CN111388679A - 蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物、其制备方法及用途 - Google Patents

蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物、其制备方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111388679A
CN111388679A CN201911391425.9A CN201911391425A CN111388679A CN 111388679 A CN111388679 A CN 111388679A CN 201911391425 A CN201911391425 A CN 201911391425A CN 111388679 A CN111388679 A CN 111388679A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
polyamino acid
helical
conjugate
unsubstituted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911391425.9A
Other languages
English (en)
Inventor
吕华
侯颖钦
胡雅丽
孙佳玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University
Original Assignee
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University filed Critical Peking University
Publication of CN111388679A publication Critical patent/CN111388679A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本申请提供了蛋白质‑螺旋聚氨基酸偶联物、其制备方法和用于降低蛋白质免疫原性的用途。

Description

蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物、其制备方法及用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，更具体地，涉及蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物及其制备方法和用途。
背景技术
自1984年首个重组胰岛素获得批准以来，蛋白质药物因其高特异性及高活性，逐渐受到人们的青睐。近5年来，蛋白质药物批准的量已经逐渐赶超传统小分子药物。然而，蛋白质药物往往药代动力学较差，循环时间短，需要高频次重复用药。
近年来逐渐受到关注的一个问题是蛋白药物的高免疫原性。以重组抗体为例，即使完全人源化的抗体在多次注射后也会产生大量的抗药物抗体(anti-drug antibody，简称ADA)。而以上抗体的产生轻则造成药物失去本身的药效，重则产生严重的过敏反应，甚至威胁病人生命安全。举例而言，Humira及Remicade在临床使用过程中被发现有广泛的ADA现象。
因此，如何避免临床用药过程(尤其是多频次给药过程)中ADA的产生成为蛋白质药物研发的必要前提。蛋白质PEG化不仅能够延长蛋白质循环时间，也能通过其自身的位阻效应一定程度上降低蛋白质的免疫原性。然而由于PEG本身具有产生anti-PEG抗体(本质上也是一种ADA)的能力，在给药过程中，病人很快产生anti-PEG IgM，进而造成其加速血液清除效应(简称ABC效应)。以PEG化门冬酰胺酶(商品名Oncaspar)为例，临床试验研究结果表明Oncaspar在血液中的活性和其anti-PEG抗体的水平密切相关：在总计接受Oncaspar给药的28人中，仅有13人(46.5％)的血液中检测到Oncaspar的活性，15人(53.5％)血液中几乎无任何活性。在13名有药物活性的病人血液中，仅有1例样本为anti-PEG阳性(7.7％)，而在另15名无药物活性的病人血液中，有13例为anti-PEG阳性(86.7％)。
由此，寻找新的低免疫原性聚合物用于蛋白质修饰以同时实现长循环与抑制ADA产生迫在眉睫。聚氨基酸(也称合成聚多肽，简称PAA)是由氨基酸N-羧基内酰胺(简称NCA)开环聚合制备的合成高分子，因其可降解性及优异的生物低毒性受到人们的关注，是一类潜在的蛋白质药物修饰高分子。相较于PEG等合成高分子，聚氨基酸具有一定的二级结构(如α-螺旋结构)，可以进一步优化其体内药学性质。
本申请提供了一类蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，通过赋予聚氨基酸螺旋结构，出乎意料地发现可极大降低偶联物在多次给药后ADA的产生并且避免ABC效应的出现，进一步极大降低了免疫原性。
发明内容
在本申请的一方面，提供了蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，其具有如通式1表示的结构:
Figure BDA0002345076570000011
其中：
Ptn表示蛋白质；
PAA表示具有螺旋结构的聚氨基酸，例如L-型聚氨基酸或D-型聚氨基酸，如全L-型聚氨基酸或全D-型聚氨基酸；
ET是连接物，其用于将Ptn共价连接于PAA；
y是大于等于1的整数，并且当y＞1时，ET各自相同或不同且PAA可以各自相同或不同。
在一个实施方案中，蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物具有如通式2或通式3表示的结构：
Figure BDA0002345076570000021
其中
Ptn表示蛋白质；
ET选自基于以下的基团：二硫化物、基于腙的化合物、氨基酸残基、多肽、寡聚氨基酸序列、硫醚类化合物、基于三氮唑的化合物、烃、杂烃、芳烃、杂芳烃、寡聚乙二醇，优选地
ET选自
Figure BDA0002345076570000022
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
R每次出现时独立地表示氢、取代或未取代的C1-C30烷基、取代或未取代的C2-C30烯基、取代或未取代的C2-C30炔基、取代或未取代的C3-C30环烷基、取代或未取代的C3-C30环烯基、取代或未取代的C1-C30杂烷基、取代或未取代的C2-C30杂烯基、取代或未取代的C2-C30杂炔基、取代或未取代的C1-C30杂环烷基、取代或未取代的C2-C30杂环烯基、取代或未取代的C6-C30芳基、取代或未取代的C5-C30杂芳基或取代或未取代的甲硅烷基；
n为选自1至300的整数；
m为2、3或4；
y是大于等于1的整数，并且当y＞1时，ET各自相同或不同且PAA各自相同或不同。
在另一个实施方案中，蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物具有如通式4表示的结构：
Figure BDA0002345076570000031
其中：
Ptn表示蛋白质；
ET选自
Figure BDA0002345076570000032
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
n为选自1至300的整数。
在一个实施方案中，蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物不包括具有通式4-1表示的结构的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，
Figure BDA0002345076570000041
其中：
Ptn表示蛋白质；
ET当与Ptn的N端连接时，为
Figure BDA0002345076570000042
而当与Ptn的除N端之外的位点连接时，为
Figure BDA0002345076570000043
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
n为选自1至300的整数；
m为2、3或4；。
在本申请的另一方面，提供了制备本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法，包括利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸；将所述螺旋聚氨基酸与蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
在一个实施方案中，提供了制备本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法，包括利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸；使蛋白质与连接物前体连接，得到修饰的蛋白质；将所述螺旋聚氨基酸与所述修饰的蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
在另一个实施方案中，提供了制备本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法，包括利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸，在制备螺旋聚氨基酸之时或之后，将连接物前体与螺旋聚氨基酸连接；将与连接物前体连接的螺旋聚氨基酸与蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
在又一个实施方案中，提供了制备本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法，包括利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸，在制备螺旋聚氨基酸之时或之后，将连接物前体1与螺旋聚氨基酸连接；使蛋白质与连接物前体2连接，得到修饰的蛋白质；将与连接物前体1连接的螺旋聚氨基酸与修饰的蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
在本申请的又一方面，提供了降低蛋白质的免疫原性的方法，所述方法包括将本文所述的聚氨基酸与蛋白质结合，形成蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
在本申请的其他方面，提供了本文所述的蛋白质-聚氨基酸偶联物在制备具有低免疫原性的蛋白质药物中的用途。
附图说明
在下文参考附图来进一步描述本文所例示的实施方案，但是所述附图仅仅是为了让本领域技术人员更好地理解本申请的内容，而不旨在限定其范围。
图1是根据一个实施方案的蛋白质药物-高分子位点特异性偶联物的合成路线；
图2是根据一个实施方案制备的聚氨基酸的分子排阻色谱(A)和圆二色谱表征(B)；
图3是根据一个实施方案制备的mPEG-COOH和mPEG-COSnBu的核磁共振氢谱，其中溶剂为D2O；
图4是根据一个实施方案制备的干扰素-高分子偶联物的蛋白质凝胶电泳图(SDS-PAGE gel)；
图5是根据一个实施方案制备的野生型干扰素及其偶联物圆二色谱表征；
图6是根据一个实施方案制备的野生型生长激素及其偶联物的蛋白质凝胶电泳胶图(A)和圆二色谱图(B)；
图7是根据一个实施方案的野生型干扰素及其偶联物的药代动力学曲线；
图8是根据一个实施方案获得的干扰素-高分子偶联物的体内抗肿瘤生长曲线：A.OVCAR-3肿瘤模型；B.PDX模型；
图9是干扰素(IFN)-高分子偶联物的体内免疫原性评价：A-B.免疫后血清中识别干扰素的IgG和IgM抗体水平；C-D.免疫后血清中识别各高分子的IgG和IgM抗体水平；
图10是生长激素(GH)-高分子偶联物的体内免疫原性评价：A-B.免疫后血清中识别生长激素的IgG和IgM抗体水平；C-D.免疫后血清中识别各高分子的IgG和IgM抗体水平；
图11是生长激素-高分子偶联物在第一次(1st)免疫和第三次(3rd)免疫后在不同时间点的血药浓度；
图12是DC细胞的摄取和激活：A.DC细胞对wt-GH，L20k-GH，DL20k-GH和PEG20k-GH的摄取；B-D.DC细胞被L20k-GH，DL20k-GH和PEG20k-GH激活后分泌的各细胞因子的含量；
图13是根据另一个实施方案的蛋白质药物-高分子非特异性多位点偶联物的合成路线；
图14是根据实施方案的不带电荷聚氨基酸、两性离子聚氨基酸以及对照聚乙二醇的分子排阻色谱和圆二色谱；
图15是根据一个实施方案的聚氨基酸化门冬酰胺酶的凝胶电泳图；
图16是根据一个实施方案的聚氨基酸化门冬酰胺酶的分子排阻色谱和动态光散谱；
图17是根据一个实施方案的酶活力测定结果；
图18是根据一个实施方案的聚氨基酸化门冬酰胺酶的细胞毒性；
图19是根据一个实施方案的聚氨基酸化门冬酰胺酶的药代动力学曲线；
图20是根据一个实施方案的聚氨基酸化门冬酰胺酶的抗原位点遮蔽性；
图21是根据一个实施方案的聚氨基酸化门冬酰胺酶大鼠体内免疫原性的检测结果。
具体实施方式
在下文中，将根据具体实施方案来进一步阐述本申请的内容。然而，所列举的具体实施方案仅出于例示目的，而并不旨在限制本申请的内容。本领域技术人员会认识到，以下任一个实施方案中的具体特征可以用于任何其他实施方案，只要其不背离本申请的主旨即可。
定义
在下文中，除非另外定义，本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)均具有如本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。术语，诸如在常用词典中定义的那些术语，应解释为具有与其在相关技术的上下文中的含义相符的含义，并且不会以理想化或过于正式的含义来解释，除非本文明确如此定义。
如本文所用，修饰词“C1-30”是指基团的主链中具有1至30的范围内的任意整数值的碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、30个碳原子。此外，本领域技术人员也知晓“C1-30”包括由1至30的范围内的数值所组成的任何子范围，例如C2-30、C6-30、C1-20、C2-20、C6-20、C2-10、C6-18、C6-12等。同理，“C1-60”是指基团的主链中具有1至60的范围内的任意整数值的碳原子，例如10、20、30、40、50或60个碳原子，并且包括由1至60的范围内的数值所组成的任何子范围。另外，“C2-60”、“C6-60”和“C5-60”也相同地定义，并且分别包括由“2至60”、“6至60”、“5至60”的范围内的数值所组成的任何子范围。
如本文所用，术语“烷基”是指具有直链或支链的饱和脂肪族烃基。其非限制性实例包括甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。
如本文所用，术语“烯基”是指在沿着烷基的碳链的一个或多个位置处具有至少一个碳-碳双键的烃基。其非限制性实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基等。
如本文所用，术语“炔基”是指在沿着烷基的碳链的一个或多个位置处具有至少一个碳-碳叁键的烃基。其非限制性实例包括乙炔基、丙炔基等。
如本文所用，术语“杂烷基”、“杂烯基”、“杂炔基”分别是指包含至少一个选自N、O、Si、P和S的杂原子的烷基、烯基、炔基。
如本文所用，术语“环烷基”是指单环饱和烃基。其非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。如本文所用，术语“杂环烷基”是指包含作为成环原子的至少一个选自N、O、Si、P和S的杂原子的单碳环基团。其非限制性实例包括四氢呋喃基和四氢噻吩基。
如本文所用，术语“环烯基”是指在其环中具有碳原子和至少一个双键的单环基团，而且其不是芳香族的。其非限制性实例包括环戊烯基、环己烯基和环庚烯基。如本文所用，术语“杂环烯基”是指在其环中包括作为成环原子的至少一个选自N、O、Si、P和S的杂原子和至少一个双键的单碳环基团。其非限制性实例包括4,5-二氢-1,2,3,4-噁三唑基、2,3-二氢呋喃基和2,3-二氢噻吩基。
如本文所用，术语“芳基”是指包含碳环芳香族体系的基团。其非限制性实例包括苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基等。当芳基包括多个环时，各自的环可以彼此稠合。
如本文所用，术语“杂芳基”是指具有包含作为成环原子的至少一个选自N、O、Si、P和S的杂原子的碳环芳香族体系的基团。其非限制性实例包括吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基等。当杂芳基包括多个环时，各自的环可以彼此稠合。
如本文所用，术语“连接物”旨在能够将蛋白质与聚氨基酸共价连接的基团(有时也称为“接头”)，其实例包括但不限于氨基酸残基(如赖氨酸残基、半胱氨酸残基)，包含腙基、二硫键、硫醚键、三氮唑的连接物，多肽，烃，杂烃，芳烃，杂芳烃，或寡聚乙二醇。本文所用的“连接物”在某些实施方案中也可是特定序列的寡聚氨基酸。举例而言，本文所用的连接物可以选自以下：
Figure BDA0002345076570000071
如本文所用，术语“蛋白质”是指具有医疗用途的蛋白质(有时也称为蛋白质药物或蛋白药物)，包括动物、植物来源和应用生物技术研究开发的具有一定生物活性、用于防治和诊断人类、动物和植物疾病的蛋白质产品。其实例包括各类抗体，如英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗，以及其他抗-PD-1/PD-L1、抗-CTLA-4、抗-EGFR、抗-HER2,抗-TNFα、抗-CD19、抗-CD33、抗-CD30、抗-CD20、抗-CD25的抗体；酶，如尿酸酶、门冬酰胺酶、精氨酸酶、羧肽酸、苯丙氨酸氨裂解酶；生长因子和细胞因子，如生长激素、G-CSF、细胞因子和趋化因子(IL-2、干扰素-α2a、干扰素-α2b、干扰素-2a、凝血因子VIII、凝血因子IX、干扰素-β1a、干扰素-γ)，等。
蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物
在本申请的一个实施方案中，提供了蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，其具有如通式1表示的结构:
Figure BDA0002345076570000072
其中：
Ptn表示蛋白质；
PAA表示具有螺旋结构的聚氨基酸，例如L-型聚氨基酸或D-型聚氨基酸，优选地，全L-型聚氨基酸或全D-型聚氨基酸；
ET是连接物，其用于将Ptn共价连接于PAA；
y是大于等于1的整数，并且当y＞1时，ET各自相同或不同且PAA可以各自相同或不同。
此处，当y＞1时，蛋白质Ptn与多条聚氨基酸链PAA经由连接物ET连接，优选地，聚氨基酸链PAA具有螺旋结构，例如L-型聚氨基酸或D-型聚氨基酸，更优选地，全L-型聚氨基酸或全D-型聚氨基酸。在一个实施方案中，y≥1且y≤15，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。进一步地，每一条-ET-PAA链中的连接物ET和PAA可以各自不同、相同、或部分相同。
在本申请的进一步的实施方案中，所述具有通式1表示的结构的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物可以为具有通式2或3表示的结构的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物：
Figure BDA0002345076570000081
其中
Ptn表示蛋白质；
ET可以选自基于以下的基团：二硫化物、基于腙的化合物、氨基酸残基、多肽、寡聚氨基酸序列、硫醚类化合物、基于三氮唑的化合物、C1-60烃(如C1-60烷烃、C2-60烯烃或C2-60炔烃)、C1-60杂烃(如包含N、O、S、P等杂原子的C1-60烷烃、C2-60烯烃或C2-60炔烃)、C6-60芳烃(如单环或多环的芳烃)、C5-60杂芳烃(如单环或多环的杂芳烃)、寡聚乙二醇，优选地，ET选自
Figure BDA0002345076570000082
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
R每次出现时独立地表示氢、取代或未取代的C1-C30烷基、取代或未取代的C2-C30烯基、取代或未取代的C2-C30炔基、取代或未取代的C3-C30环烷基、取代或未取代的C3-C30环烯基、取代或未取代的C1-C30杂烷基、取代或未取代的C2-C30杂烯基、取代或未取代的C2-C30杂炔基、取代或未取代的C1-C30杂环烷基、取代或未取代的C2-C30杂环烯基、取代或未取代的C6-C30芳基、取代或未取代的C5-C30杂芳基或取代或未取代的甲硅烷基；
n为选自1至300的整数；
y是大于等于1的整数，并且当y＞1时，ET各自相同或不同且PAA各自相同或不同。
在本申请的一个实施方案中，蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物具有通式4表示的结构：
Figure BDA0002345076570000091
其中：
Ptn表示蛋白质；
ET选自
Figure BDA0002345076570000092
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
n为选自1至300的整数。
在本申请的另一个实施方案中，提供了蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，其具有如通式4-1表示的结构：
Figure BDA0002345076570000093
其中：
Ptn表示蛋白质；
ET当与Ptn的N端连接时，为
Figure BDA0002345076570000101
而当与Ptn的除N端之外的位点连接时，为
Figure BDA0002345076570000102
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
n为选自1至300的整数。
在本申请的一个实施方案中，由通式1至4中任一项表示的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物不包括由通式4-1表示的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。在本申请的另一个实施方案中，由通式1至4中任一项表示的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物包括由通式4-1表示的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
根据本申请的一个实施方案，用于取代的取代基可以选自卤素、卤代C1-3烷基、羟基、氨基、巯基、羰基、羧基、磺酸基、羧酸盐、磺酸盐、酯基、酰胺。
根据本申请的一个实施方案，Ptn是选自酶、激素、细胞因子、单克隆抗体和/或蛋白质疫苗的蛋白质。根据本申请的另一个实施方案，Ptn是具有医疗用途的蛋白质，例如，如多肽激素、单克隆抗体、干扰素、白介素、集落刺激因子、重组疫苗等。在此实施方案中，Ptn包括各类抗体，如英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗，以及其他抗-PD-1/PD-L1、抗-CTLA-4、抗-EGFR、抗-HER2、抗-TNFα、抗-CD19、抗-CD33、抗-CD30、抗-CD20、抗-CD25的抗体；酶，如尿酸酶、aspariginase、精氨酸酶、羧肽酸、苯丙氨酸氨裂解酶；生长因子和细胞因子，如生长激素、G-CSF、细胞因子和趋化因子(IL-2、干扰素-α2a、干扰素-α2b、干扰素-2a、凝血因子VIII、凝血因子IX、干扰素-β1a、干扰素-γ)。可适用于本文的蛋白类药物不受特别的限制，只要其能够与ET连接物连接即可。理论上，任何蛋白质经修饰后均可适用于本文。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的酶包括但不限于：蛋白水解酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链激酶、尿激酶、纤溶酶、凝血酶、谷氨酰胺酶、精氨酸酶、丝氨酸脱水酶、苯丙氨酸氨解酶、亮氨酸脱氢酶、青霉素酶、超氧化物歧化酶、葡聚糖酶和/或右旋糖酐酶。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的激素包括但不限于下丘脑激素、垂体激素、胃肠激素、胰岛素、降钙素。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的细胞因子包括但不限于白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、趋化因子和/或生长因子。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的白细胞介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31和/或IL-32。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的干扰素包括但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ及其亚型。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的集落刺激因子包括但不限于：粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、多能集落刺激因子、干细胞因子、白血病抑制因子和/或红细胞生成素。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的生长因子包括但不限于表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子和/或神经生长因子。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的单克隆抗体包括但不限于：曲妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、他尼珠单抗、阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、培化阿珠单抗、阿麦妥昔单抗、阿泊珠单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、莫-比伐珠单抗、贝伦妥单抗-维多汀、莫-坎妥珠单抗、拉-坎妥珠单抗、卡罗单抗-喷地肽、卡妥索单抗、泊-西他珠单抗、西妥木单抗、可那木单抗、达西珠单抗、达洛珠单抗、地莫单抗、依美昔单抗、依决洛单抗、依洛珠单抗、恩司昔单抗、依帕珠单抗、厄马索单抗、埃达珠单抗、法勒珠单抗、芬妥木单抗、加利昔单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、格莱木单抗-维多汀、替-伊莫单抗、伊戈伏单抗、拉-英达西单抗、英妥木单抗、伊珠单抗-奥佐米星、伊匹木单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、莫-洛伏珠单抗、鲁卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、米拉珠单抗、米妥莫单抗、莫加珠单抗、他那可单抗、他那莫单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥纳珠单抗、莫-奥珠单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、帕曲土单抗、培妥珠单抗、普立木单抗、雷妥莫单抗、雷莫芦单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、奥马珠单抗、西罗珠单抗、司妥昔单抗、帕-他莫单抗、替妥莫单抗、替妥木单抗、替西木单抗、曲美木单抗、替加珠单抗、托西莫单抗、西莫白介素单抗、乌瑞鲁单抗、维妥珠单抗、伏洛昔单抗、伏妥莫单抗和扎芦木单抗，包括其抗原结合片段。
根据本申请的一个实施方案，可用于本申请的蛋白质疫苗包括但不限于白喉类毒素、破伤风类毒素、炭疽分泌蛋白疫苗和/或乙型肝炎血源疫苗。
根据本申请的一个实施方案，R1每次出现时表示天然氨基酸侧链，所述天然氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。根据本申请的另一个实施方案，R1每次出现时表示非天然氨基酸侧链，如经人工修饰的上述天然氨基酸。根据本申请的又一个实施方案，R1每次出现时表示经寡聚乙二醇(聚合度为2-10，如二缩三乙二醇，EG3)修饰、磷酸酯修饰、丙烯氧基苄酯修饰、烯丙基二缩三乙二醇修饰的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链。根据本申请的再一个实施方案，R1每次出现时表示经二缩三乙二醇(EG3)修饰的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链。本文对R1没有特别的限制，理论上，任何天然氨基酸可以直接地用于本申请的偶联物，或者经修饰后，再用于本申请的偶联物，以便改善稳定性。另外，本文描述的R1侧链可以由以下描述的EG基团封端。
根据本申请的一个实施方案，n表示选自1至200的整数，例如10至200的整数、20至200的整数。根据本申请的另一个实施方案，n表示选自1至150的整数，例如10至150的整数、20至150的整数。根据本申请的又一个实施方案，n表示选自1至100的整数，例如10至100的整数、20至100的整数。根据本申请的再一个实施方案，n表示选自1至50的整数。在理论上，n可以为任何数值，只要所得的偶联物稳定存在即可，本领域技术人员可以根据实际应用，设定具体的n值，而且，这种选择应在本领域技术人员的能力范围内。在一个实施方案中，n可以为1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、180或200，或者以这些数值为端点所形成的范围。
根据本申请的一个实施方案，本文所述的螺旋聚氨基酸包括以下部分：
Figure BDA0002345076570000121
其中
L1可以为：
Figure BDA0002345076570000122
L2不受特别的限制，只要其能够使得EG稳定地共价连接于侧链即可，例如L2可以为
Figure BDA0002345076570000123
EG可以为：
Figure BDA0002345076570000124
用于蛋白偶联的聚氨基酸
根据本申请的一个实施方案，提供了用于蛋白偶联的聚氨基酸，其具有如通式5所示的结构：
Figure BDA0002345076570000125
其中：
X表示氮、硫或硒；
R1每次出现时独立地表示天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
R5表示取代或未取代的C1-C30烷基、取代或未取代的C2-C30烯基、取代或未取代的C2-C30炔基、取代或未取代的C3-C30环烷基、取代或未取代的C3-C30环烯基、取代或未取代的C1-C30杂烷基、取代或未取代的C2-C30杂烯基、取代或未取代的C2-C30杂炔基、取代或未取代的C1-C30杂环烷基、取代或未取代的C2-C30杂环烯基、取代或未取代的C6-C30芳基、取代或未取代的C5-C30杂芳基；以及
n为选自1至200的整数。
根据本申请的一个实施方案，R1每次出现时表示天然氨基酸侧链，所述天然氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。根据本申请的另一个实施方案，R1每次出现时表示非天然氨基酸侧链，如经人工修饰的上述天然氨基酸侧链。根据本申请的又一个实施方案，R1每次出现时表示经寡聚乙二醇(聚合度为2-10，如二缩三乙二醇，EG3)修饰、磷酸酯修饰、丙烯氧基苄酯修饰、烯丙基二缩三乙二醇修饰的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸侧链。根据本申请的再一个实施方案，R1每次出现时表示经二缩三乙二醇(EG3)修饰的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸侧链。
根据本申请的一个实施方案，R5表示取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C3-C10环烯基、取代或未取代的C1-C10杂烷基、取代或未取代的C2-C10杂烯基、取代或未取代的C1-C10杂环烷基、取代或未取代的C2-C10杂环烯基、取代或未取代的C6-C18芳基、取代或未取代的C5-C18杂芳基。根据本申请的另一个实施方案，R5表示取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C1-C10杂烷基、取代或未取代的C1-C10杂环烷基、取代或未取代的C6-C18芳基、取代或未取代的C5-C18杂芳基。
根据本申请的一个实施方案，用于取代R5的取代基可以选自卤素、卤代C1-3烷基、羟基、氨基、巯基、羰基、羧基、磺酸基、羧酸盐、磺酸盐、酯基、酰胺和/或卤素。根据本申请的另一个实施方案，R5选自以下结构式，但不限于此：
Figure BDA0002345076570000131
根据本申请的又一个实施方案，R5表示甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、苯基。根据本申请的再一个实施方案，R5表示苯基。
根据本申请的一个实施方案，n表示选自1至200的整数，例如10至200的整数、20至200的整数。根据本申请的另一个实施方案，n表示选自1至150的整数，例如10至150的整数、20至150的整数。根据本申请的又一个实施方案，n表示选自1至100的整数，例如10至100的整数、20至100的整数。根据本申请的再一个实施方案，n表示选自1至50的整数。在理论上，n可以为任何数值，只要所得的聚氨基酸稳定存在即可，本领域技术人员可以根据实际应用，设定具体的n值，而且，这种选择应在本领域技术人员的能力范围内。在一个实施方案中，n可以为1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、180或200，或者以这些数值为端点所形成的范围。
制备蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法
根据本申请的一个实施方案，提供了制备本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法，包括利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸；将所述螺旋聚氨基酸与蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
根据本申请的一个实施方案，制备本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法包括：利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸；通过分子克隆和酶切等手段或其他使蛋白质与连接物前体连接的手段，得到官能修饰(也可以称为官能化)的蛋白质；将螺旋聚氨基酸与所述官能修饰的蛋白质混合，发生共价连接反应，得到蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
根据本申请的另一个实施方案，制备本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法包括利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸，并且在制备螺旋聚氨基酸之时或之后，将连接物前体与螺旋聚氨基酸连接；将与连接物前体连接的螺旋聚氨基酸与蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
根据本申请的又一个实施方案，制备本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法包括利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸，并且在制备螺旋聚氨基酸之时或之后，将连接物前体1与螺旋聚氨基酸连接；使蛋白质与连接物前体2连接，得到修饰的蛋白质；将与连接物前体1连接的螺旋聚氨基酸与修饰的蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
在一个实施方案中，可以在获得聚氨基酸之后，对螺旋聚氨基酸进行修饰，例如：
Figure BDA0002345076570000141
其中R、R1、R2、n如本文所定义。例如，
Figure BDA0002345076570000142
可以为
Figure BDA0002345076570000143
在另一个实施方案中，可以对蛋白质进行修饰，例如：
Figure BDA0002345076570000144
在进一步的实施方案中，可以进行如下反应：
Figure BDA0002345076570000145
根据本申请的一个实施方案，利用引发剂(R5XY)引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸(PAA-XR5)，如下所示：
Figure BDA0002345076570000146
其中：
X、R1、R2、R5和n如上文对通式5所定义；
Y代表氢或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基优选为C1-C10烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。
根据本申请的另一个实施方案，当Y为三烷基硅基时，所得的聚氨基酸的氮端处的三烷基硅基氨基甲酸酯结构在遇到空气中的水分时很容易脱去，因此最终得到的聚氨基酸氮端为氨基。
根据本申请的一个实施方案，以R5XY为三甲基硅基苯硫酚或三甲基硅基苯硒酚为例，反应式为：
Figure BDA0002345076570000147
其中X、R1和n如上文对通式3所定义。
根据本申请的一个实施方案，可以在非质子性溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)等溶剂中进行聚合。根据本申请的另一个实施方案，反应温度通常为室温(25℃)，反应时间则视单体和所意欲的聚合度而定，从几十分钟到几十小时不等，如20分钟、40分钟、1小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时等。
根据本申请的一个实施方案，可以将由获得的聚氨基酸进行后修饰，包括：将所得的聚氨基酸与调节剂混合并反应，由此得到经后修饰的聚氨基酸。根据本申请的另一个实施方案，所述调节剂为巯基乙胺盐酸盐或巯基丙酸。根据本申请的又一个实施方案，所述后修饰过程可在紫外灯照射下反应一段时间，例如1小时、3小时、5小时、10小时等，本领域技术人员可以根据具体反应进程而定。根据本申请的其他实施方案，后修饰在溶液中进行，例如含非质子性溶剂的溶液，如二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)等，而且，所述溶液还可以包含光敏剂，以促进反应进行，例如安息香二甲醚(DMPA)等。
根据本申请的一个实施方案，可以将蛋白质在蛋白酶作用下暴露具有反应活性的官能团，从而获得官能化的蛋白质。进一步地，可以使该官能化的蛋白质与聚氨基酸混合，获得蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
降低蛋白质免疫原性的方法
在本申请的一个实施方案中，提供了降低蛋白质免疫原性的方法，包括将上文所述的聚氨基酸与蛋白质结合，形成本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。在本申请的另一个实施方案中，提供了降低蛋白质免疫原性的方法，包括将上文所述的聚氨基酸经由本文所述的连接物与蛋白质结合，形成本文所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。在本申请的又一个实施方案中，提供了蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物在制备具有低免疫原性的蛋白质药物中的用途。
根据本申请的一个实施方案，降低蛋白质免疫原性的方法包括通过本文所述的制备蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法使螺旋聚氨基酸与蛋白质结合，例如经由本文所定义的连接物结合。根据本申请的另一个实施方案，降低蛋白质免疫原性的方法包括通过本领域的其他方法使螺旋聚氨基酸与蛋白质结合，例如经由本文所定义的连接物结合。
对此，根据本申请获得的螺旋聚氨基酸-蛋白质偶联物与PEG化的蛋白质偶联物或未修饰的蛋白质相比，具有显著降低的免疫原性并明显避免了抗药物抗体的产生，而且基本不影响蛋白质在医用方面的功效。举例而言，与聚乙二醇修饰的蛋白质偶联物或无规卷曲聚氨基酸-蛋白质偶联物相比，具有螺旋结构的聚氨基酸(如L型、D型)与蛋白质的偶联物既能显著降低蛋白质的免疫原性、避免抗药物抗体(ADA)的产生，聚氨基酸聚合物自身又具有较低的免疫原性。
实施例
实施例1-1：用于蛋白质特异性偶联的聚氨基酸P1(L20k-SPh)的合成
Figure BDA0002345076570000151
在手套箱中，将L-谷氨酸(乙二醇)3酯-N-羧基内酸酐(N1,200.0mg,0.627mmol,100当量)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(4.0mL)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的DMF溶液(12.5μL×0.5M，1.0当量)，室温搅拌36小时后，将反应液倒入80mL乙醚溶液中，析出的白色沉淀即为产品。离心得到固体产品，倾倒出上清液并再次用40mL乙醚冲洗产品，离心后所得固体通过0.5‰的乙酸水溶液透析(透析袋截留分子量为3500)，纯化后冻干，得到白色固体130mg(产率65％)，其保存于-20℃冰箱中。
实施例1-2：用于蛋白质特异性偶联的聚氨基酸P2(D20k-SPh)的合成
以与实施例1-1类似的方法合成数均分子量为约20kDa的聚D-谷氨酸(乙二醇)3酯(P2:D20k-SPh)，只需将L-谷氨酸(乙二醇)3酯-N-羧基内酸酐替换为D-谷氨酸(乙二醇)3酯-N-羧基内酸酐。
实施例1-3：用于蛋白质特异性偶联的聚氨基酸P3(DL20k-SPh)的合成
以与实施例1-1类似的方法合成数均分子量为约20kDa的聚DL-谷氨酸(乙二醇)3酯(P3:DL20k-SPh)，只需将单一手性的L-谷氨酸(乙二醇)3酯-N-羧基内酸酐替换为摩尔比1:1混合手性的L-谷氨酸(乙二醇)3酯-N-羧基内酸酐和D-谷氨酸(乙二醇)3酯-N-羧基内酸酐即可得到。
在以上三个实施例中制备的聚氨基酸的分子量及分子量分布系数(PDI)由凝胶排阻色谱(GPC)结合9角度激光光散射仪测得(参见图2A)，所用流动相为添加0.1M溴化锂的无水N,N-二甲基甲酰胺。这三种聚氨基酸与聚乙二醇的二级结构经圆二色谱(CD)表征(参见图2B)，聚氨基酸P1在波长208nm和222nm处的负吸收特征峰即为右手螺旋结构的特征吸收，说明聚氨基酸P1具有右手螺旋结构，与天然蛋白质的螺旋结构相同。聚氨基酸P2在波长208nm和222nm处的正吸收特征峰即为左手螺旋结构的特征吸收，说明聚氨基酸P2具有左手螺旋结构。聚氨基酸P3在整个波长范围(200～250nm)内，未见特征吸收峰，说明该聚氨基酸为无规卷曲结构。
实施例2：用于蛋白质位点特异性偶联的聚乙二醇(P4:mPEGCOSnBu)的修饰
Figure BDA0002345076570000161
将单甲氧基聚乙二醇羧酸(分子量20000；200.0mg,0.01mmol,1.0当量)和二环己基碳二亚胺(20.6mg,0.1mmol,10当量)溶于2.0mL二氯甲烷，用移液枪吸取丁硫醇(32.2μL，0.3mmol,30当量)加入至反应物溶液中，室温搅拌24小时。将所得的反应物溶液滴加入40mL无水乙醚中，离心，弃去上清，继续用40mL无水乙醚洗涤两次，所得固体利用PD-10柱纯化并冻干，得到白色固体粉末(P4:mPEGCOSnBu)，产率约为90％。所得高分子P4经核磁共振氢谱表征(参见图3)。
实施例3：药物蛋白ENLYFQCG-干扰素(TEV-IFN)的表达及纯化
将N端编码有MENLYFQCG的质粒pET-TEV-Cys-IFN通过化学转化的方法转入大肠杆菌(E.coli)OrigamiB(DE3)中。菌种在10mL添加有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中复苏10～12小时，然后接种至1L添加有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在250rpm，37℃的条件下摇至OD600＝0.8，加入终浓度为1.0mM的异丙基硫代半乳糖苷诱导细菌表达，培养条件改为200rpm，30℃。过夜培养后6500rpm，4℃离心30min，收集菌体。用20mL的缓冲液A(20mMTris-HCl,500mM NaCl,pH 8.0)重悬菌体，在冰浴条件下超声裂解。裂解液先后经过6500rpm,40min和12000g,40min两步4℃离心，收集上清液，用0.22μm滤膜过滤，经NiNTA亲和柱纯化得到98mg目标蛋白，并经过UPLC-MS进行确认，计算的理论分子量为21918，实测分子量为21914。分子量误差(4道尔顿)在误差允许范围(10道尔顿)内，因此可确认所得到的蛋白为目的蛋白TEV-Cys-IFN。
野生型干扰素(wt-IFN)的表达同上述过程，产量约为100mg/L。
药物蛋白质生长激素(野生型和ENLYFQCG-生长激素)的表达及纯化同上述过程，产率为～90mg/L。
实施例4：药物蛋白ENLYFQCG-干扰素的酶切
在透析袋(MWCO 3000)中加入10mL实施例3获得的蛋白质溶液(1.0mg/mL)、50μL烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease,TEV，2.0mg/mL)和500μL 20×缓冲液B(1M Tris-HCl，pH8.0，5mM EDTA和1mM DTT)。将透析袋置于1L 1×缓冲液B(50mM Tris-HCl，pH8.0，0.5mM EDTA和1mM DTT)中在室温下透析酶切。酶切1小时后得到蛋白Cys-IFN并经过UPLC-MS确认，理论分子量为20991，实测分子量为20987。分子量误差(6道尔顿)在误差允许范围(10道尔顿)内，因此可确认所得到的酶切后的蛋白为目的蛋白Cys-干扰素。
ENLYFQCG-GH的酶切参照上述步骤，酶切时间控制在2小时左右，其他处理方法与上述类似。
实施例5：药物蛋白Cys-IFN与聚氨基酸的位点特异性偶联
将10.0mg Cys-IFN(1.0当量)和～30mg聚氨基酸P1(L20k-SPh)(3.0当量)混合于50mM Tris pH7.4(终体积为1.0mL)缓冲液中，室温反应10～12小时。反应结束后，样品经过尺寸排阻柱Superdex 200increase 10/300GL分离纯化，除去未反应的蛋白。所得粗产物中，过量的聚氨基酸经过NiNTA亲和柱除去，得到纯净的右手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物(L20k-IFN)。如图4所示，在蛋白质凝胶电泳(SDS-PAGE gel)中，右手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物条带相较于野生型蛋白质条带向高分子量处位移，说明聚氨基酸接枝成功，且偶联物为单一条带，说明产物纯度较高(>95％)。
所得偶联物利用去内毒素亲和层析介质去除内毒素，经内毒素检测试剂盒鉴定内毒素含量低于0.1EU/mL(根据美国FDA要求，医疗用品或注射用药内毒素残留标准最高为0.5EU/mL)，最终产率为37％。
左手螺旋聚氨基酸(P2)-干扰素、无规卷曲聚氨基酸(P3)-干扰素以及聚乙二醇(P4)-干扰素偶联物的制备与上述条件和方法相同，只需将聚氨基酸P1(L20k-SPh)分别替换为聚氨基酸P2(D20k-SPh)、聚氨基酸P3(DL20k-SPh)以及聚乙二醇(P4)，产率均在30％～50％之间。所得偶联物经过SDS-PAGE gel鉴定，如图4所示，偶联物条带相较于野生型蛋白质均向高分子量处迁移，说明高分子均接枝成功。
实施例6：野生型干扰素和干扰素偶联物的圆二色谱(CD)测试
利用具有不同二级结构的聚氨基酸，所得偶联物在空间二级结构上相应地有所不同。如图5所示，由于聚氨基酸P3和聚乙二醇均为无规卷曲结构，所得偶联物二级结构信号与野生型干扰素基本一致，而右手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物则表现出强于野生型干扰素的CD信号，这是由于聚氨基酸P1具有右手螺旋结构，左手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物则表现出左手螺旋的CD信号，这也是由于该偶联物所偶联聚氨基酸为左手螺旋结构。CD谱图进一步说明聚氨基酸偶联成功，并且具有不同的二级结构。
药物蛋白质生长激素与聚氨基酸的偶联及纯化条件与上述干扰素偶联条件类似，同时SDS-PAGE gel(图6A)表征及CD(图6B)表征均与干扰素一致。
实施例7：干扰素偶联物-干扰素受体(IFNAR2)的表面等离子共振(SPR)分析
干扰素发挥抗肿瘤的生物学作用依赖于干扰素同细胞表面的干扰素受体的结合，因此，评价高分子偶联后的干扰素与受体间的结合活性是更直观地评价干扰素体外活性的一种方法。本申请利用SPR对干扰素偶联物与干扰素受体(IFNAR2)的结合强度进行表征。
利用EDC/NHS活化CM5芯片表面，将IFNAR2溶于pH 5.0醋酸钠缓冲液，浓度为50μg/mL，IFNAR2溶液流过CM5芯片表面进行锚定，锚定的蛋白量控制在500～800RUs。锚定结束后，利用1M乙醇胺pH 8.5进行封闭。准备不同浓度(0.1-40nM)的野生型干扰素wt-IFN及干扰素偶联物，所用缓冲液为HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％v/v表面活性剂P20)，流速为30μL/min，平衡缓冲液为HBS-EP缓冲液，再生缓冲液为pH 3.010mM Glycine-HCl，程序设定为进样120s—解离360s—再生15s—稳定100s。各样品的结合常数(KD，见表1)由BIA evaluation software(T200 version 1.0)通过1-1binding模型进行拟合。
在SPR测试中，体外活性较高的干扰素通常对应着较低的平衡速率常数(KD)。在本次实验中，测得wt-IFN的平衡速率常数为1.0nM，在文献参考范围内(1～10nM)，说明实验过程较为可靠。而后测得右手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物的KD值为5.8nM，左手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物的KD值为6.3nM。虽然相较于wt-IFN，结合活性稍有降低，但是仍然在wt-IFN的平衡速率常数的文献参考值范围内。因此，可以初步认为具有螺旋结构的聚氨基酸对干扰素的活性影响较小。而无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物和聚乙二醇-干扰素偶联物的KD值分别为19.6nM和15.9nM，与wt-IFN的平衡速率常数相比，降低了一个数量级，比螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物的结合活性降低了3～4倍，说明螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物对干扰素-干扰素受体的结合活性影响较小。
表1.野生型干扰素体外活性及体内循环半衰期
Figure BDA0002345076570000181
实施例8：野生型干扰素与干扰素偶联物的体外活性测试
采用对Daudi细胞的生长抑制来判断各种聚氨基酸-干扰素偶联物的体外抗肿瘤活性，所得数据为半数致死浓度IC50，IC50数值越低，表面蛋白质药物活性越高。
采用对IFN敏感的人B淋巴瘤细胞系Daudi来作为实验细胞系，检测各种聚氨基酸-干扰素偶联物的体外抗肿瘤活性。具体实验步骤为：5000个细胞/孔铺板至96孔板中，将蛋白质及其与聚氨基酸的偶联物稀释至合适梯度，加入到铺有细胞的96孔板中，培养72小时之后，利用Celltiter
Figure BDA0002345076570000182
Cell viability Assay(普洛麦格)检测细胞活力，利用Graphpad Prism处理相关数据得到各样品的半数抑制量IC50(参见表1)。
实验结果显示，右手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物与左手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物的IC50分别为36pg/mL和52.6pg/mL，而无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物和聚乙二醇-干扰素偶联物的IC50分别为160pg/mL和190pg/mL，比螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物的活性降低了4～6倍。该实验结果与实施例6的受体结合结果一致。因此，螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物能够较高的保留药物蛋白质的活性。
实施例9：野生型干扰素与干扰素偶联物大鼠体内药代动力学研究
采用SD雌性大鼠作为动物活体实验对象，将雌性SD大鼠(约250g)随机分为5组，每组3只或6只，对其进行颈静脉插管手术，恢复48小时后，按照0.2mg/kg(按照IFN计算蛋白的浓度)的剂量通过颈静脉插管静脉注射待测样品，分别在1min、15min、30min、1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h和72h通过颈静脉插管取血100～200μL。将血液在4℃静置30分钟，待血液凝固后，4000g离心15分钟，收集血清，分装冻存于-80℃。待血样收集完毕，血清通过ELISA方法检测其中的IFN含量。
各蛋白质样品在血液中的浓度变化曲线如图7所示。聚氨基酸-干扰素偶联物均表现出远高于wt-IFN的血药浓度半衰期，同时，螺旋聚氨基酸(包括右手螺旋和左手螺旋)-干扰素偶联物在大鼠体内的半衰期均可达9.6h，与经典的聚乙二醇偶联的干扰素半衰期相当，然而无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物的体内半衰期只有7.8h，可见，同样分子量的聚氨基酸修饰蛋白质药物时，螺旋聚氨基酸在高保留蛋白质活性的同时可更有效地延长蛋白质在体内的半衰期。
实施例10：野生型干扰素与干扰素偶联物的体内抗肿瘤活性研究
采用以人卵巢癌肿瘤细胞OVCAR-3所建立的肿瘤模型以及研究病人前列腺肿瘤样本的体内肿瘤模型。
对于OVCAR-3肿瘤模型，在六周龄的Balb/c雌性裸鼠体内构建肿瘤模型。将细胞以107/200μL的密度悬浮在1640/基质胶(1:1混合)中，以200μL/只裸鼠的量注射入裸鼠右侧前胸部皮下，三周后，肿瘤大小约为30mm3。将老鼠随机分为五组，每组6只，分别注射生理盐水、野生型干扰素、右手聚氨基酸-干扰素偶联物、左手螺旋聚氨基酸偶联物与无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物，剂量为10μg干扰素/只裸鼠，注射体积为100μL，给药频率为每周一次，每隔3天监测一次肿瘤大小和裸鼠体重。
在病人前列腺肿瘤构建的模型(PDX模型)中，将病人的前列腺肿瘤样本在无菌环境下切割成2～4mm的块状，通过手术埋在小鼠(BALB/c-nu，6周龄，雄性)皮下，待肿瘤生长至～50mm3时，将小鼠随机分为4组，每组7只。空白组尾静脉注射生理盐水，其他组分别尾静脉注射右手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物、左手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物、无规卷曲聚氨基酸偶联物和聚乙二醇-干扰素偶联物，剂量为0.75mg IFN/kg，频率为每五天一次，每隔2～3天记录小鼠的体重和肿瘤大小。
肿瘤的体积根据以下公式计算：
V＝L*W2/2
肿瘤的生长曲线(图8A)显示，野生型干扰素对肿瘤生长的抑制作用较弱，虽然螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物和无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物均能够有效地抑制肿瘤的生长，但螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物的抑制效果显著性优于无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物(P<0.001)，这可能是由于螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物具有较高的活性和体内较长的半衰期。
PDX模型是将临床上患有前列腺癌的病人的病灶处的肿瘤摘除，切成较小的块状，通过手术埋于小鼠皮下得到的肿瘤模型，该模型生长速度较快，肿瘤为恶性，侵袭性更强。待肿瘤生长至～50mm3时开始给药，每五天一次。由于野生型干扰素体内半衰期较短，在OVCAR-3模型中对肿瘤抑制作用较弱。在PDX模型中，对照组只设置生理盐水对照组。实验组设置右手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物、左手螺旋聚氨基酸偶联物、无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物和聚乙二醇-干扰素偶联物四组给药组，其中聚乙二醇-干扰素偶联物作为临床中使用的聚乙二醇化干扰素的替代药物，可以认为是阳性对照组。肿瘤生长曲线(图8B)显示，无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物和聚乙二醇-干扰素偶联物能够在一定程度上抑制肿瘤的生长，但与这二者的抑制效果相比，螺旋聚氨基酸(包括右手和左手)-干扰素偶联物的药效都具有显著性优势(P<0.001)。
由此可见，两种肿瘤模型的研究结果均显示，相比于无规卷曲的聚氨基酸或聚乙二醇与干扰素的偶联物，螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物由于具有较高的活性和体内较长的半衰期，且体内药效具有显著性(P<0.001)优势。
实施例11：干扰素偶联物体内免疫原性研究
以干扰素(IFN)为研究对象，分别对其右手螺旋聚氨基酸、左手螺旋聚氨基酸、无规卷曲聚氨基酸和聚乙二醇聚氨基酸偶联物进行在SD大鼠体内免疫原性测试。
具体免疫方法为：雌性SD大鼠(～250g)随机分为3组，每组3只。各组分别通过皮下注射免疫右手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物、左手螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物、无规卷曲聚氨基酸-干扰素偶联物和聚乙二醇-干扰素偶联物，免疫剂量为0.2mg IFN/kg，频率为每周一次，共免疫四次。每次免疫前(免疫一周后，下一次免疫前)眼眶取血，收集～200μL血清，分装冻存于-80℃保存。
免疫后血清中抗体含量采用酶联免疫检测(ELISA)进行分子，具体方案如下：
针对干扰素蛋白的抗体水平检测：将wt-IFN(1.0μg/mL，100μL/孔，即100ng/孔)加入96孔板中，4℃过夜以让蛋白吸附。清洗液(1×PBS，0.1％吐温20)200μL/孔，洗涤三次，加入200μL/孔实验缓冲液(1×PBS，0.1％吐温20，0.5％BSA)，室温封闭1～2小时。将上述免疫收集的血清(0～4周)用实验缓冲液稀释104倍后，每孔加入100μL。在微孔板振荡器上室温振荡1小时后，用清洗液洗涤三次(200μL/孔)，加入Goat anti-mouse IgG HRP(用实验缓冲液按照1/2000比例稀释)，每孔100μL，同样室温振荡孵育1小时。孵育结束后，重复洗涤步骤，加入TMB显色液(100μL/孔)，显色5～10分钟，加入2N H2SO4(100μL/孔)终止显色，在酶标仪上读取450nm处的吸收值。
针对干扰素蛋白的IgM抗体水平：检测步骤与上述类似，其中血清稀释倍数为500倍，将Goat anti-mouse IgG HRP更换为Goat anti-mouse IgM HRP，其他保持不变。
针对高分子(聚氨基酸和聚乙二醇)的抗体水平检测：将右手螺旋聚氨基酸-生长激素偶联物、左手螺旋聚氨基酸-生长激素偶联物、无规卷曲聚氨基酸-生长激素偶联物和聚乙二醇-生长激素偶联物分别按照100ng生长激素/孔吸附于96孔板中，4℃过夜后，其他步骤均与上述针对蛋白抗体水平的检测相同，其中血清稀释倍数均为200倍，整个过程所使用的缓冲液中均不添加吐温20(由于吐温20的化学结构与高分子结构有类似之处，未避免吐温20竞争性结合血清中识别高分子的抗体，所以在该ELISA实验过程中应全程避免吐温20的使用)，其他保持不变。
ELISA数据(参见图9)表明，具有螺旋结构的聚氨基酸-干扰素偶联物作为免疫源时，大鼠体内产生的抗体水平(包括IgG和IgM)均显著性(P<0.001)低于无规结构的聚氨基酸-干扰素偶联物。即使与经典的聚乙二醇相比，经过多次免疫之后，螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物仍表现出显著性(P<0.01)优势。
高分子聚合物虽然能够在一定程度上降低蛋白质的免疫原性，但是高分子聚合物自身可能刺激机体产生免疫反应。如图9所示，将聚氨基酸(包括右手螺旋、左手螺旋和无规卷曲)-生长激素和聚乙二醇-生长激素作为抗原吸附于孔板中，检测其对应干扰素偶联物免疫组血清中识别高分子聚合物自身的抗体水平。
检测结果显示，接受无规卷曲聚氨基酸-干扰素免疫的大鼠在第二次免疫后即产生了较高的识别无规卷曲聚氨基酸的IgG和IgM抗体水平，接受聚乙二醇-干扰素偶联物免疫的大鼠也产生了识别聚乙二醇的抗体。虽然IgG抗体水平较低，但是却产生了较高水平的IgM，这与以往文献所报道的结果基本一致，即聚乙二醇刺激机体免疫反应所产生的抗体类型主要为IgM。
然而，令人意外的是，螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物与这二者的免疫结果均有较大差异，接受螺旋聚氨基酸-干扰素偶联物免疫的大鼠，体内产生的各种抗体的水平均比较低，该结果表明螺旋聚氨基酸的蛋白质偶联物既能降低蛋白质的免疫原性，高分子自身又具有较低的免疫原性。
实施例12：生长激素偶联物的体内免疫原性研究
以生长激素为研究对象，长激素偶联物的免疫方法与实施例10中干扰素相同，免疫剂量改为0.4mg GH/kg，其他相同。
生长激素偶联物免疫血清的ELISA分子均参照实施例10过程进行，只需将针对蛋白抗体分析从包被孔板的蛋白质更换为生长激素，将针对高分子聚合物的抗体水平检测时所使用的偶联物更换为相应的干扰素偶联物即可。
如图10所示，生长激素偶联物的免疫结果分析与干扰素偶联物免疫结果数据基本保持一致，该数据进一步确证了螺旋聚氨基酸的蛋白质偶联物既能降低蛋白质的免疫原性，又可以降低抗药物抗体(anti-drug antibody，缩写ADA)的产生，高分子自身又具有较低的免疫原性。
实施例13：生长激素偶联物体内加速血液清除效应(accelerated blood clearance,缩写ABC效应)探究
高分子偶联药物在给药过程中难以避免抗药物抗体(ADA)或者抗高分子抗体的产生，这些抗体均会加速后续给药后血液中药物的清除，这种效应称为加速血液清除效应(简写为ABC效应)。
以右手螺旋聚氨基酸-生长激素偶联物、左手螺旋聚氨基酸-生长激素偶联物、无规卷曲聚氨基酸-生长激素偶联物和聚乙二醇-生长激素偶联物作为研究对象，对其体内血液清除效应进行验证。
免疫过程参照实施例10，在第一次和第三次免疫后的3h、9h、12h和24h眼眶采血，通过ELISA测定血清中生长激素药物浓度(图11)。右手螺旋聚氨基酸-生长激素偶联物在两次免疫之间没有明显差异，根据3～24小时药物浓度变化计算的曲线下面积3rd/1st免疫为111.8％，两次几乎一致。左手螺旋聚氨基酸-生长激素偶联物在两次免疫之间表现出同样的趋势，3rd/1st免疫为97.8％。
而无规卷曲聚氨基酸-生长激素偶联物和聚乙二醇-生长激素偶联物的第三次免疫后，采血时间点的生长激素血药浓度均显著性降低，并且24小时之时，血液中的药物浓度低于检出限。无规卷曲聚氨基酸-生长激素偶联物和聚乙二醇-生长激素偶联物的曲线下面积3rd/1st免疫分别为6.6％和6.2％，即第三次免疫后3～24小时的曲线下面积仅为第一次免疫后的6％左右。
可见，无规卷曲聚氨基酸-生长激素和聚乙二醇-生长激素偶联物会产生较为显著的ABC效应，该结果也与实施例11中关于血液中抗体水平的研究结果一致。
实施例14：DC细胞的摄取及激活
将诱导小鼠髓样细胞分化为抗原呈递细胞树突状细胞(DC细胞)，通过生长激素偶联物在DC细胞内的摄取及DC细胞的激活效果初步比较不同偶联物之间的免疫机制。
将雄性C57小鼠(5周龄)颈椎脱臼处死，从其股骨和胫骨中提取髓样细胞(约1.0×106个细胞每只老鼠)，均匀平铺至24孔板中，每孔加入1.0mL含有10％FBS，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，20ng/mL IL4，10ng/mL GM-SCF。48h后更换培养基，而后每天更换培养基，诱导分化第6天后开始实验。
对于DC细胞摄取实验，将荧光素FAM标记的野生型生长激素，右手螺旋聚氨基酸-生长激素，无规卷曲聚氨基酸-生长激素和聚乙二醇-生长激素偶联物以50μg GH/mL的终浓度，1.0mL每孔加入至孔板中，孵育12小时后，移去细胞培养基，收集细胞并用500μL1×PBS洗涤两次，最终将细胞悬于500μL1×PBS中以待流式分析。
对于DC细胞激活实验，将右手螺旋聚氨基酸-生长激素，无规卷曲聚氨基酸-生长激素和聚乙二醇-生长激素偶联物以同样的浓度刺激DC细胞，24小时后收集细胞上清，用CBA Mouse Inflammation Kit测定培养基中DC细胞分泌的各细胞因子的浓度。
图12为DC细胞对野生型生长激素，右手螺旋聚氨基酸-生长激素，无规卷曲聚氨基酸-生长激素和聚乙二醇-生长激素偶联物的摄取。由于蛋白质均标记有FAM荧光素，因此，DC细胞摄取量越多，荧光信号越强。摄取结果显示，高分子偶联均减少了DC细胞对生长激素的摄取，并且摄取量与免疫原性评价结果一致。DC细胞摄取抗原被激活之后，会分泌各种细胞因子至培养基中，利用流式细胞分析仪和CBA Mouse Inflammation Kit共同分析培养基中各细胞因子的含量。白介素6(IL-6)，干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子TNF三种细胞因子相较于空白对照组培养基中的细胞因子含量有明显增高。无规卷曲聚氨基酸-生长激素和聚乙二醇-生长激素偶联物对DC细胞的激活程度很高，而右手螺旋聚氨基酸-生长激素对DC细胞的激活作用较弱，均与体内免疫原性评价结果一致。
实施例15-1：不带电荷聚氨基酸P(EG3Glu)的合成
Figure BDA0002345076570000221
在手套箱中，将L-谷氨酸三乙二醇酯-N-羧基内酸酐(200.0mg,0.627mmol,50当量)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中，并加入六甲基二硅胺烷的N,N-二甲基甲酰胺溶液(25μL×0.5M，1.0当量)，室温搅拌12小时后，从手套箱中取出，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(16.7mg，0.0627mmol，5当量)，继续反应12小时。然后将反应液滴加至100mL乙醚溶液中，析出的白色沉淀即为聚合物。离心(4000g，5min)后弃去上清液并用10mL蒸馏水复溶聚合物，使用PD 10脱盐柱进一步纯化，随后冻干，得到白色固体125mg(产率72.5％)，保存于-20℃冰箱中。
实施例15-2：两性离子聚氨基酸P(CB-EG3Glu)的合成
Figure BDA0002345076570000222
在手套箱中，将L-谷氨酸烯丙基三乙二醇酯-N-羧基内酸酐(200.0mg,0.580mmol,40当量)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中，并加入六甲基二硅胺烷的N,N-二甲基甲酰胺溶液(29μL×0.5M，1.0当量)，室温搅拌12小时后，从手套箱中取出，将反应液滴加至100mL乙醚溶液中，析出的白色沉淀，离心(4000g，5min)后弃去上清液并用2mL N,N-二甲基甲酰胺复溶，再加入巯基甜菜碱的水溶液(284mg，1.74mmol，120当量)以及催化量安息香二甲醚，使用紫外灯照射反应1小时。随后以蒸馏水稀释至15mL，使用PD 10脱盐柱进一步纯化，冻干后得到白色固体，以2mL pH值为8.0的磷酸盐缓冲液复溶，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(15.4mg，0.058mmol，5当量)二甲亚砜溶液，继续反应12小时。然后使用PD 10脱盐柱再次纯化，冻干得到白色固体140mg(产率52.4％)，保存于-20℃冰箱中。
以上两种聚合物大小使用superdex 75 10/300GL分子排阻色谱进行了水合动力学体积的表征；圆二色谱可见两种聚合物均为右手螺旋(参见图14)。
实施例16：聚氨基酸化门冬酰胺酶的合成
门冬酰胺酶(ASP，4.5mg，1.0当量)与2-亚氨基硫烷盐酸盐(1.0mg，0.0073mmol，60当量)室温反应80分钟后，使用PD 10脱盐柱纯化后浓缩至1mL，分别与100mg的聚乙二醇马来酰亚胺以及实施例15-1和15-2中制备的聚合物混合，于4℃下反应过夜，蛋白可完全反应，使用superdex 200increase 10/300GL分子排阻色谱进行分离纯化，除去未反应的聚合物，得到纯净的聚氨基酸化门冬酰胺酶，反应示意图如图13所示，并且凝胶电泳图如图15所示。
实施例17：聚氨基酸化门冬酰胺酶的水合动力学大小表征
对于500μL野生型门冬酰胺酶或以上实施例16中制备的聚氨基酸化门冬酰胺酶(0.8mg/mL)，使用superdex 200increase 10/300GL分子排阻色谱表征水合动力学体积，使用动态光散射仪表征水合动力学直径(参见图16)。
实施例18：聚氨基酸化门冬酰胺酶酶活力的测定
90μL磷酸盐缓冲液中加入10μL的0.04mg/mL蛋白以及底物20μL的40mM左旋天冬酰胺，置于37℃反应10min后用20μL的1.5M三氯乙酸终止反应。然后吸取20μL反应液加入160μL磷酸盐缓冲液中，再加入20μL纳氏试剂，混匀，于410nm检测其吸光值。发现P(EG3Glu)-ASP和P(CB-EG3Glu)-ASP酶活跟修饰前的野生型门冬酰胺酶几乎一致(参见图17)。
实施例19：聚氨基酸与聚氨基酸化门冬酰胺酶细胞毒性
将NKYS细胞计数后使用含10ng/mL IL2以及10％FBS的1640细胞培养液稀释，以5000每孔的密度铺到黑色96孔板中，随即加入多个浓度梯度的待测物，置于二氧化碳培养箱(37℃5％CO2)培养48h后，每孔加入20μL CellTiter-Blue，2h后使用酶标仪读数(激发560nm，发射590nm)，结果如图18所示。
实施例20：野生型门冬酰胺酶与聚氨基酸化门冬酰胺酶大鼠体内药代动力学研究
将SD大鼠随机分成4组(n＝3)，以尾静脉给药的方式注射80μg蛋白，在每个时间点眼眶采血。得到的血液置于冰上凝固，随后4500rpm离心15min取血清。90μL磷酸盐缓冲液中加入10μL的0.04mg/mL蛋白以及底物20μL的40mM左旋天冬酰胺，置于37℃反应30min后用20μL的1.5M三氯乙酸终止反应。吸取20μL反应液并加入160μL磷酸盐缓冲液中，再加入20μL纳氏试剂，混匀，于410nm检测其吸光值(参见图19)。以给药后1min血清酶活为100％。
实施例21：聚氨基酸化门冬酰胺酶抗原遮蔽实验
使用夹心法ELISA，测定不同浓度的野生型门冬酰胺酶或聚氨基酸化门冬酰胺酶，发现聚合物抗原遮蔽效果很好，抗体对已无法识别(参见图20)。
实施例22：聚氨基酸化门冬酰胺酶大鼠体内免疫原性研究
免疫方法：SD大鼠(雌鼠200g，雄鼠300g)随机分为4组，每组4只，雌雄各半。各组分别通过皮下注射野生型门冬酰胺酶，聚乙二醇化门冬酰胺酶，或聚氨基酸化门冬酰胺酶，免疫剂量为0.8mg门冬酰胺酶/kg，频率为每周一次，共免疫四次。每次免疫前，以及最后一次免疫一周后眼眶取血，收集～200μL血清，分装冻存于-80℃保存。
免疫后血清中抗体含量采用酶联免疫检测(ELISA)进行分析，具体方案如下：
针对门冬酰胺酶蛋白的IgG抗体水平检测：将野生型门冬酰胺酶(1.0μg/mL，100μL/孔，即100ng/孔)加入96孔板中，4℃过夜以让蛋白吸附。清洗缓冲液(1×PBS，含0.05％吐温20)200μL/孔，洗涤三次，加入100μL/孔实验缓冲液(1×PBS，0.05％吐温20，0.5％BSA)，室温封闭2小时以上。将上述免疫收集的血清(0～4周)用实验缓冲液稀释5000倍后，每孔加入100μL。在微孔板振荡器上室温振荡1小时后，用清洗液洗涤三次(200μL/孔)，加入Goatanti-rat IgG HRP(用实验缓冲液稀释5000倍)，每孔100μL，同样室温振荡孵育1小时。孵育结束后，重复洗涤步骤，加入TMB显色液(100μL/孔)，显色5分钟，加入2N H2SO4(100μL/孔)终止显色，在酶标仪上读取450nm处的吸收值。
针对门冬酰胺酶蛋白的IgM抗体水平：检测步骤与上述类似，其中血清稀释倍数为500倍，将Goat anti-rat IgG HRP更换为Goat anti-rat IgM HRP，其他保持不变。
针对聚合物(聚氨基酸和聚乙二醇)的IgG抗体水平检测：将聚乙二醇-干扰素偶联物或聚氨基酸-干扰素偶联物按照100ng干扰素/孔吸附于96孔板中，4℃过夜后，其他步骤均与上述针对蛋白抗体水平的检测相同，其中血清稀释倍数均为500倍，整个过程所使用的缓冲液中替换吐温20为CHAPS，其他保持不变。
针对聚合物(聚氨基酸和聚乙二醇)的IgM抗体水平检测：检测步骤与上述类似，其中血清稀释倍数为200倍。
以上测试结果如图21所示。
由以上体外和体内测试，可以确定，本发明的螺旋聚氨基酸-蛋白质偶联物，能够降低抗原呈递细胞对药物的摄取和细胞的激活，从而降低机体的免疫反应。
尽管参考特定的实施例来描述本文所述的实施方案，但是应当理解，本领域技术人员会对其做出多种调整和改变，只要其不违背本发明的范围和主旨即可。

Claims (10)

1.蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，其具有如通式1表示的结构:
Figure FDA0002345076560000011
其中：
Ptn表示蛋白质；
PAA表示具有螺旋结构的聚氨基酸，例如L-型聚氨基酸或D-型聚氨基酸，如全L-型聚氨基酸或全D-型聚氨基酸；
ET是连接物，其用于将Ptn共价连接于PAA；
y是大于等于1的整数，并且当y＞1时，ET各自相同或不同且PAA各自相同或不同。
2.如权利要求1所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，其具有如通式2或通式3表示的结构：
Figure FDA0002345076560000012
其中
Ptn表示蛋白质；
ET选自基于以下的基团：二硫化物、基于腙的化合物、氨基酸残基、多肽、寡聚氨基酸序列、硫醚类化合物、基于三氮唑的化合物、烃、杂烃、芳烃、杂芳烃、寡聚乙二醇，优选地
ET选自
Figure FDA0002345076560000021
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
R每次出现时独立地表示氢、取代或未取代的C1-C30烷基、取代或未取代的C2-C30烯基、取代或未取代的C2-C30炔基、取代或未取代的C3-C30环烷基、取代或未取代的C3-C30环烯基、取代或未取代的C1-C30杂烷基、取代或未取代的C2-C30杂烯基、取代或未取代的C2-C30杂炔基、取代或未取代的C1-C30杂环烷基、取代或未取代的C2-C30杂环烯基、取代或未取代的C6-C30芳基、取代或未取代的C5-C30杂芳基或取代或未取代的甲硅烷基；
n为选自1至300的整数；
m为2、3或4；
y是大于等于1的整数，并且当y＞1时，ET各自相同或不同且PAA各自相同或不同。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，其具有如通式4表示的结构：
Figure FDA0002345076560000022
其中：
Ptn表示蛋白质；
ET选自
Figure FDA0002345076560000031
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
n为选自1至300的整数；
m为2、3或4。
4.根据权利要求3所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，其不包括具有通式4-1表示的结构的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，
Figure FDA0002345076560000032
其中：
Ptn表示蛋白质；
ET当与Ptn的N端连接时，为
Figure FDA0002345076560000033
而当与Ptn的除N端之外的位点连接时，为
Figure FDA0002345076560000041
R1每次出现时独立地表示天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或甲基；
n为选自1至300的整数。
5.制备权利要求1至4中任一项所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物的方法，包括利用引发剂引发N-羧基内酸酐聚合，得到螺旋聚氨基酸；将所述螺旋聚氨基酸与蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中使蛋白质与连接物前体连接，得到修饰的蛋白质，然后将所述螺旋聚氨基酸与所述修饰的蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
7.根据权利要求5所述的方法，其中在制备螺旋聚氨基酸之时或之后，将连接物前体与螺旋聚氨基酸连接，然后将与连接物前体连接的螺旋聚氨基酸与蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
8.根据权利要求5所述的方法，其中制备螺旋聚氨基酸之时或之后，将连接物前体1与螺旋聚氨基酸连接；使蛋白质与连接物前体2连接，得到修饰的蛋白质；将与连接物前体1连接的螺旋聚氨基酸与修饰的蛋白质混合，发生共价化学连接反应，得到所述蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
9.降低蛋白质的免疫原性的方法，所述方法包括将聚氨基酸与蛋白质结合，形成权利要求1至4中任一项所述的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物。
10.降低蛋白质的免疫原性的方法，所述方法包括将聚氨基酸与蛋白质结合，形成具有通式4-1的蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物，
Figure FDA0002345076560000042
其中：
Ptn表示蛋白质；
ET当与Ptn的N端连接时，为
Figure FDA0002345076560000043
而当与Ptn的除N端之外的位点连接时，为
Figure FDA0002345076560000044
R1每次出现时独立地表示氢、天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；
R2每次出现时独立地表示氢或C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基；
n为选自1至300的整数。
CN201911391425.9A 2019-01-03 2019-12-30 蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物、其制备方法及用途 Pending CN111388679A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910004789 2019-01-03
CN2019100047890 2019-01-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111388679A true CN111388679A (zh) 2020-07-10

Family

ID=71414996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911391425.9A Pending CN111388679A (zh) 2019-01-03 2019-12-30 蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物、其制备方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111388679A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005079861A2 (en) * 2004-02-13 2005-09-01 Safeway Investments Ltd. Polymeric water soluble prodrugs
CN103491957A (zh) * 2011-04-29 2014-01-01 西莱克塔生物科技公司 用于降低针对治疗性蛋白的免疫应答的致耐受性合成纳米载体
CN106924753A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 北京大学 制备蛋白质‑聚氨基酸环状偶联物的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005079861A2 (en) * 2004-02-13 2005-09-01 Safeway Investments Ltd. Polymeric water soluble prodrugs
CN103491957A (zh) * 2011-04-29 2014-01-01 西莱克塔生物科技公司 用于降低针对治疗性蛋白的免疫应答的致耐受性合成纳米载体
CN106924753A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 北京大学 制备蛋白质‑聚氨基酸环状偶联物的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106924754B (zh) 聚氨基酸偶联物
EP1090037B1 (en) Divalent antibody fragments conjugated to PEG
CA3072754A1 (en) 6-amino-7,9-dihydro-8h-purin-8-one derivatives as immunostimulant toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
US8426357B2 (en) Multimeric conjugate
AU2005224078B2 (en) Methods for increasing protein polyethylene glycol (PEG) conjugation
JP2020523413A (ja) 操作された抗体化合物およびこれらの抱合体
CA2710841C (en) Y-shaped polyethylene glycol modified g-csf, the preparation and use thereof
JP2022539215A (ja) 多価ペプチドコンジュゲート用の親水性リンカー
EP0325270A2 (en) Anticancer conjugates
JP2006521372A (ja) 生物学的活性物質と生体適合性高分子の１：１接合体、この製造方法とこれを含む薬学組成物
CN111150844B (zh) 抗her2亲合体靶向光敏剂的合成和应用
CN111087465B (zh) 一种针对密蛋白6的抗体偶联药物及应用
CN115068625A (zh) Pd-l1和tlr7双靶向纳米抗体偶联药物及其在抗肿瘤中的应用
CN111388679A (zh) 蛋白质-螺旋聚氨基酸偶联物、其制备方法及用途
CN105085658B (zh) 一种白细胞介素29突变体及聚乙二醇衍生物
US7713926B2 (en) Method of producing partial peptide of enolase protein from Plasmodium falciparum
TW200426155A (en) Activated polyethylene glycol esters
KR101841111B1 (ko) 히알루론산 유도체 및 이를 이용한 세포 표면 개질용 조성물
EP4366776A1 (en) Non-immunogenic, high density poegma conjugates
WO2024098023A2 (en) Interferon alpha polypeptides and conjugates
AU2021386899A1 (en) Biologically active material conjugate having biotin moiety, fatty acid moiety, or combination thereof coupled thereto
AU2021220275A1 (en) Process for site-specific modification of an antibody
CN117241831A (zh) 水相引发氨基酸n-羧基环内酸酐聚合的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20200710

Assignee: Beijing Peptide Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: Peking University

Contract record no.: X2023990000341

Denomination of invention: Protein Spiral Polyamino Acid Coupling Compound, Its Preparation Method and Application

License type: Exclusive License

Record date: 20230324

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract