ES2328534T3 - Medios para la biodepuracion de un fluido biologico. - Google Patents

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Abstract

Soporte funcionalizado para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, caracterizado por el hecho de que: - su superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes: - ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC; - ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma; - y su superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales son fijadas por enlace covalente moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos que han permitido el acoplamiento directo o indirecto, de manera covalente, de ligandos específicos.

Description

Medios para la biodepuración de un fluido biológico.
La presente invención se refiere a membranas para la biodepuración de un fluido biológico.
Se entiende por depuración o biodepuración en el conjunto de este texto el proceso de eliminación parcial o total de una molécula o macromolécula endógena o heteróloga presente en el fluido biológico y cuya eliminación total o parcial se persigue; pudiendo esta molécula o macromolécula estar aislada en estado soluble, o bien formando complejo con otras sustancias.
La presente invención es igualmente relativa a un dispositivo polivalente para la depuración de un fluido biológico. El dispositivo está constituido por un soporte funcionalizado, hemocompatible en el caso de una utilización en un circuito extracorpóreo para el tratamiento de la sangre. La particularidad del dispositivo es la de poder fijar de manera covalente todo tipo de ligando utilizable para modificar la actividad o la composición de un fluido biológico.
La invención es igualmente relativa al procedimiento de obtención y a la puesta en ejecución del soporte ya sea en solitario, o bien integrado en un kit (kit = conjunto de materiales y utensilios) de preparación extemporánea del soporte susceptible de llevar un ligando específico.
Han sido desarrolladas membranas semipermeables biocompatibles para la diálisis de pacientes insuficientes renales. Estos soportes pueden tomar la forma ya sea de membranas planas, o bien de fibras huecas. Han sido puestas a disposición de los usuarios por los fabricantes varias membranas hechas a base de polímeros sintéticos o a base de celulosa modificada. Los polímeros utilizados son raramente homopolímeros, y ninguna membrana está constituida únicamente por poliacrilonitrilo.
A título de ejemplo, la membrana de PAN (PAN = poliacrilonotrilo) de Asahi está constituida por un copolímero de acrilonitrilo, metacrilato de metilo y ácido acrílico; y esta membrana presenta una estructura microporosa asimétrica formada por una capa densa en contacto con la sangre y una pared esponjosa en el lado del dializado. La membrana de SPAN (SPAN = copolímero de injerto de almidón-poliacrilonitrilo) de ENKA es igualmente una membrana microporosa asimétrica hecha a base de acrilonitrilo, metalilsulfonato de sodio y metacrilato de metilo.
La membrana de AN69 fabricada y comercializada por HOSPAL (Meyzieu, Francia) es a base de un copolímero de acrilonitrilo y metalilsulfonato de sodio. Esta membrana es conocida por sus propiedades de biocompatibilidad y de transferencia. El contenido de sitios aniónicos (procedentes del comonómero metalilsulfonato de sodio) del polímero AN69 es de 600 mEq/kg. El de la membrana es de aproximadamente 180 Eq/kg (contenido de polímero cercano al 30%).
Otros polímeros, principalmente polímeros de polisulfona, presentan igualmente una estructura microporosa asimétrica, son fundamentalmente hidrofóbicos y deben ser mezclados con componentes hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona para poder proporcionar membranas de diálisis dotadas de propiedades difusivas suficientes.
Los soportes hidrofílicos simétricos, ya sea estando en forma de fibras huecas o bien estando en forma de membranas planas según el uso que se desee hacer de los mismos, presentan además ventajas funcionales en cuanto a su biocompatibilidad por cuanto que son débilmente activadores del complemento, no trombogénicos y de gran capacidad de difusión.
De manera general, todo polímero aniónico biocompatible, como los copolímeros de acrilonitrilo, puede proporcionar soportes funcionalizables mediante los procedimientos de la invención.
La presente invención se ocupa de dos tipos de biodepuración: Se trata, por una parte, de una biodepuración no específica tipo diálisis y/o hemofiltración comúnmente utilizada en la diálisis renal, y por otra parte, de la biodepuración en la cual se persigue eliminar de un fluido biológico una molécula o macromolécula indeseable, haciéndolo mediante una interacción específica de la molécula o de las macromoléculas a eliminar con un ligando o ligandos acoplado(s) por covalencia a soportes hidrofílicos.
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Diálisis y hemofiltración
Se utilizan aparatos para el tratamiento de la sangre por circulación extracorpórea en diversas aplicaciones médicas o paramédicas tales como las siguientes: tratamiento de la insuficiencia renal por diálisis o hemofiltración, plasmaféresis y aféresis con intención terapéutica o no terapéutica, oxigenación de la sangre, inmunodepuración, etc.
Todos los materiales utilizados en la fabricación de estos aparatos son elegidos para ser tan biocompatibles como sea posible, para que las reacciones (coagulación principalmente) que se producen al entrar la sangre en contacto con un material foráneo no se produzcan o bien lo hagan a niveles relativamente benignos.
\newpage
Es conocida la técnica de tratar en la masa o en superficie los materiales destinados a estar en contacto con sangre para mejorar la biocompatibilidad de los mismos. Los tratamientos conocidos tienen lugar ya sea al proceder a la preparación de las soluciones de polímeros utilizadas para fabricar tal o cual parte de un aparato (tratamiento másico), o bien después de haber sido ensambladas las distintas partes del aparato y antes de la esterilización del aparato, o bien extemporáneamente, justo antes de la utilización del aparato.
Un problema particularmente arduo a resolver se plantea cuando se persigue mejorar la biocompatibilidad del elemento activo de un aparato (membrana de diálisis, por ejemplo) respetando las condiciones siguientes:
1) la elección de la sustancia utilizada para el tratamiento y las modalidades del tratamiento deben tener por resultado la modificación de un elemento activo conocido, teniendo esta modificación por efecto mejorar la biocompatibilidad del elemento activo preservando al mismo tiempo todas las cualidades conocidas del mismo (por ejemplo, para una membrana de diálisis/hemofiltración: rendimientos de las transferencias difusivas y convectivas, capacidad de adsorción de sustancias indeseables, etc.);
2) la esterilización del aparato no debe tener influencia en el tratamiento;
3) el tratamiento no debe requerir una manipulación particular por parte del usuario.
De manera más específica, la invención tiene por objetivo proponer un procedimiento de fabricación de un dispositivo que satisfaga las condiciones anteriormente enunciadas y cuyo elemento activo, antes del tratamiento, presente cargas negativas en superficie. Cuando la sangre entra en contacto con una superficie cargada negativamente, es sede de un fenómeno biológico llamado activación de la fase de contacto, que se manifiesta por la generación de sustancias activas, la calicreína y el factor XIIa, a partir de sustancias inactivas, precalicreína y factor XII.
La activación de la fase de contacto es benigna en sí, pero cuando se produce simultáneamente a ciertos factores pertubadores (toma de medicamentos hipotensores de tipo IEC por el paciente, dilución de la sangre que penetra en el aparato lleno de solución salina, concomitante descenso del pH), parece estar en el origen de reacciones indeseables llamadas anafilactoides que se manifiestan algunos minutos después del comienzo del tratamiento por diversos síntomas, entre los cuales están la sensación de calor generalizada, el engrosamiento de los dedos, los labios o la lengua, el jadeo, la náusea y el edema laríngeo. Se recuerda que las reacciones anafilactoides no están exclusivamente ligadas a la utilización de aparatos médicos cuyo compartimento de la sangre tiene una superficie interna cargada negativamente. Estas reacciones han sido observadas con intercambiadores que tienen membranas de distintas composiciones químicas, ora en una primera utilización, ora tras varias utilizaciones cuando los intercambiadores, en lugar de ser desechados tras un uso único, son reutilizados una pluralidad de veces y son reciclados después de cada uso. Como ejemplo de intercambiadores de los que una primera utilización ha ido acompañada de una reacción indeseable, pueden citarse los dializadores que tienen una membrana de polimetilmetacrilato y de poliacrilonitrilo. Han sido igualmente bien documentadas reacciones asociadas a la reutilización de los dializadores de membrana de acetato de celulosa y de polisulfona (véase "Anaphylactoide reactions associated with reuse of hollow-fiber hemodialyzers and ACE inhibitors" en Kidney International, vol. 42 (1992), pp. 1232-1237).
Biodepuración específica
La fijación covalente de macromoléculas sobre soportes sólidos ha sido objeto de numerosos desarrollos, más en particular destinados a aumentar la tasa de fijación específica y reducir la tasa de fijación no específica, por ejemplo por adsorción. A título de ejemplo, pueden citarse las solicitudes de patente WO 92/07023, 92/07006 y WO 92/05201, que desarrollan una tecnología en la cual un soporte es recubierto con un polímero hidrofílico no cargado: el epoxi-PEG (polietilenglicol), enlazado de manera covalente con una polietilenimina (PEI). El procedimiento descrito en estas tres solicitudes de patente es puesto en ejecución en un medio de reacción apolar; y el epoxi-PEG forma un enlace estable con la PEI, que, por reacción directa reduciendo el pH del medio de reacción, se fija sobre el soporte insoluble. Se obtiene entonces un soporte funcionalizado de tipo epoxi; si bien estos soportes presentan el inconveniente de ser a veces demasiado hidrofílicos debido a la presencia de estos grupos hidroxilo, y este exceso de hidrofilicidad puede impedir que una proteína que se desee utilizar a título de ligando entre en contacto con los grupos epoxi reactivos, teniendo ello como consecuencia la disminución de la tasa de fijación del ligando al soporte.
Para eliminar este problema, ha sido desarrollada una microemulsión que contiene el ligando para favorecer el contacto entre el ligando y un soporte hidrofílico (WO 92/07023).
Una de las aplicaciones particulares de una fijación de macromoléculas biológicas sobre soportes que se contemplan desde hace mucho tiempo es la depuración específica de los fluidos a efectos de purificación de moléculas o macromoléculas. Dicha depuración específica, de la cual es un ejemplo particular la inmunodepuración de proteínas plasmáticas, es habitualmente realizada pasando el plasma y más raramente la sangre obtenida mediante toma a partir de donantes por sobre un soporte sólido sobre el cual está ligado un ligando capaz de reaccionar específicamente y de ser posible con buena afinidad con la molécula que se desea obtener.
Entre los ligandos que son particularmente interesantes para la purificación se encuentra la clase de los anticuerpos monoclonales. Por la especificidad de sus interacciones con los antígenos y por las elevadas afinidades con los antígenos correspondientes, su utilización es ensayada en la inmunodepuración específica in vitro en las numerosas aplicaciones de la cromatografía de afinidad (Current Protocol in Immunology, Section II, Unit 8-2). Sin embargo, la inmunodepuración extracorpórea que tiene como objetivo la máxima depuración de la sustancia en el plasma se diferencia fundamentalmente de la inmunodepuración in vitro que tiene como objetivo la obtención de una sustancia purificada y/o concentrada, en numerosos parámetros, y en particular:
- la necesaria biocompatibilidad del soporte modificado como se ha expuesto anteriormente,
- la fijación covalente del ligando por un método que le permite conservar su integridad funcional,
- la afinidad de los anticuerpos por sus epítopes debe ser tal que la reliberación de los antígenos a la circulación sea mínima, mientras que la inmunodepuración in vitro para la obtención de sustancias purificadas debe permitir en cambio la reliberación sin desnaturalización de dichas sustancias, a riesgo de tener un más bajo rendimiento de fijación.
El único producto comercial que puede citarse a título de ejemplo de depuración extracorpórea es una columna que se compone de Proteína A incorporada a bolas de sefarosa y comercializada con el nombre de columna Immunosorba (Excorim). La Proteína A, extraída de la pared de S. aureus, tiene una afinidad por el fragmento Fc de las IgG, y también las columnas Immunosorba son de aplicación muy limitada en la medida en que son eliminadas solamente las IgG, pero todas las IgG sin distinción de su especificidad antigénica, lo cual no es evidentemente la finalidad que se persigue en la mayor parte de los casos.
Es igualmente conocido el artículo de S. Mitzner et al.: "Extracorporal endotoxin removal by immobilized polyethyleneimine" ARTIFICIAL ORGANS vol. 11, Nº 9, setiembre 1993, páginas 775-781, que divulga una depuración extracorpórea de endotoxina con ayuda de bolas de celulosa hidrofílica macroporosa ligadas de manera covalente a polietilenimina (PEI) (página 776, columna derecha, párrafo "Adsorbents"). Esto constituye el adsorbente. Como se indica en el último párrafo de esta columna, se ponen 3 ml de este adsorbente en una cápsula a través de la cual circula el fluido que contiene las endotoxinas bacterianas a eliminar.
Está claro que:
la PEI no está ligada de manera iónica al soporte celulósico,
la PEI no está ligada de manera covalente a moléculas de otro tipo que presenten grupos carboxílicos,
la cápsula según este artículo no es un módulo de diálisis que comprenda un compartimento para la circulación del fluido, delimitado al menos parcialmente por un soporte funcionalizado.
Este artículo no divulga un procedimiento de preparación de un soporte biocompatible funcionalizado polivalente que consista en seleccionar el ligando y realizar un acoplamiento del soporte con el ligando para obtener un producto de acoplamiento que permita la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico y, en consecuencia, el tratamiento terapéutico de patologías ligadas a la presencia de estas moléculas indeseables que se persigue eliminar.
El documento DE-A-4 209 988 corresponde sensiblemente al contenido del artículo de S. Mitzner et al. al que se ha aludido anteriormente. En este adsorbente celulósico para endotoxinas contenidas en fluidos biológicos, la PEI se utiliza solamente como revestimiento del soporte y como ligando (véase la columna 2, línea 48).
El documento GB-A-2 197 720 describe una placa de microtitulación sin relación con dispositivos de depuración de fluidos biológicos por circulación extracorpórea. La placa de microtitulación según la GB-A-2 197 720 es un soporte plástico de PVC o poliestireno que comprende pocillos en cuyas paredes está adsorbida PEI modificada con ayuda de glutaraldehído, para introducir funciones aldehído a las cuales se fijan secuencias de ADN conocidas que son aptas para ligarse por hibridación a secuencias de ADN diana a efectos diagnósticos. La GB-A-2 197 720 no da a conocer la existencia de enlaces iónicos entre el soporte y la PEI. La GB-A-2 197 720 no divulga moléculas de otro tipo que presenten grupos carboxílicos que permitan el anclaje de ligandos.
Los pocillos de la placa de microtitulación según la GB-A-2 197 720 no son compartimentos para la circulación de un fluido biológico. La GB-A-2 197 720 tampoco divulga un procedimiento para la depuración específica y el tratamiento de una enfermedad determinada partiendo de un soporte o de un módulo polivalente preparado en condiciones de esterilidad, con facilidad y extemporáneamente, mediante la incorporación del ligando específico apropiado.
La US-B-5 403 917 describe un soporte poroso de vidrio, de sílice y preferiblemente de celulosa, ligado de manera covalente a un polisacárido sulfatado, como por ejemplo sulfato de dextrano.
Como se indica en la columna 4, líneas 28 a 31 de la US-B-5 403 917, la celulosa a la que se ha incorporado sulfato de dextrano está alojada en compartimento cilíndrico de vidrio o de plástico de 5 a 20 cm de diámetro. El fluido del cual se persigue eliminar el TNF (TNF = factor de necrosis tumoral) o los LPS (LPS = lipopolisacáridos) circula a través de este compartimento que contiene el adsorbente. El sulfato de dextrano no está enlazado mediante enlaces iónicos con la celulosa. El sulfato de dextrano no presenta grupos carboxílicos que hayan permitido la fijación directa o indirecta de manera covalente de ligandos específicos.
La US-B-5 403 917 no describe un módulo que comprenda un compartimento previsto para la circulación del fluido a depurar y delimitado por el soporte funcionalizado. Además, la US-B-5 403 917 no divulga medios ni método de depuración específica alguno.
El artículo de Kopaciewicz, W et al.: "Synthesis of Cation-Exchange Stationary Phases Using an Adsorbed Polymeric Coating" JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, NETHERLANDS, 16 mayo 1986, vol. 358, Nº 1, páginas 107 a 117, divulga una fase estacionaria de cromatografía de intercambio catiónico. El soporte está formado por bolas de sílice en las cuales es absorbida PEI, siendo esta PEI a continuación reticulada con ayuda de una solución metanólica de glicerol diglicidol (véase el esquema 1, etapa 2, figura 1, página 110 de este artículo). La PEI reticulada se hace reaccionar con un anhídrido de ácido carboxílico (véase la etapa 3, esquema 1, figura 1) en presencia de dimetilformamida y de diisopropiletilamina DIEA.
El soporte según este artículo no lleva ligando específico para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico.
Una fase estacionaria de cromatografía de intercambio catiónico no es un soporte funcionalizado ni un módulo delimitado por este soporte para la depuración específica de fluido biológico.
Por añadidura hay que señalar que la unión entre la PEI y el soporte de sílice según este artículo no es un enlace esencialmente iónico, sino una simple adsorción. En esta resina intercambiadora de cationes, la PEI forma el ligando no específico.
Los inventores han querido utilizar las propiedades físicas y funcionales ventajosas de los sistemas existentes en materia de circulación extracorpórea para depurar los fluidos biológicos, y en particular el plasma; pudiendo una depuración de este tipo representar una terapéutica para la eliminación de moléculas o macromoléculas cuya presencia conduce a ciertas patologías o ciertas disfunciones biológicas, y más en particular de las moléculas y macromoléculas tóxicas de masa molecular superior a la de la albúmina (66.400 daltons) y no depuradas por las técnicas de hemofiltración o de hemodiálisis.
La presente invención tiene por objeto aportar un soporte funcionalizado para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico que pueda ser según la invención:
1. Ya sea enlazado de manera covalente a un ligando que sea por su parte apto para interactuar específicamente con moléculas o elementos del fluido biológico que se desea depurar;
2. O bien no enlazado pero apto para enlazarse a un ligando de este tipo.
Así, en una primera forma de realización (con ligandos), el soporte según la invención está caracterizado por el hecho de que:
\bullet su superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet y su superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales son fijadas por enlace covalente moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos que han permitido el acoplamiento directo o indirecto, de manera covalente, de ligandos específicos.
Con preferencia, los grupos funcionalizados satisfacen igualmente la condición siguiente: Tener una hidrofilicidad suficiente para evitar las fijaciones no específicas de macromoléculas, pero inferior a un umbral crítico más allá del cual sería baja cuando no nula la tasa de fijación covalente de los ligandos. El carácter hidrofílico puede ser intrínseco o bien conferido por modificación química.
Preferiblemente, los grupos carboxílicos de este soporte funcionalizado han formado directa o indirectamente enlaces covalentes con ligandos portadores de grupos: -CHO, -NH_{2}, -COOH, -SH, -OH,
1
Por ejemplo, estos grupos carboxílicos:
1) han formado enlaces amida, éster y tioéster con grupos NH_{2}, OH y SH respectivamente; o
2) han sido modificados siendo convertidos en hidracinas para formar enlaces hidrazona con aldehídos; o
3) han sido modificados siendo convertidos en aminas para formar iminas con aldehídos, pudiendo estas iminas ser estabilizadas para ser convertidas en aminas por reducción; o
4) han sido modificados siendo convertidos en 1,2-dicetona para poder formar enlaces
2
covalentes con guanidinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Según una 1ª variante, se fijan por enlace covalente a los grupos carboxílicos moléculas de un tercer tipo que tienen una función de espaciador para disminuir el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula o de los elementos contemplados a depurar.
Según una 2ª variante, se fijan por enlace covalente a los grupos carboxílicos moléculas de un cuarto tipo que tienen por función aumentar la hidrofilicidad del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas.
Según una 3ª variante, se fijan por enlace covalente a los grupos carboxílicos moléculas de un quinto tipo que presentan, una vez enlazadas, grupos de otra naturaleza que permiten otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador en particular de grupos -CHO o -COOH.
En una segunda forma de realización (sin ligandos), el soporte según la invención está caracterizado por el hecho de que:
\bullet su superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet y su superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales son fijadas, por enlace covalente, moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos a los cuales se fijan por enlace covalente:
\circ
moléculas de un tercer tipo que tienen una función de espaciador para hacer que disminuya el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula y/o de los elementos contemplados a depurar;
\circ
y/o moléculas de un cuarto tipo que tienen por función incrementar la hidrofilicidad del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas;
\circ
y/o moléculas de un quinto tipo que presentan, una vez ligadas, grupos de otra naturaleza que permiten otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador principalmente de grupos -CHO o -COOH.
Tanto si es como si no es con ligandos, el soporte funcionalizado según la invención puede ventajosamente ser una membrana semipermeable fabricada a partir de un copolímero de acrilonitrilo y metalilsulfonato de sodio.
Tratándose del ligando, el mismo es ventajosamente seleccionado de entre los miembros de un grupo que consta de anticuerpos, antígenos, péptidos, proteínas o glicoproteínas, hormonas, enzimas, cofactores de la mismas, sustratos o inhibidores de los mismos, polisacáridos, lectinas, toxinas o antitoxinas, ácidos nucleicos o polinucleótidos, haptenos o ligandos de haptenos, pigmentos o colorantes.
Ventajosamente, la molécula del primer tipo es una polietilenimina (PEI) de masa molecular comprendida entre 10.000 y 2.000.000 de daltons, siendo la PEI sustituida o insustituida.
Ventajosamente, la molécula del segundo tipo es un anhídrido de un ácido dicarboxílico de fórmula:
3
en la cual X = [CH_{2}]_{n}, siendo n igual a 2 o 3, o X = -CH=CH-.
\vskip1.000000\baselineskip
La molécula del segundo tipo es por ejemplo un anhídrido de un ácido monocarboxílico de fórmula:
4
Según una posibilidad, una sola molécula desempeña las funciones de los tipos tercero, cuarto y quinto de molécula, siendo dicha molécula una dihidracina de fórmula:
NH_{2}NHCO-Y-CO-NH-NH_{2}
donde Y es preferiblemente un grupo (CH_{2})_{m} en el cual m está comprendido entre 2 y 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ventajosamente, el soporte según la invención entra en la constitución de una membrana, y principalmente de una membrana de diálisis, en forma de películas planas o de fibras, porosas o no, macizas o huecas, de microbolas porosas o no porosas o de una combinación de las mismas.
Puede tratarse de una membrana de diálisis destinada a la diálisis renal o a la hemofiltración.
Según otro de sus aspectos, la invención tiene por objeto un módulo para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, caracterizado por el hecho de que comprende al menos un compartimento para la circulación de dicho fluido, estando este compartimento delimitado al menos parcialmente por un soporte funcionalizado tal como el definido anteriormente.
La aplicación de este módulo persigue la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, y puede extenderse a la depuración extracorpórea no específica de un fluido biológico. En este caso el soporte funcionalizado de este módulo polivalente es un soporte funcionalizado:
\bullet cuya superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre aproximadamente 15ºC y aproximadamente 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet y cuya superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales se fijan, por enlace covalente, moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos que son aptos para formar directa o indirectamente enlaces covalentes con ligandos portadores de grupos:
-CHO, -NH_{2}, -COOH, -SH, -OH.
5
La invención apunta también a un módulo para la depuración extracorpórea no específica de un fluido biológico, siendo el soporte de dicho módulo "con ligandos" y presentando dicho soporte moléculas de un 3^{er} tipo y/o de un 4º tipo y/o de un 5º tipo, es decir, siendo dicho soporte un soporte funcionalizado:
\global\parskip0.950000\baselineskip
\bullet cuya superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet y cuya superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales se fijan, por enlace covalente, moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos a los cuales se fijan por enlace covalente:
\circ
moléculas de un cuarto tipo que tienen una función de espaciador para hacer que disminuya el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula y/o de los elementos contemplados a depurar;
\circ
y/o moléculas de un cuarto tipo que tienen por función hacer que aumente la hidrofilicidad del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas;
\circ
y/o moléculas de un quinto tipo que presentan, una vez ligadas, grupos de otra naturaleza que permiten otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador principalmente de grupos -CHO o -COOH.
En el conjunto del texto, se llamará soporte funcionalizado a toda pared o superficie que comprenda grupos estables a temperatura ambiente y durante un periodo de tiempo compatible con una utilización comercial y aptos, en presencia de una sustancia activadora, para generar grupos funcionales en sí mismos aptos para reaccionar con grupos orgánicos del tipo -CHO, -NH2, -COOH, -SH, con vistas al acoplamiento directo o indirecto de un ligando que sea por su parte apto para interactuar específicamente con moléculas o elementos contemplados del fluido biológico que se desea depurar.
El módulo para la depuración extracorpórea de un fluido biológico puede igualmente comprender un soporte funcionalizado cuya superficie presente cargas por medio de las cuales sean ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presenten, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales se fijen por enlace covalente moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presenten grupos carboxílicos libres 1) aptos para formar enlaces amida, éster y tioéster con grupos NH_{2}, OH y SH respectivamente; o 2) aptos para ser modificados siendo así convertidos en hidracinas para formar enlaces hidrazona con aldehídos; o 3) aptos para ser modificados siendo así convertidos en aminas para formar iminas con aldehídos y que puedan ser estabilizados en forma de aminas por reducción; o 4) aptos para ser modificados siendo así convertidos en 1,2-dicetona (por ejemplo ciclohexanodiona, glioxal, etc. ...) para poder formar enlaces covalentes con guanidinas.
6
Para la aplicación a la biodepuración específica, los grupos carboxílicos libres pueden formar enlaces amida ya sea con el ligando que permite la biodepuración específica, o bien con una molécula de un tercer tipo que puede tener una o varias de las funciones siguientes:
- añadir un espaciador para hacer que disminuya el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula o de los elementos contemplados a depurar,
- hacer que aumente la hidrofilicidad de la membrana o del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas con proteínas o con todo sustrato susceptible de tales interacciones,
- presentar un grupo de otra naturaleza, como por ejemplo un grupo aminado que permita otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador principalmente de grupos -CHO, -COOH, -NH_{2}.
Estas distintas funcionalidades pueden acumularse y reunirse en una sola molécula. Un ejemplo ventajoso de molécula del tercer tipo que asocia las tres funcionalidades anteriormente indicadas es una dihidracida de fórmula:
NH_{2}-NH-CO-Y-CO-NH-NH_{2},
donde Y es preferiblemente un grupo (CH_{2})_{m} en el cual m está comprendido entre 2 y 6.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Además, Y debe ser elegido de forma tal que debe ser portador de grupos hidrofílicos, en ningún caso debe ser activador del complemento, y debe ser estable a al menos un método de esterilización de dispositivos médicos, tal como el método de esterilización por rayos gamma.
La utilización de un módulo según la invención en un circuito extracorpóreo implica la existencia de propiedades intrínsecas de dichos soportes que son las siguientes:
- una adsorción inespecífica mínima,
- una ausencia de activación de la fase de contacto, es decir, una generación de calicreína inferior a 10 Unidades por litro;
- una atoxicidad.
Además, para la utilización en biodepuración específica, dichos soportes deben presentar una gran capacidad de acoplamiento con los ligandos específicos.
Los módulos confeccionados a partir de dichos soportes deben permitir la circulación de un fluido biológico en condiciones compatibles con el enfoque terapéutico contemplado.
Los módulos de la invención comprenderán preferiblemente como membrana una membrana semipermeable fabricada a partir de un copolímero de acrilonitrilo y metalilsulfonato de sodio, de tipo AN69.
La presente invención se refiere igualmente a un procedimiento de preparación de un soporte biocompatible funcionalizado portador de grupos aptos para formar enlaces covalentes con grupos orgánicos, y en particular con los grupos:
-CHO, -NH_{2}, -COOH, -SH, -OH,
7
comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a) puesta en contacto de soportes que lleven grupos aniónicos fijos con una polietilenimina (PEI) de masa molecular comprendida entre 10.000 y 2.000.000 de daltons, siendo la PEI sustituida o insustituida;
b) puesta en contacto del soporte tratado en a) con una solución de un anhídrido de ácido dicarboxílico de fórmula:
8
en la cual X = [CH_{2}]_{n}, siendo n igual a 2 o 3, o X = -CH=CH-,
o un anhídrido de ácido monocarboxílico como el del ácido acético de fórmula:
9
El grupo carboxílico terminal puede ser utilizado directamente para el acoplamiento de un ligando, ya sea añadiendo una carbodiimida, o bien convirtiendo el grupo carboxilo en éster activado en forma de N-hidroxisuccinimida.
\newpage
c) dado el caso, puesta en contacto del soporte modificado en las etapas a) y b) con una dihidracida de fórmula:
NH_{2}-NH-CO-Y-CO-NH-NH_{2},
en presencia de un agente de acoplamiento activador de los grupos carboxilo tales como las carbodiimidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Y se elige de entre los grupos que no activan el complemento y son estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización de dispositivos médicos tal como las radiaciones \gamma. Y es preferiblemente un grupo [CH_{2}]_{m} en el cual m está comprendido entre 1 y 4.
A esta primera variante del procedimiento de la invención se la denomina de aquí en adelante en este texto "postacilación".
El procedimiento de la invención puede comprender una variante que conduzca a la obtención de un resultado equivalente y en la cual el anhídrido carboxílico de la etapa b) ha reaccionado con la PEI de la etapa a) antes del tratamiento del soporte como el que se propone en la etapa a); o dicho de otra manera, en esta variante un soporte biocompatible funcionalizado portador de grupos aptos para formar enlaces covalentes con grupos orgánicos, y en particular con grupos:
-CHO, -NH_{2}, -COOH, -SH, -OH,
10
puede ser obtenido mediante la puesta en contacto de soportes de carácter iónico con el producto de la reacción entre: una polietilenimina (PEI) de masa molecular comprendida entre 10,000 y 2.000.000 de daltons, siendo dicha PEI sustituida o insustituida, y una solución de un anhídrido de ácido dicarboxílico de fórmula:
11
en la cual X tiene el mismo significado como el indicado anteriormente,
o de un anhídrido de ácido monocarboxílico de fórmula:
12
El soporte así modificado es entonces puesto en contacto con una dihidracida de fórmula:
NH_{2}-NH-CO-Y-CO-NH-NH_{2},
teniendo Y el mismo significado como el indicado anteriormente.
\newpage
En otros términos, en este procedimiento de preparación el soporte es obtenido:
- por reacción de soportes de carácter iónico con:
\rightarrow ya sea
a)
polietilenimina (PEI) de masa molecular comprendida entre 10.000 y 2.000.000, sustituida o insustituida; y después con
b)
una solución de un anhídrido de ácido carboxílico de fórmula:
13
en la cual X = [CH_{2}]_{n}, estando n comprendido entre 1 y 4,
\circ X = -CH=CH-,
\circ de fórmula:
14
\rightarrow o bien con el producto de la reacción entre a) y b):
- y eventualmente por último:
\rightarrow ya sea
c)
mediante fijación por enlace covalente a grupos carboxílicos:
\bullet
de las moléculas de un tercer tipo que tienen una función de espaciador para hacer que disminuya el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula y/o de los elementos contemplados a depurar;
\bullet
y/o de las moléculas de un cuarto tipo que tienen por función hacer que aumente la hidrofilicidad del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas;
\bullet
y/o de las moléculas de un quinto tipo que presentan, una vez ligadas, grupos de otra naturaleza que permiten otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador principalmente de grupos -CHO o -COOH;
\rightarrow o bien mediante puesta en contacto del soporte así modificado con una dihidracida de fórmula:
NH_{2}-NH-CO-Y-CO-NH-NH_{2},
siendo Y elegido de entre los grupos que tienen la doble propiedad de ser portadores de grupos hidrofílicos y de ser estables a las radiaciones \gamma y que son preferiblemente un grupo [CH_{2}]_{m}, en el cual m está comprendido entre 2 y 6.
\vskip1.000000\baselineskip
En uno cualquiera de los procedimientos que se han expuesto anteriormente, el soporte de carácter aniónico es preferiblemente una membrana constituida por un copolímero de acrilonitrilo y metalilsulfonato de sodio, de tipo AN69 tal como el descrito anteriormente. La PEI tiene preferiblemente una masa molecular comprendida entre 10.000 y 2.000.000 de daltons.
\newpage
El anhídrido de ácido dicarboxílico es preferiblemente el del ácido succínico de fórmula:
15
El anhídrido es utilizado en solución de una concentración de 0,5M a 2M en el acetonitrilo. Se llama a esta segunda variante "preacilación", para diferenciarla claramente de la primera.
Tras el acoplamiento ya sea del anhídrido acético o bien del anhídrido succínico a la PEI mediante un enlace amida, el conjunto es puesto en contacto con el soporte aniónico. En el caso del tratamiento con la PEI presuccinilada, las funcionalidades -COOH pueden reaccionar con la dihidracida que es preferiblemente la ADH (dihidracida adípica) en la cual m es igual a 4.
La invención se refiere más en general a los soportes que son susceptibles de ser obtenidos por el procedimiento o su variante anteriormente descritos, así como a los módulos de biodepuración que los comprenden. Estos soportes deben satisfacer las mismas condiciones como las que han sido enumeradas anteriormente.
Los procedimientos de la invención anteriormente descritos pueden ser puestos en ejecución para la preparación de membranas de diálisis y/o de hemofiltración. La invención se refiere a las membranas que son susceptibles de ser obtenidas por estos procedimientos, tanto si los mismos consisten en una postacilación de la PEI como si los mismos consisten en una preacilación de ésta última.
Forman parte de la invención los módulos de diálisis que comprenden las membranas así realizadas.
Según otro de sus aspectos, la invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de un soporte biocompatible funcionalizado polivalente para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, o de un módulo polivalente para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, comprendiendo este módulo al menos un compartimento para la circulación de dicho fluido, estando este compartimento delimitado al menos parcialmente por el susodicho soporte funcionalizado,
\rightarrow siendo este soporte tal que:
\bullet
su superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet
y su superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales se fijan, por enlace covalente, moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos que permiten el acoplamiento directo o indirecto, de manera covalente, de ligandos específicos;
\rightarrow y representado esta depuración extracorpórea específica de un fluido biológico una terapéutica para la eliminación de moléculas o macromoléculas cuya presencia conduce a ciertas patologías o ciertas disfunciones biológicas;
estando dicho procedimiento caracterizado por el hecho de que consiste
a. en seleccionar el ligando o la mezcla de ligandos apropiados en función de la patología que se dé;
b. en realizar un acoplamiento del soporte con el ligando o las mezclas de ligandos, para obtener un producto de acoplamiento.
Los ligandos susceptibles de ser acoplados a los soportes funcionalizados pueden ser de naturaleza homogénea o heterogénea, es decir que pueden estar constituidos por una sola especie molecular o por una mezcla compatible de varias especies moleculares si se persigue depurar el fluido biológico de varias moléculas simultáneamente, o de una sola molécula con ligandos que tengan una distinta afinidad para distintos sitios de la misma; pudiendo tratarse por ejemplo, cuando el ligando es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, de una mezcla de anticuerpos de especificidades distintas. La puesta en contacto de un fluido biológico con el soporte así modificado para un acoplamiento covalente de dichos ligandos permite eliminar selectivamente una o varias especies moleculares o macromoléculas, o el elemento contemplado del fluido biológico, que presenten una afinidad con el ligando o los ligandos.
Los ligandos serán fijados de manera covalente por todo medio conocido, por acción de una sustancia activadora compatible con una utilización extracorpórea del soporte modificado. Tales medios están descritos en los documentos siguientes: patente US 4 217 338; Thomas et al., Colloids and surfaces A. (1993) vol. 77; 125-139; Malmsten et al. J. Colloid and Interface Science. (1996) vol. 177; 70-78.
Los números entre paréntesis corresponden a referencias bibliográficas cuya lista se da para el conjunto del texto al final de la descripción.
Cuando los ligandos son anticuerpos, son posibles dos enfoques para hacerlo; consistiendo el primero en acoplar los anticuerpos por enlace amida entre los grupos aminados de los anticuerpos y los grupos carboxilo de los soportes.
El segundo consiste en oxidar los anticuerpos mediante peryodato de sodio, y en acoplarlos después mediante la formación de un enlace hidrazona entre grupos aldehído engendrados en los grupos glucídicos de la molécula y las hidracidas ácidas del soporte funcionalizado por las dihidracidas; siendo la eficacia del acoplamiento en estas condiciones máxima cuando el pH está comprendido entre 4 y 6.
Está representado en las figuras 1 y 2 un ejemplo de cada uno de estos enfoques.
Sería fastidioso y vano enumerar todas las situaciones en las cuales una biodepuración de los fluidos biológicos presentaría un interés terapéutico, tanto más por cuanto que la constante evolución de los conocimientos sobre los procesos metabólicos y patológicos aportará constantemente nuevos candidatos a la depuración; y el experto en la materia sabrá elegir y seleccionar el ligando o la mezcla de ligandos apropiados en función de la decisión terapéutica que haya tomado; y así por ejemplo, podrá, dado el caso, asociar mezclas de anticuerpos de distintas especificidades epitópicas o antigénicas en el caso de la depuración de moléculas o de mezclas complejas; y podrá en fin elegir depurar el fluido biológico mediante un ligando que presente una afinidad no por la sustancia a depurar sino por otra sustancia que forme específicamente complejo con la que se desea depurar.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o preferiblemente anticuerpos monoclonales, ya sea monoespecíficos, o bien en forma de mezcla de varias especificidades epitópicas o moleculares. A título de ejemplo, podrán citarse:
- los anticuerpos anti-citoquinas pro-inflamatorias (IL-1\beta; TNFa; IL-6) en el tratamiento del shock séptico o en el tratamiento de fenómenos inflamatorios tales como la poliartritis reumatoide;
- los anticuerpos anti-RhD en el tratamiento o la prevención de la enfermedad hemolítica del neonato;
- los anticuerpos anti-HLA, en la profilaxis de injertos de órganos.
Podrá igualmente elegirse depurar específicamente determinados elementos de la sangre tales como las células o las plaquetas con ayuda de ligandos apropiados como los anticuerpos, los receptores, las lectinas, etc. ...
Los productos de acoplamiento entre los soportes funcionalizados de la invención con los ligandos y en particular los anticuerpos monoclonales o policlonales son nuevos y forman igualmente parte de la invención, así como su utilización en la depuración de fluidos biológicos.
A fin de ser eficaz, el producto de acoplamiento debe estar caracterizado por una óptima cantidad de anticuerpos fijada variable para cada tipo de antígenos. A título de ejemplo, pueden fijarse aproximadamente 2 mg/m^{2}.
Los antígenos representan igualmente una clase de candidatos interesantes para la depuración de los fluidos biológicos, principalmente en el caso de enfermedades autoinmunes para la eliminación de los autoanticuerpos.
Las enfermedades autoinmunes representan hoy en día el tercer gran proceso patológico después de las enfermedades cardiovasculares y los cánceres, y para las mismas solamente existen tratamientos sintomáticos.
Las enfermedades autoinmunes están ante todo marcadas por una hiperactividad de los linfocitos B y se caracterizan, entre otros síntomas biológicos, por la presencia de múltiples autoanticuerpos dirigidos contra autoantígenos. A título de ejemplo pueden citarse anticuerpos anti-antígenos nucleares variados, anticuerpos anti-ADN, anticuerpos contra enzimas y nucleoproteínas que intervienen en el proceso de transcripción y traducción del ARN. Son ejemplos típicos de enfermedades autoinmunes los del lupus eritematoso diseminado (LED) o de la poliartritis reumatoide. La gran diversidad de los autoanticuerpos que pueden estar presentes en varias enfermedades sistémicas hace que el diagnóstico resulte muy difícil ya que clínicamente los síntomas están a veces mezclados.
Si la producción de autoanticuerpos parece ser una característica en los pacientes aquejados de enfermedades autoinmunes, es interesante constatar que esta producción aumenta también con la edad en los individuos sanos (8, 14, 18) sin que por ello estos individuos desarrollen patologías autoinmunes. Por otro lado, los autoantígenos diana (ADN, histonas, enzimas y nucleoproteínas) de los autoanticuerpos producidos en estas mismas personas son los mismos que los que se encuentran en las enfermedades autoinmunes, y en particular en el LED (11).
En cambio, numerosos trabajos tienen en cuenta el carácter patógeno de los inmunocomplejos. En efecto, se ha demostrado que la insuficiencia renal, que es una de las causas últimas de mortalidad en los enfermos aquejados de LED, es inducida por los depósitos de inmunocomplejos en los riñones y en particular de inmunocomplejos ADN/anti-ADN (9, 10). Recientemente Sasaki et al. han aportado un cierto número de elementos que conducen a asociar la presencia de inmunocomplejos ADN/anti-AND a la incidencia de la glomerulonefritis proliferativa difusa, y de ahí el interés de eliminar, antes de toda complicación renal, los antígenos y los anticuerpos implicados en la formación de inmunocomplejos circulantes a fin de reducir su formación en los enfermos aquejados.
Las distintas vías terapéuticas actualmente utilizadas son principalmente las siguientes:
a) el tratamiento mediante glucocorticoides que a una alta dosis (de 0,7 a 1 ml/kg) ocasionan una franca mejoría clínica con disminución de la tasa de los distintos autoanticuerpos, desaparición de los inmunocomplejos y subida de la tasa de complemento sérico;
b) los inmunosupresores, cuya utilización es más controvertida;
c) los intercambios plasmáticos o plasmaféresis.
Si bien esta última técnica ha resultado ser eficaz para algunos pacientes lúpicos, la misma presenta numerosos inconvenientes: es onerosa y de delicada puesta en ejecución, la eliminación es no selectiva puesto que depura no solamente los inmunocomplejos patógenos, sino también constituyentes esenciales tales como las inmunoglobulinas, los factores de la coagulación, las moléculas del complemento y muchos otros compuestos que tienen una actividad reguladora. Dicha técnica es por consiguiente mucho más traumatizante para el organismo que una técnica específica.
Por último, el tratamiento a menudo va seguido de fenómenos de "rebote", o bien las tasas de inmunocomplejos y de autoanticuerpos aumentan espectacularmente varios días después de haber cesado el tratamiento.
d) la aféresis, que habitualmente se realiza pasando el plasma o más raramente la sangre por un soporte sólido al cual está ligado un ligando capaz de reaccionar específicamente y de ser posible con una gran afinidad con los sitios presentes en las células diana o en los constituyentes de baja o alta masa molecular.
En el caso del LED, una posible vía terapéutica consiste en eliminar específicamente los anticuerpos patógenos, y en este caso los anticuerpos anti-ADN, por este procedimiento. Los primeros datos habían sido aportados por Terman et al., que habían utilizado una columna de ADN en forma coloidal para depurar la sangre de pacientes lúpicos. Sin embargo, el uso del ADN como ligando sigue siendo muy limitado por causa, por una parte, de su inestabilidad al contacto de enzimas tales como las nucleasas y esterasas plasmáticas, y, por otra parte, por causa del peligro potencial que va ligado a su carácter potencialmente transformante que podría presentar su reliberación a la circulación, formando complejo con proteínas séricas. Sin embargo, los anticuerpos anti-ADN pueden ser específicamente atrapados no por el ADN sino por otros compuestos con los cuales estos anticuerpos dan reacciones cruzadas. Numerosos autores entre los cuales se cuentan Lafer et al. y después Shoenfeld han demostrado que los anticuerpos anti-ADN murino y humano son capaces de reaccionar con compuestos muy distintos del ADN tales como la cardiolipina u otras moléculas fosfolipídicas cargadas negativamente; y Susuki et al. han concebido un sistema de aféresis en continuo en gel de sulfato de dextrano acoplado a un sistema de regeneración del soporte, y han puesto en evidencia una disminución de la tasa de anticuerpos anti-ADN en pacientes lúpicos. Sin embargo, el interés de esta estrategia terapéutica parece limitado por el hecho de que solamente los anticuerpos anti-ADN son parcialmente eliminados, y de que los mismos no son los únicos autoanticuerpos que se encuentran en el origen de las lesiones que se dan en el lupus.
El ácido lipoico (AL) o ácido lipoico 6,8-ditiooctanoico (AT) es una molécula de ocho átomos de carbono enlazada a dos átomos de azufre en los carbonos 6 y 8 para formar un heterociclo ditiolano.
16
En el plano metabólico constituye un cofactor esencial para oxoácido deshidrogenasas que son los complejos multienzimáticos esenciales para enzimas como la piruvato deshidrogenasa (PDH) o la oxoglutarato deshidrogenasa, a las cuales se liga de manera covalente a los grupos NH2 de la lisina (1, 2, 21).
En el plano inmunológico, se ha demostrado claramente que la parte de la PDH que corresponde al sitio de fijación del ácido lipoico constituye un autoantígeno que es susceptible de ser reconocido por autoanticuerpos en los enfermos aquejados de cirrosis biliar primitiva (7). Autores han demostrado recientemente que la presencia del ácido lipoico en este autoantígeno es determinante para este reconocimiento en estos enfermos (6, 7).
Siempre dentro del dominio inmunológico, se ha demostrado que los compuestos portadores de grupos sulfhidrilo, entre los cuales figuran el 2-mercaptoetanol y el ditiotreitol, son capaces de estimular la producción de anticuerpos en linfocitos en cultivo (3, 4, 15, 17).
Ohmori ha estudiado in vitro el efecto del AL con la finalidad de definir su eventual carácter inmunoestimulante (16). Parece evidente que el aumento de la respuesta anticuerpo consecutiva a una estimulación antigénica en presencia de AL es dependiente de la población T. En efecto, una depleción de linfocitos T auxiliares anula la acción del AL. Por otro lado, la estimulación obtenida es específica del antígeno utilizado.
La elección del ácido lipoico como ligando en el tratamiento del LED por inmunodepuración ha estado fundada en las observaciones siguientes:
1) Los sueros de enfermos aquejados de LED contienen una elevada tasa de anticuerpos anti-AL de la clase IgG pero sobre todo de la clase IgM, a diferencia de los sujetos normales, como queda de manifiesto en la figura 3.
2) La tasa de anticuerpos anti-AL aumenta en el suero de ratones MRL/lpr con la edad: Además estos ratones desarrollan espontáneamente LED al envejecer. Un estudio comparativo de las tasas de anticuerpos anti-AL en los ratones MRL/lpr y en ratones de control llamados MRL/mp en función de la edad de los animales pone claramente de manifiesto que el título de anticuerpos anti-AL aumenta a partir de la duodécima semana en el ratón MRL/lpr, mientras que esta tasa sigue siendo baja en el ratón de control MRL/mp. Los resultados están representados en la figura 4.
3) Anticuerpos anti-AL reaccionan con ADN de doble hebra, pero no con ADN de una sola hebra (13); ahora bien, el LED está caracterizado por la presencia en un momento dado de la enfermedad de anticuerpos anti-ADN de doble hebra.
4) La depuración de los anticuerpos anti-AL a partir de un suero de paciente enfermo de LED hace que disminuya simultáneamente la tasa de anticuerpos anti-ADN de doble hebra (figura 5).
En función de las observaciones y de los resultados expuestos anteriormente, parecía que el ácido lipoico era un excelente candidato para depurar el plasma de anticuerpos anti-AL y anti-ADN en la patología lúpica.
El ácido lipoico es susceptible de ser acoplado al soporte funcionalizado por enlace amida con grupos aminados conferidos por una monohidracida, por una dihidracida o por una diamina de fórmula NH_{2}-(CH_{2})_{n}-NH_{2} con n comprendido entre 2 y 6, o un poliamina de fórmula NH_{2}-(CH_{2})x-NH-(CH_{2})y-NH_{2} con x e y comprendidos entre 3 y 6, por ejemplo. Se darán a continuación en los ejemplos de realización los ejemplos de realización del acoplamiento según la invención con el ácido lipoico para el tratamiento del LED.
La invención se refiere igualmente al producto de acoplamiento entre un soporte funcionalizado según la invención y el ácido lipoico, así como a su utilización para depurar el suero de pacientes aquejados de LED. Dispositivos que comprenden este producto de acoplamiento son particularmente eficaces para tratar las enfermedades autoinmunes, y más en particular el LED.
El experto en la materia sabrá, según los casos, seleccionar el ligando apropiado para la terapéutica de una patología determinada seleccionándolo de entre los miembros de un grupo que consta, además de los anticuerpos y los antígenos anteriormente descritos, de péptidos, glicoproteínas, hormonas, enzimas, cofactores de las mismas, sustratos o inhibidores de los mismos, polisacáridos, lectinas, toxinas o antitoxinas, ácidos nucleicos o polinucleotídicos, haptenos, ligandos de hapteno, pigmentos o colorantes.
El tratamiento de una patología determinada podrá ser realizado mediante una mezcla de ligandos, ya sea de manera simultánea o bien de manera secuencial, mediante la utilización de varios productos de acoplamiento.
La presente invención se refiere a la utilización de un soporte funcionalizado tal como el descrito anteriormente y resultante de la puesta en ejecución de los procedimientos de la invención en la fabricación de un módulo polivalente destinado a la depuración extracorpórea de fluidos biológicos y en el cual son depuradas especies bioquímicas o células presentes en fluidos biológicos y cuya eliminación se persigue, y en particular antígenos, anticuerpos o haptenos.
La invención se refiere igualmente a un dispositivo de circulación extracorpórea de sangre que incorpora un soporte o un módulo según la invención.
Preferiblemente, este dispositivo es un dispositivo de tratamiento terapéutico para la eliminación de moléculas o macromoléculas cuya presencia conduce a ciertas patologías o ciertas disfunciones biológicas.
La presente invención se refiere igualmente a un kit polivalente de preparación de un producto de acoplamiento según la invención, entre el soporte funcionalizado y uno o varios ligandos específicos para la depuración de los fluidos biológicos, comprendiendo dicho kit al menos:
1 - un dispositivo portador de un soporte susceptible de ser acoplado de manera covalente a un ligando,
2 - un recipiente o bolsa estéril que contiene una solución activadora de la reacción entre el soporte funcionalizado y el ligando;
- el ligando en una solución y a una concentración apropiadas;
- dado el caso, una solución de enjuague o soluciones de enjuague.
Más concretamente, este kit puede comprender:
\bullet un módulo polivalente según la invención,
\bullet un recipiente o bolsa estéril que contiene una solución activadora de la reacción entre el soporte funcionalizado y un ligando,
dado el caso, un recipiente o bolsa estéril que contenga una solución del ligando elegido;
dado el caso, las soluciones tampón o de enjuague que sean necesarias para la activación y/o el acoplamiento covalente del ligando.
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El kit de la invención, del cual está representado un modo de realización en la figura 10, consiste en proponer una solución terapéutica que asocia un soporte modificado susceptible de ser obtenido por un procedimiento descrito anteriormente, siendo la porosidad y la modificación del soporte adaptadas al ligando y a la naturaleza y la concentración de la molécula o las moléculas o los elementos contemplados que se persigue eliminar en el fluido biológico.
En el kit, el dispositivo podrá ventajosamente ser un cartucho de diálisis, y más en particular un cartucho de AN69 funcionalizado tal como el descrito anteriormente.
Cuando el ligando del kit de la invención es el ácido lipoico y los grupos presentes en el soporte son grupos aminados, la solución activadora será preferiblemente carbodiimida en forma hidrosoluble.
Cuando el ligando del kit de la invención es un anticuerpo, la solución activadora es por ejemplo peryodato de Na. Las reacciones que intervienen en los acoplamientos son reacciones clásicas que son perfectamente conocidas para el experto en la materia, que podrá poner en ejecución las condiciones de trabajo más eficaces tanto en razón de la naturaleza del activador como en razón de las condiciones fisicoquímicas de la reacción, en función del ligando elegido.
El kit de la invención podrá ser ventajosamente utilizado por un personal cuidador o un personal cualificado asociado al mismo para preparar de manera estéril y extemporánea un cartucho portador de un ligando específico y utilizable en circulación extracorpórea para la depuración de un fluido biológico que será preferiblemente sangre o plasma.
La invención se refiere a la utilización de un kit tal como el anteriormente descrito en todo tratamiento profiláctico o terapéutico de un mamífero, y más en particular de los humanos.
La invención se refiere por último a un procedimiento de biodepuración específica de sangre o plasma humano o animal por circulación extracorpórea por un dispositivo que comprende al menos un módulo de la invención. En la representación esquemática de la figura 11, sangre total es tratada por circulación extracorpórea mediante su paso al interior de un módulo de la invención y su readministración al paciente. Dentro del marco de un tratamiento de este tipo, hay la posibilidad de ultrafiltrar una parte de la sangre, de ser necesario.
Otras características y ventajas de la invención quedarán de manifiesto en los ejemplos que se dan a continuación haciendo referencia a las figuras 1 a 23.
La figura 1 representa a título de ilustración el acoplamiento de una molécula de baja masa molecular, o sea glicina, o de un anticuerpo, a un soporte funcionalizado con PEI con grupos aminados succinilados.
La figura 2 representa un acoplamiento similar mediante enlace hidrazona a una molécula de bajo peso molecular (piruvato) o de alto peso molecular (anticuerpo oxidado).
La figura 3 representa un título de anticuerpos anti ácido lipoico en el suero de ratón MLR. Está representada en gris claro la tasa en los ratones MRL/lpr, y está representada en gris oscuro sombreado la tasa obtenida en los ratones MRL/mp.
La figura 4 representa la comparación de las tasas de IgM anti ácido lipoico en distintas patologías. C representa al control, PBC representa a la cirrosis biliar primitiva, M representa a la miastenia, RA representa a la artritis reumatoide, SLE representa al lupus eritematoso diseminado, S representa a la sífilis, y TH representa a la tiroiditis.
La figura 5 representa la disminución de los anticuerpos anti-ADN depurados tras el paso de un suero lúpico por un soporte al cual está acoplado de manera covalente ácido lipoico.
La figura 6 representa el número de sitios disponibles tras la funcionalización del AN69-PEI mediante el anhídrido succínico. La curva representa la cantidad de anhídridos obtenidos en relación con la cantidad de etanolamina introducida en el AN69 solo succinilado (representado en la curva con un círculo) y en el AN69-PEI succinilado. La determinación del contenido se ha hecho tanto a la entrada (representado en la curva con un triángulo) como en el centro (representado en la curva con un rombo) y a la salida del módulo (representado en la curva con un cuadrado).
Las figuras 7, 8 y 9 representan la fijación del ácido pirúvico ^{14}C al AN69 no funcionalizado o funcionalizado con, respectivamente, EDC (EDC = 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) y ADH, anhídrido succínico, EDC y ADH, y PEI, anhídrido succínico, EDC y ADH.
La figura 10 representa las modalidades de preparación de un módulo de tratamiento y la figura 11 representa las modalidades de tratamiento por circulación extracorpórea.
La figura 12 es una representación esquemática del procedimiento de obtención de un soporte constituido por una superficie epoxi acoplada a putrescina, apto para formar un enlace covalente con ácido lipoico en presencia de un activador que es EDC.
La figura 13 representa, a título de comparación, la formación del soporte mediante enlace éster directamente entre el AL y los grupos OH del epoxi.
La figura 14 compara las tasas de IgM anti-AL obtenidas, o en otras palabras las tasas de depuración, en un soporte de AN69-AL obtenido por enlace éster (puntos negros) o por enlace amida (rombos negros).
La figura 15 compara las tasas de depuración obtenidas tras sucesivos pasos por columnas cuyo soporte está constituido por AN69-AL.
La figura 16 representa el perfil obtenido en electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% de las proteínas eluidas tras varios pasos por el mismo soporte.
La figura 17 indica la tasa de aminas sustituidas de la PEI-P en función de cantidades crecientes de anhídrido succínico que reaccionan con la PEI.
La figura 18 representa la influencia de la postsuccinilación de la PEI-P en la activación de contacto.
La figura 19 representa la cantidad de PEI-P presuccinilada por minimódulo de AN69 en función del grado de succinilación.
La figura 20 representa la cantidad de PEI-P presuccinilada por minimódulo de AN69 en función del grado de succinilación para concentraciones variables de PEI-P presuccinilada.
La figura 21 es una representación esquemática de la presentación de los grupos cargados del ácido succínico que explica los resultados obtenidos según la tasa de presuccinilación de la PEI-P.
La figura 22 representa la activación de la fase de contacto medida según la generación de calicreína, en función de la tasa de succinilación.
La figura 23 indica la cantidad de heparina que se fija a los minimódulos recubiertos con PEI-P presuccinilada en función de la tasa de presuccinilación.
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Procedimiento de preparación de los soportes funcionalizados para la biodepuración específica y para la diálisis y la hemofiltración
El siguiente estudio trata sobre la preparación de membranas de tipo copolímero de acrilonitrilo tratadas por postacilación o por preacilación. Dicho estudio permite poner de manifiesto las ventajas del segundo método para las aplicaciones en biodepuración no específica (membranas de diálisis y/o hemofiltración) o específica (acoplamiento de un ligando o de ligandos específico(s) de las moléculas a depurar).
Las modificaciones de la PEI han sido realizadas con finalidad de:
- optimizar la tasa de funcionalización, es decir, la tasa de grupos reactivos aptos para ser acoplados, dado el caso, con un ligando;
- limitar la trombogenicidad que se observa con las membranas polianiónicas no tratadas, evitando al mismo tiempo las fijaciones no específicas, como por ejemplo la fijación de la heparina.
La PEI que ha sido utilizada en estos experimentos es el producto llamado LUPASOL-P, que es comercializado por la sociedad BASF y tiene una masa molecular media de 750.000 daltons, medida por difusión de luz.
Pueden utilizarse otros tipos de PEI, y en particular el lupasol-WF comercializado por la misma sociedad y de masa molecular media de 25.000.
El anhídrido de ácido carboxílico utilizado es el del ácido succínico. La acilación es en este caso una succinilación.
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1º Método 1.1 Modificación de superficie
todos los experimentos se realizan utilizando minidializadores que comprenden 170 fibras huecas de AN69 (diámetro interno: 210 \mum; espesor de pared: 42 \mum; longitud: 0,18 m) y PEI-P marcada con tritio y modificada o no modificada en solución en suero fisiológico (NaCl 0,14N). Se han utilizado dos enfoques:
a) los módulos han sido inicialmente tratados con PEI-P, marcada con tritio y después succinilada;
b) los módulos han sido recubiertos con la PEI-P marcada con tritio previamente succinilada, total o parcialmente.
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1.2 Preparación de la PEI-P con distintas tasas de succinilación
A 3 mg de PEI-P en 50 ml de Borato 0,05M pH 8,6 se les añade anhídrido succínico (AS) disuelto en acetonitrilo.
La cantidad de AS añadida según el grado de succinilación en la siguiente:
100% de Succinilación: 162 \mumoles de AS
80% de Succinilación: 54 \mumoles de AS
60% de Succinilación: 31 \mumoles de AS
40% de Succinilación: 18 \mumoles de AS
20% de Succinilación: 8 \mumoles de AS
Tras un tiempo de contacto de una hora bajo agitación ajustando el pH a 8,6 de ser necesario con sosa 0,1M, se detiene la reacción mediante disminución del pH a 5 mediante adición de ácido acético 12M.
La tasa de sustitución de las aminas se verifica con ayuda de fluorescamina según el método descrito en "Pratique de l'analyse organique calorimétrique et fluorométrique", de J. Bartos y M. Tesez, segunda edición, 1984, Masson, páginas 84 a 85 (figura 17).
Para revestir los minimódulos, se ajusta el pH a 8.
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1.3 Evaluación de la estabilidad de la membrana de AN69 recubierta con PEI
La estabilidad de las modificaciones de superficie ha sido evaluada estableciendo una circulación de una solución de NaCl a distintas concentraciones (0,14M, 1, 2 y 4M).
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1.4 Evaluación biológica
Para evaluar si los minimódulos tratados según la invención activan la fase de contacto, se les somete al ensayo siguiente: Se ha preparado un líquido biológico apropiado para estimular la producción de calicreínas en contacto con una membrana cargada negativamente en superficie. El líquido biológico utilizado para el ensayo estaba constituido por plasma humano pobre en plaquetas, diluido al 5% en suero fisiológico con citrato adicionado (se señala que las condiciones del ensayo utilizado distan de las condiciones de utilización de un aparato para la circulación extracorpórea de sangre: La tasa de dilución es muy elevada, el líquido elegido es plasma y no sangre, el plasma tiene citrato añadido, y está en consecuencia acidificado, mientras que en la diálisis el anticoagulante utilizado es heparina. Estas condiciones de ensayo se eligen adrede puesto que las mismas estimulan y amplifican la activación de la fase de contacto). 150 ml de este líquido han sido puestos en circulación en circuito abierto en el compartimento de la sangre del minimódulo con un caudal de 0,5 ml/min. durante 30 minutos. Las calicreínas plasmáticas han sido determinadas en muestras de líquido tomadas a intervalos de tiempo por medio de un ensayo cromogénico clásico, a partir del sustrato S 2302 de la sociedad BIOGENIC.
Se precisa que, teniendo en cuenta la sensibilidad del ensayo cromogénico utilizado, se considera que no hay una elevación significativa de la tasa de calicreínas si la concentración de calicreínas no llega a la de aproximadamente 10 unidades por litro.
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2º Resultados obtenidos 2.1 Modificación de superficie 2.1.1 Postsuccinilación
Los módulos son en primer lugar recubiertos con PEI-P marcada con tritio y después succinilada. Se indican a continuación en la tabla I los resultados:
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TABLA I Influencia de la postsuccinilación en la reliberación de la PEI-P preadsorbida en AN69
17
Estos resultados demuestran que la postsuccinilación ocasiona un 43% de reliberación de la PEI-P.
Por otro lado, está representado en la figura 18 el nivel de activación de la fase de contacto medida por vía de la generación de calicreínas. Esta figura compara la calicreína producida, medida en unidades por litro, en el caso de la membrana de AN69 al desnudo, de la membrana de AN69 recubierta con PEI-P y de la membrana de AN69 recubierta con PEI-P luego succinilada.
Esta figura muestra que el AN69 tratado con PEI-P no activa la fase de contacto. En cambio, al desorber la postsuccinilación parcialmente la PEI-P, el AN69 tratado con PEI-P postsuccinilada activa la fase de contacto.
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2.1.2 Efecto de la presuccinilación
Ha sido presuccinilado en distintos grados (figura 17) un minimódulo recubierto con PEI-P marcada con tritio, y se ha determinado la cantidad de PEI-P marcada con tritio presuccinilada adsorbida en el AN69. Los resultados aparecen en la figura 19.
La figura 19 indica que la cantidad de PEI-P adsorbida en el AN69 aumenta con el grado de succinilación, para alcanzar un máximo al ser dicho grado de succinilación de un 60%. Más allá del 60%, la cantidad de PEI-P adsorbida disminuye rápidamente.
Por otro lado, la cantidad de PEI-P adsorbida aumenta tanto con el grado de succinilación (como indica la figura 19) como con la concentración de PEI-P presuccinilada introducida en el minimódulo. La máxima adsorción se observa con una presuccinilación de la PEI-P de un 60%, y ello sucede en todos los casos.
La figura 20 indica que la cantidad de PEI-P adsorbida en el minimódulo alcanza una meseta de 216 \mug para concentraciones de PEI-P presuccinilada introducida en el minimódulo superiores o iguales a 60 mg/l.
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2.1.3 Conclusión
El aumento de la adsorción de la PEI-P presuccinilada en los módulos de AN69 puede ser resultado de un cambio conformacional resultante de una modificación de las interacciones electrostáticas entre los grupos cargados amina y carboxilo.
La figura 21 es una representación esquemática de la adsorción de PEI no presuccinilada (esquema de la parte superior) y presuccinilada en un 30%, un 60% y un 100%, en una membrana de AN69.
Cuando la PEI-P no está presuccinilada, es importante el número de grupos amina por mol de PEI-P que interactúan con los grupos iónicos (SO_{3}^{-}) de la membrana. La presuccinilación hace que disminuya el número de grupos amina por mol de PEI-P que inducen un cambio de conformación de la PEI-P presuccinilada, lo cual hace que aumente la cantidad de PEI-P adsorbida, y por consiguiente el número de sitios reactivos disponibles para la biodepuración específica. Además, el control de la tasa de presuccinilación permite controlar la cantidad de sitios reactivos que son susceptibles de ser obtenidos en las membranas de AN69 así tratadas.
En cambio, en el caso de la postsuccinilación, en el primer esquema de la figura 21 puede verse que el número de sitios N+ reactivos es relativamente bajo, lo cual conduce así a un número de sitios carboxilo reactivos tras succinilación que es más bajo que en el caso de la presuccinilación.
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2.2 Estabilidad de la PEI marcada con tritio no succinilada y presuccinilada tras lavado de los minimódulos con concentraciones salinas crecientes
En el caso de la postsuccinilación, el acoplamiento del anhídrido succínico a la PEI pasa por una etapa de desprotonación que conduce a una reliberación de un 30 a un 40% de la PEI debido al debilitamiento de la unión entre los grupos NH3+ y los grupos SO3- de la membrana (como se ha mostrado anteriormente en la tabla I).
La siguiente tabla II muestra el porcentaje de desorción de la PEI-P tras lavado con incremento de la concentración salina.
TABLA II
18
El resultado demuestra que cuando los minimódulos son tratados con 40, 60 y 110 mg/l de PEI-P presuccinilada y son después lavados con 20 ml de suero fisiológico (NaCl 0,14M), no hay desorción de la PEI-P, y ello es así hasta una concentración salina de 1M. En cambio, cuando los minimódulos son lavados con una solución salina que tiene una molaridad superior o igual a 2M, se observa en todos los casos una desorción parcial de la PEI-P presuccinilada.
El nivel de desorción de la PEI-P presuccinilada aumenta con el grado de presuccinilación.
Un tratamiento de los minimódulos con PEI-P presuccinilada en un 60% es óptimo para obtener el máximo de sitios funcionales.
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2.3 Hemocompatibilidad
La figura 22 indica que el AN69 tratado con PEI-P presuccinilada en un porcentaje de entre un 20 y un 70% no provoca la activación de la fase de contacto. En cambio, cuando el tratamiento del AN69 se realiza con una PEI-P presuccinilada en un 100% (figura 22), la activación de la fase de contacto que se observa es equivalente a la del AN69 no tratado con PEI-P.
Una ventaja suplementaria del tratamiento superficial del AN69 con la PEI-P presuccinilada es la disminución de la adsorción de la heparina sobre el soporte con respecto a la adsorción que se observa con el AN69 tratado con PEI-P no succinilada (figura 23). Esto representa una ventaja considerable cuando estas membranas son utilizadas en hemodiálisis/hemofiltración, puesto que la heparina es a menudo utilizada como anticoagulante.
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3º Conclusiones
Estos experimentos comparativos han permitido definir las condiciones óptimas de preparación de las membranas de AN69 funcionalizadas, en particular cuando las mismas son tratadas con PEI-P preacilada. Si el anhídrido de ácido carboxílico es el del ácido succínico, estas condiciones son las siguientes:
- un grado de succinilación de un 60%;
- un tratamiento en superficie con una concentración de 60 mg/l de PEI presuccinilada.
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Esto conduce a:
- una funcionalidad máxima de 2 \muM de COOH/m^{2} de membrana:
- una muy buena estabilidad en un medio de alta fuerza iónica (hasta 1 molar);
- ausencia de activación de la fase de contacto de la sangre;
- una limitada adsorción de heparina en el soporte, lo cual constituye una ventaja considerable cuando se utiliza este tipo de membranas en diálisis/hemofiltración.
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De manera general, esta técnica permite controlar de manera reproducible el número de sitios reactivos presentes en la membrana tratada, y concretamente:
- un aumento del número de sitios reactivos para la aplicación a la biodepuración específica;
- la reproducibilidad del número de sitios reactivos obtenidos en el conjunto de las aplicaciones de las membranas de la invención.
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Los experimentos que se describen a continuación ponen además de manifiesto la ventaja de la presuccinilación con respecto a la postsuccinilación. En efecto, en ésta última una reliberación de la PEI prefijada provoca la probable formación de "agujeros" en el revestimiento de la membrana de AN69. La existencia de tales "agujeros" conduce a efectos indeseables, y en particular a efectos de activación de la fase de contacto, que se observan en la membrana al desnudo, no recubierta.
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Ejemplo 1 Inmovilización de los anticuerpos anti-IL6 en AN69-PEI-epóxido de PEG
Hemos llevado a cabo experimentos para determinar el mejor método para inmovilizar los anticuerpos anti-IL6 sobre los soportes insolubles, como por ejemplo la sefarosa, y una vez establecido el método, para aplicarlo al AN69.
Se han puesto en ejecución dos técnicas de acoplamiento de los anticuerpos utilizando IgG marcadas con tritio [^{3}H].
a) un acoplamiento por enlace amida a \varepsilonNH_{2} de la lisina en la cadena proteica de las IgG;
b) un acoplamiento por enlace hidrazona a grupos glucídicos previamente oxidados y que se encuentran en la parte Fc de la IgG según la técnica descrita en los documentos siguientes: Patente US Nº 4217338; Quash et al. J. Immunol. Methods, 1978, 22, 165-174.
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Las bolas de sefarosa y los Ac (Ac = anticuerpos) anti-IL6 son puestos en contacto durante 2 horas a razón de un volumen de bolas por un volumen de Ac anti-IL6 a concentraciones crecientes de Ac anti-IL6 depositados.
La cantidad de radiactividad obtenida en cada muestra de bolas es entonces medida en un contador de escintilación líquida PACKARD MINAXI \beta.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Los resultados están indicados en las siguientes tablas I y II:
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TABLA I Acoplamiento covalente de los Ac anti-IL6 sobre bolas de sefarosa
19 
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Los resultados de la tabla I demuestran que:
1) para bajas concentraciones de Ac anti-IL6 puestas en juego, la cantidad de anticuerpos acoplados representa un 20% de la cantidad de anticuerpos depositados, y ello es así para las dos técnicas (tabla I),
2) el hecho de aumentar la concentración de Ac anti-IL6 depositados provoca un aumento de la cantidad de Ac anti-IL6 acoplados por medio de las dos técnicas, puesto que se pasa de 0,54 \mug a 13,6 \mug de Ac anti-IL6 acoplados por cada 40 cm^{2} de bolas cuando el anticuerpo anti-IL6 es acoplado mediante enlace amida. Esta cantidad es de 0,38 \mug a 18 \mug de Ac anti-IL6 acoplados por cada 40 cm^{2} de bolas cuando los Ac anti-IL6 son acoplados mediante enlace hidrazona,
3) cuando los Ac anti-IL6 son acoplados mediante enlace hidrazona, el rendimiento de acoplamiento aumenta en función de la cantidad de Ac anti-IL6 depositada, pasando de un 20% a un 42%, mientras que para los Ac anti-IL6 acoplados mediante enlace amida el rendimiento de Ac anti-IL6 acoplados se mantiene constante (26%) en función de la cantidad de Ac depositada.
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Experimentos llevados a cabo para determinar el grado de adsorción de los anticuerpos anti-IL6, oxidados o no oxidados, sobre bolas de sefarosa han demostrado que esta adsorción no sobrepasaba el 7%.
Así pues, parece que si la cantidad de Ac anti-IL6 acoplados aumenta para las dos técnicas en función de la concentración de Ac anti-IL6 depositados, la eficacia de acoplamiento de estos Ac anti-IL6 es superior cuando estos Ac anti-IL6 son acoplados mediante enlace hidrazona.
Esto es más marcado a altas concentraciones de Ac añadidos:
- un 42% para enlace hidrazona,
- un 26% para enlace amida.
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Ejemplo 2 Inmunodepuración del antígeno IL6 en AN69-PEI-epóxido de PEG 2.1 Sobre bolas de sefarosa con Ac anti-IL6 acoplados mediante enlace amida o enlace hidrazona
Se han efectuado ensayos de inmunodepuración de la IL6 utilizando:
- por una parte bolas a las cuales los Ac anti-IL6 han sido acoplados en cantidades crecientes ya sea mediante enlace amida o bien mediante enlace hidrazona según las técnicas y las mismas relaciones que se enuncian en el párrafo I, 1) y en la tabla I,
- por otra parte haciendo que varíe la tasa de IL6 que está presente en los sueros a someter a ensayo. Para ello, hemos diluido un suero que contenía una tasa muy elevada de IL6 (1,7 \mug de IL6 por 1 ml de suero) en una mezcla de sueros negativos previamente sometidos a ensayo. Finalmente los sueros sometidos a ensayo tienen una tasa final de IL6 de 33.050, 22.470, 11.235 y 3.157 pg/ml.
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Estas bolas de sefarosa/Ac anti-IL6 son entonces puestas en contacto con distintas mezclas de sueros modificados a razón de un volumen de bolas por un volumen de sueros.
La tasa de IL6 que permanece en los sueros antes y después de haber sido los mismos pasados por las bolas se mide mediante una técnica inmunoenzimática de tipo sándwich.
Los resultados figuran en la siguiente tabla II.
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TABLA IIa % de IL6 inmunodepurada tras el paso por las bolas
20
TABLA IIb % de IL6 inmunodepurada tras el paso por las bolas
21
Estos resultados demuestran que:
1) el soporte en solitario (bolas sin Ac anti-IL6), tratado o no tratado con hidracina, no fija la IL6.
2) cuanto mayor es la cantidad de Ac anti-IL6 acoplados, tanto más eficaz es la inmunodepuración de la IL6, y ello es así para las dos técnicas de acoplamiento utilizadas.
3) cuando los Ac anti-IL6 son acoplados a razón de 13,6 \mug/40 cm^{2} (enlace amida) y de 18 \mug/40 cm^{2} (enlace hidrazona), la inmunodepuración de la IL6 es eficaz en un 90-100% para las dos técnicas de acoplamiento utilizadas y para sueros que tienen una baja o una alta tasa de IL6.
4) para cantidades de Ac anti-IL6 acoplados inferiores a 13,6 \mug/40 cm^{2} (enlace amida) y a 18 \mug/40 cm^{2} (enlace hidrazona), la inmunodepuración de la IL6 disminuye en función de la cantidad de Ac anti-IL6 acoplados y en función de la tasa IL6 que esté presente en el suero.
En efecto, cuando los Ac anti-IL6 son acoplados mediante enlace amida a razón de 2,64 \mug/40 cm^{2}, la eficacia de inmunodepuración disminuye pasando de ser de un 98% para un suero con 3.157 pg/ml de IL6 a ser de un 81,3% para un suero con 35.030 pg/ml de IL6. De igual modo, cuando los Ac anti-IL6 son acoplados a razón de 0,54 \mug/40 cm^{2}, la eficacia de inmunodepuración disminuye pasando de ser de un 86,9% para un suero con 3.157 pg/ml de IL6 a ser de un 18,5% para un suero con 35.030 pg/ml de IL6. (tabla II).
Cuando los Ac anti-IL6 son acoplados mediante enlace hidrazona a razón de 2,72 \mug/40 cm^{2}, la eficacia de inmunodepuración disminuye pasando de ser de un 90% para un suero con 3.157 pg/ml de IL6 a ser de un 54,2% para un suero con 35.030 pg/ml de IL6. Del mismo modo, cuando los Ac anti-IL6 son acoplados a razón de 0,38 \mug/40 cm^{2}, la eficacia de inmunodepuración disminuye pasando de ser de un 57,1% para un suero con 3.157 pg/ml de IL6 a ser de un 28,5% para un suero con 35.030 pg/ml de IL6 (tabla III).
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Conclusión
El acoplamiento de los Ac anti-IL6 mediante enlace amida o mediante enlace hidrazona preserva su actividad frente a la IL6.
Para que la inmunodepuración de la IL6 presente en un suero que contenga hasta 35.000 pg/ml sea eficaz en un 90-100%, la cantidad de Ac anti-EL6 acoplados debe ser del orden de 0,4 \mug/cm^{2}. Esta eficacia de inmunodepuración es la misma para los Ac anti-IL6 acoplados ya sea mediante enlace amida o bien mediante enlace hidrazona.
Para cantidades de Ac anti-IL6 acoplados inferiores a 0,4 \mug/cm^{2}, la inmunodepuración de la IL6 es tanto o menos eficaz cuanto mayor es la tasa de IL6 presente en un suero. Esta constatación se cumple para los dos tipos de enlace, si bien cuando los Ac anti-IL6 son acoplados mediante enlace amida la inmunodepuración de la Il6 es de manera general más eficaz que cuando los Ac anti-IL6 son acoplados mediante enlace hidrazona.
Habiendo sido definida sobre bolas la cantidad óptima de Ac anti-IL6 acoplados por cm^{2} para una inmunodepuración de la IL total, podemos pasar a la inmunodepuración de la IL6 sobre minimódulos de AN69.
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2.2. Ensayos de inmunodepuración de la IL6 sobre minimódulos de AN69
Los minimódulos han sido hidrofilizados y funcionalizados (H&F) según el método descrito en el documento WO 92/07023.
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1) Métodos
Se han ensamblado minimódulos que comprenden 170 fibras huecas de AN69 de 18 cm de longitud (superficie interna: 256 cm^{2}). Estos minimódulos han sido sometidos a un tratamiento con tetraepóxido de PEG a fin de generar grupos epóxido.
Hemos acoplado mediante enlace hidrazona Ac anti-IL6 marcados con propionato ^{3}H a uno de los dos minimódulos de AN69 en las mismas condiciones como para las bolas a razón de 0,4 \mug/cm^{2} sabiendo que estos 0,4 \mug/cm^{2} de Ac acoplados representan teóricamente un 42% de los Ac depositados si se considera que la eficacia de acoplamiento a las fibras de AN69 es similar a la eficacia de acoplamiento a las bolas de sefarosa.
Así pues, hemos puesto en contacto 0,95 \mug de Ac por 1 cm^{2} de fibra, o sea 243 \mug de Ac por cada 256 cm^{2} de fibra.
Por otra parte, hemos acoplado Ac de cabra testigo siempre mediante enlace hidrazona al segundo minimódulo de AN69 en las mismas condiciones como para el minimódulo de AN69 + Ac anti-IL6.
Tres ml de suero con 11.203 pg/ml de IL6 se han hecho recircular durante dos horas pasándolos por estos minimódulos (0,5 ml/min.).
Después la tasa de IL6 presente es entonces medida mediante una técnica inmunoenzimática de tipo sándwich antes y después del paso por estos minimódulos.
Según la tabla III, queda de manifiesto que la inmunodepuración ha sido eficaz y específica, puesto que tras el paso por el AN69 que tiene incorporados los Ac testigo no hay más que un 14% de IL6 retirada no específicamente, mientras que tras el paso por el AN69 con los Ac anti-IL6 la tasa de inmunodepuración aumenta hasta llegar a ser de un 77,5%.
TABLA III Inmunodepuración de la IL6 tras el paso por el AN69
22
En las condiciones experimentales utilizadas, la tasa de fijación de anticuerpos anti-IL6 al módulo de AN69 es de 0,11 \mug/cm^{2}.
La hipótesis más verosímil que puede explicar este rendimiento medio de acoplamiento de los Ac anti-IL6 a las fibras de AN69 es la de la raridad de sitios epóxido en la superficie de las fibras y por consiguiente la raridad tras tratamiento con dihidracida adípica de grupos hidracina disponibles para generar un enlace hidrazona con las aldehídos de la parte glucídica de los Ac oxidados.
Sabemos que la inmunodepuración de la IL6 es eficaz en un 100% para sueros cuyas tasas de IL6 son \leq 35.000 pg/ml, a condición de que la cantidad de Ac anti-IL6 acoplados sea de al menos 0,4 \mug/cm^{2}. Ahora bien, tenemos a nuestra disposición un sistema (fibra de AN69) que probablemente no permite obtener tal densidad de Ac acoplados de manera covalente por cm^{2} y por consiguiente limita la inmunodepuración de la IL6.
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2.3 Control de la capacidad para fijar el complemento
Habiendo sido demostrada la eficacia de depuración de la IL6 sérica por parte del minimódulo de AN69 hidrofilizado y funcionalizado (H&F) y con Ac anti-IL6 incorporados al mismo, hemos determinado si este mismo minimódulo químicamente modificado conservaba su propiedad inicial relativa a su no reactividad para con el sistema del complemento. Así pues, hemos verificado su capacidad para fijar o no fijar el complemento.
Las membranas de AN69 H&F no han fijado el complemento añadido a razón de 0,625 UH50 (UH50 = unidades hemolíticas al 50%) o de 2,5 UH (UH = unidades hemolíticas).
Los cartuchos de AN69 H&F con los Ac incorporados a los mismos permiten eliminar específicamente el Ag (Ag = antígeno) correspondiente y no engendran la fijación del complemento.
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Ejemplo 3 Preparación del AN69-PEI postsuccinilada para la biodepuración específica
Esta preparación se ha hecho mediante tratamiento de los minimódulos con PEI WF, seguido por una postsuccinilación.
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3.1 Determinación del número de sitios disponibles en el AN69-PEI para la fijación de moléculas de baja masa molecular (FPM) 1) Tras funcionalización del AN69-PEI mediante anhídrido succínico
Para este estudio, hemos utilizado un módulo constituido por una membrana plana que representa una superficie de 1 m^{2}. Este módulo ha sido tratado con PEI y después desmontado a fin de poder tomar en los extremos y en el centro del módulo muestras de membrana de 4,5 cm^{2} con ayuda de un sacabocados.
Hemos comparado el número de sitios disponibles en estas pastillas de AN69-PEI con respecto a pastillas de AN69 testigo utilizando una molécula de baja masa molecular radiomarcada: la [^{14}C] etanolamina.
El anhídrido succínico es a continuación fijado mediante el protocolo siguiente:
- Preparación de una solución de anhídrido succínico 1M en acetonitrilo;
- Dilución de la misma en 1/10 en tampón de borato 50 mM pH 8,5, y dejarla en contacto con las pastillas de AN69 testigo y AN69-PEI durante 15 minutos;
- Reiniciar la operación una segunda vez;
- Intensos lavados en H_{2}O.
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En las partidas así obtenidas, la etanolamina marcada es fijada de la manera siguiente:
a) activación de los grupos COOH generados:
a - 1):
preparar una solución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (50 nM) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (50 nM) en NaH_{2}PO_{4} 10 nM y dejarla durante 15 minutos en contacto con las pastillas.
a - 2):
eliminar la solución de activación.
b) fijación de etanolamina:
b - 1):
preparar diluciones isotópicas de etanolamina no marcada/etanolamina marcada
-
4 nmoles sin marcar/0,4 nmoles marcada
-
40 nmoles sin marcar/0,4 nmoles marcada
-
400 nmoles sin marcar/0,4 nmoles marcada
-
4000 nmoles sin marcar/0,4 nmoles marcada,
\quad
siendo cada solución preparada en borato 50 mM pH 8 final.
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b - 2):
dejarlas en contacto con las pastillas de AN69 testigo y de AN69-PEI durante dos horas bajo agitación, y después lavar en borato/NaCl 0,5M y contar.
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La figura 6 muestra que:
- la cantidad óptima de etanolamina retenida sobre AN69 + PEI + anhídrido succínico es de 5,6 nmoles/pastilla.
- la cantidad de etanolamina retenida sobre AN69 + anhídrido succínico es de 1,2 nmoles/pastilla.
Así pues, la cantidad de etanolamina realmente retenida sobre AN69 + PEI succinilado es de 5,6-1,2 = 4,4 nmoles/4,5 cm^{2}, o sea 1 nmol/cm^{2} o 10 \mumoles/m^{2}.
Por último la figura 6 muestra que la cantidad de etanolamina retenida sobre AN69 + PEI succinilado es homogénea en la totalidad del módulo puesto que encontramos el mismo número de sitios en la entrada, en el centro o en la salida del módulo.
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2) Tras funcionalización del AN69-PEI succinilado mediante dihidracida adípica (ADH)
La ADH es fijada de la manera siguiente:
Tras activación de los grupos COOH (véase a)), preparar una solución de ADH 50 mM en borato 50 mM pH 8,5, y dejarla en contacto con las pastillas de AN69 durante 1 hora.
Lavar abundantemente en borato y después en H_{2}O y después en acetato.
La fijación de ácido pirúvicoC a las pastillas se efectúa de la manera siguiente:
Preparar diluciones isotópicas de ácido pirúvico no marcado/ácido pirúvico marcado en 1 ml de acetato 50 nM pH 5,4:
- 0 nmoles sin marcar/5 nmoles marcado
- 20 nmoles sin marcar/5 nmoles marcado
- 200 nmoles sin marcar/5 nmoles marcado
- 2000 nmoles sin marcar/5 nmoles marcado;
Dejarlas en contacto con las pastillas durante 2 horas, y después lavar en acetato, NaCl 0,5M y contar.
La figura 7 muestra que la cantidad de ácido pirúvico óptima retenida sobre AN69 + ADH es de 0,1 nmoles/pastilla con o sin activación (EDC) del soporte.
La figura 8 muestra que la cantidad de ácido pirúvico óptima retenida sobre AN69 succinilado + ADH es de 0,5 nmoles/pastilla con o sin activación (EDC) del soporte para cantidades de ácido pirúvico introducidas superiores a 150 nmoles por pastilla.
La figura 9 muestra que:
- la cantidad de ácido pirúvico acoplada al AN69 + PEI + anhídrido succínico + ADH es de al menos 1,1 nmoles por pastilla tras activación de los carboxilos generados sobre el soporte (por vía del anhídrido succínico) para la fijación mediante enlace amida de la ADH;
- cuando no se activan los grupos carboxilo generados en el soporte, la cantidad de ácido pirúvico adsorbida en el AN69 + PEI + succinilación + ADH es de 0,45 nmoles por pastilla.
En conclusión, la funcionalización del AN69 mediante la PEI en primer lugar y a continuación mediante anhídrido succínico hace que aumente en al menos 5 veces el número de sitios disponibles para las moléculas de baja masa molecular. Este aumento es del mismo orden dimensional tras el tratamiento mediante la ADH.
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3.2 Determinación del número de sitios disponibles en el AN69-PEI para la fijación de moléculas de alta masa molecular (HPM)
Para este estudio, hemos puesto a dos concentraciones de inmunoglobulina (Ig) oxidada o no oxidada (5 \mug y 60 \mug) en contacto con pastillas de AN69 funcionalizadas o no funcionalizadas.
23
La funcionalización del AN69 en primer lugar mediante la PEI y a continuación mediante el anhídrido succínico y finalmente mediante la ADH permite aumentar en al menos dos veces el número de sitios disponibles para las moléculas de alta masa molecular.
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Ejemplo 4 Inmunodepuración de los Anticuerpos anti ácido lipoico (AL) en AN69-PEI postsuccinilado
En lo relativo al LED, los resultados que se presentan en las figuras 1, 2 y 3 nos han incitado a poner a punto cartuchos capaces de eliminar específicamente los Ac anti-AL en el plasma de los enfermos aquejados de LED. Al ser el AL un hapteno de un peso molecular de 100 kDa, la técnica desarrollada podría extenderse a otros haptenos que contengan grupos COOH funcionales.
La fijación del AL de manera covalente a un soporte insoluble se hace de la manera siguiente:
- el grupo funcional terminal epoxi ha sido sustituido con putrescina directamente para formar un brazo que termina en un grupo NH2 \alpha al cual se ha incorporado mediante enlace amida el ácido lipoico (véase la figura 1).
Esta puesta a punto era necesaria por dos razones: por una parte, debería permitir la reutilización del cartucho tras elución de los Ac en medio alcalino y, por otra parte, el enlace amida es intrínsecamente mucho más estable que el enlace éster (véase la figura 2) que habría sido formado si el AL hubiese sido acoplado directamente con grupos OH del epóxido hidrolizado (véase figura 5).
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4.1 Estudio comparativo de inmunodepuración en función del tipo de enlace del AL
La figura 5 muestra que la inmunodepuración de las IgM anti-AL es netamente más eficaz cuando el AL es acoplado mediante un enlace amida puesto que es eliminada la totalidad de estas anti-AL, mientras que el AL acoplado mediante un enlace éster no provoca más que una muy baja disminución de las IgM anti-AL del orden de un 8%.
Estando demostrada la eficacia de inmunodepuración de los Ac anti-AL mediante AL acoplado mediante enlace amida, la etapa siguiente consistía en someter a ensayo la reutilización y así pues la estabilidad del soporte.
Para ello hemos inmunodepurado sobre el mismo soporte seis muestras procedentes del mismo suero lúpico.
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4.2 Ensayos de reutilización del minimódulo de AN69 H&F-AL
La figura 8 muestra que seis pasos sucesivos, con una etapa de elución entre los distintos pasos, por el mismo soporte de seis muestras distintas pero procedentes del mismo suero lúpico dan una eficacia de depuración de los Ac anti-AL idéntica tras el primer paso como tras el sexto paso.
La elución sucesiva de las proteínas retenidas tras estos seis pasos da el mismo perfil en gel de poliacrilamida (figura 9).
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Conclusión
Así pues, hemos puesto a punto sobre el AN69 un sistema de inmunodepuración de los Ac anti-AL que es eficaz, específico y reutilizable en circulación extracorpórea.
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Ejemplo 5 Acoplamiento por covalencia de IgG purificadas sobre AN69-PEI-P presuccinilada 5.1 Materiales
Los experimentos se realizan en minidializadores que comprenden 170 fibras huecas de AN69 (diámetro interno: 210 \mum; espesor de pared: 42 \mum; longitud: 0,18 m).
Las IgG de cabra proceden de la firma Biosys (Compiègne, Francia).
IgG de ratón e IgG de conejo han sido purificadas en el laboratorio respectivamente en columna de proteína A-sefarosa a partir de un pool de líquido de ascitis y en DEAE-celulosa a partir de un suero de conejo.
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5.2 Método 5.2.1 Preparación de las IgG radiomarcadas
Las IgG de ratón, de conejo y de cabra han sido radiomarcadas con N-succinidil-(2-3 ^{3}H)-propionato, y el exceso de radiactividad ha sido eliminado por diálisis.
- actividad específica de las IgG tras diálisis:
IgG de ratón: 1,25 10^{6} cpm/mg de proteína
IgG de conejo: 1,86 10^{6} cpm/mg de proteína
IgG de cabra: 0,77 10^{6} cpm/mg de proteína
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5.2.2 Modificación de los minimódulos
5.2.2.1) 6 minimódulos han sido desglicerinados y luego tratados con una solución de PEI-P presuccinilada al 60%;
5.2.2.2) 3 minimódulos, designados como A, B, C, son a continuación activados por una carbodiimida, mientras que a los otros 3, llamados D, E, F, se les deja tal cual;
5.2.2.3) 50 \mug de IgG de conejo radiomarcadas son recirculados durante 2 horas en PBS (PBS = suero salino tamponado con fosfato) (volumen final: 3 ml) en los minimódulos A y D.
50 \mug de IgG de ratón radiomarcadas son recirculados durante 2 horas en PBS (volumen final: 3 ml) en los minimódulos B y E.
50 \mug de IgG de cabra radiomarcadas son recirculados durante 2 horas en PBS (volumen final: 3 ml) en los minimódulos C y F.
5.2.2.4) Los 6 minimódulos son a continuación lavados hasta no haber ya trazas de radiactividad.
La cantidad de IgG acoplada corresponde a la cantidad de radiactividad introducida - la cantidad de radiactividad restituida.
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5.3 Resultados: Cantidad de IgG acoplada sobre AN69 presuccinilado
24
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias que cita el solicitante se aporta solamente en calidad de información para el lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este respecto.
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\bullet GB 2197720 A [0025] [0025] [0025] [0025] [0025] [0025]
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Claims (18)

1. Soporte funcionalizado para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, caracterizado por el hecho de que:
\bullet su superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet y su superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales son fijadas por enlace covalente moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos que han permitido el acoplamiento directo o indirecto, de manera covalente, de ligandos específicos.
2. Soporte funcionalizado según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los grupos carboxílicos han formado directa o indirectamente enlaces covalentes con ligandos portadores de grupos:
-CHO, -NH_{2}, -COOH, -SH, -OH,
25
3. Soporte funcionalizado según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que están fijadas mediante enlace covalente a los grupos carboxílicos moléculas de un tercer tipo que tienen una función de espaciador para disminuir el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula o los elementos contemplados a depurar.
4. Soporte funcionalizado según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que están fijadas mediante enlace covalente a los grupos carboxílicos moléculas de un cuarto tipo que tienen por función aumentar la hidrofilicidad del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas.
5. Soporte funcionalizado según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que están fijadas mediante enlace covalente a los grupos carboxílicos moléculas de un quinto tipo que presentan, una vez ligadas, grupos de otra naturaleza que permiten otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador principalmente de grupos -CHO o -COOH.
6. Soporte funcionalizado para la depuración extracorpórea de un fluido biológico, caracterizado por el hecho de que:
\bullet su superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet y su superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales son fijadas, por enlace covalente, moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos a los cuales se fijan por enlace covalente:
\circ
moléculas de un tercer tipo que tienen una función de espaciador para hacer que disminuya el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula y/o de los elementos contemplados a depurar;
\circ
y/o moléculas de un cuarto tipo que tienen por función incrementar la hidrofilicidad del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas;
\circ
y/o moléculas de un quinto tipo que presentan, una vez ligadas, grupos de otra naturaleza que permiten otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador principalmente de grupos -CHO o -COOH.
7. Soporte funcionalizado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de que es una membrana semipermeable fabricada a partir de un copolímero de acrilonitrilo y metalilsulfonato de sodio.
8. Soporte funcionalizado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de que el ligando es seleccionado de entre los miembros de un grupo que consta de anticuerpos, antígenos, péptidos, proteínas, glicoproteínas, hormonas, enzimas, cofactores de las mismas, sustratos o inhibidores de los mismos, polisacáridos, lectinas, toxinas o antitoxinas, ácidos nucleicos o polinucleótidos, haptenos o ligandos de haptenos, pigmentos o colorantes.
9. Soporte funcionalizado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de que entra en la constitución de una membrana, y en particular de una membrana de diálisis en forma de películas planas o de fibras, porosas o no porosas, macizas o huecas, microbolas porosas o no porosas o de una combinación de las mismas.
10. Módulo para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, caracterizado por el hecho de que comprende al menos un compartimento para la circulación de dicho fluido, estando este compartimento delimitado al menos parcialmente por un soporte funcionalizado según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
11. Módulo polivalente para la depuración extracorpórea de un fluido biológico, que comprende al menos un compartimento para la circulación de dicho fluido, estando este compartimento delimitado al menos parcialmente por un soporte funcionalizado:
\bullet cuya superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre aproximadamente 15ºC y aproximadamente 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet y cuya superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales se fijan, por enlace covalente, moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos que son aptos para formar directa o indirectamente enlaces covalentes con ligandos portadores de grupos:
-CHO, -NH_{2}, -COOH, -SH, -OH.
26
12. Módulo para la depuración extracorpórea no específica de un fluido biológico, caracterizado por el hecho de que comprende un soporte funcionalizado:
\bullet cuya superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet y cuya superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales se fijan, por enlace covalente, moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos a los cuales se fijan por enlace covalente:
\circ
moléculas de un cuarto tipo que tienen una función de espaciador para hacer que disminuya el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula y/o de los elementos contemplados a depurar;
\circ
y/o moléculas de un cuarto tipo que tienen por función hacer que aumente la hidrofilicidad del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas;
\circ
y/o moléculas de un quinto tipo que presentan, una vez ligadas, grupos de otra naturaleza que permiten otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador principalmente de grupos -CHO o -COOH.
13. Procedimiento de preparación de un soporte biocompatible funcionalizado polivalente para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, o de un módulo polivalente para la depuración extracorpórea específica de un fluido biológico, comprendiendo este módulo al menos un compartimento para la circulación de dicho fluido, estando este compartimento delimitado al menos parcialmente por el susodicho soporte funcionalizado,
\rightarrow siendo este soporte tal que:
\bullet
su superficie comprende grupos funcionalizados que satisfacen las condiciones siguientes:
\Rightarrow
ser estables al menos a una temperatura comprendida entre 15ºC y 45ºC;
\Rightarrow
ser estables a al menos un tipo de procedimiento de esterilización aplicable a los dispositivos médicos, y en particular a las radiaciones gamma;
\bullet
y su superficie presenta cargas por medio de las cuales son ligadas por enlaces iónicos moléculas o macromoléculas de un primer tipo que presentan, una vez ligadas, grupos amina libres a los cuales se fijan, por enlace covalente, moléculas de un segundo tipo que, una vez ligadas, presentan grupos carboxílicos que permiten el acoplamiento directo o indirecto, de manera covalente, de ligandos específicos;
\rightarrow y representado esta depuración extracorpórea específica de un fluido biológico una terapéutica para la eliminación de moléculas o macromoléculas cuya presencia conduce a ciertas patologías o ciertas disfunciones biológicas;
estando dicho procedimiento caracterizado por el hecho de que consiste
a. en seleccionar el ligando o la mezcla de ligandos apropiados en función de la patología que se dé;
b. en realizar un acoplamiento del soporte con el ligando o las mezclas de ligandos, para obtener un producto de acoplamiento.
14. Procedimiento de preparación del soporte que se pone en ejecución en el procedimiento según la reivindicación 13, siendo este soporte biocompatible, funcionalizado y portador de grupos susceptibles de formar enlaces covalentes con grupos orgánicos, y en particular con grupos
-CHO, -NH_{2}, -COOH, -SH, -OH,
27
caracterizado por el hecho de que dicho soporte es obtenido:
- mediante reacción de soportes de carácter iónico con:
\rightarrow ya sea
a)
polietilenimina (PEI) de masa molecular comprendida entre 10.000 y 2.000.000, sustituida o insustituida; después con
b)
una solución de un anhídrido de ácido carboxílico de fórmula:
28
en la cual X = [CH_{2}]_{n}, estando n comprendido entre 1 y 4,
\circ X = -CH=CH-,
\circ de fórmula:
29
\rightarrow o bien con el producto de la reacción entre a) y b);
- y eventualmente por último:
\rightarrow ya sea
c)
mediante fijación por enlace covalente a los grupos carboxílicos:
\bullet
de las moléculas del tercer tipo que tienen una función de espaciador para hacer que disminuya el bloqueo estérico y favorecer la ulterior fijación de un ligando y/o de la molécula y/o de los elementos contemplados a depurar;
\bullet
y/o de las moléculas de un cuarto tipo que tienen por función aumentar la hidrofilicidad del soporte con vistas a limitar las interacciones no específicas;
\bullet
y/o de las moléculas de un quinto tipo que presentan, una vez ligadas, grupos de otra naturaleza que permiten otro tipo de acoplamiento covalente con un ligando portador principalmente de grupos -CHO o -COOH;
\rightarrow o bien mediante puesta en contacto del soporte así modificado con una dihidracida de fórmula:
NH_{2}-NH-CO-Y-CO-NH-NH_{2},
siendo Y elegido de entre los grupos que tienen la doble propiedad de ser portadores de grupos hidrofílicos y de ser estables a las radiaciones \gamma y que son preferiblemente un grupo [CH_{2}]_{m}, en el cual m está comprendido entre 2 y 6.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el cual el soporte de carácter iónico es un copolímero de acrilonitrilo y metalilsulfonato de Na.
16. Dispositivo de circulación extracorpórea de sangre que incorpora un soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un módulo según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
17. Dispositivo según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que se trata de un dispositivo de tratamiento terapéutico para la eliminación de moléculas o macromoléculas cuya presencia conduce a ciertas patologías o ciertas disfunciones biológicas.
18. Kit que comprende:
\bullet un módulo polivalente según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12,
\bullet un recipiente o bolsa estéril que contiene una solución activadora de la reacción entre el soporte funcionalizado y un ligando,
- dado el caso un recipiente o bolsa estéril que contiene una solución del ligando elegido;
- dado el caso las soluciones tampón o de enjuague necesarias para la activación y/o el acoplamiento covalente del ligando.
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