BR112020012464A2 - molécula de ligação ao antígeno biespecífica; proteína de fusão recombinante, receptor de antígeno quimérico, célula, sequência de ácidos nucleicos, vetor, célula hospedeira, método para preparar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, composição farmacêutica, uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, método para tratamento de uma doença em um paciente que necessita de tratamento, método para avaliar a presença de um analito-alvo em uma amostra, método para imageamento de um sítio de doença em um indivíduo, método para diagnóstico de uma doença ou afecção médica em um indivíduo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno, kit e método para diagnóstico de um indivíduo que sofre de câncer, ou uma predisposição para o mesmo, ou para fornecer um prognóstico da afecção de um indivíduo, método para eliminar ou inibir o crescimento de uma célula que expressa ror1 e egfr in vitro ou em um paciente - Google Patents

molécula de ligação ao antígeno biespecífica; proteína de fusão recombinante, receptor de antígeno quimérico, célula, sequência de ácidos nucleicos, vetor, célula hospedeira, método para preparar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, composição farmacêutica, uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, método para tratamento de uma doença em um paciente que necessita de tratamento, método para avaliar a presença de um analito-alvo em uma amostra, método para imageamento de um sítio de doença em um indivíduo, método para diagnóstico de uma doença ou afecção médica em um indivíduo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno, kit e método para diagnóstico de um indivíduo que sofre de câncer, ou uma predisposição para o mesmo, ou para fornecer um prognóstico da afecção de um indivíduo, método para eliminar ou inibir o crescimento de uma célula que expressa ror1 e egfr in vitro ou em um paciente Download PDF

Info

Publication number
BR112020012464A2
BR112020012464A2 BR112020012464-8A BR112020012464A BR112020012464A2 BR 112020012464 A2 BR112020012464 A2 BR 112020012464A2 BR 112020012464 A BR112020012464 A BR 112020012464A BR 112020012464 A2 BR112020012464 A2 BR 112020012464A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
ror1
binding molecule
cancer
cell
Prior art date
Application number
BR112020012464-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Estelle Grace Mclean
Paul Richard Trumper
Jennifer Thom
Timothy Harrison
Graham John Cotton
Chiara Saladino
Caroline BARELLE
Andrew Porter
Marina Kovaleva
Original Assignee
Almac Discovery Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Almac Discovery Limited filed Critical Almac Discovery Limited
Publication of BR112020012464A2 publication Critical patent/BR112020012464A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6831—Fungal toxins, e.g. alpha sarcine, mitogillin, zinniol or restrictocin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se às moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, e proteínas e conjugados de fusão associados. Em particular, a presente invenção se refere às moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas com especificidade tanto para o receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 1 (ROR1) quanto para o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), e proteínas e conjugados de fusão associados. Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere aos receptores de antígeno inovadores variáveis (VNARs) de tubarão semelhantes a imunoglobulina conjugados.

Description

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA; PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, CÉLULA, SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE OU RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, MÉTODO
PARA TRATAMENTO DE UMA DOENÇA EM UM PACIENTE QUE NECESSITA DE TRATAMENTO, MÉTODO PARA AVALIAR A PRESENÇA DE UM ANALITO-ALVO EM UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA IMAGEAMENTO DE UM SÍTIO DE DOENÇA EM UM INDIVÍDUO, MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE UMA DOENÇA OU AFECÇÃO MÉDICA EM UM INDIVÍDUO, ANTICORPO, FRAGMENTO DE ANTICORPO OU MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, KIT E MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE UM INDIVÍDUO QUE SOFRE DE CÂNCER, OU UMA PREDISPOSIÇÃO PARA O MESMO, OU PARA FORNECER UM PROGNÓSTICO DA AFECÇÃO DE UM INDIVÍDUO, MÉTODO PARA ELIMINAR OU INIBIR O CRESCIMENTO DE UMA CÉLULA QUE EXPRESSA ROR1 E EGFR IN VITRO OU
EM UM PACIENTE CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se às moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, e proteínas e conjugados de fusão associados Em particular, a presente invenção se refere às moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas com especificidade tanto para o receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 1 (ROR1) quanto para o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), e proteínas e conjugados de fusão associados. Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere aos receptores de antígeno inovadores variáveis (VNARs) de tubarão semelhantes a imunoglobulina conjugados.
ANTECEDENTES
[002] O receptor órfão semelhante a receptor tirosina quinase 1 (ROR1) é uma proteína transmembranar de passagem única do tipo I glicosilada de 937 aminoácidos. A região extracelular consiste em três domínios distintos que compõem um domínio de imunoglobulina N-terminal (Ig), seguido por um domínio frisado rico em cisteína (fz) que, por sua vez, é ligado ao domínio kringle proximal de membrana (kr). A região intracelular da proteína contém um domínio de pseudo quinase seguido por dois domínios ricos em Ser/Thr que são intercaladas por uma região rica em prolina, e essa mesma arquitetura de domínio geral é conservada no membro da família proximamente relacionado ROR2, com o qual a mesma compartilha alta identidade de sequência. (Rebagay G et al, Frontiers Oncology, 2012, 2, Borcherding N et al Protein Cell, 2014, 5, 496 a 502).
[003] ROR1 é expresso durante o desenvolvimento embrionário, em que o mesmo é proeminentemente expresso em células da crista neural e nas zonas necróticas e interdigitais nos últimos estágios de desenvolvimento. Entretanto, sua expressão é rapidamente silenciada após o nascimento e está amplamente ausente no tecido adulto normal (Fukada PNAS, 2012, Baskar et al Clin. Cancer Res., 2008, 14, 396, Broome HE et al, Leuk. Res., 2011, 35, 1390; Balakrishnan A et al, Clin. Cancer. Res. 2017, 23, 3.061 a 3.071).
[004] A expressão de ROR1 foi observada tanto no nível de mRNA quanto proteína em uma gama ampla de tumores sólidos e malignidades hematológicas, incluindo cânceres de pulmão, mama, pancreático, ovário, cólon, cabeça e pescoço e próstata, melanoma e carcinoma de célula renal (Zhang S et al Am J. Pathol., 2012, 181, 1.903 a 1.910), câncer de mama (Zhang S et al PLoS One 2012, 7, e31127; Oxford Biotherapeutics patent application WO2011054007) e leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia linfoblástica aguda AML (Fukuda T et al, Proc Natl
Acad Sci U S A. 2008, 105, 3.047 a 3.052; Baskar S et al, Clin Cancer Res., 2008, 14, 396 a 404; Daneshmanesh AH et al, Int J Cancer. 2008, 123, 1.190 a 1.195; Dave H et al, PLOS ONE, 2012, 7, e52655).
[005] Adicionalmente, é relatado que a expressão aumentada de ROR1 se correlaciona com resultados clínicos ruins para diversas indicações de câncer, incluindo câncer de mama (Chien HP et al, Virchows Arch., 2016, 468, 589 a 595; Zhang), câncer de ovário (Zhang H et al, Sci Rep., 2014, 4:5.811. doi:
10.1038/srep05811), câncer colorretal (Zhou JK et al, Oncotarget, 2017, 8, 32.864 a 32.872), adenocarcinoma de pulmão (Zheng YZ et al, Sci Rep., 2016, 6, 36.447) e CLL (Cui B et al, Blood, 2016, 128, 2.931 a 2.940).
[006] Consistente com padrão de expressão de ROR1 e a ligação com prognóstico clínico ruim, um papel funcional para ROR1 em tumourigênese e progressão da doença foi demonstrado para diversas indicações de câncer diferentes. ROR1 promove a transição epitelial-mesenquimal e metástase em modelos de câncer de mama (Cui B et al Cancer Res, 2013, 73,
3.649 a 3.660) e formação de esferoide e enxerto de tuor em modelos de câncer de mama (Zhang S et al, Proc Natl Acad Sci., 2014, 11, 17.266 a 17.271). ROR1 é um alvo de transcrito do oncogene de fator de sobrevivência de linhagem NKX2-1/TTF-1 em adenocarcinoma de pulmão, em que o mesmo sustenta a sinalização de EGFR e reprime a sinalização pró-apoptótica e uma interação induzida por EGF entre ROR1 e EGFR foi observada (Yamaguchi T et al, Cancer Cell, 2012, 21, 348 a 361; Ida L et al, Cancer Science, 2016, 107, 155 a 161). Enquanto a coexpressão de mRNA de EGFR e ROR1 foi observada a partir de exploração do banco de dados de expressão de genes de câncer de mama (Peng H et al, J. Mol. Biol, 2017, 429, 2.954 a 2.973 ). ROR1 também mostrou atuar como um arcabouço para sustentar estruturas de cavéolas e contornar o mecanismo de sinalização que conferem resistência a inibidores de EGFR tirosina quinase (Yamaguchi T et al, Nat Commun., 2016, 7, 10.060). A sinalização através de um complexo de ROR1-HER3 modula a trajetória de Hippo-YAP e promove metástase óssea de câncer de mama (Li C et al, Nature Cell Biol., 19, 1.206 a 119) e a proteína pode promover tumorigênese acionada por Met (Gentile A et al, Cancer Res., 2011, 71, 3.132 a 3.140). Enquanto em CLL, foi relatado que ROR1 hetero-oligomeriza-se com ROR2 em resposta a Wnt5a transduzir sinalização e aumentar a proliferação e migração (Yu J et al, J. Clin. Invest., 2016, 2, 585 a 598)
[007] Dado o papel funcional de ROR1 em patologia de câncer e a falta geral de expressão em tecido adulto normal, essa proteína oncofetal é um alvo atrativo para terapia contra câncer. Os anticorpos para ROR1 foram descritos na literatura WO2021097313 (4A5 kipps), WO2014031174 (UC961), WO2016187220 (Five Prime) WO2010124188 (2A2), WO2012075158 (R11,R12), WO2011054007(Oxford Bio), WO2011079902 (Bioinvent) WO2017127664, WO2017127664 (NBE Therapeutics, SCRIPPS), WO2016094847 (Emergent), WO2017127499), e um anticorpo anti- ROR1 murino humanizado, UC961, entrou em testes clínicos para leucemia linfocítica crônica recidiva ou refratária. Células T de receptor de antígeno quimérico que têm como alvo ROR1 foram também relatadas (Hudecek M et al, Clin. Cancer Res., 2013, 19, 3.153 a 3.164) e estudos pré-clínicos em primata com UC961 e com células CAR-T que têm como alvo ROR1 não mostraram toxicidade evidente, que é consistente com a falta geral de expressão da proteína em tecido adulto (Choi M et al, Clinical Lymphoma, myeloma & leukemia, 2015, S167; Berger C et al, Cancer Immunol. Res., 2015, 3, 206).
[008] O receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) é um membro da família ErbB dos receptores tirosina quinase. O mesmo é uma proteína transmembranar de 170 kDa composta por quatro domínios extracelulares, uma região transmembranar, um domínio de tirosina quinase intracelular e uma cauda carbóxi-terminal. A função normal de EGFR refere-se à regulação de desenvolvimento de tecido epitelial, mas está também associada a diversos estados patológicos. Em particular, a superexpressão de EGFR foi associada a diversos cânceres. Consequentemente, é um alvo de fármaco importante e muitas abordagens terapêuticas foram aplicadas. Adicionalmente a diversos inibidores de EGFR baseados em molécula pequena, tal como gefitinibe, erlotinibe, afatinibe, brigatinibe, icotinibe e osimertinibe, diversos anticorpos para EGFR foram desenvolvidos. Os anticopos anti-EGFR cetuximabe, panitumumabe, zalutumumabe, nimotuzumabe e matuzumabe. Esses anticorpos bloqueiam o domínio de ligação a ligante extracelular, impedindo a ligação a ligante e subsequente ativação do domínio de tirosina quinase. Anticorpos de domínio único (sdAb) que mostram ligação competitiva com cetuximabe ou matuzumabe foram também desenvolvidos.
[009] As moléculas de ligação de domínio único podem ser derivadas de um arranjo de proteínas de espécies distintas. O receptor de antígeno inovador de isótopo de imunoglobulina (IgNAR) é um complexo de cadeia pesada homodimérico originalmente encontrado no soro do tubarão- enfermeiro (Ginglymostoma cirratum) e outros tubarões e espécies de arraia. IgNARs não contêm cadeias leves e são distintos da estrutura de imunoglobulina típica. Cada molécula consiste em um domínio variável único (VNAR) e cinco domínios constantes (CNAR). A nomenclatura na literatura refere-se a IgNARs como receptores de antígeno inovadores de isótopo de imunoglobulina ou receptores de antígeno novos de isótopo de imunoglobulina e os termos são sinônimos.
[0010] Há três tipos definidos principais de IgNAR de tubarão conhecidos como I, II e III (Kovalena et al, Exp Opin Biol Ther 2014 14(10) 1.527 a 1.539). Os mesmos foram categorizados com base na posição de resíduos de cisteína não canônicos que estão sob forte pressão seletiva e são, portanto, raramente substituídos.
[0011] Todos os três tipos têm as cisteínas canônicas de imunoglobulina clássicas nas posições 35 e 107 que estabilizam o enovelamento de imunoglobulina padrão, juntamente com um triptofano invariável na posição 36. Não há CDR2 definido como tal, mas regiões de variação de sequência que comparam mais proximamente a TCR HV2 e HV4 foram definidas no arcabouço 2 e 3, respectivamente. O tipo I tem resíduos de cisteína codificados por linhagem germinativa no arcabouço 2 e no arcabouço 4 e um número par de cisteínas adicionais dentro de CDR3. Os estudos de estrutura de cristal de um IgNAR do tipo I isolado contra e em complexo com lisozima possibilitaram que a contribuição desses resíduos fosse determinada. Ambas as cisteínas de arcabouço 2 e 4 formam pontos de dissulfeto com aquelas em CDR3, formando uma estrutura fortemente encapsulada dentro da qual a alça de CDR3 é mantida firmemente até a região de HV2. Até a presente data, IgNARs do Tipo I foram apenas identificados em tubarões-enfermeiro – todos os outros elasmobrânquios, incluindo membros da mesma ordem têm apenas Tipo II ou variações desse tipo.
[0012] Os IgNAR do tipo II são definidos como tendo um resíduo de cisteína em CDR1 e CDR3 que formam ligações de dissulfeto intramoleculares que mantêm essas duas regiões em estreita proximidade, resultando em uma CDR3 protuberante que é conducente à ligação de bolsos ou sulcos. As sequências do Tipo I tipicamente têm CDR3s mais longas que o tipo II com uma média de 21 e 15 resíduos, respectivamente. Acredita-se que isso se deva a uma forte pressão seletiva para dois ou mais resíduos de cisteína em CDR3 do Tipo I para associação com suas contrapartes de arcabouço 2 e 4. Os estudos no acúmulo de mutações somáticas mostram que há um número maior de mutações em CDR1 de tipo II do que tipo I, enquanto as regiões HV2 do tipo I mostram maior variação de sequência do que o tipo II. Essa evidência se correlaciona bem com o posicionamento determinado dessas regiões dentro dos sítios de ligação ao antígeno. Um terceiro tipo de IgNAR conhecido como Tipo III foi identificado em neonatos. Esse membro da família de IgNAR carece de diversidade dentro da CDR3 devido à fusão de linhagem germinativa das regiões D1 e D2 (que formam CDR3) com o gene V. Quase todos os clones conhecidos têm um comprimento de CDR3 de 15 resíduos com pouca ou nenhuma diversidade de sequência.
[0013] Outro tipo estrutural de VNAR, denominado tipo (IIb ou IV), tem apenas dois resíduos de cisteína canônicos (em regiões de arcabouço 1 e arcabouço 3b). Até o momento, esse tipo foi encontrado principalmente em tubarões galhudos (Liu, J.L., et al. Mol. Immunol. 2007. 44(7): páginas
1.775 a 1.783; Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): páginas 17.408 a 17.419) e foi também isolado de bibliotecas de V-NAR semissintéticas derivadas de tubarões wobbegong (Streltsov, V.A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(34): páginas 12.444 a 12.449).
[0014] SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0015] A presente invenção refere-se, de modo geral, a moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas. Especificamente, a presente invenção refere-se a moléculas biespecíficas que têm a capacidade de se ligar tanto a ROR1 quanto a EGFR.
[0016] Em um primeiro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende:
[0017] uma molécula de ligação ao antígeno específica de receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 1 (ROR1) que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula (I):
[0018] FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4 (I)
[0019] em que
[0020] FW1 é uma região de arcabouço
[0021] CDR1 é uma sequência de CDR
[0022] FW2 é uma região de arcabouço
[0023] HV2 é uma sequência hipervariável
[0024] FW3a é uma região de arcabouço
[0025] HV4 é uma sequência hipervariável
[0026] FW3b é uma região de arcabouço
[0027] CDR3 é uma sequência de CDR
[0028] FW4 é uma região de arcabouço
[0029] ; e
[0030] (ii) uma molécula de ligação ao antígeno específica de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR).
[0031] A região de arcabouço FW1 tem, de preferência, de 20 a 28 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, de 22 a 26 aminoácidos de comprimento, ainda mais preferencialmente, de 23 a 25 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, FW1 tem 26 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, FW1 tem 25 aminoácidos de comprimento. Em ainda outras modalidades preferenciais, FW1 tem 24 aminoácidos de comprimento.
[0032] A região de CDR CDR1 tem, de preferência, de 7 a 11 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente,
de 8 a 10 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, CDR1 tem 9 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, CDR1 tem 8 aminoácidos de comprimento.
[0033] A região de arcabouço FW2 tem, de preferência, de 6 a 14 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, de 8 a 12 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, FW2 tem 12 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, FW2 tem 10 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, FW2 tem 9 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, FW2 tem 8 aminoácidos de comprimento.
[0034] A sequência hipervariável HV2 tem, de preferência, de 4 a 11 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, de 5 a 10 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, HV2 tem 10 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, HV2 tem 9 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, HV2 tem 6 aminoácidos de comprimento.
[0035] A região de arcabouço FW3a tem, de preferência, de 6 a 10 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, de 7 a 9 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, FW3a tem 8 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, FW3a tem 7 aminoácidos de comprimento.
[0036] A sequência hipervariável HV4 tem, de preferência, de 3 a 7 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, de 4 a 6 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, HV4 tem 5 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, HV4 tem 4 aminoácidos de comprimento.
[0037] A região de arcabouço FW3b tem, de preferência, de 17 a 24 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, de 18 a 23 aminoácidos de comprimento, ainda mais preferencialmente, de 19 a 22 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, FW3b tem 21 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, FW3b tem 20 aminoácidos de comprimento.
[0038] A região de CDR CDR3 tem, de preferência, de 8 a 21 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, de 9 a 20 aminoácidos de comprimento, ainda mais preferencialmente, de 10 a 19 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, CDR3 tem 17 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, CDR3 tem 14 aminoácidos de comprimento. Em ainda outras modalidades preferenciais, CDR3 tem 12 aminoácidos de comprimento. Em ainda outras modalidades preferenciais, CDR3 tem 10 aminoácidos de comprimento.
[0039] A região de arcabouço FW4 tem, de preferência, de 7 a 14 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, de 8 a 13 aminoácidos de comprimento, ainda mais preferencialmente, de 9 a 12 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades preferenciais, FW4 tem 12 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades preferenciais, FW4 tem 11 aminoácidos de comprimento. Em ainda outras modalidades preferenciais, FW4 tem 10 aminoácidos de comprimento. Em ainda outras modalidades preferenciais, FW4 tem 9 aminoácidos de comprimento.
[0040] De preferência, a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 não se liga ao receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 2 (ROR2). Mais preferencialmente, a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 se liga tanto ao ROR1 humano quanto ao ROR1 murino (mROR1). Ainda mais preferencialmente, a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 se liga ao ROR1 deglicosilado.
[0041] Certas moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 da invenção não se liga a uma sequência de peptídeos linear selecionada dentre:
[0042] YMESLHMQGEIENQI (SEQ ID NO: 34)
[0043] CQPWNSQYPHTHTFTALRFP (SEQ ID NO: 35)
[0044] RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ (SEQ ID NO: 36)
[0045] QCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYE (SEQ ID NO: 37)
[0046] Nas modalidades preferenciais da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1:
[0047] FW1 é uma região de arcabouço de 20 a 28 aminoácidos
[0048] CDR1 é uma sequência de CDR selecionada dentre DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1), GAKYGLAA (SEQ ID NO: 2), GAKYGLFA (SEQ ID NO: 3), GANYGLAA (SEQ ID NO: 4) ou GANYGLAS (SEQ ID NO: 5)
[0049] FW2 é uma região de arcabouço de 6 a 14 aminoácidos
[0050] HV2 é uma sequência hipervariável selecionada dentre TTDWERMSIG (SEQ ID NO: 6), SSNQERISIS (SEQ ID NO: 7) ou SSNKEQISIS (SEQ ID NO: 8)
[0051] FW3a é uma região de arcabouço de 6 a 10 aminoácidos
[0052] HV4 é uma sequência hipervariável selecionada dentre NKRAK (SEQ ID NO: 9), NKRTM (SEQ ID NO: 10), NKGAK (SEQ ID NO: 11) ou NKGTK (SEQ ID NO: 12)
[0053] FW3b é uma região de arcabouço de 17 a 24 aminoácidos
[0054] CDR3 é uma sequência de CDR selecionada dentre QSGMAISTGSGHGYNWY (SEQ ID NO: 13), QSGMAIDIGSGHGYNWY (SEQ ID NO: 14), YPWAMWGQWY (SEQ ID NO: 15), VFMPQHWHPAAHWY (SEQ ID NO: 16), REARHPWLRQWY (SEQ ID NO: 17), ou YPWGAGAPWLVQWY (SEQ ID NO: 18)
[0055] FW4 é uma região de arcabouço de 7 a 14 aminoácidos
[0056] ou uma variante funcional com pelo menos 45% de identidade de sequência com a mesma.
[0057] Em outras modalidades preferenciais da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é selecionada dentre: ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 19), AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 20), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 21), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 22), ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 23), ou TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (SEQ ID NO: 24), FW2 é selecionada dentre: TSWFRKNPG (SEQ ID NO: 25) ou TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26), Fw3a é selecionada dentre: GRYVESV (SEQ ID NO: 27) ou GRYSESV (SEQ ID NO: 28), Fw3b é selecionada dentre: SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29), SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (SEQ ID NO: 30) ou SFTLTISSLQPEDFATYYCKA (SEQ ID NO: 31), e FW4 é selecionada dentre DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32) ou DGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 33), ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0058] Todas as combinações e permutações possíveis das regiões de arcabouço, regiões determinantes de complementaridade e regiões hipervariáveis listadas acima são explicitamente contempladas no presente documento.
[0059] A identidade de sequência mencionada em relação às moléculas da invenção pode ser julgada no nível de CDRs, HVs ou Fws individuais, ou pode ser julgada ao longo do comprimento da molécula inteira. As sequências de CDR, HV e FW descritas podem ser também mais longas ou mais curtas, seja por adição ou deleção de aminoácidos nas extremidades N ou C- terminais da sequência ou por inserção ou deleção de aminoácidos com uma sequência.
[0060] Em uma modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 19); CDR1 é DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1); FW2 é TSWFRKNPG (SEQ ID NO: 25); HV2 é TTDWERMSIG (SEQ ID NO: 6); FW3a é GRYVESV (SEQ ID NO: 27); HV4 é NKRAK (SEQ ID NO: 9); FW3b é SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29); CDR3 é QSGMAISTGSGHGYNWY (SEQ ID NO: 13); e FW4 é DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0061] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 20); CDR1 é DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1); FW2 é TSWFRKNPG (SEQ ID NO: 25); HV2 é TTDWERMSIG (SEQ ID NO: 6); FW3a é GRYVESV (SEQ ID NO: 27); HV4 é NKRAK (SEQ ID NO: 9); FW3b é SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29); CDR3 é QSGMAIDIGSGHGYNWY (SEQ ID NO: 14); e FW4 é DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0062] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 21); CDR1 é GAKYGLAA (SEQ ID NO: 2); FW2 é TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26); HV2 é SSNQERISIS (SEQ ID NO: 7); FW3a é GRYVESV (SEQ ID NO: 27); HV4 é NKRTM (SEQ ID NO: 10); FW3b é SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29); CDR3 é YPWAMWGQWY (SEQ ID NO: 15); e FW4 é DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0063] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 21); CDR1 é GAKYGLFA (SEQ ID NO: 3); FW2 é TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26); HV2 é SSNQERISIS (SEQ ID NO: 7); FW3a é GRYVESV (SEQ ID NO: 27); HV4 é NKRTM (SEQ ID NO: 10); FW3b é SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29); CDR3 é VFMPQHWHPAAHWY (SEQ ID NO: 16); e FW4 é DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0064] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 22); CDR1 é DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1); FW2 é TSWFRKNPG (SEQ ID NO: 25); HV2 é TTDWERMSIG (SEQ ID NO: 6); FW3a é GRYVESV (SEQ ID NO: 27); HV4 é NKGAK (SEQ ID NO: 11); FW3b é SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29); CDR3 é REARHPWLRQWY (SEQ ID NO: 17); e FW4 é DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0065] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 23); CDR1 é GANYGLAA (SEQ ID NO: 4); FW2 é TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26); HV2 é SSNQERISIS (SEQ ID NO: 7); FW3a é GRYVESV (SEQ ID NO: 27); HV4 é NKRTM (SEQ ID NO: 10); FW3b é SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29); CDR3 é YPWGAGAPWLVQWY (SEQ ID NO: 18); e FW4 é DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0066] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (SEQ ID NO: 24); CDR1 é GANYGLAS (SEQ ID NO: 5); FW2 é TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26); HV2 é SSNKEQISIS (SEQ ID NO: 8); FW3a é GRYSESV (SEQ ID NO: 28); HV4 é NKGTK (SEQ ID NO: 12); FW3b é SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (SEQ ID NO: 30); CDR3 é YPWGAGAPWLVQWY (SEQ ID NO: 18); e FW4 é DGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 33); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0067] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (SEQ ID NO: 24); CDR1 é GANYGLAS (SEQ ID NO: 5); FW2 é TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26); HV2 é SSNQERISIS (SEQ ID NO: 7); FW3a é GRYSESV (SEQ ID NO: 28); HV4 é NKRTM (SEQ ID NO: 10); FW3b é SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (SEQ ID NO: 30); CDR3 é YPWGAGAPWLVQWY (SEQ ID NO: 18); e FW4 é DGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 33); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0068] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (SEQ ID NO: 24); CDR1 é DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1); FW2 é TSWFRKNPG (SEQ ID NO: 25); HV2 é TTDWERMSIG (SEQ ID NO: 6); FW3a é GRYVESV (SEQ ID NO: 27); HV4 é NKGAK (SEQ ID NO: 11); FW3b é SFTLTISSLQPEDFATYYCKA (SEQ ID NO: 31); CDR3 é REARHPWLRQWY (SEQ ID NO: 17); e FW4 é DGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 33); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0069] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (SEQ ID NO: 24); CDR1 é DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1); FW2 é TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26); HV2 é SSNKEQISIS (SEQ ID NO: 8); FW3a é GRYSESV (SEQ ID NO: 28); HV4 é NKGTK (SEQ ID NO: 12); FW3b é SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (SEQ ID NO: 30); CDR3 é REARHPWLRQWY (SEQ ID NO: 17); e FW4 é DGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 33); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0070] Em outra modalidade preferencial da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, FW1 é TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (SEQ ID NO: 24); CDR1 é DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1); FW2 é TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26); HV2 é TTDWERMSIG (SEQ ID NO: 6); FW3a é GRYSESV (SEQ ID NO: 28); HV4 é NKGAK (SEQ ID NO: 11); FW3b é SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (SEQ ID NO: 30); CDR3 é REARHPWLRQWY (SEQ ID NO: 17); e FW4 é DGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 33); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0071] Em ainda outras modalidades preferenciais, a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre:
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNK RAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 39);
AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNK RAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAIDIGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 40);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNK RTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWAMWGQWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 41);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLFATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNK RTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAVFMPQHWHPAAHWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 42);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNK GAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 43);
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNK RTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 44);,
[0072] TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNP
GSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGA GTKVEIK (SEQ ID NO: 45);
[0073] TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNP
GSSNQERISISGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGA GTKVEIK (SEQ ID NO: 46);
[0074] TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNP
GTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 47);
[0075] TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNP
GSSNKEQISISGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 48);
[0076] TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNP
GTTDWERMSIGGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 49), ou uma variante funcional da mesma com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
[0077] A molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR pode ser qualquer molécula que se liga a EGFR. Em particular, a molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR pode ser selecionada dentre o grupo que compreende uma imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina, uma cadeia única Fv (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um acoplador de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio de VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio de VH ou uma proteína em arcabouço (aficorpos, centirinas, darpinas, etc.). De preferência, a molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR é um anticorpo de domínio único (sdAb).
[0078] Cetuximabe é um agente terapêutico de anticorpo monoclonal aprovado que inibe o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR). Cetuximabe impede que EGF e outros ligantes se liguem a EGFR e ativem de outro modo EGFR (isto é, impede a conformação de receptor estendida necessária para ligação a ligante com alta afinidade e dimerização) [Li 2005 Cancer Cell 7 301 a 311]. Cetuximabe se liga a um epítopo específico dentro do domínio de EGFR que compreende os aminoácidos 384 a 408.
[0079] 7C12 e 7D12 são anticorpos de domínio único de camelídeo (nanocorpos) que competem pelo epítopo de Cetuximabe em EGFR [WO 2007042289 A2]. Tanto 7C12 quanto 7D12 demonstram ligação de EGFR com alta afinidade (baixo nM KD) [Roovers 2011 Int J Cancer 129 p2013, Gainkam 2010 Mol Imaging] e bloqueiam ligação de EGF a EGFR [Schmitz 2013 Structure 21 p1214]. 7C12 e 7D12 diferem em 5 aminoácidos, com 7C12 tendo uma taxa de dissociação mais alta para ligação de EGFR [Roovers 2011 Int J Cancer 129 p2013]
[0080] Matuzumabe é outro agente terapêutico de anticorpo monoclonal aprovado que inibe EGFR. A ligação de Matuzumabe bloqueia estericamente a reorganização de domínio de EGFR necessária para ligação a ligante com alta afinidade e dimerização de receptor [Schmiedel 2008 Cancer Cell 13(4) 365 a 373]. Matuzumabe se liga principalmente à alça antes da fita mais C-terminal da hélice β do domínio III (aa 454 a 464 de EGFR).
[0081] 9G8 é uma sequência de sdAb (nanocorpo) que, embora competindo que epítopo de EGFR de Matuzumabe [WO 2007042289 A2], tem um epítopo de EGFR distinto, adicionalmente em direção à terminação N de domínio de EGFR III e adicionalmente a partir do sítio de ligação a ligante de domínio II, regiões inacessíveis a anticorpos convencionais [Schmitz 2013 Structure 21 p1214].
[0082] Os exemplos de sdAbs para uso na molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto da invenção incluem, porém sem limitação, moléculas que competem pela ligação com cetuximabe ou matuzumabe. De preferência, o sdAb é selecionado dentre o grupo que compreende:
[0083] 7C12:
AVQLVESGGGSVQAGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYA
DSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSTWYGTLYEYDYWGQGTQVTV SS (SEQ ID NO: 83)
[0084] 7D12:
QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYA
DSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTV SS (SEQ ID NO: 84)
[0085] 9G8:
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVAINWSSGSTYYA
DSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGYQINSGNYNFKDYEYDYWGQGTQ VTVSS (SEQ ID NO: 85)
[0086] 38G7:
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYVMGWFRQATGKEREFVATIAWDSGSTYYA
DSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCAASYNVYYNNYYYPISRDEYDYWGQG TQVTVSS (SEQ ID NO: 86)
[0087] Será percebido que a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 e a molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR podem ser combinadas em qualquer ordem para formar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto, isto é, a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 pode ser N-terminal à molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR ou vice versa.
[0088] Além disso, será percebido que construtos de ordem mais alta são também contemplados no presente documento, por exemplo, construtos compostos por múltiplas moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 e moléculas de ligação ao antígeno específicas de EGFR. Os mesmos podem assumir a forma de múltiplas cópias em uma sequência de aminoácidos primária, por exemplo, aglutinante de ROR1- aglutinante de EGFR-aglutinante de ROR1 ou aglutinante de EGFR- aglutinante de ROR1-aglutinante de EGFR.
[0089] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto pode incluir adicionalmente uma região de ligante entre a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 e a molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR. Os ligantes preferenciais incluem, porém sem limitação, [G4S]x, em que x é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou
10. Um ligante preferencial particular é [G4S]5. Outros ligantes incluem, porém sem limitação, PGVQPSPGGGGS (SEQ ID NO: 63) (Wobbe-G4S), PGVQPAPGGGGS (SEQ ID NO: 64) (Wobbe-G4S GM). Será entendido que diferentes combinações de diferentes ligantes podem ser combinados dentro do mesmo construto.
[0090] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto pode também compreender domínios adicionais, que podem assumir a forma de adições N- terminais ou C-terminais ou podem ser posicionados entre a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 e a molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR na sequência de aminoácidos da molécula de ligação biespecífica. Cada domínio da molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto pode estar conectada através de regiões de ligante, conforme descrito acima. Os domínios adicionais preferenciais incluem, porém sem limitação, uma imunoglobulina, uma região Fc de imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina, um Fv de cadeia única (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um acoplador de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio de VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio de VH ou uma proteína em arcabouço (aficorpos, centirinas, darpinas, etc.). Um domínio adicional particularmente preferencial é uma região Fc de imunoglobulina, de preferência, uma região Fc humana.
[0091] As combinações expressamente contempladas no presente pedido incluem, porém sem limitação:
ROR1xEGFR monovalentes (fusão de Fc) biespecíficos
B1-Fc-7C12 P3A1-Fc-9G8 E9-Fc-7C12 7C12-Fc-B1 9G8-Fc-P3A1 7C12-Fc-E9 B1-Fc-9G8 D3-Fc-7C12 E9-Fc-9G8 9G8-Fc-B1 7C12-Fc-D3 9G8-Fc-E9 P3A1-Fc-7C12 D3-Fc-9G8 7C12-Fc-P3A1 9G8-Fc-D3
ROR1xEGFR bivalentes (fusão de Fc) biespecíficos
B1-B1-Fc-7C12 7C12-P3A1-Fc-7C12 7C12-Fc-D3-7C12 B1-7C12-Fc-B1 P3A1-7C12-Fc-7C12 7C12-Fc-7C12-D3 7C12-B1-Fc-B1 7C12-Fc-P3A1-P3A1 D3-Fc-7C12-D3 7C12-7C12-Fc-B1 P3A1-Fc-7C12-7C12 D3-Fc-D3-7C12 7C12-B1-Fc-7C12 7C12-Fc-P3A1-7C12 E9-E9-Fc-7C12 B1-7C12-Fc-7C12 7C12-Fc-7C12-P3A1 E9-7C12-Fc-E9 7C12-Fc-B1-B1 P3A1-Fc-7C12-P3A1 7C12-E9-Fc-E9 B1-Fc-7C12-7C12 P3A1-Fc-P3A1-7C12 7C12-7C12-Fc-E9 7C12-Fc-B1-7C12 D3-D3-Fc-7C12 7C12-E9-Fc-7C12 7C12-Fc-7C12-B1 D3-7C12-Fc-D3 E9-7C12-Fc-7C12 B1-Fc-7C12-B1 7C12-D3-Fc-D3 7C12-Fc-E9-E9 B1-Fc-B1-7C12 7C12-7C12-Fc-D3 E9-Fc-7C12-7C12 P3A1-P3A1-Fc-7C12 7C12-D3-Fc-7C12 7C12-Fc-E9-7C12 P3A1-7C12-Fc-P3A1 D3-7C12-Fc-7C12 7C12-Fc-7C12-E9 7C12-P3A1-Fc-P3A1 7C12-Fc-D3-D3 E9-Fc-7C12-E9 7C12-7C12-Fc-P3A1 D3-Fc-7C12-7C12 E9-Fc-E9-7C12
ROR1xEGFR monovalentes (não Fc) biespecíficos
B1-7C12 9G8-P3A1 E9-7C12
7C12-B1 P3A1-9G8 7C12-E9 9G8-B1 D3-7C12 9G8-E9 B1-9G8 7C12-D3 E9-9G8 P3A1-7C12 9G8-D3 7C12-P3A1
ROR1xEGFR bivalentes (não Fc) biespecíficos
B1-B1-7C12 7C12-P3A1-P3A1 D3-9G8-D3 B1-7C12-B1 P3A1-P3A1-9G8 9G8-D3-D3 7C12-B1-B1 P3A1-9G8-P3A1 E9-E9-7C12 B1-B1-9G8 9G8-P3A1-P3A1 E9-E9-D3 B1-9G8-B1 D3-D3-7C12 7C12-E9-E9 9G8-B1-B1 D3-7C12-D3 E9-E9-9G8 P3A1-P3A1-7C12 7C12-D3-D3 E9-9G8-E9 P3A1-7C12-P3A1 D3-D3-9G8 9G8-E9-E9
ROR1 monovalente, ROR1xEGFR com meia-vida estendida (não Fc) biespecíficos
[0092] Quando os ligantes entre os domínios são, de preferência, porém sem limitação, (G4S)X, em que X é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, PGVQPSPGGGGS (SEQ ID NO: 63) (Wobbe- G4S), PGVQPAPGGGGS (SEQ ID NO: 64) (Wobbe-G4S GM) e em que combinações diferentes de ligantes diferentes podem ser combinados dentro do mesmo construto.
[0093] Desse modo, sequências de etiqueta C- terminais (ou N-terminais) adicionais podem ou não estar presentes.
[0094] As etiquetas C-terminais incluem, porém, sem limitação, etiquetas que contêm sequências de poli- Histidina para facilitar a purificação (tal como His6), contêm sequências de c-Myc (tal como EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 68)) para possibilitar a detecção e/ou contêm resíduos de Cisteína para possibilitar a identificação e bioconjugação com o uso de cargas úteis reativas a tiol e sondas e combinações dos mesmos. As etiquetas C-terminais preferenciais incluem, porém sem limitação. QASGAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 69) QACGAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 67) QACKAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 70) AAAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 71) ACAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 72) QASGAHHHHHH (SEQ ID NO: 73) QACGAHHHHHH (SEQ ID NO: 74) QACKAHHHHHH (SEQ ID NO: 75) AAAHHHHHH (SEQ ID NO: 76) ACAHHHHHH (SEQ ID NO: 77) QASGA (SEQ ID NO: 78) QACGA (SEQ ID NO: 79) QACKA (SEQ ID NO: 80) ACA (SEQ ID NO: 81) SAPSA (SEQ ID NO: 82)
[0095] Os domínios podem ser também combinados através de fusão N-terminal, C-terminal ou tanto N- quanto C- terminal a um domínio Fc, incluindo, porém sem limitação: hIgG1
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 87)
hIgG1 (S252C)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 88) hIgG1 (S473C)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLCLSPGK (SEQ ID NO: 89)
[0096] Em que: • 7C12 é
AVQLVESGGGSVQAGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGI
SWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSTWYGTLYEYD YWGQGTQVTVSSAAAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 90) • 9G8 é
MEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVA
INWSSGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGYQINSGNYNFKD YEYDYWGQGTQVTVSSAAAHHHHHHGAEFEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 91) • B1 é
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNK RTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 44) • 2V é
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNK GAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSLAISTRSYWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 65)
• P3A1 é
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNK GAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 43) • D3 é
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNK RAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 39) • D3D3 é
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI GGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTVLTVN GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSW
FRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGH GYNWYDGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 92) • BA11 é
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYPLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNK GTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAMSTNIWTGDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 66)
[0097] Ficará claro para aqueles versados na técnica relevante que as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que compreendem domínios adicionais, conforme descrito no presente documento, podem, em algumas situações, incluir especificidade adicional além de ROR1 e EGFR. Tais configurações estão também dentro do escopo da presente invenção.
[0098] A molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 pode ser humanizada. A molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 pode ser desimunizada. Os exemplos de sequências humanizadas da invenção incluem, porém sem limitação: B1 G1
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNK
GTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 45); B1 G2
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNK RTMSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 46); P3A1 V1
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNK GAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 47); P3A1 G1
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNK GTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 48); P3A1 G2
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNK GAKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 49); ADV1 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 50); ADV2 humanizado com D3
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 51); ADV3 humanizado com D3
ASVNQSPSSASASVGDRLTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKLEVK (SEQ ID NO: 52);
V5 humanizado com B1
ASVDQSPSSLSASVGDRVTITCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 53); V7 humanizado com B1
ASVDQSPSSASASVGDRLTITCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKLEVK (SEQ ID NO: 54); EL V1 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 55); EL V2 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 56); EL V3 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRFSGSGSKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 57); EL V4 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWYQQKPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 58); e EL V5 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWYQQKPGTTDWERMSI
GGRFSGSGSKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 59).
[0099] A molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR pode ser humanizada ou desimunizada,
independentemente da humanização ou desimunização da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1.
[00100] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção pode também ser conjugada a uma identificação detectável, corante, toxina, fármaco, pró- fármaco, radionuclídeo ou molécula biologicamente ativa. A conjugação pode ser através da molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 e molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR. Adicionalmente, a conjugação pode ser através de sequências ou domínios fundidos à molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 e molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR. Em particular, a conjugação é através de domínios Fc ou sequências contendo tiol curtas fundidas à molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 e molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR.
[00101] De preferência, a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 interage seletivamente com a proteína ROR1 com uma afinidade constante de aproximadamente 0,01 a 50 nM, de preferência, 0,1 a 30 nM, ainda mais preferencialmente, 0,1 a 10 nM.
[00102] Além disso, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode, de preferência, mediar o extermínio de células tumorais que expressam ROR1 ou pode inibir a proliferação de células cancerosas. Adicionalmente, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode, de preferência, mediar o extermínio de células tumorais que expressam EGFR ou pode inibir a proliferação de células cancerosas. Além disso, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode, de preferência, mediar o extermínio de células tumorais que expressam tanto ROR1 quanto EGFR ou pode inibir a proliferação de tais células.
[00103] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode também ser capacidade de ser endocitada mediante ligação a ROR1 e/ou EGFR. Em outras modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode não ser endocitada mediante ligação a ROR1 e/ou EGFR.
[00104] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode também ter capacidade de regular de modo decrescente os níveis de superfície celular ou níveis de proteína total de ROR1 ou EGFR mediante ligação a ROR1 e/ou EGFR. Além disso, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode também ter capacidade de regular de modo decrescente a sinalização de ROR1 ou EGFR. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode também ter capacidade de regular de modo decrescente a sinalização de ROR1 e EGFR
[00105] Os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser conectada através de um ou mais domínios de ligante. Os ligantes preferenciais incluem, porém sem limitação, [G4S]x, em que x é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou
10. Os ligantes preferenciais particulares são [G4S]3 (SEQ ID NO: 60) e [G4S]5 (SEQ ID NO: 61). Outros ligantes preferenciais incluem as sequências PGVQPSP (SEQ ID NO: 62), PGVQPSPGGGGS (SEQ ID NO: 63) e PGVQPAPGGGGS (SEQ ID NO: 64). Esses ligantes podem ser particularmente úteis quando as proteínas são expressas em diferentes sistemas de expressão que diferem em padrões de glicosilação, tal como CHO e inseto, e aqueles que não glicosilam proteínas expressas (por exemplo, E. coli).
[00106] Será também percebido que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção pode ser construída em qualquer ordem, isto é, com a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 na terminação N ou terminação C.
[00107] Em um segundo aspecto da presente invenção, é fornecida uma proteína de fusão recombinante que compreende uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto. De preferência, na proteína de fusão recombinante do segundo aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é fundida a uma ou mais proteínas biologicamente ativas. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser fundida a uma ou mais proteínas biologicamente ativas através de um ou mais domínios de ligante. Os ligantes preferenciais incluem, porém sem limitação, [G4S]x, em que x é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os ligantes preferenciais particulares são [G4S]3 (SEQ ID NO: 60) e [G4S]5 (SEQ ID NO: 61). Outros ligantes preferenciais incluem as sequências PGVQPSP (SEQ ID NO: 62), PGVQPSPGGGGS (SEQ ID NO: 63) e PGVQPAPGGGGS (SEQ ID NO: 64). Esses ligantes podem ser particularmente úteis quando as proteínas de fusão recombinantes são expressas em diferentes sistemas de expressão que diferem em padrões de glicosilação, tal como CHO e inseto, e aqueles que não glicosilam proteínas expressas (por exemplo, E. coli).
[00108] Será entendido que as proteínas de fusão da invenção podem ser construídas em qualquer ordem, isto é, com a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 na terminação N, terminação C, ou em nenhuma terminação (por exemplo, no meio de uma sequência de aminoácidos mais longa). Além disso, são descritas proteínas de fusão em que os componentes ROR1 e EGFR da molécula de ligação ao antígeno biespecífica estão separados pela proteína biologicamente ativa. Um exemplo não limitante poderia ser a presença de um domínio Fc entre os dois componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Dependendo da configuração exata desejada, um ou mais domínios de ligante, conforme descrito no presente documento, podem estar incluídos.
[00109] As proteínas biologicamente ativas preferenciais incluem, porém sem limitação, uma imunoglobulina, uma região Fc de imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina, um Fv de cadeia única (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um acoplador de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio de VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio de VH ou uma proteína em arcabouço (aficorpos, centirinas, darpinas, etc.). Uma proteína biologicamente ativa particularmente preferencial é uma região Fc de imunoglobulina.
[00110] Qualquer parte da proteína de fusão da invenção pode ser geneticamente modificada para possibilitar a conjugação. Em um exemplo preferencial, em que uma região Fc de imunoglobulina é usada, a mesma pode ser geneticamente modificada para inclui um resíduo de cisteína como um sítio de conjugação. Os resíduos de cisteína introduzidos preferenciais incluem, porém sem limitação, S252C e S473C (numeração de Kabat), que correspondem a S239C e S442C na numeração de EU, respectivamente.
[00111] Em conformidade com o segundo aspecto, são fornecidas fusões recombinantes que compreendem múltiplos domínios de VNAR. Consequentemente, as fusões recombinantes da invenção podem ser dímeros, trímeros ou multímeros de ordem superior de VNARs. Em tais fusões recombinantes, a especificidade de cada VNAR pode ser igual ou diferente. As fusões recombinantes da invenção incluem, porém sem limitação, moléculas biespecíficas ou triespecíficas em que cada domínio de VNAR se liga a um antígeno diferente, ou a epítopos diferentes em um único antígeno (aglutinantes biparatópicos). O termo "biparatópico", conforme usado no presente documento, destina-se a abranger moléculas que se ligam a múltiplos epítopos em um dado antígeno. Moléculas que se ligam a três ou mais epítopos em um dado antígeno são também contempladas no presente documento e, quando o termo "biparatópico" é usado, deve-se compreender que o potencial para moléculas triparatópicas ou multiparatópicas é também abrangido.
[00112] Ainda em conformidade com o segundo aspecto, são fornecidas fusões recombinantes que incluem uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto e um domínio de VNAR humanizado. Os domínios de VNAR humanizados podem ser denominados soloMERs e incluem, porém sem limitação, VNAR BA11, que é um VNAR humanizado que se liga com alta afinidade a albumina sérica humana (Kovalenko et al, J.Biol. Chem., 2013 JBC).
[00113] Em certas modalidades, as moléculas de ligação específicas ou fusões recombinantes da invenção podem ser expressas com etiquetas N ou C-terminais para auxiliar a purificação. Os exemplos incluem, porém sem limitação, His6 e/ou Myc. Adicionalmente, a etiqueta N ou C-terminal pode ser, ainda, geneticamente modificada para incluir resíduos de cisteína adicionais para servir como pontos de conjugação. Será, portanto, entendido que a referência a moléculas de ligação específicas ou fusões recombinantes em todos os aspectos da invenção se destina também a abranger tais moléculas com uma variedade de etiquetas N ou C-terminais, em que as etiquetas podem também incluir cisteínas adicionais para conjugação.
[00114] Ainda em conformidade com o segundo aspecto, são fornecidas fusões recombinantes que incluem uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto e uma toxina recombinante. Os exemplos de toxinas recombinantes incluem, porém sem limitação, endotoxina de Pseudomonas PE38 e toxina de difteria.
[00115] Em um terceiro aspecto da presente invenção, é fornecido um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende pelo menos uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme definido pelo primeiro aspecto da invenção, fundida ou conjugada a pelo menos uma região transmembranar e pelo menos um domínio intracelular.
[00116] A presente invenção também fornece uma célula que compreende um receptor de antígeno quimérico de acordo com o terceiro aspecto, em que a célula é, de preferência, uma célula T geneticamente modificada.
[00117] Em um quarto aspecto da invenção, é fornecida uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico de acordo com o primeiro, o segundo ou o terceiro aspectos da invenção.
[00118] É também fornecido um vetor que compreende uma sequência de ácidos nucleicos em conformidade com o quarto aspecto e uma célula hospedeira que compreende tal ácido nucleico.
[00119] É fornecido um método para preparar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico do primeiro, segundo ou terceiro aspecto, em que o método compreende cultivar ou gerenciar uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo ou vetor descrito acima sob condições de modo que a dita célula hospedeira produza a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, que compreende, ainda, opcionalmente, isolar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico.
[00120] Em um quinto aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão ou receptor de antígeno quimérico do primeiro, segundo ou terceiro aspectos. A composição farmacêutica pode conter uma variedade de carreadores farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas da invenção podem ser para administração por qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo, porém sem limitação, administração intravenosa, intramuscular, oral, intraperitoneal ou tópica. Nas modalidades preferenciais, a composição farmacêutica pode ser preparada na forma de um líquido, gel, pó, tablete, cápsula ou espuma.
[00121] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico do primeiro, segundo ou terceiro aspectos pode ser para uso em terapia. Mais especificamente, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico do primeiro, segundo ou terceiro aspectos pode ser para uso no tratamento de câncer. De preferência, o câncer é um tipo de câncer positivo para ROR1. Mais preferencialmente, o câncer é selecionado dentre o grupo que compreende cânceres de sangue, tal como linfomas e leucemias, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda de célula B (B-ALL), linfoma de zona marginal (MZL), linfomas não Hodgkin (NHL), leucemia mieloide aguda (AML) e tumores sólidos, incluindo neuroblastoma, câncer renal, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pele, câncer uterino, câncer de próstata, câncer da tireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de estômago ou câncer de fígado.
[00122] É também fornecido no presente documento o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico do primeiro, segundo ou terceiro aspectos na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um paciente que precisa do mesmo.
[00123] Além disso, em conformidade com a presente invenção, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um paciente que precisa de tratamento que compreende a administração ao dito paciente de uma dosagem terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico do primeiro, segundo ou terceiro aspectos ou uma composição farmacêutica do quinto aspecto.
[00124] De preferência, o câncer é um tipo de câncer positivo para ROR1. Mais preferencialmente, o câncer é selecionado dentre o grupo que compreende cânceres de sangue, tal como linfomas e leucemias, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda de célula B (B-ALL), linfoma de zona marginal (MZL), linfomas não Hodgkin (NHL), leucemia mieloide aguda (AML) e tumores sólidos, incluindo neuroblastoma, câncer renal, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pele, câncer uterino, câncer de próstata, câncer da tireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de estômago ou câncer de fígado.
[00125] É também fornecido no presente documento um método para avaliar a presença de um analito alvo em uma amostra que compreende a adição de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica detectavelmente identificada do primeiro aspecto, ou uma proteína de fusão recombinante do segundo aspecto à amostra e detecção da ligação da molécula ao analito alvo.
[00126] Adicionalmente, é fornecido no presente documento um método para imagear um sítio de doença em um indivíduo que compreende a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica detectavelmente identificada do primeiro aspecto ou uma proteína de fusão recombinante detectavelmente identificada do segundo aspecto a um indivíduo.
[00127] É também fornecido no presente documento um método de diagnóstico de uma doença ou condição médica em um indivíduo que compreende a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto ou uma proteína de fusão recombinante do segundo aspecto.
[00128] É também contemplado no presente documento um anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao anticorpo que compete pela ligação a ROR1 com a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 do primeiro aspecto. É também contemplado no presente documento um anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao anticorpo que compete pela ligação a ROR1 e EGFR com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto. O termo "competir", quando usado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, proteínas de ligação ao antígeno neutralizantes ou anticorpos neutralizantes) significa competição entre proteínas de ligação ao antígeno, conforme determinado por um ensaio em que a proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento funcional do mesmo) sob teste impede ou inibe a ligação específica da molécula de ligação ao antígeno definida no presente documento (por exemplo, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto) a um antígeno comum (por exemplo, ROR1 ou EGFR no caso da molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto).
[00129] É também descrito no presente documento é um kit para diagnosticar um indivíduo que sofre de câncer, ou uma pré-disposição ao mesmo, ou para fornecer prognóstico da condição do indivíduo, em que o kit compreende meios de detecção para detectar a concentração de antígeno presente em uma amostra de um indivíduo de teste, em que os meios de detecção compreendem uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto, uma proteína de fusão recombinante do segundo aspecto, um receptor de antígeno quimérico do terceiro aspecto ou uma sequência de ácidos nucleicos do quarto aspecto, em que cada um é opcionalmente derivado, em que a presença de antígeno na amostra sugere que o indivíduo sofre de câncer. De preferência, o antígeno compreende proteína ROR1, mais preferencialmente, um domínio extracelular da mesma. Mais preferencialmente, o kit é usado para identificar a presença ou ausência de células positivas para ROR1 na amostra ou determinar a concentração das mesmas na amostra. O kit pode também compreender um controle positivo e/ou um controle negativo contra o qual o ensaio é comparado e/ou uma identificação que pode ser detectada.
[00130] A presente invenção também fornece um método para diagnosticar um indivíduo que sofre de câncer, ou uma pré-disposição ao mesmo, ou para fornecer um prognóstico da condição do indivíduo, em que o método compreende detectar a concentração de antígeno presente em uma amostra obtida de um indivíduo, em que a detecção é atingida com o uso de um molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto, uma proteína de fusão recombinante do segundo aspecto, um receptor de antígeno quimérico do terceiro aspecto ou uma sequência de ácidos nucleicos do quarto aspecto, em que cada um é opcionalmente derivado e em que a presença de antígeno na amostra sugere que o indivíduo sofre de câncer.
[00131] É também contemplado no presente documento um método para exterminar ou inibir a proliferação de uma célula que expressa ROR1 in vitro ou em um paciente, em que o método compreende administrar à célula uma dose ou quantidade farmaceuticamente eficaz de (i) molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto, uma proteína de fusão recombinante do segundo aspecto, uma sequência de ácidos nucleicos do terceiro aspecto ou o CAR ou célula de acordo com o quarto aspecto ou (ii) de uma composição farmacêutica do quinto aspecto. De preferência, a célula que expressa ROR1 é uma célula cancerosa. Mais preferencialmente, o ROR1 é ROR1 humano.
[00132] É também contemplado no presente documento um método para exterminar ou inibir a proliferação de uma célula que expressa EGFR in vitro ou em um paciente, em que o método compreende administrar à célula uma dose ou quantidade farmaceuticamente eficaz de (i) molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto, uma proteína de fusão recombinante do segundo aspecto, um ácido nucleico do terceiro aspecto ou o CAR ou célula de acordo com o aspecto de célula ou (ii) de uma composição farmacêutica de acordo com o quinto aspecto. De preferência, a célula que expressa EGFR é uma célula cancerosa.
[00133] É também contemplado no presente documento um método para exterminar ou inibir a proliferação de uma célula que expressa tanto ROR1 quanto EGFR in vitro ou em um paciente, em que o método compreende administrar à célula uma dose ou quantidade farmaceuticamente eficaz de (i) molécula de ligação ao antígeno biespecífica do primeiro aspecto, uma proteína de fusão recombinante do segundo aspecto, um ácido nucleico do terceiro aspecto ou o CAR ou célula de acordo com o aspecto de célula ou (ii) de uma composição farmacêutica de acordo com o quinto aspecto. De preferência, a célula que expressa ROR1 e EGFR é uma célula cancerosa.
[00134] Em um sexto aspecto da presente invenção, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula (II):
[00135] Xb-X-Xa-FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b- CDR3-FW4-Ya-Y-Yb (II)
[00136] em que
[00137] FW1 é uma região de arcabouço
[00138] CDR1 é uma sequência de CDR
[00139] FW2 é uma região de arcabouço
[00140] HV2 é uma sequência hipervariável
[00141] FW3a é uma região de arcabouço
[00142] HV4 é uma sequência hipervariável
[00143] FW3b é uma região de arcabouço
[00144] CDR3 é uma sequência de CDR
[00145] FW4 é uma região de arcabouço
[00146] em que Xa, Xb, Ya e Yb estão ausentes ou são uma molécula de ligação específica de EGFR,
[00147] em que pelo menos um dentre Xa, Xb, Ya e Yb é uma molécula de ligação específica de EGFR,
[00148] X e Y são sequências de aminoácidos opcionais
[00149] em que a molécula de ligação ao antígeno específica é conjugada a uma segunda porção química.
[00150] Em certas modalidades preferenciais, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com esse aspecto da invenção pode ser adicionalmente conjugada a uma terceira, quarta ou quinta porção química. A conjugação de outras porções químicas é também contemplada. Em alguns casos, uma terceira, quarta ou quinta porção química pode ser conjugada à segunda porção química. Consequentemente, será entendido que qualquer uma das porções químicas de acordo com esse aspecto da invenção podem ser porções químicas adicionais conjugadas às mesmas. A descrição dos recursos preferenciais da segunda porção química conforme apresentado abaixo se aplica à terceira, quarta, quinta ou ordem superior de porção química após devidas alterações.
[00151] De preferência, X ou Y estão individualmente ausentes ou são selecionados dentre o grupo que compreende uma imunoglobulina, uma região Fc de imunoglobulina, um região Fab de imunoglobulina, um Fv de cadeia única (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um acoplador de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio de VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio de VH ou uma proteína em arcabouço (aficorpos, centirinas, darpinas etc.), ou uma toxina, incluindo, porém sem limitação, endotoxina de Pseudomonas PE38, toxina de difteria.
[00152] De preferência, a conjugação é através de um resíduo de cisteína na sequência de aminoácidos da molécula de ligação ao antígeno específica. O resíduo de cisteína pode estar em qualquer parte na sequência, incluindo em sequências opcionais X ou Y (se estiver presente).
[00153] A conjugação pode ser através de uma porção química tiol, aminóxi ou hidrazinila incorporada na terminação N ou terminação C da sequência de aminoácidos da molécula de ligação ao antígeno específica.
[00154] De preferência, a segunda porção química é selecionada dentre o grupo que compreende identificação detectável, corante, toxina, fármaco, pró-fármaco, radionuclídeo ou molécula biologicamente ativa.
[00155] Mais preferencialmente, a segunda porção química é pelo menos uma toxina selecionada dentre o grupo que compreende: • maitansinoides, • auristatinas, • antraciclinas, de preferência, antraciclinas derivadas de PNU • caliqueamicinas, • derivados de amanitina, de preferência, derivados de α-amanitina • tubulisinas • duocarmicinas • radioisótopos, por exemplo, radionuclídeo emissor de alfa, tal como 227 Th ou 225 Ac • lipossomas que compreendem carga útil tóxica, • toxinas proteicas • taxanos, • pirrolbenzodiazepinas • pseudodímeros de indolinobenzodiazepina e/ou • inibidores de espliceossoma • Inibidores de CDK11 • Piridinobenzodiazepinas
[00156] Em outras modalidades preferenciais em conformidade com esse aspecto, a segunda porção química pode ser do grupo que compreende uma imunoglobulina, uma região Fc de imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina, um Fv de cadeia única (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um acoplador de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio de VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio de VH ou uma proteína em arcabouço (aficorpos,
centirinas, darpinas etc.), ou uma toxina, incluindo, porém sem limitação, endotoxina de Pseudomonas PE38, toxina de difteria.
[00157] Nas modalidades particularmente preferenciais, a segunda porção química é um domínio de VNAR, que pode ser igual ou diferente em relação à molécula de ligação ao antígeno específica de acordo com esse aspecto. Consequentemente, dímeros, trímeros ou multímeros de ordem superior de domínios de VNAR ligados por conjugação química são explicitamente contemplados no presente documento. Em tais modalidades, cada domínio de VNAR individual pode ter a mesma especificidade de antígeno que outros domínios de VNAR, ou pode ser diferente.
[00158] Em conformidade com esse aspecto, a molécula de ligação ao antígeno específica pode ser uma molécula de ligação ao antígeno específica de receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 1 (ROR1). A mesma pode ser uma molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 conforme descrito acima em relação ao primeiro aspecto da invenção. Consequentemente, qualquer um dos recursos preferenciais descritos acima em relação ao primeiro, segundo ou terceiro aspectos se aplicam após devidas alterações ao sexto aspecto.
[00159] De preferência, a molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR é selecionada dentre o grupo que compreende uma imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina, uma cadeia única Fv (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um acoplador de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio de VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio de VH ou uma proteína em arcabouço (aficorpos, centirinas, darpinas, etc.).
[00160] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica do sexto aspecto pode ser para uso em terapia. Mais especificamente, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica do sexto aspecto pode ser para uso no tratamento de câncer. De preferência, o câncer é um tipo de câncer positivo para ROR1. Mais preferencialmente, o câncer é selecionado dentre o grupo que compreende cânceres de sangue, tal como linfomas e leucemias, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda de célula B (B-ALL), linfoma de zona marginal (MZL), linfomas não Hodgkin (NHL), leucemia mieloide aguda (AML) e tumores sólidos, incluindo neuroblastoma, câncer renal, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pele, câncer uterino, câncer de próstata, câncer da tireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de estômago ou câncer de fígado.
[00161] É também fornecido no presente documento o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica do sexto aspecto na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um paciente que precisa do mesmo.
[00162] São também fornecidas composições farmacêuticas que compreendem a molécula de ligação ao antígeno biespecífica do sexto aspecto. A composição farmacêutica pode conter uma variedade de carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
[00163] Além disso, em conformidade com a presente invenção, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um paciente que precisa de tratamento que compreende a administração ao dito paciente de uma dosagem terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica do sexto aspecto ou uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno específica do sexto aspecto.
[00164] De preferência, o câncer é um tipo de câncer positivo para ROR1. Mais preferencialmente, o câncer é selecionado dentre o grupo que compreende cânceres de sangue, tal como linfomas e leucemias, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda de célula B (B-ALL), linfoma de zona marginal (MZL), linfomas não Hodgkin (NHL), leucemia mieloide aguda (AML) e tumores sólidos, incluindo neuroblastoma, câncer renal, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pele, câncer uterino, câncer de próstata, câncer da tireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de estômago ou câncer de fígado.
[00165] É também fornecido no presente documento um método para avaliar a presença de um analito alvo em uma amostra que compreende a adição de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica detectavelmente identificada do sexto aspecto à amostra e detecção da ligação da molécula ao analito alvo.
[00166] Adicionalmente, é fornecido no presente documento um método para imagear um sítio de doença em um indivíduo que compreende a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica detectavelmente identificada do sexto aspecto a um indivíduo.
[00167] É também fornecido no presente documento um método de diagnóstico de uma doença ou condição médica em um indivíduo que compreende a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica do sexto aspecto.
[00168] Em um sétimo aspecto da presente invenção, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula (II): Xb-X-Xa-FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4-Ya- Y-Yb (II) em que FW1 é uma região de arcabouço CDR1 é uma sequência de CDR FW2 é uma região de arcabouço HV2 é uma sequência hipervariável FW3a é uma região de arcabouço HV4 é uma sequência hipervariável FW3b é uma região de arcabouço CDR3 é uma sequência de CDR FW4 é uma região de arcabouço em que Xa, Xb, Ya e Yb estão ausentes ou são uma molécula de ligação específica de EGFR, em que pelo menos um dentre Xa, Xb, Ya e Yb é uma molécula de ligação específica de EGFR, X e Y são sequências de aminoácidos opcionais.
[00169] Todos os recursos descritos em relação ao sexto aspecto da invenção se aplicam, após devidas alterações, à molécula do sétimo aspecto.
[00170] Além disso, qualquer um dos recursos descritos em relação a qualquer um dos aspectos mencionados acima da invenção pode ser combinado, após devidas alterações, com outros aspectos da invenção.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00171] Figura 1: anticorpos monoclonais de fago anti-ROR1 que exibem domínios de VNAR: ligação a ROR1-Fc recombinante de ser humano ou camundongo em ELISA. Aglutinantes de ROR1 específico de B1, P3A1 e E7, H2 – fago não específico.
[00172] Figura 2: Sequências de ligação de ROR1 obtidas a partir de triagem da biblioteca de VNAR sintética com o uso de ROR1 humano (B1 e E7) e ROR1 de camundongo (P3A1 e CPF7). As sequências são mostradas sem e com etiqueta de His6Myc C-terminal (sequência His6 Myc em itálico).
[00173] Figura 3: Geração da biblioteca de VNAR imunizada com o uso de ROR1 humano: análise de ligação de plasma pré e pós-imunização de três galhudos malhados a ROR1 murino ou humano.
[00174] Figura 4: anticorpos monoclonais de fago anti-ROR1 biblioteca de VNAR imunizado: ligação a ROR1-Fc recombinante de ser humano ou camundongo em ELISA. E9 e D3 - aglutinantes de ROR1 específicos, H1 – aglutinante de VNAR não específico exibido em fago.
[00175] Figura 5: As sequências de ligação de ROR1 E9 e D3 obtidas a partir da triagem da biblioteca de VNAR imunizada com o uso de ROR1 de camundongo. As sequências são mostradas sem e com etiqueta de His6 Myc C-terminal (sequência His6 Myc em itálico).
[00176] Figura 6: Espectros de CD de UV distante de VNAR sem etiqueta, VNAR 6xHis e VNAR- His6-Myc em tampão NaCl 50 mM NaP 20 mM pH 6,0 à temperatura ambiente.
[00177] Figura 7: Reformatação de VNAR A: VNAR monomérico, B: homodímeros, C: homodímeros conjugados através de ligação de dissulfeto intermolecular C-terminal, D: heterodímeros, E: Fusões de VNAR IgG Fc, F: Fusões de IgG Fc – VNAR, G: Fusões de VNAR- (IgG Fc) – VNAR.
[00178] Figura 8: Ligação de homodímero ligado C- terminalmente de B1 a hROR1. Ligação de B1, tiol C-terminal de B1 (B1 SH) e dímero de dissulfeto C-terminal de B1 (B1 S-S B1) a ROR1 humano por ELISA.
[00179] Figura 9: Ligação de superfície celular de moléculas de VNAR (etiqueta His6Myc) a células de câncer de pulmão A549 (ROR1alto) por citometria de fluxo. Monômeros de B1 e E7 e dímero de P3A1-P3A1 se ligam fortemente a células A549 em todas as concentrações testadas. Monômeros de CPF7 e P3A1 se ligam a 50 µg/ml a células A549. A ligação de VNAR foi detectada com o uso de Ab de etiqueta PE-anti Myc (CST) e analisada com o uso de um citômetro de fluxo BD Biosciences FACSCalibur.
[00180] Figura 10: Sequências de IgG de camundongo ligante e IgG humana ligante usadas em proteínas de fusão de Fc de IgG de VNAR. Proteínas de fusão Fc de hIgG1 geneticamente modificadas incorporaram uma substituição de cisteína geneticamente modificada na sequência Fc de hIgG1, por exemplo, na posição S252C (numeração de Kabat) para possibilitar a identificação específica de sítio.
[00181] Figura 11: Reagentes de clivagem de inteína e os derivados C-terminais de VNAR correspondentes.
[00182] Figura 12: Ligação de VNAR a ROR1 de ser humano, camundongo e rato e ROR2 humano por ELISA. Todos os VNARs mostraram reação cruzada entre espécies a ROR1. Nenhum dos clones de VNAR apresentou reatividade cruzada com ROR2 humano.
[00183] Figura 13: Ligação de superfície celular de VNAR a linhagens de células de câncer de pulmão A549 (ROR1alto) vs A427 (ROR1baixo) por citometria de fluxo. A ligação de VNAR foi detectada com o uso de um Ab PE-anti-Myc (CST) e um citômetro de fluxo ThermoFisher Attune NxT.
[00184] Figura 14: Ligação de superfície celular de VNARs a células de câncer de mama MDA-MB-231 por 2 horas a 4 °C ou 37 °C. A perda de sinal de superfície celular a 37 °C sugere a internalização de ROR1. A ligação de VNAR foi detectada com o uso de Ab de etiqueta PE-anti Myc (CST) e analisada com o uso de um citômetro de fluxo BD Biosciences FACS Calibur (B1) ou ThermoFisher Attune NxT.
[00185] Figura 15: Gráfico de barras que representa ligação de superfície celular de molécula de VNAR- hFc a linhagens de células de câncer de pulmão A549 (ROR1alto) vs A427 (ROR1baixo). A ligação de VNAR hFc foi detectada com o uso de um anticorpo Pe-anti-humano (Jackson ImmunoResearch Labs/Stratech) e um citômetro de fluxo ThermoFisher Attune NxT.
[00186] Figura 16: Internalização de fusões de VNAR-Fc. Ligação de superfície celular de VNAR-Fc a células de câncer de mama MDA-MB-231 por 2 horas a 4 °C ou 37 °C. A perda de sinal de superfície celular a 37 °C sugere a internalização de ROR1. A ligação de VNAR-Fc foi detectada com o uso de um anticorpo Pe-anti-humano (JacksonImmunoResearch) e um citômetro de fluxo ThermoFisher Attune NxT.
[00187] Figura 17: VNARs se ligam a ROR1 humano independente de glicosilação. A, análise por SDS PAGE de hROR1
(faixa 2) e hROR1 desglicosilado (faixa 3). Marcadores Mwt (faixa 1). B, VNARs de ligação a ROR1 B1, P3A1-P3A1 e D3-D3 se ligam igualmente bem a hROR1 desglicosilado por ELISA. C, B1 mFc se liga igualmente bem a hROR1 glicosilado e desglicosilado por ELISA. A ligação a hROR1 não enovelado (reduzida com DTT 28 mM, 0,5% de Sarkosyl) foi significativamente reduzida, consistente com ligação de B1 VNAR a epítopo (ou epítopos) conformacional.
[00188] Figura 18: B1 forma um complexo com domínio Ig de ROR1 por SEC. A, Análise por SEC sobreposto (Superdex 200 Increase 10/300, GE Healthcare) de domínio Ig de ROR1 humano com e sem B1 his (vestígios laranja e azul, respectivamente). B, Análise por SDS PAGE de frações de pico.
[00189] Figura 19: Sensogramas de SPR que representam ligação de VNARs a hROR1 +/- VNAR B1 His6Myc anteriormente capturado. Monômero ou dímero de 2V não se ligaram sob qualquer uma dessas condições.
[00190] Figura 20: B1 e P3A1 não se ligam a peptídeos ROR1 lineares selecionados por ELISA. Ligação a ROR1 humano está incluída como um controle positivo.
[00191] Figura 21: B1, P3A1, D3 e D3-D3 não se ligam a peptídeos ROR1 lineares selecionados por ELISA. Ligação a ROR1 humano está incluída como um controle positivo.
[00192] Figura 22: Experimentos de ELISA de competição.
[00193] Figura 23: Experimentos de ELISA de competição.
[00194] Figura 24: Ligação de monômero de B1, P3A1, D3 e dímero de D3-D3 a diferentes domínios de ROR1.
[00195] Figura 25: Esquema de conjugação de BA11 aminóxi a benzaldeído fluoresceína.
[00196] Figura 26: Esquema de conjugação de BA11 tiol a maleimida fluoresceína.
[00197] Figura 27: Esquema de conjugação de derivado de cisteína C-terminal BA11 a maleimida fluoresceína.
[00198] Figura 28: Exemplos de identificações e cargas úteis usadas para conjugação.
[00199] Figura 29: Análise de conjugados de B1 MMAE. A, análise por SDS PAGE de derivados e conjugados de B1 his myc - faixas 1, B1 aminóxi; 2, B1 oxima MMAE; 3, B1 oxima vc MMAE; 4, B1 SH vc MMAE. B a F, espectros de massa por eletroaspersão de derivados e conjugados de B1 his myc – B, B1 SH (massa esperada; 14.908,9 Da, massa observada: 14.908,4 Da); C, B1 SH vc MMAE (massa esperada 16.225,5 Da, massa observada 16.225,5 Da); D, B1 aminóxi (massa esperada 14.937,4 Da, massa observada 14.936,5 Da); E, B1 oxima MMAE (massa esperada 16.015,4 Da, massa observada 16.016,7 Da); F, B1 oxima vc MMAE (massa esperada 16.334,4 Da, massa observada 16.334,2 Da).
[00200] Figura 30: Ligação de superfície celular de moléculas de B1-, P3A1- e 2V- hFc vs as versões conjugadas a MMAE em linhagens de células de câncer de pulmão A549 (ROR1alto) vs A427 (ROR1baixo). A ligação de VNAR hFc foi detectada com o uso de um anticorpo Pe-anti-humano (Jackson ImmunoResearch Labs/Stratech) e um citômetro de fluxo ThermoFisher Attune NxT.
[00201] Figura 31: Análise de conjugados de VNAR hFc. A e B, Análise por SDS PAGE de proteínas de VNAR hFc (S252C) e conjugados (4 a 12% e 12% de gel Bis Tris,
respectivamente). Faixas 1, proteína não tratada, 2, proteína reenovelada e 3, conjugado de MMAE (+ / - redução com DTT). C e D, Exemplo de análise por espectometria de massa de proteínas de fusão de VNAR hFc (S252C) reduzidas desglicosiladas antes e após conjugação de MMAE, respectivamente. Massas esperadas: não conjugado 38.997,8 Da e conjugado de MMAE (DAR 2) 40.310,0 Da. E e F Análise por SDS PAGE de conjugados de proteína VNAR hFc (S473C). Faixas 3, conjugados de MMAE e 4, conjugados de AF488 (+/- redução com DTT). G e H Análise por espectrometria de massa de conjugados de B1- e P3A1 hFc (S473C) MMAE reduzidos, desglicosilados, respectivamente. Massas esperadas: Conjugado de B1 40.170,5 Da e conjugado de P3A1 40.308,5 Da (DARs de 2) [* corresponde ao artefato MS devido à fragmentação em fonte]. I e J Análise por espectrometria de massa de conjugados de B1- e P3A1 hFc (S473C) AF488 reduzidos, desglicosilados, respectivamente. Massas esperadas: Conjugado de B1 39.552,4 Da e conjugado de P3A1 39.690,4 Da (DARs de 2).
[00202] Figura 32: Esquema de conjugados de VNAR hFc PBD dímero, amanitina e PNU.
[00203] Figura 33: Viabilidade celular após tratamento com moléculas de B1 mFc MMAE ou 2V mFc-MMAE (72 h) em um painel de diferentes linhagens de células de câncer humanas. Reagente Cell Titre Glo (Promega) foi usado para quantificar ATP, que se correlaciona com o número de células metabolicamente ativas em cultura. Os valores de IC50 foram determinados com o uso do software GraphPad Prism.
[00204] Figura 34: Viabilidade celular após tratamento com conjugados de VNAR hFc PBD (96 h) em 2 linhagens de células de câncer humanas diferentes (DU145 e Jeko-1). Reagente Cell Titre Glo (Promega) foi usado para quantificar
ATP, que se correlaciona com o número de células metabolicamente ativas em cultura. Os valores de IC50 foram determinados com o uso do software GraphPad Prism. Os conjugados de VNAR hFc foram gerados reagindo-se fusões de VNAR hIgG1 Fc(S252C) com MA PEG4 va PBD (consultar a Figura 32).
[00205] Figura 35: Viabilidade celular após tratamento com conjugados de VNAR hFc PBD, SG3199 PBD e PNU (PEG4 vc PAB DMAE PNU159682) (96 h) em 2 linhagens de células de câncer humanas diferentes (PA-1 e Kasumi-2). Reagente Cell Titre Glo (Promega) foi usado para quantificar ATP, que se correlaciona com o número de células metabolicamente ativas em cultura. Os valores de IC50 foram determinados com o uso do software GraphPad Prism. De modo que os conjugados de VNAR hFc fossem gerados reagindo-se fusões de VNAR hIgG1 Fc(S252C) com MA PEG4 va PBD, MA PEG8 va PAB SG3199, MA PEG4 vc PAB DMAE PNU 159682 (consultar a Figura 32).
[00206] Figura 36A e 36B: Ligação de superfície celular de molécula biespecífica B1hFc7C12 a uma variedade de linhagens celulares em comparação com moléculas originais. B1hFc7C12 mostra uma elevação na ligação. Realizada com o uso de um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher) e um anticorpo secundário anti-humano conjugado a PE para detectar (Biolegend). A: Proteínas aplicadas a 66 nM B: Proteínas aplicadas a 357 nM.
[00207] Figura 36C: Ligação de superfície celular de molécula biespecífica P3A1hFc7C12 a uma variedade de linhagens celulares em comparação com moléculas originais. P3A1hFc7C12 mostra uma elevação na ligação. Realizada com o uso de um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher) e um anticorpo secundário anti-humano conjugado a PE para detectar (Biolegend).
[00208] Figura 37A: Ligação de superfície celular de moléculas biespecíficas de ROR1-, EGFR- e EGFR-ROR1 a células A549 (alto ROR1, alto EGFR). A ligação das proteínas com etiqueta His6Myc foi avaliada por citometria de fluxo com o uso de um anticorpo de etiqueta PE-anti-Myc para detectar (CST). As análises foram realizadas com o uso de um citômetro de fluxo Attune NxT (Thermo).
[00209] Figura 37B: Ligação de superfície celular de moléculas biespecíficas de ROR1-, EGFR- e EGFR-ROR1 a células PA-1 (alto ROR1, médio/baixo EGFR). A ligação das proteínas com etiqueta His6Myc foi avaliada por citometria de fluxo com o uso de um anticorpo de etiqueta PE-anti-Myc para detectar (CST). As análises foram realizadas com o uso de um citômetro de fluxo Attune NxT (Thermo).
[00210] Figura 37C: Ligação de superfície celular de moléculas biespecíficas de ROR1-, EGFR- e EGFR-ROR1 à célula A427 (baixo ROR1, baixo EGFR). A ligação das proteínas com etiqueta His6Myc foi avaliada por citometria de fluxo com o uso de um anticorpo de etiqueta PE-anti-Myc para detectar (CST). As análises foram realizadas com o uso de um citômetro de fluxo Attune NxT (Thermo). A427 são ROR1 baixo, então, conforme esperado, o ROR1xEGFR biespecífico mostra pouco aumento em ligação a aglutinante de EGFR original wrt apenas.
[00211] Figura 38: Comparação de ligação de superfície celular de fusão de 7C12hFc e fusão de hFc-7C12 a uma variedade de linhagens celulares. Fusão de 7C12 à terminação C do hFc mostra uma diminuição na ligação a EGFR em linhagens celulares em comparação com quando 7C12 é fundido à terminação N da proteína hFc. Realizada com o uso de um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher) e um anticorpo secundário anti-humano conjugado a PE para detectar (Biolegend).
[00212] Figura 39: Microscopia de B1hFc7C12
[00213] Ligação de superfície celular aumentada a 4 °C de molécula biespecífica B1hFc7C12 e internalização após incubação a 37 °C por 2 horas foram observadas em células A549 em comparação com moléculas originais. As imagens foram obtidas com o uso de um GE Healthcare InCell 2000. Corante Hoechst foi usado para manchar os núcleos (azul), Ab Af488-anti-humano (Thermo) foi usado para detectar moléculas de VNAR hFc (verde) e Ab AF647-anticoelho (CST) foi usado para detectar Lamp-1 ou EEA1 (vermelho).
[00214] Figura 40: Microscopia de P3A1hFc7C12
[00215] Ligação de superfície celular aumentada a 4 °C de molécula biespecífica P3A1hFc7C12 e internalização após incubação a 37 °C por 2 horas foram observadas em células A549 em comparação com moléculas originais. As imagens foram obtidas com o uso de um GE Healthcare InCell 2000. Corante Hoechst foi usado para manchar os núcleos (azul), Ab Af488- anti-humano (Thermo) foi usado para detectar moléculas de VNAR hFc (verde) e Ab AF647-anticoelho (CST) foi usado para detectar Lamp-1 ou EEA1 (vermelho).
[00216] Figura 41: Colocalização de B1hFc7C12
[00217] A molécula biespecífica B1hFc7C12 parece se colocalizar com EEA1 (antígeno de endossomo precoce 1) e, até certo ponto, com Lamp-1 (marcador lisossomal 1) após incubação a 37 °C por 2 horas em células A549.
[00218] Figura 42: Dados de ensaio de internalização de A549 para (A) 9G8 contendo biespecificidade e (B) 7C12 contendo biespecificidade por análise por citometria de fluxo a 4 °C e 37 °C. Realizado com o uso de um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher) e um Ab PE-anti-Myc (CST) para detectar.
[00219] Figura 43: (A) Regulação decrescente de ROR1 por B1hFc, hFc7C12 e B1hFc7C12; (B) Regulação decrescente de EGFR por B1hFc, hFc7C12 e B1hFc7C12. A expressão de superfície celular de receptores ROR1 ou EGFR foi avaliada com o uso de mAb PE-ROR1 2A2 (Biolegend) e mAb PE-AY13 EGFR (Biolegend), respectivamente. Um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher) foi usado para realizar as análises. Os dados são apresentados como % de níveis de controle em 0 h.
[00220] Figura 44: (A) Regulação decrescente de ROR1 por P3A1hFc, hFc7C12 e P3A1hFc7C12; (B) Regulação decrescente de EGFR por P3A1hFc, hFc7C12 e P3A1hFc7C12. A expressão de superfície celular de receptores ROR1 ou EGFR foi avaliada com o uso de mAb PE-ROR1 2A2 (Biolegend) e mAb PE- AY13 EGFR (Biolegend), respectivamente. Um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher) foi usado para realizar as análises. Os dados são apresentados como % de níveis de controle em 0 h.
[00221] Figura 45: (A) Regulação decrescente de ROR1 por D3D3hFc, hFc7C12 e D3D3hFc7C12; (B) Regulação decrescente de EGFR por D3D3hFc, hFc7C12 e D3D3hFc7C12. A expressão de superfície celular de receptores ROR1 ou EGFR foi avaliada com o uso de mAb PE-ROR1 2A2 (Biolegend) e mAb PE- AY13 EGFR (Biolegend), respectivamente. Um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher) foi usado para realizar as análises. Os dados são apresentados como % de níveis de controle em 0 h.
[00222] Figura 46: Exemplos de ligação de ROR1 e EGFR simultânea de moléculas biespecíficas ROR1xEGFR com o uso de BLI. Os construtos mostraram se ligar a hROR1 imobilizado, que, então, por sua vez, se liga a EGFR conforme o mesmo é passado sobre a superfície de sensor. VNAR de ligação a ROR1 monoespecífico B1 não contém uma porção química de ligação de EGFR e, assim, nenhum aumento adicional em sinal é observado quando EGFR flui sobre a superfície do sensor.
[00223] Adicionalmente às sequências mencionadas, as sequências a seguir são expressamente reveladas. Algumas dessas sequências referem-se a exemplos de moléculas da invenção descritas no presente documento: SEQ ID NO: Nome da Sequência SEQ ID Nome da Sequência NO: 111 7C12 hFc (S252C) 142 B1 QASGA his myc 112 hFc (S252C) 7C12 143 D3 QASGA his myc 113 B1 hFc (S252C) 144 D3-D3 QASGA his 7C12 myc 114 P3A1 hFc (S252C) 145 P3A1 QASGA his myc 7C12 115 D3D3 hFc (S252C) 146 7C12 hFc (S252C) 7C12 116 B1-7C12 AAA his 147 hFc (S252C) 7C12 myc 117 B1-7C12 ACA his 148 B1 hFc (S252C) myc 7C12 118 7C12-B1 QASGA his 149 P3A1 hFc (S252C) myc 7C12 119 7C12-B1 QACGA his 150 D3D3 hFc (S252C) myc 7C12 120 B1-9G8 AAA his 151 B1-7C12 myc 121 9G8-B1 QASGA his 152 7C12-B1 myc 122 D3-7C12 AAA his 153 B1-9G8 myc 123 D3-7C12 ACA his 154 9G8-B1 myc
124 7C12-D3 QASGA his 155 D3-7C12 myc 125 7C12-D3 QACGA his 156 7C12-D3 myc 126 D3-9G8 AAA his 157 D3-9G8 myc 127 9G8-D3 QASGA his 158 9G8-D3 myc 128 D3D3-7C12 AAA his 159 D3D3-7C12 myc 129 D3D3-7C12 ACA his 160 7C12-D3D3 myc 130 7C12-D3D3 QASGA 161 P3A1-7C12 his myc 131 7C12-D3D3 QACGA 162 7C12-P3A1 his myc 132 P3A1-7C12 AAA his 163 2V-7C12 myc 133 P3A1-7C12 ACA his 164 7C12-2V myc 134 7C12-P3A1 QASGA 165 2V-9G8 his myc 135 7C12-P3A1 QACGA 166 9G8-2V his myc 136 2V-7C12 ACA his 167 7C12 myc 137 7C12-2V QACGA his 168 9G8 myc 138 2V-9G8 ACA his 169 B1 myc 139 9G8-2V QACGA his 170 D3 myc 140 7C12 AAA his myc 171 D3-D3 141 9G8 AAA his myc 172 P3A1
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00224] A presente invenção refere-se, de modo geral, a moléculas de ligação ao antígeno específicas. Especificamente, a invenção fornece receptores de antígeno inovadores variáveis de tubarão semelhantes a imunoglobulina (VNARs) específicos para receptor órfão semelhante a receptor tirosina quinase 1 (ROR1) e proteínas de fusão associadas,
receptor de antígeno quiméricos, conjugados e ácidos nucleicos, assim como métodos anexos. Os domínios de VNAR específicos de ROR1 são descritos no presente documento como moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1.
[00225] O receptor de antígeno Novo ou Inovador (IgNAR) é uma proteína homodimérica de aproximadamente 160 kDa encontrada no soro de peixes cartilaginosos (Greenberg A. S., et al., Nature, 1995. 374(6518): páginas 168 a 173, Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): páginas 25 a 33; Müller, M.R., et al., mAbs, 2012. 4(6): páginas 673 a 685)). Cada molécula consiste em um domínio variável N-terminal único (VNAR) e cinco domínios constantes (CNAR). Os domínios de IgNAR são membros da superfamília da imunoglobulina. O VNAR é um domínio firmemente enovelado com similaridades estruturais e algumas similaridades de sequência em relação à imunoglobulina e domínios variáveis de receptor de célula T e a molécula de adesão celular e é denominado VNAR por analogia ao domínio terminal variável N das imunoglobulinas clássicas e receptores de célula T. O VNAR compartilha homologia de sequência limitada a imunoglobulinas, por exemplo, 25 a 30% de similaridade entre VNAR e sequências de cadeia leve humanas (Dooley, H. and Flajnik, M. F., Eur. J. Immunol., 2005. 35(3): páginas 936- 945).
[00226] Kovaleva M. et al Expert Opin. Biol. Ther.
2014. 14(10): páginas 1.527 a 1.539 e Zielonka S. et al mAbs
2015. 7(1): páginas 15 a 25 forneceram resumos da caracterização estrutural e geração dos VNARs que estão incorporados ao presente documento a título de referência.
[00227] O VNAR não parece ter evoluído de um antecessor de anticorpo de imunoglobulina clássico. Os recursos estruturais distintos de VNARs são o truncamento das sequências equivalentes à alça de CDR2 presente em domínios variáveis de imunoglobulina convencionais e a falta dos resíduos de interface de VH/VL hidrofóbicos que poderiam normalmente permitir a associação a um domínio de cadeia leve, que não está presente na estrutura de IgNAR. Além disso, diferente das imunoglobulinas clássicas, alguns subtipos de VNAR incluem resíduos de cisteína extra nas regiões CDR que se observa que formam pontes de dissulfeto adicionalmente à ponte de superfamília da imunoglobulina canônica entre as Cisteínas nas regiões de Arcabouço 1 e 3 N terminalmente adjacentes às CDRs 1 e 3.
[00228] Até a presente data, pode haver três tipos definidos de IgNAR de tubarão conhecidos como I, II e III. Os mesmos foram categorizados com base na posição de resíduos de cisteína não canônicos que estão sob forte pressão seletiva e são, portanto, raramente substituídos.
[00229] Todos os três tipos têm as cisteínas canônicas de imunoglobulina clássicas nas posições 35 e 107 (numeração como em Kabat, E.A. et al. Sequences of proteins of immunological interest. 5ª edição, 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH) que estabilizam o enovelamento de imunoglobulina padrão, juntamente com um triptofano invariável na posição 36. Não há CDR2 definido como tal, mas regiões de variação de sequência que comparam mais proximamente a TCR HV2 e HV4 foram definidas no arcabouço 2 e 3, respectivamente. O tipo I tem resíduos de cisteína codificados por linhagem germinativa no arcabouço 2 e no arcabouço 4 e um número par de cisteínas adicionais dentro de CDR3. Os estudos de estrutura de cristal de um IgNAR do tipo
I isolado contra e em complexo com lisozima possibilitaram que a contribuição desses resíduos fosse determinada. Ambas as cisteínas de arcabouço 2 e 4 formam pontos de dissulfeto com aquelas em CDR3, formando uma estrutura fortemente encapsulada dentro da qual a alça de CDR3 é mantida firmemente até a região de HV2. Até a presente data, IgNARs do Tipo I foram apenas identificados em tubarões-enfermeiro – todos os outros elasmobrânquios, incluindo membros da mesma ordem têm apenas Tipo II ou variações desse tipo.
[00230] Os IgNAR do tipo II são definidos como tendo um resíduo de cisteína em CDR1 e CDR3 que formam ligações de dissulfeto intramoleculares que mantêm essas duas regiões em estreita proximidade, resultando em uma CDR3 protuberante (Figura 2) que é conducente à ligação de bolsos ou sulcos. As sequências do Tipo I tipicamente têm CDR3s mais longas que o tipo II com uma média de 21 e 15 resíduos, respectivamente. Acredita-se que isso se deva a uma forte pressão seletiva para dois ou mais resíduos de cisteína em CDR3 do Tipo I para associação com suas contrapartes de arcabouço 2 e 4. Os estudos no acúmulo de mutações somáticas mostram que há um número maior de mutações em CDR1 de tipo II do que tipo I, enquanto as regiões HV2 do tipo I mostram maior variação de sequência do que o tipo II. Essa evidência se correlaciona bem com o posicionamento determinado dessas regiões dentro dos sítios de ligação ao antígeno.
[00231] Um terceiro tipo de IgNAR conhecido como Tipo III foi identificado em neonatos. Esse membro da família de IgNAR carece de diversidade dentro da CDR3 devido à fusão de linhagem germinativa das regiões D1 e D2 (que formam CDR3) com o gene V. Quase todos os clones conhecidos têm um comprimento de CDR3 de 15 resíduos com pouca ou nenhuma diversidade de sequência.
[00232] Outro tipo estrutural de VNAR, denominado tipo (IIb ou IV), tem apenas dois resíduos de cisteína canônicos (em regiões de arcabouço 1 e arcabouço 3b). Até o momento, esse tipo foi encontrado principalmente em tubarões galhudos (Liu, J.L., et al. Mol. Immunol. 2007. 44(7): páginas
1.775 a 1.783; Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): páginas 17.408 a 17.419) e foi também isolado de bibliotecas de V-NAR semissintéticas derivadas de tubarões wobbegong (Streltsov, V.A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(34): páginas 12.444 a 12.449).
[00233] Foi mostrado, no entanto, que VNARs específicos isolados de bibliotecas sintéticas formadas a partir das sequências de VNAR podem se ligar com alta afinidade a outras proteínas (Shao C.Y. et al. Mol Immunol. 2007. 44(4): páginas 656 a 565; WO2014/173959) e que o IgNAR é parte do sistema adaptativo, já que peixes cartilaginosos podem ser imunizados com antígeno e IgNARs responsivos obtidos que se ligam ao antígeno (Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): páginas 25 a 33; WO2003/014161). Foi mostrado que o IgNAR tem um mecanismo para união combinatória de sequências semelhantes a V com sequências D e J similar àquele de imunoglobulinas e o receptor de célula T (resumido por Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): páginas 15 a 25).
[00234] A superfície de ligação de VNAR, diferente de domínios variáveis em outras imunoglobulinas naturais, deriva de quatro regiões de diversidade: CDR1, HV2, HV4 e CDR3 (consultar também Stanfield, R. L., et al, Science, 2004. 305(5691): páginas 1.770 a 1.773; Streltsov, V.A., et al,
Protein Sci., 2005. 14(11): páginas 2.901 a 2.909; Stanfield, R. L., et al., J Mol. Biol., 2007. 367(2): páginas 358 a 372), junidas por sequências de arcabouço intercaladas na ordem: FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4. A combinação de uma falta de um parceiro de cadeia leve natural e falta de CDR2 tornam os VNARs os menores domínios de ligação de ocorrência natural no reino vertebrado.
[00235] O IgNAR compartilha alguns recursos incidentais com a imunoglobulina apenas de cadeia pesada (HCAb) encontrada na família Camelidae (camelos, dromedários e lhamas, Hamers-Casterman, C. et al. Nature, 1993. 363, 446 a 448; Wesolowski, J., et al., Med Microbiol Immunol, 2009. 198(3): páginas 157 a 174). Diferente do IgNAR, o HCAb é claramente derivado da família de imunoglobulina e compartilha homologia de sequência significativa com as imunoglobulinas padrão. De modo importante, uma distinção chave de VNARs é que a molécula não teve em qualquer ponto em sua evolução uma cadeia leve parceira, diferente de imunoglobulinas clássicas ou os HCAbs. Flajnik M.F. et al PLoS Biol 2011. 9(8): e1001120 e Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): páginas 15 a 25 comentaram entre as similaridades e diferenças entre, e as possíveis e distintas origens evolucionárias do, VNAR e o domínio de ligação única de VHH derivado de imunoglobulina dos camelídeos.
[00236] Embora os anticorpos para ROR1 tenham sido relatados na literatura, a alta identidade de sequência entre o domínio extracelular de ROR1 humano, de camundongo e de rato e entre membros da família de ROR1 e ROR2 humanos, significa que a geração de agentes de ligação específicos de hROR1 de alta afinidade não é trivial. Adicionalmente, o tamanho grande dos anticorpos compromete sua capacidade de penetrar em tumores sólidos e torna regiões de proteínas alvo inacessíveis devido a fatores estéricos, o que pode ser particularmente agudo para proteínas da superfície celular em que oligomerização ou agrupamento de receptores é observado.
[00237] Como resultado, há uma necessidade na técnica de agentes proteicos de ligação anti-ROR1 aprimorados com diferentes características ou propriedades funcionais ou físicas a anticorpos e o desenvolvimento de agentes terapêuticos e diagnósticos para malignidades associadas à expressão de ROR1. A presente invenção fornece tais agentes na forma das moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 descritos no presente documento.
[00238] As moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 descritas no presente documento mostram se ligar a ROR1 tanto humano quanto murino. Além disso, as moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 da presente invenção se ligam a formas desglicosiladas de ROR1 e não se ligam a diversos peptídeos lineares associados a anticorpos anti-ROR1 descritos na técnica anterior. Acredita- se, portanto, que as moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 descritas no presente documento se ligam a epítopos inovadores na sequência de ROR1.
[00239] A ligação das moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 da invenção a linhagens de células cancerosas, assim como internalização, foi demonstrada. Isso confirma o potencial para o uso de tais moléculas no tratamento de cânceres, especificamente cânceres que expressam ROR1.
[00240] O receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) é um membro da família ErbB dos receptores tirosina quinase. O mesmo é uma proteína transmembranar de 170 kDa composta por quatro domínios extracelulares, uma região transmembranar, um domínio de tirosina quinase intracelular e uma cauda carbóxi-terminal. A função normal de EGFR refere-se à regulação de desenvolvimento de tecido epitelial, mas está também associada a diversos estados patológicos. Em particular, a superexpressão de EGFR foi associada a diversos cânceres. Consequentemente, é um alvo de fármaco importante e muitas abordagens terapêuticas foram aplicadas. Adicionalmente a diversos inibidores de EGFR baseados em molécula pequena, tal como gefitinibe, erlotinibe, afatinibe, brigatinibe, icotinibe e osimertinibe, diversos anticorpos para EGFR foram desenvolvidos. Os anticopos anti-EGFR cetuximabe, panitumumabe, zalutumumabe, nimotuzumabe e matuzumabe. Esses anticorpos bloqueiam o domínio de ligação a ligante extracelular, impedindo a ligação a ligante e subsequente ativação do domínio de tirosina quinase. Anticorpos de domínio único (sdAb) que mostram ligação competitiva com cetuximabe ou matuzumabe foram também desenvolvidos.
[00241] Os presentes inventores criaram uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica com base em um VNAR específica de ROR1 e uma molécula de ligação de EGFR. Várias formas das moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 são descritas, incluindo proteínas de fusão de diversos tipos, que podem ser usados na molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Proteínas de fusão, incluindo uma região Fc de imunoglobulina, são descritas, assim como tanto homodímeros quanto heterodímeros. A fusão de proteínas a um domínio Fc pode melhorar a solubilidade e a estabilidade da proteína, aumentar notavelmente a meia-vida plasmática e melhorar a eficácia terapêutica geral.
[00242] Surpreendentemente, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas mostram melhora notável em ligação e internalização em comparação com as moléculas constituintes equivalentes.
[00243] Os presentes inventores também criaram, pela primeira vez, moléculas de VNAR conjugadas a uma variedade de porções químicas e cargas úteis. A presente invenção, portanto, também fornece VNARs quimicamente conjugados. Mais especificamente, moléculas de antígeno específicas de ROR1 em diversos formatos conjugados são fornecidas. Tais moléculas podem estar incluídas nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas. Além disso, são fornecidas no presente documento moléculas de antígeno específicas de ROR1/EGFR biespecíficas quimicamente conjugadas a várias cargas úteis em vários formatos. Especificamente, os presentes inventores forneceram proteínas de fusão recombinantes biespecíficas de ROR1/EGFR que incluem uma região Fc, em que os conjugados são fornecidos através da região Fc. Nos exemplos específicos, as mutações S239C ou S442C (numeração de EU, equivalente a S252C e S473C na numeração de Kabat) no domínio Fc são usados como sítios de conjugação.
[00244] Moléculas de antígeno específicas de ROR1/EGFR biespecíficas também foram geradas anexadas com sequências de etiqueta de cisteína curtas para facilitar a conjugação com cargas úteis e identificações reativas a tiol.
[00245] Além disso, os inventores concluíram que, surpreendentemente, o aumento em ligação a células A549 e células PA1 é observado depende da orientação do domínio de ligação de EGFR (9G8 ou 7C12) em relação ao agente de ligação de ROR1. Quando o agente de ligação de EGFR é fundido em posição C-terminal ao agente de ligação de ROR1, a ligação de superfície celular é comprometida em comparação com o mesmo construto, mas com o agente de ligação de EGFR fundido em posição N-terminal ao agente de ligação de ROR1. Alterar a orientação dos domínios dentro do construto, portanto, fornece um método para alterar a afinidade do agente biespecífico à superfície celular.
[00246] Uma observação surpreendente similar estava dentro do contexto de proteínas de fusão Fc (Figura 38). Quando o agente de ligação de EGFR 7C12 foi fundido à terminação C do fragmento Fc (hFc 7C12), a ligação às linhagens de células EGFR+ve A549, PA-1 e A427 foi consistentemente mais baixa em comparação com a fusão N-terminal correspondente (7C12 hFc). Desse modo, possibilitando que as características de ligação de superfície celular de agentes de ligação biespecíficos de ROR1-EGFR sejam moduladas através de projeto adequado das proteínas de fusão Fc correspondentes. Definições
[00247] Uma molécula de ligação específica ao antígeno da invenção compreende uma sequência de aminoácidos derivada de uma biblioteca sintética de moléculas de VNAR ou de bibliotecas derivadas da imunização de um peixe cartilaginoso. Os termos VNAR, IgNAR e NAR podem ser usados de forma intercambiável também.
[00248] Os aminoácidos são representados no presente documento como um código de uma letra ou como o código de três letras ou ambos.
[00249] O termo "purificação por afinidade" significa a purificação de uma molécula com base em uma atração ou ligação específica da molécula a um parceiro químico ou de ligação para formar uma combinação ou complexo que permite que a molécula seja separada de impurezas enquanto permanece ligada ou atraída à porção química parceira.
[00250] O termo "Regiões Determinantes de Complementaridade" ou CDRs (isto é, CDR1 e CDR3) refere-se aos resíduos de aminoácidos de um domínio de VNAR cuja presença está tipicamente envolvida em ligação ao antígeno. Cada VNAR tipicamente tem duas regiões CDR identificadas como CDR1 e CDR3. Adicionalmente, cada domínio de VNAR compreende aminoácidos de uma "alça hipervariável" (HV), que podem também estar envolvidos em ligação ao antígeno. Em alguns casos, uma região determinante de complementaridade pode incluir aminoácidos tanto de uma região CDR como uma alça hipervariável. Em outros casos, a ligação ao antígeno pode também envolver resíduos de uma única CDR ou HV. De acordo com a nomenclatura geralmente aceita para moléculas de VNAR, uma região CDR2 não está presente.
[00251] "Regiões de arcabouço" (FW) são aqueles resíduos de VNAR diferentes dos resíduos de CDR. Cada VNAR tipicamente tem cinco regiões de arcabouço identificadas como FW1, FW2, FW3a, FW3b e FW4.
[00252] Os limites entre as regiões FW, CDR e HV em VNARs não são concebidos como sendo fixos e, consequentemente, alguma variação nos comprimentos e composições dessas regiões deve ser esperada. Isso será entendido por aqueles que são versados na técnica, particularmente em referência ao trabalho que foi executado para analisar essas regiões. (Anderson et al., PLoS ONE (2016) 11 (8); Lui et al., Mol Immun (2014) 59, 194 a 199; Zielonka et al., Mar Biotechnol (2015). 17, (4) 386 a 392; Fennell et al., J Mol Biol (2010) 400. 155 a 170; Kovalenko et al., J Biol Chem (2013) 288. 17.408 a 17.419; Dooley et al., (2006) PNAS 103 (6). 1.846 a 1.851). As moléculas da presente invenção, embora definidas por referência a regiões FW, CDR e HV no presente documento, não se limitam a essas definições restritas. Variação em linha com o entendimento da técnica como a estrutura do domínio de VNAR é, portanto, expressamente contemplada no presente documento.
[00253] Um "conjunto de códons" refere-se a m conjunto de diferentes sequências de tripleto de nucleotídeos usadas para codificar aminoácidos variantes desejados. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese em fase sólida, incluindo sequências que representam todas as combinações possíveis de tripletos de nucleotídeo fornecidos pelo conjunto de códons e que codificarão o grupo desejado de aminoácidos. Uma forma padrão de designação de códon é aquela do código IUB, que é conhecido na técnica e descrito no presente documento.
[00254] Um conjunto de códons é tipicamente representado por 3 letras maiúsculas em itálico, por exemplo, NNK, NNS, XYZ, DVK etc. Um "conjunto de códons não aleatório", portanto, refere-se a um conjunto de códons que codifica aminoácidos selecionados que atentem parcialmente, de preferência, completamente, os critérios para seleção de aminoácido conforme descrito no presente documento. A síntese de oligonucleotídeos com "degenerescência" de nucleotídeo selecionado em certas posições é bem conhecida na técnica, por exemplo, a abordagem TRIM (Knappek et al.; J. Mol. Biol. (1999), 296, 57 a 86); Garrard & Henner, Gene (1993), 128, 103). Tais conjuntos de oligonucleotídeos que têm conjuntos de códons podem ser sintetizados com o uso de sintetizadores de ácido nucleico comerciais (disponível, por exemplo, junto à Applied Biosystems, Foster City, CA) ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, junto à Life Technologies, Rockville, MD). Um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados que têm um conjunto de códons particular incluirá tipicamente uma pluralidade de oligonucleotídeos com diferentes sequências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códons dentro da sequência geral. Os oligonucleotídeos usados de acordo com a presente invenção têm sequências que permitem a hibridização a um modelo de ácido nucleico de VNAR e também podem, quando conveniente, incluir sítios de enzima de restrição.
[00255] "Célula", "linhagem de células" e "cultura celular " são usados de forma intercambiável (a não ser que o contexto indique de outro modo) e tais designações incluem toda progênie de uma célula ou linhagem de células. Assim, por exemplo, termos como "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula em questão primária e culturas derivadas da mesma sem considerar o número de transferências. É também entendido que toda progênie pode não ser exatamente idêntica em teor de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica que a triada na célula originalmente transformada está incluída.
[00256] "Sequências de controle", quando em referência à expressão, significam sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação ligada de maneira funcional em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, um sítio de ligação de ribossomo, etc. As células eucarióticas usam sequências de controle, tais como promotores, sinais de poliadenilação, e intensificadores.
[00257] O termo "proteína de revestimento" significa uma proteína, em que pelo menos uma porção da mesma está presente na superfície da partícula viral. De uma perspectiva funcional, uma proteína de revestimento é qualquer proteína que se associada a uma partícula viral durante o processo de montagem viral em uma célula hospedeira e permanece assoviada ao vírus montado até que infecte outra célula hospedeira.
[00258] O "limite de detecção" para uma entidade química em um ensaio particular é a concentração mínima dessa entidade que pode ser detectada acima do nível de fundo para esse ensaio. Por exemplo, no ELISA de fago, o "limite de detecção" para um fago particular que exibe um fragmento de ligação ao antígeno particular é a concentração de fago em que o fago particular produz um sinal de ELISA acima daquele produzido por um fago de controle que não exibe o fragmento de ligação ao antígeno.
[00259] Uma "proteína de fusão" e um "polipeptídeo de fusão" referem-se a um polipeptídeo que tem duas porções ligadas covalentemente juntas, em que cada uma das porções é um polipeptídeo que tem uma propriedade diferente. A propriedade pode ser uma propriedade biológica, tal como atividade in vitro ou in vivo. A propriedade pode ser também uma propriedade química ou física simples, tal como ligação a um antígeno alvo, catálise de uma reação, etc. As duas porções podem estar ligadas diretamente por uma ligação de peptídeo simples ou através de um ligante peptídico contendo um ou mais resíduos de aminoácido. De modo geral, as duas porções e o ligante estarão em quadro de leitura um com o outro. De preferência, as duas porções do polipeptídeo são obtidas a partir de polipeptídeos heterólogos ou diferentes.
[00260] O termo "proteína de fusão” neste texto significa, em termos gerais, uma ou mais proteínas unidas juntas por meios químicos, incluindo ligações de hidrogênio ou pontes de sal, ou por ligações peptídicas através de síntese de proteína ou ambos. Tipicamente, as proteínas de fusão serão preparadas por técnicas de recombinação de DNA e podem ser denominadas no presente documento proteínas de fusão recombinantes.
[00261] "DNA heterólogo" é qualquer DNA que é introduzido em uma célula hospedeira. O DNA pode ser derivado de uma variedade de fontes, incluindo DNA genômico, cDNA, DNA sintético e fusões e combinações dos mesmos. O DNA pode incluir DNA da mesma célula ou tipo de célula que a célula hospedeira ou receptora ou DNA de um tipo de célula diferente, por exemplo, de uma fonte alogênica ou xenogênica. O DNA pode, opcionalmente, incluir genes marcadores ou de seleção, por exemplo, genes de resistência a antibióticos, genes de resistência a temperatura, etc.
[00262] Uma "posição altamente diversa" refere-se a uma posição de um aminoácido localizado nas regiões variáveis das cadeias leve e pesada que têm diversos aminoácidos diferentes representados na posição quando as sequências de aminoácidos de anticorpos conhecidos e/ou de ocorrência natural ou fragmentos de ligação ao antígeno são comparados.
As posições altamente diversas estão tipicamente nas regiões CDR ou HV.
[00263] "Identidade” descreve a relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado através da comparação de sequências. Identidade também significa o grau de relação (homologia) de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme possa ser o caso, conforme determinado pelo número de correlação entre as cadeias de tais sequências. Embora existam diversos métodos para medir identidade entre sequências de dois polipeptídeos ou dois polinucleotídeos, os métodos comumente empregados para determinar a identidade são codificados em programas de computador. Os programas de computador preferenciais para determinar a identidade entre duas sequências incluem, porém sem limitação, o pacote de programas GCG (Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. (1990) 215, 403).
[00264] De preferência, a sequência de aminoácidos da proteína tem pelo menos 45% de identidade, com o uso dos parâmetros padrão do programa de computador BLAST (Atschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403 a 410) fornecidos por HGMP (Projeto de Mapeamento do Genoma Humano), no nível de aminoácido, às sequências de aminoácidos reveladas no presente documento.
[00265] Mais preferencialmente, a sequência de proteínas podem ter pelo menos 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e, ainda mais preferencialmente, 95% (ainda mais preferencialmente, pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade, no nível de ácido nucleico ou aminoácido, com as sequências de aminoácidos conforme mostrado no presente documento.
[00266] A proteína pode também compreender uma sequência que tem pelo menos 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente documento, com o uso dos parâmetros padrão do programa de computador BLAST fornecido por HGMP, para o mesmo.
[00267] Uma pluralidade de "biblioteca" refere-se a uma pluralidade de VNARs ou sequências de fragmento de VNAR (por exemplo, polipeptídeos da invenção), ou os ácidos nucleicos que codificam essas sequências, em que as sequências são diferentes na combinação de aminoácidos variantes que são introduzidos nessas sequências de acordo com os métodos da invenção.
[00268] "Ligação" é o processo de formar ligações de fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico. Para ligação dos dois fragmentos, as extremidades dos fragmentos precisam ser compatíveis uma com a outra. Em alguns casos, as extremidades serão diretamente compatíveis após digestão por endonuclease. Entretanto, pode ser necessário converter as extremidades desalinhadas comumente produzidas após digestão por endonuclease em extremidades cegas para tornar as mesmas compatíveis para ligação. Para cegar as extremidades, o DNA é tratado em um tampão adequado por pelo menos 15 minutos a 15 °C com cerca de 10 unidades do fragmento de Klenow de DNA polimerase I ou T4 DNA polimerase na presença dos quatro desoxirribonucleosídeo trifosfatos. O DNA, então, é purificado por extração de fenol-clorofórmio e precipitação de etanol ou por purificação de sílica. OS fragmentos de DNA que devem ser ligados juntos são colocados em solução em quantidades quase equimolares. A solução também conterá ATP, tampão ligase e uma ligase, tal como T4 DNA ligase, a cerca de 10 unidades por 0,5 µg de DNA. Se o DNA deve ser ligado a um vetor, o vetor é primeiramente linearizado por digestão com a endonuclease (ou endonucleases) de restrição adequada. O fragmento de linearização e, então, tratado com fosfatase alcalina bacteriana ou fosfatase intestinal de bezerro para impedir a autoligação durante a etapa de ligação.
[00269] Uma "mutação" é uma deleção, inserção ou substituição de um nucleotídeo (ou nucleotídeos) em relação a uma sequência de nucleotídeos de referência, tal como uma sequência do tipo selvagem.
[00270] VNARs "naturais" ou "de ocorrência natural” refere-se a VNARs identificadas a partir de uma fonte não sintética, por exemplo, de uma fonte de tecido obtida ex vivo, ou do soro de um animal da subclasse de Elasmobranchii. Esses VNARs podem incluir VNARs gerados em qualquer tipo de resposta imunológica, seja natural ou induzida de outro modo. Os VNARs naturais incluem as sequências de aminoácidos, e as sequências de nucleotídeos que constituem ou codificam esses anticorpos. Conforme usado no presente documento, os VNARs naturais são diferentes de "VNARs sintéticos", em que VNARs sintéticos se referem a sequências de VNAR que foram alteradas a partir de uma sequência de fonte ou modelo, por exemplo, pela substituição, deleção ou adição, de um aminoácido, ou mais de um aminoácido, em uma certa posição com um aminoácido diferente, em que o aminoácido diferente fornece uma sequência de anticorpo diferente da sequência de anticorpo de fonte.
[00271] O termo "constructo de ácido nucleico" refere-se, de modo geral, a qualquer comprimento de ácido nucleico que possa ser DNA, cDNA ou RNA, tal como mRNA obtido por clonagem ou produzido por síntese química. O DNA pode ser de fita simples ou dupla. DNA de fita simples pode ser a fita senso de codificação ou pode ser a fita de não codificação ou antissenso. Para uso terapêutico, o constructo de ácido nucleico está, de preferência, em uma forma capaz de ser expressa no indivíduo a ser tratado.
[00272] "Ligada de maneira funcional", em referência a ácidos nucleicos, significa que os ácidos nucleicos são colocados em uma relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretório está ligado de maneira funcional ao DNA para um polipeptídeo se for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação a ribossomo está ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. De modo geral, "ligado de maneira funcional" significa que as sequências de DNA que estão ligadas são contíguas e, no caso de líder secretório, contingentes e no quadro de leitura. Entretanto, os intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.
[00273] O termo "proteína" significa, em termos gerais, uma pluralidade de resíduos de aminoácidos unidos juntos por ligações peptídicas. O mesmo é usado de forma intercambiável e significa o mesmo que peptídeo, oligopeptídeo, oligômero ou polipeptídeo e inclui glicoproteínas e derivados das mesmas. O termo "proteína" também se destina a incluir fragmentos, análogos, variantes e derivados de uma proteína, em que o fragmento, análogo, variante ou derivado mantém essencialmente a mesma atividade ou função biológica que uma proteína de referência. Os exemplos de análogos e derivados de proteína incluem ácidos nucleicos peptídicos e DARPinas (Proteínas de Repetição de Anquirina Projetadas).
[00274] Um fragmento, análogo, variante ou derivado da proteína pode ter pelo menos 25, de preferência, 30 ou 40, ou até 50 ou 100, ou 60 a 120 aminoácidos de comprimento, dependendo do comprimento da sequência de proteínas original da qual a mesma é derivada. Um comprimento de 90 a 120, 100 a 110 aminoácidos pode ser conveniente em alguns casos.
[00275] O fragmento, derivado, variante ou análogo da proteína pode ser (i) aquele em que um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser aquele codificado pelo código genético ou (ii) aquele em que um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte, ou (iii) aquele em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro, tal como uma sequência líder ou auxiliar que é empregada para purificação do polipeptídeo. Tais fragmentos, derivados, variantes e análogos são considerados como estando dentro do escopo daqueles versados na técnica a partir dos ensinamentos no presente documento.
[00276] "Oligonucleotídeos" são polidesoxinucleotídeos de comprimento curto, de fita simples ou dupla fita que são quimicamente sintetizados por métodos conhecidos (tal como química de fosfotriéster, fosfito ou fosforamidita, com o uso de técnica de fase sólida). Outros métodos incluem a reação em cadeia de polimerase (PCR) usada se a sequência de ácidos nucleicos inteira do gene for conhecida ou a sequência do ácido nucleico complementar à fita de codificação estiver disponível. Alternativamente, se a sequência de aminoácidos alvo for conhecida, pode-se inferir as sequências de ácidos nucleicos potenciais com o uso de resíduos de codificação conhecidos e preferenciais para cada resíduo de aminoácido. Os oligonucleotídeos podem ser purificados em géis de poliacrilamida ou colunas de dimensionamento molecular ou por precipitação. O DNA é "purificado" quando o DNA é separado de impurezas não ácido nucleico (que podem ser polares, não polares, iônicos, etc.).
[00277] Um VNAR "fonte" ou "modelo”, conforme usado no presente documento, refere-se a um VNAR ou fragmento de ligação ao antígeno de VNAR cuja sequência de ligação ao antígeno serve como a sequência modelo mediante a qual a diversificação de acordo com os critérios descritos no presente documento é realizada. Uma sequência de ligação ao antígeno,
de modo geral, inclui dentro de um VNAR de preferência pelo menos uma CDR, de preferência, incluindo regiões de arcabouço.
[00278] Um "elemento regulador de transcrição" conterá um ou mais dos seguintes componentes: um elemento intensificador, um promotor, uma sequência operadora, um gene repressor e uma sequência terminadora de transcrição.
[00279] "Transformação" significa um processo de modo que uma célula absorva DNA e se torne um "transformante". A absorção de DNA pode ser permanente ou temporária. Um "transformante" é uma célula que absorveu e manteve DNA conforme evidenciado pela expressão de um fenótipo associado ao DNA (por exemplo, resistência a antibióticos conferida por uma proteína codificada pelo DNA).
[00280] Uma "variante" ou "mutante" de um polipeptídeo de partida ou referência (por exemplo, um VNAR fonte ou uma CDR do mesmo), tal como uma proteína de fusão (polipeptídeo) ou um polipeptídeo heterólogo (heterólogo a um fago), é um polipeptídeo que (1) tem uma sequência de aminoácidos diferente daquela do polipeptídeo de partida ou referência e (2) foi derivado do polipeptídeo de partida ou referência através de mutagênese natural ou artificial. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse. Por exemplo, um polipeptídeo de fusão da invenção gerado com o uso de um oligonucleotídeo que compreende um conjunto de códons não aleatório que codifica uma sequência com um aminoácido variante (em relação ao aminoácido encontrado na posição correspondente em um VNAR fonte ou um fragmento de ligação ao antígeno) poderia ser um polipeptídeo variante em relação a um VNAR fonte ou fragmento de ligação ao antígeno. Assim, uma CDR variante refere-se a uma CDR que compreende uma sequência variante em relação a uma sequência de polipeptídeos de partida ou referência (tal como aquela de um VNAR fonte ou fragmento de ligação ao antígeno). Um aminoácido variante, nesse contexto, refere-se a um aminoácido diferente do aminoácido na posição correspondente em uma sequência de polipeptídeos de partida ou referência (tal como aquela de um VNAR fonte ou um fragmento de ligação ao antígeno). Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser realizada para chegar no construto variante ou mutante final, contanto que o construto final possua as características funcionais desejadas. As alterações de aminoácido podem alterar os processos pós-traducionais do polipeptídeo, tal como alterar o número ou a posição de sítios de glicosilação.
[00281] Uma sequência "do tipo selvagem" ou "de referência" ou a sequência de uma proteína/polipeptídeo "do tipo selvagem" ou "de referência", tal como uma proteína de revestimento, ou uma CDR de um VNAR fonte, pode ser a sequência de referência da qual os polipeptídeos variantes são derivados através da introdução de mutações. Em geral, a sequência "do tipo selvagem" para uma dada proteína é a sequência que é mais comum na natureza. Similarmente, uma sequência de genes "do tipo selvagem” é a selvagem para aquele gene que é mais comumente encontrado na natureza. Mutações podem ser introduzidas em um gene "do tipo" (e, assim, a proteína que o mesmo codifica) seja através de processos naturais ou através de meios induzidos pelo homem. Os produtos de tais processos são formas "variantes" ou "mutantes" da proteína ou gene "do tipo selvagem" original.
[00282] O termo "receptores de antígeno quimérico (CARs)", conforme usado no presente documento, pode se referir a receptores de célula T artificiais, receptores de célula T quiméricos, ou imunorreceptores quiméricos, por exemplo, e abranger receptores geneticamente modificados que enxertam uma especificidade artificial em uma célula efetora imune particular.
Os CARs podem ser empregados para conferir a especificidade de uma proteína de ligação específica de antígeno, tal como um anticorpo monoclonal ou VNAR, em uma célula T, permitindo, assim, que um grande número de células T seja gerado, por exemplo, para uso em terapia com células adoptivas.
Os CARs podem direcionar a especificidade da célula para um antígeno associado a tumor, por exemplo.
Os CARs podem compreender um domínio de ativação intracelular, um domínio transmembranar e um domínio extracelular que compreende uma região de ligação ao antígeno associada a tumor.
Em aspectos particulares, os CARs compreendem fusões de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) derivados de anticorpos monoclonais fundidos a endodomínios e tranmambrana CD3-zeta.
Em outros aspectos particulares, os CARs compreendem fusões dos domínios de VNAR descritos no presente documento com endodomínios e transmembrana CD3-zeta.
A especificidade de outros projetos de CAR pode ser derivada de ligantes de receptores (por exemplo, peptídeos) ou de receptores de reconhecimento de padrão, tais como Dectinas.
Em modalidades particulares, pode-se ter como alvo células B malignas redirecionando-se a especificidade de células T com o uso de um CAR específico para a molécula da linhagem B, CD 19. Em certos casos, o espaçamento do domínio de reconhecimento de antígeno pode ser modificado para reduzir a morte celular induzida por ativação. Em certos casos, os CARs compreendem domínios para sinalização coestimularória adicional, tal como CD3-zeta, FcR, CD27, CD28, CD 137, DAP 10 e/ou OX40. Em alguns casos, as moléculas podem ser coexpressas cm o CAR, incluindo moléculas coestimulatórias, genes repórter para imaginologia (por exemplo, para tomografia por emissão de pósitrons), produtos de gene que remover condicionalmente as células T mediante adição de um pró-fármaco, receptores de endereçamento, quimiocinas, receptores de quimioquina, citocinas e receptores de citocinas.
[00283] O termo "conjugação", conforme usado no presente documento, pode se referir a um método para ligar quimicamente duas ou mais porções químicas. Tipicamente, a conjugação será através de ligação covalente. No contexto da presente invenção, pelo menos uma das porções químicas será um polipeptídeo e, em alguns casos, a conjugação envolverá dois ou mais polipeptídeos, um dos quais pode ser gerado por tecnologia de DNA recombinante. Diversos sistemas para conjugar polipeptídeos são conhecidos na técnica. Por exemplo, a conjugação pode ser atingida através de um resíduo de lisina presente na molécula de polipeptídeo com o uso de N-hidroxi- succinimida ou através de um resíduo de cisteína presente na molécula de polipeptídeo com o uso de éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida. Em algumas modalidades, a conjugação ocorre através de uma ligação degradável, de curta duração, incluindo, porém sem limitação, ligações fisiologicamente cliváveis, incluindo ligações de éster, éster de carbonato, carbamato, sulfato, fosfato, éter aciloxialquímico, acetal e cetal, hidrazona, oxima e dissulfeto. Em algumas modalidades, os ligantes que são cliváveis por enzimas intracelulares ou extracelulares, tal como membros da família da catepsina, cliváveis sob condições de redução ou pH ácido, são incorporadas para possibilitar liberações de porções químicas conjugadas do polipeptídeo ou proteína à qual estão conjugadas.
[00284] Um método particularmente preferencial de conjugação é o uso de tecnologia baseada em inteína (US2006247417). Em resumo, a proteína de interesse é expressa como uma fusão N terminal de um domínio de inteína geneticamente modificado (Muir 2006 Nature 442, 517 a 518). O desvio de acila N para S subsequente na união proteína-inteína em um intermediário ligado a tioéster que pode ser quimicamente clivado com agentes de bis-aminóxi ou amino-tióis para gerar o derivado de aminóxi ou tiol C-terminal à proteína desejada, respectivamente (Figura 11). Esses derivados de aminóxi e tiol C-terminais podem ser reagidos com porções químicas funcionalizadas com aldeído / cetona e maleimida, respectivamente, de uma forma quimiosseletiva para gerar a proteína modificada C-terminalmente específica de sítio (Figuras 25 a 27).
[00285] Em outro método preferencial de conjugação, os VNARs são diretamente expressos com uma cisteína adicional na ou próxima à região C-terminal do VNAR ou incorporada dentro de uma sequência de etiqueta C-terminal curta que possibilita a conjugação com cargas úteis reativas a tiol, tais como porções químicas funcionalizadas com maleimida.
[00286] Conjugação, conforme denominado no presente documento, também se destina a abranger o uso de uma porção química ligante, que pode conferir diversas propriedades úteis. As porções químicas ligantes incluem,
porém sem limitação, sequências de peptídeos, tal como poli- glicina, gly-ser, val-cit ou val-ala. Em certos casos, a porção química ligante pode ser selecionada de modo que seja clivável sob certas condições, por exemplo, através do uso de enzimas, reagentes nucleofílicos/básicos, agentes redutores, fotoirradiação, reagentes eletrofílicos/ácidos, reagentes organometálicos e metálicos ou reagentes oxidantes, ou o ligante pode ser especificamente selecionado para resistir à clivagem sob tais condições.
[00287] Os polipeptídeos podem ser conjugados a uma variedade de porções químicas funcionais a gim de atingir diversos objetivos. Os exemplos de porções químicas funcionais incluem, porém sem limitação, polímeros, tal como polietilenoglicol, a fim de reduzir a imunogenicidade e a antigenicidade ou melhorar a solubilidade. Outros exemplos não limitantes incluem a conjugação de um polipeptídeo a um agente terapêutico ou um agente citotóxico.
[00288] O termo "identificação detectável" é usado no presente documento para especificar que uma entidade pode ser visualizada ou detectada de outro modo por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos, químicos ou outros. A identificação detectável pode ser selecionada de modo que gere um sinal que pode ser medido e cuja intensidade é proporcional à quantidade de entidade ligada. Uma ampla variedade de sistemas para identificar e/ou detectar proteínas e peptídeos é conhecida na técnica. Uma identificação pode ser diretamente detectável (isto é, não exige qualquer reação ou manipulação adicional para ser detectável, por exemplo, um fluoróforo é diretamente detectável) ou pode ser indiretamente detectável (isto é,
torna-se detectável através de reação ou ligação com outra entidade que é detectável, por exemplo, um hapteno é detectável por imunocoloração após reação com um anticorpo adequado que compreende um repórter, tal como um fluoróforo). Os agentes detectáveis adequados incluem, porém sem limitação, radionuclídeos, fluoróforos, agentes quimioluminescentes, micropartícula, enzimas, identificações colorimétricas, identificações magnéticas, haptenos, sinalizadores moleculares e sinalizadores de aptâmero.
[00289] Métodos para exterminar ou inibir a proliferação de células que expressam ROR1 in vitro ou em um paciente são contemplados no presente documento. Em geral, o termo "exterminar", conforme usado no presente documento, no contexto de células, significa causar uma morte celular. Isso pode ser atingido por diversos mecanismos, tal como necrose ou outras lesões celulares, ou a indução de apoptose. Os sintagmas "inibir o crescimento" ou "inibir a proliferação", quando usados no presente documento, se destinam a abranger o impedimento de desenvolvimento celular, mais especificamente, o impedimento de divisão celular.
[00290] A presente invenção será entendida adicionalmente por referência aos exemplos a seguir.
EXEMPLOS
[00291] EXEMPLO 1 – Geração de sequências de VNAR anti-ROR1 específicas
[00292] Sequências de VNAR específicas de biblioteca sintética
[00293] Duas campanhas de seleção foram adotadas para triar uma biblioteca de domínio sintético de VNAR (WO2014173959) para aglutinantes de ROR1 específicos. A primeira campanha fez uso de antígeno de ROR1 humano e o segundo usou antígeno de ROR1 de camundongo. Ambas as proteínas de ROR1 recombinantes foram biotiniladas de acordo com as instruções do fabricante (protocolo Thermo Scientific Sulfo- NHS-LC-Biotin, número de catálogo 21327) para auxiliar a apresentação de antígeno e processo de seleção. Os domínios de VNAR foram isolados após 3 rodadas de seleção com o uso desses antígenos de ROR1 biotinilados imobilizados em microesferas revestidas com estreptavidina. Após a seleção e em seguida à triagem de clones individuais, 70% do fago monoclonal que exibem domínios de VNAR (selecionados contra proteína de ROR1 humano) mostraram ser específicos para ROR1 humano e de camundongo, mas não uma proteína de ROR2 proximamente relacionada (os clones líder dessa seleção foram denominados B1 - 40 % e E7 – 30% (Figura 1). Similarmente, 45% do fago monoclonal selecionado com ROR1 de camundongo foram específicos para ROR1 humano ou de camundongo, mas não ROR2 (o clone líder sessa seleção foi denominado P3A1, Figura 1). Outro clone específico obtido a partir da triagem de ROR1 de camundongo foi CPF7, que estava presente como uma sequência única dentre 200 clones triados.
[00294] As sequências obtidas a partir da triagem com ROR1 humano são B1 e E7, e a partir da triagem com ROR1 de camundongo são P3A1 e CPF7. (Figura 2)
[00295] Sequências de VNAR específicas de bibliotecas imunizadas
[00296] Construção de bibliotecas.
[00297] Três galhudos malhados foram imunizados com domínio extracelular de proteína de ROR1 humano recombinante e uma resposta imunológica de IgNAR específica de alvo foi monitorada através da análise de soros pós-imunizados, conforme descrito em Müller M.R. et al. Generation and Isolation of Target-Specific Single-Domain Antibodies from Shark Immune Repertoires, Humana Press 2012. As amostras de soro pré e pós-imunização foram obtidas a partir de animais e testadas quanto à ligação ao antígeno em ELISA. Um aumento de título de IgNAR, específico para ROR1 humano, foi observado após 16 semanas em todos os animais (Figura 3). A especificidade de soros pós-imunes para ROR1 de camundongo foi também observada, indicando a presença em animais imunizados de aglutinantes de IgNAR espécies de ROR1 de reação cruzada entre espécies (Figura 3).
[00298] O repertório de VNAR (sítios de ligação de IgNAR) foi amplificado a partir de sangue de galhudo com o uso de iniciadores de PCR específicos e clonados em um vetor de exibição de fago, que continha uma proteína de revestimento em quadro pIII do gene de bacteriófago M13, conforme descrito em Müller M.R. et al. Generation and Isolation of Target-Specific Single-Domain Antibodies from Shark Immune Repertoires, Humana Press 2012. Os tamanhos de biblioteca foram calculados e são mostrados na Tabela 1: Tabela 1: Peixe Biblioteca Tamanho nº (transformantes exclusivos) 154 ELSI 5 6 x 107 156 ELSI 6 1,7 x 107 161 ELSI 7 2 x 107 Triagem das bibliotecas imunizadas para sequências de VNAR específicas de antígeno.
[00299] A proteína de ROR1 de camundongo recombinante foi usada para triar bibliotecas imunizadas (ELSI
5–7). Após um protocolo similar àquele usado para triar a biblioteca sintética, os domínios de VNAR foram isolados após 3 rodadas de seleção com o uso de antígeno de ROR1 biotinilado imobilizado em microesferas revestidas com estreptavidina. Após o processo de seleção, 45% do fago monoclonal que exibe um domínio de VNAR (do resultado combinado das 3 bibliotecas) foram específicos para ROR1 humano e de camundongo. Um terço do VNAR específico de ROR1 mostrou ter a sequência D3 (Figuras 4 e 5) e os dois terços restantes - à sequência E9 (Figuras 4 e 5).
[00300] As sequências obtidas a partir da triagem com ROR1 de camundongo são E9 e D3. (Figura 5)
[00301] Todas as proteínas VNAR anti-ROR1 líder foram expressas em células de E.coli TG1 ou de mamífero HEK293 e purificadas por IMAC a partir da fração periplásmica ou o sobrenadante celular, respectivamente. Métodos
[00302] Título de IgNAR em ELISA de soro
[00303] ELISA foi executado com o uso do seguinte protocolo:
1. Revestir uma placa de ELISA com 100 μl/poço de 1 mg/ml de ROR1-Fc humano ou ROR1-Fc de camundongo em PBS. Incubar a 4 °C de um dia para o outro.
2. Lavar placas 3x com PBST.
3. Bloquear placas adicionando 200 μl/poço de M-PBS 2% (p/v) e incubar a 37 °C por 1 h.
4. Lavar placas 3x com PBST.
5. Diluir em série soro de galhudo em PBS de não menos que 1:10 até 1:1.000 e adicionar 100 μl/poço. Incubar à temperatura ambiente por 1 h.
6. Lavar placas 3x com PBST.
7. Adicionar 100 μl/poço de anticorpo primário (anticorpo anti-IgNAR monoclonal de camundongo, GA8) diluído como sobrenadante de cultura de tecido de hibridoma em PBST.
8. Lavar placas 3x com PBST.
9. Adicionar 100 μl/poço de um conjugado de IgG HRP anticamundongo secundário adequado diluída em PBS. Incubar por 1 h.
10. Lavar placas 2x com PBST seguido por 2x com PBS.
11. Adicionar 100 μl/poço de substrato de TMB à placa e incubar até o aparecimento de sinal/início de saturação. Interromper o desenvolvimento de cor adicionando 100 μl/poço de H2SO4 0,18 M.
12. Ler a 450 nm com um leitor de placa de microtitulação. Triagem de biblioteca
1. Para resgatar fago de biblioteca para seleções, culturas de estoques de glicerol de biblioteca foram cultivadas a 37 °C e 250 rpm, em 2xTY, 2% de glicose, 100 µg/ml de ampicilina a um OD600 de 0,5.
2. Células foram superinfectadas com fago auxiliar 109 M13K07 (NEB) e, então, incubadas de um dia para o outro em 2xTY, 100 µg/ml de ampicilina, 50 µg/ml de canamicina a 25 °C e 250 rpm.
3. O fago foi precipitado por PEG (20% de PEG/NaCl 2,5 M) duas vezes a partir da cultura bacteriana e os péletes de fago resultantes foram ressuspensos em 1 ml de PBS.
4. 200 μl de Dynabeads M-280 Estreptavidina (Invitrogen no 11205D), pré-bloqueadas com 2% (p/v) de MPBS,
foram revestidos com ROR1 de camundongo biotinilado 400 nM, girando a 20 rpm, à temperatura ambiente por 1 h.
5. O fago de biblioteca foi desselecionado por incubação com Dynabeads por 1 h. girando à temperatura ambiente e, então, adicionado às microesferas revestidas com antígeno.
6. As microesferas foram lavadas 5 a 10 vezes com PBST e 5 a 10 vezes com PBS, eluídas por rotação por 8 min em 400 μl de TEA 100 mM e neutralizadas pela adição de 200 μl de Tris-HCl 1 M pH 7,5.
7. Células TG1 de E. coli (10 ml) foram infectadas com 300 de fago eluído por 30 min a 37 °C e cultivadas de um dia para o outro a 37 °C em placas de ágar TYE contendo 2% (p/v) de glicose e 100 μg/ml de ampicilina.
8. Três rodadas adicionais de seleção foram conduzidas e os resultados foram triados quanto à ligação específica de antígeno por fago monoclonal e ELISAs de extrato periplásmico contra ROR1 humano ou de camundongo. Os aglutinantes de fago foram detectados com o uso de anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (GE Healthcare, 27942101) e proteína periplásmico foi detectada com o uso e anticorpo anti-c-Myc conjugado a HRP (Roche, 118 141 50 001).
[00304] Expressão de VNAR em E.coli
1. Diluir a cultura de um dia para o outro a 1:50 em meio TB com sais fosfato, 1% de glicose, 100 ug/ml de Ampicilina e incubar a 37 °C com agitação vigorosa (250 rpm) todos os dias.
2. Peletizar as células por centrifugação a 3,000 x g por 20 min a 20 °C.
3. Ressuspender as células no mesmo volume de meio TB com sais fosfato, 100 ug/ml de Ampicilina (sem glicose).
4. Adicionar IPTG a uma concentração final de 1 mM de IPTG e incubar a 16 °C de um dia para o outro (16 h) com agitação a 250 rpm.
5. Coletar as células por centrifugação a 6,000 x g por 30 min (o pélete poderia ser congelado nesse ponto a -20 °C).
6. Ressuspender o pélete em 10% de volume de cultura de TES gelado e agitar suavemente em gelo por 15 min.
7. Adicionar um volume igual de MgSO4 5 mM gelado (para concentração final de 2,5 mM de MgSO4) e continuar a agitar suavemente em gelo por mais 15 min.
8. Peletizar a suspensão por centrifugação a 15,000 x g por 30 min a 4 °C e decantar cuidadosamente o sobrenadante contendo proteína periplásmica liberada em um falcon limpo.
9. Adicionar 10x PBS pH 7,4 [concentração final de 1xPBS] a extrato peri-prep antes de incubação por IMAC. Expressão de VNAR em HEK293 10 μg de DNA em água (filtrada estéril) para 10 ml de cultura.
[00305] Usar 10 ml de células (~106/ml) em um tubo de bioprreator de 50 ml (cultivar exponencialmente células em meio fresco)
[00306] Adicionar meio OptiMEM a DNA até um volume total de 500 μl.
[00307] Adicionar 25 μl de PEI (1 mg/ml de estoque constituído em água) a 500 μl de meio OptiMEM separado.
[00308] Incubar DNA e PEI à temperatura ambiente por até 15 min.
[00309] Misturar 500 μl de PEI em meio até cada 500 μl de DNA em meio.
[00310] Incubar à temperatura ambiente por 20 a 30 min, facilitando a formação de complexo.
[00311] Adicionar 1 ml de mistura às células e incubar a 37 °C, 5% de CO2 em agitação a 140 rpm.
[00312] No dia seguinte, adicionar células por adição de 250 μl de triptona 20% (p/v) a 10 ml de células para obter a concentração final de triptona 0,5%
[00313] Deixar as células expressarem por 3 a 5 dias.
[00314] Centrifugar as células e avaliar o sobrenadante quanto à proteína triada para determinar a produtividade.
[00315] Adicionar 10xPBS pH 7,4 [concentração final de 1xPBS] a extrato peri-prep antes de incubação por IMAC.
[00316] Esse protocolo pode ter a escala aumentada ou diminuída conforme necessário para produção de proteína.
[00317] Expressão de proteína (aumento de escala)
[00318] Proteínas de VNAR de ligação a ROR1 foram bem expressas em muitas formas diferentes em diversos sistemas de expressado diferentes. A adição de etiquetas C terminais padrão, incluindo His e His6Myc, para auxiliar a purificação de proteína, manuseio e análise de proteína, não afetou a ligação de VNARs de ROR1 para ter como alvo ROR1 (Tabela 2).
[00319] Tabela 2: Dados de SPR para ligação de VNARs com diferentes etiquetas C-terminais a ROR1 e ROR2 humanos etiqueta hROR1 VNAR C- Ka (M-1s- Kd (s- KD hROR2 terminal 1) 1) (nM)
1,91E- Sem 6xHis 2,33E+06 0,11 04 ligação B1 6xHis 6,09E- Sem 7,47E+05 0,83 myc 04 ligação 2,06E- Sem 6xHis 2,92E+06 7,8 02 ligação P3A1 6xHis 2,5E- Sem 9,8E+05 25,6 myc 02 ligação Sem 5,98E- Sem dímero 1,67E+06 0,36 etiqueta 04 ligação de P3A1 6xHis 6,37E- Sem 2,08E+06 0,35 myc 04 ligação
[00320] Adicionalmente, etiquetas C-terminais de VNAR não afetar a estrutura de VNAR conforme medida por dicroísmo circular (Figura 6 – espectros CD de VNARs) (Glasgow University, RU).
[00321] Os VNARs foram também expressos geneticamente fundidos a sequências Fc de IgG de ser humano e camundongo, e como fusões N-terminais a inteínas geneticamente modificadas, possibilitando a conjugação específica a identificações e fármacos. Os sistemas de expressão usados incluem E. coli (expressão periplásmica e citoplasmática), HEK 293 e CHO (proteínas de fusão Fc Evitria). EXEMPLO 2 – Reformatação de VNAR Homodímeros
[00322] VNARs de ligação a ROR1 foram reformatados com sucesso em homodímeros por fusão genética com o uso de ligantes à base de GlySer padrão (Figura 7B). Os homodímeros mostraram ter afinidade aumentada para hROR1 recombinante por SPR e ELISA, e ligação aumentada a ROR1 de superfície celular em linhagens de células cancerosas positivas para ROR1 por citometria de fluxo (Figura 9). Experimentos de citometria de fluxo são descritos em mais detalhes no Exemplo 4.
[00323] Adicionalmente, homodímeros de VNAR de ligação a ROR1 foram gerados com sucesso através de conjugação química. VNARs foram expressos como proteínas de fusão de inteína e clivados com cisteamina para gerar derivados de tiol C-terminais, que, então, se autoassociaram em homodímeros através de formação de dissulfeto intermolecular C terminal (Figura 7C). Esses homodímeros ligados a dissulfeto mostraram afinidade de ligação a hROR1 recombinante por ELISA (Figura 8). A produção de proteínas de fusão de inteína é discutida em mais detalhes no Exemplo 8. Heterodímeros
[00324] Heterodímeros de VNAR de ligação de ROR1 foram gerados por fusão genética com ligantes GlySer padrão (Figura 7D) e demonstraram ligação específica de alta afinidade a ROR1 recombinante e células positivas para ROR1. As proteínas de VNAR heterodiméricas podem ser também geradas por conjugação química.
[00325] Os resultados para experimentos de caracterização de ligação são tabulados na Tabela 3 e 4 (consultar o Exemplo 3).
[00326] Proteínas de fusão Fc de VNAR
[00327] A fusão de proteínas a um domínio Fc pode melhorar a solubilidade e a estabilidade da proteína, aumentar notavelmente a meia-vida plasmática e melhorar a eficácia terapêutica geral. VNARs de ligação a ROR1 foram geneticamente fundidos à terminação N de Fc de IgG2a de camundongo (mFc) e ambas as terminações N e C de IgG1 humana (hFc) através de ligantes GlySer padrão (Figura 7 E, F, G). Exemplos de sequências Fc
[00328] Fc de IgG2a de camundongo (mFc)
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVD VSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNK DLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKT
ELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 93) Fc de IgG1 humana (hFc)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 94)
[00329] Proteínas de fusão Fc de VNAR foram expressos como proteína secretada em células CHO K1 e purificadas do mesmo com o uso de MabSelect™ SuRe™ (Evitria, Suíça). As proteínas purificadas foram analisadas por SEC (AdvanceBio, Agilent), SDS PAGE e espectrometria de massa para confirmar a integridade de sequência e proteína. As proteínas de fusão Fc de VNAR resultantes se ligam a ROR1 humano recombinante por SPR (Tabela 6) e células positivas para ROR1 com alta afinidade (Figura 15) e mostraram se internalizar em células positivas para ROR1.
[00330] VNARs de ligação a ROR1 foram também geneticamente fundidos a proteínas de fusão Fc de hIgG1 geneticamente modificadas que incorporaram uma substituição de cisteína geneticamente modificada na sequência Fc de hIgG1, por exemplo, na posição S252C ou S473C (numeração de Kabat)
para possibilitar a identificação específica de sítio. (Figura 10)
[00331] Método típico para expressão de proteínas de fusão de inteína de VNAR
[00332] Para expressão de fusões de inteína, DNA que codifica VNARs foi otimizado para expressão de E. coli (GeneArt, Thermo) e clonado nos sítios NdeI/SapI do vetor pTXB1 (NEB) e derivados do mesmo. Isso resulta em um gene que codifica a proteína de VNAR de interesse fundida a um domínio de inteína geneticamente modificado que, por sua vez, é fundido a um domínio de ligação a quitina (CBD) para possibilitar a purificação em uma coluna de quitina. Os derivados de vetor pTXB1 codificam inteínas alternativas como proteínas de fusão.
[00333] As células de E.coli transformadas cultivadas em frascos de agitação de 1 l até OD600 = ~0,6 poderiam ser submetidas a choque a 4 °C por 2 horas, então, a expressão de proteína induzida com IPTG 0,5 mM a 18 °C de um dia para o outro. As células foram lisadas por sonicação em tampão de lise (fosfato de sódio 50 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M, 15% de glicerol, EDTA 0,5 mM, 0,1% de Sarkosyl, AEBSF 1 mM) e centrifugadas para remover os restos de células. A proteína de fusão de inteína de VNAR foi purificada do lisato celular clarificado por imobilização em microesferas de quitina (NEB, S6651). As microesferas foram lavadas extensivamente com tampão de lise seguida por tampão de clivagem (fosfato de sódio 50 mM pH 6,9, NaCl 200 mM) e VNARs liberados das microesferas por clivagem química de um dia para o outro em dioxiamina 400 mM, ou O,O'-1,3-propanodiolbishidroxilamina, ou cisteína ou cisteamina 100 mM para gerar o derivado correspondente de aminóxi C-terminal, cisteína C-terminal ou tiol C-terminal dos VNARs (Figura 11).
[00334] O sobrenadante de VNAR clivado foi, então, adicionalmente purificado por SEC (Superdex75 26/60 GE healthcare) ou IMAC (HisTrap HP, GE Healthcare). As concentrações foram determinadas a partir da absorbância a 280 nm com o uso do coeficiente de extinção teórico previsto a partir da sequência de aminoácidos. Todas as proteínas foram caracterizadas por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa. A formação da ligação de dissulfeto desejada foi confirmada por métodos de espectrometria de massa.
[00335] EXEMPLO 3 – Caracterização de VNAR Anti- ROR1 – ligação a ROR1 e ROR2 por SPR e ELISA
[00336] Reatividade Cruzada entre Espécies de aglutinantes de VNAR de ROR1
[00337] Os clones de proteína de VNAR solúveis (B1, P3A1 e D3) foram analisados quanto à reatividade cruzada entre espécies com ROR1 de ser humano, camundongo e rato juntamente com um anticorpo de controle positivo 2A2 e um controle de anticorpo espécie anti ROR2. 2A2 é um anticorpo monoclonal de camundongo específico de ROR1 anti-humano (BioLegend número de catálogo 357802) e o anticorpo anti ROR2 é um anticorpo monoclonal de camundongo comercial de R&D (número de catálogo MAB2064).
[00338] Foi observado que VNAR B1 é um aglutinante muito forte tanto para ROR1 humano quanto de camundongo. Todos os VNARs apresentam reatividade cruzada entre espécies para ROR1 derivado de uma origem de ser humano, camundongo e rato
(Tabela 3 e Tabela 4). Nenhum dos clones de VNAR apresentou reatividade cruzada com ROR2 humano (Tabela 3).
[00339] Determinação de cinética de ligação a ROR1 humano, ROR2 humano, ROR1 de camundongo ou ROR1 de rato
[00340] As cinéticas de ligação foram determinadas com o uso de um instrumento de Ressonância de Plásmon de Superfície Pioneer (SPR) (SensiQ/Pall ForteBio). As proteínas de fusão ROR1-hFc ou ROR2-hFc (domínio extracelular) foram imobilizadas em tampão acetato de sódio pH 5 a fragmentos de COOH2 com o uso de acoplamento de amina. VNARs e moléculas de VNAR-Fc foram testados em várias concentrações e os valores de Ka (M-1s-1), Kd (s-1) e KD (nM) foram determinados com o uso do software Qdat (SensiQ/Pall ForteBio). mAb ROR1 2A2 (Biolegend) e mAb ROR2 (R&D Systems) foram incluídos como controles para ligação positiva/negativa a ROR1 e ROR2. 2V é uma sequência de VNAR de controle, derivada de uma biblioteca de VNAR virgem, portanto, é representativa dessa classe de proteína, mas não tem alvo conhecido.
[00341] Tabela 3: Dados de SPR para ligação de moléculas de VNAR a ROR1 humano (hROR1) e ROR2 humano (hROR2). VNARs etiquetados com His6 ou His6Myc C-terminais foram expressos.
hROR1 VNAR hROR2 Sistema de Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD (nM) Expressão Sem B1 E. coli 6,29E+05 7,93E-04 1,6 ligação
Sem B1 HEK293 5,36E+05 2,26E-03 0,63 ligação
Sem P3A1 E. coli 2,47E+06 4,42E-02 19,1 ligação
Sem CPF7 E. coli 2,33E+06 2,96E-02 13,6 ligação
Sem E7 E. coli 1,11E+06 1,18E-02 11,1 ligação
Sem D3 E. coli 2,09E-05 3,24E-02 159,1 ligação
Sem D3 HEK293 1,39E+06 7,52E-02 54,5 ligação
Sem E9 HEK293 4,23E+05 4,45E-02 136,6 ligação
P3A1-[G4S]5- Sem HEK293 4,9E+06 1,12E-03 0,30 P3A1 ligação
Sem D3-[G4S]5-D3 E. coli 2,95E+06 3,38E-03 2,33 ligação
Sem P3A1-[G4S]5-B1 E. coli 3,13E+06 2,08E-03 1,0 ligação
Sem P3A1-[G4S]3-B1 E. coli 1,09E+06 2,84E-03 2,7 ligação
Sem P3A1-[G4S]7-B1 E. coli 1,49E+06 6,44E-03 4,3 ligação
Sem Sem Sem Sem 2V E. coli ligação ligação ligação ligação
Sem Sem Sem Sem 2V-[G4S]5-2V E. coli ligação ligação ligação ligação
Tabela 4 – Dados de SPR para ligação a ROR1 de camundongo (mROR1) e ROR1 de rato (rROR1) Sistem mROR1 rROR1 a de VNAR Kd Expres Ka (M- Kd KD Ka (s- KD são 1s-1) (M-1s- (s-1) (nM) 1) 1) (nM) E. 4,32E+ 2,09E 1,2E+0 1,11E B1 5,2 94,5 coli 05 -03 5 -02 HEK 7,2E+0 1,51E 1,16E+ 6,51E B1 2,18 56,5 293 5 -03 05 -03 E. 2,95E+ 4,08E 2,86E+ 4,5E- P3A1 14,3 17,7 coli 06 -02 06 02 E. 2,26E+ 3,2E- 7,72E+ 3,66E CPF7 19,1 68,6 coli 06 02 05 -02 E. 1,41E+ 2,0E- E7 1,4 ND ND ND coli 06 03 P3A1 - HEK 4,17E+ 1,45E 3,18E+ 1,73E [G4S] 0,396 0,57 293 06 -03 06 -03 5- P3A1 Sem Sem Sem Sem Sem Sem E. 2V ligaçã ligaç ligaç ligaçã ligaç ligaç coli o ão ão o ão ão 2V- Sem Sem Sem Sem Sem Sem E. [G4S] ligaçã ligaç ligaç ligaçã ligaç ligaç coli 5-2V o ão ão o ão ão
[00342] Foram desenvolvidas proteínas de VNAR que se ligam com alta afinidade a ECD de ROR1 humano em formatos monoméricos e multiméricos (formas tanto homodiméricas quanto heterodiméricas), não mostraram ligação ao membro da família proximamente relacionado ROR2 humano e reagem de modo cruzado com alta afinidade a ortólogos de camundongo e rato de ROR1.
A reformatação das proteínas P3A1 e D3 como dímeros aumentou significativamente a afinidade de ligação a ROR1 humano com uma redução significativa nas constantes de taxa de dissociação que é observada.
[00343] A ligação de um homodímero B1 quimicamente conjugado a hROR1 foi também avaliada por ELISA. Para gerar essa molécula, um derivado de B1 foi gerado com um tiol C- terminal exclusivo funcionalmente através de clivagem química do precursor de proteína de fusão B1-inteína correspondente com cisteamina. A formação de ligação de dissulfeto intermolecular foi usada para ligar covalentemente as terminações C das duas proteínas para gerar um homodímero de topologia não natural, mas definida (B1-S-S-B1, Figura 7C). A ligação do B1-S-S-B1 a hROR1 foi comparada ao monômero B1 por ELISA.
[00344] Em resumo, o método ELISA conforme segue. Poços revestidos com 100 ng de antígeno e incubados, cobertos, à temperatura ambiente por 2 h. Placas lavadas 3x 400 ul por poço com PBST (PBS + 0,05% de Tween 20 (v/v)), então, bloqueadas com 4% de leite em pó desnatado (p/v) em PBST por 1 hora a 37 °C. As placas foram lavadas como anteriormente mais lavagem adicional em PBS sozinho. As proteínas de ligação foram diluídas em 4% de PBST de leite e incubadas de um dia para o outro a 4 °C. As placas foram lavadas 3x com PBST, 3x PBS e a ligação foi detectada com o uso de anticorpo de detecção secundária adequado em 4% de PBST de leite, temperatura ambiente 1 hora. Os anticorpos secundários usados incluem:
[00345] Anti-c-Myc, HRP (Invitrogen no R951-25)
[00346] IgG H&L anti-humano de coelho, HRP (Abcam no ab6759)
[00347] IgG H&L anticamundongo de coelho, HRP (Abcam no ab97046)
[00348] anti-polyHis de camundongo , HRP (Sigma no A7058)
[00349] Placas lavadas 3x com PBST. 100 µl de substrato TMB (Thermo no 34029) adicionados e a foi permitido que a reação prosseguisse a r.t. por 10 minutos. 100 µl de H2SO4 2 M adicionados para arrefecer bruscamente a reação. Placa centrifugada brevemente antes da leitura de absorbância a 450 nm em um leitor de placa CLARIOstar (BMG Labtech).
[00350] Enquanto o monômero de B1 e o derivado de tiol C-terminal se ligaram fortemente a ROR1 humano, um aumento em ligação de ROR1 humano foi observado para o dímero B1-S-S- B1 quimicamente ligado (Figura 8).
[00351] EXEMPLO 4 – Caracterização de VNAR Anti- EGFR-ROR1 – ligação e internalização de célula por citometria de fluxo
[00352] Ligação de Superfície Celular
[00353] Células cancerosas humanas aderentes foram desprendidas de frascos de cultura de tecido por incubação com 0,1% de solução de EDTA/PBS a 37 °C por ~10 minutos ou até as células se desprenderem facilmente. As células foram ressuspensas em 5 ml de PBS/2%FCS gelado em tubos de 15 ml e centrifugadas a 1,500 rpm por 5 minutos a 4 °C. P sobrenadante foi removido e o pélete celular ressuspenso em 1 a 2ml de PBS/2%FCS. Uma contagem celular foi realizada com o uso de um Contador de Partículas Z1 Coulter (Beckman Coulter) e 5 x 105 células foram aliquotadas por amostra de teste. As células foram incubadas com 100 µl de VNAR (etiquetado com His6Myc), moléculas de VNAR-Fc ou mAb ROR1, mAb EGFR e controles de IgG por 1 hora em gelo. O excesso de VNAR, VNAR-Fc ou mAb foi removido adicionando-se 5 ml de PBS/2% FCS gelado, seguido por centrifugação a 1,500 rpm por 5 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido por ressuspensão do pélete celular em 1 ml de PBS/2%FCS gelado e adição de mais 4 ml de PBS/2%FCS gelado. As amostras foram novamente centrifugadas a 1,500 rpm por 5 min a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o líquido em excesso removido por secagem dos tubos em lenço de papel. Os anticorpos secundários adequados foram usados para detectar VNAR ligado (His6Myc), VNAR-hFc, VNAR-mFc ou mAb ROR (anticorpo de etiqueta PE-anti-Myc (CST), anticorpo PE-anti-humano (JIR labs/Stratech) e anticorpo PE-anti-camundongo (JIR/Stratech), respectivamente). As células foram incubadas com o anticorpo secundário escolhido por 30 min em gelo. As células foram lavadas para remover o anticorpo em excesso, conforme descrito anteriormente. Os péletes celulares foram ressuspensos em 0,5 ml de PBS/2%FCS gelado e deixados em gelo no escuro antes da análise em um citômetro de fluxo FACS Calibur (BD Biosciences) ou Attune NxT (ThermoFisher).
[00354] Manchamento de superfície celular após incubação a 37 °C vs 4 °C.
[00355] Em resumo, 5 x 105 células foram incubadas com VNAR, VNAR-Fc, mAb ROR1 2A2, mAb EGFR AY13 ou controle de IgG1 por 1 hora em gelo. As células foram lavadas duas vezes por adição de 5 ml de PBS/2%FCS gelado seguido por centrifugação a 1,500 rpm por 5 minutos a 4 °C. Após a etapa de centrifugação final, o sobrenadante em excesso foi removido e os tubos secos em lenço de papel. Cada pélete celular foi ressuspenso em 200 µl de PBS/2%FCS e colocado em gelo ou a 37 °C por 2 horas. VNAR ligado (etiquetado com His6Myc), VNAR-
hFc, VNAR, ROR1 mAb 2A2 ou mAb EGFR AY13 foi detectado com o uso de anticorpo de etiqueta anti-Myc conjugado a PE (CST), anticorpo anti-humano conjugado a PE (JIR/Stratech) ou anticorpo anticamundongo conjugado a PE (JIR/Stratech). A perda de sinal a 37 °C em relação às amostras incubadas em gelo é indicativa de internalização de ROR1.
[00356] Uma diminuição em ligação de superfície celular após incubação a 37 °C versus 4 °C foi observada para construtos de VNAR anti-ROR1 (Figura 14) e moléculas de VNAR anti-EGFR-ROR1 (Figura 42A e 42B), o que é consistente com ligação e internalização das proteínas por ROR1 e EGFR.
[00357] Ligação de VNARs a um painel de linhagens celulares de câncer
[00358] A Figura 9 mostra histogramas de citometria de fluxo representativos para ligação de VNARs anti ROR1 que se ligam às células de adenocarcinoma de pulmão ROR1alto A549.
[00359] A Figura 13 mostra a ligação de diferentes VNARs às células de adenocarcinoma de pulmão ROR1alto A549 e a línhagem de células de câncer de pulmão ROR1baixo A427 por citometria de fluxo.
[00360] A Tabela 5 mostra um resumo de dados de citometria de fluxo para ligação de proteínas de VNAR para uma variedade de linhagens de células de câncer ROR1alto e ROR1baixo.
[00361] Tabela 5: Classificação relativa de ligação de superfície celular de VNAR em linhagens de células cancerosas humanas, avaliada por
[00362] citometria de fluxo. Número de “+” corresponde à intensidade de ligação. “–” indica sem ligação. “/” não-determinado nessa linhagem de células.
Com base em Mediana (YL1-PE) ou Geo Mean (FL2-PE) MDA- A549 A427 T47D HT-29 Colo205 Molécu MB-231 (ROR1al (ROR1bai (ROR1bai (ROR1al (ROR1bai la to) xo) (ROR1al xo) to) xo) to) B1 +++++ + +++ ++ +++ + E7 ++++ + +++ ++ +++ + P3A1 + - + +/- + - CPF7 ++ - + +/- + - dímero P3A1- +++ - ++ / / / [G4S]5 -P3A1 dímero CPF7- +++ ++ / / / / [G4S]5- CPF7 P3A1- [G4S]5 ++++ - +++ / / / -B1 D3 + - / / / / dímero D3- ++++ - ++ / / / [G4S]5 -D3 2V - - - - - - dímero 2V- - - - - - - [G4S]5 -2V
[00363] A ligação robusta dos VNARs a linhagens de células cancerosas que expressam ROR1 é observada em comparação com as linhagens de células cancerosas ROR1baixo, em que pouco a nenhum manchamento foi observado para a maior parte dos VNARs de ligação a ROR1 testados.
[00364] O manchamento de superfície celular para P3A1-P3A1 não tão forte quanto para proteínas B1 ou D3-D3, o que pode refletir diferenças nos epítopos desses aglutinantes e que, no contexto celular, algumas regiões do domínio extracelular de ROR1 são potencialmente mais acessíveis para ligação que outros.
[00365] EXEMPLO 5 - Característica de proteínas de fusão de VNAR-Fc anti-ROR1 - ligação a ROR1 e ROR2 por SPR e ligação de superfície celular e internalização
[00366] VNARs de ligação a ROR1 foram expressos fundidos à terminação N de Fc de IgG2a de camundongo (mFc) e a terminação N e a terminação C de IgG1 humana (hFc) através de ligantes GlySer padrão. A fusão do Fc de IgG1 humana foi também gerada de modo que Ser235 na região Fc (numeração de Kabat) fosse substituída por uma Cys (Figura 10).
[00367] Ligação de ROR1 e ROR2 por SPR
[00368] Com o uso dos procedimentos representados acima, a ligação de fusões de VNAR-Fc a ROR1 de ser humano, camundongo e rato e ROR2 humano foi determinada por SPR.
[00369] Tabela 6 – Dados de SPR para ligação de fusões de VNAR-Fc a ROR1 humano e ROR2 humano hROR1 Molécula hROR2 Ka (M-1s- 1) Kd (s-1) KD (nM) B1 mFc 4,19E+05 3,356E-04 0,8 Sem ligação
Sem Sem Sem 2V mFc Sem ligação ligação ligação ligação B1 hFc 3,08E+06 9,53E-05 0,032 Sem ligação P3A1 hFc 1,07E+07 5,64E-04 0,084 Sem ligação D3 hFc 1,21E+06 2,88E-03 2,6 Sem ligação E9 hFc 7,07E+05 3,64E-03 5,3 Sem ligação D3-D3 hFc 4,96E+06 9,88E-04 0,25 Sem ligação hFc - P3A1 2,38E+06 7,76E-04 0,35 Sem ligação hFc - D3 1,10E+06 2,35E-03 2,37 Sem ligação hFc – D3- 2,35E+06 1,01E-03 0,49 Sem ligação D3 Sem Sem Sem 2V hFc Sem ligação ligação ligação ligação Sem Sem Sem 2V-2V hFc Sem ligação ligação ligação ligação
[00370] Conforme mostrado na Tabela 6, proteínas de VNAR-Fc anti ROR1 se ligam com alta afinidade a ROR1 humano, sem ligação a ROR2 humano observada. Forte ligação a ECD de ROR1 de camundongo e rato foi também observada.
[00371] Como fusões de VNAR-Fc, uma diminuição significativa nos valores evidentes de KD para ligação de ROR1 é observada em relação aos monômeros de VNAR correspondentes. Isso é consistente com essa ligação de fusões de VNAR-Fc de uma forma bivalente à superfície do fragmento de ROR1 nos experimentos de SPR. Ambas as fusões de VNAR Fc N e C terminais se ligam com alta afinidade a ROR1 humano, mas não se ligam a ROR2 humano.
[00372] Ligação de VNARs a linhagens celulares de câncer
[00373] A ligação das fusões de VNAR-Fc à superfície de um painel de linhagens celulares de câncer foi medida por citometria de fluxo com o uso dos métodos apresentados anteriormente. A Figura 15 mostra a ligação de diferentes fusões de VNAR-Fc às células de adenocarcinoma de pulmão ROR1alto A549 e a línhagem de células de câncer de pulmão ROR1baixo A427 por citometria de fluxo a uma concentração fixa de proteína.
[00374] A Tabela 7 resume os dados de ligação para proteínas de VNAR-Fc com uma variedade de linhagens de células cancerosas ROR1alto.
[00375] Tabela 7: Classificação relativa de ligação de superfície celular de molécula de VNAR hFc em linhagens de células cancerosas humanas ROR1alto. O número de “+” indica a intensidade de ligação. “–” indica sem ligação. “/” indica que a mesma foi determinada. As moléculas de hFc foram detectadas com o uso de um anticorpo PE-anti-humano (Jackson Immune Research/Stratech) e um citômetro de fluxo ThermoFisher Attune NxT.
Com base em Mediana (YL1-PE) MDA-MB- Molécula A549 PC-9 NCI-H1975 231 B1 hFc ++++ +++++ +++++ +++++
P3A1 hFc ++ +++ ++ ++ D3 hFc + ++ / / E9 hFc + / / / D3-D3 hFc ++ ++++ / / 2V hFc - - - - 2V-2V hFc + / / /
[00376] A ligação robusta dos VNARs a linhagens de células cancerosas que expressam ROR1 é observada em comparação com as linhagens de células cancerosas ROR1baixo, em que pouco a nenhum manchamento foi detectado para a maior parte dos VNARs de ligação a ROR1 testados.
[00377] As diferenças no manchamento de superfície celular médio podem indicar que diferentes regiões de ROR1 podem ser mais acessíveis que outras quando a proteína é expressa na superfície celular. Para ter como alvo regiões menos acessíveis de ROR1 em células cancerosas, poderia ser vantajoso usar aglutinantes de proteína pequenos, tais como VNARs, em oposição a anticorpos grandes, que serão estericamente ocluídos.
[00378] Manchamento de superfície celular após incubação a 37 °C vs 4 °C.
[00379] A ligação de fusões de VNAR-Fc a células MDA-MB-231 após incubação a 37 °C ou 4 °C foi determinada por citometria de fluxo com o uso dos métodos descritos anteriormente. Para as proteínas B1-hFc, P3A1-hFc, D3-hFc e
D3D3-hFc testadas, houve uma perda de manchamento de superfície celular após a incubação a 37 °C versus 4 °C (Figura 16), consistente com a ligação e internalização dessas proteínas de fusão de VNAR-hFc.
[00380] Internalização por imunofluorescência após incubação a 37 °C vs 4 °C.
[00381] A localização celular de proteínas de fusão de Fc de IgG1 humana e Fc de IgG2a de camundongo pode ser detectada por imunofluorescência com o uso de anticorpos secundário identificados com fluorescência que têm como alvo esses domínios. Métodos de imunofluorescência foram usados para detectar a internalização de VNAR-Fc por ROR1 em células cancerosas.
[00382] Placas pretas de 96 poços de fundo transparente (Greiner) foram revestidas com 100 µg/ml de colágeno I (Sigma) para auxiliar a fixação celular. As células foram inoculadas em meio de crescimento completo (Gibco) nas placas de 96 poços revestidas e incubadas a 5% de CO2, 37 °C por 24 horas. O meio foi removido e substituído por meio sem soro (Gibco) no dia seguinte e deixado de um dia para o outro. Na manhã seguinte, o meio foi removido e as células foram tratadas com várias concentrações de moléculas de VNAR-Fc. As placas foram incubadas em gelo por 30 minutos. Os tratamentos foram removidos e substituídos por 100 µl de PBS/2%FCS por poço. Uma placa foi mantida em gelo e a outra foi colocada a 37 °C, 5% de CO2 por 2 horas. Após essa incubação por 2 horas, a solução de PBS/2%FCS foi removida e as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS gelado por 20 min em gelo. A solução de PFA foi removida e substituída por 0,05% de Saponina (Sigma) constituída em PBS/2% de FCS por 15 min à temperatura ambiente. Essa etapa permeabiliza as membranas celulares. O manchamento de anticorpo secundário foi realizado com o uso de Ab Af488-anti-humano (1:250; ThermoFisher) para detectar proteínas de fusão de VNAR-hFc. Todos os estoques de trabalho de anticorpo secundário foram constituídos em 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS. As placas foram incubadas a 4 °C de um dia para o outro no escuro. No dia seguinte, os anticorpos conjugados a AF488 secundários foram removidos e as células foram lavadas X3 com o uso de 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS. Anticorpo Lamp-1 (1:200; CST) ou anticorpo EEA1 (1:50; CST) foi adicionado para detectar lisossomo e compartimentos de endossomo precoces, respectivamente. As placas foram incubadas no escuro à temperatura ambiente por 2 horas. Os anticorpos Lamp-1 e EEA1 foram, então, removidos e as células foram lavadas X3 com 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS. Anticorpo Af647-anticoelho (1:1.000; CST) foi, então, adicionado para detectar ligação de anticorpo Lamp1 e EEA1. Uma incubação adicional no escuro à temperatura ambiente por 2 horas foi realizada antes de remover o anticorpo secundário AF647 e lavar as células X3 com 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS. Os núcleos das células foram manchados com o uso de reagente Hoechst 10 µM (Sigma) em 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS por 20 min à temperatura ambiente no escuro. Finalmente, essa solução foi removida e substituída por PBS. As placas foram armazenadas a 4 °C no escuro antes do imageamento com o uso de um instrumento GE Healthcare InCell 2000.
[00383] A internalização de B1 hFc e B1 mFc foi observada em células de câncer de mama MDA-MB-231 após a incubação a 37 °C por 2 horas. O complexo de VNAR-Fc-ROR1 parece se sobrepor ao manchamento de Lamp-1 e EEA1 após a internalização, o que sugere o tráfego celular de ROR1 através de compartimentos endossomais e lisossomais precoces. O manchamento de ROR1-VNAR-Fc permaneceu predominantemente na superfície celular quando as amostras foram incubadas em gelo por 2 horas. Nenhuma ligação de superfície celular ou internalização foi observada após incubação com proteína 2V Fc (VNAR de controle negativo sem ligação). B1-hFc e B1-mFc não foram internalizados pela linhagem de células de câncer de pulmão ROR1baixo A427.
[00384] EXEMPLO 6 - Humanização e modificação genética adicional
[00385] Diversos derivados de sequência humanizada de dois VNARs de ligação a ROR1 líder foram gerados com o uso de duas estratégias diferentes.
[00386] As sequências humanizadas foram projetadas com base na sequência de linhagem germinativa humana Vκ1, DPK-
9. Por exemplo, em P3A1 V1, as regiões de arcabouço 1, 3 e 4 do VNAR sofreram mutação para alinhamento com as regiões de arcabouço de DPK-9.
[00387] A segunda estratégia envolveu enxertar as alças de ligação dos VNARs de ligação a ROR1 em um arcabouço de VNAR anteriormente humanizado (Kovalenko et al JBC 2013 288(24) 17.408 a 17.419; WO2013/167883). Para o primeiro construto (G1), apenas as alças de CDR1 e CDR3 foram enxertadas. O segundo construto (G2) teve tanto as CDRs quanto as alças HV enxertadas.
[00388] Exemplos de sequências de VNAR humanizadas / enxertadas: B1 G1
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNK
GTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 45) B1 G2
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISISGRYSESVNK RTMSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 46) P3A1 V1
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNK GAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 47) P3A1 G1
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISISGRYSESVNK GTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 48) P3A1 G2
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSIGGRYSESVNK GAKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 49) ADV1 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 50) ADV2 humanizado com D3
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 51) ADV3 humanizado com D3
ASVNQSPSSASASVGDRLTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKLEVK (SEQ ID NO: 52) V5 humanizado com B1
ASVDQSPSSLSASVGDRVTITCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 53) V7 humanizado com B1
ASVDQSPSSASASVGDRLTITCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGAGTKLEVK (SEQ ID NO: 54)
[00389] O DNA que codifica os construtos humanizados sofreu otimização de códon para expressão em E. coli e sintetizado por GeneArt (Thermo). As sequências P3A1 foram projetadas como dímeros com um ligante [G4S]5 que conecta os domínios de VNAR. Todas as sequências humanizadas foram geradas com a seguinte etiqueta His6myc C terminal:
[00390] QASGAHHHHHHGAEFEQKLISEEDLG (SEQ ID NO: 95)
[00391] O DNA que codifica essas proteínas foi subclonado nos vetores de expressão de inteína, expresso em E. coli e purificado conforme descrito anteriormente na seção "Método típico para expressão de proteínas de fusão de inteína de VNAR".
[00392] Outras versões humanizadas de D3 foram criadas conforme segue: EL V1 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 55) EL V2 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 56) EL V3 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRFSGSGSKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 57) EL V4 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWYQQKPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 58) EL V5 humanizado com D3
ASVNQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWYQQKPGTTDWERMSI
GGRFSGSGSKRAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWYDGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 59)
[00393] As variantes de VNAR de ligação a ROR1 humanizadas demonstraram ligação com alta afinidade a ROR1 humano por SPR e estabilidade térmica melhorada. SPR foi realizado conforme descrito anteriormente com o uso de ECD de ROR1 humano– Fc imobilizado à superfície do fragmento. Os ensaios de estabilidade térmica usaram o sistema Applied Biosystems StepOne Real Time PCR com o kit de corante Protein Thermal Shift™ (Thermo). A mistura de ensaio foi configurada de modo que a proteína estivesse a uma concentração final de 20 μM em 20 μl. 5 μl de tampão Thermal Shift™ foram adicionados juntamente com 2,5 ul de 8x Corante Thermal Shift™. Os ensaios foram executados com o uso do software StepOne e dados analisados com o uso do software Protein Thermal Shift™. Todos os dados são da primeira análise de derivado. Tabela 8 – Estabilidade térmica de dados de ligação a hROR1 para variantes de VNAR humanizadas ligação de hROR1 (SPR) Construto Tm (°C) Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD (nM) B1 54,2 7,45E+05 6,09E-04 0,83
B1G1 58,0 2,20E+05 1,62E-02 82,8 B1G2 59,9 1,85E+05 7,90E-03 45,9 B1V5 46,05 5,20E+04 3,85E-05 0,74 B1V7 43,91 7,74E+04 5,54E-05 0,77 dímero de 60,7 3,78E+05 1,17E-03 0,30 P3A1 dímero de 48,5 4,78E+05 8,46E-04 0,18 P3A1 V1 dímero de 57,1 4,30E+05 1,47E-03 0,43 P3A1 G1 dímero de 54,0 1,88E+05 1,19E-03 0,77 P3A1 G2 B1G1-hFc ND 2,4E+05 2,66E-03 11,8 B1G2-hFc ND 6,26E+05 1,41E-03 2,55 dímero de 54,66 6,36E+05 5,67E-03 8,92 D3 ADV1 dímero de 56,18 6,09E+05 1,60E-02 26,2 D3 ADV2 D3 WT 64,4 1,21E+06 9,43E-05 15,5 D3 AD V2 56,98 4,58E+04 2,36E-03 51,6 D3 EL V1 53,25 1,50E+06 1,58E-04 16,1 D3 EL V2 56,50 1,85E+06 1,63E-04 18,9 D3 EL V4 54,1 1,38E+06 5,45E-04 58,5
[00394] Enxertar as alças de HV e / ou CDR de B1 em um arcabouço de VNAR humanizado e substituir sequências P3A1 por regiões da sequência DPK-9 humana produziu proteínas substancialmente modificadas geneticamente que são estáveis e mantêm ligação de hROR1 com afinidade nanomolar e picomolar, respectivamente. EXEMPLO 7 - Mapeamento de epítopo
[00395] Ligação de proteínas a ROR1 humano desglicosilado
[00396] ELISA foi usado para comparar a ligação de VNAR a proteína de ROR1 humano glicolisada e desglicosilada. Para gerar ROR1 humano desglicosilado, 0,2 mg/ml de proteína foi incubado de um dia para o outro à temperatura ambiente com 1U PNGaseF (Roche) por 2 μg de proteína de ROR1. ROR1 humano glicosilado de controle foi preparado em paralelo sem adição de PNGaseF. A análise por SDS PAGE mostrou desvio em tratamento com PNGaseF, consistente com desglicosilação de ROR1 (Figura 17A).
[00397] Essas proteínas de ROR1 foram usadas para revestir placas de ELISA e ELISAs foram realizados conforme descrito anteriormente na seção "Caracterização de VNAR Anti ROR1". VNARs (B1, P3A1-P3A1, D3-D3, B1 mFc) ligados igualmente bem a proteínas de ROR1 tanto glicosiladas quanto desglicosiladas por ELISA (Figuras 17B e 17C), indicando ligação de ROR1, é independente de glicosilação de ROR1.
[00398] A ligação de B1 a hROR1 não enovelado (reduzida com DTT 28 mM, 0,5% de Sarkosyl) foi significativamente reduzida, consistente com ligação de B1 VNAR a epítopo (ou epítopos) conformacional (Figura 17C)
[00399] Ligação de B1 a domínio Ig de ROR1 por SEC
[00400] VNAR de B1 forma um complexo com domínio Ig de ROR1 por SEC (Figura 18). O par de domínio 1:1 VNAR:ROR1 ou domínio ROR1 foi incubado em gelo por 30 minutos, então, rodado em uma coluna 10/300 de aumento Superdex 200 (GE Healthcare) em PBS e frações analisadas por SDS-PAGE. Sob essas condições, B1 formou um complexo com o domínio Ig de ROR1.
[00401] Experimentos de ligação de epítopo
[00402] Competição de estudos de ligação foi concluída com o uso de SPR. ROR1 humano (hROR1) foi imobilizado a canais de fluxo 1 e 3 (FC1 e FC3) de um fragmento de COOH2 por acoplamento de amina. FC2 foi usado como o canal de referência. Um VNAR escolhido, por exemplo, B1, dímero de P3A1;
ou mAb ROR1 2A2 (BioLegend) foi, então, capturado a hROR1 em FC1. Análises de teste foram, então, avaliadas quanto à ligação a i) hROR1 com VNAR ou mAb ROR1 2A2 anteriormente capturado ou ii) a hROR1 na ausência de VNAR ou mAb ligado. A superfície do fragmento de hROR1 foi regenerada após cada analito de teste com o uso de pH2 de glicina. Antes de testar o analito seguinte, VNAR ou mAb ROR1 2A2 foi novamente capturado a hROR1 em FC1 e assim por diante. As cinéticas de ligação foram determinadas com o uso do software Qdat. Para moléculas não competidoras, as cinéticas de ligação e os perfis de sensograma foram similares/não afetados para hROR1 +/- aglutinante capturado. Para moléculas competidoras, o perfil de sensograma e as cinéticas de ligação foram significativamente alternadas.
[00403] A Figura 19 mostra sensogramas representativos e cinéticas de ligação para ligação dos VNARs a ROR1 humano sem e com incubação anterior com B1. Os resultados demonstraram que os VNARs de B1 e P3A1 não competem entre si nem com o mAb de ROR1 2A2 pela ligação a hROR1. Quando VNAR de B1 foi capturado a hROR1 na superfície do fragmento, a ligação adicional de B1 foi significativamente impedida, entretanto, os perfis de ligação de monômero de P3A1, dímero de P3A1 ou mAb de ROR1 2A2 a hROR1 foram iguais na ausência e presença de B1 pré-capturado (Figura 19). Os parâmetros cinéticos derivados para ligação dessas moléculas a hROR1 na presença ou ausência de VNAR de B1 capturado confirmam que as mesmas não competem com B1 (com exceção de B1, que compete consigo mesmo, conforme esperado).
[00404] A ligação de VNARs a hROR1 com e sem pré- captura de derivados de P3A1 ou mAb 2A2 foi similarmente avaliada. Os resultados são resumidos na (Tabela 9), que mostrou que B1, P3A1 e 2A2 não competem uns com os outros, mas competem com si mesmos conforme previsto e, portanto, se ligam a regiões diferentes de hROR1.
[00405] Tabela 9 - Dados cinéticos de ligação derivados por análise por SPR de VNARs ou mAb ROR1 2A2 a hROR1 +/- VNAR de B1 anteriormente capturado. Os dados demonstram que a ligação de B1 não competem com P3A1 ou 2A2. VNARs foram expressos com etiquetas His6Myc C-terminais. tohROR1 pré-capturado Ligação de hROR1 com B1 Ka (M-1s- Kd (s- Ka (M-1s- Kd (s- Molécula 1) 1) KD (nM) 1) 1) KD (nM) 4,40E- Ligação B1 1,04E+06 0,424nM 04 nula/insuficiente 6,28E- 5,36E- P3A1-P3A1 1,63E+06 0,385nM 1,52E+06 0,352nM 04 04 4,11E- 3,20E- P3A1 2,58E+06 15,9nM 1,94E+06 16,45nM 02 02 mAb ROR1 2,11E- 8,47E- 2A2 9,79E+05 0,21nM 8,35E+05 0,101nM 04 05 (Biolegend)
[00406] Mapeamento de Epítopo de VNARs anti-ROR1 com o uso de peptídeos anti-ROR1
[00407] A análise por ELISA foi usada para determinar se os domínios de VNAR anti-ROR1 líder, B1, P3A1 e D3 ligados a epítopos iguais ou sobrepostos em ROR1 (definidos aqui como quatro peptídeos de ECD). A análise inicial de ligação direta com peptídeos (em PBS e DMSO) imobilizados em placas de ELISA indicou que nenhum dos VNARs se ligou a qualquer um dos peptídeos, mas não se ligou ao controle de proteína de ECD hROR1-Fc imobilizado incluído como parte da mesma ELISA (Figura 20 e Figura 21). Para interrogação adicional sobre isso, um ensaio de competição foi projetado em que VNARs foram incubados com concentrações crescentes dos quatro peptídeos de teste (ou ECD-Fc de ROR1 humano) em solução e uma avaliação de ligação residual a ROR1-Fc imobilizado em uma placa de ELISA foi, então, observada. A competição foi evidente entre os VNARs e ECD-Fc de ROR1 humano, que foi usado como um controle positivo. Entretanto, nenhum sinal de diminuição foi evidente na presença dos peptídeos, indicando claramente que nenhuma ligação de VNAR a esses peptídeos ECD específicos ocorreu (Figura 22 e Figura 23).
[00408] Além disso, VNARs de B1, P3A1 e D3 não se ligam a quaisquer peptídeos de 15 mer lineares sobrepostos que abrangem todo ECD de hROR1. Nem se ligam a hROR1 anteriormente sonicado em tampão contendo SDS sob condições de redução, condições que tipicamente desnaturam proteína (dados Pepscan não mostrados). Em conjunto, isso indica que VNARs de B1, P3A1 e D3 se ligam a um epítopo (ou epítopos) conformacional distinto em proteínas de ECD de ROR1 humano.
[00409] Ligação direta de VNARs a peptídeos ECD
[00410] Os seguintes peptídeos foram sintetizados e dissolvidos em PBS pH 7,4: Peptídeo 1 -– YMESLHMQGEIENQI (SEQ ID NO: 34) Peptídeo 2 -– RSTIYGSRLRINLDTTDTGYFQ (SEQ ID NO: 38) Peptídeo 3 -– CQPWNSQYPHTHTFTALRFP (SEQ ID NO: 35) Peptídeo 4 – QCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYE (SEQ ID NO: 37) Peptídeo 5 – RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ (SEQ ID NO: 36)
[00411] Os clones B1 e P3A1 isolados de ELSS1 foram avaliados como monômeros e D3 de uma biblioteca imunizada como tanto um monômero quanto um homodímero.
[00412] Tanto B1 quanto P3A1 demonstraram ligação a ROR1 sem ligação evidente a qualquer um dos quatro peptídeos. HSA foi incluído como um controle não específico (Figura 20).
[00413] Entretanto, como o peptídeo 2 foi insolúvel em PBS, os ELISAs de ligação direta foram repetidos com os peptídeos dissolvidos em 25% de DMSO. D3 e D3-D3 como uma fusão de dímero de proteína foram incluídos nesses conjuntos de dados e novamente nenhuma ligação aos peptídeos foi observada (Figura 21). Métodos ELISA de Ligação Direta de Peptídeo
1. Placas de 96 poços revestidas com huROR1-Fc 10 ou 50 nM em PBS ou 10 μM e peptídeos em PBS ou 25% de DMSO. Incubado de um dia para o outro a 4 ºC
2. Lavado 2xPBS
3. Bloqueado com 200 μl/polo de 4% de MPBS por 1 h a RT.
4. Lavado 2xPBS
5. Adicionado B1 ou P3A1 a 1 μg/ml (67 nM); D3 e D3-D3 a 10 μg/ml (670 nM) e diluições em série a 1:3 através da placa. Incubado por 1 h a RT.
6. Lavado 3xPBST
7. Placas incubadas com 100 ul de anti-his-HRP SIGMA (1:1.000 em PBST) por 1 h a RT
8. Lavado 2xPBST e 2xPBS
9. Adicionar 100 μl/poço de substrato TMB. Reação interrompida com H2SO4 1 M Ensaio de competição de VNARs e peptídeos ROR1
[00414] Ensaios de competição foram conduzidos conforme descrito nos métodos com todos os quatro peptídeos reconstituídos em PBS. Nesses ensaios, nenhuma ligação foi observada por VNARs B1 ou P3A1 a qualquer um dos quatro peptídeos imobilizados em formato de ELISA de ligação típico (Figura 22). Portanto, não houve evidência de que esses peptídeos representassem epítopos em ROR1 que são reconhecidos por B1 ou P3A1.
[00415] Após as condições usadas na Figura 21 (devido ao peptídeo 2 ser insolúvel em PBS), todos os ensaios de competição foram repetidos com peptídeos dissolvidos em 25% de DMSO. Para o ensaio, D3 e dímero de D3-D3 foram também incluídos nesses conjuntos de dados. Esses resultados confirmaram que os domínios de VNAR B1, P3A1 e D3 reconhecem um epítopo (ou epítopos) diferente daqueles representados pelos 4 peptídeos testados. Métodos ELISA de Competição
1. Placas de 96 poços revestidas com 50 nM de huROR1-Fc para P3A1; 10 nM de huROR1-Fc para B1, D3 e dímero de D3-D3 em PBS. Incubado de um dia para o outro a 4 ºC
2. Lavado 2xPBS
3. Bloqueado com 200 μl/polo de 4% de MPBS por 1 h a RT.
4. Lavado 2xPBS
5. Pré -incubado por 30 min a RT • B1= 15 nM
[00416] Mais peptídeos (em PBS ou 25% de DMSO) em concentração inicial de 1 μM (então, diluições em série a 1:3 através da placa)
[00417] ou huROR1-Fc em concentração inicial de 100 nM (então, diluições em série a 1:3 através da placa)
• P3A1= 670 nM
[00418] Mais peptídeos (em PBS ou 25% de DMSO) em concentração inicial de 50 μM (então, diluições em série a 1:3 através da placa)
[00419] ou huROR1-Fc a uma concentração inicial de 1 μM (então, diluições em série a 1:3 através da placa) • D3 = 67 nM
[00420] Mais peptídeos ou huROR1-Fc (em PBS ou 25% de DMSO) em concentração inicial de 500 nM (então, diluições em série a 1:3 através da placa) • D3-D3 = 0,67 nM
[00421] Mais peptídeos ou huROR1-Fc (em PBS ou 25% de DMSO) em concentração inicial de 500 nM (então, diluições em série a 1:3 através da placa)
6. Adicionar 100 μl/poço de amostras pré- incubadas. Incubado 1 h a RT
7. Lavado 3 x PBST
8. Placas incubadas com 100 μl/poço de anti-His- HRP (1:1.000 em PBST). Incubado 1 h a RT
9. Lavado 2 x PBST e 2 x PBS
10. Adicionado 100 μl/poço de substrato TMB. Reação interrompida com 50 μl/poço de H2SO4 1 M
[00422] Mapeamento de Epítopo de VNARs anti-ROR1 com o uso de domínios de ROR1 recombinante
[00423] O ECD de ROR1 é constituído por três domínios de proteína distintos: semelhante a Ig, Frizzle e Kringle. Para determinar se o epítopo reconhecido por cada um desses VNARs estava dentro de um subdomínio específico da proteína de ROR1 inteira, a análise por ELISA a seguir foi realizada.
[00424] Ligação direta de VNARs a domínios de ROR1
[00425] VNARs anti-ROR1 B1, P3A1 e D3 foram avaliados quanto à ligação aos três domínios extracelulares de ROR1 humano (semelhante a Ig, Frizzle e Kringle) por ELISA de ligação direta. B1 e P3A1 foram avaliados como monômeros e D3 tanto como um monômero quanto um homodímero (D3-D3). O anticorpo anti-ROR1 2A2 foi também incorporado no ensaio como um controle positivo.
[00426] B1 e 2A2 reconheceram o domínio semelhante a Ig, no entanto, essa ligação ao domínio semelhante a Ig foi muito mais fraco em comparação com sua ligação do huROR1 extracelular inteiro. P3A1 reconheceu o domínio Frizzled, mas novamente ligação mais fraca que para a proteína de ROR1 intacta (Figura 24 e Tabela 10). Homodímero de D3 e D3-D3 ligou-se a ECD de ROR1 de comprimento completo, mas nenhuma ligação a subdomínios de ECD de ROR1 individuais foi observada (Figura 24 e Tabela 10).
[00427] Todos os resultados são resumidos em uma Tabela 10. Tabela 10: B1 P3A1 D3 2A2 rhROR1-Fc +++ +++ +++ +++ Domínio + - - + semelhante a Ig Domínio - + - - Frizzle Domínio - - - - Kringle
Métodos ELISA de Ligação Direta a Domínios de ROR1
1. Placas de 96 poços revestidas com 1 μg/ml de domínios de huROR1-Fc ou huROR1 em PBS. Incubado de um dia para o outro a 4 ºC
2. Lavado 2xPBS
3. Bloqueado com 200 μl/polo de 4% de MPBS por 1 h a RT.
4. Lavado 2 x PBS
5. Adicionado D3, dímero de D3-D3 ou mAb 2A2 em concentração inicial de 10 μg/ml para VNAR e diluição a 1:150 para mAb. Realizar diluições em série 3 vezes através da placa. Incubado por 1 h a RT.
6. Lavado 3 x PBST
7. Placas incubadas com 100 μl de anti-c-myc-HRP (1:1.000 em PBST) por 1 h a RT
8. Lavado 2 x PBST e 2 x PBS
9. Adicionado 100 μl/poço de substrato TMB. Reação interrompida com H2SO4 1 M EXEMPLO 8 – Químicas de conjugação de VNAR
[00428] Identificação de BA11 como prova de conceito para concepção de VNAR específica de sítio
[00429] Atualmente, não há métodos para a conjugação específica de sítio de identificações e fármacos a VNARs, portanto, há uma necessidade de estabelecer tais métodos de conjugação. O VNAR BA11 é uma variante humanizada de E06 que se liga com alta afinidade a albumina sérica humana (Kovalenko et al, J.Biol. Chem., 2013 JBC) e tem aplicações como uma tecnologia de extensão de meia-vida. BA11 foi usado como um VNAR de modelo para determinar se VNARs conjugados especificamente ao sítio podem ser gerados em bom rendimento sem comprometer a atividade de ligação do domínio de VNAR. A terminação C de VNARs é distal às regiões CDR1 e 3 e HV2 e 4, que são as regiões do VNAR geralmente usadas para se ligar a seu alvo.
[00430] Portanto, tecnologia à base de inteína (US2006247417) foi usada para avaliar a conjugação específica de sítio de cargas úteis à terminação C de VNARs através de químicas diferentes. Em resumo, a proteína de interesse é expressa como uma fusão N terminal de um domínio de inteína geneticamente modificado (Muir TW 2006 Nature 442, 517 a 518). O desvio de acila N para S subsequente na união proteína- inteína em um intermediário ligado a tioéster que pode ser quimicamente clivado com agentes de bis-aminóxi ou amino-tióis para gerar o derivado de aminóxi ou tiol C-terminal à proteína desejada, respectivamente (Figura 11). Esses derivados de aminóxi e tiol C-terminais podem ser reagidos com porções químicas funcionalizadas com aldeído / cetona e maleimida, respectivamente, de uma forma quimiosseletiva para gerar a proteína modificada C-terminalmente específica de sítio (Figuras 25 a 27). Com o uso dessa abordagem, conjugados de BA11 fluoresceína foram gerados através de química de formação de oxima e tioéter em bons rendimentos e esses conjugados mantiveram a ligação à proteína albumina sérica humana.
[00431] Inicialmente, a proteína de fusão inteína BA11-CBD imobilizada em microesferas de quitina foi gerada conforme descrito anteriormente com rendimentos típicos ≥10 mg/l a partir de expressão citosólica em E. coli. Essa proteína de fusão precursora foi, então, clivada sob condições tamponadas aquosas com diferentes agentes de molécula pequena para gerar BA11 com funcionalidades quimicamente reativas exclusivas em sua terminação C.
[00432] Geração de Ba11-aminóxi (Figura 11)
[00433] A proteína de fusão inteína BA11-CBD imobilizada foi clivada de um dia para o outro em dioxiamina 400 mM (NH2-O-(CH2)2-O-NH2 ) em tampão de clivagem pH 6,9, resultando em ~75% de clivagem.
[00434] O sobrenadante de clivagem contendo BA11 aminóxi foi drenado e purificado em um Superdex75 26/60 (GE Healthcare) em fosfato de sódio 20 mM pH 6,9, NaCl 200 mM. Isso produziu uma proteína solúvel, derivada, enovelada com rendimentos de >2 mg/l de E. coli. Toda proteína foi caracterizada por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa. A formação da ligação de dissulfeto desejada foi confirmada por métodos de espectrometria de massa.
[00435] Geração de Ba11-oxima-fluoresceína (Figura 25)
[00436] BA11 aminóxi purificado foi misturado com 3 equivalentes molares de benzaldeído-peg-fluoresceína em tampão de pH 5,5 com 10% de acetonitrila e catalisador de anilina 10 mM, temperatura ambiente de um dia para o outro. SDS PAGE e espectrometria de massa mostraram ≥98% de reação e o conjugado foi purificado por SEC conforme acima e confirmado por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa.
[00437] Geração de derivados de tiol C-terminal de BA11 (Figura 11)
[00438] A proteína de fusão inteína BA11-CBD imobilizada em microesferas de quitina foi clivada de um dia para o outro em cisteamina 100 mM (Sigma) em tampão de clivagem com TCEP 2 mM para gerar o derivado de tiol C-terminal correspondente do VNAR. O sobrenadante de clivagem contendo tiol BA11 foi drenado, tratado com TCEP 2 mM para reduzir quaisquer adutos de cisteamina no grupo tiol C-terminal introduzido, e a proteína purificada em um Superdex75 26/60 (GE Healthcare) em fosfato de sódio 20 mM pH 6,9, NaCl 200 mM. Rendimentos ~1,6 mg / l de E. coli para BA11 SH foram obtidos. Todas as proteínas foram caracterizadas por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa. A formação da ligação de dissulfeto e tiol C-terminal livre desejados foi confirmada por métodos de espectrometria de massa.
[00439] Geração de Ba11-tiol C-terminal-maleimida- peg-fluoresceína (Figura 26)
[00440] BA11 gerado com um tiol C-terminal (BA11 SH) foi misturado com 4 equivalentes molares de maleimida-peg- fluoresceína em tampão de pH 6,9 com 0,3% de DMF final, temperatura ambiente 0,5 a 1 hora. SDS PAGE e espectrometria de massa mostraram ≥98% de reação. O conjugado foi purificado por SEC conforme acima e confirmado por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa.
[00441] Geração de derivados de cisteína C- terminal de BA11 (Figura 11)
[00442] A proteína de fusão inteína BA11-CBD imobilizada em microesferas de quitina foi clivada de um dia para o outro em cisteína 100 mM em tampão de clivagem com TCEP 2 mM para gerar o derivado de cisteína C-terminal correspondente do VNAR. O sobrenadante de clivagem contendo Cys BA11 foi drenado, tratado com TCEP 2 mM para reduzir quaisquer adutos de cisteína no grupo tiol C-terminal introduzido, e a proteína purificada em um Superdex75 26/60 (GE Healthcare) em fosfato de sódio 20 mM pH 6,9, NaCl 200 mM. Rendimentos ~3mg / l de E. coli para BA11-cys foram obtidos. Todas as proteínas foram caracterizadas por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa. A formação da ligação de dissulfeto e cisteína tiol C-terminal livre desejados foi confirmada por métodos de espectrometria de massa.
[00443] Geração de Ba11-cisteína C-terminal- maleimida-peg-fluoresceína (Figura 27)
[00444] BA11 gerado com um cisteína C-terminal (BA11 cys) foi misturado com 4 equivalentes molares de maleimida-peg-fluoresceína em tampão de pH 6,9 com 0,3% de DMF final, temperatura ambiente 0,5 a 1 hora. SDS PAGE e espectrometria de massa mostraram 60 a 80% de reação para BA11 cys, a redução mais baixa foi devido à formação significativa de dímero de BA11 cys. O conjugado foi purificado por SEC conforme acima e confirmado por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa.
[00445] A ligação de BA11 e os derivados C- terminais correspondentes e conjugados a albuminas séricas foi determinada por SPR
[00446] Determinação da cinética de ligação do VNAR de extensão de meia-vida (BA11) ou BA11 conjugado a fluoresceína para albumina sérica de ser humano, camundongo, rato e macaco cynomolgous
[00447] As cinéticas de ligação foram determinadas com o uso SPR. As albuminas séricas ou proteína de controle negativo foram imobilizadas a fragmentos de COOH2 por acoplamento de amina com o uso de condições de tampão otimizado:- Albumina sérica humana (HSA) e albumina sérica de camundongo (MSA) foram imobilizadas em tampão acetato de sódio pH 5. Albumina sérica de rato (RSA) e albumina sérica de macaco cynomolgous (CSA) em tampão acetato de sódio pH 4,5 e a proteína lisozima de ovo de galinha de controle negativo (HEL) foram imobilizadas em tampão acetato de sódio pH 5,5.
[00448] Os analitos (BA11, BA11-Fluoresceína ou aglutinante de controle negativo 2V) foram testados em várias concentrações e os valores de Ka (M-1s-1), Kd (s-1) and KD (nM) foram determinados com o uso do software QDat (SensiQ/Pall ForteBio). Para cada experimento de teste de analito, a ligação à proteína albumina sérica escolhida foi avaliada juntamente com a proteína de controle negativo (HEL).
[00449] Tabela 11. Sumário de dados de SPR (KD nM) para derivados C-terminais de BA11 e conjugados de fluoresceína subsequentes com diferentes químicas de conjugação que se ligam a proteínas albumina sérica. Fl, fluoresceína; cys, cisteína; mal, maleimida; SH, tiol; 2V, controle negativo de VNAR de não ligação.
Albumina Sérica Ser humano Rato Camundongo Ciano PH 7,4 5,5 7,4 5,5 7,4 5,5 7,4 5,5 BA11 0,636 0,910 2,969 4,389 1,902 4,804 3,360 1,109 BAll-aminóxi 1,118 ND 10,85 ND 8,767 21,20 7,970 ND BAll-oxima-Fl 0,677 1,296 5,725 5,928 4,238 7,442 1,748 5,540 BAll-cys 0,756 1,956 3,370 3,215 ND 3,775 2,103 ND BAll-cys-mal-FI 1,097 3,160 4,775 7,240 5,064 13,645 3,681 8,205 BA11-SH 0,774 2,229 7,671 12,10 4,764 11,08 3,414 6,738 BAll-S-mal-FI 1,417 1,912 5,297 7,925 5,004 10,60 2,300 7,010 2V Não se ligou
[00450] Todos os derivados e conjugados de BA11 mostraram ligação com alta afinidade a diferentes proteínas albumina sérica em pH 7,4 e pH 5,5. Portanto, as metodologias descritas acima fornecem abordagens de alto rendimento robustas para a modificação e a conjugação específicas de sítio de VNARs que mantêm a atividade de ligação da proteína.
[00451] VNARs de ligação a ROR1 - Conjugados de AF488 e MMAE
[00452] A expressão de VNARs de ligação a ROR1 como proteínas de fusão de inteína C-terminal possibilitou a geração de VNARs de ligação a ROR1 com aminóxi C-terminal exclusivo e grupos tiol C-terminais. Isso, por sua vez, possibilita a conjugação C-terminal, específica de sítio a identificações fluorescentes e cargas úteis citotóxicas através de química de conjugação de formação de oxima e química de maleimida, respectivamente. Os exemplos de identificações e cargas úteis são mostrados na Figura 28.
[00453] Uma proteína de fusão de CBD de inteína de VNAR de ligação a ROR1 imobilizada em microesferas de quitina foi gerada conforme descrito acima.
[00454] Geração de VNAR-ox-vcMMAE e VNAR-ox-MMAE
[00455] A proteína de fusão de inteína de VNAR imobilizada foi clivada com O,O'-1,3-propanodiolbis- hidroxilamina 400 mM (NH2-O-(CH2)3-O-NH2 ) em tampão de clivagem pH 6,9, temperatura ambiente de um dia para o outro. O VNAR resultante contendo um grupo aminóxi C-terminal (VNAR aminóxi) foi purificado por IMAC ou SEC e reagido com 3 equivalentes molares de benzaldeído PEG2 vc PAB MMAE ou benzaldeído PEG4 MMAE em 10% de acetonitrila com catalisador de anilina 10 mM final, temperatura ambiente de um dia para o outro. Os conjugados foram purificados por IMAC ou SEC, filtrados estéreis e a formação do material desejado e pureza final confirmadas por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa (Figura 29).
[00456] Geração de VNAR-S-mal-vcMMAE
[00457] A proteína de fusão de inteína de VNAR imobilizada foi clivada com cisteamina 100 mM em tampão de clivagem pH 6,9 com TCEP 2 mM, temperatura ambiente de um dia para o outro. O VNAR resultante contendo um grupo tiol C- terminal (VNAR SH) foi purificado por IMAC ou SEC e reagido com 4 equivalentes molares de MC vc PAB MMAE ou malAF488. Os conjugados foram purificados por IMAC ou SEC e filtrados estéreis e a formação do material desejado e pureza final confirmadas por análise por SDS PAGE de redução e não redução e espectrometria de massa (Figura 29).
[00458] Caracterização de conjugados anti ROR1 VNAR-MMAE - ligação a ROR1 and ROR2 por SPR e ligação de superfície celular por citometria de fluxo
[00459] Ligação de conjugados de VNAR a ROR1 e ROR2 por SPR
[00460] A capacidade dos conjugados de VNAR-MMAE e dos conjugados de VNAR-fluoresceína de se ligar a ECD de ROR1 humano foi determinada por SPR com o uso dos procedimentos descritos acima.
[00461] Conforme mostrado na Tabela 12, os conjugados de VNAR que foram preparados através de ligação de oxima de cargas úteis de benzaldeído a VNARs de aminóxi C- terminais; através de ligação de tioéter de cargas úteis funcionalizadas com malemida a VNARs de tiol C-terminais ou através de ligação de tioéter de cargas úteis funcionalizadas com malemida a VNARs de cisteína C-terminais, todos mantêm alta afinidade para ROR1 humano, mas não se ligam a ROR2 humano. Os conjugados foram preparados com o uso de ligantes cliváveis por enzima (Val-Cit) ou ligantes não cliváveis e mostraram ligação similar a ROR1 humano. Tabela 12: Dados de SPR para ligação de VNARs e conjugados de Fluoresceína e MMAE correspondentes a ROR1 e ROR2 humanos. VNARs foram expressos com etiquetas His6Myc C- terminais.
hROR1 hROR2 VNAR Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD (nM) B1 4,75E+05 7,56E-04 1,65 Sem ligação B1 -S- mal- 4,7E+05 3,67E-04 0,81 Sem Fluoresceína ligação 2V Sem Sem Sem Sem ligação ligação ligação ligação 2V -S-mal- Sem Sem Sem Sem vcMMAE ligação ligação ligação ligação 2V-Ox-vcMMAE Sem Sem Sem Sem ligação ligação ligação ligação 2V-Ox-MMAE Sem Sem Sem Sem ligação ligação ligação ligação P3A1-P3A1 1,86E+06 2,96E-03 1,61 Sem ligação P3A1-P3A1–S- 4,96E+06 2,6E-03 0,59 Sem mal-vcMMAE ligação P3A1-P3A1- 2,07E+06 2,77E-03 1,43 Sem Ox-vcMMAE ligação
P3A1-P3A1- 4,20E+06 3,20E-03 0,78 Sem Ox-MMAE ligação 2V-2V Sem Sem Sem Sem ligação ligação ligação ligação 2V-2V-S-mal- Sem Sem Sem Sem vcMMAE ligação ligação ligação ligação 2V-2V-Ox- Ligação Ligação Ligação Sem vcMMAE não não não ligação específica específica específica 2V-2V-Ox- Sem Sem Sem Sem MMAE ligação ligação ligação ligação
[00462] Ligação de conjugados de VNAR a linhagens celulares de câncer
[00463] A ligação de conjugados de MMAE B1 e P3A1 a linhagens de células cancerosas foi determinada por citometria de fluxo com o uso dos métodos descritos acima. Os conjugados B1 e P3A1 mantêm a ligação às células de adenocarcinoma de pulmão ROR1alto A549 e não se ligam à linhagem de células de câncer de pulmão ROR1baixo A427 por citometria de fluxo a uma concentração fixa de proteína.
[00464] Conjugados de proteína de fusão VNAR mFc
[00465] As proteínas de fusão B1 mIgG2a Fc e 2V mIgG2a Fc de não ligação foram identificadas com mal AF488 e mc vc PAB MMAE através de protocolos adaptados a partir da redução parcial e identificação de dissulfetos entre cadeias de anticorpo (Methods in Molecular Biology volume 1045 capítulo 9; Sun et al, Bioconj Chem 2005). Em resumo, proteínas VNAR mIgG2a Fc a 1 mg/ml em PBS +100 mM L-Arg com EDTA 1 mM adicionado foram parcialmente reduzidas com 2,75 equivalentes molares de TCEP fresco; 37 °C 2 horas. 1,1 equivalente molar de identificação de maleimida em relação a tiol de proteína livre foi adicionado, incubado em gelo 45 minutos e L-cisteína adicionada para interromper a reação. As reações foram dialisadas para remover identificação / fármaco não reagido, filtradas estéreis e analisadas por SDS PAGE. DAR típico de 4,4 para B1-mFc-AF488, e 3,9 para 2V-mFc-AF488.
[00466] Conjugados de proteína de fusão VNAR hFc
[00467] Outra abordagem para gerar ADCs é modificar geneticamente substituições e adições de cisteína nas posições nas cadeias leve e pesada de anticorpos e essas cisteínas fornecem grupos tiol reativos para identificação específica de sítio (Junutula 2008 Nature Biotechnology 26, 925 a 932, Jeffrey 2013, Sutherland 2016).
[00468] VNARs anti ROR1 foram geneticamente fundidos a domínios Fc de hIgG1 geneticamente modificados que continham uma substituição de cisteína na sequência Fc de hIgG1, S252C ou S473C (numeração de Kabat). Isso possibilitou a identificação específica de sítio com derivados de maleimida de identificações fluorescentes (AF488) e fármacos citotóxicos (MC vc PAB MMAE, MC vc PAB NHC6 α-amanitina, MA PEG4 va PBD, MA PEG8 va PAB SG3199, MA PEG4 vc PAB DMAE PNU 159682) (Figura 32).
[00469] Geração de VNAR-hFc – conjugados de fármaco
[00470] Um método redução parcial, reenovelamento e identificação para identificar o VNAR Fc S252C foi adaptado a partir da literatura (Junutula et al, 2008 Nat Biotech, Jeffrey et al, 2013 Bioconj Chem). Em resumo, 1 mg/ml de soluções de VNAR hFc foi preparado em PBS +100 mM L-Arginina pH 7,4 com EDTA 1 mM. 20 equivalentes molares de TCEP adicionados e incubados a 4 °C por um mínimo de 48 horas. 30 equivalentes molares de DHAA adicionados, pH ajustado em 6,5 e incubados à temperatura ambiente por 1 hora. VNAR Fc S252C reenovelado foi extensivamente dialisado ou o tampão trocado em PBS +50 mM L-Arginina e quantificado por UV antes da reação com 4 equivalentes molares de solução de identificação / fármaco de maleimida, temperatura ambiente 1 hora de um dia para o outro dependendo da identificação / fármaco. Os conjugados foram dialisados / tiveram o tampão trocado diretamente ou purificados adicionalmente por SEC ou IEX antes da diálise / troca de tampão.
[00471] Essa abordagem foi usada para gerar conjugados de MMAE de proteínas de fusão B1, P3A1 e 2V Fc de modo que o derivado de Fc de hIgG1 correspondente (S252C) fosse identificado com uma carga útil de MMAE funcionalizada com maleimida que incorpora um ligante clivável por enzima (Catepsina B).
[00472] Uma abordagem similar foi usada para gerar conjugados de MMAE de proteínas de fusão de B1-hFc-7C12 e P3A1- hFc-7C12.
[00473] Análise por SDS-PAGE e espectrometria de massa dos conjugados finais determinou que a identificação prosseguiu de uma forma quantitativa para gerar conjugados de VNAR-hFc – MMAE homogêneos altamente puros com razão entre fármaco e anticorpo (DAR) de 2 (Figura 31). Procedimentos similares foram usados para gerar o dímero de PBD, α-amanitina e conjugados de PNU de proteínas de fusão VNAR-hFc geneticamente modificadas com cisteína (Levena Biopharma, San Diego). De modo que que as fusões de VNAR (B1, P3A1, 2V) hIgG1 Fc(S252C) fossem reagidas com MC vc PAB NHC6 α-amanitina, MA PEG4 va PBD, MA PEG8 va PAB SG3199, MA PEG4 vc PAB DMAE PNU 159682 (Figura 32).
[00474] Ligação de conjugados de VNAR-hFc – MMAE a hROR1 e linhagens de células cancerosas
[00475] A capacidade dos conjugados de VNAR-hFc de se ligar a ECD de ROR1 humano foi determinada por SPR com o uso dos procedimentos descritos acima. Tabela 13: Dados de SPR para ligação de Fc humano de VNAR (hFc) e versões de conjugado de MMAE para ROR1 humano e ROR2 humano hROR1 Conjunto de hROR2 moléculas Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD (nM) Sem B1 hFc 3,08E+06 9,53E-05 0,032 ligação B1 hFc-MMAE 1,22E+06 1,29E-04 0,105 Sem ligação Sem P3A1 hFc 1,07E+07 5,64E-04 0,084 ligação P3A1 hFc- 2,68E+06 1,00E-03 0,38 Sem
MMAE ligação Sem Sem Sem Sem 2V hFc ligação ligação ligação ligação 2V hFc - Sem Sem Sem Sem
MMAE ligação ligação ligação ligação Sem Sem Sem Sem 2V-2V hFc ligação ligação ligação ligação
[00476] B1 e P3A1 VNAR -hIgG Fc (S252C) – conjugados de vcMMAE demonstraram ligação com alta afinidade a ROR1, mas não se ligam a ROR2 humano. 2V é um VNAR de não ligação e os conjugados de fármaco 2V-hFc correspondentes foram gerados como controles de não ligação.
[00477] A ligação de conjugados de hFc - vcMMAE B1 e P3A1 à linhagem de células de adenocarcinoma de pulmão
ROR1alto A549 e a linhagem de células de câncer de pulmão ROR1baixo A427 foi determinada por citometria de fluxo com o uso dos métodos descritos acima.
[00478] A Figura 30 mostra que os conjugados de hFc-vcMMAE B1 e P3A1 se ligam fortemente a células cancerosas ROR1alto, mas não a células cancerosas ROR1baixo. Enquanto o conjugado de 2V-hFc-vcMMAE não se liga a qualquer linhagem de células.
[00479] Ensaios de viabilidade celular in vitro para células de câncer tratadas com conjugados de fármaco de VNAR anti EGFR-ROR1
[00480] As células foram inoculadas em placas brancas de 96 poços de fundo transparente (Costar) e incubadas a 37 °C, 5% de CO2 por 24 horas. No dia seguinte, as séries de diluição foram definidas para cada agente de teste em estoques de trabalho x10. 10 µl das soluções de estoque X10 foram adicionados às placas de células (90 µl por poço) com o uso de uma pipeta multicanal. Isso resultou em uma diluição a 1:10 no poço e respostas à dose na faixa de uma concentração superior 1,000 nM (coluna 1) a 0,05 nM (coluna 10). 10 µl de controle de veículo (PBS) foram adicionados aos poços de controle (colunas 11 e 12). As placas foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2 por 96 horas. Reagente Promega Cell Titre Glo foi usado de acordo com as instruções do fabricante para avaliar a viabilidade celular. Em resumo, as placas de ensaio foram removidas da incubadora e deixadas entrar em equilíbrio com a temperatura ambiente antes da adição de 100 µl de reagente Cell Titre Glo à temperatura ambiente a cada poço de ensaio de 100 µl. As placas foram colocadas em um agitador de placa por 2 minutos a 600 rpm. As placas foram deixadas em repouso por mais 10 minutos à temperatura ambiente antes de medir a leitura de luminescência com o uso de um leitor de placa Clariostar (BMG). Os dados foram analisados calculando-se a média para poços de controle não tratados (veículo apenas) e determinando- se a % de controle para cada poço tratado. % de dados de controle foi, então, plotada contra a concentração em Log [Tratamento] e o valor de IC50 derivado com o uso de ajuste de regressão não linear em software GraphPad Prism.
[00481] A Figura 33 mostras curvas de resposta à dose, com valores de IC50 correspondentes, para extermínio celular das linhagens de células de câncer positivas para ROR1 A549 (adenocarcinoma de pulmão), MDA-MB-231 (câncer de mama), DU145 (câncer de próstata), Kasumi-2 (células de ALL) e Jeko1 (células de MCL) por conjugados de B1-mFc-vcMMAE e 2V-mFc- vcMMAE. Os conjugados de B1-hFc-vcMMAE mostram extermínio celular potente das células cancerosas positivas para ROR1 e mostra potência superior ao conjugado de 2V-mFc-vcMMAE correspondente através de cada uma das linhagens de células.
[00482] Tabela 14: Valores de IC50 para extermínio celular por B1-mFc-MMAE e 2V-mFc-MMAE por linhagem de células.
IC50 (nM) Linhagem celular B1 mFc 2V mFc MMAE
MMAE A549 24,2 228 MDA-231 36,6 212 DU145 15 75 Kasumi-2 26 240 JeKo-1 8,1 66
[00483] A Figura 34 mostra as curvas de resposta à dose, com valores de IC50 correspondentes, para extermínio celular de A) as células de câncer de próstata DU145 positivas para ROR1 por conjugados de B1-hFc-PBD, D3-hFc-PBD e 2V-hFc- PBD e B) células de MCL Jeko1 positivas para ROR1 por conjugados de B1-hFc-PBD, P3A1-hFc-PBD, D3-hFc-PBD e 2V-hFc- PBD. Os conjugados de B1-hFc-vcMMAE mostram extermínio celular potente das células de câncer positivas para ROR1 e são significativamente mais potentes que os conjugados de 2V-mFc- vcMMAE correspondentes.
[00484] Tabela 15: Valores de IC50 (nM) determinados para moléculas de VNAR hFc-PBD em linhagens de células de câncer DU145 e Jeko-1 em 96 h.
IC50 (nM) Linhagem de B1 hFc- P3A1 hFc- D3 hFc- 2V hFc- Células PBD PBD PBD PBD DU145 4,6 / 29,2 226,2 JeKo-1 0,36 1,9 12,6 25,4
[00485] Os conjugados de VNAR-PBD que têm como alvo ROR1 mostram extermínio potente de ambas as linhagens celulares e mostram potência aumentada em relação ao conjugado de 2V- hFc-PBD, com os valores de IC50 para o conjugado de B1-hFc pelo menos 49 vezes mais baixo que o conjugado de 2V-hFc.
[00486] A Figura 35 mostra as curvas de resposta à dose, com valores de IC50 correspondentes, para extermínio celular das células de câncer de ovário PA-1 positivas para ROR1 (A,C,E) e células de leucemia precursoras de célula B Kasumi-2 (B, D, F) por B1-hFc-PNU, conjugados de 2V-hFc-PNU (PEG4-vc PAB DMAE PNU 159682), P3A1-hFc-PBD, D3-hFc-PBD e conjugados e 2V-hFc-PBD e B1-hFc SG3199 PBD e conjugados de 2V-hFc SG3199 PBD.
[00487] Tabela 16: Os valores de IC50 calculados (nM) para o extermínio celular de células cancerosas PA-1 e Kasumi-2 por conjugados de VNAR-hFc. PA-1 ROR1 ko é uma linhagem de células de câncer PA-1 em que a expressão de ROR1 sofreu knock out.
Linha P3A1 D3 2V B1 2V B1 P3A1 2V- gem hFc- hFc- hFc- hFc hFc hFc- hFc- hFc- de va- va- va- - - vc- vc- vc- Célul PBD- PBD- PBD- va- va- PAB- PAB- PAB- as SGD1 SGD1 SGD1 PAB PAB DMAE- DMAE- DMAE- 882 882 882 - - PNU15 PNU15 PNU15 IC50 IC50 IC50 SG3 SG3 9682 9682 9682 (nM) (nM) (nM) 199 199 IC50 IC50 IC50 IC5 IC5 (nM) (nM) (nM) 0 0 (nM (nM ) ) PA-1 0,06 0,34 2,5 0,0 5,9 0,028 0,002 3,13 5 3 7 PA-1 ND ND ND 0,7 10, 1,5 3,4 4,5 ROR1 9 5 ko Kasum 0,52 0,25 6,6 0,0 4,4 0,8 5,1 11 i-2 6
[00488] Os conjugados de VNAR que têm como alvo ROR1 mostram extermínio potente de ambas as linhagens de células cancerosas PA-1 e Kasumi-2 e mostram potência aumentada em relação aos conjugados de 2V-hFc correspondentes, com os valores de IC50 para diversos conjugados que têm como alvo ROR1 > 100 vezes mais baixo que os controles de conjugado de 2V-hFc correspondente. EXEMPLO 10 – Biespecificidade de VNAR de ROR1
[00489] Combinações alvo biespecíficas para VNARs de ligação a ROR1 incluem, por exemplo,
[00490] HSA para extensão de meia-vida; acoplamento biespecífico de ROR1 e albumina sérica
[00491] RTKs, por exemplo, EGFR, Her3; que têm como alvo biespecífico tanto EGFR quanto ROR1 ou tanto HER3 quanto ROR1 na superfície das células.
[00492] Abordagem CD3 BiTE; exemplos de sequências de ligação a CD3 para uso como um VNAR de ROR1 biespecífico
[00493] Clone anti CD3 scFv OKT3 (WO 2014028776 Zyngenia) e orientação e derivados humanizados dos mesmos
[00494] VH-[G4S]3-VL
[00495] DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRP
GQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDD HYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSV
SYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQW SSNPLTFGAGTKLELKS (SEQ ID NO: 96)
[00496] UCHT1 anti CD3 scFv humanizado (Arnett et al PNAS 2004 101(46) 16.268 a 16.273) e derivados do mesmo
[00497] VL-[G4S]3-VH
[00498] MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKP
DGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGG TKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQS
HGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGY YGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS (SEQ ID NO: 97) EXEMPLO 11 – Abordagens de ROR1 CAR-T
[00499] Receptores de antígeno quiméricos (CARs) baseados nas moléculas de ligação ao antígeno específicas de ROR1 descritas no presente pedido podem ser gerados. Além disso, células T geneticamente modificadas que expressam tal CAR podem ser também geradas, que podem, então, ser usadas, por exemplo, em terapia de célula adoptiva.
[00500] Em resumo, um constructo de ácido nucleico que codifica um CAR específico para ROR1 pode ser produzido. O CAR específico para ROR1 pode incluir um domínio de ativação intracelular, um domínio transmembranar e um domínio extracelular que compreende a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 descrita no presente documento. O constructo de ácido nucleico pode ser, então, incorporado em um vetor viral, tal como um vetor retroviral (por exemplo, um vetor lentiviral).
[00501] As células T podem ser isoladas de um paciente que precisa de tratamento, que podem, então, ser modificadas para expressar o construto de ácido nucleico que codifica o CAR, por exemplo, por transfecção retroviral ou edição de gene com o uso de abordagens, tal como CRISPR-CAS-
9.
[00502] As células T geneticamente modificadas podem ser, então, reinfundidas no paciente a fim de tratar a afecção, tal como tratamento de câncer. EXEMPLO 12 – Caracterização de moléculas biespecíficas ROR1xEGFR
[00503] Construção de molécula de ligação ao antígeno biespecífica ROR1xEGFR
[00504] Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ROR1xEGFR foram construídas com o uso dos aglutinantes de nanocorpo EGFR 7C12 ou 9G8. 7C12 foi escolhido devido ao fato de que bloqueia a ligação de EGF, mostra alta afinidade a EGFR (baixo nM) e tem uma taxa de dissociação mais alta do que o 7D12 relacionado (diferença de seq 5aa). 9G8, que se liga a um epítopo de EGFR ligeiramente diferente e produz inibição de EGFR através de um mecanismo ligeiramente diferente, foi também escolhido.
[00505] Os nanocorpos de EGFR foram fundidos aos VNARs específicos de ROR1 B1, D3 e D3D3, P3A1 com o uso de uma sequência ligante [G4S]5. Uma etiqueta His6Myc foi incluída para purificação e detecção.
[00506] As fusões foram também geradas contendo uma sequência curta de QACGA (SEQ ID NO: 79) entre o VNAR e a etiqueta His6Myc ou alternativamente a sequência -ACA- (SEQ ID NO: 81) entre o nanocorpo e a etiqueta His6Myc para facilitar a conjugação com cargas úteis e identificações reativas a tiol.
[00507] Adicionalmente, as proteínas de fusão que compreendem uma molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, um nanocorpo específico de EGFR e uma região Fc humana foram construídas.
[00508] Determinação de número de receptor ROR1 e
EGFR
[00509] Os números de receptor celular ROR1 e EGFR foram determinados para diversas linhagens de células cancerosas humanas com o uso de um mAb de ROR1 conjugado a PE (2A2) e um mAb de EGFR conjugado a PE (AY13) (ambos Biolegend). Em resumo, 5 x 105 células foram incubadas com mAb ROR1 2A2 conjugado a PE a 5 µg/ml ou com 5 µg/ml de mAb de EGFR conjugado a PE (AY13), por 1 hora em gelo no escuro. As células foram lavadas duas vezes por ressuspensão em 5 ml de PBS/2% de FCS gelado e centrifugação a 1,500 rpm por 5 min a 4 °C. Microesferas Quantibrite (BD Biosciences) foram usados de acordo com as instruções do fabricante. A análise foi realizada em um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher). Os números de receptor (média de n=2) são exibidos na Tabela 17.
[00510] Caracterização de painel de célula
[00511] Ligação de Superfície Celular
[00512] Células cancerosas humanas aderentes foram desprendidas de frascos de cultura de tecido por incubação com 0,1% de solução de EDTA/PBS a 37 °C por ~10 minutos ou até as células se desprenderem facilmente. As células foram ressuspensas em 5 ml de PBS/2%FCS gelado em tubos de 15 ml e centrifugadas a 1,500 rpm por 5 minutos a 4 °C. P sobrenadante foi removido e o pélete celular ressuspenso em 1 a 2ml de PBS/2%FCS. Uma contagem celular foi realizada com o uso de um Contador de Partículas Z1 Coulter (Beckman Coulter) e 5 x 105 células foram aliquotadas por amostra de teste. Células em suspensão foram tratadas similarmente, mas não exigiram a etapa de desprendimento inicial. As células foram incubadas com 100 µl de VNAR (etiquetado com His6Myc), moléculas de VNAR-Fc ou mAb ROR1, mAb EGFR e controles de IgG por 1 hora em gelo. O excesso de VNAR, VNAR-Fc ou mAb foi removido adicionando-se 5 ml de PBS/2% FCS gelado, seguido por centrifugação a 1.500 rpm por 5 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido por ressuspensão do pélete celular em 1 ml de PBS/2%FCS gelado e adição de mais 4 ml de PBS/2%FCS gelado. As amostras foram novamente centrifugadas a 1,500 rpm por 5 min a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o líquido em excesso removido por secagem dos tubos em lenço de papel. Os anticorpos secundários adequados foram usados para detectar VNAR ligado (His6Myc), VNAR-hFc ou mAb (anticorpo de etiqueta PE-anti-Myc (CST), anticorpo PE-anti-humano (JIR labs/Stratech) e anticorpo PE- anti-camundongo (JIR/Stratech)). As células foram incubadas com o anticorpo secundário escolhido por 30 min em gelo. As células foram lavadas para remover o anticorpo em excesso,
conforme descrito anteriormente. Os péletes celulares foram ressuspensos em 0,5 ml de PBS/2%FCS gelado e deixados em gelo no escuro antes da análise em um citômetro de fluxo Attune NxT (ThermoFisher).
[00513] Um painel de 5 linhagens celulares que expressam diferentes níveis de ROR1- EGFR foi selecionado para triar moléculas biespecíficas. Essas linhagens celulares são apresentadas na Tabela 17 Tabela 17 Número do Situação de EGFR Receptor EGFR ROR1 Alto ROR1 – Alto EGFR A549 118793 9316 amplificação wt (mutação K-Ras G12S) Níveis equivalentes de ROR1/EGFR PA-1 6334 12249 * peso Alto ROR1 – Baixo EGFR Kasumi-2 0 8087 Baixo ROR1 – Médio/Baixo EGFR A427 27662 222 wt (mutação K-Ras G12D) Baixo ROR1-Baixo EGFR Mv4-11 0 0 Linhagens celulares com Mutações de EGFR MDA-MB231 84540 6997 EGFR L468W (mutação K- Ras G13D) PC9 122293 9827 EGFR del.E746_A750 H1975 32584 7987 EGFR L858R+T790M
[00514] A ligação de superfície celular da molécula biespecífica B1hFc7C12 foi investigada em células A549, PA-1, A427, Kasumi-2 e Mv4-11 com o uso de citometria de fluxo a 4 °C conforme descrito anteriormente. Uma elevação de sinal foi observada nas linhagens de células A549 e PA-1 entre a molécula biespecífica B1hFc7C12 e suas moléculas de domínio único originais B1hFc e hFc7C12 (Figura 36A e 36B). Uma elevação de sinal foi também observada na linhagem de células positiva para EGFR, ROR1 baixo, A427. Nenhuma ligação às células Mv4-11 negativas para receptor foi observada.
[00515] A ligação da molécula biespecífica P3A1hFc7C12 foi investigada em células A549, PA-1, A427 e Kasumi-2 novamente com o uso de citometria de fluxo a 4 °C. Uma elevação de sinal é observada na linhagem de células A549 entre a molécula biespecífica P3A1hFc7C12 e suas moléculas de domínio único originais P3A1hFc e hFc7C12 (Figura 36C).
[00516] Agentes de ligação biespecíficos de ROR1 e EGFR, sem uma porção Fc, foram também avaliados quanto à ligação de superfície celular nas duas orientações diferentes, isto é, ROR1-EGFR e EGFR-ROR1 (Figuras 37A, 37B e 37C)
[00517] A Figura 37A mostra a ligação de superfície celular a células A549 (alto ROR1, baixo EGFR). Uma elevação em ligação para os agentes de ligação biespecíficos ROR1-EGFR em relação aos domínios de ligação de ROR1 e EGFR individuais é claramente observada para certos construtos.
[00518] A Figura 37B mostra a ligação de superfície celular a células PA-1 (alto ROR1, médio/baixo EGFR). Novamente, uma elevação em ligação para os agentes de ligação biespecíficos ROR1-EGFR em relação aos domínios de ligação de ROR1 e EGFR individuais é claramente observada.
[00519] Entretanto, conforme mostrado na Figura 37C, nenhuma elevação em ligação dos agentes de ligação biespecíficos de ROR1-EGFR é observada para células A427 (baixo ROR1, baixo EGFR), o que é consistente com os agentes biespecíficos que têm como alvo ROR1 e EGFR na superfície de células ROR1+EGFR+.
[00520] Surpreendentemente, o aumento em ligação a células A549 e células PA1 depende da orientação do domínio de ligação de EGFR (9G8 ou 7C12) em relação ao agente de ligação de ROR1. Quando o agente de ligação de EGFR é fundido em posição C-terminal ao agente de ligação de ROR1, a ligação de superfície celular é comprometida em comparação com o mesmo construto, mas com o agente de ligação de EGFR fundido em posição N-terminal ao agente de ligação de ROR1. Alterar a orientação dos domínios dentro do construto, portanto, fornece um método para alterar a afinidade do agente biespecífico à superfície celular.
[00521] Uma observação similar foi realizada dentro do contexto de proteínas de fusão Fc (Figura 38). Quando o agente de ligação de EGFR 7C12 foi fundido à terminação C do fragmento Fc (hFc 7C12), a ligação às linhagens de células EGFR+ve A549, PA-1 e A427 foi consistentemente mais baixa em comparação com a fusão N-terminal correspondente (7C12 hFc). Desse modo, possibilitando que as características de ligação de superfície celular de agentes de ligação biespecíficos de ROR1-EGFR sejam moduladas através de projeto adequado das proteínas de fusão Fc correspondentes. Experimentos de Internalização
[00522] A internalização de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ROR1xEGFR foi investigada com o uso de microscopia por imunofluorescência (IF) em células A549.
[00523] Placas pretas de 96 poços de fundo transparente (Greiner) foram revestidas com 100 µg/ml de colágeno I (Sigma) para auxiliar a fixação celular. As células foram inoculadas em meio de crescimento completo (Gibco) nas placas de 96 poços revestidas e incubadas a 5% de CO2, 37 °C por 24 horas. O meio foi removido e substituído por meio sem soro (Gibco) no dia seguinte e deixado de um dia para o outro.
Na manhã seguinte, o meio foi removido e as células foram tratadas com moléculas de VNAR-hFc.
As placas foram incubadas em gelo por 30 minutos.
Os tratamentos foram removidos e substituídos por 100 µl de PBS/2%FCS por poço.
Uma placa foi mantida em gelo e a outra foi colocada a 37 °C, 5% de CO2 por 2 horas.
Após essa incubação por 2 horas, a solução de PBS/2%FCS foi removida e as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS gelado por 20 min em gelo.
A solução de PFA foi removida e substituída por 0,05% de Saponina (Sigma) constituída em PBS/2% de FCS por 15 min à temperatura ambiente.
Essa etapa permeabiliza as membranas celulares.
O manchamento de anticorpo secundário foi realizado com o uso de Ab Af488- anti-humano (1:250; ThermoFisher) para detectar proteínas de fusão de VNAR-hFc.
Todos os estoques de trabalho de anticorpo secundário foram constituídos em 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS.
As placas foram incubadas a 4 °C de um dia para o outro no escuro.
No dia seguinte, os anticorpos conjugados a AF488 secundários foram removidos e as células foram lavadas X3 com o uso de 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS.
Anticorpo Lamp-1 (1:200; CST) ou anticorpo EEA1 (1:50; CST) foi adicionado para detectar lisossomo e compartimentos de endossomo precoces, respectivamente.
As placas foram incubadas no escuro à temperatura ambiente por 2 horas.
Os anticorpos Lamp-1 e EEA1 foram, então, removidos e as células foram lavadas X3 com 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS.
Anticorpo Af647-anticoelho (1:1.000; CST) foi, então, adicionado para detectar ligação de anticorpo Lamp1 e EEA1. Uma incubação adicional no escuro à temperatura ambiente por 2 horas foi realizada antes de remover o anticorpo secundário AF647 e lavar as células X3 com 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS.
Os núcleos das células foram manchados com o uso de reagente Hoechst 10 µM (Sigma) em 0,05% de Saponina/PBS/2% de FCS por 20 min à temperatura ambiente no escuro. Finalmente, essa solução foi removida e substituída por PBS. As placas foram armazenadas a 4 °C no escuro antes do imageamento com o uso de um instrumento GE Healthcare InCell
2000.
[00524] Conforme mostrado na Figura 39, B1hFc7C12 é clara e fortemente internalizado por células A549 após 2 h a 37 ºC. Em contrapartida, as moléculas originais B1hFc e hFc7C12 mostram níveis mais baixos de internalização e para hFc7C12 apenas em algumas células.
[00525] Similarmente, P3A1hFc7C12 é internalizado por células A549 após 2 h a 37 ºC (Figura 40). A molécula original hFc7C12 mostra baixos níveis de internalização e apenas em algumas células.
[00526] Adicionalmente, B1hFc7C12 mostrou se colocalizar com o Antígeno de Endossomo Precoce 1 (EEA1) e proteína de membrana associada a lisossomo 1 (LAMP-1) em células A549 (Figura 41).
[00527] A internalização de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ROR1xEGFR não Fc foi investigada com o uso de citometria de fluxo conforme descrito anteriormente (Figura 42A e 42B). O sinal de fluorescência para as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ROR1xEGFR foi significativamente inferior após incubação a 37 °C versus 4 °C, indicando a internalização das proteínas biespecíficas mediante ligação ao alvo. Regulação decrescente de Receptor de Superfície
[00528] A expressão de ROR1 e EGFR em células A549 foi monitorada durante um período de 24 horas após o tratamento com B1hFc7C12. Conforme mostrado na Figura 43A, B1hFc7C12 regula de modo decrescente temporariamente ROR1. B1hFc7C12 também regula de modo decrescente EGFR com um efeito mais prolongado: Os níveis de EGFR não retornam aos níveis não tratados mesmo após 24 horas (Figura 43B).
[00529] A regulação decrescente de ROR1 e EGFR por P3A1hFc7C12 e D3D3hFc7C12 é observada, enquanto a regulação decrescente de EGFR por esses construtos biespecíficos é menos óbvia (Figuras 44 a 45). Ligação a proteínas de ROR1 e EGFR
[00530] A capacidade de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ROR1xEGFR de se acoplar simultaneamente a ambos os alvos de ROR1 e EGFR foi confirmada por BLI (Figura 46). hROR1 foi imobilizado em um sensor e os construtos biespecíficos ou os aglutinantes monoespecíficos constituintes foram fluídos sobre o sensor para confirmar a ligação de ROR1. EGFR foi, então, imediatamente passado sobre o sensor e a ligação do agente de ligação biespecífico imobilizado com ROR1 a EGFR, então, avaliada por um segundo aumento em sinal.
[00531] Os exemplos representativos para uma seleção de diferentes construtos biespecíficos são mostrados na Figura 46. VNAR de ligação a ROR1 monoespecífico B1 não contém uma porção química de ligação de EGFR e, assim, nenhum aumento adicional em sinal é observado quando EGFR flui sobre a superfície do sensor. Extermínio Celular por Moléculas de Fusão de Fc ROR1xEGFR
[00532] A potência de moléculas de fusão de Fc ROR1xEGFR foi investigada em diversas linhagens celulares. Os resultados são resumidos na tabela 18. Ambas as moléculas de
B1hFc-7C12-MMAE e P3A1hFc-7C12-MMAE mostraram ser mais potentes que hFc7C12-MMAE sozinho.
Tabela 18: Conjugados de B1hFc-7C12-, P3A1hFc-7C12 biespecífico-MMAE e hFc7C12-MMAE foram testados em um ensaio de viabilidade celular de 96 h com o uso de leitura de Cell Titer Glo.
IC50 (nM) são relatados.
B1hFc-7C12-MMAE e P3A1hFc- 7C12 foram mais potentes que hFc7C12-MMAE sozinho.
IC50 (nM) 96 IC50 (nM) 96 h h B1hFc- P3A1hFc- Linhagem Receptor Receptor 7C12- 7C12- hFc7C12- B1hFc- 2VhFc- celular ROR1 no EGFR no MMAE MMAE MMAE MMAE MMAE A549 9316 118,793 11 197 257 83 >1000 PA-1 12,249 6334 14 32 148 46 641 MDA-MB- 468 4107 1,825,000 5,2 25 45 ND ND NCI- H1975 7987 35,800 18,3 83 255 ND ND PC-9 9827 122,293 3,4 15 42 98 692

Claims (73)

REIVINDICAÇÕES
1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, caracterizada por compreender: (i) uma molécula de ligação ao antígeno específica de receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 1 (ROR1) que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula (I): FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4 (I) em que FW1 é uma região de arcabouço, CDR1 é uma sequência de CDR, FW2 é uma região de arcabouço, HV2 é uma sequência hipervariável, FW3a é uma região de arcabouço, HV4 é uma sequência hipervariável, FW3b é uma região de framework, CDR3 é uma sequência de CDR, FW4 é uma região de arcabouço; e (ii) uma molécula de ligação ao antígeno específica de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); ou uma variante funcional da mesma.
2. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 não se ligar ao receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 2 (ROR2).
3. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizada ppela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 se ligar tanto ao ROR1 humano quanto ao ROR1 murino (mROR1).
4. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 se ligar ao ROR1 desglicosilado.
5. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 não se ligar a uma sequência de peptídeos linear selecionada dentre: YMESLHMQGEIENQI (SEQ ID NO: 34) CQPWNSQYPHTHTFTALRFP (SEQ ID NO: 35) RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ (SEQ ID NO: 36) QCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYE (SEQ ID NO: 37).
6. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender uma molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, em que FW1 é uma região de arcabouço de 20 a 28 aminoácidos, CDR1 é uma sequência de CDR selecionada dentre DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1), GAKYGLAA (SEQ ID NO: 2), GAKYGLFA (SEQ ID NO: 3), GANYGLAA (SEQ ID NO: 4) ou GANYGLAS (SEQ ID NO: 5), FW2 é uma região de arcabouço de 6 a 14 aminoácidos, HV2 é uma sequência hipervariável selecionada dentre TTDWERMSIG (SEQ ID NO: 6), SSNQERISIS (SEQ ID NO: 7) ou SSNKEQISIS (SEQ ID NO: 8), FW3a é uma região de arcabouço de 6 a 10 aminoácidos, HV4 é uma sequência hipervariável selecionada dentre NKRAK (SEQ ID NO: 9), NKRTM (SEQ ID NO: 10), NKGAK (SEQ ID NO: 11) ou NKGTK (SEQ ID NO: 12), FW3b é uma região de arcabouço de 17 a 24 aminoácidos,
CDR3 é uma sequência de CDR selecionada dentre QSGMAISTGSGHGYNWY (SEQ ID NO: 13), QSGMAIDIGSGHGYNWY (SEQ ID NO: 14), YPWAMWGQWY (SEQ ID NO: 15), VFMPQHWHPAAHWY (SEQ ID NO: 16), REARHPWLRQWY (SEQ ID NO: 17) ou YPWGAGAPWLVQWY (SEQ ID NO: 18), FW4 é uma região de arcabouço de 7 a 14 aminoácidos ou uma variante funcional das mesmas com pelo menos 45% de identidade de sequência com a mesma.
7. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo FW1 ser selecionada dentre: ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 19), AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 20), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 21), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 22), ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 23) ou TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (SEQ ID NO: 24), FW2 é selecionada dentre: TSWFRKNPG (SEQ ID NO: 25) ou TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26); FW3a é selecionada dentre: GRYVESV (SEQ ID NO: 27) ou GRYSESV (SEQ ID NO: 28), FW3b é selecionada dentre: SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29), SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (SEQ ID NO: 30) ou SFTLTISSLQPEDFATYYCKA (SEQ ID NO: 31) e FW4 é selecionada dentre: DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32) ou DGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 33); ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
8. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 compreender uma sequência de aminoácidos selecionada dentre:
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWY DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 39);
AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAIDIGSGHGYNWY DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 40);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLAATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWAMWGQWYDGAGTVL TVN (SEQ ID NO: 41);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLFATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAVFMPQHWHPAAHWYDGA GTVLTVN (SEQ ID NO: 42);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGT VLTVN (SEQ ID NO: 43);
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGA GTVLTVN (SEQ ID NO: 44);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISI
SGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGA GTKVEIK (SEQ ID NO: 45);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGA GTKVEIK (SEQ ID NO: 46);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKGAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 47);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISI
SGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 48);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSI
GGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 49); ou uma variante funcional das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
9. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 ser humanizada.
10. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 ser desumanizada.
11. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ser conjugada em uma marcação detectável, corante, toxina, fármaco, profármaco, radionuclídeo ou molécula biologicamente ativa.
12. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 interagir seletivamente com a proteína de ROR1 com uma constante de afinidade de aproximadamente 0,01 a 50 nM, preferencialmente de 0,1 a 30 nM, ainda mais preferencialmente de 0,1 a 10 nM.
13. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica tem capacidade para mediar a eliminação de células tumorais de expressão de ROR1.
14. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ter capacidade para inibir a proliferação de célula cancerígena.
15. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ter capacidade para ser endocitada mediante ligação ao ROR1.
16. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ter capacidade para regular de maneira decrescente ROR1 ou EGFR mediante ligação.
17. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ter capacidade para regular de maneira decrescente a sinalização de ROR1 ou EGFR.
18. PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE, caracterizada por compreender uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
19. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ser fundida em uma ou mais proteínas biologicamente ativas.
20. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica ser fundida em uma ou mais proteínas biologicamente ativas através de um ou mais domínios ligantes.
21. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, caracterizada por pelo menos uma proteína biologicamente ativa ser uma imunoglobulina, uma região Fc de imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina,
um Fv de cadeia única (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um engager de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio VH ou uma proteína de arcabouço.
22. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por pelo menos uma proteína biologicamente ativa ser uma região Fc de imunoglobulina.
23. RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO (CAR), caracterizado por compreender pelo menos uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, fundida ou conjugada em pelo menos uma região transmembranar e pelo menos um domínio intracelular.
24. CÉLULA, caracterizada por compreender um receptor de antígeno quimérico, conforme definido na reivindicação 23, sendo que a célula é preferencialmente uma célula T geneticamente modificada.
25. SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS, caracterizada por compreender uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.
26. VETOR, caracterizado por compreender uma sequência de ácidos nucleicos, conforme definido na reivindicação 25, que, opcionalmente, compreende adicionalmente uma ou mais sequências reguladoras.
27. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender um vetor, conforme definido na reivindicação 26.
28. MÉTODO PARA PREPARAR UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE OU
RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, caracterizado por compreender cultivar ou manter uma célula hospedeira que compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 25, sob tais condições que a dita célula hospedeira produza a molécula de ligação, que, opcionalmente, compreende adicionalmente isolar a molécula de ligação.
29. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.
30. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA,
PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE OU RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado por ser para uso em terapia.
31. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA,
PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE OU RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado por ser para uso no tratamento de câncer.
32. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA,
PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE OU RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo câncer ser um tipo de câncer ROR1 positivo.
33. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA,
PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE OU RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo câncer ser selecionado dentre o grupo que compreende cânceres sanguíneos, tais como linfomas e leucemias, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula do manto (MCL),
leucemia linfoblástica aguda de célula B (B-ALL), linfoma de zona marginal (MZL), linfomas de não Hodgkin (NHL), leucemia mieloide aguda (AML) e tumores sólidos que incluem neuroblastoma, câncer renal, câncer pulmonar, câncer do cólon, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pele, câncer uterino, câncer de próstata, câncer de tireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de estômago ou câncer de fígado.
34. USO DE UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, PROTEÍNA DE FUSÃO RECOMBINANTE OU RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado por se dá na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um paciente que necessita do mesmo.
35. MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UMA DOENÇA EM UM PACIENTE QUE NECESSITA DE TRATAMENTO, caracterizado por compreender a administração ao dito paciente de uma dosagem terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou uma composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 29.
36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela doença ser câncer.
37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo câncer ser um tipo de câncer ROR1 positivo.
38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo câncer ser selecionado dentre o grupo que compreende cânceres sanguíneos, tais como linfomas e leucemias, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda de célula B (B-ALL), linfoma de zona marginal (MZL), linfomas de não Hodgkin (NHL), leucemia mieloide aguda (AML) e tumores sólidos que incluem neuroblastoma, câncer renal, câncer pulmonar, câncer do cólon, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pele, câncer uterino, câncer de próstata, câncer de tireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de estômago ou câncer de fígado.
39. MÉTODO PARA AVALIAR A PRESENÇA DE UM ANALITO- ALVO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender a adição de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica detectavelmente marcada, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou uma proteína de fusão recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22, na amostra e detectar a ligação da molécula ao analito-alvo.
40. MÉTODO PARA IMAGEAMENTO DE UM SÍTIO DE DOENÇA EM UM INDIVÍDUO, caracterizado por compreender a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica detectavelmente marcada, conforme definido qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou uma proteína de fusão recombinante detectavelmente marcada, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22, a um indivíduo.
41. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE UMA DOENÇA OU AFECÇÃO MÉDICA EM UM INDIVÍDUO, caracterizado por compreender a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou uma proteína de fusão recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22.
42. ANTICORPO, FRAGMENTO DE ANTICORPO OU MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, caracterizada por competer para ligação ao ROR1 com a molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17; ou um anticorpo biespecífico de ROR1 e EGFR, fragmento de anticorpo biespecífico de ROR1 e EGFR ou molécula de ligação ao antígeno biespecífico de ROR1 e EGFR que compete para ligação ao ROR1 e/ou EGFR com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17
43. KIT PARA DIAGNÓSTICO DE UM INDIVÍDUO QUE SOFRE DE CÂNCER, OU UMA PREDISPOSIÇÃO PARA O MESMO, OU PARA FORNECER UM PROGNÓSTICO DA AFECÇÃO DE UM INDIVÍDUO, sendo que o kit é caracterizado por compreender meios de detecção para detectar a concentração de antígeno presente em uma amostra de um indivíduo de teste, sendo que os meios de detecção compreendem uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, uma proteína de fusão recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22, um CAR, conforme definido na reivindicação 23, ou um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 25, sendo que, cada um, é opcionalmente derivado, sendo que a presença de antígeno na amostra sugere que o indivíduo sofre de câncer.
44. KIT, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo antígeno compreender proteína de ROR1, mais preferencialmente um domínio extracelular da mesma.
45. KIT, de acordo com a reivindicação 43, sendo que o kit é caracterizado por ser usado para identificar a presença ou ausência de células ROR1 positivas na amostra, ou determinar a concentração das mesmas na amostra.
46. KIT, de acordo com a reivindicação 43, sendo que o kit é caracterizado por compreender um controle positivo e/ou um controle negativo ao qual o ensaio é comparado.
47. KIT, de acordo com a reivindicação 43, sendo que o kit é caracterizado por compreender adicionalmente uma marcação que pode ser detectada.
48. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE UM INDIVÍDUO QUE SOFRE DE CÂNCER, OU UMA PREDISPOSIÇÃO PARA O MESMO, OU PARA FORNECER UM PROGNÓSTICO DA AFECÇÃO DE UM INDIVÍDUO, sendo que o método é caracterizado por compreender detectar a concentração de antígeno presente em uma amostra obtida a partir de um indivíduo, sendo que a detecção é alcançada com o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, uma proteína de fusão recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22, um CAR, conforme definido na reivindicação 23, ou uma sequência de ácidos nucleicos, conforme definido na reivindicação 25, sendo que, cada um, é opcionalmente derivado e em que a presença de antígeno na amostra sugere que o indivíduo sofre de câncer.
49. MÉTODO PARA ELIMINAR OU INIBIR O CRESCIMENTO DE UMA CÉLULA QUE EXPRESSA ROR1 IN VITRO OU EM UM PACIENTE, em que o método é caracterizado por compreender administrar à célula uma quantidade ou dose farmaceuticamente eficaz de (i) molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, uma proteína de fusão recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22, um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 25, ou o CAR ou célula, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 23 e 25, ou (ii)
de uma composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 29.
50. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pela célula que expressa ROR1 ser uma célula cancerígena.
51. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 e 50, caracterizado pelo ROR1 ser ROR1 humano.
52. MÉTODO PARA ELIMINAR OU INIBIR O CRESCIMENTO DE UMA CÉLULA QUE EXPRESSA EGFR IN VITRO OU EM UM PACIENTE, em que o método é caracterizado por compreender administrar à célula uma quantidade ou dose farmaceuticamente eficaz de (i) molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, uma proteína de fusão recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22, um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 25, ou o CAR ou célula, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 23 ou 25, ou (ii) de uma composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 29.
53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pela célula que expressa EGFR ser uma célula cancerígena.
54. MÉTODO PARA ELIMINAR OU INIBIR O CRESCIMENTO DE UMA CÉLULA QUE EXPRESSA ROR1 E EGFR IN VITRO OU EM UM PACIENTE, em que o método é caracterizado por compreender administrar à célula uma quantidade ou dose farmaceuticamente eficaz de (i) molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, uma proteína de fusão recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22, um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 25, ou o CAR ou célula, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 23 e 25, ou (ii) de uma composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 29.
55. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pela célula que expressa ROR1 e EGFR ser uma célula cancerígena.
56. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula (II): Xb-X-Xa-FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4-Ya- Y-Yb (II) em que FW1 é uma região de arcabouço, CDR1 é uma sequência de CDR, FW2 é uma região de arcabouço, HV2 é uma sequência hipervariável, FW3a é uma região de arcabouço, HV4 é uma sequência hipervariável, FW3b é uma região de arcabouço, CDR3 é uma sequência de CDR, FW4 é uma região de arcabouço, em que Xa, Xb, Ya e Yb estão ausentes ou são uma molécula de ligação específica de EGFR, em que pelo menos um dentre Xa, Xb, Ya e Yb é uma molécula de ligação específica de EGFR, X e Y são sequências de aminoácidos opcionais, em que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é conjugada em uma segunda porção química.
57. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada por X ou Y estão, individualmente, ausentes ou serem selecionadas dentre o grupo que compreende uma imunoglobulina, uma região Fc de imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina, um Fv de cadeia única (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um engager de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio VH ou uma proteína de arcabouço.
58. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 e 57, caracterizada pela conjugação ocorrer através de um resíduo de cisteína na sequência de aminoácidos da molécula de ligação ao antígeno específica.
59. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 e 57, caracterizada pela conjugação ocorrer através de uma porção química de tiol, aminóxi ou hidrazinila incorporada no N- terminal ou C-terminal da sequência de aminoácidos da molécula de ligação ao antígeno específica.
60. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizada pela segunda porção química ser selecionada dentre o grupo que compreende uma imunoglobulina, uma região Fc de imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina, um Fv de cadeia única (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um engager de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio VH ou uma proteína de arcabouço.
61. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizada pela segunda porção química ser selecionada dentre o grupo que compreende uma marcação detectável, corante, toxina, fármaco, profármaco, radionuclídeo ou molécula biologicamente ativa.
62. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 61, caracterizada pelo fato de que a segunda porção química é pelo menos uma toxina selecionada dentre o grupo que compreende: • maitansinoides, • auristatinas, • antraciclinas, preferencialmente antraciclinas derivadas de PNU • derivados de amanitina, preferencialmente derivados de α-amanitina • caliqueamicinas, • tubulisinas • duocarmicinas • radioisótopos - tal como um radionuclídeo alfa- emissor, tal como marcação 227 Th e 225 Ac • lipossomas que compreendem uma carga útil tóxica, • toxinas de proteína • taxanos • pirrolbenzodiazepinas e/ou • pseudodímeros de indolinobenzodiazepina e/ou • inibidores de spliceossoma • inibidores de CDK11 • piridinobenzodiazepinas.
63. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 62, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica ser uma molécula de ligação ao antígeno específica de receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 1 (ROR1).
64. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 não se liga ao receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 2 (ROR2).
65. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 e 64, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 se liga tanto ao ROR1 humano quanto ao ROR1 murino (mROR1).
66. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 65, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 se liga ao ROR1 desglicosilado.
67. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 não se liga a uma sequência de peptídeos linear selecionada dentre: YMESLHMQGEIENQI (SEQ ID NO: 34), CQPWNSQYPHTHTFTALRFP (SEQ ID NO: 35), RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ (SEQ ID NO: 36), QCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYE (SEQ ID NO: 37).
68. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 67, caracterizada por: FW1 é uma região de arcabouço de 20 a 28 aminoácidos CDR1 é uma sequência de CDR selecionada dentre DTSYGLYS (SEQ ID NO: 1), GAKYGLAA (SEQ ID NO: 2), GAKYGLFA (SEQ ID NO: 3), GANYGLAA (SEQ ID NO: 4) ou GANYGLAS (SEQ ID NO: 5) FW2 é uma região de arcabouço de 6 a 14 aminoácidos HV2 é uma sequência hipervariável selecionada dentre TTDWERMSIG (SEQ ID NO: 6), SSNQERISIS (SEQ ID NO: 7) ou SSNKEQISIS (SEQ ID NO: 8) FW3a é uma região de arcabouço de 6 a 10 aminoácidos HV4 é uma sequência hipervariável selecionada dentre NKRAK (SEQ ID NO: 9), NKRTM (SEQ ID NO: 10), NKGAK (SEQ ID NO: 11) ou NKGTK (SEQ ID NO: 12) FW3b é uma região de arcabouço de 17 a 24 aminoácidos CDR3 é uma sequência de CDR selecionada dentre QSGMAISTGSGHGYNWY (SEQ ID NO: 13), QSGMAIDIGSGHGYNWY (SEQ ID NO: 14), YPWAMWGQWY (SEQ ID NO: 15), VFMPQHWHPAAHWY (SEQ ID NO: 16), REARHPWLRQWY (SEQ ID NO: 17) ou YPWGAGAPWLVQWY (SEQ ID NO: 18) FW4 é uma região de arcabouço de 7 a 14 aminoácidos ou uma variante funcional das mesmas com pelo menos 45% de identidade de sequência com a mesma.
69. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 68, caracterizada por FW1 ser selecionado dentre ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 19), AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 20),
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 21), TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLT (SEQ ID NO: 22), ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVT (SEQ ID NO: 23) ou TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLT (SEQ ID NO: 24), FW2 é selecionado dentre TSWFRKNPG (SEQ ID NO: 25) ou TYWYRKNPG (SEQ ID NO: 26), FW3a é selecionado dentre GRYVESV (SEQ ID NO: 27) ou GRYSESV (SEQ ID NO: 28), FW3b é selecionado dentre SFSLRIKDLTVADSATYYCKA (SEQ ID NO: 29), SFTLTISSLQPEDSATYYCRA (SEQ ID NO: 30) ou SFTLTISSLQPEDFATYYCKA (SEQ ID NO: 31) e FW4 é selecionado dentre DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 32) ou DGAGTKVEIK (SEQ ID NO: 33), ou variantes funcionais das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
70. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 68, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 compreender uma sequência de aminoácidos selecionada dentre
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAISTGSGHGYNWY DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 39);
AKVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKRAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAQSGMAIDIGSGHGYNWY DGAGTVLTVN (SEQ ID NO: 40);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLAATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWAMWGQWYDGAGTVL TVN (SEQ ID NO: 41);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGAKYGLFATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAVFMPQHWHPAAHWYDGA GTVLTVN (SEQ ID NO: 42);
TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGT VLTVN (SEQ ID NO: 43);
ASVNQTPRTATKETGESLTINCVVTGANYGLAATYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKAYPWGAGAPWLVQWYDGA GTVLTVN (SEQ ID NO: 44);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNKEQISI
SGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGA GTKVEIK (SEQ ID NO: 45);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTGANYGLASTYWYRKNPGSSNQERISI
SGRYSESVNKRTMSFTLTISSLQPEDSATYYCRAYPWGAGAPWLVQWYDGA GTKVEIK (SEQ ID NO: 46);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTSWFRKNPGTTDWERMSI
GGRYVESVNKGAKSFTLTISSLQPEDFATYYCKAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 47);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGSSNKEQISI
SGRYSESVNKGTKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 48);
TRVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLTDTSYGLYSTYWYRKNPGTTDWERMSI
GGRYSESVNKGAKSFTLTISSLQPEDSATYYCRAREARHPWLRQWYDGAGT KVEIK (SEQ ID NO: 49); ou uma variante funcional das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 45%.
71. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 70, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 ser humanizada.
72. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 70,
caracterizada pelaa molécula de ligação ao antígeno específica de ROR1 ser desumanizada.
73. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 71, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno específica de EGFR ser selecionada dentre o grupo que compreende uma imunoglobulina, uma região Fab de imunoglobulina, um Fv de cadeia única (scFv), um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um engager de célula t biespecífico (BiTE), uma inteína, um domínio VNAR, um anticorpo de domínio único (sdAb), um domínio VH ou uma proteína de arcabouço.
BR112020012464-8A 2017-12-22 2018-12-21 molécula de ligação ao antígeno biespecífica; proteína de fusão recombinante, receptor de antígeno quimérico, célula, sequência de ácidos nucleicos, vetor, célula hospedeira, método para preparar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, composição farmacêutica, uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, método para tratamento de uma doença em um paciente que necessita de tratamento, método para avaliar a presença de um analito-alvo em uma amostra, método para imageamento de um sítio de doença em um indivíduo, método para diagnóstico de uma doença ou afecção médica em um indivíduo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno, kit e método para diagnóstico de um indivíduo que sofre de câncer, ou uma predisposição para o mesmo, ou para fornecer um prognóstico da afecção de um indivíduo, método para eliminar ou inibir o crescimento de uma célula que expressa ror1 e egfr in vitro ou em um paciente BR112020012464A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1721802.5A GB201721802D0 (en) 2017-12-22 2017-12-22 Ror1-specific antigen binding molecules
GB1721802.5 2017-12-22
PCT/EP2018/086821 WO2019122445A1 (en) 2017-12-22 2018-12-21 Bi-specific antigen binding molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020012464A2 true BR112020012464A2 (pt) 2020-11-24

Family

ID=61131591

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020012464-8A BR112020012464A2 (pt) 2017-12-22 2018-12-21 molécula de ligação ao antígeno biespecífica; proteína de fusão recombinante, receptor de antígeno quimérico, célula, sequência de ácidos nucleicos, vetor, célula hospedeira, método para preparar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, composição farmacêutica, uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, método para tratamento de uma doença em um paciente que necessita de tratamento, método para avaliar a presença de um analito-alvo em uma amostra, método para imageamento de um sítio de doença em um indivíduo, método para diagnóstico de uma doença ou afecção médica em um indivíduo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno, kit e método para diagnóstico de um indivíduo que sofre de câncer, ou uma predisposição para o mesmo, ou para fornecer um prognóstico da afecção de um indivíduo, método para eliminar ou inibir o crescimento de uma célula que expressa ror1 e egfr in vitro ou em um paciente
BR112020012463-0A BR112020012463A2 (pt) 2017-12-22 2018-12-21 molécula de ligação ao antígeno específica de receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 1 (ror1), proteína de fusão recombinante, receptor de antígeno quimérico (car) específico de ror1, célula, sequência de ácidos nucleicos, vetor, célula hospedeira, método para preparar e uso de uma molécula de ligação ao antígeno específica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, composição farmacêutica, método para tratamento de uma doença em um paciente que necessita de tratamento, método para avaliar a presença de um analito-alvo em uma amostra, método para imageamento de um sítio de doença em um indivíduo, método para diagnóstico de uma doença ou afecção médica em um indivíduo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno, kit e método para diagnóstico de um indivíduo que sofre de câncer, ou uma predisposição para o mesmo, ou para fornecer um prognóstico da afecção de um indivíduo e método para eliminar ou inibir o crescimento de uma célula que expressa ror1 in vitro ou em um paciente

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020012463-0A BR112020012463A2 (pt) 2017-12-22 2018-12-21 molécula de ligação ao antígeno específica de receptor órfão semelhante ao receptor tirosina quinase 1 (ror1), proteína de fusão recombinante, receptor de antígeno quimérico (car) específico de ror1, célula, sequência de ácidos nucleicos, vetor, célula hospedeira, método para preparar e uso de uma molécula de ligação ao antígeno específica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, composição farmacêutica, método para tratamento de uma doença em um paciente que necessita de tratamento, método para avaliar a presença de um analito-alvo em uma amostra, método para imageamento de um sítio de doença em um indivíduo, método para diagnóstico de uma doença ou afecção médica em um indivíduo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno, kit e método para diagnóstico de um indivíduo que sofre de câncer, ou uma predisposição para o mesmo, ou para fornecer um prognóstico da afecção de um indivíduo e método para eliminar ou inibir o crescimento de uma célula que expressa ror1 in vitro ou em um paciente

Country Status (14)

Country Link
US (2) US20230203155A1 (pt)
EP (2) EP3727433A1 (pt)
JP (2) JP2021508458A (pt)
KR (2) KR20200104328A (pt)
CN (2) CN112074534A (pt)
AU (2) AU2018391026A1 (pt)
BR (2) BR112020012464A2 (pt)
CA (2) CA3086795A1 (pt)
GB (1) GB201721802D0 (pt)
IL (2) IL275510A (pt)
MX (2) MX2020006409A (pt)
RU (2) RU2020121782A (pt)
SG (2) SG11202005771PA (pt)
WO (2) WO2019122445A1 (pt)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201710835D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Antibodies
GB201710836D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
GB201710838D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc Bispecific antibodies
GB201721802D0 (en) * 2017-12-22 2018-02-07 Almac Discovery Ltd Ror1-specific antigen binding molecules
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
JPWO2020026987A1 (ja) * 2018-08-01 2021-08-19 国立大学法人東海国立大学機構 抗ｒｏｒ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、遺伝子、薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物
EP3636284A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-15 NBE Therapeutics AG Binding protein-toxin conjugates comprising anthracyclines, and use thereof in immune-oncological applications
WO2020127993A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Vib Vzw Fusion protein with a toxin and scaffold protein
MX2021009239A (es) * 2019-02-01 2021-11-12 Velosbio Inc Tratamiento contra el cáncer con inmunoconjugados de anticuerpos ror1.
GB201908886D0 (en) 2019-06-20 2019-08-07 Almac Discovery Ltd Anthracycline derivatives
GB202020152D0 (en) * 2020-12-18 2021-02-03 Elasmogen Ltd Fast-track humanisation of specific binding molecules
GB202020154D0 (en) * 2020-12-18 2021-02-03 Almac Discovery Ltd ROR1-specific variant antigen binding molecules
CA3211803A1 (en) * 2021-02-27 2022-09-01 Eluminex Biosciences (Suzhou) Limited Antibody fusion proteins targeting il-6 receptor and angiogenic factors
AU2022376953A1 (en) 2021-10-28 2024-05-02 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells expressing ror1-binding protein
CN114044823B (zh) * 2021-11-05 2022-07-05 深圳市人民医院 靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用
CN116333117B (zh) * 2021-12-16 2024-04-26 徕特康(苏州)生物制药有限公司 抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途
CN116333118B (zh) * 2021-12-16 2024-04-19 徕特康(苏州)生物制药有限公司 抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途
GB202209196D0 (en) * 2022-06-22 2022-08-10 Almac Discovery Ltd Bi-specific antigen binding molecules
WO2023247729A1 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 Almac Discovery Limited Ror1/egfr bi-specific antigen binding molecules
WO2024008112A1 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Nona Biosciences (Suzhou) Co., Ltd. Anti-ror1 antibodies
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2277913A3 (en) 2001-08-10 2012-08-08 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
DK1651664T3 (da) 2003-08-05 2009-08-24 Almac Sciences Scotland Ltd Ligeringsfremgangsmåde
CA2624781A1 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Ablynx N.V. Nanobodies tm and polypeptides against egfr and igf-ir
US9316646B2 (en) 2009-04-23 2016-04-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-human ROR1 antibodies
US20120282177A1 (en) 2009-11-02 2012-11-08 Christian Rohlff ROR1 as Therapeutic and Diagnostic Target
WO2011079902A2 (en) 2009-12-18 2011-07-07 Biolnvent International Ab Biological materials and uses thereof
JP5870400B2 (ja) * 2010-04-15 2016-03-01 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 標的化ピロロベンゾジアゼピンコンジュゲート
EP2646469B1 (en) 2010-12-01 2017-11-01 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Chimeric rabbit/human ror1 antibodies
DK2663579T3 (en) 2011-01-14 2017-07-31 Univ California THERAPEUTIC ANTIBODIES AGAINST ROR-1 PROTEIN AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
EP3594245A1 (en) * 2012-02-13 2020-01-15 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
AU2013257848A1 (en) * 2012-05-07 2014-11-27 The University Court Of The University Of Aberdeen Single domain binding molecule
EP2869849A1 (en) * 2012-07-09 2015-05-13 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
WO2014028776A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 Zyngenia, Inc. Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
EP3838923B1 (en) * 2012-08-24 2024-05-01 The Regents of The University of California Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
KR20150128997A (ko) * 2013-03-15 2015-11-18 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 면역치료용 조성물 및 방법
WO2014173975A1 (en) * 2013-04-23 2014-10-30 The University Court Of The University Of Aberdeen Isolation of therapeutic target specific vnar domains to icosl
US10526406B2 (en) * 2014-01-14 2020-01-07 Cellectis Chimeric antigen receptor using antigen recognition domains derived from cartilaginous fish
EP3160995A2 (en) * 2014-06-26 2017-05-03 Ossianix Inc. Semi-synthetic nurse shark vnar libraries for making and using selective binding compounds
EP3194432B1 (en) * 2014-07-31 2019-04-10 Cellectis Ror1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
EP3204416A1 (en) * 2014-10-09 2017-08-16 EngMab AG Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer
CN106999704B (zh) 2014-12-12 2020-06-19 美国圣戈班性能塑料公司 Ir管件密封机及密封管件的方法
CN114920848A (zh) * 2015-05-13 2022-08-19 埃博灵克斯股份有限公司 基于cd3反应性的t细胞募集多肽
US20180147271A1 (en) * 2015-05-18 2018-05-31 Bluebird Bio, Inc. Anti-ror1 chimeric antigen receptors
EP3842072A1 (en) * 2015-05-18 2021-06-30 Eureka Therapeutics, Inc. Anti-ror1 antibodies
BR112018014615A2 (pt) * 2016-01-20 2018-12-11 The Scripps Research Institute composições de anticorpo para ror1 e métodos relacionados
WO2017127499A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 Janssen Biotech, Inc. Anti-ror1 antibodies, ror1 x cd3 bispecific antibodies, and methods of using the same
WO2017133175A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered mammalian cells for cancer therapy
US20170233472A1 (en) * 2016-02-17 2017-08-17 Macrogenics, Inc. ROR1-Binding Molecules, and Methods of Use Thereof
WO2017156479A1 (en) * 2016-03-11 2017-09-14 Bluebird Bio, Inc. Ror1 chimeric antigen receptors
WO2017196847A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Variable new antigen receptor (vnar) antibodies and antibody conjugates targeting tumor and viral antigens
BR112019024654A2 (pt) * 2017-05-23 2020-06-09 Dragonfly Therapeutics Inc proteína de ligação nkg2d, cd16 e ror1 ou ror2
GB201721802D0 (en) * 2017-12-22 2018-02-07 Almac Discovery Ltd Ror1-specific antigen binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
IL275483A (en) 2020-08-31
BR112020012463A2 (pt) 2020-11-24
JP2021508458A (ja) 2021-03-11
SG11202005771PA (en) 2020-07-29
WO2019122447A1 (en) 2019-06-27
JP2021509014A (ja) 2021-03-18
AU2018391026A1 (en) 2020-07-16
KR20200104328A (ko) 2020-09-03
SG11202005774QA (en) 2020-07-29
RU2020121782A (ru) 2022-01-24
GB201721802D0 (en) 2018-02-07
WO2019122445A1 (en) 2019-06-27
MX2020006409A (es) 2021-01-08
RU2020121784A (ru) 2022-01-26
CA3086795A1 (en) 2019-06-27
EP3727433A1 (en) 2020-10-28
EP3728320A1 (en) 2020-10-28
US20210317204A1 (en) 2021-10-14
CN112074534A (zh) 2020-12-11
KR20200104329A (ko) 2020-09-03
US20230203155A1 (en) 2023-06-29
AU2018387855A1 (en) 2020-07-09
CN111670045A (zh) 2020-09-15
MX2020006408A (es) 2020-11-06
IL275510A (en) 2020-08-31
CA3086760A1 (en) 2019-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020012464A2 (pt) molécula de ligação ao antígeno biespecífica; proteína de fusão recombinante, receptor de antígeno quimérico, célula, sequência de ácidos nucleicos, vetor, célula hospedeira, método para preparar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína de fusão recombinante ou receptor de antígeno quimérico, composição farmacêutica, uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, método para tratamento de uma doença em um paciente que necessita de tratamento, método para avaliar a presença de um analito-alvo em uma amostra, método para imageamento de um sítio de doença em um indivíduo, método para diagnóstico de uma doença ou afecção médica em um indivíduo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno, kit e método para diagnóstico de um indivíduo que sofre de câncer, ou uma predisposição para o mesmo, ou para fornecer um prognóstico da afecção de um indivíduo, método para eliminar ou inibir o crescimento de uma célula que expressa ror1 e egfr in vitro ou em um paciente
JP7000660B2 (ja) Ｒｏｒ１抗体組成物及び関連の方法
ES2861925T3 (es) Anticuerpos que se dirigen al antígeno de maduración de células B y métodos de uso
US20220380471A1 (en) High affinity nanobodies targeting b7-h3 (cd276) for treating multiple solid tumors
BRPI0707824A2 (pt) proteÍna de ligaÇço a antÍgeno, e, mÉtodos de neutralizaÇço da ativaÇço de um receptor de tirosina quinase, de inibiÇço de angiogÊnese, de reduÇço de crescimento de tumor e de produÇço de uma proteÍna de ligaÇço a antÍgeno
JP2023540526A (ja) ネクチン－４抗体およびそれの使用
CN111148759A (zh) 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白
JP2023539501A (ja) 抗ｖｅｇｆ－抗ｐｄ－ｌ１二重特異性抗体、その医薬組成物およびその使用
CN114786720A (zh) TriAx抗体的组合物及其制备和使用方法
CN111548417B (zh) EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用
US20220298260A1 (en) Antigen-binding protein constructs and uses thereof
US20220313845A1 (en) Antigen-binding protein constructs and uses thereof
TW201102086A (en) Antibodies against human CCN1 and uses thereof
WO2016059057A1 (en) Vegfr-2 binding polypeptides
WO2016059068A1 (en) Vegfr-2 binding polypeptides
US20220348679A1 (en) Antigen-binding protein constructs and uses thereof
EP4342914A1 (en) Anti-bcam antibody or antigen-binding fragment thereof
WO2023236844A1 (zh) 靶向her2和pd-l1的双特异性抗体及其制备方法和应用
JP2024521545A (ja) 抗ｂｃａｍ抗体又はその抗原結合フラグメント
TW202413422A (zh) 抗體、其抗原結合片段及其藥物用途
US8597655B2 (en) Recombinant fusion protein and polynucleotide construct for immunotoxin production

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]