JPH0587520B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、担体上への生物学的活性高分子の固
定方法に関する。

固体担体上に固定された生物学的活性高分子の
使用は、医学、生物学研究、生物工学または生物
医学工学の分野における数多くの要求に応えてい
ることが知られている。

関係する高分子は、たとえば、変換すべき溶液
を処理する生命反応器を作る時に使用されるよう
な型の酵素である。それはまた、例えば、放射線
免疫学、または酵素免疫学測定に使用される管ま
たは球の上に固定された抗体である。

同様に、生物学的活性高分子の大部分は、それ
らの天然のリガンドのクロマトグラフイーのため
の固定相で使用される。すなわち、受容体を浄化
するためのホルモン、酵素を浄化するための基
盤、抗体のための抗原またはその逆。

今までこの様な高分子を固定するために使用さ
れた方法は二つの概念に基づいていた。すなわ
ち、主として次のようなものである。

１ 担体および固定すべき高分子は、互いに反応
し得る適切な官能基が存在することが必然的に
前提となる化学的連結。従つて、もしそれが重
合体の担体であれば、あるいはこの重合体の合
成時に、あるいはその後に反応性官能基（例え
ばカルボキシル基）を出現させることができ
る、かかる官能基は通常のカルボジイミドやア
ルキルクロロカルボナートのような活性剤で高
分子内に存在する反応性官能基（たとえば、ア
ミン官能基）と反応するようにされる。同様
に、担体上にアミン官能基を出現させることが
出来る。この官能基は、高分子上にすでに存在
している反応性官能基（たとえばカルボキシル
官能基）に前もつて連結される。従つて、強塩
基によつて処理されたポリアミド（“ナイロ
ン”）は表面上で部分的に加水分解され、カル
ボキシル官能基またはアミン官能基を出現させ
る、これらの官能基は、このポリアミド型の担
体上に固定すべき高分子中にすでに存在してい
るアミンまたはカルボキシル官能基とそれぞれ
反応することが可能である。

同様に、クロマトグラフイー担体として非常
によく使用される一群の多糖類内に過沃素酸陰
イオンまたは臭化シアンによつて反応性基を新
たに作り出すことが出来、この一群の多糖類上
に高分子のアミン官能基を付加することが可能
である。従つて、ジアゾカツプリング、セミキ
ノンによる結合、等のような化学連結に基づい
たこの第１の概念を明らかにする実施例をふや
すことが可能であろう。

２ ある一定の担体に対する若干の高分子の確認
された親和力。

その際固定は、共有結合ではない結合によつ
て自然に行なわれる。最もよく知られているケ
ースは、ポリビニルまたポリスチレン型の疎水
性重合体担体上に付着している抗体（免疫グロ
ブリン）のケースである。またガラス質の担体
上に自然に付着している陽イオンペプチドのケ
ースも知られている。

上述した方法は、有利な面と不都合な面の両方
を呈示している。

第１のケースでは、堅固な結合を得ることが出
来るが、しかしそれは担体上での化学的操作によ
つてであり、この操作は大規模になると常に実現
可能ではなく、また可能な担体の種類を制限す
る。

第２のケースでは、応用の範囲が、一定の担体
に対する一定の高分子の親和力によつて左右さ
れ、この特性がすべての担体にまで広げることが
出来ないことから、より一層制限される。その
上、得られた表面はもろく、一定の時間が過ぎる
と不安定になる。さらに、どちらの場合において
も、固定すべき高分子の量を制御することは出来
ない。

本発明は、上述した従来の方法の欠点を克服
し、一方では、任意の生物学的活性高分子の任意
の担体上への堅固な耐久性のある結合を、他方で
は、この高分子の一定の量の制御が可能である方
法を目的としている。

本方法は主に、固定すべき生物学的高分子をベ
ースとした、またはこれに化合した、または結合
された重合体構造を前記の高分子の親和力よりも
高い親和力を担体に対して有する被覆を形成する
ために、作ることから成り立つことによつて特徴
づけられる。

実施可能な方法によれば、被覆は、固定すべき
生物学的高分子の互いの結合から結果として生じ
る生成物によつて作られる。

実際、本発明者等は、担体に対してほとんど親
和力を持たない一定のビオチン化蛋白質が、それ
らが架橋された状態にある時この担体に対してよ
り高い親和力を示すことを発見した。

実現可能なもう一つの方法によれば、およびさ
らにすぐれた固定を確実にするために、ビオチン
を生物学的活性高分子に結合または化合させ、担
体に対して必要な親和力を有する高分子の重合体
構造を実現する。

一つの実現可能な方法によれば、連結、硬化お
よび（または）重合によつて固定される生物学的
高分子に対して新しい担体を構成するようにし
て、上記担体上に、この担体に対してすぐれた親
和力を持つ被覆を作る。

これらの実施方法は、一定の担体に対して弱い
親和力を持つことで、またはこの担体上に固定し
にくいことで知られる生物学的高分子をＡで示す
ことによつて、次の方法で示すことが出来る。

一つの実施態様によれば連結、硬化または重合
の後、Ａを受け取り、Ａを固定するためのＢ（重
合された、または重合されていない）によつて担
体上に被覆を作る。その際全体は強力に付着した
最終的な被覆を形成する。

本発明に従つて行なうことによつて、以下に示
すように、担体上に固定すべき生物学的活性高分
子の量の制御または調節が可能である。

本発明は、抗体（免疫グロブリン）、抗原、血
清アルブミン、オバルブミン、膠原質、カゼイ
ン、酵素、ホルモン、ヘパリンのような生物学的
活動状態の多糖類、同じくビールス、バクテリ
ア、微生物、亜細胞部分、等のような任意の生物
学的活性高分子に応用可能である。同様に本発明
は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルお
よびその類似物のようなプラスチツク材料、鋼
鉄、ガラス等の任意の担体にも、形態や大きさを
制限することなく応用可能である。

重合または硬化は、カルボジイミド、アルデヒ
ド（グルタルアルデヒド）、ヒドロキノン等のよ
うな従来から使用されている薬剤の一つによつて
行なうことができる。有利な特性によつて、今ま
では生物学的高分子の重合においては利用されな
かつた反応体の種類、すなわち２塩化スクシニー
ルのようなジ酸ジクロライドが使用される。

次の各実施例は本発明の少しも制限的でない実
例として示されている。

参考例 １ ポリスチレンの管上への抗体の直接固定 うさぎおよび他の種類の動物の抗体は多かれ少
なかれポリスチレンおよび他のプラスチツク材料
（ポリビニール、ポリカルボナート、等）に安定
して付着することが知られている。この現象は、
とりわけ免疫分析（放射線免疫学の測定または免
疫酵素学の測定）の分野において数多くの応用の
基礎となつている。

本参考例はこの固定の安定化を示す。

ポリスチレンの管（溶血用の管13×75mm）が、
中性または弱アルカリ性のバツフアー中0.1mg／
mlの抗体の溶液を受け取る。室温での４時間の培
養の後、管の表面は１cm²あたり約1μgの抗体を吸
着した。

固定を安定させるために、 − 管を乾燥させる、 − 乾燥した管を２塩化スクシニールの飽和蒸気
圧にさらして抗体の重合を行なう。

− 水で濯ぎ、乾燥させる。

実施例 １ “中継網”を使用する抗体の間接固定および固
定された抗体の量の測定 参考例１に従つて固定される抗体の量は、担体
の表面の吸着能力によつてだけ決定され、抗体の
溶液の濃度および培養の時間の複合した方法に左
右される。この参考例１に記載された方法は、過
剰の抗体が適しており、このような反応には有利
に応用される。

抗体の量を制御したい時、これは免疫学的測定
において必要であるので、本発明に従つて、次の
方法で行なう。

− 燐酸塩5mMPH7.3のバツフアー中に、６mg／
mlでアルブミンの濃縮液を調整する。

− ジメチルホルムアミドの中にＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドによつて活性化されたビオチン
を10mg／mlの割合で溶解し、この溶液をアルブ
ミンの溶液100mlに対して1.56ml加え、ついで
室温で１時間培養させることによつて、アルブ
ミン上にビオチンを固定する。

− 過剰のビオチンを透析する。

− 結果として生じる媒体の重合を次いで次の方
法で行なう。すなわち、ビオチンに連結された
アルブミンの溶液を１ｇ／に調節し、モルホ
リノ・エタン・スルフオン酸のバツフアー
20mMをPH5.5に調節する。１−エチル−３，
３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドを
１ｇ／加え、１時間攪拌する。再びカルボジ
イミド１ｇ／を加え、さらに１時間再攪拌す
る。

− 結果として生じる重合された溶液を次に燐酸
塩0.05M、PH7.3のバツフアーの中で10mg／
に希釈し、ついでこの溶液はポリスチレンの
（またはポリエチレンの）各管内に分配し、そ
こで室温で16時間放置する。こうして、層の固
定が得られ、この層をNaClの0.15M溶液によ
つて２回濯ぐ。

− 次に、これらの管の中に、同じ燐酸塩0.05M
PH７のバツフアー中のアビジン溶液５mg／を
配分する。16時間後、管は空にし、燐酸塩
10mM、NaCl0.15M、ナトリウムアジド
10mM、PH7.3のバツフアーの溶液で濯ぎ、そ
のまま保存するかまたは室温で乾燥させる。こ
うしてアビジンの層はビオチンにしつかりと固
定され、本発明による目的の網が形成される。

−別の操作において、ビオチンに結合された抗体
を“SEPHADEX G25”上でクロマトグラフ
イーによつてビオチンの過剰を注意深く除去し
て、アルブミンに役だつたのと同じ手順で調製
する。

− 抗体は、燐酸塩10mM、窒化物10mM、
NaCl150mM、PH7.3、アルブミン0.1ｇ／の
バツフアー中で望ましい濃度（例えば0.01〜
0.05mg／）に希釈する。

− ビオチンが結合した血清アルブミンとアビジ
ンによつて処理された各管はそこで抗体の溶液
を受け取る。16時間後、ビオチンが結合した抗
体は定量でアビジンに固定される、ついで
NaCl0.15Mで濯ぎ、乾燥する。

この固定は確実で耐久力がある。

実施例 ２ 同じ手順（同じ溶液、同じ培養時間）を、所望
密度に（１ミクログラム／cm²まで）、ラテツクス
の球の上に抗体または抗原を固定するために使用
する。これらの球は、それらの大きさ（０から
200μまで制限なし）に従つて使用され得る。す
なわち、 − 試験管内の診断テストにおいて、通常、梅毒
のために使用されるテストとして。

− 細胞精製の装置として。この型の応用におい
て、好ましくは磁気球が選択されるだろう。こ
れらの球は、浮遊状態の細胞を含んでいる容器
の中で、細胞が球によつてもたらされた抗体に
よつて固定されるまで、まず、攪拌する。次に
磁場を球を上の方に引き寄せるのに利用し、一
方固定されない細胞は下の方に沈澱する。

この様な装置はたとえば、移植のために人間の
髄の片鱗を精製するために役立ち得る。

実施例 ３ − 生命資材上へのヘパリンの固定 ヘパリンの固定は、人口補整術の場合におい
て、あるいは体外使用（たとえば腎臓透析）の
場合において、血液と接触する資材の適合とい
う古い問題の解決を目指している。ヘパリンの
吸湿性と血液凝固防止性という特性は資材と接
触する時の血液の凝固を防止する。ヘパリンの
固定は次の各条件で達成させることが可能であ
る。

−アルブミン１ｇ／およびヘパリン１ｇ／を
含有する溶液をモルホリノエタン・スルフオン
50mMPH5.5のバツフアーの中で調製する。重
合は１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロ
ピルカルボジイミド１ｇ／で達成する。重合
の１時間後、溶液は10倍に希釈する。

アルブミン−ヘパリンの共重合体の有効な固定
を得るため、次いで資材を４時間浸すだけで十分
である。疎水性が不十分な資材の場合には、また
ガラス上では、乾燥の後参考例１に記載されたよ
うに２塩化スクシニールの蒸気にさらすことによ
つて処理を完全なものにすることが出来る。アビ
ジン−ビオチンの中継も実施例１におけるように
使用することができる。

短開管、フイルター、腎臓透析のモジユール、
ベレツト、コンタクトレンズはこのようにして処
理され得る。

また非常に特別に、本発明による方法は、球
（とくにポリエチレンの）の生物学的活性高分子
によつて被覆を得ることが出来ることが確認され
るだろう。この球は低密度（球が使用される溶媒
中または媒質中の密度よりも低い）を示し、従つ
て、現在では自由に利用出来ず、そしてそのすべ
ての有用性が認められるであろう生成物をもたら
す。従つて、これらの球は新しい工業的生成物で
ある。本発明は少しも制限的でなくもつぱら実例
としてしか記載されていず、あらゆる有効な変更
がその範囲を出ることなくもたらされ得ることは
いうまでもないことである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ビオチン化蛋白質を化学的に不活性な担体上
   に付着させ、このビオチン化蛋白質をアビジンを
   用いて架橋させ、そして予めビオチン化した結合
   させるべき生物学的活性高分子を、予め結合させ
   たビオチン残基により前記アビジンに結合させ、
   かくして前記ビオチン化蛋白質及び生物学的活性
   高分子からなる被覆が安定でかつ前記生物学的活
   性高分子の制御された量を含有することを特徴と
   する親和性の小さい化学的に不活性なキヤリヤー
   に予めビオチン化した生物学的活性高分子を耐久
   性をもつて結合させる方法。 ２ 前記ビオチン化蛋白質がビオチン化アルブミ
   ンである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 金属、ガラス、プラスチツク材料を含む何れ
   かの種類の化学的に不活性な担体に対して、生物
   学的作用を有する抗体、抗原、アルブミン、オバ
   ルブミン、膠原質、酵素、ホルモン、ポリサツカ
   ライドを含む何れかの種類の生物学的活性高分子
   を結合させる特許請求の範囲第１項又は第２項記
   載の方法。 ４ 固体担体が免疫学的測定装置における抗原ま
   たは抗体を担持する特許請求の範囲第２項又は第
   ３項記載の方法。 ５ 固体担体が、親和法によつて生物学的物質ま
   た細胞の分離のため使用される生物学的物質また
   は高分子である特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載の方法。