JP4224621B2 - 生体液の生体内浄化膜および生体内浄化方法 - Google Patents
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Description
浄化又は生体内浄化とは、この明細書全体において、生体液中に存在する内因性の又は外因性の分子又は巨大分子であって、これの一部又は全部除去が求められているような分子又は巨大分子の一部又は全部を除去するプロセスのことを言う。この分子又は巨大分子は、孤立しているか又は他の物質と複合して、場合によっては溶解状態にある。
本発明はまた、生体液浄化用の、多目的に使用しうる装置にも関する。この装置は、血液処理用の体外回路に用いる場合、血球適合性のある機能化担体から構成されている。この装置の特徴は、生体液の活性又は組成を変えるために用いることができるあらゆる型のリガンドを、共有結合的に固定しうることである。
本発明はまた、単独で、あるいは特異的リガンドを保持することのできる担体をその場で調合できる調製用キット中に組込んだ担体の製造方法及び使用方法にも関する。
腎不全患者の透析のために、生理的適合性のある半透膜が開発された。これらの担体は、平らな膜、あるいは中空繊維の形態を取ることができる。合成ポリマーをベースとした、あるいは変性セルロースをベースとした多くの膜が、製造業者によって、ユーザーが入手できるようにされている。用いられているポリマーはホモポリマーであることはめったになく、ポリアクリロニトリルのみから構成されている膜はまったくない。
例えばアサヒ社(Asahi)の膜PANは、アクリロニトリルコポリマー、メタクリル酸メチル、及びアクリル酸から構成されている。この膜は、血液と接触する濃密層と、透析物側のスポンジ状壁とから成る非対称微孔構造である。アンカ社(ENKA)の膜SPANも、アクリロニトリル、メタリルスルホン酸ナトリウム、及びメタクリル酸メチルをベースとする非対称微孔膜である。
オスパル社(HOSPAL)(フランス国メジウ(Meyzieu,France))によって製造販売されている膜AN69は、アクリロニトリルコポリマーと、メタリルスルホン酸ナトリウムとをベースとするものである。この膜は、その生物学的適合性と転移性によって知られている。ポリマーAN69のアニオン部位(メタリルスルホン酸ナトリウムコモノマーに由来するもの)の含有量は、600mEq/kgである。この膜の含有量は、約180Eq/kgである(ポリマー含有量は概略30%)。
その他のポリマー、特にポリスルホンポリマーもまた、非対称微孔性構造を示す。これらは基本的に疎水性であり、十分な拡散性を備えた透析膜を形成するには、親水性成分、例えばポリビニルピロリドンと混合しなければならない。
対称親水性担体は、所望の用途に従って中空繊維形態であっても、平らな膜であっても、さらに、その生物学的適合性に関して次のような機能的利点を有する。すなわちこれらは、わずかに補体を活性化するものであり、血栓を発生させず、大きな拡散能力を有するという点である。
一般的には、例えばアクリロニトリルコポリマーのような、生物学的適合性アニオン性ポリマーはすべて、本発明の方法によって機能化可能な担体を生じうる。
2つの型の生体内浄化が本発明に関わっている。1つには、腎透析の際に普通に用いられている透析及び/又は血液濾過型の非特異的生体内浄化に関しており、もう1つには、生体液から望ましくない分子又は巨大分子を除去しようとする生体内浄化に関しており、これは、親水性担体と共有結合によって組合わされた1つ又はそれ以上のリガンドと共に除去される分子又は巨大分子の特異的相互作用によるものである。
透析及び血液濾過
体外循環による血液の処理のための装置は、医学的用途又は医療関係の様々な用途に用いられる。例えば透析又は血液濾過による腎不全の治療、治療用及び非治療用のプラスマフェレーゼ及びアフェレーゼ、血液の酸素付加、免疫浄化等である。
これらの装置の製造に用いられる材料はすべて、できるだけ生物学的適合性になるように選ばれ、血液が異物と接触する時に生じる反応(特に凝固)が生じないように、あるいは比較的軽いレベルでしか生じないようにする。
その生物学的適合性を改良するために、血液と接触することになる材料の、全体あるいは表面を処理することが知られている。既知の処理は、装置のうちの種々の部分を製造するために用いられるポリマー溶液の製造の際(全体処理)、あるいは装置の様々な部分が組立てられた後であって装置の滅菌の前、あるいは装置の使用直前にその場で実施される。
次の条件を尊重しつつ、装置の活性要素(例えば透析膜)の生物学的適合性を改良しようとする場合に、特に解決が難しい問題を生じる:
1)処理及び処理方法に用いられる物質の選択は、結果として既知の活性要素の変更をもたらすことになるものでなければならず、この変更は、既知の品質のすべて(例えば透析/血液濾過膜の場合、拡散性及び対流性転移性能、望ましくない物質の吸着能力等)を保持しながら、活性要素の生物学的適合性を改良する効果を生む;
2)装置の滅菌は処理に影響を及ぼしてはならない;
3)処理は、ユーザー側での特別な操作を必要としないものでなければならない。
より特定すれば、本発明は、前記の条件を満足させる装置であって、処理前に表面が負の電荷を示すような活性要素を有する装置の製造方法を提案することを目的とする。血液が負電荷表面と接触するとき、血液は、接触相の活性化と呼ばれる生物学的現象起こり、これは、不活性物質すなわちプレカリクレイン及びXII因子からの、活性物質すなわちカリクレイン及びXIIa因子の発生として発現する。
接触相の活性化それ自体は良性なものであるが、いくつかの撹乱因子(患者によるIEC型の降圧剤の摂取、塩水の満たされた装置を透過する血液の希釈、これに付随するpH低下)と同時に生じる場合、望ましくない反応の原因になるようである。これらの反応は、アナフィラキシー反応と呼ばれ、これは治療開始の数分後に様々な症状として現れる。これらの症状としては、全体が熱っぽい感じ、指、唇、舌のしびれ、息切れ、嘔吐、喉頭浮腫がある。アナフィラキシー反応は、血液区画の内側表面が負電荷であるような医療装置の使用とのみ関連しているわけではないことを再確認する必要がある。これらの反応は、様々な化学組成の膜を有する交換器の場合に見られ、ある時は最初の使用時、またある時は交換器を一回の使用後に捨てずに、何度も再使用し、使用する都度リサイクルすることで何度も用いた後に発生する。最初の使用時に望ましくない反応が生じた交換器の例として、ポリメチルメタクリレート及びポリアクリロニトリル膜を有する透析器を挙げることができる。酢酸セルロース及びポリスルホン膜を備えた透析器の再利用に関する反応も、多くの文献に示されている(キドニー・インターナショナル「中空繊維血液透析器の再使用及びACE阻害剤に関連したアナフィラキシー反応(Anaphylactoide reactions associated with reuse of hollow−fiber hemodialyzers and ACE inhibitors)キドニー・インターナショナル(Kidney International)、第42巻(1992年)、1232−1237頁参照)。
特異的生体内浄化
固体担体への巨大分子の共有結合固定に関して、多くの開発が行われている。より詳しくは、例えば吸着により、特異的固定率を増加させるため、及び非特異的固定率を低下させることを目的とした開発である。例えば特許出願WO92/07023号、92/07006号、及びWO92/05201号を挙げることができる。これらの特許出願は、担体が非負荷親水性ポリマーで覆われているという技術を開発している。すなわちポリエチレンイミン(PEI)に共有結合的に結合しているPEG(ポリエチレングリコール)−エポキシである。これら3つの特許出願に記載された方法は、非極性反応媒質中で実施される。すなわちPEGエポキシは、PEIと安定な関係を形成し、これは反応媒質のpHを低下させながら直接反応によって、不溶性担体上に固定される。従ってエポキシ型の機能化担体が得られる。それにもかかわらず、これらの担体は、これらのヒドロキシル基の存在によって多くの場合過剰に親水性であるという欠点を示し、これらの過剰な親水性によって、リガンドとして用いるべき蛋白質が、エポキシ反応基と接触するのを妨げる。これは結果としてリガンドの担体上への固定率を減少させるものである。
この問題を取り除くため、リガンドと親水性担体との接触を促進するように、リガンドを含むミクロエマルジョンが開発された(WO92/07023号)。
担体上への生物学的巨大分子の固定についての以前から考えられていた特別な用途の1つは、分子又は巨大分子の精製を目的とする液体の特異的浄化である。この用途の特別な例は血漿蛋白質の免疫浄化であるが、これは通常、血漿、あるいはよりまれではあるがドナーからの採取によって得られた血液を、固体担体上を通過させて実施される。この固体担体上には、特異的に、かつ可能であれば得たいと望んでいる分子と良好な親和性をもって反応しうるリガンドが結合している。
精製に対して特に有利なリガンドには、モノクローン抗体類がある。抗原とこれらの相互作用の特異性によって、及び対応する抗原とのこれらの高い親和性によって、これらの使用は、親和性クロマトグラフィの数多くの用途における、試験管内特異性免疫浄化において検証されている(「免疫学における現行のプロトコル(Current Protocol in Immunology)」第2節、単元8−2)。それにもかかわらず、血漿中の物質の最大限の浄化を目的とする体外免疫浄化は、精製及び/又は濃縮物質の製造を目的とする試験管内免疫浄化とは、多くのパラメーターによって根本的に異なる。特に次のパラメーターである:
−上記のような修飾担体に必要な生物学的適合性、
−その機能的一体性を保持させることができる方法によるリガンドの共有結合固定、
−抗原のそれらのエピトープに対する親和性は、循環における抗原の塩析が最小限になるようなものでなければならないが、一方で、精製物質を得るための試験管内免疫浄化は、その代り固定収率がより少なくなるリスクを冒しても、前記物質の変性を伴なわずに塩析が可能にされるものでなければならない。
体外浄化の例として挙げることができる唯一の製品は、セファローゼ球に付け加えられた蛋白質Aから構成されるカラムであり、イムノソルバ(エクスコリム社(Excorim))カラムという名称で販売されているものである。S.aureus壁から抽出された蛋白質Aは、IgGのFc断片に親和性があり、同様にイミュノソルバカラムは、IgGのみではあるが、これらの抗原特異性による区別なしにすべてのIgGが除去される限り、用途が非常に限定される。このことは明らかに大部分の場合に求められるものではない。
本発明者らは、生体液、特に血漿を浄化するための体外循環物質として存在する系の有利な物理的機能的特性を利用したいと考えた。このような浄化は、このようなものが存在することによって、あるいくつかの病気又はあるいくつかの生物学的機能障害を発生させる分子又は巨大分子、より詳しくはアルブミン(66,400ダルトン)より大きい分子量の毒性分子及び巨大分子であって、血液濾過又は血液透析技術によって浄化されないものの除去のための治療となりうる。
本発明は、生体液の循環のための区画を備えた生体液の体外浄化用モジュールを提供することを目的とする。この区画は少なくとも一部、機能化担体又は機能化基を有する表面を持つ壁によって画定されており、次の条件を満たしている:
−少なくとも約15℃〜約45℃の温度で安定であること;
−血球適合性を有すること;
−医療装置に用いうる滅菌方法の少なくとも1つの型、特にガンマ線に対して安定であること;
−場合によっては、活性化物質の存在下に官能基を発生させるのに適していること、この意味において、次の基を有するリガンドと共有結合を形成するのに適していること:
−巨大分子の非特異的固定を防ぐのに十分ではあるが、臨界閾値より低く、この値を超えるとリガンドの共有結合固定率が低くなるか、さもなければゼロになるような親水性を有すること。親水性は固有のものであってもよく、化学的処理によって与えられたものであってもよい。
この明細書全体において、機能化担体とは、室温において、及び商品としての使用に適合した時間の間安定な基を有するあらゆる壁又は表面のことを言うが、これらは活性化物質の存在下に、官能基を発生させるのに適している。これらの官能基自体が、リガンドと直接的又は間接的カップリングのために、−CHO、−NH2、−COOH、−SH型の有機基と反応するのに適しており、リガンド自体は、浄化したいと望む生体液の分子又は有形成分と特異的に相互作用するのに適している。
特に機能化担体のベースは、平面フィルム又は中空繊維の形態;平面フィルム又は非多孔質中実又は中空繊維の形態;多孔質又は非多孔質超微粉、又は前記のものの組合わせの形態にあるあらゆる透析膜を構成するであろう。
生体液の体外浄化のためのモジュールはまた、表面が電荷を示す機能化担体を備えていてもよい。これらの電荷を介して、イオン結合により、第一の型の分子又は巨大分子が結合される。第一の型の分子は、一度結合したら遊離アミン基を示し、これらのアミン基には共有結合によって第二の型の分子が固定されており、これらの第二の型の分子は一度結合されると遊離カルボン酸基を示し、これらの遊離カルボン酸基は、1)各々NH2、OH、及びSH基と共にアミド結合、エステル結合、及びチオエステル結合を形成するのに適している;あるいは、2)修飾されてヒドラジンになり、アルデヒドとヒドラゾン結合を形成するのに適している;あるいは、3)修飾されてアミンになり、アルデヒドと共にイミンを形成するのに適しており、還元によってアミンとして安定化されうる;あるいは、4)修飾されて1,2−ジケトン(例えばシクロヘキサジオン、グリオキサール等)になり、次のものと共有結合を形成するのに適している:
第一の型の分子の例は、10,000〜2,000,000ダルトンの分子量のポリエチレンイミンである。
第二の型の分子の例は、次式のジカルボン酸の無水物である:
ここにおいてX=[CH2]nであり、nは2又は3であるか、又はX=−CH=CH−である。
第二の型の分子のもう1つの例は、モノカルボン酸の無水物であり、例えば次式の酢酸の無水物である:
特異的生体内浄化への使用のためには、遊離カルボン酸基は、特異的生体内浄化を可能にするリガンドと、あるいは1つ又は複数の下記機能を有しうる第三の型の分子とアミド結合を形成してもよい:
−立体障害を減少させ、リガンド及び/又は分子又は浄化される有形成分のその後の固定を促進するためにスペーサーを添加すること、
−蛋白質又はこのような相互作用を行なうことができるあらゆる物質との非特異的相互作用を制限するために、膜又は担体の親水性を増すこと、
−その他の種類の基、例えばアミン基、特に基−CHO、−COOH、−NH2を有するリガンドともう1つの型の共有結合を可能にするものを示すこと。
これらの様々な機能性が累積されて、単一の分子に存在することもある。前記の3つの機能性を組合わせた第三の型の分子の有利な例は、次の式のジヒドラジドである:
NH2−NH−CO−Y−CO−NH−NH2
ここにおいてYは好ましくは基(CH2)mであり、mは2〜6である。
さらにYは、次のようにして選ばれなければならない。すなわちYは、親水基を有していなければならず、どんな場合でも補体の活性化剤であってはならず、医療装置の少なくとも1つの滅菌方法、例えばガンマ線に対して安定でなければならない。
体外回路における本発明によるモジュールの使用は、前記担体の固有の性質が存在することを前提としている。すなわち、
−最小限の非特異的吸着;
−接触相の活性化の不存在、すなわち1リットルあたり10単位以下のカリクレインの発生;
−非毒性。
さらには特異的生体内浄化の使用のためには、これらは特異的リガンドとの高いカップリング能力を有するものでなければならない。
前記担体から作られたモジュールは、考慮されている治療方法に適合した条件において、生体液の循環を可能にするものでなければならない。
本発明のモジュールは、好ましくは膜として、AN69型の、アクリロニトリルコポリマー及びメタリルスルホン酸ナトリウムから製造された半透膜を含むものである。
本発明はまた、有機基と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性機能化担体の製造方法にも関する。特に、
であり、下記工程を含む:
a)固定アニオン基を有する担体と、分子量10,000〜2,000,000ダルトンのポリエチレンイミン(PEI)とを接触させる工程であって、PEIは置換又は非置換である;
b)a)で処理された担体と、次式のジカルボン酸の無水物:
(ここにおいてX=[CH2]nであり、nは2又は3であるか、又はX=−CH=CH−である)
又はモノカルボン酸の無水物、例えば次式の酢酸の無水物:
の溶液とを接触させる工程。
末端カルボン酸基は、カルボジイミドを添加するか、あるいはカルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミドの形態の活性化エステルに転換して、リガンドのカップリングのために直接用いることができる。
c)場合によっては、工程a)及びb)によって修飾された担体と、次式:
NH2−NH−CO−Y−CO−NH−NH2、
のジヒドラジドとを、カルボキシル基の活性化カップリング剤、例えばカルボジイミドの存在下に接触させる工程。
Yは、補体を活性化させず、例えばγ線のような医療装置の滅菌方法の少なくとも1つの型に対して安定な基から選ばれる。Yは好ましくは[CH2]mであり、mは1〜4である。
本発明の方法のこの第一の変形例は、以下の明細書において「アセチル化後」と呼ばれる。
本発明の方法は、同等の結果を生じる変形例を含めてもよい。この変形例においては、工程b)の無水カルボン酸は、工程a)で提案された担体の処理の前に、工程a)のPEIと反応している。換言すれば、この変形例において、有機基と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性機能化担体、特に:
は、イオン性を有する担体と、次のものの反応生成物との接触によって得られる:すなわち分子量10,000〜2,000,000ダルトンのポリエチレンイミン(PEI)であって、前記PEIは置換又は非置換であるものと、式:
(ここにおいてXは上記と同じ意味を有する)
のジカルボン酸の無水物、又は式:
のモノカルボン酸の無水物、の溶液との反応生成物である。
このように修飾された担体は、次いで式:
NH2−NH−CO−Y−CO−NH−NH2
(Yは上記と同じ意味を有する)
のジヒドラジドと接触させられる。
前記方法のいずれか1つにおいて、アニオン性を有する担体は好ましくは、前記のようなAN69型の、アクリロニトリルコポリマーとメタリルスルホン酸ナトリウムから成る膜である。PEIは好ましくは、分子量が10,000〜2,000,000ダルトンである。
ジカルボン酸の無水物は、好ましくは次式のコハク酸の無水物である:
この無水物は、アセトニトリル中の0.5M〜2Mの濃度の溶液として用いられる。この第二変形例は、第一変形例と区別しやすくするために、「アセチル化前」と呼ばれる。
無水酢酸、あるいは無水コハク酸とPEIとのアミド結合によるカップリング後、全体をアニオン性担体と接触させる。予備スクシニル化PEIでの処理の場合、−COOH官能基は、ジヒドラジドと反応することができる。このジヒドラジドは好ましくはADH(アジピン酸ジヒドラジド)であり、ここにおいてmは4である。
本発明はより一般的には、この方法又は前記の変形例によって得ることができる担体、並びにこれを含む生体内浄化モジュールに関する。これらの担体は、上に列挙されたものと同じ条件を満足させなければならない。
前記のような本発明の方法は、透析及び/又は血液濾過膜の調製のために用いることができる。本発明は、これらの方法によって得ることができる膜であって、PEIのアセチル化後、又はPEIのアセチル化前から成るものに関する。
このようにして作られた膜を含む透析モジュールは、本発明の一部を成す。
機能化担体と組合わせることができるリガンドは、均質性又は異質性のものであってもよい。すなわちこれらは、単一の分子種から構成されていてもよく、あるいは複数の分子の生体液を同時に浄化しようとする場合、複数の分子種の適合性混合物から構成されていてもよく、あるいは分子の異なる部位に対して異なる親和性を有するリガンドを有する単一の分子から構成されていてもよい。例えばリガンドが抗体又は抗体断片である場合、異なる特異性を有する抗体の混合物であっていてもよい。前記リガンドの共有結合的カップリングによってこのように修飾された担体と生体液との接触によって、1つ又は複数のリガンドとの親和性を有する、1つ又は複数の分子種又は巨大分子種、あるいは生体液の有形成分を選択的に除去することができる。
リガンドは、あらゆる既知の方法によって、修飾された担体の体外使用と適合する活性化物質の作用によって、共有結合的に固定されるであろう。このような手段は、次の文献に記載されている。すなわち米国特許第4,217,338号;Thomasら「コロイド及びA表面(Colloids and Surfaces A)(1993年)第77巻、125−139頁;Malmstenら「J.コロイド及び界面科学(Colloids and Interface Science)」(1996年)第177巻、70−78頁である。
カッコ内の数字は、この明細書の全体について、この記載の最後にリストが挙げられている参考文献に対応している。
リガンドが抗体である場合、これを行なうためには2つの方法が可能である。第一の方法は、抗体のアミン基と担体のカルボキシル基との間のアミド結合によって、抗体をカップリングすることから成る。
第二の方法は、過ヨウ素酸ナトリウムによって抗体を酸化し、次いで分子のグルコース基上に発生したアルデヒド基と、ジヒドラジドによる機能化担体のヒドラジド酸との間のヒドラゾン結合の形成によって、これらをカップリングすることから成る。これらの条件下におけるカップリング効率は、pHが4〜6である時に最大である。
これらの方法の各々の例は、図1及び2に示されている。
生体液の生体内浄化が治療上利点があるような状況をすべて列挙することは、手間のかかることでもあり、無駄であろう。代謝及び病理プロセスに関する知識は絶えず進歩しているので、新たな浄化方法の候補が絶えず発生しているからである。当業者なら、決定される治療方法によって、適切なリガンド又はリガンド混合物を選び、選択することができよう。例えば場合によっては、分子又は複合混合物の浄化の場合、異なるエピトープ又は抗原特異性の抗体の混合物を組合わせることもできよう。要するに、浄化される物質に対してではなく、浄化したいと考えている物質に対して特異的に複合されたもう1つの物質に対して親和性を示すリガンドによって、生体液を浄化することを選ぶこともできよう。
抗体は、単一特異的であるか、あるいは複数のエピトープ的又は分子的特異性が混合されたポリクローン抗体、あるいは好ましくはモノクローン抗体であってもよい。例えば次のものを挙げることができる:
−敗血症ショックの治療において、あるいは炎症性現象、例えば慢性関節リューマチの治療においては、炎症に効果がある抗サイトカイン抗体(IL−1β;TNFα;IL−6);
−新生児の溶血疾患の治療及び予防における抗RhD抗体;
−臓器移植の予防法における抗HLA抗体。
同様に、例えば抗体、受容体、レクチン等のような適切なリガンドによって、例えば細胞又は血小板のような血液の有形成分を特異的に浄化することを選ぶこともできよう。
本発明の機能化担体とリガンド、特にモノクローン抗体又はポリクローン抗体とのカップリング生成物は新規であり、これらも本発明の一部を成し、及び生体液の浄化におけるこれらの使用もこの発明の一部である。
カップリング生成物は、効率的であるためには、抗原の各型に対して可変であるような固定抗体の最適量を特徴とするものでなければならない。例えば約2mg/m2を固定することができる。
抗原はまた、生体液の浄化に対して有利な候補の一種でもある。特に自己免疫疾患の場合に、自己抗体の除去に有利である可能性がある。
今日、自己免疫疾患は、心臓血管病及び癌に次ぐ三番目に大きな病理プロセスであり、これらには対症療法しか存在しない。
自己免疫疾患は何よりもまず、Bリンパ球の活動亢進が際立っており、その他の生物学的症状のうちでも自己抗原に逆らって進む多数の自己抗体の存在を特徴としている。例えば、様々な各抗抗原抗体、抗DNA抗体、酵素に対する、及びRNA転写及び翻訳プロセスに介入する核蛋白質に対する抗体を挙げることができる。自己免疫疾病の典型的な例は、播種性エリテマドーシス(LED)又は慢性関節リューマチである。複数の全身的疾患に存在することがある自己抗体の多様性によって、臨床的には症状が混在することが多いだけに、診断が非常に難しくなる。
自己抗体の産生が自己免疫疾患患者の場合の特徴であるとすれば、この産生はまた、健康な個人の場合に年齢と共に増加する(8、14、18)が、だからといってこれらの個人は自己免疫病を発病しないことを認めるのは興味深いことである。さらには、これらの同じ人たちの場合に生じた自己抗体の標的自己抗原(DNA、ヒストン、酵素、及び核蛋白質)は、自己免疫疾患、特にLEDの場合に見られるものと同じである(11)。
一方で、多くの研究が免疫複合体の発病性について報告している。実際、LED患者の場合の死因の1つである腎不全は、腎臓内の免疫複合体、特にDNA/抗DNA免疫複合体の沈積によって誘発されることが証明されている(9、10)。最近Sasakiらは、DNA/抗DNA免疫複合体の存在と、増殖性瀰漫性糸球体腎炎の罹患率とを結び付けることになるいくつかの要素について発表した。このために、すべての腎合併症が出る前に、循環する免疫複合体の形成に関わる抗原及び抗体を除去して、患者側にこれらが形成されるのを減らすのが有利であることになる。
現在用いられている種々の治療方法は、主として:
a)糖質コルチコイドによる治療。これは高い用量(0.7〜1ml/kg)で、明らかな臨床的改善が生じ、種々の自己抗体率の低下、免疫複合体の消滅、及び血清補体率の再上昇を伴なう;
b)免疫抑制剤、これの使用についてはより異論が多い。
c)血漿交換又はプラスマフェレシス。
この後者の技術は、いくらかの狼瘡患者には効果があることが証明されてはいるが、いくつかの欠点がある。すなわちこの技術は費用がかかり、実施が難しく、除去は選択的ではない。その理由は、この技術では病原性免疫複合体だけでなく、必須成分、例えば免疫グロブリン、凝固因子、補体の分子、及び調整活性を有するその他の多くの化合物をも浄化するからである。従ってこれは臓器に対して、特異的技術よりもはるかに外傷性がある。
結局この治療の後では、「リバウンド」現象が起こることが多く、免疫複合体及び自己抗体率が、治療停止の数日後に劇的に増加する。
d)通常、血漿又はこれよりまれではあるが血液を、リガンドが結合されている固体担体上に通過させて実施されるアフェレーゼ。このリガンドは、特異的かつ可能であれば高い親和性を持って、標的細胞上又は低分子量又は高分子量の成分上に存在する部位と反応しうるものである。
LEDの場合、可能な治療方法は、病原抗体、この場合抗DNA抗体を、この方法によって特異的に除去することから成る。最初のデータは、Termanらによってもたらされたものであるが、これらの研究者らは、狼瘡患者の血液を浄化するために、コロイド形態のDNAカラムを用いた。しかしながらリガンドとしてのDNAの使用は、次の理由によって非常に限定されている。1つには、例えばヌクレアーゼ及び血漿エステラーゼのような酵素と接触した場合に不安定であるからであり、もう1つには、潜在的な変形性と関連した潜在的危険性のためである。これは、血清蛋白質と複合した、循環中のその塩析が示すことがあるものである。それにもかかわらず、抗DNA抗体は、DNAによってではなく、これらの抗体が交叉反応を生じるその他の化合物によって特異的に捕らえられる。多くの研究者、例えばLaferら、次いでShoenfeldは、ネズミ及びヒトの抗DNA抗体は、DNAとは非常に異なる化合物、例えばカルジオリピン又はその他の負電荷リン脂質分子と反応しうることを証明した。Susukiらは、担体の再生装置と組合わされた硫酸デキストランゲル上での連続的アフェレーゼ装置を考案し、狼瘡患者の場合の抗DNA抗体率の減少を証明した。しかしながらこの治療戦略の利点は、抗DNA抗体のみが一部除去され、これらは狼瘡患者の病変の原因の唯一の自己抗体ではないという事実によって、限定されるようである。
リポ酸(AL)又は6,8−ジチオオクタンリポ酸(AT)は、炭素6及び8に対して2個の硫黄原子と結合した、炭素原子8個の分子であり、ジチオランヘテロ環を形成する:
代謝面においては、これはデヒドロゲナーゼオキソ酸に対して必須の補助因子を構成する。これらは酵素、例えばピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)又はオキソグルタル酸デヒドロゲナーゼに対して必須の多酵素複合体であり、これらにおいて、これは共有結合的にリジンのNH2基に結合している(1、2、21)。
免疫面においては、リポ酸の固定部位に対応するPDHの部分が、初期胆汁性肝硬変患者の場合に自己抗体によって確認することができる自己抗原を構成することは明らかに示されている(7)。最近になって数人の研究者は、この自己抗原上にリポ酸が存在することが、これらの患者の場合のこの認識についての決定要因であることを証明した(6、7)。
さらに免疫の分野において、スルフヒドリル基を有する化合物、例えば2−メルカプトエタノール及びジチオトレイトールは、培養中のリンパ球の場合、抗体の産生を刺激しうることが証明された(3、4、15、17)。
Ohmoriは、試験管内で、場合によって生じる免疫刺激性を明らかにするためにALの効果を研究した(16)。ALの存在下における抗原刺激の結果生じる抗体応答の増加は、T個体群に依ることは明白であるようである。実際、副Tリンパ球の枯渇は、ALの作用を無効にする。さらには得られた刺激は用いられた抗原に特異的なものである。
LEDの免疫浄化による治療におけるリガンドとしてリポ酸の選ぶことは、次の観察事項に基づいている。
1)LED患者の血清は、図3に表れているように正常な被験者とは異なって、IgG類、特にIgM類の高い率の抗AL抗体を含んでいる。
2)抗AL抗体率は、ネズミMRL/lprの血清においては年齢とともに増加する。その他にこれらのネズミは、年を取るとLEDを自然発生的に発病する。ネズミMRL/lprと、MRL/mpと呼ばれる対照ネズミの場合の抗AL抗体率の動物の年齢による比較研究によって、抗AL抗体の滴定量、ネズミMRL/lprの場合12週目から増加し、一方この率は、対照ネズミMRL/mpの場合低いままであることが明らかにされる。結果を図4に示す。
3)抗AL抗体は、二本鎖DNAと反応するが、一本鎖DNAとは反応しない(13)。あるいはこのLEDは、ある一定の時の抗DNA二本鎖抗体疾患の存在を特徴とする。
4)LED疾患患者の血清からの抗AL抗体の浄化は、同時に抗DNA二本鎖抗体率をも減少させる(図5)。
上記の観察事項と結果によって、リポ酸は狼瘡病において血漿を抗AL及び抗DNA抗体浄化するための優れた方法の候補であるようであった。
リポ酸は、アミン基とのアミド結合によって機能化担体とカップリングされうる。これらのアミン基は、例えば、モノヒドラジドによって、ジヒドラジドによって、あるいは式:NH2−(CH2)n−NH2(nは2〜6である)のジアミンによって、あるいはNH2−(CH2)x−NH−(CH2)y−NH2(x及びyは3〜6である)のポリアミンによって与えられたものである。LEDの治療のためのリポ酸との本発明によるカップリングの実施例は、次の実施例において示される。
本発明はまた、本発明による機能化担体と、リポ酸とのカップリング生成物にも関しており、及びLED患者の血清の浄化のためのこれの使用にも関する。このカップリング生成物を含む装置は、自己免疫疾患、より詳しくはLEDを治療するのに特に成績がよい。
当業者であれば、場合によっては、前記の抗体及び抗原の他に、ペプチド、糖蛋白質、ホルモン、酵素、これらの補助因子、これらの基質又は阻害剤、多糖類、レクチン、毒素又は抗毒素、核酸又はポリヌクレオチド酸、ハプテン、ハプテンのリガンド、顔料又は色素から成る群から選んで、一定の病気の治療に適したリガンドを選ぶことができよう。
一定の病気の治療は、同時にあるいは逐次に、複数のカップリング生成物の使用により、リガンド混合物によって実施することができる。
本発明は、本発明の方法の実施の結果生じた前記のような機能化担体の、多目的に使用しうるモジュールの製造への使用に関する。このモジュールは、生体液の体外浄化のためのものであり、このモジュールでは、生体液中に存在する、除去が求められている生化学種又は細胞、特に抗原、抗体、又はハプテンが浄化される。
本発明はまた、機能化担体と、生体液の浄化用の1つ又は複数の特異的リガンドとの本発明によるカップリング生成物の調製のための、多目的に使用しうるキットにも関する。前記キットは少なくとも次のものを含んでいる:
1−リガンドと共有結合的にカップリングされうる担体を有する装置;
2−機能化担体とリガンドとの反応の活性化溶液を含む滅菌容器又は滅菌袋;
−適切な溶液及び濃度のリガンド;
−場合によっては1つ又は複数のリンス溶液。
実施態様が図10に示されている本発明のキットは、前記方法によって得られる修飾担体を組合わせた治療用溶液を提供するものである。この担体の多孔度及び修飾は、リガンドに適しており、1つ又は複数の分子、又は生体液中の除去したいと考えている有形成分の種類及び濃度に適しているものである。
キットにおいて、装置は有利には透析カートリッジ、より詳しくは、例えば前記のような機能化カートリッジAN69であってもよい。
本発明のキットのリガンドがリポ酸であり、担体上に存在する基がアミン基である場合、活性溶液は好ましくは水溶性形態のカルボジイミドであろう。
本発明のキットのリガンドが抗体である場合、活性化溶液は例えば過ヨウ素酸ナトリウムである。カップリングに用いられる反応は、当業者によく知られた従来の反応であり、これは、選ばれたリガンドに従って、活性化剤の種類によっても、反応の物理化学条件によっても、最も性能のよい操作条件を用いることができるものであろう。
本発明のキットは有利には、看護人、あるいはこれらと関連した資格のある人によって用いられ、好ましくは血液又は血漿であるような生体液の浄化のために、体外循環において使用しうる特異的リガンドを有するカートリッジを、無菌的かつその場で調製するためのものである。
本発明は前記のようなキットの、哺乳動物、より詳しくはヒトのあらゆる予防的又は治療的処理においての使用に関する。
本発明は要するに、本発明の少なくとも1つのモジュールを含む装置の体外循環による、ヒト又は動物の血液又は血漿の特異的生体内浄化方法に関する。図11の概略図において、血液全体は、本発明のモジュ−ル内の通過及び患者への再投与によって、体外循環により処理される。このような処理の枠内において、必要であれば、血液の一部を限外濾過することも可能である。
本発明のその他の特徴および利点は、図1〜22を参照しながら、以下の実施例の中で明らかになるであろう。
図1は、低分子量の分子、グリシン、あるいはPEIで機能化された支持体を持つ抗体と、スクシニル化されたアミノ基との結合を例示したものである。
図2は、低分子量の分子(ピルビン酸塩)あるいは高分子量の分子(酸化された抗体)とのヒドラゾン結合による同様の連結を示す。
図3は、MLRマウス血清におけるリポ制酸性抗体の力価を示す。明灰色の部分はMRL/lprマウスにおける割合、影を付けた濃灰色はMRL/mpマウスにおいて得られた割合を示す。
図4は、種々の疾病におけるリポ制酸性IgMの割合の比較を示す。Cは対照、PBCは原発性胆汁性肝硬変、Mは筋無力症、RAは慢性関節リウマチ、SLEは播種状エリテマトーデス、Sは梅毒、THは甲状腺炎を示す。
図5は、リポ酸が共有結合している支持体上を狼瘡血清が通過したあとの浄化された抗DNA抗体の減少を示す。
図6は、無水コハク酸によるAN69-PEIの機能化後に使用しうる部位の数を示す。曲線は、スクシニル化した単独AN69(丸でつないだ曲線)およびスクシニル化したAN69-PEIに導入されたエタノールアミンの量に対して、得られた無水物の量を示す。定量は、ユニットの入口(三角でつないだ曲線)、中央部(菱形でつないだ曲線)および出口(四角でつないだ曲線)で行った。
図7、8および9は、機能化していないあるいは各々EDCおよびADH、無水コハク酸、EDCおよびADH、ならびにPEI、無水コハク酸、EDCおよびADHで機能化したAN69への14Cピルビン酸の固定を示す。
図10は、処置ユニットの準備方法を示し、図11は体外循環による処置方法を示している。
図12は、EDCという活性化剤の存在下でリポ酸と共有結合を形成するのに適したプトレシンに連結した、エポキシ表面で構成される支持体を得る方法を図式的に表わしたものである。
図13は、比較として、ALとエポキシのOH基との直接エステル結合による支持体の形成を示す。
図14は、エステル結合(黒い点)あるいはアミド結合(黒い菱形)によって得られたAN69-AL支持体で得られる抗AL IgMの割合、すなわち浄化の割合を比較したものである。
図15は、支持体がAN69-ALで構成されるカラムを連続的に通過させた後に得られる浄化率を比較したものである。
図16は、同じ支持体を数回通過した後に溶出されるタンパクの10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で得られるプロフィールを示す。
図17は、PEIと反応する漸増量の無水コハク酸に対してのPEI-Pのアミン置換率を示す。
図18は、接触活性化へのPEIのスクシニル化後の影響を示す。
図19は、スクシニル化の度合に応じて、AN69の小ユニットによってスクシニル化される前のPEI-Pの量を示す。
図20は、スクシニル化の度合に応じて、また様々な濃度のスクシニル化前のPEI-Pについて、AN69の小ユニットによってスクシニル化される前のPEI-Pの量を示す。
図21は、PEI-Pのスクシニル化前の割合に応じて得られる結果を説明する、コハク酸の電荷した基の様相を図式的に表わしたものである。
図22は、スクシニル化の度合に応じて、カリクレインの生成によって測定した接触相の活性化を示す。
図23は、スクシニル化前の割合に応じて、スクシニル化前のPEI-Pで被覆した小ユニットに固定されるヘパリンの量を示す。
特異的生体内浄化および透析と血液濾過のための機能化された支持体の調製方法:
以下の試験は、後アクリル化あるいは前アクリル化によって処理した、アクリロニトリルコポリマー型の膜の調製に基づく。この試験によって、非特異的(透析および/あるいは血液濾過膜)あるいは特異的(浄化する分子の単数または複数の特異的リガンドの連結)生体内浄化における適用のための第二の方法の利点を明らかにすることができる。
次の事柄を目的としてPEIの修正を行った:
-機能化の割合、すなわち場合によってリガンドと連結するのに適した反応基の割合を最適化する;
-非特異的固定、たとえばヘパリンの固定を避けながら、処理していない多アニオン性膜に関して認められるトロンボゲン形成を抑制する。
これらの実験で使用したPEIは、BASFによって市販されている、光拡散によって測定した平均分子質量が750,000ダルトンのLUPASOL−Pである。
その他のタイプのPEI、特に同じ会社が市販している平均分子質量25,000のlupasol-WFも使用することができる。
使用したカルボキシル酸無水物は無水コハク酸である。アクリル化はこの場合にはスクシニル化である。
1.方法:
1.1 表面の修正:
すべての実験は、170本の中空ファイバーAN69(内径:210μm;壁の厚さ:42μm:長さ:0.18m)および生理的血清(NaCl 0.14N)溶液として修正したあるいは修正していないトリチウム標識PEI-Pを含む小透析器を用いて実施した。2つのアプローチを使用した:
a)まず最初にトリチウムで標識したPEI-Pでユニットを処理し、その後スクシニル化した;
b)あらかじめ完全にあるいは部分的にスクシニル化しておいたトリチウム標識PEI-Pでユニットを被覆した。
1.2 様々な割合でスクシニル化されたPEI-Pの調製:
ホウ酸緩衝液0.05M pH8.6 50ml中のPEIP3mgに、アセトニトリルに溶解した無水コハク酸(AS)を加えた。
スクシニル化の度合に応じて加えたA.S.の量は次の通りであった:
100%のスクシニル化:AS162μmol
80%のスクシニル化:AS54μmol
60%のスクシニル化:AS31μmol
40%のスクシニル化:AS18μmol
20%のスクシニル化:AS8μmol
必要に応じて0.1MソーダでpHを8.6に調整しながら撹押下で1時間の接触期間を置いたあと、12M酢酸を加えてpHを5に下げることにより反応を停止させた。
アミンの置換の割合を、バルトスとテッセ(J.Bartos and M.Tesez)の「熱量測定および蛍光光度法による生体分析の実施」、第2版、1984年、マッソン、p.84〜85(図17)の中に述べられている方法に従って、フルオレスカミンを用いて検査した。
小ユニットを被覆するために、pHを8に調整した。
1.3 PEIで被覆したAN69膜の安定性の評価:
種々の濃度(0.14M、1、2および4M)のNaCl溶液の循環を明らかにすることにより、表面修正の安定性を評価した。
1.4 生物学的評価:
本発明に従って処理した小ユニットが接触相を活性化するかどうかを評価するため、次のような試験に供した:表面が負に電荷した膜との接触によってカリクレインの生成を刺激するのに適した生物学的液体を調製した。試験に使用した生物学的液体は、クエン酸塩を加えた生理的血清中で5%に希釈した、血小板欠乏のヒト血漿であった(使用した試験条件は、血液の体外循環のための装置の使用条件とは異なっている:希釈の比率が非常に高く、選択した液体は血液ではなく血漿であり、血漿はクエン酸塩を加えたため酸性化されているのに対し、透析では使用する抗凝固剤はヘパリンである。これらの試験条件は、接触相の活性化を刺激し、増大することから、故意に選択した)。この液体150mlを、0.5ml/分の流量で30分間、小ユニットの血液区画において開放回路で循環させた。バイオジェニック(BIOGENIC)社の基質S2302から、古典的色素産生試験によって時間間隔を置いて採取した液体サンプル中の血漿カリクレインを定量した。
使用した色素産生試験の感受性を考慮すると、カリクレインの濃度が約10単位/リットルまでにとどまっていれば、カリクレインの比率の有意の上昇はないとみなすことができる。
2.得られた結果:
2.1 表面の修正:
2.1.1 スクシニル化後:
まず最初にトリチウム標識したPEI-Pでユニットを被覆し、その後スクシニル化した。その結果を以下の表Iに示す:
これらの結果は、スクシニル化後がPEI-Pの43%の再放出を引き起こすことを示している。
さらに、カリクレイン生成のバイアスによって測定した接触相の活性化のレベルが図18に示されている。この図は、裸の状態のAN69膜、PEI-Pで被覆したAN69膜、およびPEI-Pで被覆してその後スクシニル化したAN69膜について、リットル当り単位で測定したカリクレイン生成を比較したものである。
この図は、PEI-Pで処理したAN69が接触相を活性化しないことを示している。それに対し、スクシニル化後はPEI-Pを部分的に脱着させるので、スクシニル化後のPEI-Pで処理したAN69は接触相を活性化させる。
2.1.2 スクシニル化前の作用;
トリチウム標識したPEI-Pで被覆した小ユニットを種々の度合でスクシニル化前を行い(図17)、AN69に吸着されたスクシニル化前トリチウム標識PEI-Pの量を測定した。その結果が表19に示されている。
図19は、AN69に吸着されるPEI-Pの量がスクシニル化の度合と共に増加し、最大60%に達することを示している。60%を超えると、吸着されるPEI-Pの量は急速に減少する。
さらに、吸着されるPEI-Pの量は、スクシニル化の度合(図19に示すように)と同様に、小ユニットに導入されるスクシニル化前のPEI-Pの濃度と共に増加する。最大吸着は、PEI-Pの60%のスクシニル化前に関して認められ、これはすべての場合に当てはまる。
図20は、小ユニットに吸着されるPEI-Pの量が、小ユニットに導入されるスクシニル化前PEI-Pの濃度が60mg/lまたはそれ以上である場合には、216μgのプラトーに達することを示している。
2.1.3 結論:
スクシニル化前のPEI-PのAN69ユニットへの吸着の増加は、アミンとカルボキシルの電荷基の間での静電相互作用の変化から生じる立体配座変化の結果であると考えられる。
図21は、スクシニル化前していないPEI(上の図)と30%、60%および100%スクシニル化前のPEIのAN69膜への吸着を図式的に表わしたものである。
PEI-Pがスクシニル化前されていない時には、膜のイオン基と相互作用するPEI-Pのモル当りのアミン基の数(50- 3)が大きい。スクシニル化前は、スクシニル化前のPEI−Pの立体配座変化を引き起こすPEI−Pのモル当りのアミン基の数を減少させ、そのことが吸着されるPEI−Pの量を増加させ、結果として特異的生体内浄化のために使用しうる反応部位の数を増加させる。さらに、スクシニル化前の割合を制御することにより、このように処理したAN69膜上で得られる可能性のある反応部位の量をコントロールすることができる。
これに対し、スクシニル化後の場合には、図21の最初の図で、反応性のN+部位数が比較的少ないことが認められ、従ってスクシニル化後の反応性カルボキシル部位数がスクシニル化前の場合よりも少なくなる。
2.2 スクシニル化していないトリチウム標識PEIと、漸増食塩濃度で小ユニットを洗浄したあとスクシニル化前したトリチウム標識PEIの安定性
スクシニル化後の場合、無水コハク酸のPEIへの連結は、NH3+基と膜のSO3-基の結合が弱まることにより(上記の表Iで示されたように)30〜40%のPEIの再放出を導く脱プロトン化の段階を通過する。
下記の表IIは、食塩濃度を漸増して洗浄した後のPEI-Pの脱着のパーセンテージを示す。
上記の結果は、小ユニットを40、60および110mg/lのスクシニル化前のPEI-Pで処理し、その後生理的血清20ml(0.14M NaCl)で洗浄した時、PEI-Pの脱着は起こらず、これが1Mの食塩濃度まで続くことを示している。これに対し、小ユニットを2Mまたはそれ以上のモル濃度の食塩水で洗浄した時には、すべての場合にスクシニル化前のPEI-Pの部分的な脱着が認められた。
スクシニル化前のPEI-Pの脱着のレベルは、スクシニル化前の度合と共に上昇する。
最大の機能性部位を得るためには、60%スクシニル化前のPEI-Pによる小ユニットの処理が至適である。
2.3 血液適合性
図22は、20〜70%スクシニル化前のPEI-Pで処理したAN69が接触相の活性化を生じさせないことを示している。これに対し、100%スクシニル化前のPEI-PでAN69の処理を行うと(図22)、認められる接触相の活性化は、AN69をPEI-Pで処理していない場合と同等である。
スクシニル化前のPEI-PによるAN69の表面処理の追加的な利点は、支持体へのヘパリンの吸着が、スクシニル化していないPEI-Pで処理したAN69に関して認められる吸着に比べて少ないことである(図23)。ヘパリンはしばしば抗凝固剤として使用されるので、これらの膜を血液透析/血液濾過において使用する際に、このことが大きな利点となる。
3.結論
これらの比較実験から、機能化したAN69膜の調製、特にそれらをスクシニル化前のPEI-Pで処理する時の至適条件を定義することができた。カルボキシル酸の無水物がコハク酸の無水物である場合、条件は次の通りである:
-スクシニル化の度合は60%;
-スクシニル化前の60mg/l濃度のPEIによる表面処理。
これによって次の結果が導かれる:
-2μmのCOOH/m2膜という最大の機能性;
-イオン価の高い(1モル濃度まで)媒質中での極めて良好な安定性;
-血液の接触相の活性化なし;
-この種の膜を透析/血液濾過において使用する時大きな利点となる、支持体へのヘパリンの限られた吸着。
一般に、この手法は処理した膜上に存在する反応性部位の数を再現可能に制御することができる、すなわち:
-特異的生体内浄化に適用するための反応性部位数の増加;
-本発明の膜の適用全体として、得られる反応性部位数の再現性。
上記の実験はさらに、スクシニル化後に比べてスクシニル化前の有利さを明らかにした;実際に、スクシニル化後では、あらかじめ固定したPEIの再放出がおそらくAN69膜の被覆中に「孔」の形成を生じさせるのであろう。そのような「孔」の存在は好ましくない作用、特に被覆していない裸の膜に関して認められた、接触相の活性化作用を導く。
実施例1:AN69 PEI-PEGエポキシドへの抗IL6Acの固定:
抗IL6Acを不溶性支持体、たとえばセファロースに固定するための最良の方法を定義し、ひとたび方法が確立すればそれをAN69に適用するための実験を試みた。
2つの手法によるACの連結を、トリチウム[3H]標識したIgGを用いて実施した。
a)IgGのタンパク鎖中のリシンのεNH2へのアミド結合による連結;
b)次の資料に述べられている手法に従って、IgGのFc部分に存在する、あらかじめ酸化された炭水化物群へのヒドラゾン結合による連結:米国特許第4217338号;Quashら、J.Immunol.Methods,1978年、第22巻、165−174頁参照。
セファロースのビーズと抗IL6Acを、加えるAcIL6の濃度を漸増させてビーズの容量1対AcIL6の容量1の割合で2時間接触させた。
各々のビーズサンプルについて得られた放射能の量を、パッカードMINAXI β液体シンチレーションコンピュータで測定した。
その結果を以下の表IおよびIIに示す:
表1の結果は次の事柄を示している:
1)使用する抗IL6Acの濃度が低い場合は、結合したAcの量は加えたAcの量の20%であり、これは2つの手法について同様である(表I)。
2)加える抗IL6Acの濃度を高くすると、2つの手法によって結合する抗IL6 Acの量が増加する。抗IL6Acをアミド結合によって連結した時、ビーズ40cm2について結合した抗IL6Acは0.54μgから13.6μgに増加した。この量は、抗IL6Acをヒドラゾン結合によって連結した時には、ビーズ40cm2につき結合した抗IL6Acが0.38μgから18μgとなった。
3)抗IL6Acをヒドラゾン結合によって連結した時には、結合の収率は加える抗IL6Acの量に従って上昇し、20%から42%になったが、一方アミド結合によって連結した抗IL6Acについては、結合抗IL6Acの収率は加えたAcの量にかかわらず一定なままであった(26%)。
酸化されたあるいは酸化されていない抗IL-6抗体のセファロースビーズへの吸着の度合を調べるために実施した実験は、この吸着が7%を越えないことを示した。
それ故、結合する抗IL6Acの量が、2つの手法について、加える抗IL6Acの量に従って増加するとすれば、これらの抗IL6Acの結合効率は、抗IL6Acをヒドラゾン結合によって連結した時の方が優れていると思われる。
このことは加えるAcの濃度が高い場合により著明である:
-ヒドラゾン結合については42%、
-アミド結合については26%。
実施例2:AN69 PEI-PECエポキシドでのIL6抗原の免疫浄化:
2.1 アミド結合あるいはヒドラゾン結合によって連結した抗IL-6Acとセファロースビーズに関して:
下記のものを用いてIL6の免疫浄化試験を実施した:
-一方では、1.1)項および表Iに述べられている手法に従って同じ比率で、アミド結合あるいはヒドラゾン結合により抗IL6Acを漸増量で結合したビーズ、
-他方で、被検血清中に存在するIL6の割合を変化させた。このために、あらかじめ検査した陰性血清の混合物中で、非常に高い比率のIL6(血清1ml当りIL6 1.7μg)を含む血清を希釈した。最終的に、試験した血清はIL6の最終比率が33,050、22,470、11,235および3,157pg/mlであった。
これらのセファロースビーズ/抗IL6Acを、修正した種々の血清混合物と、ビーズの容量1対血清の容量1の割合で接触させた。
通過の前後に血清中に存在したIL6の比率をサンドイッチ型酵素免疫測定法によって測定した。
その結果を以下の表IIに示す。
これらの結果は次のことを示している:
1)ヒドラジンで処理したあるいは処理していない支持体単独(抗IL6Acを伴わないビーズ)ではIL6を固定しない。
2)結合する抗IL6Acの量が多いほどIL6の免疫浄化は有効であり、これは使用した2つの結合手法のいずれにも当てはまる。
3)抗IL6Acが13.6μg/40cm2(アミド結合)および18μg/40cm2(ヒドラゾン結合)の割合で結合する時、IL6の免疫浄化は、使用した2つの結合手法について、また低い比率あるいは高い比率のIL6を含む血清について、90-100%有効である。
4)結合する抗IL6Acの量が13.6μg/40cm2(アミド結合)および18μg/40cm2未満である場合には、結合する抗IL6Acの量に従って、ならびに血清中に存在するIL6の比率に従って、IL6の免疫浄化が低下する。
実際に、抗IL6Acがアミド結合により2.64μg/40cm2結合する時には、免疫浄化の効率が3,157pg/mlのIL6を含む血清についての98%から、35,030pg/mlのIL6を含む血清についての81.3%まで低下する。同様に、抗IL6Acが0.54μg/40cm2結合する時には、免疫浄化効率は、3,157pg/mlのIL6を含む血清についての86.9%から、35,030pg/mlのIL6を含む血清についての18.5%に低下する(表II)。
抗IL6Acがヒドラゾン結合により2.72μg/40cm2結合する時には、免疫浄化の効率が3,157pg/mlのIL6を含む血清についての90%から、35,030pg/mlのIL6を含む血清についての54.2%まで低下する。同様に、抗IL6Acが0.38μg/40cm2結合する時には、免疫浄化効率は、3,157pg/mlのIL6を含む血清についての57.1%から、35,030pg/mlのIL6を含む血清についての28.5%に低下する(表III)。
結論:
アミド結合あるいはヒドラゾン結合による抗IL6Acの結合は、IL6に対する活性を保存する。
35,000pg/mlまでを含む血清中に存在するIL6の免疫浄化が90-100%有効であるためには、結合する抗IL6Acの量が約0.4μg/cm2でなければならない。この免疫浄化効率は、アミド結合であれヒドラゾン結合であれ結合する抗IL6Acについて同様である。
結合する抗IL6Acの量が0.4μg/cm2未満である場合には、IL6の免疫浄化は、血清中に存在するIL6の比率が高いほど効率が低くなる。この所見は2つの結合型のいずれにも当てはまるが、それにかかわらず、抗IL6Acがアミド結合によって連結している時には、IL6の免疫浄化は一般に、抗IL6Acがヒドラゾン結合によって連結している時よりも有効である。
IL6の総免疫浄化についてcm2当りに結合する抗IL6Acの至適量をビーズに関して定義したので、AN69の小ユニットに関するIL6の免疫浄化に移った。
2.2 AN69小ユニットでのIL6の免疫浄化試験:
第WO92/07023号に述べられている方法に従って小ユニットを親水化し、機能化した(H&F)。
1)方法:
長さ18cmのAN69の中空ファイバー170本を含む小ユニットを組み立てた(内表面積:256cm2)。エポキシド群を生成するため、これらの小ユニットをPEGテトラポキシドによる処理に供した。
プロピオネート3Hで標識した抗IL6Acを、ヒドラゾン結合により0.4μg/cm2の割合でビーズの場合と同じ条件下で2つのAN69小ユニットのひとつに結合した。AN69ファイバーへの結合効率がセファロースビーズへの結合効率と同様であるとみなせば、この0.4μg/cm2という結合Acは、理論的には加えたAcの42%に相当する。
そこで、ファイバー1cm2当り0.95μgのAc、すなわちファイバー256cm2につき243μgのAcを接触させた。
他方で、対照のヤギのAcを、常にヒドラゾン結合によって、AN69小ユニット+抗IL6Acの場合と同じ条件下で2番目のAN69小ユニットに結合した。
11,203pg/mlのIL6を含む血清3mlを、これらの小ユニット上で2時間再循環させた(0.5ml/分)。
その後、これらの小ユニットの通過の前後に、存在するIL6の比率をサンドイッチ型酵素免疫測定法によって測定した。
表IIIによれば、対照Acを加えたAN69を通過した後は、IL6の14%が非特異的に除去されただけであったのに対し、抗IL6Acを結合したAN69の通過後には免疫浄化率が77.5%まで上昇したことから、免疫浄化は有効であり、且つ特異的であったと思われる。
使用した実験条件下では、AN69小ユニットへの抗IL6抗体の固定率は0.11μg/cm2であった。
このAN69ファイバーへの抗IL6Acの結合の平均収率を説明することができる最も可能性の高い仮説は、ファイバー表面のエポキシド部位の少なさであり、従ってアジピン酸ジヒドラジドによる処理後の、酸化されたAcの炭水化物部分のアルデヒドとのヒドラゾン結合を生成するために使用しうるヒドラジン基の少なさである。
IL6の比率が≦35,000pg/mlである血清については、結合する抗IL6Acの量が少なくとも0.4μg/cm2であることを条件として、IL6の免疫浄化は100%の効率であることがわかっている。ところで、我々は、おそらくcm2当りで共有結合するAcのそのような密度を得ることができない、従ってIL6の免疫浄化を制限する系(AN69ファイバー)を有している。
2.3 補体を固定する能力の検査:
抗IL6Acを結合して親水化し、機能化した小ユニットAN69H&Fによる血清IL6の浄化効率が明らかになったので、化学的に修正したこの同じ小ユニットが、補体系に対するその無反応性に関して最初の特性を保持しているかどうかを検討した。すなわち、補体を固定する能力の有無について試験した。
AN69 H&Fの膜は、0.625UH50あるいは2.5UHの割合で加えた補体を固定しなかった。
Acを結合したAN69 H&Fカートリッジは、対応するAgを特異的に除去することができ、補体の固定を生じさせなかった。
実施例3:特異的生体内浄化のためのスクシニル化後のAN69PEIの調製:
この調製は、小ユニットをPEI WFで処理したあと、スクシニル化した後実施した。
3.1 AN69-PEI上の、低分子量(FPM)分子の固定のために使用しうる部位数の測定:
1)無水コハク酸によるAN69-PEIの機能化後:
この試験のために、1m2の表面積を持つ平らな膜で構成されるユニットを使用した。このユニットをPEIで処理し、その後、ユニットの両端と中央部で鉗子を用いて4.5cm2の膜サンプルを採取できるように分解した。
放射標識したFPM分子:[14℃]エタノールアミンを用いて、これらのAN69-PEIトローチと対照AN69トローチの使用可能部位数を比較した。
その後次のプロトコールに従って無水コハク酸を固定した:
-アセトニトリル中での1M無水コハク酸溶液の調製;
-50mM pH8.5のホウ酸緩衝液中で上記の溶液を1/10に希釈し、対照AN69トローチとAN69 PEIトローチに15分間接触させる;
-2回目の操作を開始する;
-H2Oで十分に洗浄する。
このようにして得られた部分上に、次のようにして標識エタノールアミンを固定した:
a)生成されたCOOH基の活性化:
a-1):NaH2PO4 10nM中で1 エチル3(3 ジメチルアミノプロピルカルボジイミド)(EDC)(50nM)とN.ヒドロキシスクシニミド(NHS)(50nM)の溶液を調製し、トローチと15分間接触させる。
a-2):活性化溶液を除去する。
b)エタノールアミンの固定:
b-1):低温エタノールアミン/標識エタノールアミンの同位体希釈液を調製する
-低温4nmol/標識0.4nmol
-低温40nmol/標識0.4nmol
-低温400nmol/標識0.4nmol
-低温4000nmol/標識0.4nmol
各々の溶液は、最終pH8の50mMホウ酸緩衝液中で調製する。
b-2):対照AN69とAN69-PEIトローチを撹拌下で2時間接触させ、その後ホウ酸塩/NaCl 0.5M中で洗浄し、計数する。
図6は次の事柄を示している:
-AN69+PEI+無水コハク酸に固定されるエタノールアミンの最大量は5.6nmol/トローチである;
-AN69+無水コハク酸に固定されるエタノールアミンの量は1.2nmol/トローチである。
従って、AN69+スクシニル化PEIに実際に固定されたエタノールアミンの量は、5.6−1.2=4.4nmol/4.5cm2、すなわち1nmol/cm2あるいは10μmol/m2である。
最後に、図6は、AN69+スクシニル化PEIに固定されたエタノールアミンの量がユニット全体に関して均一であることを示している。ユニットの入口、中央部および出口で同じ部位数が認められたからである。
2)アジピン酸ジヒドラジド(ADH)によってスクシニル化したAN69-PEIの機能化後
次のようにしてADHを固定する:
COOH基を活性化した後(a)参照)、ホウ酸緩衝液50mM pH8.5中50mMのADH溶液を長関市、AN69トローチと1時間接触させる。
ホウ酸緩衝液中で、次にH2Oで、さらにアセテートで十分に洗浄する。
次のようにしてピルビン酸14Cのトローチへの固定を行なう:
50mM pH5.4のアセテート1ml中で低温ピルビン酸/標識ピルビン酸の同位体溶液を調製する:
-低温0nmol/標識5nmol
-低温20nmol/標識5nmol
-低温200nmol/標識5nmol
-低温2000nmol/標識5nmol;
トローチと2時間接触させた後、アセテート、NaCl 0.5Mで洗浄し、計数する。
図7は、AN69+ADHに保持されるピルビン酸の至適量が、支持体の活性化(EDC)の有無にかかわらず0.1nmol/トローチであることを示している。
図8は、スクシニル化AN69+ADHに固定されるピルビン酸の至適量が、導入されるピルビン酸の量が150nmol/トローチを越える場合には、支持体の活性化(EDC)の有無にかかわらず0.5nmol/トローチであることを示している。
図9は次のことを示している:
-AN69+PEI+無水コハク酸+ADHに結合するピルビン酸の量は、ADHのアミド結合による固定のために支持体上に生じるカルボキシル基の活性化(無水コハク酸を通して)後には、少なくとも1.1nmol/トローチである;
-支持体上に生成されるカルボキシル基が活性化されない時には、AN69+PEI+スクシニル化+ADHに吸着されるピルビン酸の量は、0.45nmol/トローチである。
結論として、まず最初にPEI、次いで無水コハク酸によるAN69の機能化は、低分子量分子のために使用しうる部位数を少なくとも5倍増加させる。この増加はADHによる処理後とほぼ同じ大きさである。
3.2 高分子量(HPM)分子の固定のために使用しうるAN69-PEI上の部位数の測定:
この試験のために、2種類の濃度(5μgと60μg)の酸化した免疫グロブリン(Ig)あるいは酸化していない免疫グロブリンを機能化したあるいは機能化していないAN69のトローチと接触させた。
まず最初にPEI、次に無水コハク酸、そして最後にADHによるAN69の機能化は、高分子量分子のために使用しうる部位数を少なくとも2倍増加させることができる。
実施例4:スクシニル化後のAN69-PEIでの抗リポ酸(AL)抗体の免疫浄化:
LEDに関して、図1、2および3に示された結果から我々は、LEDを発症した患者の血漿中の抗ALAcを特異的に除去することができるカートリッジに注目するに至った。ALは分子量100kDaのハプテンであるので、開発された手法は官能性COOH基を含む他のハプテンにも拡大することができるであろう。
不溶性支持体への共有結合によるALの固定は次のようにして実施する:
-エポキシ末端の官能基を直接プトレシンで置換して、αNH2で終わる腕を形成し、そこにアミド結合によってリポ酸を付け加える(図1参照)。
2つの理由からこの操作が必要である:一方では、アルカリ性媒質中でAcを溶出した後カートリッジを再使用できるようにし、また他方で、アミド結合は、ALを加水分解したエポキシドのOH基に直接連結した場合に生じるエステル結合(図2参照)よりも本質的にはるかに安定である(図5参照)。
4.1 AL結合の種類に従った免疫浄化の比較試験:
図5は、ALをアミド結合によって連結した時に、抗ALIgMの免疫浄化が明らかにより有効であることを示している。エステル結合によって連結したALは約8%というごくわずかな抗ALIgMの低下をもたらすだけであるのに対し、前記の場合には抗ALが完全に除去されるからである。
アミド結合によって連結したALによる抗ALAcの免疫浄化の有効性が証明されたので、次の段階は再使用を検討すること、従って支持体の安定性を調べることであった。
このために、同じ支持体で、同じ狼瘡血清に由来する6つのサンプルを免疫浄化した。
4.2 小ユニットAN69 H&F-ALの再使用試験:
図8は、異なるものであるが同じ狼瘡血清に由来する6つのサンプルを、各々の通過の間に溶出段階をはさんで同じ支持体に連続6回通過させると、最初の通過後と6回目の通過後に同じ抗ALAcの浄化効果が得られることを示している。
これら6回の通過後に固定されたタンパクの連続的溶出は、ポリアクリルアミドゲルの場合と同じプロフィールを生じる(図9)。
結論:
我々は、AN69が体外循環における有効で特異的且つ再使用可能な、抗ALAcの免疫浄化系であることを明らかにした。
実施例5:スクシニル化前のAN69 PEI-Pで精製したIgGの共有結合による連結:
5.1 実験材料:
実験はAN69の中空ファイバー(内径:210μm;壁の厚さ:42μm;長さ:0.18m)170本を含む小透析器で実施した。
ヤギのIgGは、ビオシー(コンピエーニュ、フランス)由来のものである。
ヤギのIgGとウサギのIgGを、各々腹水プールからのタンパクAセファロースカラムおよびウサギ血清からのDEAEセルロースで、実験室において精製した。
5.2 実験方法:
5.2.1 放射標識IgGの調製:
マウス、ウサギおよびヤギのIgGをN-スクシニジル(2-33H)プロピオネートで放射標識し、過剰の放射能を透析によって除去した。
-透析後のIgGの比放射能:
マウスのIgG:1.25 106cpm/mgタンパク
ウサギのIgG:1.86 106cpm/mgタンパク
ヤギのIgG:0.77 106cpm/mgタンパク
5.2.2 小ユニットの修正
5.2.2.1)6つの小ユニットを脱グリセリン化し、その後60%スクシニル化前のPEI-P溶液で処理した;
5.2.2.2)A、B、Cと名付けた3つの小ユニットをカルボジイミドで活性化し、D、E、Fと称する他の3つはそのままにしておいた;
5.2.2.3)放射標識したウサギのIgG 50μgを、小ユニットAとD上をPBS(最終容量:3ml)中で2時間再循環させた。
放射標識したマウスのIgG 50μgを、小ユニットBとE上をPBS(最終容量:3ml)中で2時間再循環させた。
放射標識したヤギのIgG 50μgを、小ユニットCとF上をPBS(最終容量:3ml)中で2時間再循環させた。
5.2.2.4)次に6つの小ユニットを放射能の痕跡がなくなるまで洗浄した。
結合したIgGの量は、導入された放射能の量−放出された放射能の量に相当する。
5.3 実験結果:スクシニル化前のAN69に結合したIgGの量
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Claims (37)
- 生体液の特異的体外浄化のための機能性担体であって、
機能性担体の表面が以下の条件を満たす官能基を含み:
−少なくとも約15℃〜約45℃の温度において安定しておいる;
−血液適合性を有している;
−医療装置に用いることができる滅菌方法の少なくとも1つに対して、特にガンマ線に対して安定している;
担体の表面は、第一の分子又は巨大分子がイオン結合によって結合していることにより電荷を帯びており、前記第一の分子は第二の分子に共有結合したアミン基を示しており、前記第二の分子は特異的リガンドとの直接的又は間接的共有結合を可能にする遊離カルボン酸基を示す、
ことを特徴とする、生体液の特異的体外浄化のための機能性担体。 - 前記カルボン酸基が、
(1)それぞれNH 2 、OH及びSH基とアミド結合、エステル結合及びチオエステル結合を形成する;
(2)修飾されてヒドラジンになり、アルデヒドとヒドラゾン結合を形成する;
(3)修飾されてアミンになり、アルデヒドと共にイミンを形成し、還元によってアミンとして安定化されうる;あるいは、
(4)修飾されて1,2−ジケトンになり、グアニジンと共有結合を形成しうる、
ことを特徴とする、請求項1に記載の機能性担体。 - 第三の分子がカルボン酸基に共有結合しており、この第三の型の分子は、立体障害を減少させる、且つリガンド及び/又は分子又は浄化される成分のその後の結合を促進するスペーサー機能を有することを特徴とする、請求項1に記載の機能性担体。
- 第四の分子が共有結合によってカルボン酸基上に結合され、この第四の分子は、非特異的相互作用を制限するために、担体の親水性を増加させる機能を有することを特徴とする、請求項1に記載の機能性担体。
- 第五の分子が共有結合によってカルボン酸基上に結合され、この第五の分子は一度結合されると、もう1つの種類の基を示し、特に基−CHO、−COOH又は−NH2を有するリガンドともう1つの共有結合カップリングを可能にすることを特徴とする、請求項1に記載の機能性担体。
- 生体液の体外浄化のための機能性担体であって、
機能性担体の表面が以下の条件を満たす官能基を含み:
−少なくとも約15℃〜約45℃の温度において安定しており;
−血液適合性を有しており;
−医療装置に用いることができる滅菌方法の少なくとも1つに対して、特にガンマ線に対して安定している、
担体の表面は、第一の分子又は巨大分子がイオン結合によって結合していることにより電荷を帯びており、該第一の分子は第二の分子に共有結合したアミン基を示しており、該第二の分子は共有結合した遊離カルボン酸基を示し:
第三の分子がカルボン酸基に共有結合しており、この第三の分子は、立体障害を減少させる、且つリガンド及び/又は分子又は浄化される成分のその後の結合を促進するスペーサー機能を有し:及び/又は、
第四の分子が共有結合によってカルボン酸基上に結合され、この第四の分子は、非特異的相互作用を制限するために、担体の親水性を増加させる機能を有し:及び又は、
第五の分子が共有結合によってカルボン酸基上に結合され、この第五の分子は一度結合されると、もう1つの種類の基を示し、特に基−CHO−、−COOH又は−NH2を有するリガンドともう1つの共有結合カップリングを可能にする、
ことを特徴とする、生体液の体外浄化のための機能性担体。 - アクリロニトリル及びメタリルスルホン酸ナトリウムのコポリマーから製造される半透膜を含むことを特徴とする、請求項1ないし7の何れか一項に記載の機能性担体。
- 前記第一の分子又は巨大分子が、分子量10,000〜2,000,000ダルトンの置換型又は非置換型のポリエチレンイミン(PEI)であることを特徴とする、請求項1ないし7の何れか一項に記載の機能性担体。
- 一つの分子が、第三、第四、及び第五の分子の機能を果たし、この分子は式:
NH2−NH−CO−Y−CO−NH−NH2
(ここにおいてYは好ましくは基(CH2)mであり、ここにおいてmは2〜6である)
のジヒドラジンであることを特徴とする、請求項4ないし7の何れか一項に記載の機能性担体。 - 多孔質又は非多孔質の平面フィルム、中実又は中空の繊維、多孔質又は非多孔質の微小球、又はこれらの組合わせの形態で、膜、特に透析膜の成分中に入っていることを特徴とする、請求項1ないし12の何れか一項に記載の機能性担体。
- 生体液の特異的体外浄化用モジュールであって、生体液の循環のための区画を少なくとも一つ含み、前記区画の少なくとも一部は、請求項1ないし13の何れか一項に記載のイオン性機能性担体により区切られている、体外浄化用モジュール。
- 前記機能性担体の第二の分子のカルボン酸基が、結合を形成し得る又は修飾され得る遊離カルボン酸基であることを特徴とする、請求項14に記載のモジュール。
- 生体液の非特異的体外浄化用モジュールであって、生体液の循環のための区画を少なくとも一つ含み、前記区画の少なくとも一部は、請求項7ないし12の何れか一項に記載のイオン性機能性担体により区切られている、体外浄化用モジュール。
- 生体液の特異的体外浄化のための多目的機能性担体の調製方法であって、
前記機能性担体の表面が、
以下の条件を満たす官能基を含み:
−少なくとも約15℃〜約45℃の温度において安定している;
−血液適合性を有している;
−医療装置に用いることができる滅菌方法の少なくとも1つに対して、特にガンマ線に対して安定している;
第一の分子又は巨大分子がイオン結合によって結合していることにより電荷を帯びており、前記第一の分子は第二の分子に共有結合したアミン基を示しており、前記第二の分子は特異的リガンドとの直接的又は間接的共有結合を可能にする遊離カルボン酸基を示し、
前記生体液の体外浄化は、あるいくつかの病気又はあるいくつかの生物学的機能障害を発生させる分子又は巨大分子の除去のための治療であり、
a.一定の病気に応じて適切なリガンド又はリガンド混合物を選択する、
b.担体を前記リガンド又はリガンド混合物と結合させ、カップリング生成物を得る、
ことにより特徴付けられる、方法。 - 生体液の体外浄化のための多目的機能性モジュールの調製方法であって、
生体液の循環のための区画を少なくとも一つ含み、
前記区画は、生体液の特異的体外浄化のための生物学的適合性を有するイオン性機能性担体により区切られており、
前記機能性担体の表面が、
以下の条件を満たす官能基を含み:
−少なくとも約15℃〜約45℃の温度において安定しておいる;
−血液適合性を有している;
−医療装置に用いることができる滅菌方法の少なくとも1つに対して、特にガンマ線に対して安定している;
第一の分子又は巨大分子がイオン結合によって結合していることにより電荷を帯びており、該第一の分子は第二の分子に共有結合したアミン基を示しており、該第二の分子は特異的リガンドとの直接的又は間接的共有結合を可能にする遊離カルボン酸基を示し、
前記生体液の体外浄化は、あるいくつかの病気又はあるいくつかの生物学的機能障害を発生させる分子又は巨大分子の除去のための治療であり、
a.一定の病気に応じて適切なリガンド又はリガンド混合物を選択する、
b.担体を該リガンド又はリガンド混合物と結合させ、カップリング生成物を得る、
ことにより特徴付けられる、方法。 - 前記リガンドが、修飾された担体の体外における使用に適した活性化物質の作用により共有結合していることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 前記リガンドが、抗体、抗原、ペプチド、蛋白質、又は糖蛋白質、ホルモン、酵素、これらの補助因子、これらの基質又は阻害物質、多糖類、レクチン、毒素又は抗毒素、核酸又はポリヌクレオチド酸、ハプテン、又はハプテンのリガンド、顔料又は色素から成る群から選ばれることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 前記病気が、自己免疫疾患であることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 前記病気が、関節リウマチであることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 前記病気が、播種状エリテマトーデスであり、前記リガンドがリポ酸であることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 生体液の浄化のために体外回路に用い得る特異的リガンドを含むカートリッジを、無菌的かつその場で調製しうることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 請求項17又は18に記載の方法において用いられる担体の調整方法であって、
前記担体は、有機基、特に:
と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性を有する機能性担体であって、
前記方法は、
a)置換又は非置換の、分子量10,000〜2,000,000のポリエチレンイミン(PEI);
b)式:
のジカルボン酸の無水物の溶液
(ここにおいて、X=[CH2]nであり、nは2又は3であるか、又はX=−CH=CH−である)、
又は式:
のモノカルボン酸の無水物の溶液、
との反応生成物と、イオン性を有する担体とを接触させることからなり、
c)このように修飾された担体が、場合によっては式:
NH2−NH−CO−Y−CO−NH−NH2
(Yは、補体を活性化しない親水基を有するという特性と、γ線に対して安定であるという特性の二重の特性を有する基から選ばれ、好ましくは基[CH2]m(ここにおいてnは2〜6である))
のヒドラジドと接触させられる機能性担体の調整方法。 - 請求項17又は18に記載の方法において用いられる担体の調整方法であって、
前記担体は、有機基、特に:
と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性を有する機能性担体であって、
前記方法は、下記工程を備える方法:
a)処理された担体を形成するために、固定アニオン基を有する担体と、置換又は非置換の分子量10,000〜2,000,000を有するポリエチレンイミン(PEI)とを接触させる工程;
b)a)で処理された担体と、式:
(ここにおいて、X=[CH2]nであり、nは2又は3であるか、又はX=−CH=CH−である)のジカルボン酸の無水物、
又は式:
のモノカルボン酸の無水物、の溶液とを接触させる工程;
c)場合によって、工程a)及びb)によって修飾された担体と、式:
NH2−NH−CO−Y−CO−NH−NH2
(ここにおいてYは好ましくは基(CH2)mであり、ここにおいてmは2〜6である)
のジヒドラジドとを接触させる工程。 - 請求項17又は18に記載の方法において用いられる担体の調整方法であって、
前記担体は、有機基、特に:
と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性を有する機能性担体であって、
前記方法は、下記工程を備える方法:
a)処理された担体を形成するために、固定アニオン基を有する担体と、置換又は非置換の分子量10,000〜2,000,000を有するポリエチレンイミン(PEI)とを接触させる工程;
b)a)で処理された担体と、式:
(ここにおいて、X=[CH2]nであり、nは2又は3であるか、又はX=−CH=CH−である)のジカルボン酸の無水物、
又は式:
のモノカルボン酸の無水物、の溶液とを接触させる工程;
c)カルボン酸基に:
立体障害を減少させ、リガンド及び/又は分子又は浄化される有形成分のその後の固定を促進するためのスペーサー機能を有する第三の分子;及び/又は
非特異的相互作用を制限するために、担体の親水性を増す機能を有する第四の分子;及び/又は
一度結合されると、もう1つの種類の基を示し、特に基−CHO又は−COOHを有するリガンドともう1つの型の共有結合カップリングを可能にする第五の分子、
を共有結合させる工程。 - 前記イオン性担体が、アクリロニトリルコポリマー及びメタリルスルホン酸ナトリウムである、請求項17、18、又は25ないし27に記載の方法。
- 請求項1ないし13のいずれか一項に定義されている担体と、抗体、抗原、ペプチド、蛋白質、又は糖蛋白質、ホルモン、酵素、これらの補助因子、これらの基質又は阻害物質、多糖類、レクチン、毒素又は抗毒素、核酸又はポリヌクレオチド酸、ハプテン、又はハプテンのリガンド、顔料又は色素から成る群から選ばれるリガンドとのカップリング生成物。
- 請求項1ないし13のいずれか一項に記載の担体、又は請求項14ないし16のいずれか一項に記載のモジュールを組込んでいる、血液の体外循環のための装置。
- 透析装置であることを特徴とする、請求項30に記載の装置。
- あるいくつかの病気又はあるいくつかの生物学的機能障害を発生させる分子又は巨大分子の除去のための装置であることを特徴とする、請求項30に記載の装置。
- 前記病気が、自己免疫疾患であることを特徴とする、請求項32に記載の装置。
- 前記病気が、播種状エリテマトーデス(SLE)又は関節リウマチであることを特徴とする、請求項33に記載の装置。
- 次のものを含むキット:
−請求項14から16のいずれか一項に記載の多目的に使用しうるモジュール;
−機能性担体とリガンドとの反応の活性化溶液を含む滅菌容器又は滅菌袋;
−場合によっては選ばれたリガンドの溶液を含む滅菌容器又は滅菌袋;
−場合によってはリガンドの活性化及び/又は共有結合カップリングに必要な緩衝溶液又はリンス溶液。 - 活性化溶液がカルボジイミドであり、リガンドがリポ酸であることを特徴とする、請求項35に記載のキット。
- 活性化溶液が、過ヨウ素酸ナトリウムであり、リガンドが抗体であることを特徴とする、請求項35に記載のキット。
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