CN106856656B - 一种稳定型抗体药物耦联物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

一种偶联物及其制备方法、包含所述偶联物的药物组合物、以及该药物组合物在用于制备治疗或预防疾病的药物中的用途。

Description

一种稳定型抗体药物耦联物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物制药及生物技术领域，具体涉及新型的具有耦联功能的连接子(linker，又称耦联剂)，新型的具有开环稳定结构的连接子－细胞毒素中间物及其制备，及其应用于小分子化合物、核酸、核酸类似物、示踪分子等以位点特异的方式稳定地耦联到蛋白质、多肽的C端的方法。本发明涉及的连接子及耦联方法可用于制备肿瘤靶向治疗的ADC药物、靶向示踪诊断试剂和特定细胞种类高效投送试剂等。采用本发明所制得ADC药物具有稳定的开环结构、特定的载药量、可重复的药代动力学数据。从根本上解决了困扰ADC药物的稳定性及异质性两大问题。具体涉及新型抗人ErbB2/Her2抗体－美登木素衍生物耦联物、新型抗人ErbB2/Her2抗体－奥利斯达汀衍生物耦联物、制备方法及其用于ErbB2/Her2阳性肿瘤的靶向治疗。
发明背景
抗体药物耦联物(Antibody-Drug Conjugates,ADC)是在单克隆抗体药物基础上研发的新一代兼具抗体的靶向作用和传统细胞毒药物的强效抗肿瘤药物。2011年美国FDA批准ADC药物Adcetris(brentuximab vedotin)用于霍奇金淋巴瘤的治疗，2013年Kadcyla(ado-trastuzumab emtansine)获准用于晚期转移性乳腺癌的治疗。截至到2015年4月，全球有约50个候选ADC候选药物处于临床I，II，III期。
ADC药物的作用机制如下：抗体或抗体类配体特异性识别细胞表面某种抗原并与之结合；形成的结合物以内吞方式进入细胞内，同时将小分子药物带入；抗体被酶解或连接子自身断裂，小分子药物以适当的活性形式释放到细胞内，杀死目标细胞。ADC药物采用的小分子细胞毒性药物活性非常高，通常比目前应用于临床一线的化疗药物活性高10－1000倍。
ADC药物由抗体(antibody)、连接子(linker)和细胞毒素(toxin)三部分组成。其中，抗体决定药物作用的细胞类型和靶点；细胞毒素可以是可致细胞死亡、引诱细胞凋亡或减少细胞生存力的任何化合物；而连接子则是将两者有机结合的桥梁，是ADC药物设计的最核心部分，是实现靶向释药的关键。
ADC药物采用的连接子分为可断裂型及不可断裂型两种。理想的连接子需要满足以下要求：在细胞外具有足够的稳定性，保证小分子药物不与配体脱离；进入细胞后，可断裂的连接子在适当条件下断裂，释放出活性小分子药物；对于不可断裂的连接子，活性成分则由小分子、连接子，以及由配体酶解产生的氨基酸残基构成。
连接子连接抗体与小分子细胞毒素。细胞毒素如果在未到达靶点就脱落，一方面会对正常组织造成毒性，另一方面也减低了到达靶点的ADC药物的效能。因此，在ADC药物的研发中，连接子和耦联策略的设计极为关键，不仅对ADC药物的稳定性起关键作用，还可以直接影响耦联物的生物活性、聚合状态、生物利用度和体内分布及代谢。目前已上市的及处于临床期的ADC药物中，连接子的结构及耦联策略多数源自Seattle Genetics和Immunogen两家公司。它们的耦联策略略有不同，但二者都是通过巯基(thiol)与马来酰亚胺(maleimide)所形成的硫代琥珀酰亚胺结构(thiosuccinimide linkage)将小分子药物与靶向抗体蛋白连接起来(图1)；由于这种耦联反应具有快速、定量且条件温和等优势，应用非常广泛(Hermanson GT,Bioconjugate Techniques.2nd edition,2008)。但遗憾的是硫代琥珀酰亚胺结构并不稳定，在生物体内会与其它巯基进行可逆交换，称为马来酰亚胺去除反应(maleimide elimination reaction)。体内的半胱氨酸(cysteine)，谷胱甘肽(glutathione)及白蛋白(albumin)提供了很高浓度的巯基，这些巯基可以捕捉硫代琥珀酰亚胺结构中的琥珀酰亚胺环(succinimide ring)并与ADC药物中的巯基进行交换。这种巯基的交换反应直接导致ADC药物中的抗体与细胞毒素的分离(Alley SC et al.,Bioconjug.Chem.2008；Shen BQ etal.,Nat.Biotechnol.30,184-189,2012；ChudasamaVL,et al.,Clin.Pharmacol.Ther.92,520-527,2012)。
前期基于琥珀酰亚胺的化学研究发现，硫代琥珀酰亚胺结构可以通过促进水解反应开环(ring-open hydrolysis)。开环后硫代琥珀酰胺结构无法与体内的巯基实施交换反应(图1,开环反应示意图)，从而提高了ADC药物的体内稳定性。传统化学手段中可选的开环条件有：碱性条件处理、钼酸盐处理等(Kalia J等，2007)，但这些条件无法直接应用于ADC药物中琥珀酰亚胺环的开环反应，这是由于上述处理条件过于剧烈，会对蛋白质(抗体)造成严重的不可逆损伤，因此条件无法直接应用于ADC药物中琥珀酰亚胺环的开环反应。
为了解决这个问题，业界进行了不懈的努力，尝试各种解决办法。例如：Genentech公司通过筛选抗体表面结构与化学特性适宜的位置作为细胞毒素耦联位点，可加速硫代琥珀酰亚胺的开环水解反应(Shen BQ et al.,Nat.Biotechnol.30,184-189,2012)；SeattleGenetics公司通过diaminopropionic acid(DPR)在连接子的马来酰亚胺(maleimide)相邻位置引入碱性的氨基，从而促进ADC药物中硫代琥珀酰亚胺结构的快速水解(Lyon RP etal.,Nat Biotechnol.2014Oct；32(10):1059-62；US2013/0309256A1)；Pfizer公司开发的使用较温和的弱碱性硼酸盐缓冲液(Borate buffer)促进硫代琥珀酰亚胺结构水解(TumeyLN,et al.，Bioconjugate Chem.2014,(25):1871-1880)。以上策略都可以在一定程度上促进硫代琥珀酰亚胺结构的水解，从而稳定ADC药物，但它们都存在同样的问题：水解过程必须在抗体与细胞毒素耦联后进行，这使得ADC药物制备工艺多了额外的开环步骤，更为繁复，增加了抗体受损失去活性的风险；更为重要的是，因水解过程在抗体与细胞毒素耦联后进行，对于硫代琥珀酰亚胺结构水解程度完全无法精确控制，质量控制标准很难制定。
以上策略都是对利用抗体的半胱氨酸(cysteine)作为耦联位点而开发的。而对于利用抗体的赖氨酸(lysine)作为耦联位点，且细胞毒素含有可用于耦联的巯基的情形(例如已上市药物Kadcyla，采用了Immunogen公司的DM1分子及相应SMCC连接子)，细胞毒素很容易被体内丰富的半胱氨酸(cysteine)，谷胱甘肽(glutathione)及白蛋白(albumin)提供的巯基置换，目前还没有任何有效的办法主动促进连接子结构中硫代琥珀酰亚胺的开环水解反应，细胞毒素的脱落在体内处于不可控状态，给用药安全留下隐患。
当前的主流耦联技术主要基于化学耦联方法，主要依赖抗体分子中的lysine或cysteine。由于抗体中可与连接子发生化学反应的氨基酸的数目和位置的多样性，导致ADC药物中实际耦联的细胞毒化合物数目及结合位点不确定，所获得的ADC药物呈现异质性，必然影响ADC药物的质量、稳定性、有效性、代谢和毒性。以2013年上市的ADC药物Kadcyla为例，其说明书标明：每个抗体分子所耦联的细胞毒化合物数目为0-8，平均值n约为3.5。解决ADC药物的异质性问题已成为新一代ADC药物研发的主要目标和巨大挑战。
ErbB2/Her2抗原是包括人在内的哺乳动物表皮生长因子受体跨膜受体家族的成员之一，在大约20％的乳腺癌和16％的胃癌细胞表面高表达(Slamon等1987,Science,Vol235:177-182)。人源化单克隆抗体Trastuzumab(商品名Herceptin)可选择性地与人ErbB2/Her2抗原的胞外区域高亲和力结合(Kd＝5nM)，抑制肿瘤细胞的增殖和生长(Hudziak等1989，Mol.Cell Biol.,Vol 9:1165-1172；Lewis等1993，CancerImmuno.Immunother.,Vol 37:255-263；Baselga等1998,CancerRes.,Vol 58:2825-2831)。Herceptin用于ErbB2/Her2阳性肿瘤患者的治疗取得了比单独化疗更为显著的效果，获得了巨大的商业成功。但随着Herceptin的广泛应用，部分患者对Herceptin治疗的不响应或响应不足等问题逐渐凸现出来。
发明内容
本发明涉及新型的耦联功能连接子(linker，又称耦联剂)，连接子－装载物质(payload)中间物、及其开环反应和制备方法。本发明还涉及以位点特异性的方式将蛋白质、多肽的C端稳定地耦联到连接子-装载物质中间物形成的耦联物、及其制备方法。本发明还涉及包含所述耦联物的药物组合物。本发明还涉及所述耦联物或包含所述耦联物的药物组合物在治疗或预防疾病方面的用途。
一方面，本发明提供了一种结构如式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure GDA0002766902420000041
Figure GDA0002766902420000051
Figure GDA0002766902420000052
Figure GDA0002766902420000053
其中，PCA为连接酶的特异底物识别序列。所述连接酶是能催化两种分子以一种新的化学键结合在一起的酶。在某些实施方式中，所述连接酶是指转肽酶，包括但不限于各种天然Sortase酶及经过优选改造的各种新型转肽酶。在某些实施方式中，所述Sortase酶为Sortase A或Sortase B。在某些实施方式中，PCA为连接酶受体底物的特异识别序列。在某些实施方式中，PCA包括至少1个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。在某些实施方式中，PCA包括1-100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。优选地，PCA包括1-50个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。更优选地，PCA包括1-20个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。更优选地，PCA包括5个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。更优选地，PCA包括3个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。
LA1、LA2为连接区，a、p独立地为0或1，即，LA1和LA2可独立地存在或不存在。LA1是PCA与CCA’的衔接部分，LA2是-S-基团与Y的衔接部分。CCA’为化学耦联区。
Figure GDA0002766902420000061
表示单键或双键。在某些实施方式中，
Figure GDA0002766902420000062
表示单键。
Y为装载物质，其选自下组：核酸序列、短肽序列、多肽、蛋白质、小分子化合物和生物物质。在某些实施方式中，Y为核酸序列、核酸类似物、标记、标签或药物等。在某些实施方式中，Y为放射性标记、荧光标记、亲和纯化标签、示踪分子或小分子化合物等。在某些实施方式中，Y为细胞毒素。在某些实施方式中，Y为美登木素或其衍生物、奥利斯达汀(Auristatin)或其衍生物、埃博霉素或其类似物、紫杉醇或其衍生物、或长春碱类化合物等。在某些实施方式中，Y为美登木素或其衍生物。
z为1到1000之间的任一整数。优选地，z为1到100、1到50、1到40、1到30、1到20、1到10、1到5之间的任一整数。
在某些实施方式中，本发明提供了如下所示的化合物：
Figure GDA0002766902420000071
Figure GDA0002766902420000072
Figure GDA0002766902420000073
Figure GDA0002766902420000081
Figure GDA0002766902420000091
Figure GDA0002766902420000101
Figure GDA0002766902420000111
Figure GDA0002766902420000121
Figure GDA0002766902420000131
Figure GDA0002766902420000141
其中n表示1-100之间的任一整数，例如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20等。m为0或1－1000之间的任一整数，例如m可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100等。
另一方面，本发明提供了一种包含一种或多种上述化合物的组合物，其由以下步骤制备：
A)将Y溶液与
Figure GDA0002766902420000151
溶液混合，孵育，得到耦联物
Figure GDA0002766902420000152
溶液；
或者
将Y溶液与
Figure GDA0002766902420000153
溶液混合，孵育，得到耦联物
Figure GDA0002766902420000154
溶液，在这种情况下，Y上连有-S-(LA2)p基团；
或者
将Y溶液与
Figure GDA0002766902420000161
溶液混合，孵育，得到
Figure GDA0002766902420000162
溶液；
或者
将Y溶液与
Figure GDA0002766902420000163
溶液混合，孵育，得到耦联物
Figure GDA0002766902420000164
溶液，在这种情况下，Y上连有
Figure GDA0002766902420000165
基团；
B)向步骤A)中制备得到的耦联物
Figure GDA0002766902420000171
溶液或
Figure GDA0002766902420000172
溶液中加入三羟甲基氨基甲烷碱溶液或其他促进开环反应的溶液。
在某些实施方式中，上述步骤进一步包括将制备得到的产物经HPLC纯化。在某些实施方式中，上述步骤进一步包括将制备得到的产物经半制备型/制备型HPLC纯化。在某些实施方式中，根据上述步骤制备得到的组合物中的如式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示化合物的总含量超过50％摩尔百分比，例如超过60％摩尔百分比、70％摩尔百分比、80％摩尔百分比、85％摩尔百分比、90％摩尔百分比、95％摩尔百分比、99％摩尔百分比或更多。
另一方面，本发明还提供了一种结构如式(V)、(VI)、(VII)或式(VIII)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure GDA0002766902420000181
Figure GDA0002766902420000191
其中，A为蛋白质、肽、信号转导因子、细胞增殖因子、免疫球蛋白或抗体。在某些实施方式中，所述抗体为重组制备的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段及类抗体(如Fab，ScFv，minibody，diabody，nanobody等)。在某些实施方式中，A为抗ErbB2/Her2抗体。在某些实施方式中，如本发明式(V)、式(VI)、式(VII)或式(VIII)所示的化合物能够特异地结合Her2受体的胞外结构域并抑制ErbB2/Her2受体阳性的肿瘤细胞的生长。
LA1、LA2和LA3分别独立地为连接区。LA1是PCA与CCA’的衔接部分，LA2是-S-基团与Y的衔接部分，LA3是A与F的衔接部分。LA3包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；优选地，LA3包括1-50个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。更优选地，LA3包括1-20个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。更优选地，LA3包括5个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。a、b和p分别独立地为0或1，即，LA1、LA2和LA3可独立地存在或不存在。
PCA和F分别为连接酶的特异识别序列，在所述连接酶的作用下，PCA能与F特异性结合。所述连接酶包括但不限于各种天然Sortase酶及经过优选改造的各种新型转肽酶。在某些实施方式中，所述Sortase酶为Sortase A或Sortase B。在某些实施方式中，F为连接酶供体底物的特异识别序列，PCA为连接酶受体底物的特异识别序列。在某些实施方式中，F为连接酶受体底物的特异识别序列，PCA为连接酶供体底物的特异识别序列。在某些实施方式中，在某些实施方式中，PCA包括至少1个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。在某些实施方式中，PCA包括1-100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。优选地，PCA包括1-50个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。更优选地，PCA包括1-20个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。更优选地，PCA包括5个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。在某些实施方式中，F通过LA3或直接以共价键定点连接于A重链或轻链的C末端。在某些实施方式中，F为X1X2X3TX4X5，其中X1为亮氨酸或天冬酰胺，X2为脯氨酸或丙氨酸，X3为任何天然或非天然的氨基酸，T为苏氨酸，X4代表甘氨酸、丝氨酸或天冬酰胺或不存在，X5为任何天然或非天然的氨基酸或不存在。在某些实施方式中，F为LPX3T或LPX3TGG，其中L为亮氨酸，P为脯氨酸，X3为任何天然或非天然的氨基酸，T为苏氨酸，G为甘氨酸。
CCA’为化学耦联区。
Figure GDA0002766902420000201
表示单键或双键。在某些实施方式中，
Figure GDA0002766902420000202
表示单键。
Y为装载物质，其选自下组：氢、核酸序列、短肽序列、多肽、蛋白质、化合物和生物物质。在某些实施方式中，Y为核酸序列、核酸类似物、标记、标签或药物等。在某些实施方式中，Y为放射性标记、荧光标记、亲和纯化标签、示踪分子或小分子化合物等。在某些实施方式中，Y为细胞毒素。在某些实施方式中，Y为美登木素或其衍生物、奥利斯达汀(Auristatin)或其衍生物、埃博霉素或其类似物、紫杉醇或其衍生物、或长春碱类化合物等。在某些实施方式中，Y为美登木素或其衍生物。
z为1到1000之间的任一整数。优选地，z为1到100、1到50、1到40、1到30、1到20、1到10、1到5之间的任一整数。d为1到20之间的任一整数，例如d可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等。
在某些实施方式中，本发明提供了如下所示的化合物：
Figure GDA0002766902420000211
Figure GDA0002766902420000221
Figure GDA0002766902420000231
Figure GDA0002766902420000241
Figure GDA0002766902420000251
Figure GDA0002766902420000261
其中n表示1-100之间的任一整数，m为0或1－1000之间的任一整数，d表示1－20之间的任一整数，LA3包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；b独立地为0或1，即，LA3可独立地存在或不存在。
另一方面，本发明提供了一种包含以上化合物的组合物，其由以下步骤制备：
i)制备如式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的化合物；
ii)制备A-(LA3)b-F；
iii)在存在连接酶的情况下，在适宜连接酶作用的条件下，将步骤ii)中制备得到的A-(LA3)b-F与如式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的化合物耦合。
在某些实施方式中，根据上述步骤制备得到的组合物中的如式(V)、式(VI)、式(VII)或式(VIII)所示化合物的总含量超过50％摩尔百分比，例如超过60％摩尔百分比、70％摩尔百分比、80％摩尔百分比、85％摩尔百分比、90％摩尔百分比、95％摩尔百分比、99％摩尔百分比或更多。
另一方面，本发明提供了一种抑制动物中细胞增殖的方法，包括用本发明所述化合物或组合物处理所述动物。在某些实施方式中，所述动物为哺乳动物。在某些实施方式中，所述动物为人。
另一方面，本发明提供了本发明所述的化合物在制备用于治疗或预防人类疾病的药物中的用途。在某些实施方式中，所述疾病包括肿瘤和自身免疫疾病。在某些实施方式中，所述肿瘤的细胞表面具有识别并结合所述化合物或组合物的特异抗原或受体蛋白。在某些实施方式中，所述肿瘤的细胞表面的特异抗原或受体蛋白为ErbB2/Her2。在某些实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌或者食管癌。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如式(V)、式(VI)、式(VII)、或式(VIII)所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。在某些实施方式中，所述药物组合物为冻干粉针剂或注射液。
本发明提供了一个完善的耦联系统，解决目前ADC药物连接子不稳定及异质性的问题。本发明提供的解决方案同时也可应用于靶向核酸药物制备，靶向示踪诊断试剂制备等方面。本发明包括一系列连接子及其制备方法、连接子－细胞毒素中间物(Linker－Payload intermediate)及其制备方法、开环稳定形式的连接子－细胞毒素中间物及其制备方法。本发明包括一系列经过基因工程手段改造的基于Herceptin或其他抗人ErbB2/Her2的抗体、连接子(Linker)以及经过修饰的美登木素及衍生物或奥利斯达汀(Auristatin)衍生物MMAE在LDC专有技术平台上耦联形成的新一代ADC药物及其制备方法和用途。
本发明使用独特的连接酶催化耦联技术(Ligase dependent conjugation,LDC)进行ADC药物的制备，如图2所示。此处连接酶是指转肽酶，包括但不限于各种天然Sortase酶(包括A,B,C,D,L.plantarum的Sortase等，详见专利US20110321183A1)及经过优选改造的各种新型转肽酶。耦联反应通过生物酶催化手段实现，反应条件温和，降低了耦联过程对抗体的物理、化学损伤，制备工艺与流程更为优化，易于产业化升级，有利于ADC产品的质量控制。
LDC技术的核心优势是，利用生物酶催化手段，一步催化反应将连接子－细胞毒素中间物高效地耦联在抗体特定位点，从而保证了所制备ADC药物的高度均质性。在制备连接子—细胞毒素中间物的过程中进行琥珀酰亚胺环的开环反应，不涉及大分子抗体。这种方法具有两方面的优势：一方面开环反应是在小分子化合物状态进行，其开环水解条件对比抗体与细胞毒素耦联后的水解条件可以有更多灵活多样的选择，不用担心抗体蛋白损伤的问题；另一方面，即使连接子－细胞毒素分子中琥珀酰亚胺环的开环反应不完全，开环产物很容易与未开环产物通过HPLC等常规分离手段进行分离，从而得到高度纯化的开环产物。
本发明适用于任何含有硫代琥珀酰亚胺结构的ADC药物，靶向核酸药物及靶向示踪剂的稳定制备。
1.连接子(Linker)
本发明涉及一系列具有双向连接功能的连接子，其特征在于，由蛋白耦联区(Protein Conjugation Area，PCA)，连接区1(Linker Area1,LA1)以及化学耦联区(Chemical Conjugation Area,CCA)3部分组成，结构示意为
PCA－(LA1)a－CCA
其中PCA可以为Sortase A酶的适宜的受体底物，包括但不限于寡聚甘氨酸(Gly)序列Gn(n通常为1－100)，其C端氨基酸的α位羧基应用于与LA耦联；式中PCA也可以为其他Sortase酶或改造优选酶的适宜的受体底物，如寡聚丙氨酸(Ala)序列或者寡聚甘氨酸/丙氨酸混合序列。
LA1是PCA与CCA的衔接部，a为0或1，即指，LA1可存在或不存在。LA1结构如下所示：
Figure GDA0002766902420000281
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10是相同的或者不同的，并且是H、具有1-6个碳原子的线性烷基、具有3至6个碳原子的支化或环状烷基、具有2至6个碳原子的线性、支化或环状烯基或炔基、选自阴离子和阳离子的带电荷取代基—所述阴离子选自SO3-、X-SO3-、OPO32-、X-OPO32-、PO32-、X-PO32-、CO2-和所述阳离子选自含氮杂环、N+R11R12R13或X-N+R11R12R13、或苯基，其中：R11、R12和R13是相同的或者不同的，并且是H、具有1-6个碳原子的线性烷基或具有3至6个碳原子的支化或环状烷基；
α、β和γ是0或1至4的整数；
B是苯基或取代的苯基，其中取代基是具有1至6个碳原子的线性烷基、或具有3至6个碳原子的支化或环状烷基、或者选自阴离子和阳离子的带电荷取代基——所述阴离子选自SO3-、X-SO3-、OPO32-、X-OPO32-、PO32-、X-PO32-、CO2-和所述阳离子选自含氮杂环、N+R11R12R13或X-N+R11R12R13，其中X具有与以上相同的定义，和其中y是0或1；P是式(OCH2CH2)z的任选的聚乙二醇单元，其中z是0或者1至1000的整数。
本发明中的LA2既可以与LA1具有相同的定义，也可以是一段由天然氨基酸及非天然氨基酸通过酰胺键形成的肽或类肽，还可以是上述两种定义的适当组合。LA3包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。
CCA包括CCA’和含有适当的官能团，可通过酰胺键、二硫键、硫醚键、硫酯键、肽键、腙键、酯键、醚键或氨基甲酸酯键与小分子化合物、核酸分子、示踪分子等共价耦联。优选的化学基团包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯(适于与伯胺反应)；马来酰亚胺基(适于与巯基进行反应)；二硫代吡啶基(pyridyldithio)(适于与巯基起反应形成二硫键)；以及卤代烷基(alkylhalide)或卤代乙酰基(haloacetyl)(适于与巯基反应)；异氰酸酯基(isocyanate)(适于与羟基进行反应)。
本发明中连接子的一类优选的CCA1包含有一段肽序列(通过α位胺基与羧基缩合反应形成酰胺键)，其中必定含有赖氨酸(Lysine)(数目1－100)，此肽段N端的氨基酸的α位胺基与LA(或直接与PCA)形成酰胺键。依据预期耦联数目的需要，一方面寡聚赖氨酸链上的ε位胺基可直接通过适当的双功能交联剂(Heterobifunctional cross-linkers)引入马来酰亚胺基官能团；另一方面ε位胺基可用于与另外的赖氨酸的α位羧基形成酰胺键，形成支链，进而支链的赖氨酸的α位及ε位胺基可直接通过适当的双功能交联剂引入马来酰亚胺基官能团。以此类推，通过增加主链寡聚赖氨酸数目及拓展侧链赖氨酸的分支结构，可使此类CCA1分子中引入的官能团数目实现1-1000。优选的可引入马来酰亚胺基官能团的双功能交联试剂包括但不限于，包含马来酰亚胺基的交联试剂有4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(N-Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,SMCC)、SMCC的“长链”类似物N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(N-[alpha-maleimidoacetoxy]Succinimide ester,AMAS)、4-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(N-gamma-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester,GMBS)、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(3-MaleiMidobenzoic acid N-hydroxysucciniMide ester,MBS)、ε-马来酰亚胺基己酸琥珀酰亚胺酯(6-maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester,EMCS)、4-(4-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(N-SucciniMidyl 4-(4-MaleiMidophenyl)butyrate,SMPB)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯(Succinimidyl 6-[(beta-maleimidopropionamido)hexanoate,SMPH]、琥珀酰亚胺基-[4-(N-马来酰亚胺甲基)]-环己烷-1-甲酸-(6-氨基己酸酯)(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate),LC-SMCC)、11-马来酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺基酯(N-Succinimidyl 11-(maleimido)undecanoate,KMUS)、包含N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)n-马来酰亚胺的双功能交联剂(SM(PEG)n)，此处n代表2，4，6，8，12或24个聚乙二醇(PEG)单位。
满足以上要求的连接子，优选的分子示例如图3－6所示，但不限于此。上述连接子1，2，3，4都具有马来酰亚胺结构，可与任何含有巯基的物质(见下面‘装载物质’)快速量化地完成耦联，形成硫代琥珀酰亚胺结构。
本发明中连接子中另一类优选的CCA2含有寡聚半胱氨酸(Cysteine)序列(Cysteine数目1－100，通过α位胺基与羧基缩合反应形成酰胺键)，N端半胱氨酸通过其α位胺基与LA(或直接与PCA)形成酰胺键，其侧链巯基则可与包含马来酰亚胺官能团的分子耦联。
满足以上要求的连接子，优选的分子示例如图7-10所示，但不限于此。
本发明所述连接子，皆可通过常规的多肽固相合成方法加上适当调整实现，由以下步骤组成：
(1)树脂的选择：对于C-末端为酰胺的序列合成采用Rink amide-MBHA Resin为载体，对于C-末端为羧酸的序列使用王树脂。
(2)树脂的溶胀：根据合成的目标摩尔数计算用于反应的树脂，加入DCM浸泡过的反应柱中，以DCM洗涤2次后，加入能浸没全部树脂的DMF浸泡30min，以使其充分溶胀。
(3)Fmoc的脱除：用20％哌淀的DMF溶液，氮气保护下反应10min，然后压滤除去，再加入上述溶液反应5min。用DCM洗涤树脂两次，DMF洗三次，而后用茚三酮法检测树脂应成深红棕色或深蓝色。
(4)氨基酸的连接：按照目标摩尔数2-4倍量称取需要缩合的下一个氨基酸，加入DMF使其刚好溶解。在此溶液中加入合适当量的缩合剂DIC或HBTU，活化5min。活化溶液加入反应柱中氮气保护下反应2h。用茚三酮法检测树脂，如仍有颜色应重复上述反应。如检验液接近无色表明反应完全，以DCM洗涤树脂两次，然后用DMF洗涤树脂三次。
(5)重复(3)(4)直到所有氨基酸全部连接完毕。最后一个氨基酸采用Boc保护。
(6)连接侧链SMCC或其他双功能分子：根据不同的Lys侧链保护基，采用不同的方法将其脱除。比如采用催化氢化脱Z，水合肼脱除ivDde。然后直接接入已活化的SMCC或其他双功能分子。如无需侧链修饰，则反应到此结束。
(7)树脂的处理与切割：反应结束后，用氮气将洗净的树脂复合物吹干，按照10ml/g树脂的量加入切割液(TFA/phenol/H20/thioanisole/EDT/TIS(80/5/5/5/3/2)，氮气保护下0-5℃搅拌反应2h。过滤，滤液加入30倍体积量的冰乙醚中，放置冰箱2h。离心收集沉淀，真空冷冻干燥即得粗肽。
(8)纯化及质谱鉴定：粗肽溶解于适当比例的乙腈水溶液，用反相色谱纯化至所需纯度，MS鉴定其分子量是否与理论值一致。
2.装载物质(payload)
本发明中的装载物质(payload)可为小分子化合物、核酸、核酸类似物、示踪分子等(包括caged放射性核素及荧光分子等)，小分子化合物中优选的是细胞毒素。
所述细胞毒素选自微管抑制剂如紫杉醇及其衍生物、美登木素及其衍生物、奥利斯达汀(Auristatin)及其衍生物、埃博霉素及其类似物、combretastatin A-4phosphate、Combretastatin A-4及其衍生物、吲哚-磺胺类化合物、长春碱类化合物如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)、长春甘酯(vinglycinate)、脱水长春碱(anhy-drovinblastine)、Dolastatins 10及其类似物、软海绵素B与eribulin、吲哚-3-草酰胺类化合物、取代吲哚-3-草酰、鬼臼毒素类化合物、7-二乙氨基-3-(2'-苯并噁唑基)-香豆素(DBC)、Discodermolide、Laulimalide；DNA拓扑异构酶抑制剂如喜树碱及其衍生物、米托蒽醌、米托胍腙；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、蛋氨氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素如烯二炔抗生素、达内霉素、埃斯培拉霉素、新制癌菌素、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素类、放线菌素C、卡拉比星、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、洋红霉素、防线菌素D、柔红霉素、地拖比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、依达曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、吉西他滨、依诺他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；单端孢霉烯类如T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和安归啶；吖丙啶类如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；铂类似物如顺铂、卡铂、奥沙利铂、米铂、依托泊苷；抗雄激素类如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；蛋白激酶及蛋白酶体抑制剂等。
本发明优选的细胞毒素是美登木素及其衍生物DM1、DM4以及奥利斯达汀(Auristatin)衍生物MMAE、MMAF、MMAD等。
3.连接子—细胞毒素中间物(Linker-toxin intermediate)及开环反应
上述含有CCA1的优选连接子，其CCA1中都含有马来酰亚胺环结构，可以与任何含巯基的分子形成硫代琥珀酰亚胺结构，含有巯基的物质包括小分子化合物、短肽、多肽、拟肽、蛋白质、核酸以及类核酸分子等。上述耦联中间物可充分利用琥珀酰亚胺环开环的条件进行处理，从而形成相应的开环稳定形式的中间物分子，结构式如下：
PCA－(LA1)a－CCA1open-Y
其中，CCA1open-Y都含有如下结构：
Figure GDA0002766902420000331
Figure GDA0002766902420000332
已有报道，马来酰亚胺的琥珀酰亚胺环在与巯基耦联过程中会形成硫代琥珀酰亚胺同分异构体。开环后的硫代琥珀酰胺结构也同样存在同分异构体，如式(IX)及式(X)所示，不影响活性。
本发明优选的连接子1，2，3，4分子的溶液分别与优选细胞毒素美登木素衍生物DM1的溶液混合孵育，可形成以下含有硫代琥珀酰亚胺结构的连接子－DM1中间物分子，其结构分别如图11-14所示。本发明优选连接子1，2，3，4分别与优选的细胞毒素DM1耦联后，经开环反应得到如图15-18所示的分子。开环反应可通过以下任意条件处理，但不限于此：0.1-0.5M Lys，0.1-0.5M Arg，0.1-0.5M Tris Base，0.1-0.5M碳酸氢钠，0.1-0.5M碳酸钠，0.1-0.5M硼酸钠，室温反应2-12h。优选以上条件，开环效率可达到10％，20％，30％，50％，60％，70％，80％，90％或接近100％。实施例中以连接子2－DM1中间物(n＝3)的开环为例，介绍了完整的制备流程。
重要的是，无论琥珀酰亚胺环开环反应产率高低，都可通过半制备/制备型HPLC或其他适宜的分离手段来完成开环中间物的高纯度制备，确保后续应用于耦联抗体(具体见实施例)。
上述含有CCA2的优选连接子，其CCA2中都含有巯基，可以与任何含马来酰亚胺的分子形成硫代琥珀酰亚胺结构，含有马来酰亚胺的物质包括小分子化合物、短肽、多肽、拟肽、蛋白质、核酸以及类核酸分子等。上述耦联中间物可充分利用琥珀酰亚胺环开环的条件进行处理，从而形成相应的开环稳定形式的中间物，结构式如下：
PCA－(LA1)a－CCA2open-Y
其中，CCA2 open-Y都含有如下结构：
Figure GDA0002766902420000341
Figure GDA0002766902420000351
已有报道，马来酰亚胺的琥珀酰亚胺环在与巯基耦联过程中会形成硫代琥珀酰亚胺同分异构体。开环后的硫代琥珀酰胺结构也同样存在同分异构体，如式(XI)及式(XII)所示，不影响活性。
上述连接子5，6，7，8分别与MC-VC-PAB-MMAE耦联，可形成以下含有硫代琥珀酰亚胺结构的连接子－MMAE中间物分子，其结构分别如图19-22所示，本发明所用的细胞毒素包括但不限于MMAE。本发明优选连接子5，6，7，8分别与优选的细胞毒素MMAE耦联后，经开环反应得到如下相应分子，结构分别如图23-26所示。开环反应可通过以下任意条件处理，但不限于此：0.1-0.5M Lys，0.1-0.5M Arg，0.1-0.5M Tris Base，0.1-0.5M碳酸氢钠，0.1-0.5M碳酸钠，0.1-0.5M硼酸钠，室温反应2-12h。优选以上条件，开环效率可达到10％，20％，30％，50％，60％，70％，80％，90％或接近100％。实施例13中以连接子5－MMAE中间物(n＝3)的开环为例，介绍了完整的制备流程。
重要的是，无论琥珀酰亚胺环开环反应产率高低，都可通过半制备/制备型HPLC或其他适宜的分离手段来完成开环中间物的高纯度制备，确保后续应用于耦联抗体。
4.抗体(Ab)
本发明中涉及的抗体指重组制备的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段及类抗体(如Fab，ScFv，minibody，diabody，nanobody等)。
本发明的抗体优选为一系列经过基因工程技术改造的重组抗体，其重链和/或轻链的C末端含有基于连接酶识别位点序列的特有修饰，此处连接酶是指转肽酶，包括但不限于各种天然Sortase酶(包括A，B，C，D，L.plantarum的Sortase等，详见专利US20110321183A1)及经过优选改造的各种新型转肽酶。连接酶识别位点可以是来源于Staphylococcus aureus的Sortase A酶的典型识别序列(LPXTG)，其中X可以是任何天然的或非天然的氨基酸；连接酶识别位点也可采用其他类型的Sortase酶的识别序列(Sortase酶的供体底物的识别序列，Staphylococcus aureus的Sortase B为NPQTN，Bacillusanthracis的Sortase B为NPKTG，Streptococcus pyogenes的Sortase A为LPXTG，Streptomyces coelicolor的Sortase subfamily5为LAXTG，Lactobacillus plantarum的Sortase为LPQTSEQ等)；连接酶识别位点也可以是其他经人工筛选后的优选转肽酶的全新的识别序列)。
本发明的抗体进一步优选为一系列经过基因工程技术改造的抗人ErbB2/HER2抗体，所述抗ErbB2/HER2抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段及类抗体等(如Fab，ScFv，minibody，diabody，nanobody等)。所述抗ErbB2/HER2抗体特异地结合ErbB2/HER2受体的胞外结构域，并在体内、体外抑制高表达Her2受体的肿瘤细胞的生长。
本发明进一步优选为基于Herceptin/Trastuzumab改造的抗ErbB2/HER2抗体组合。其所包含的轻链(light chain，LC)有野生型(LC)、C末端直接引入连接酶识别序列LPETGG的修饰(LCCT)、C末端引入短连接区(Gly-Ala)再加上连接酶识别序列LPETGG的修饰(LCCTL)3种类型；其所包含的重链(heavy chain，HC)有野生型(HC)、C末端直接引入连接酶识别序列LPETGG的修饰(HCCT)、C末端引入短连接区(Gly-Ala)再加上连接酶识别序列LPETGG的修饰(HCCTL)3种类型。以上重链与轻链的组合可形成3种优选的抗体分子。各种重、轻链组合共形成8种优选的抗体分子，氨基酸残基序列详见氨基酸序列表。
5.ADC药物的制备及质量控制
传统化学方式耦联制备的ADC药物连接位点不确定，产物的DAR(Drug AntibodyRatio)分布范围较广，成药异质性严重，且无法进一步纯化。本发明制备的ADC药物为位点特异耦联。
1)制备方法
步骤1，按照前述步骤制备式(I)及(II)、(III)及(IV)所示的适宜的连接子－细胞毒素开环中间物。无论琥珀酰亚胺环开环反应产率高低，通过半制备/制备型HPLC或其他适宜分离手段来完成开环中间物的高纯度分离、制备。
步骤2，基因工程改造的含有连接酶特异识别序列的重组抗体通过CHO细胞或其他合适的哺乳动物细胞培养体系进行表达与纯化。
步骤3，重组抗体(或类抗体)与连接子－细胞毒素开环中间物的耦联反应。轻链和/或重链C-端含有特异识别位点的重组抗体与连接子－细胞毒素中间物由适宜的连接酶(或连接酶组合)在适宜的催化反应条件下完成耦联反应。
优选抗体分子与连接子－细胞毒素中间物通过连接酶催化反应获得一系列优选的ADC药物，示例如图27-32。具体见实施例。
2)ADC药物的结构分析
本发明提供的ADC药物可通过多种方式进行分析。反应效率可通过SDS-PAGE方法进行初步分析，精确分子结构可通过高精度分子量质谱(ESI-MS)分析，DAR分布可通过疏水作用高效液相色谱(HIC-HPLC)进行分析，抗体聚集程度可通过分子筛高效液相色谱(SEC-HPLC)进行分析。
6.ADC药物的活性分析
1)ADC药物与肿瘤细胞表面特定抗原的结合与亲和力测定
本发明提供了测定ADC药物与肿瘤细胞表面特定抗原结合及亲和力大小的方法，用于筛选和识别高效结合肿瘤细胞表面特定抗原或受体的ADC药物。其中一个具体方案为将ADC候选药物GQ1001与来自稳定的乳腺癌细胞系的细胞孵育一定时间(10-60min)，采用FACS测定ADC候选药物GQ1001和乳腺癌细胞表面ErbB2/Her2受体的亲和力。结果显示采用本发明中的连接子及耦联方法制备的ADC药物如GQ1001可特异识别细胞表面ErbB2/Her2受体，亲和力与Herceptin无明显差异，提示本发明中的连接子及耦联方法对抗体本身的影响很小。
2)ADC药物对肿瘤细胞增殖的选择性抑制作用
为确定候选ADC药物对肿瘤细胞(如ErbB2/Her2高表达的肿瘤细胞)的选择性抑制作用，本发明通过如下方法测定候选ADC药物的细胞毒性或细胞增殖抑制活性：将具有肿瘤相关抗原或受体蛋白的哺乳动物细胞(如ErbB2/Her2高表达或低表达的乳腺癌细胞)与候选ADC药物共同孵育，培养细胞约12-120h，Cell Titer Glo方法测定细胞存活力(viability)。
其中一个实施例将ADC药物GQ1001与人乳腺癌细胞(如BT474、HCC1954、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-468)、人卵巢癌细胞(SK-OV-3)、人胃癌细胞(NCI-N87)共同孵育24-120h，Cell Titer Glo方法检测细胞内的ATP，通过ATP的量反映细胞活力。结果显示GQ1001可选择性抑制ErbB2/HER2高表达细胞的增殖。
3)大鼠体内代谢和稳定性
大鼠尾静脉注射5-50mg/kg候选ADC药物，给药后不同时间点采集血样，ELISA法检测血清中候选ADC药物的浓度。一个具体实施例中，SD大鼠经尾静脉单次注射给予GQ1001或Kadcyla，给药后1小时至28天的不同时间点采集大鼠血液，ELISA法检测各个时间点血清中GQ1001或Kadcyla浓度。结果显示该方法检测所得GQ1001和Kadcyla在大鼠体内的浓度变化时程无明显差异。
4)ADC药物体内药效
本发明对裸鼠异种移植瘤模型给予候选ADC药物处理后测定ADC药物的体内抗肿瘤作用。其中一个实施例采用人乳腺癌细胞造瘤，经尾静脉单次注射给予0.5-50mg/kg ADC药物GQ1001后测定肿瘤生长情况。结果证实0.5-50mg/kg剂量范围的GQ1001单次静脉注射可显著抑制ErbB2/Her2阳性肿瘤细胞的增殖。
5)啮齿类动物毒性
本发明在大鼠中评估了候选ADC药物的急性毒性。雌性Sprague-Dawley大鼠注射给予大剂量(60mg/kg或以上)候选ADC药物，随后观察和分析药物对大鼠的影响，以体重、临床症状、血液学、临床生化和组织病理学等多种指标考察候选ADC药物的毒性。结果发现在同等剂量水平(60mg/kg)，ADC药物GQ1001的毒性明显小于Kadcyla。
本发明提供了一类特殊的连接子，这些连接子可用于蛋白质，尤其是各种抗体与小分子化合物、肽段、核酸、示踪剂等各种物质的连接，制备用于科研、临床诊断和治疗的各种耦联物。
本发明提供的连接子可用于小分子化合物与抗体的定点连接，制备高度均质的ADC药物。本发明特别提供了一类通过上述连接子将小分子细胞毒药物，尤其是美登木素及其衍生物定点连接到抗人ErbB2/Her2抗体上形成的ADC药物。
本发明的ADC药物可用于治疗多种疾病或紊乱，如肿瘤和自身免疫疾病。对ADC药物治疗敏感的肿瘤包括以特定肿瘤相关抗原或细胞表面受体为特征的肿瘤，这些肿瘤能被ADC药物中的抗体特异识别，进而被ADC药物中所连接的小分子细胞毒药物杀死。
本发明提供的抗人ErbB2/Her2抗体与小分子细胞毒药物连接形成的ADC药物GQ1001可与肿瘤细胞表面的ErbB2/Her2特异结合，进而选择性杀伤ErbB2/Her2高表达的肿瘤细胞，治疗各种ErbB2/Her2阳性的肿瘤，包括但不限于乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等。
1)本发明提供的连接子适用于各种蛋白质，尤其是抗体与小分子化合物、肽段、核酸、荧光示踪剂、指示剂等多种物质的定点耦联。耦联条件温和，对生物分子活性无影响，具有广泛的应用前景。
2)本发明提供的连接子为琥珀酰亚胺开环结构，相比于闭环结构，其在哺乳动物体内稳定，连接的细胞毒素不易与体内丰富的半胱氨酸，谷胱甘肽及白蛋白等提供的巯基置换。用此连接子制备的ADC药物能更稳定地存在于体内，解决了目前ADC药物中小分子容易脱落的问题。
3)本发明提供的ADC药物为定点耦联产物，高度均质，相比于传统的非定点化学耦联产物，本发明提供的ADC药物在质量控制、用药安全性方面有明显的改善，从根本上解决了困扰业界的ADC药物异质性问题。
附图说明
图1.开环反应示意图
图2.连接酶催化耦联技术示意图
图3.连接子1的化学结构(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团)
图4.连接子2的化学结构(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团
图5.连接子3的化学结构(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团)
图6.连接子4的化学结构(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团)
图7.连接子5的化学结构(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团)
图8.连接子6的化学结构(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团)
图9.连接子7的化学结构(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团)
图10.连接子8的化学结构(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团)
图11.连接子1-DM1中间物的分子示意图(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团)
图12.连接子2-DM1中间物的分子示意图(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团)
图13.连接子3-DM1中间物的分子示意图(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团)
图14.连接子4-DM1中间物的分子示意图(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团)
图15.连接子1-DM1中间物的开环分子结构示意图(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图16.连接子2-DM1中间物的开环分子结构示意图(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图17.连接子3-DM1中间物的开环分子结构示意图(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图18连接子4-DM1中间物的开环分子结构示意图(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图19.连接子5-MMAE中间物的化学结构(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团)
图20.连接子6-MMAE中间物的化学结构(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团)
图21连接子7-MMAE中间物的化学结构(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团)
图22连接子8-MMAE中间物的化学结构(n为1-100之间的整数，m为0或1-1000之间的任意整数，x为-OH或-NH2基团)
图23连接子5-MMAE中间物的开环分子结构示意图(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图24连接子6-MMAE中间物的开环分子结构示意图(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图25连接子7-MMAE中间物的开环分子结构示意图(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团，m为0或1-1000之间的任意整数；A与B为同分异构体)
图26.连接子8-MMAE中间物的开环分子结构示意图(n为1-100之间的整数，x为-OH或-NH2基团，m为0或1-1000之间的任意整数；A与B为同分异构体)
图27.优选ADC1的分子示意图(n为1-100之间的整数，d为1-20之间的任一整数，连接酶识别序列LPXT中的X为谷氨酸(E)或其他任何天然/非天然氨基酸；LA3为连接区，包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；b为分别独立地为0或1，代表LA3在或不存在；x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图28.优选ADC2的分子示意图(n为1-100之间的整数，d为1-20之间的任一整数，连接酶识别序列LPXT中的X为谷氨酸(E)或其他任何天然/非天然氨基酸；LA3为连接区，包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；b为分别独立地为0或1，代表LA3在或不存在；x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图29.优选ADC3的分子示意图(n为1-100之间的整数，d为1-20之间的任一整数，连接酶识别序列LPXT中的X为谷氨酸(E)或其他任何天然/非天然氨基酸；m为0或1-1000之间的任意整数，LA3为连接区，包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；b为分别独立地为0或1，代表LA3在或不存在；x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图30.优选ADC4的分子示意图(n为1-100之间的整数，d为1-20之间的任一整数，连接酶识别序列LPXT中的X为谷氨酸(E)或其他任何天然/非天然氨基酸；m为0或1-1000之间的任意整数，LA3为连接区，包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；b为分别独立地为0或1，代表LA3在或不存在；x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图31.优选ADC5的分子示意图(n为1-100之间的整数，d为1-20之间的任一整数，连接酶识别序列LPXT中的X为谷氨酸(E)或其他任何天然/非天然氨基酸；LA3为连接区，包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；b为分别独立地为0或1，代表LA3在或不存在；x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图32.优选ADC6的分子示意图(n为1-100之间的整数，d为1-20之间的任一整数，连接酶识别序列LPXT中的X为谷氨酸(E)或其他任何天然/非天然氨基酸；LA3为连接区，包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；b为分别独立地为0或1，代表LA3在或不存在；x为-OH或-NH2基团；A与B为同分异构体)
图33.连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环)的UPLC检测结果
图34.连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环)的质谱检测结果
图35.连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环)的开环反应进程，A、B、C、D和E分别表示开环反应进行了20分钟、40分钟、60分钟、2小时和4小时的UPLC检测结果
图36.连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的UPLC检测结果
图37.连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的质谱检测结果
图38.ADC药物GQ1001的SDS-PAGE检测结果
图39.ADC药物GQ1001轻链高精度分子量质谱(ESI-MS)检测结果。A，轻链的质谱图；B，用ProMass 2.8软件去卷积化后轻链的相对分子量(25281)
图40.ADC药物GQ1001的HIC-HPLC检测结果
图41.ADC药物GQ1001的SEC-HPLC检测结果
图42.ADC药物GQ1001与BT474细胞表面ErbB2/Her2受体的结合亲和力
图43.ADC药物GQ1001与SK-BR-3细胞表面ErbB2/Her2受体的结合亲和力
图44.GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1对MCF-7细胞增殖的影响
图45.GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1对MDA-MB-468细胞增殖的影响
图46.GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1对BT-474细胞增殖的影响
图47.GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1对SK-BR-3细胞增殖的影响
图48.GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1对HCC1954细胞增殖的影响
图49.GQ1001、Kadcyla、DM1对SK-OV-3细胞增殖的影响
图50.GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1对NCI-N87细胞增殖的影响
图51.大鼠单次静脉注射GQ1001、Kadcyla的药代动力学分析。SD大鼠经尾静脉注射GQ1001(10mg/kg)或Kadcyla(10mg/kg)，ELISA法检测大鼠血清中总ADC药物的浓度
图52.ADC药物GQ1001抑制HCC1954裸鼠移植瘤生长(n＝10，Mean±SEM.)
图53.大鼠单次静脉注射GQ1001和Kadcyla后体重变化。健康成年雌性大鼠，经尾静脉单次注射给予GQ1001(6、60mg/kg)或Kadcyla(60mg/kg)，GQ1001给药组大鼠体重增长与溶媒对照组相比无明显差异(P>0.05)，Kadcyla给药组大鼠体重则明显降低(P<0.05vsVehicle)
图54.大鼠单次静脉注射GQ1001和Kadcyla后ALT和AST变化。健康成年雌性大鼠，经尾静脉单次注射给予GQ1001(6、60mg/kg)或Kadcyla(60mg/kg)，与溶媒对照组相比，GQ1001给药组大鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)无明显变化(P>0.05)，Kadcyla给药组大鼠ALT和AST则明显升高(P<0.05vs Vehicle)
图55.连接子5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE药物中间体(n＝3)开环反应液的高效液相色谱检测结果
图56.连接子5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE药物中间体(n＝3)开环反应液的MALDI-TOF质谱检测结果
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅做示范之用。
实施例
实施例1—抗人ErbB2/Her2抗体T-LCCTL-HC的生产、纯化及鉴定
1)抗体T-LCCTL-HC的生产
编码SEQ ID No.1抗体T-LCCTL-HC的质粒转染CHO细胞并构建细胞群，筛选表达量高的细胞群，参照Trastuzumab的培养工艺进行5-10L反应器培养，收集上清。
2)抗体T-LCCTL-HC的纯化
利用MabSelect亲和层析和SepharoseS阳离子交换层析相结合的方法按标准流程进行T-LCCTL-HC的纯化，溶于Trastuzumab原研药缓冲液(5mM histidine-HCl,2％Trehalose,0.009％Polysorbate 20,PH6.0)，分装冻存。
3)T-LCCTL-HC的质控检测
纯化的抗体T-LCCTL-HC经SDS-PAGE检测纯度为98.5％；样本经SEC-HPLC检测高分子量聚体的含量小于0.4％；其内毒素含量小于0.098EU/mg。
实施例2—连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的制备
1)连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环)的制备和质控检测
称取等摩尔数的连接子2(n＝3)和DM1，溶解后充分混合，0-40℃下反应0.5-20h，得连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环，结构如图12所示)。液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS)检测连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环)的纯度和分子量，结果表明，其表观纯度为100％(含有同分异构体，量大致相当，如图33所示)，分子量为1274(如图34所示)，完全符合预期。
2)连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环)的开环反应及纯化
连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环)溶液与适量Tris Base溶液或其他促进开环反应的溶液混合，0-40℃下反应0.2-20h，所得连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)，结构如图16所示)。开环反应进行20分钟、40分钟、60分钟、2小时和4小时的UPLC检测结果如图35A-E所示，随着反应的进行，反应物中连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的比例不断增加(由10％增加至73％)。无论连接子2-DM1中间物(n＝3，闭环)中琥珀酰亚胺环开环反应产率高低，都可通过半制备/制备型HPLC来完成连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的高纯度制备，确保后续应用于耦联抗体。
3)连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的质控检测
称取适量的连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)，溶解，经液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS)检测其纯度和分子量；结果见图36和图37，经HPLC纯化的连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的纯度达100％，分子量为1291.8，符合预期，为后续生产ADC药物GQ-1001奠定了坚实的基础。
实施例3—ADC药物GQ1001的制备
本发明通过转肽酶将连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)与抗体T-LCCTL-HC以位点特异的方式耦联，形成如图28所示的ADC药物，其中，n为3，d为2，连接酶识别序列LPXT中的X为谷氨酸(E)。
1)抗体T-LCCTL-HC的处理
利用超滤或者透析或者脱盐柱法处理抗体T-LCCTL-HC,更换其储存buffer为1×连接酶缓冲液。1×连接酶缓冲液的主要成分为50mM Tris-HCl(pH值介于5-8)，150mMNaCl，含有或不含CaCl2。
2)ADC药物GQ1001的固相制备
本发明使用基于Sortase酶优选改造的转肽酶催化抗体T-LCCTL-HC与连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的耦联反应，生产ADC药物GQ1001。
在1×转肽酶缓冲液中，将抗体T-LCCTL-HC与连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)按适当摩尔数比例(1:1至1:100)充分混合，注入固相耦联柱。固相耦联柱的基质上有固定化的转肽酶，催化抗体T-LCCTL-HC与连接子2-DM1中间物(n＝3，开环)的耦联反应。耦联反应在4-40℃进行0.5-20小时。反应结束后，固相耦联柱释出反应混合物，经超滤或透析以除去未反应的药物中间体。纯化的ADC药物GQ1001储存于Kadcyla原研缓冲液(10mM SodiumSuccinate，pH5.0；100mg/ml Trahelose；0.1％(w/v)Polysorbate 20；参照Kadcyla制剂配方配制)中，存储于4℃或-80℃。
实施例4—ADC药物GQ1001的SDS-PAGE检测分析
耦联反应结束后，可通过SDS-PAGE法检测GQ1001的纯度和耦联效率。GQ1001的SDS-PAGE检测结果如图38所示，耦联反应定点发生抗体T-LCCTL-HC的轻链上，且耦联上细胞毒素DM1的GQ1001轻链与未耦联细胞毒素的T-LCCTL-HC轻链相比有了明显的分子量跃迁；耦联产物中没有检测到未耦联细胞毒素的轻链，耦联效率高达95％以上，耦联产物的纯度符合预期。
实施例5—ADC药物GQ1001的高精度分子量质谱(ESI-MS)分析
利用高精度分子量质谱对ADC药物GQ1001的轻链进行分析检测，结果表明，其表观分子量为25281，理论分子量为25284，符合预期，确证了每条轻链末端耦联一个细胞毒素分子。高精度分子量质谱(ESI-MS)分析检测结果见图39A和B。
实施例6—ADC药物GQ1001的HIC-HPLC检测分析
使用Butyl-HIC色谱柱检测ADC药物GQ1001 DAR的分布，检测结果如图40所示，未耦联细胞毒素的抗体T-LCCTL-HC小于5％；耦联产物以DAR2的GQ1001为主，总体上ADC药物GQ1001的DAR为1.8左右。
实施例7—ADC药物GQ1001的SEC-HPLC检测分析
使用SEC-色谱柱分析检测ADC药物GQ1001的高分子量聚集程度。检测结果如图41所示，ADC药物GQ1001中未检测到高分子量聚体，耦联反应对抗体的损伤几乎可以忽略不计。
实施例8—ADC药物GQ1001对细胞表面ErbB2/Her2亲和力检测
1)收集人乳腺癌BT-474或SK-BR-3细胞，并制成单细胞悬液，调整细胞密度至(0.5-5)×106/ml，取5×105cells/test，分别加入6.25nM的Herceptin、T-LCCTL-HC、GQ1001，于4℃孵育60min。加入1ml洗涤液(PBS+1％BSA)，1000rpm离心5min，去除上清，重复两遍。
2)分别取100μL FITC-Goat anti-human IgG抗体稀释液加入到Herceptin、T-LCCTL-HC、GQ1001孵育的细胞中，4℃避光孵育30min。加入1ml洗涤液1000rpm离心5min，去除上清，重复两遍。加入500μL PBS重悬，过300目网筛，冰盒避光放置，通过BD C6进行流式检测。结果如图42-43所示，Herceptin，T-LCCTL-HC，GQ1001与BT-474、SK-BR-3细胞表面ErbB2/Her2受体的结合亲和力无明显差异。
实施例9—ADC药物GQ1001对ErbB2/Her2不同表达水平的肿瘤细胞增殖的影响
1)ErbB2/Her2低表达人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-468，ErbB2/Her2高表达的人乳腺癌细胞BT-474、SK-BR-3、HCC1954，人卵巢癌细胞SK-OV-3，人胃癌细胞NCI-N87。以每孔100μl(含有1000～10000个细胞)接种入96孔细胞板内，37℃，5％CO2，95％空气，100％湿度，细胞培养箱内培养过夜。
2)培养过夜的细胞加入不同浓度(30、10、3.333、1.111、0.370、0.123、0.041、0.014、0.005nM)的GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1，对照组加入浓度为50μM的Puromycin，37℃继续温育48～96h。
3)自37℃细胞培养箱取出细胞板，平衡约30分钟至室温。每孔添加100μlCellTiter Glo试剂，振荡器震荡2min后室温避光静置10min，用BioTech Gen5酶标仪测量发光值(RLU)。
4)不同药物对肿瘤细胞增殖抑制作用的结果如表1及图44-50所示，DM1对ErbB2/Her2高表达和低表达细胞均有明显的增殖抑制作用，而Herceptin、GQ1001仅对ErbB2/Her2高表达细胞有明显抑制作用，对ErbB2/Her2低表达细胞则没有明显的抑制作用，Kadcyla仅在高浓度时对ErbB2/Her2低表达细胞有一定抑制作用。
表1.不同药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用(IC50,nM)
Figure GDA0002766902420000481
注：“-”未测得
实施例10—大鼠体内药代动力学检测
1)160～180g SPF级雌性SD大鼠，随机分为GQ1001组、Kadcyla组、空白对照组，每组4只。
2)尾静脉注射给予10mg/kg GQ1001(批号：20141128，纯度>98％)或Kadcyla(LotN1003)，空白对照组经尾静脉注射等体积PBS(pH 7.4)。
3)分别在给药后1h、1天、2天、3天、4天、6天、8天、13天、17天、21天、28天经眼内眦静脉采血100～200μL(不加抗凝剂)。采集的血液冰上放置1～2h后4000rpm离心20min(4℃)，取上层血清入新EP管内，分装，-80℃保存备用。
4)ELISA检测血清内总GQ1001、Kadcyla的含量。
5)结果显示，给药后1天，GQ1001及Kadcyla血药浓度迅速降低，与给药后1h相比分别为44.7％和42.5％，两者无明显差异，此为进入体内的ADC药物快速全身分布所致。给药后6天，GQ1001及Kadcyla两组与给药后1h相比分别为20.9％和20.5％；给药后第13天，GQ1001及Kadcyla两组与给药后1h相比分别为9.9％和12.2％。到给药后第21天，GQ1001及Kadcyla两组与给药后1h相比分别为5.5％和7.7％。到给药后第28天，GQ1001及Kadcyla两组与给药后1h相比分别为3.5％和5.2％。上述结果表明，GQ1001、Kadcyla两种药物在雌性大鼠体内衰减速度无明显差异(图51)。
实施例11—ADC药物GQ1001体内药效评价
1)收集对数生长期HCC1954乳腺癌细胞，用基质胶缓冲液(PBS:BD Matrigel＝1:1)调整细胞密度至2.5×107/ml。6～8周龄SPF级雌性BALB/c裸鼠，每只动物右肩胛部位皮下注射配制好的HCC1954细胞悬液0.2ml。
2)接种细胞7天后，用游标卡尺测量肿瘤直径并按公式V＝0.5a×b2计算肿瘤体积(a为肿瘤的最长直径，b为肿瘤的最短直径)。筛选肿瘤体积130～140mm3的动物，随机分为溶媒对照组，GQ1001 0.5mg/kg、5mg/kg组，Kacyla 5mg/kg组和Herceptin 5mg/kg组，每组10只。各组动物经尾静脉注射给药，对照组给予等体积溶媒。给药后31天内每周两次测量各组动物肿瘤体积，31天后每周测量一次。计算各测量时间点动物肿瘤体积并进行组间比较。同时，用T-C或T/C值作为评价药物抗肿瘤活性的指标。T-C值计算方式：T为治疗组肿瘤平均大小达到预定尺寸(500mm3)的平均时间(天)，C为对照组肿瘤平均值达到预定尺寸(500mm3)的平均时间(天)。T/C(百分比)值为肿瘤抑制效果的指标，T为固定时间点时各药物治疗组肿瘤平均体积，C为固定时间点时对照组肿瘤平均体积。
3)GQ1001 5mg/kg和Kadcyla 5mg/kg组给药10天后，肿瘤体积即明显小于对照组，部分动物甚至出现肿瘤消失现象，直至给药38天实验结束时，肿瘤并未出现生长反弹现象(表2，图52)。上述结果表明，GQ1001与Kadcyla在5mg/kg剂量时对ErbB2/Her2阳性乳腺癌有显著抑制作用。
表2.ADC药物GQ1001对HCC1954小鼠移植瘤的生长抑制作用
Figure GDA0002766902420000491
a.Mean±SEM.
b.Tumor Growth Inhibition is calculated by dividing the group averagetumor volume for the treated group by the group average tumor volume for thecontrol group(T/C).
实施例12—ADC药物GQ1001单次注射给药毒性研究
1)成年健康雌性SD大鼠，随机分成4组(6只/组)，分别为溶媒对照组(0mg/kg)，GQ1001 6、60mg/kg剂量组，Kadcyla 60mg/kg剂量组。各组大鼠经尾静脉单次注射给药，给药容量为10ml/kg，给药速度约1ml/min。试验期间，对动物进行临床观察、体重、食量、血细胞计数、血液生化指标的检查。观察期结束后，所有动物实施安乐死，进行系统解剖和大体观察，主要脏器称重并计算脏器系数，并记录肉眼可见病变。
2)结果显示，试验期间GQ1001各剂量组动物临床观察均未见异常表现；Kadcyla在60mg/kg剂量下，给药后第5天(D5)可见鼻分泌物(2/6)、双耳潮红(耳根部)及肿胀(6/6)、被毛蓬松(6/6)、消瘦(1/6)、弓背(1/6)、双耳及四肢苍白(1/6)；其中双耳肿胀于D6消失、鼻分泌物于D7消失；4/6动物于D8恢复正常，其余2/6动物除D15安乐死前可见被毛蓬松外，其他症状已恢复。与同期溶媒对照组比较，GQ1001各剂量组动物体重未见与给药相关的改变；而Kadcyla 60mg/kg剂量组给药后(D2～D12)体重明显降低，结果见图53。
血液学和临床生化分析结果显示，GQ1001各剂量组未见明显毒性反应，Kadcyla60mg/kg剂量组动物红系指标(RBC、HGB、HCT、Retic)减少，白细胞及其分类计数增加，ALT、AST、TBIL、GGT升高或呈升高趋势，尤其是ALT、AST升高明显，提示Kadcyla 60mg/kg剂量单次注射给药可出现药物相关的肝脏毒性，结果见图54。
系统解剖和大体观察结果显示，GQ1001各剂量组动物大体观察未见异常改变，而Kadcyla 60mg/kg剂量组动物可见与给药相关的大体改变，包括脾脏大(6/6)、肝脏边缘钝圆(4/6)、胸腺小(1/6)。
上述试验结果表明，在等剂量(60mg/kg)条件下，GQ1001急性毒性反应明显低于Kadcyla。
实施例13—连接子5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE药物中间体(n＝3)稳定开环形式的制 备
1)连接子5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE药物中间体(n＝3)闭环形式的制备和质控检测
称取等摩尔数的连接子5(n＝3)和Mc-Val-Cit-Pab-MMAE，溶解后充分混合，0-40℃下反应0.5-20h，得药物中间体连接子5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE(n＝3)(闭环)，结构如图19所示。
2)连接子5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE药物中间体(n＝3)闭环形式的开环反应及检测
连接子5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE药物中间体(n＝3)闭环形式与适量Tris Base溶液或其他促进开环反应的溶液混合，0-40℃下反应0.2-20h，得到开环形式的药物中间体，结构如图23所示。高效液相色谱检测药物中间体(开环)的纯度和分子量，结果如图55所示，同分异构体在普通液相上无法分离。取开环反应液经MALDI-TOF质谱仪检测，得到系列物质分子量，如图56所示。理论分子量为1681，质谱图中的部分组分的分子量为1702，1718，分别对应钠，钾离子化的形式，完全符合预期，证实得到预期开环产物。无论琥珀酰亚胺环开环反应产率高低，都可通过半制备/制备型HPLC来完成开环形式的高纯度制备，确保后续应用于耦联抗体。

Claims (45)

1.一种结构如式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的化合物：
Figure FDA0002788404820000011
Figure FDA0002788404820000021
或其药学上可接受的盐，其中，
PCA为连接酶的特异底物识别序列；
LA1、LA2为连接区；
a、p独立地为0或1，即，LA1和LA2可独立地存在或不存在；
CCA’为化学耦联区；
Figure FDA0002788404820000022
表示单键或双键；
Y为装载物质，其选自下组：核酸序列、短肽序列、多肽、蛋白质、小分子化合物和生物物质；
z为1到1000之间的任一整数。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述连接酶为Sortase酶。
3.如权利要求1所述的化合物，其中所述PCA为连接酶受体底物的特异识别序列。
4.如权利要求3所述的化合物，其中所述PCA包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。
5.如权利要求4所述的化合物，其中所述PCA包括1到5个串联连接的甘氨酸。
6.如权利要求5所述的化合物，其中所述PCA为甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-Gly)三肽。
7.如权利要求1所述的化合物，其中所述PCA为连接酶供体底物的特异识别序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中Y为放射性标记、荧光标记、亲和纯化标签、示踪分子、抗癌药物或细胞毒素分子。
9.如权利要求8所述的化合物，其中Y为美登木素或其衍生物、紫杉醇、奥利斯达汀或其衍生物、埃博霉素或长春碱类化合物，其中所述美登木素的衍生物为DM1或DM4，所述奥利斯达汀的衍生物选自MMAE、MMAF和MMAD。
10.如权利要求1所述的化合物，其选自下组
Figure FDA0002788404820000031
Figure FDA0002788404820000041
Figure FDA0002788404820000051
Figure FDA0002788404820000061
Figure FDA0002788404820000071
Figure FDA0002788404820000081
其中n表示1-100之间的任一整数，m为0或1－1000之间的任一整数，x为-OH或-NH2基团。
11.如权利要求10所述的化合物，其中n为3，m为0，x为-NH2基团。
12.一种包含如权利要求1-9中任一所述化合物的组合物，其中所述化合物由以下步骤制备：
A)将Y溶液与
Figure FDA0002788404820000082
溶液混合，孵育，得到耦联物
Figure FDA0002788404820000091
溶液；
或者
将Y溶液与
Figure FDA0002788404820000092
溶液混合，孵育，得到耦联物
Figure FDA0002788404820000093
溶液，在这种情况下，Y上连有-S-(LA2)p基团；
或者
将Y溶液与
Figure FDA0002788404820000094
溶液混合，孵育，得到
Figure FDA0002788404820000101
溶液；
或者
将Y溶液与
Figure FDA0002788404820000102
溶液混合，孵育，得到耦联物
Figure FDA0002788404820000103
溶液，在这种情况下，Y上连有
Figure FDA0002788404820000104
基团；
B)向步骤A)中制备得到的耦联物
Figure FDA0002788404820000105
溶液或
Figure FDA0002788404820000111
溶液中加入三羟甲基氨基甲烷碱溶液。
13.如权利要求12所述的组合物，其中进一步包括将制备得到的产物经HPLC纯化。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述组合物中的如式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示化合物总含量超过50％摩尔百分比。
15.一种结构如式(V)、(VI)、(VII)或式(VIII)所示的化合物：
Figure FDA0002788404820000112
Figure FDA0002788404820000121
或其药学上可接受的盐，其中，
A为蛋白质、肽、信号转导因子、细胞增殖因子、免疫球蛋白或抗体；
LA1、LA2和LA3分别独立地为连接区，LA3包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；
a、b和p分别独立地为0或1，即，LA1、LA2和LA3可独立地存在或不存在；
PCA和F分别为连接酶的特异识别序列，在所述连接酶的作用下，PCA能与F特异性结合；
CCA’为化学耦联区；
Figure FDA0002788404820000122
表示单键或双键；
Y为装载物质，其选自下组：氢、核酸序列、短肽序列、多肽、蛋白质、化合物或生物物质；
z为1到20之间的任一整数；
d为1到20之间的任一整数。
16.如权利要求15所述的化合物，其中A为抗体。
17.如权利要求16所述的化合物，其中A为重组制备的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段、或类抗体。
18.如权利要求17所述的化合物，其中A为抗ErbB2/Her2抗体。
19.如权利要求18所述的化合物，其中A为曲妥珠单抗(Trastuzumab)。
20.如权利要求16所述的化合物，其中F通过LA3或直接以共价键定点连接于A重链或轻链的C末端。
21.如权利要求15-20中任一项所述的化合物，其中所述连接酶为Sortase酶。
22.如权利要求15-20中任一项所述的化合物，其中所述F为连接酶供体底物的特异识别序列，所述PCA为连接酶受体底物的特异识别序列。
23.如权利要求22所述的化合物，其中所述F为X1X2X3TX4X5，其中X1为亮氨酸或天冬酰胺，X2为脯氨酸或丙氨酸，X3为任何天然或非天然的氨基酸，T为苏氨酸，X4代表甘氨酸、丝氨酸或天冬酰胺或不存在，X5为任何天然或非天然的氨基酸或不存在。
24.如权利要求23所述的化合物，其中所述F为LPX3T或LPX3TGG，其中L为亮氨酸，P为脯氨酸，X3为任何天然或非天然的氨基酸，T为苏氨酸，G为甘氨酸。
25.如权利要求22所述的化合物，其中所述PCA包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸。
26.如权利要求25所述的化合物，其中所述PCA包括1到5个串联连接的甘氨酸。
27.如权利要求26所述的化合物，其中所述PCA为甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-Gly)三肽。
28.如权利要求15-20中任一项所述的化合物，其中所述F为连接酶受体底物的特异识别序列，所述PCA为连接酶供体底物的特异识别序列。
29.权利要求15-20中任一所述的化合物，其中d为1-20之间的任意整数。
30.如权利要求29所述的化合物，其中d为2、4或8。
31.如权利要求15-20中任一所述的化合物，其中Y为放射性标记、荧光标记、亲和纯化标签、示踪分子、抗癌药物或细胞毒素分子。
32.如权利要求31所述的化合物，其中Y为美登木素或其衍生物、紫杉醇、奥利斯达汀或其衍生物、埃博霉素或长春碱类化合物，其中所述美登木素的衍生物为DM1或DM4，所述奥利斯达汀的衍生物选自MMAE、MMAF和MMAD。
33.如权利要求15所述的化合物，其选自下组：
Figure FDA0002788404820000141
Figure FDA0002788404820000151
Figure FDA0002788404820000161
Figure FDA0002788404820000171
Figure FDA0002788404820000181
Figure FDA0002788404820000191
其中n表示1到100之间的任一整数，m为0或1到1000之间的任一整数，d表示1到20之间的任一整数，A为一种抗体，LA3包括1到100个串联连接的选自以下组的一个或多个单位结构：甘氨酸和丙氨酸；b独立地为0或1，即，LA3可独立地存在或不存在，LPX3T中的X3为谷氨酸(E)或其他任何天然/非天然氨基酸；x为-OH或-NH2基团。
34.一种选自下组的化合物：
Figure FDA0002788404820000201
其中n为3，d表示1到20之间的任一整数，A为抗ErbB2/Her2抗体，LA3为甘氨酸-丙氨酸(Gly-Ala)二肽；b独立地为0或1，LPX3T中的X3为谷氨酸(E)；x为-OH或-NH2基团。
35.如权利要求34所述的化合物，其中A为曲妥珠单抗(Trastuzumab)，LA3为甘氨酸-丙氨酸(Gly-Ala)二肽，b为1，d为2、4或8，LPX3T中的X3为谷氨酸(E)；x为-NH2基团。
36.一种选自下组的化合物：
Figure FDA0002788404820000211
其中n为3，d表示1到20之间的任一整数，A为抗人ErbB2/Her2抗体，LA3为甘氨酸-丙氨酸(Gly-Ala)二肽；b独立地为0或1，LPX3T中的X3为谷氨酸(E)；x为-OH或-NH2基团。
37.如权利要求36所述的化合物，其中A为Trastuzumab(曲妥珠单抗)，LA3为甘氨酸-丙氨酸(Gly-Ala)二肽，b为1，d为2、4或8，LPX3T中的X3为谷氨酸(E)；x为-OH基团。
38.一种包含如权利要求15-32中任一所述化合物的组合物，其中所述化合物由以下步骤制备：
i)制备如权利要求1-11之一所述式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的化合物；
ii)制备如权利要求15-32之一所述化合物中的A-(LA3)b-F；
iii)在存在连接酶的情况下，在适宜连接酶作用的条件下，将步骤ii)中制备得到的A-(LA3)b-F与步骤i)制备的如式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的化合物耦合。
39.如权利要求38所述的组合物，其中如式(V)、式(VI)、式(VII)或式(VIII)所示化合物的总含量超过80％摩尔百分比。
40.如权利要求15-37中任一所述的化合物或者权利要求38或39所述的组合物在制备用于治疗人类疾病的药物中的用途，其中所述疾病包括肿瘤和自身免疫疾病。
41.如权利要求40所述的用途，其中所述肿瘤的细胞表面具有识别并结合所述化合物或组合物的特异抗原或受体蛋白。
42.如权利要求41所述的用途，其中所述肿瘤的细胞表面的特异抗原或受体蛋白为ErbB2/Her2。
43.如权利要求42所述的用途，其中所述肿瘤为乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌或者食管癌。
44.一种药物组合物，其包含权利要求15-37中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
45.如权利要求44所述的药物组合物，其为冻干粉针剂或注射液。
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