐ Ｈ１〜約ｐＨ１３、望ましくは約ｐＨ４〜約ｐＨ１１のｐＨ範囲で起こる。好ま しくは緩衝剤、ポリアニオン性塩、および生理活性物質の好ましい濃度おｊび生 理活性物質のｐＨ安定性に基いて、ｐＨは約６〜約９の範囲である。

共有結合固定化の方法 本発明の第一の態様において、少くとも一つの無機ポリアニオン性塩または少く とも一つの有機ポリアニオン性塩および緩衝剤が高度にイオン性の緩衝化された 塩溶液を構成する。生理活性物質を次に加え、共有結合固定のために完全に準備 された生理活性物質溶液を形成する（以後ＲＡＭ溶液と呼ぶ）。

本発明の第二の態様では同じ高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液を用いるこ とができる。生理活性物質とアズラクトンクエンチャ−の両方を加え、ＢＡＭ− クエンチャー溶液を形成する。

第一の態様においては一定量のアズラクトン官能性の高分子担体を一定撹拌下、 約５分〜約３時間、常温常圧でＲＡＭ溶液と混合する。次にアズラクトンクエン チャ−をＲＡＭ溶液に加えて、アズラクトン官能性高分子担体上の残存アズラク トンと反応させ、溶液を除くために遠心分離し、クエンチング工程を繰返す。

本発明の第二の態様では、一定量のアズラクトン官能性高分子担体を第一の態様 と同じ条件でＢＡＭ−クエンチャ−溶液と混合する。次に第一の態様におけるよ うに、アズラクトンクエンチャ−を加え、遠心、分離および再りエンチングを行 う。予期しないことに、生理活性物質のアズラクトン官能性高分子担体への最適 の共有結合固定化が起る前に、ＲＡＭ溶液中にアズラクトンクエンチャ−が存在 することはアズラクトン官能性高分子担体のアズラクトン官能性を不活性化しな い。

両態様での使用のためのアズラクトンクエンチャ−の非限定的な例には、エタノ ールアミン、牛血清アルブミン、カゼイン溶解物、ヒドロキシルアミン、エチル アミン、水酸化アンモニウム、グリシン、硫酸アンモニウム、ブチルアミン、グ リシンアミド、トリス、ゼラチン、リゾチーム、脱脂ドライミルク、β−メルカ プトエタノール、メルカプトエチルエーテル、ジチオスライ）・−ル、グルタチ オン、アルギニン、グアニジン、リジン、ジアミン類およびそれらの組合せがあ る。これらの非限定的な例のいくつかは望ましい固定化と“無関係”なタンパク 質を含む。

あるいはまたアズラクトン官能性の高分子担体上での種々の多数の活性が、二辺 上の異った生理活性物質を用いて達成することができる。

コストおよび取扱いのためにはアズラクトンクエンチャ−としてエタノールアミ ンの使用が現在のところ好ましい。

本発明の第二の態様の高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液中のアズラクトン クエンチャ−の濃度は約０．１Ｍ〜約１０Ｍの範囲である。望ましくはその範囲 は約０．５Ｍ〜約２Ｍの間である。エタノールアミンがアズラクトンクエンチャ −として働く時、その濃度は約０．１Ｍ〜約ＩＭの範囲である。アズラクトンク エンチヤーとしてのエタノールアミンの現在のところの好ましい濃度は０．５Ｍ 〜約ＩＭである。

本発明の有用性 バイルマン等を含め従来開示された生理活性物質の共有結合固定化と比較した場 合、本発明は生理活性物質のアズラクトン官能性担体上での結合比生物学的活性 が水性媒体中でのポリアニオン性塩の使用により高められ、驚くべきことに高度 にイオン性の緩衝化された塩の溶液がアズラクトンクエンチャ−を含んでいる時 でさえ高められることを予期せずに見出した。

本発明のポリアニオン性塩とバイルマン等およびその他で以前に用いられた緩衝 化された食塩溶液の生理学的濃度間の直接的な比較では本発明の方法は結合比生 物学的活性を少（とも１３％、そして１５７％も改良した。バイルマン等および 他のものによって以前に用いられた緩衝化された食塩の溶液の生理学的濃度と比 較して本発明のポリアニオン性塩を用いて固定化された生理活性物質の高められ た密度と組合せた時、固定化された生理活性物質についての生理活性物質のキャ パシティ（結合比生物学的活性と固定化した生理活性物質の量の積）はバイルマ ン等によって達成されたキャパシティの少くとも二倍そして３７倍である。

また本発明の第二の態様の使用もバイルマン等により達成されたキャパシティよ りキャパシティを改良する。さらに本発明の第二の態様の使用により達成された キャパシティは本発明の第一の態様の使用により達成されたキャパシティを超え る。

本発明のどちらかの態様を用いると共有結合の方法は非常に早い。反応条件は穏 やか、すなわち常温常圧である。その方法は複雑でなく第一の態様の場合には共 有結合固定化とクエンチングという二工程反応、第二の態様の場合には共有結合 固定化とクエンチングの組合せとその後のクエンチングである。

本発明の範囲より大きい理解が次の実施例中に見出される。

実施例 アズラクトン官能性高分子担体および生理活性物質の製造方法材料　ビニルジメ チルアズラクトン（ＶＤＭ）は５ＮＰＥ社、プリンストン、ニューシャーシから 購入した。メチレン−ビス−アクリルアミド（ＭＢＡ）および他のすべての有機 試薬はアルドリッチ（ミルクオーキー、ウイスコンンン）から得た。

組換えプロティンＡ（ｒＰｒｏｔＡ）はレブリゲン（ケンブリッジ、マサチュー セッツ）から購入した。入手できる最良のグレードの他のタンパク質はシグマケ ミカル（セントルイス、ミズリー）から購入した。Ｎａ　ｌ　２５１はデュポン ＮＥＮ（ビレリカ、マサチューセッツ）から購入した。ヨードピースおよびビシ ンコニン酸試薬はピエールスケミカルス（ロックホード、イリノイ）から購入し た。

ポリマー合成　２０：８０　ＶＤＭ：ＭＢ、Ａビーズの形のアズラクトン官能性 高分子担体は逆相重合（方法■）により以下の如く製造した。

コポリ（メチレンビスアクリルアミド：２−ビニル−４，４−ジメチルアズラク トン）（２０＋８０）の調製 メカニカルスターラー（撹拌速度３００ｒｐｍ）、窒素入口、温度計、およびコ ンデンサーを備えた３Ｌのフリースをつけた丸底フラスコに溶媒溶液［実施例１ 〜５の場合、ヘプタン（１０４３ｍｉ）および四塩化炭素（５６５ｍｌ）、実施 例１０〜１３の場合、酢酸エチル（１３７５ｒ！ＩＡ）および四塩化炭素（２２ ５ｍｌ）、残りの実施例の場合、ヘプタン（１０４３ｍｌ）およびトルエン（５ ６５ｍ／）］および安定剤［実施例１〜５の場合、（９０：１０）のコポリ（イ ソオクチルアクリレート：アクリル酸）ナトリウム塩４ｇ、残りの実施例の場合 、（９１，８：　８．２）のコポリ（インオクチルアクリレート二Ｎ−アクυロ イル−ａ−アミノイソブチルアミド）４ｇコを入れた。この溶液を１５分間窒素 でスバージした。別の溶液を次のようにして作った。

メチレンビスアクリルアミド（４０９，０，２５４９モル）をジメチルホルムア ミド（１６０ｍｌ）に溶かした。溶解した後に、水（１６０ｍｆ）を加え、生じ た溶液に窒素を１５分間スバージした。この時点で過硫酸アンモニウム（１ｇ） を加え、スパーンングをもう１分間続けた。その溶液を有機の懸濁用媒体に次に 素早（加えた。

この添加の後すぐに〜’ＤＭ（１０９、ｏ、ｏ７ｉ９モル）を加え、全混合物を 更に５分間スパーンした。Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’−テトラメチル−１，２ −ジアミノエタン（２ａ））を加え、反応温度は２２℃から２９℃にかなり早く 上った。反応混合物をジアミン添加の時点から全体で４時間撹拌し、次に“Ｄ” （２１μ諺より大きい）焼結ガラスロートを用いて濾過した。フィルターケーキ をフィルター上でアセトン（２×５００ｍＡ’）で洗い、次に６０℃、１トール 以下で、使用できるまで乾燥した。ＩＲ分析は強いアズラクトンカルボニル吸収 を示した。

タンパク質のヨード化　タンパク質をヨウ素ピースを用いるクロラミン−Ｔ反応 によりｒｘｓｒで同位体ラベルした。典型的な反応は０．５Ｌ１ｇのタンパク質 ＣｒＰｒｏｔＡまたはｒｌｇＧ）および１００玉のリン酸ナトリウム中の１２５ １でラベルしたヨウ化ナトリウム１００ｇＣ１，１００ｍＭのＮａＣ１緩衝液（ ｐＨ７，５）および全体積中５００ｍＡ’のヨードピースを含む。反応はビーズ からの溶液の除去により３０〜６０公債終了した。タンパク質をＰＤ−１０カラ ム（ファーマシアから商業的に入手できる）上で反応しない放射性同位体から分 離した。典型的には５０％以上の同位体をタンパク質に、タンパク質１μｇ当り ０．１０〜０．１５μＣｉの比放射能で導入した。放射性ヨウ素化したタンパク 質溶液を凍結して保存し、調製後−月までに用いた。

タンパク質の共有結合固定化　タンパク質の共有結合固定化反応は様々な量のタ ンパク質（２０Ｉ１ｇ〜５．０１１１９）を含んだ表１および３に示した体積の 緩衝液中に懸濁した表１および３に示したポリマービーズよりなった。固定化中 ＢＡＭ溶液を常温および常圧での反応期間中連続的に揺り動かした。下の表に示 した比較例では１５０ｍＭのＮａＣ１（ｐＨ７，５）を用いた。残りの実施例は 表に示した無機のポリアニオン性塩または有機のポリアニオン性塩を用いた。実 施例３６〜４８ではアズラクトンクエンチャ−を共有結合固定化中に用いた。す へての実施例で、示した反応時間の後に反応をアズラクトクエンチャ−１すなわ ちＭＣＩでｐＨ９，０に滴定した２５０１Ｍビロリン酸ナトリウム中の１．０Ｍ エタノールアミンの添加により終了させた。

５分の連続的なロッキングの後に、サンプルを遠心分離し、上清液を除き、新し いエタノールアミン溶液を加えて残存するアズラクトン官能性基のクエンチング を続けた。６０分の更なる反応の後に、ビーズを遠心分離し、ｐＨ７，５のリン 酸塩／ＮａＣ１緩衝液中で数度再懸濁させた。

固定化した同位体ラベルしたタンパク質の量をバラカードのガンマーンンチレー ンヨンカウンター（モデル５２３０）で測定した。固定化すべきタンパク質の比 放射能は標識しないタンパク質の添加により各実験前に調節し、１１１ｇのタン パク質あたり１００〜２０００ｃｐｍの範囲とした。固定化した同位体ラベルし たタンパク質の最初の測定の後、１．０％のドデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） と、４時間３７℃で間欠的な撹拌をしながらビーズをインキュベートし、その後 遠心、上澄液の除去、ＳＤＳでさらに数度の洗浄サイクルを行ってポリマービー ズに共有結合的に固定化されたタンパク質の量を測定した。

アフィニティクロマトグラフィを用いた固定化ｒＰｒｏｔＡの活性アフィニティ クロマトグラフィのための固定化ｒＰｒｏｔＡを、表に示した質量の２０　：　 ８０のＶＤＭ：ＭＢＡビーズの、１．２５〜２．５１９のｒＰｒｏｔＡとの、表 １および３に示した量の塩を含む緩衝液の表に示した全量中での、示したｐＨに おける６０分間の反応により調製した。残存アズラクトン官能基はエタノールア ミンによる２回の処理により不活性化し、その後吸着したタンパク質を除（ため リン酸緩衝液および１，０ＭＮａＣ１を用いる洗浄を行った。誘導したビーズは 使用する迄４℃で２０％エタノール中で蓄えた。

クロマトグラフィはＦＰＬＣ“マネージャー”ソフトウェア（ファルマシア）に よりコントロールされたフアルマシアＦＰＬＣ装置で行った。

プロティンＡのアフニティクロマトグラフィはヒト血清（実施例１〜４）または 精製したヒトｈＩｇＧ（実施例５および１６〜３５）を用い、０．３　Ｘ　１０ −ｃｍ（０゜７０ｍＡ）オム二カラム（ライニン、ウォバーン、マサチューセッ ツ）または０．５×２５　１０．０−ｃｍ（２，０ｍ１）カラム（ファルマシア ）で行った。ＩｇＧは２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣ１（ｐＨ７ ，５）に溶解した。たんばく質濃度およびフロー速度は実験により変えた。ヒト 血清は等体積のリン酸緩衝液で希釈した。

すべてのサンプルはカラムへの注入直前に０．２−ｕフィルターで濾過した。サ ンプルをのせた後、カラムを最初にリン酸塩／ＮａＣ１緩衝液で溶出し、特記す る場合を除き実施例１〜４の場合には非特異的に結合したタンパク質を除くため １゜０ＭＮａＣ１を有する同じリン酸塩緩衝液までステップグラジェントしたの みであった。カラムが低クロライド緩衝液に戻つた後に特異的に結合したＩｇＧ をステップグラジェントによりＯ，ＩＩＩグリシン／２．０％酢酸緩衝液（ｐＨ ２，２）まで溶出した。カラムからのタンパク質の回収は各フラクションの２８ ０ｎｍにおける吸光度測定により決定した。なぜなら襄タンパク質濃度（＞２ｍ ｇ／＠ｌ）では７０−セル光学読みは信頼できないからである。これらの実験に おいてＩｇＧ：ｒＰｒｏｔＡの化学量論は放射能の量またはグリシン処理で溶出 した２８Ｏｒ＋ｍでの吸光度の量、分子量について１５０．０００Ｄａ、ヒト１ ９Ｇの吸光係数にライては１．３ｃｍ２／ｍ９およびｒＰｒｏｔ、Ａについては ４５．０ＯＯＤａから計算した。

免疫アフニティクロマトグラフイを用いた固定化ｒＰｒａｔＡの活性免疫アフィ ニティクロマトグラフイを実施例１０〜１５について以下の如く行った。ラット ＩｇＧ（モノクローナル抗体ｒ１ｇＧ）を示した緩衝液（ｐＨ８，０）中で希釈 し、生じたタンパク質溶液３．Ｑｍｌを１５０ｍｑのアズラクトンビーズと６０ 分間室温で混合した。遠心分離と上澄液の除去後、２５１１Ｍピロリン酸、ｐＨ ９，０中の１．ＱｍエタノールアミンｌＱｍＪを加え、６０分間反応させた。遠 心と第１のクエンチャ−添加の除去の後、第２の１０．０ｆｆｉ／のクエンチン グ剤をに次に加えた。この第二のブロッキング作用は連続して撹拌しながら４℃ −晩インキユベートさせて行った。ビーズを３０分間次の各溶液を用いてすすい だ：ＰＢ３　１０ｍ１，１．０ＭＮａＣ１１０ｍ１．ＰＢＳ　１０＋ｌ５ＰＢＳ 　１０ｍ７！、１０ｍＭトリス　１０　ｍ７！（２度）。ビーズを次にカラムに 詰めるまで４℃で貯蔵した。ビーズを１０ｍＭトリスをバッキング用緩衝液とし て用いてオムニガラスカラム（３ｍ＋！１ＩＤｘ５０Ｉ）にスラリーで詰めた。

マウスの抗原を濾過し２倍モル過剰でアプライし、１０ｍＭトリス中で充填し、 ベースラインまで平衡させ、０．１Ｍグリシン＋２％酢酸、ｐＨ２，２で溶出さ せた。ｌ、ＱｍＡ’のフラクションを集め抗原濃度を分光学的に測定した。

表１〜４に用いた用語の語弊。

ｒＰＡ　レプリゲン社から商業的に入手できる組換えプロティンＡｆＰＡ　ファ ーメンチクから商業的に入手できるプロティンＡＢ　Ｓ　Ａ　牛血清アルブミン ＮａＣ１塩化ナトリウム Ｂ　Ａ　Ｍ　生理活性物質 ５０４　硫酸ナトリウム ＰＯ２リン酸ナトリウム（−塩基性リン酸ナトリウム十二塩基性リン酸ナトリウ ム） ｍｌｇＧ　マウスイムノグロブリンＧ ｒＩｇＧ　ラットＩｇＧ ＭＯＰＳ　３−［Ｎ−モルホリノ〕プロパンースルホン酸ＥＤＴＡ　エチレンジ アミンテトラ酢酸ナトリウムＥＡ　エタノールアミン ＴＲトリス（トリス（ヒドロキシメチｌし）アミノメタン）ＬｉＳＯ硫酸リチウ ム Ｃ１ｔｒ　クエン酸ナトリウム ＮＨ４硫酸アンモニウム 実施例１〜３５について次の例外があるが上に一般的に記載したのと同じ方法を 用いた。ビーズ質量、全体積、ｐＨおよび時間は表１に示したとおりである。

すべての固定化反応時間は１時間であった。エタノールアミンによるクエンチン グは少くとも６時間、典型的には一晩４℃で行い、すべての残存する反応性のア ズラクトンの完全なブロックを確実にした。タンパク質の共有結合固定化の密度 は同時になされる同位体ラベルしたタンパク質固定化実験により測定した。

無機ポリアニオン性塩および有機ポリアニオン性塩による結合比生物学的活性の 上昇の条件 本比較例 （１）実施例２０〜２６では緩衝剤および塩は作用において併合されている。

表２ 結果　無機ポリアニオン性塩および有機ポリアニオン性塩による結合比生物学的 活性の上昇 固定化の結果　活性の結果 ＲＡＭ　密度　比　牛ヤへ°ノティ これらの実施例は、比較例と共に、アズラクトンビーズ担体上へタンパク質を共 有結合的に固定化するために用いた硫酸塩、リン酸塩、他の無機のポリアニオン 性塩若しくは他の有機酸塩、またはそれらの組合せの水性緩衝液への添加がこれ らのタンパク質の結合比生物学的活性を高めるという予期しない発見を示す。

実施例１〜４は１．５Ｍ硫酸ナトリウム存在下および０．１５Ｍ塩化ナトリウム 存在下でのｒＰ、Ａの固定化を比較する。硫酸塩は共有結合的に固定化したタン パク質の密度を高めるばかりでなく、固定化されたタンパク質の結合比生物学的 活性を少くとも２倍にする。溶出したＩｇＧ・固定化されたｒＰＡのモル比は、 固定化されたｒＰＡは従来技術に比べて効率的に固定化されることを示す。

実施例５はこの結合比生物学的活性の上昇は、結合する過剰のＩｇＧが与えられ た場合、担体上のｒＰＡの密度に独立であることを示す。

実施例６〜９は固定化されたリガンドの比較できる密度を有するクロマトグラフ ィカラムのセントにおける結合比生物学的活性のこの上昇を示す。１．５Ｍ硫酸 ナトリウム存在下にアズラクトンピース上に共有結合的に固定化されたｒＰＡは 密度とは独立に高められた結合比生物学的活性を示す。

実施例１０〜１３は高められた結合比生物学的活性は異った生理活性物質、ラッ ト１ｇＧでも起ることを示す。この場合実施例１１および１３における０、７５ Ｍ硫酸塩の存在はその特異抗原で試験された時、固定化された抗原のより大きい 結合比生理活性をもたらした。

実施例１４〜１５はビーズ上に共有結合的に固定化されたラットＴｇＧの密度と は独立に、ラットＩｇＧの高められた結合比生物学的活性を示す。

実施例１６〜３３は二つの異ったプロティンＡ製品についてのこの観察を示す。

レブリゲンのプロティンＡは４５．０ＯＯｄａの分子量、５．１のｐｌを有する 組換えプロティンＡである。ファーメンテツクの製品は５０．０００の分子量を 有する。レプリゲンの製品は低濃度での硫酸塩の添加により共存結合的に固定化 されたｒＰＡの密度のわずかな増加を示すが（実施例１６および１７）、結合比 生物学的活性の３倍の増加（モル比）を示す。より高濃度のポリアニオン性塩（ 実施例１８および１９）を用いるとタンパク質は実施例１６および１７の結果に くらべて固定化密度における３倍の増加、および実施例１６の結果より大きいが 実施例１７の結果に匹敵する結合比生物学的活性を示す。

ファーメンテツクのプロティンＡ（実施例２０〜３３）はしかしながら高密度の 共有結合固定化を行うのに水性媒体中の多量の塩の存在を必要としない。図１は 実施例２０〜３３の結果をグラフ的に示す。表２で示した実施例２０〜２６につ いての結果は図工でマークされ、終始一貫して５０ｍｑ／ｙ以上の生理活性物質 の共有結合的固定化の密度を示す。結合比生物学的活性を表すモル比は直接の関 係を有しない。実施例２０（図１中の２０８）についての結合比生物学的活性は 実施例２４（図１中の２４ａ）についての結合比生物学的活性よりずっと小さい 。無機のポリアニオン性塩として硫酸ナトリウムを用いた時匹敵する結果が得ら れる。

図１においてデータポイント２８．３０．２８ａおよび３０ａとして示した実施 例２８および３０を比較せよ。達成された固定化密度と達成された結合比生物学 的活性の量の間には直接の関係はない。か（して固定化の効率のために高濃度の ポリアニオン性塩は予期しないほどに大きい結合比生物学的活性を生じる。固定 化された生理活性物質の大きい密度と組み合せた時、アズラクトン官能性の高分 子担体と生理活性物質のアダクト担体は最適化される。

高濃度の硫酸塩ポリアニオンまたは高濃度のリン酸塩ポリアニオンのいずれかを 加えることは、固定化された量の比例した増加なしに固定化されたタンパク質の 結合比生物学的活性を増加させる。か（して固定化の高密度を達成することは本 質的に大きい結合比生物学的活性を生じるものではない。

結合比生物学的活性の増加は異ったカチオン（実施例３４）について、および有 機ポリ酸（実施例３５）についても認められ、その効果はナトリウムイオンに限 定されるのでなく、硫酸またはリン酸アニオンに限定されるのでもないことを示 す。

実施例３６〜４８ アズラクトンクエンチャ−存在下での固定化ｒＰＡを表３に示した条件でアズラ クトンビーズに固定化した。各サンプルにおいて固定化反応時間は１時間であっ た。各サンプルにおける溶液の全容積は１ｍｌであった。ビーズの各試料をオム ニガラスカラム（３ｍｍ　Ｉ　［ｌｘ　５ｃｍ）にスラリーにして詰め、実施例 １〜３５で述べたようにアフィニティクロマトグラフィに用いた。約５ｍｇ／ｍ ｌでのｈｌｇＧを各カラムにＰＢＳ過剰でｐＨ７，５で載せ、上記したグリシン ／酢酸緩衝液で溶出した。定量は上記の如（分光学的に行った。

表３ 条件：アズラクトンクエンチャ−を用いて固定化したタンパク質の活性ヒ’−ｘ ”７ｘ　ＢＡＭ　緩衝液　塩　アミン　全体積３７’　５０　ｒＰＡ（５，０） 　ＰＯ４［，５０コ　ＳＯ４［１，５］　ＥＡ［０，１］　１．０３８　５０　 ｒＰＡ（５，０）　ＰＯ４［，５０］　Ｓ０４［１，５コ　ＥＡ［１，０コ　１ ．０３９　５０　ｒＰＡ（５，０）　ＰＯ４［，５０］　Ｓ０４［１，５コ　Ｔ Ｒ［０，５］　１．０４０　５０　ｒＰＡ（５，０）　５Ｏ４０，５］　ＴＲ［ ０，５コ　１，０４１　５０　ｒＰＡ（５，０）　ＭＯＰＳ［，５］　Ｌｉ５Ｏ ［１，５］　１．０４２　５０　ｒＰＡ（５，０）　ＭＯＰＳ［，５］　Ｌｉ５ Ｏ［１゜５コ　ＥＡ［０，ｌコ　１．０４３　５０　ｒＰＡ（５，０）　ＰＯ４ ［，５０］　Ｃ１ｔｒ［，７５］　１．０４４　５０　ｒＰＡ（５，０）　ＰＯ ４［，５０］　Ｃ１ｔｒ１．７５］　ＥＡ［１，０］　１．０４５　５０　ｒＰ Ａ（５，０）　ＰＯ４［，５０コ　Ｓ０４［１，５コ　ＢＳＡ１　１．０４６　 ５０　ｒＰＡ（５，０）　ＰＯ４［，５０］　Ｓ０４［１，５コ　Ｂ５Ａ２　１ ．０４７　５０　ｒＰＡ（５，０）　ＰＯ４［，５０］　ＳＯ４［１，５］　Ｃ ａ５ｅｉｎ”　１．０４８　５０　ｒＰＡ（３，０）　ＰＯ４［，５０］　ＳＯ ４［１，５］　ＮＨ４［３］３１．０３　塩およびアミンは（ＮＨ４）２Ｓ０４ の形で与えた表４ 結果：第二の態様の活性 固定化の結果　活性の結果 ＲＡＭ　密度　比　キャへ°ノティ 実施例　（ｒｓｑ／ｑ）（ｍ９／ｍ７）　（靭／ｍｌ’）３６　９０．３　６． ９５　０．６２　１４．４３７　９０．７　６，７３　０．７５　１６．８３８ 　７５．２　５．７８　０．９５　１８．３３９　８ｇ、３　６．７９　０．７ ０　１５．８４０　８１．６　６．２８　１．０８　２２．７４１　７６．３　 ５．８６　１．０９　２１．３４２　４３．３　３．３４　１．４９　１６．６ ４３　７９．８　６．１４　０．８７　１７．８４４　６ｇ、６　５．２８　１ ．１４　２０．０４５　９１．６　７，０５　０．６６　１５．５４６　９１． ９　７．０７　０．５９　１４．０４７　９２．６　７，１２　０．５９　１４ ．０４８　２３．４　１，８０　２．０４　１２．２固定化したタンパク質の効 率は表４に示した結合比生物学的活性により示される。実際、固定化密度と結合 比生物学的活性は従来技術および表２に示した結果と比較した時予期しないほど に高められる。

実施例３６〜４１においては固有結合固定化時にアズラクトンクエンチャ−を加 えると固定化ｒＰＡの固定化密度と結合比生物学的活性の両方を高める。アズラ クトンクエンチャ−は、生理活性物質、緩衝剤およびポリアニオン性の塩と混合 したエタノールアミン（実施例３６〜３８）またはトリス（実施例３９および４ ０）である。実施例４１および４２もアズラクトンクエンチャ−としてのエタノ ールアミンを用いておよび用いないで硫酸リチウムの場合の同じ予期しない結果 を示す。同じことはエタノールアミンを用いるおよび用いないクエン酸ナトリウ ムについての実施例４３および４４の場合にも正しい。か（して任意の数の他の 無機塩および／または有機ポリアニオン塩も固定化反応におけるこれらの利点を 与える。

ＢＳＡ等の大きいアミンのアズラクトンクエンチャ−としての使用は、実施例４ ５において１ｍｖ／ｍＡ’以下の濃度として用いると、バイルマン等に記載され たＮａｃ１固定化および次のクエンチングに比べて結合比生物学的活性にいく分 かの改良を示した。１０ｍｇ／ｍｌ（実施例４６および４７）の濃度でのタンパ ク質は実施例３６に示した条件と好都合に比較する。実施例４８は単一の化合物 、硫酸アンモニウム、がポリアニオン性塩およびアズラクトンクエンチャ−であ り得て、優れた結合比生物学的活性が達成されることを示す。上述したことに限 定されることなく、本発明はこれによって以下にクレームされる。

固定化プロティンＡ　（ｍｇ／ｇ） 結合比生物学的活性（モル比） フロントページの続き （７２）発明者　ミルプラス、ディージ・ニスアメリカ合衆国　５５１３３−３ ４２７、ミネソタ州、セント・ボール、ポスト・オフィス・ボックス３３４２７ 番　（番地の表示なし）（７２）発明者　ウォルカー、マーガレット・エムアメ リカ合衆国　５５１３３−３４２７、ミネソタ州、セント・ポール、ポスト・オ フィス・ボックス３３４２７番　（番地の表示なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アズラクトン官能性の高分子担体とその上に共有結合的に固定化される生理 活性物質から、無機のポリアニオン性塩およびアズラクトンクェンチャーの存在 下に、あるいはアズラクトンクェンチャーと共に若しくは無しに有機ポリアニオ ン性塩の存在下に作られ、生理学的な濃度の緩衝化された食塩の溶液中で形成さ れた生物学的に活性なアダクト担体の結合比生物学的活性より少くとも１０％大 きい結合比生物学的活性を生ずる生物学的に活性なアダクト担体。 ２．アズラクトン官能性の高分子担体が、式：▲数式、化学式、表等があります ▼ （式中、 Ｒ１は水素またはメチルであり、 Ｒ２およびＲ３は独立に１〜１４個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１４個 の炭素原子を有するシクロアルキル基、５〜１２個の環原子を有するアリール基 、６〜２６個の炭素原子と０〜３個のＳ、Ｎ、および非過酸化物のＯヘテロ原子 を有するアレニル基であるか、Ｒ２およびＲ３がそれらに結合する炭素原子と一 緒になって４〜１２個の環原子を有する炭素環式の環を形成してもよく、そして ｎは０または１の整数である。） の単位を有する請求の範囲第１項に記載の生物学的に活性なアダクト担体。 ３．式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびｎは請求の範囲第２項で定義したとおりであり、ｎ＝０ または１であり、 Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＮＲ４（Ｒ４はアルキルまたはアリー ルである。）であり、 Ｇは生理活性物質の残基である。） の単位を有する請求の範囲第２項に記載の生物学的に活性なアダクト担体。 ４．アダクト担体がビーヅ、膜、フィルムまたは基材上のコーティングであり； 生理活性物質がタンパク質、抗体、抗原性物質、酵素、補足因子、レクチン、ホ ルモン、レセプター、凝固因子、ヒストン、細胞表面マーカー、またはこれらの 物質と相互作用する物質である請求の範囲第１項または第３項に記載の生物学的 に活性なアダクト担体。 ５．Ｒ１が水素であり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、ｎ＝０である請求の範 囲第２項または第３項に記載の生物学的に活性なアダクト担体。 ６．生理活性物質が生化学的に、免疫化学的に、生理学的に、および／または薬 学的に活性な物質である請求の範囲第１項または第３項に記載の生物学的に活性 なアダクト担体。 ７．（ａ）生理活性物質を高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液に溶解して生 理活性物質の溶液を形成し、 （ｂ）該生理活性物質をアズラクトン官能性の高分子担体と混合して、生理学的 な濃度の緩衝化された食塩溶液中で形成された生物学的に活性なアダクト担体よ り少くとも１０％大きい結合比生物学的活性を有する生物学的に活性なアダクト 担体を３時間以内に形成することよりなり、該高度にイオン性の緩衝化された塩 の溶液は約０．５Ｍからおおよそ有機ポリアニオン性の塩の溶解限界までの濃度 を有する有機のポリアニオン性塩を含んでなり、該高度にイオン性の緩衝化され た塩の溶液は任意的にさらにアズラクトンクェンチャーを含む、 アズラクトン官能性高分子担体への生理活性物質の共有結合的な固定化方法。 ８．（ａ）生理活性物質およびアズラクトンクェンチャーを高度にイオン性の緩 衝化された塩の溶液に溶解して生理活性物質の溶液を形成し、（ｂ）該生理活性 物質の溶液をアズラクトン官能性の高分子担体と混合して生理学的な濃度の緩衝 化された食塩溶液中で形成された生理活性アダクト担体より少くとも１０％大き い結合比生物学的活性を有する生物学的に活性なアダクト担体を３時間以内に形 成することよりなり、 該高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液は、無機の硫酸塩、リン酸塩、ピロリ ン酸塩、ピロ硫酸塩、ヒ酸塩、またはホウ酸塩を約０．５Ｍからおおよそ該無機 塩の溶解限界までの濃度で含む、 アズラクトン官能性の高分子担体への生理活性物質の共有結合的な固定化方法。 ９．アズラクトンクェンチャーが高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液中で約 ０．１Ｍ〜約１０Ｍの濃度を有し、エタノールアミン、牛血清アルブミン、カゼ イン溶解物、ヒドロキシルアミン、エチルアミン、水酸化アンモニウム、グリシ ン、硫酸アンモニウム、ブチルアミン、グリシンアミド、ゼラチン、リゾチーム 、脱脂ドライミルク、β−メルカプトエタノール、メルカプトエチルエーテル、 ジチオスライトール、グルタチオン、アルジミン、グアニジン、リシン、ジアミ ン類、トリス［ヒドロキシルメチル］アミノメタンまたはそれらの組合せを含ん でおり； 生理活性物質が高度にイオン性の緩衝化された溶液中に、少くとも最低有用量か ら、約４〜約１１のｐＨを有する高度にイオン性の緩衝化された塩の溶液中での 生理活性物質のおおよその溶解限界までの濃度で溶解している、請求の範囲第７ 項または第８項に記載の方法。 １０．該ポリアニオン性の塩が、クエン酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、ＥＤＴＡ またはコハク酸塩を含む少くとも一つの有機のポリアニオン性塩である請求の範 囲第７項に記載の方法。