JP2022539215A - 多価ペプチドコンジュゲート用の親水性リンカー - Google Patents

Abstract

本開示は、親水性リンカーを利用するペプチド－ポリマーコンジュゲート、および疾患または障害の治療におけるそれらの使用に関する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年７月１日に出願された米国仮出願第６２／８６９，２３３号および２０１９年９月１１日に出願された米国仮出願第６２／８９８，９６７号の優先権を主張する。

配列表に関する記載
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が組み込まれる。２０２０年６月３０日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、０５２５６６＿５０５００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で、サイズは３７，４５０バイトである。

生体高分子を使用して生物活性剤の特性を改変することは、幅広い医療および生物学的用途にわたって繰り返されるテーマである。様々な化学的リンカーを使用して、生理活性ペプチドまたはタンパク質を生体高分子に結合させ、特定の疾患の最適な治療を提供することができる薬物として使用するために、得られるコンジュゲートの薬理学的特性を改変することができる。単一の生体高分子鎖に結合した一つまたは複数の種のペプチドの複数のコピーを含むペプチド－ポリマーコンジュゲートを使用して、ペプチドの薬理学的特性に、以下を含む明確な改善（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）を与える： （１）生物学的標的へのより高い結合親和性、（２）標的組織を介したより遅い拡散性、および（３）ペプチドまたはタンパク質の生理活性を不活性化する可能性のあるプロテアーゼの阻害。

ペプチド－ポリマーコンジュゲートのこれらの改善された薬理学的特性は、病変組織に直接送達される強力な薬物の送達に特に有用である。薬物が標的組織に局所的に投与されているため、組織に直接送達される用量は、全身投与後に同じ治療効果を達成するために必要とされるよりも低くすることができる。血液からの輸送特性が悪い組織に薬剤を投与することも可能である。直接的な薬物投与が一般的である組織の具体例は、硝子体内注射を用いる後眼房（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｅｙｅ ｃｈａｍｂｅｒ）および関節内注射を用いる関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）を含む。

しかし、局所組織投与では、専門家が必要な注射を安全に提供する必要があり、全身投与に比べて投与の負担および費用が高くなる。ペプチド薬をペプチド－ポリマーコンジュゲートの一部として投与する場合、薬物投与の頻度を大幅に減らすことが可能であり、それにより、効果的な治療を受けるための患者の負担を軽減することができる。さらに、局所注射の回数を減らすと、局所組織の損傷や注射の副作用のリスクが軽減する。最後に、投与頻度を減らすニーズは、標的組織内の薬物濃度が治療濃度を下回る時間を短縮し、それによって薬物の全体的な有効性を向上させることができる。これらの利点に基づき、様々な疾患のためのタンパク質－ポリマー医薬品を開発する強い動機がある。

ペプチド－ポリマーコンジュゲートを医薬品（ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）として適切に製剤化するには、患者に適切な投与を可能にするために十分に高い薬物濃度を達成する必要がある。十分な投薬を達成するには、医薬品溶液中のペプチド－ポリマーコンジュゲートの適切な濃度と、各ポリマーに結合されたペプチドの適切な薬物負荷との両方を達成する必要がある。また、溶液を汚染している可能性のある細菌または病原体を排除するために、０．２２ミクロンのフィルターでペプチド－ポリマー原薬をろ過する必要がある。最後に、ペプチド－ポリマー医薬品は、製造日から臨床使用日まで最大２年間溶液中に留まることにより、貯蔵安定性を示さなければならない。ペプチド－ポリマーコンジュゲート間の相互作用は、これらの薬物を可能にする特性のいずれかを完全にする能力に悪影響を与える可能性がある。

ポリマーおよびペプチドを結合するために使用されるリンカーは、コンジュゲートの薬理学的特性、コンジュゲート内相互作用、ならびにコンジュゲート間相互作用に実質的な影響を与える可能性がある。したがって、所与の疾患に好ましい薬理学的特性を達成し、医薬品への製剤化に成功することを可能にする、特定のリンカー化学とのペプチド－ポリマーコンジュゲートを開発する必要がある。本発明は、このニーズおよび他のニーズを満たす。

一つの実施形態では、本発明は、式Ｉ：

のコンジュゲートを提供し、ここで各Ｘは、独立して、約５ｋＤａ～約２００ｋＤａの分子量を有するペプチドであり；各Ｙは独立して親水性リンカーであり；Ｚは、約０．１ＭＤａ～約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーであり；および下付き文字ｎは、１０～１０００の整数である。

別の実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲートおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、眼の疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象への治療有効量の本発明のコンジュゲートの硝子体内投与を含み、それによって眼の疾患または障害を治療する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）の疾患または障害を治療する方法であって、関節に本発明のコンジュゲートの有効量を注射することにより、関節の疾患または障害を治療することを含む方法を提供する。

様々なチオール反応性リンカーを使用して合成された、精製された８３０ｋＤａのヒアルロン酸中間体のＵＶスペクトルを示す。コンジュゲートについては、表２を参照のこと。 Ｚｅｂａ ７ ｋＤａ ＭＷＣＯ脱塩カラムによる精製前後のＨｙＡ－（Ｍａｌ ＰＥＧ２ヒドラジド）中間生成物の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。 コンジュゲートピークを示すコンジュゲート４０のＳＥＣトレース、ならびにその後に続くより小さなＤＡＲＰｉｎのダイマーのピークおよびモノマーのピークを示す。 ペプチドタンパク質コンジュゲート１（ＥＭＣＨ）、３（ＢＭＰＨ）、４（ＭＰ２Ｈ）、１６（ＭＰ２Ａ）、５（ＭＰ３Ａ）、および６（ｎ－ＡＥＭ）リンカーの０．２２ｕｍろ過後の損失率を示す。 ＥＭＣＨリンカーを有するＭＶＰと比較した、Ｍａｌ－ＰＥＧ２－ヒドラジドリンカーおよびＤＡＲＰｉｎ、Ｅ１－１またはＶＨＨのペプチドを有するＭＶＰの改善された対数抗ＶＥＧＦ力価を示す。 抗ＴＮＦａ ＶＨＨ抗体および様々な架橋剤を使用して作製された抗ＴＮＦａポリマーコンジュゲート１９、２１、２２、および１６を滅菌（０．２２ｕｍ）ろ過した後の治療用タンパク質の損失量の比較を示す。ＥＭＣＨおよびＢＭＰＨは、ろ過中の大幅なコンジュゲートの損失をもたらしたが、マレイミドＰＥＧ２ヒドラジド（ＭＰ２Ｈ）およびマレイミドＰＥＧ２アミン（ＭＰ２Ａ）リンカーの損失はごくわずかであった。 ＊ゼロと比較してｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙを用いたＡＮＯＶＡおよびｎ＝４。 抗ＴＮＦａ ＶＨＨ抗体およびＥＭＣＨまたはＭＰ２Ｈのいずれかを使用して作製された抗ＴＮＦａ ＭＶＰの関節内（ＩＡ）保持率の比較を示す。両方のＭＶＰは、非結合型抗ＴＮＦａＶＨＨと比較してＩＡ半減期が大幅に増加した。ＭＰ２Ｈで作成されたＭＶＰは、ＥＭＣＨで作成されたＭＶＰと比較して、関節内半減期が有意に長かった（Ｔｕｋｅｙを用いたＡＮＯＶＡおよびｎ＝４）。 Ｚｅｂａ ７ ｋＤａ ＭＷＣＯ脱塩カラムを用いた粗（左）または精製（右）の中間体４０（ＥＭＣＨ、上）および４１（ＭＰ２Ｈ、下）中間反応生成物の精製を示す逆相ＨＰＬＣ ２３０および２５４ｎｍトレースを示す。 Ｚｅｂａ ７ ｋＤａ ＭＷＣＯ脱塩カラムを用いた粗（左）または精製（右）の中間体４０（ＥＭＣＨ、上）および４１（ＭＰ２Ｈ、下）中間反応生成物の精製を示す逆相ＨＰＬＣ ２３０および２５４ｎｍトレースを示す。 ＰＡＧＥ試料を加熱せずに行われた、ＥＭＣＨリンカー（ラベルＡ）またはＭＰ２Ｈリンカー（ラベルＢ）を有する８３０ｋＤａのＨＡ中間体で作製されたアバスチンポリマーコンジュゲートのＰＡＧＥ分析を示す。ゲルに移動しなかったバンドは、コンジュゲートの形成を示す。 ＭＰ２Ｈリンカー（標識された）を有する８３０ｋＤａのＨＡ中間体で作製されたヤギ抗ヒトＩｇＧポリマーコンジュゲートのＰＡＧＥ分析を示す。ゲルに移動しなかったバンドは、コンジュゲートの形成を示す。 ＭＰ２ＨまたはＥＭＣＨリンカーのいずれかからなる８３０ｋＤａのＨＡ中間体で合成された抗ＶＥＧＦ Ｇ５－１ポリマーコンジュゲート２４および２５のＨＰＬＣ ＳＥＣ ２８０ｎｍトレースおよび０．２μｍフィルターを使用したコンジュゲートのろ過回収を示す。 ＭＰ２Ｈ（３０）またはＥＭＣＨ（３１）のいずれかからなる８３０ｋＤａのＨＡ中間体で合成された抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎコンジュゲート３０および３１のＨＰＬＣ ＳＥＣ ２８０ｎｍトレースを示す。ＥＭＣＨリンカーは、ＭＰ２Ｈリンカーと比較して低い反応効率、保持時間によるサイズ、高い割合の未反応のＤＡＲＰｉｎを示す。 ＥＭＣＨアバスチンコンジュゲートまたはアバスチン単独と比較した、ＭＰ２ＨアバスチンＩｇＧコンジュゲートの改善された結合動態を示すＢＬＩ生物活性データを示す。トラウト（Ｔｒａｕｔ）のアバスチンは、２－イミノチオラン（トラウト試薬）で活性化した後のアバスチンＩｇＧの結合データを示す。 Ｇ５－１単独と比較したＭＰ２Ｈ Ｇ５－１抗ＶＥＧＦコンジュゲートおよびＥＭＣＨ Ｇ５－１コンジュゲートの結合動態を示す生物活性データを示す。Ｇ５－１ ＭＰ２Ｈ＝コンジュゲート２４、Ｇ５－１ ＥＭＣＨ＝コンジュゲート２５。 異なる力価で合成されたＭＰ２Ｈ（コンジュゲート３２～３５）またはＥＭＣＨ（コンジュゲート３６～３９）抗ＴＮＦａポリマーコンジュゲートのろ過回収および反応効率を示す。 異なる力価で合成されたＭＰ２Ｈ（コンジュゲート３２～３５）またはＥＭＣＨ（コンジュゲート３６～３９）抗ＴＮＦａポリマーコンジュゲートのろ過回収および反応効率を示す。 異なる力価で合成されたタンパク質コンジュゲート３２～３５（ＭＰ２Ｈ）または３６～３８（ＥＭＣＨ）抗ＴＮＦａポリマーコンジュゲートの結合動態を示す。ＥＭＣＨはＭＰＨ２と比較して低い結合価で高い結合親和性を示したが、ＥＭＣＨコンジュゲートは達成可能な最大結合価（ペプチド結合価７５を超えて沈殿）に制限され、高いペプチド結合価で低い反応効率および不十分な取り扱い性を示した。Ｋｄが０．００１の場合、読み取り値がＬＯＤ未満であることを示す。 ペプチドタンパク質コンジュゲート４１またはペプチド（ＤＡＲＰｉｎ）単独の硝子体内半減期を示す。 ２ｋＤａのナトリウム利尿ペプチドを使用する精製ペプチドポリマーコンジュゲートおよびＥＭＣＨ（ラベルＡまたはＤ）またはＭＰ２Ｈ（ラベルＢまたはＣ）を含むポリマー中間体を試料の熱変性あり（図１８Ｂ）および試料の熱変性なし（図１８Ａ）で実行したＰＡＧＥ分析を示す。ゲルに移動しなかったバンドは、コンジュゲートの形成を示す。 ２ｋＤａのナトリウム利尿ペプチドを使用する精製ペプチドポリマーコンジュゲートおよびＥＭＣＨ（ラベルＡまたはＤ）またはＭＰ２Ｈ（ラベルＢまたはＣ）を含むポリマー中間体を試料の熱変性あり（図１８Ｂ）および試料の熱変性なし（図１８Ａ）で実行したＰＡＧＥ分析を示す。ゲルに移動しなかったバンドは、コンジュゲートの形成を示す。

発明の詳細な説明
Ｉ． 概要
本発明は、親水性リンカーを使用して各ペプチドをポリマーに共有結合させるペプチド－ポリマーコンジュゲートを提供する。親水性ポリマーは、ペプチド－ポリマーコンジュゲートに追加の安定性を提供する。

ＩＩ． 定義
特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、本明細書に記載の方法または材料と類似または同等の任意の方法または材料を、本発明の実施において使用することができる。本発明の目的のために、以下の用語が定義される。

「チオール反応性基」は、チオールと反応して硫黄原子との共有結合を形成することができる基を指す。代表的なチオール反応性基は、チオール、ＴＮＢ－チオール、ハロアセチル、アジリジン、アクリロイル、ビニルスルホン、ＡＰＮ（３－アリールプロピオロニトリル）、マレイミド、およびピリジルジスルフィドを含むが、これらに限定されない。チオール反応性基とチオールとの反応は、ジスルフィドまたはチオエーテルを形成することができる。

「チオール」は－ＳＨ官能基を指す。

「ヘテロアルキル」は、任意の適切な長さであり、Ｎ、ＯおよびＳ等の１～６個のヘテロ原子を有するアルキル基を指す。Ｂ、Ａｌ、ＳｉおよびＰを含むがこれらに限定されない追加のヘテロ原子も有用であり得る。－Ｓ（Ｏ）－および－Ｓ（Ｏ）₂－等であるがこれらに限定されないヘテロ原子も酸化され得る。たとえば、ヘテロアルキルは、エーテル、チオエーテル、およびアルキルアミンを含んでもよい。ヘテロアルキルのヘテロ原子部分は、アルキル基の水素を置換して、ヒドロキシ、チオ、またはアミノ基を形成することができる。あるいは、ヘテロ原子部分は、結合原子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ａｔｏｍ）であるか、または２つの炭素原子の間に挿入されていてもよい。

「ヘテロアルキレン」は、上記で定義されたように、少なくとも２つの他の基を結合するヘテロアルキル基を指す。ヘテロアルキレンに結合した２つの部分は、ヘテロアルキレンの同じ原子または異なる原子に結合することができる。

「カルボキシ反応性基」は、カルボキシまたはカルボン酸基、すなわち、－ＣＯＯＨと反応することができる基を指す。代表的なカルボキシ反応性基は、アミン、ヒドラジド、アルコール、およびチオールを含むが、これらに限定されない。カルボキシ反応性基との反応は、アミド、エステルまたはチオエステルを形成する可能性がある。

本明細書で使用する「ＨｙＡ」は、ヒアルロン酸を指す。

「ＣＭＣ」は、カルボキシメチルセルロースを指す。

「ｓｃＦｖ」は、単鎖可変領域（ｓｍａｌｌ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）抗体を指す。

本明細書で使用する「ＶＨＨ」は、単一ドメイン重鎖抗体を指す。

「ＤＡＲＰｉｎ」は、設計されたアンキリン反復タンパク質を指す。これは、遺伝子操作された抗体模倣タンパク質であり、高特異性および高親和性の標的タンパク質結合を示すことができる。

本明細書で使用する「関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）」は、線維性または軟骨性関節を指し、これは、２つ以上の骨が互いに接続する線維性または軟骨性の領域である。

本明細書で使用する「治療有効量」は、それが投与される治療効果を生み出す用量を指す。正確な用量は、治療の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である（たとえば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ （ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）； Ｌｌｏｙｄ， Ｔｈｅ Ａｒｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ （１９９９）； Ｐｉｃｋａｒ， Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ （１９９９）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。感作細胞では、治療有効量は、非感作細胞の通常の治療有効量よりも低くなることが多い。

本明細書で使用する「生体適合性ポリマー」は、注射部位の関節と適合性のあるポリマーを指す。代表的な生体適合性ポリマーは、多糖類、グリコサミノグリカン、およびヒアルロン酸を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用する「ポリマー分子量」は、ポリマーの分子量を指す。

「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さの天然および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。「ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端メチオニン残基を伴うまたは伴わない異種および相同リーダー配列との融合を含むがこれらに限定されない、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質；免疫学的にタグ付けされたタンパク質；等を含む。「ポリペプチド」という用語は、翻訳後修飾されたポリペプチドを含む。

本明細書で使用する「調節する」は、関連する活性（たとえば、免疫細胞機能）の機能または活性を増加または減少させる化合物の能力を指す。

「免疫細胞機能」は、たとえば、免疫応答の調節を含む。調節は、免疫抑制性または免疫刺激性であってもよい。免疫応答の例は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、または炎症性応答を含んでもよく、これらに限定されない。

本明細書で使用する「阻害」、「阻害する」および「阻害剤」は、特定の作用または機能を妨げる化合物または妨げる方法を指す。

本明細書で使用する「抗体」は、抗原に特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片によってコードされるポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ミュー定常領域遺伝子、および種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ定義する。抗体は、ホルモン受容体、末梢性ベンゾジアゼピン受容体などの薬物標的、および担体タンパク質を含む多種多様な受容体の代表である。代表的な抗体は、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体断片、単鎖ｓｃＦｖ抗体、単一ドメイン重鎖ＶＨＨ抗体、またはアドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、操作されたクニッツ型阻害剤等の操作された抗体様スキャフォールドを含むが、これらに限定されない。他の例は、腫瘍壊死因子－αおよびＩＬ－１β、ＩＬ－６、またはインターフェロン－γ等の免疫調節性サイトカインのデコイ受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｃｏｙ）も含む。

本明細書で使用する「硫化物結合」は、硫黄共有結合を有する任意の部分を指す。

本明細書で使用する「拡散半減期」は、所与の体積または空間内のコンジュゲートの初期濃度が半分に減少するのにかかる時間を指し、濃度の減少は濃度勾配の関数である。

本明細書で使用する「関節内半減期（Ｉｎｔｒａ－ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）」は、特定の関節内のコンジュゲートの初期濃度が半分に減少するのにかかる時間を指し、関節からの輸送は対流を介する。対流輸送は、拡散と移流による輸送の組み合わせであり、移流輸送は、バルク運動（ｂｕｌｋ ｍｏｔｉｏｎ）による物質の輸送である。

本明細書で使用する「医薬組成物」は、特定の量の特定の成分を含む製品、ならびに特定の量の特定の成分の組み合わせから直接的または間接的に生じる任意の製品を指す。医薬組成物は、一般に生体利用に対して安全である。

本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」および「薬学的に許容される賦形剤」は、対象による吸収に対する活性剤の投与を助ける物質を指す。本発明において有用な医薬担体および／または賦形剤は、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、および着色剤を含むが、これらに限定されない。当業者は、他の医薬担体および／または賦形剤が本発明において有用であることを認識するであろう。

ＩＩＩ． ペプチド－ポリマーコンジュゲート
本発明は、高分子量ポリマー、および同様の濃度の非結合ペプチドよりも高い力価を有する複数のペプチドとの結合体を提供し、ここで、ペプチドは、親水性リンカーを介してポリマーに共有結合している。一部の実施形態において、本発明は、式Ｉ：

のコンジュゲートを提供する。ここで、各Ｘは、独立して、約５ｋＤａ～約２００ｋＤａの分子量を有するペプチドであり；各Ｙは独立して親水性リンカーであり；Ｚは、約０．１ＭＤａ～約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーであり；および下付き文字ｎは、１０～１０００の整数である。

抗ＶＥＧＦペプチド
本開示の方法で使用するためのコンジュゲートに含めるのに適したペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、および網膜細胞の機能を増強するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。

本開示の方法で使用するための、コンジュゲートに含めるのに適したペプチドは、神経保護ポリペプチド（たとえば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ４、ＮＧＦ、およびＮＴＮ）；抗血管新生ポリペプチド（たとえば、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体）；ＶＥＧＦ結合抗体；ＶＥＧＦ結合抗体断片（たとえば、単鎖抗ＶＥＧＦ抗体）；エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １２：６５９）；可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（たとえば、Ｐｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １６：１０を参照）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；可溶性Ｔｉｅ－２受容体；等）；組織メタロプロテアーゼ阻害物質－３（ＴＩＭＰ－３）；光応答性オプシン、たとえばロドプシン；抗アポトーシスポリペプチド（たとえば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘｌ）；等を含むが、これに限定されない。適切なポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；線維芽細胞増殖因子２；ニュールツリン（ＮＴＮ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；上皮増殖因子；ロドプシン；Ｘ連鎖アポトーシス抑制タンパク質（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）；およびソニックヘッジホッグを含むが、これらに限定されない。

本開示の方法で使用するための、コンジュゲートに含めるのに適したペプチドは、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体；アンジオスタチン；エンドスタチン；バソスタチン；網膜色素上皮特異的タンパク質 ６５ｋＤａ（ＲＰＥ６５）；およびコンプスタチンを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、生理活性ポリペプチドは、可溶性Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－１（ｓＦｌｔ－１）ポリペプチドである。一部の実施形態では、生理活性ポリペプチドは、単一ドメインラクダ（ＶＨＨ）抗ＶＥＧＦ抗体（ＶＨＨ抗ＶＥＧＦ抗体）である。一部の実施形態では、生理活性ポリペプチドは、単鎖Ｆｖ抗ＶＥＧＦ抗体（ｓｃＦｖ抗ＶＥＧＦ抗体）である。一部の実施形態では、ペプチドは、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、クニッツ型阻害剤、またはデコイ受容体である。

本開示の方法で使用するための、コンジュゲートに含めるのに適したペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮増殖因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス抑制タンパク質、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ相互作用タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２、ロドプシン、およびソニックヘッジホッグを含むが、これらに限定されない。

適切なポリペプチドは、レチノスキシンも含む。適切なポリペプチドは、たとえば、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質－１（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、およびＱ９ＧＬＭ３を参照）；ペリフェリン－２（Ｐｒｐｈ２）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００３１３；およびＴｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：７３３を参照）；ペリフェリン；網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ３９６６０；およびＭｏｒｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：３０８８を参照）；等を含む。

適切なポリペプチドは、以下も含む：ＣＨＭ（全脈絡膜萎縮［ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｍｉａ］（Ｒａｂエスコートタンパク質１））、欠損があるかまたは欠落している場合に全脈絡膜萎縮［ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｍｉａ］を引き起こすポリペプチド（たとえば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ３：１０１７；およびｖａｎ Ｂｏｋｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ３：１０４１を参照）；およびＣｒｕｍｂｓ ｈｏｍｏｌｏｇ １ （ＣＲＢ１）、欠損があるかまたは欠落している場合にレーバー先天黒内障および網膜色素変性症を引き起こすポリペプチド（たとえば、ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２３：２１７；およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ２３３２８を参照）。

適切なポリペプチドは、欠損があるかまたは欠落している場合に色覚異常（ａｃｈｒｏｍｏｔｏｐｓｉａ）を引き起こすペプチドも含み、ここでそのようなポリペプチドは、たとえば錐体視細胞ｃＧＭＰ依存性チャネルαサブユニット（ＣＮＧＡ３）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２８９；およびＢｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１８：１６０－１６７を参照）；錐体視細胞ｃＧＭＰ依存性カチオンチャネルβサブユニット（ＣＮＧＢ３）（たとえば、Ｋｏｈｌ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． １３（３）：３０２を参照）；グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、ａｌｐｈａ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ２（ＧＮＡＴ２） （ＡＣＨＭ４）；およびＡＣＨＭ５；および欠損があるかまたは欠落している場合に様々な形の色覚異常を引き起こすポリペプチド（たとえば、Ｌ－オプシン、Ｍ－オプシン、およびＳ－オプシン）を含む。たとえば、Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｔｕｒｅ ４６１（７２６５）：７８４－７８７を参照されたい。

本開示の方法で使用するための、コンジュゲートに含めるのに適したペプチドは、抗体を含む。適切な抗体は、たとえばＶＥＧＦ特異的抗体；腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）特異的抗体；等を含む。

適切な抗体は、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、クラザキズマブ（ｃｌａａｋｉｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エタラシズマブ、フェザキヌマブ（ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィギツムマブ、フォントリズマブ、ゲボキズマブ、ゴリムマブ（ｇｏｔｉｍｕｍａｂ）、インフリキシマブ、ナミルマブ（ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナミルマブ（ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナタリズマブ、ニュートラズマブ（ｎｅｕｔｒａｚｕｍａｂ）、ニュートマブ（ｎｅｘｔｏｍａｂ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ、オロキズマブ（ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ（ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、ラニビズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、シルクマブ、ソネプシズマブ（ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、タバルマブ、トシリズマブ、トラリズマブ（ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ウステキヌマブ、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ビジリズマブ、ボルセツズマブ、およびジラリムマブ（ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）を含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、ペプチドは、可溶性Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－１（ｓＦｌｔ－１）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列の１００アミノ酸（ａａ）から２００アミノ酸まで、２００アミノ酸から３００アミノ酸まで、３００アミノ酸から４００アミノ酸まで、４００アミノ酸から５００アミノ酸まで、５００アミノ酸から６００アミノ酸まで、６００アミノ酸から７００アミノ酸まで、７００アミノ酸から７５５アミノ酸までの連続したストレッチに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１５０アミノ酸～２００アミノ酸、２００アミノ酸～２５０アミノ酸、２５０アミノ酸～３００アミノ酸、３００アミノ酸～３５０アミノ酸、または３５０アミノ酸～４００アミノ酸の長さを有するｓＦｌｔ－１ポリペプチドである。

一部の実施形態では、ペプチドは、ｓｃＦｖ抗ＶＥＧＦ抗体である。任意の適したｓｃＦｖ抗ＶＥＧＦ抗体を使用することができる。ｓｃＦｖ抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列の非限定的な例は、配列番号１６に示される。エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）およびｐｏｌｙ（Ｈｉｓ） ｔｒａｃｔ （ＨＨＨＨＨＨ）は、Ｆ配列番号１６に示されるｓｃＦｖ抗ＶＥＧＦ抗体のカルボキシル末端に存在する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ抗ＶＥＧＦ抗体は、エンテロキナーゼ切断部位またはｐｏｌｙ（Ｈｉｓ） ｔｒａｃｔ を含まない。

一部の実施形態では、ペプチドは、単一ドメインラクダ（ＶＨＨ）抗ＶＥＧＦ抗体である。任意の適したＶＨＨ抗ＶＥＧＦ抗体を使用することができる。ＶＨＨ抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列の非限定的な例は、配列番号１７に示される。エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）およびｐｏｌｙ（Ｈｉｓ） ｔｒａｃｔ （ＨＨＨＨＨＨ）は、配列番号１７に示されるＶＨＨ抗ＶＥＧＦ抗体のカルボキシル末端に存在する。一部の実施形態では、ＶＨＨ抗ＶＥＧＦ抗体は、エンテロキナーゼ切断部位またはｐｏｌｙ（Ｈｉｓ） ｔｒａｃｔを含まない。

一部の実施形態では、ペプチドは、血管新生の阻害剤である。一部の実施形態では、ペプチドは、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、ＶＥＧＦ特異的受容体、またはＶＥＧＦ特異的ＤＡＲＰｉｎである。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２、ＰＤＧＦ、またはＰｌＧＦを阻害する。一部の実施形態では、ペプチドは、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体断片、単鎖可変領域抗体、単一ドメイン重鎖抗体、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、クニッツ型阻害剤、またはデコイ受容体である。

抗ＴＮＦαペプチド
本発明に適したペプチドは、少なくとも２ｋＤａの分子量を有し、および立体構造を示すペプチドである。代表的なペプチドは、ポリペプチド、一つまたは複数のアプタマー、ヒトＡドメインに基づくアビマースキャフォールド、ジアボディ、ラクダ（ｃａｍｅｌｉｄ）、サメＩｇＮＡＲ抗体、改変された特異性を有するフィブロネクチンＩＩＩ型スキャフォールド、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、ペプチドは治療用タンパク質である。エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、ヒト成長ホルモン、およびイミグルセラーゼ等の多数の治療用タンパク質が本願全体で開示されているが、これに限定されない。

一部の実施形態では、ペプチドは、以下を含むがこれらに限定されない、明確に同定されたタンパク質またはペプチド剤から選択することができる： Ａβ、アガルシダーゼ、アレファセプト、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、アムドキソビル（ＤＡＰＤ）、ａｎｔｉｄｅ、ベカプレルミン、タイプＡおよびＢを含むボツリヌス毒素およびボツリヌス毒素活性を有する低分子量化合物、カルシトニン、シアノビリン（ｃｙａｎｏｖｉｒｉｎ）、デニロイキンジフチトクス、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯアゴニスト、ドルナーゼアルファ、赤血球生成促進タンパク質（ＮＥＳＰ）、ファクターＶ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩａ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、ファクターＸ、ファクターＸＩＩ、ファクターＸＩＩＩ、フォン・ヴィレブランド因子等の凝固因子；ｃｅｒｅｄａｓｅ、セレザイム、αグルコシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ、コラーゲン、シクロスポリン、αディフェンシン、βディフェンシン、デスモプレシン、エキセンディン－４、サイトカイン、サイトカイン受容体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、α１プロテイナーゼインヒビター、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、フィブリノゲン、フィルグラスチム、成長ホルモンヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ソマトロピン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ＧＲＯ－β、ＧＲＯ－β抗体、骨形態形成タンパク質－２、骨形態形成タンパク質－６等の骨形態形成タンパク質、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ＯＰ－１；酸性線維芽細胞増殖因子、アルカリ性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２１、ＣＤ－４０リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω、インターフェロンτ、コンセンサスインターフェロン、ｌｙｓｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ－ｌｉｋｅ－２ （ＬＯＸＬ２）；インターロイキンおよびインターロイキン受容体、たとえばインターフェロン－１受容体、インターロイキン－２、インターロイキン－２融合タンパク質、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン－４受容体、インターロイキン－６、インターロイキン－８、インターロイキン－１２、インターロイキン－１５、インターロイキン－１７、インターロイキン－２１、インターロイキン－２３、ｐ４０、インターロイキン－１３受容体、インターロイキン－１７受容体；ラクトフェリンおよびラクトフェリン断片、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インスリン、プロインスリン、インスリンアナログ、レプチン、グレリン、アミリン、Ｃ－ペプチド、ソマトスタチン、オクトレオチドを含むソマトスタチンアナログ、バソプレシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、イミグルセラーゼ、インフルエンザワクチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリントロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｔｒｏｐｉｎ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、およびテネプラーゼ等のプラスミノーゲン活性化因子；神経成長因子（ＮＧＦ）、オステオプロテジェリン、血小板由来成長因子、組織成長因子、トランスフォーミング増殖因子－１、血管内皮成長因子、白血病抑制因子、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、グリア細胞増殖因子（ＧＧＦ）、T細胞受容体、ＣＤ分子／抗原、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（たとえば、ＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－β）、ＴＮＦ受容体（たとえば、ＴＮＦ－α受容体およびＴＮＦ－β受容体）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４受容体、単球走化性タンパク質－１、内皮増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチド、ソマトトロピン、サイモシンα１、ラスブリカーゼ、サイモシンα１ ＩＩｂ／ＩＩＩａインヒビター、サイモシンβ１０、サイモシンβ９、サイモシンβ４、α－１アンチトリプシン、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）化合物、ＶＬＡ－４（最晩期抗原－４）、ＶＬＡ－４インヒビター、ビスホスホネート、呼吸器多核体ウイルス抗体、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、殺菌性透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）、および抗ＣＭＶ抗体。例示的なモノクローナル抗体は、エタネルセプト（ＩｇＧ１のＦｃ部分に結合したヒト７５ｋＤ ＴＮＦ受容体の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合タンパク質）、アブシキシマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アレムツズマブ、Ｂリンパ球に対する抗体、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ（ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ、ＣＤＰ－４８４、ＣＤＰ－５７１、ＣＤＰ－７９１、ＣＤＰ－８６０、ＣＤＰ－８７０、セツキシマブ、クレノリキシマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、フォントリズマブ、ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イノリモマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ、オマリズマブ（ｏｌｉｚｕｍａｂ）、放射標識ｌｙｍ－１、ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ、メポリズマブ、ｍｉｔｕｍｏｍａｂ、ムロモナブ－ＣＤ３（ｍｕｒｏｍｏｎａｄ－ＣＤ３）、ネバクマブ、ナタリズマブ、ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ、パキセリズマブ、ｒｈｕＭＡｂ－ＶＥＧＦ、リツキシマブ、ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ、ｓｅｖｉｒｕｍａｂ、シプリズマブ、トシツモマブ、Ｉ¹³¹トシツモマブ、トラツズマブ、ｔｕｖｉｒｕｍａｂ、ビジリズマブ、およびそれらの断片および模倣物を含む。

一部の実施形態では、ペプチドは融合タンパク質である。たとえば、限定されないが、ペプチドは、一つまたは複数の特定の有用なペプチド配列に融合された免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの一部であってもよい。たとえば、ペプチドは抗体Fc断片を含んでもよい。一つの実施形態では、ペプチドはＣＴＬＡ４融合タンパク質である。たとえば、ペプチドはＦｃ－ＣＴＬＡ４融合タンパク質であってもよい。別の実施形態では、ペプチドは、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質である。たとえば、ペプチドは、Ｆｃ－第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であってもよい。

一部の実施形態では、ペプチドは、ヒトタンパク質またはヒトポリペプチド、たとえば、異種生産されたヒトタンパク質またはヒトポリペプチドである。対応するヒト型（すなわち、タンパク質またはペプチドは通常、人体のヒト細胞で産生される）が存在する多数のタンパク質およびポリペプチドが本明細書に開示されている。したがって、一つの実施形態では、ペプチドは、ヒト型が存在する、本明細書に開示されるタンパク質およびポリペプチドのそれぞれのヒト型である。そのようなヒトタンパク質の例は、ヒト抗体、ヒト酵素、ヒトホルモン、および顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン（たとえば、アルファインターフェロンおよびベータインターフェロン）、ヒト成長ホルモンおよびエリスロポエチン等のヒトサイトカインを含むが、これらに限定されない。

治療用タンパク質の他の例は、第ＶＩＩＩ因子、ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、抗凝固剤；ヒルジン、アルテプラーゼ、ｔｐａ、レテプラーゼ、ｔｐａ、５つのドメインのうち３つが欠失したｔｐａ、インスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、長時間作用型インシュリンアナログ、ｈｇｈ、グルカゴン、ｔｓｈ、フォリトロピンベータ、ｆｓｈ、ｇｍ－ｃｓｆ、ｐｄｇｈ、ｉｆｎ α２、ｉｆｎ α２ａ、ｉｆｎ α２ｂ、ｉｎｆ－ａｐｈａ１、コンセンサスｉｆｎ、ｉｆｎ－β、ｉｆｎ－β １ｂ、ｉｆｎ－β １ａ、ｉｆｎ－γ（たとえば、１および２）、ｉｆｎ－λ、ｉｆｎ －δ、ｉｌ－２、ｉｌ－１１、ｈｂｓａｇ、ｏｓｐａ、ｔリンパ球抗原に対するマウスｍａｂ、ｔａｇ－７２に対するマウスｍａｂ、腫瘍関連糖タンパク質、血小板表面受容体ｇｐＩＩ（ｂ）／ＩＩＩ（ａ）に対するキメラｍａｂに由来するｆａｂ断片、腫瘍関連抗原ｃａｌ ２５に対するマウスｍａｂ断片、ヒトがん胚性抗原に向けられたマウスｍａｂ断片、ｃｅａ、ヒト心臓ミオシンに対するマウスｍａｂ断片、腫瘍表面抗原ｐｓｍａに対するマウスｍａｂ断片、ｈｍｗ－ｍａａに対するマウスｍａｂ断片（ｆａｂ／ｆａｂ２混合物）、がん関連抗原に対するマウスｍａｂ断片（ｆａｂ）、ｎｃａ ９０に対するｍａｂ断片（ｆａｂ）、表面顆粒球非特異的交差反応抗原、ｂリンパ球の表面に見られるＣＤ２０抗原に対するキメラｍａｂ、ｉｌ２受容体のアルファ鎖に対するヒト化ｍａｂ、ｉｌ２受容体のアルファ鎖に対するキメラｍａｂ、ｔｎｆ－ａｌｐｈａに対するキメラｍａｂ、呼吸器多核体ウイルスの表面上のエピトープに対するヒト化ｍａｂ、ｈｅｒ２に対するヒト化ｍａｂ、ヒト表皮成長因子受容体２、サイトケラチン腫瘍関連抗原抗ｃｔｌａ４に対するヒトｍａｂ、ｂリンパ球ドルナーゼアルファｄｎａｓｅのｃｄ２０表面抗原に対するキメラｍａｂ、ベータグルコセレブロシダーゼ、ｔｎｆ－α、ｉｌ－２－ジフテリア毒素融合タンパク質、ｔｎｆｒ－ｌｇｇ断片融合タンパク質ラロニダーゼ、ｄｎａａｓｅｓ、アレファセプト、ダルベポエチンアルファ（コロニー刺激因子）、トシツモマブ、マウスｍａｂ、アレムツズマブ、ラスブリカーゼ、アガルシダーゼβ、テリパラチド、副甲状腺ホルモン誘導体、アダリムマブ（ｌｇｇ１）、アナキンラ、生物学的修飾因子、ネシリチド、ヒトｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈｂｎｐ）、コロニー刺激因子、ペグビソマント、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト、組換え活性化プロテインｃ、オマリズマブ、免疫グロブリンｅ（ｌｇｅ）ブロッカー、リブリツモマブチウキセタン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン（ｐｉｇｍｅｎｔａｒｙ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体化ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部放出因子、エタネルセプト、抗利尿ホルモン、プロラクチンおよび甲状腺刺激ホルモンを含むが、これらに限定されない。そして、これらのいずれも、天然（たとえば、セリンからシステインへの置換）（たとえば、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの方法ごとのホルミルアルデヒド）または非天然アミノ酸を使用して、部位特異的結合点（Ｎ末端、またはＣ末端、または他の位置）を有するように改変することができる。

本発明において有用な治療用抗体（またはそれらのそれぞれのｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）の例は、ＴＮＦデコイ受容体エタネルセプトおよびモノクローナル抗体アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、およびセルトリズマブ等の抗ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ－６モノクローナル抗体阻害剤シルツキシマブ、ＩＬ－１７モノクローナル抗体阻害剤セクキヌマブおよびイキセキズマブ、ＩＬ－１２／２３モノクローナル抗体阻害剤ウステキヌマブ、モノクローナル抗体阻害剤ナタリズマブおよびエトロリズマブ等のインテグリン受容体アンタゴニスト、ＣＬＴＡ受容体アンタゴニストアバタセプト、ＩＬ－１３モノクローナル抗体阻害剤トラロキヌマブ、モノクローナル抗体エルデルマブおよびベルチルマブ等のケモカイン阻害剤、ならびにデコイ受容体リロナセプトおよびモノクローナル抗体カナキヌマブ等のＩＬ－１阻害剤を含むが、これらに限定されない。

本発明において有用な治療用抗体（またはそれらのそれぞれのｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）の他の例は、転移性乳がん患者の治療のための抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ、ＣＡ）；血餅形成を防ぐための血小板上の抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩｃ受容体である、レオプロ（商標）（アブシキシマブ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；急性腎同種移植片拒絶反応を予防するための免疫抑制性のヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体である、ゼナパックス（商標）（ダクリズマブ）（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、スイス）；マウス抗１７－ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体である、ＰＡＮＯＲＥＸ（商標）（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；マウス抗イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体であるＢＥＣ２（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ）；キメラ抗ＥＧＦＲＩｇＧ抗体であるＩＭＣ－Ｃ２２５（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ）；ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体であるＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；キャンパス；ヒト化抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１抗体であるキャンパス１Ｈ／ＬＤＰ－０３（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ）；ヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔ Ｍ１９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂ／Ｋａｎｅｂｏ）；キメラ抗ＣＤ２Ｏ ＩｇＧ１抗体であるリツキサン（商標）（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｒｏｃｈｅ／Ｚｅｔｔｙａｋｕ）；ヒト化抗ＣＤ２２ ＩｇＧ抗体であるＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体であるＩＣＭ３（ＩＣＯＳ Ｐｈａｒｍ）；霊長類の抗ＣＤ８０抗体であるＩＤＥＣ－１１４（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍ／Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）；放射性標識マウス抗ＣＤ２０抗体であるゼヴァリン（商標）（ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ－１３１；霊長類化された抗ＣＤ４抗体であるＩＤＥＣ－１５１（ＩＤＥＣ）；霊長類化された抗ＣＤ２３抗体であるＩＤＥＣ－１５２（ＩＤＥＣ／Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）；ヒト化抗ＣＤ３ ＩｇＧである、ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂ）；ヒト化ａｎｔｉ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ ５ （ＣＳ）抗体である５Ｇ１．１（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍ）；ヒト化抗ＴＮＦ－α抗体であるＤ２Ｅ７（ＣＡＴＩＢＡＳＦ）；ヒト化抗ＴＮＦ－α Ｆａｂ断片であるＣＤＰ８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；霊長類化された抗ＣＤ４ ＩｇＧ１抗体であるＩＤＥＣ－１５１（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）；ヒト化抗ＣＤ４ ＩｇＧ抗体であるＭＤＸ－ＣＤ４（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｅｉｓａｉ／Ｇｅｎｍａｂ）；ヒト化抗ＴＮＦ－α ＩｇＧ４抗体であるＣＤｐ５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ヒト化抗α４β７抗体であるＬＤＰ－０２（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ４ ＩｇＧ抗体であるＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ ＯＫＴ４Ａ（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ ＩｇＧ抗体であるＡＮＴＯＶＡ（商標）（Ｂｉｏｇｅｎ）；ヒト化抗ＶＬＡ－４ ＩｇＧ抗体であるアンテグレン（商標）（Ｅｌａｎ）；ヒト化抗ＴＧＦ－β．ｓｕｂ．２抗体であるＣＡＴ－１５２（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｂ Ｔｅｃｈ）；モノクローナル抗ＥＧＦ受容体（ＥＧＦｒ）抗体であるセツキシマブ（ＢＭＳ）；抗ＶＥＧＦヒトモノクローナル抗体であるベバシズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；自己免疫疾患の治療に使用されるキメラ（マウスおよびヒト）モノクローナル抗体であるインフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ，ＪＪ）；化学療法のために使用されるモノクローナル抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン（Ｗｙｅｔｈ）；および黄斑変性症の治療に使用されるキメラ（マウスおよびヒト）モノクローナル抗体であるラニビズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含むが、これらに限定されない。

本明細書に開示されるタンパク質およびペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成による生産および生物系での生産を含む任意の有用な方法によって生産することができる。当技術分野でよく知られているｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法の典型的な例は、固相合成（「ＳＰＰＳ」）および固相断片濃縮（「ＳＰＦＣ」）を含む。タンパク質の生産に使用される生物系もまた、当技術分野でよく知られている。細菌（たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）、酵母（たとえば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、タバコの葉（タバコモザイクウイルスを介して）は、異種タンパク質の生産に広く使用されている。さらに、本明細書に開示されるように使用するためのペプチドの産生のための異種遺伝子発現は、哺乳動物細胞株（たとえば、ＣＨＯ細胞）等の動物細胞株を使用して達成することができる。一つの特に有用な実施形態では、ペプチドは、それぞれ当技術分野で理解されるように、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびトリ（たとえば、ニワトリ、ウズラ、アヒルおよびシチメンチョウ）等のトランスジェニックまたはクローン化動物において産生される。たとえば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００４年８月２４日に発行された米国特許第６，７８１，０３０号を参照されたい。

本発明において有用なタンパク質またはポリペプチドはまた、タンパク質およびポリペプチドに見られる一般的な天然に存在するアミノ酸に加えて、非天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドまたはタンパク質の特性を改変する目的で存在することに加えて、天然に存在しないアミノ酸を導入して、タンパク質またはポリペプチドをランダムコポリマーに直接結合するために使用できる官能基を提供することができる。さらに、天然に存在するアミノ酸、たとえば、システイン、チロシン、トリプトファンをこのように使用することができる。

天然に存在しないアミノ酸は、様々な方法でタンパク質やペプチドに導入することができる。非天然アミノ酸を導入するための技術のいくつかは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１６２，２１８号に論じられている。第一に、天然に存在しないアミノ酸は、アミノ酸側鎖上、またはアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかでのポリペプチドまたはタンパク質の化学修飾によって導入することができる。タンパク質またはペプチドの化学修飾の非限定的な例は、ジアゾメタン等の薬剤によるメチル化、またはリジンの側鎖またはペプチドまたはタンパク質のアミノ末端に存在するアミノ基でのアセチル化の導入であってもよい。非天然アミノ酸を調製するためのタンパク質／ポリペプチドアミノ基修飾の別の例は、メチル３－メルカプトプロピオンイミデートエステルまたは２－イミノチオランを使用して、第一級アミンを有するタンパク質またはポリペプチドの位置に連結されたチオール（スルフヒドリル、－－ＳＨ）を有する官能基を導入することである。導入されると、そのような基を使用して、タンパク質またはポリペプチドへの共有結合を形成することができる。

第二に、天然に存在しないアミノ酸は、化学合成中にタンパク質やポリペプチドに導入することができる。合成法は、通常、約２００アミノ酸未満、通常は約１５０アミノ酸未満、より通常は１００アミノ酸以下のアミノ酸を有するポリペプチドを調製するために利用される。約７５アミノ酸未満または約５０アミノ酸未満を有するより短いタンパク質またはポリペプチドは、化学合成によって調製することができる。

所望の位置に非天然アミノ酸を挿入することを可能にするために特に便利な合成調製方法は、当技術分野で知られている。適切な合成ポリペプチド調製法は、アミノ酸が成長する鎖に連続的に付加されるメリフィールド固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９６３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９－２１５６）に基づいていてもよい。そのような技術によってポリペプチドを合成するための自動化された系は、現在、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ． ９４４０４； Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｅｄｉｓｏｎ， Ｎ．Ｊ． ０８８１８；およびＰｈａｒｍａｃｉａ， Ｉｎｃ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ． ０８８５４等の供給業者から市販されている。

ポリペプチドの化学合成中に導入することができる非天然アミノ酸の例は、以下を含むが、これらに限定されない： ２０種類の天然アミノ酸のＤ－アミノ酸およびＤ－型およびＬ－型アミノ酸の混合物、Ｎ－ホルミルグリシン、オルニチン、ノルロイシン、ヒドロキシプロリン、ベータアラニン、ヒドロキシバリン、ノルバリン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｔ－ブチルグリシン（ｔ－ロイシン、２－アミノ－３，３－ジメチルブタン酸）、ヒドロキシ－ｔ－ブチルグリシン、アミノ酪酸、シクロロイシン、４－ヒドロキシプロリン、ピログルタミン酸（５－オキソプロリン）、アゼチジンカルボン酸、ピペコリン酸、インドリン－２－カルボン酸 、テトラヒドロ－３－イソキノリンカルボン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２，６－ジアミノピメリン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２，６－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、５－ヒドロキシリジン、ニューラミン酸、および３，５－ジヨードチロシン。

第三に、天然に存在しないアミノ酸は、非天然アミノ酸が挿入される位置に対応するコドンのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（たとえば、遺伝子）にナンセンスコドン（たとえば、アンバーコドンまたはオーカーコドン）を挿入することにより、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的合成を通じて導入することができる。そのような技術は、たとえば、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１６２，２１８号および第６，９６４，８５９号に論じられている。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を含む変異コドンを挿入するために、様々な方法を使用することができる。改変された配列は、その後、所望の非天然アミノ酸で化学的または酵素的にアシル化されたナンセンスコドンに対するサプレッサーｔＲＮＡを提供する軽において、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳される。合成アミノ酸は、ナンセンスコドンに対応する位置に挿入される。より大きなおよび／またはグリコシル化されたポリペプチドの調製には、通常、このタイプの組換え調製技術が好ましい。この方法で導入することができるアミノ酸の中には、ホルミルグリシン、フルオロアラニン、２－アミノ－３－メルカプト－３－メチルブタン酸、ホモシステイン、ホモアルギニン等がある。タンパク質中の非天然アミノ酸を得るための他の同様のアプローチは、メチオニン置換法を含む。

天然に存在しないアミノ酸が選択的修飾を受けやすい機能性を有する場合、それらはタンパク質またはポリペプチドへの共有結合を形成するために特に有用である。機能が選択的修飾を受けやすい状況は、その機能が独特である場合、または目的の条件下で反応する可能性のある他の機能が立体化学的にまたは他の方法で妨げられる場合が含まれる。

単一ドメイン抗体等の他の抗体は、本発明において有用である。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ＡｂｌｙｎｘによってＮａｎｏｂｏｄｙと呼ばれる）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。抗体全体と同様に、ｓｄＡｂは特定の抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか１２～１５ｋＤａであるため、単一ドメイン抗体は一般的な全抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さくなる。単一ドメイン抗体は、長さが約１１０アミノ酸のペプチド鎖であり、重鎖抗体または一般的なＩｇＧの一つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

全抗体とは異なり、ＶＨＨ等の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂｓ）は、Ｆｃ領域を欠失しているため、補体系によって引き起こされる細胞毒性を示さない。ラクダ科および魚由来のｓｄＡｂは、全抗体、たとえば酵素の活性部位にはアクセスできない隠れた抗原に結合することができる。

ｓｄＡｂは、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ、またはサメを所望の抗原で免疫し、続いて重鎖抗体をコードするｍＲＮＡを単離することによって得ることができる。あるいは、合成ライブラリーをスクリーニングすることによって作成することもできる。ラクダ科の動物は、ラクダ科の亜目で唯一生きている科であるラクダ科の仲間である。ラクダ、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコがこの群に含まれる。

本発明において有用なペプチドは、大環状ペプチド、シクロチド、ＬＤＬ受容体Ａドメイン、可溶性受容体、酵素、ペプチド多量体、ドメイン多量体、抗体断片多量体、および融合タンパク質も含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、ペプチドは、免疫細胞機能の活性を調節する。一部の実施形態では、ペプチドは、腫瘍壊死因子－α、インターロイキン－１β、インターロイキン－６、またはインターフェロン－γを阻害する。一部の実施形態では、ペプチドは、腫瘍壊死因子－αを阻害する。一部の実施形態では、ペプチドは、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体断片、単鎖可変領域抗体、単一ドメイン重鎖抗体、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、クニッツ型阻害剤、またはデコイ受容体である。

一部の実施形態では、ペプチドは抗ＴＮＦａ単一ドメイン重鎖（ＶＨＨ）抗体であってもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、抗ＴＮＦαアフィボディであってもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、抗ＴＮＦαで設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）であってもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、抗ＩＬ－１Ｂ単鎖（ｓｃＦｖ）抗体であってもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、可溶性インターロイキン受容体２（ｓＩＬＲ２）であってもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号９、または配列番号１１であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号６、配列番号７、または配列番号９であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号６であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号７であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号９であるアミノ酸配列を有する。

本発明において有用なペプチドは、少なくとも２ｋＤａの分子量を有していてもよい。本発明において有用なペプチドは、少なくとも２ｋＤａの分子量を有し、および立体構造を示していてもよい。たとえば、ペプチドの分子量は、約２ｋＤａ～約１５０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１５０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１００ｋＤａ、約２ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約３０ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａであってもよい。ペプチドの代表的な分子量は、約２ｋＤａ、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、 ３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ｋＤａを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、約５ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を有する。

リンカー
本発明のリンカーは親水性リンカーである。 親水性リンカーは、核酸塩基、ダイマー、およびオリゴマー、炭水化物モノマーまたは様々な組成のオリゴ糖、デキストランス、ジペプチド、またはオリゴペプチドのような天然に存在する分子を含んでいてもよい。他の親水性リンカーは、エチレングリコールダイマー、トリマー、オリゴマーおよびポリマー、ならびにポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリレート、ペプトイド、Ｄ型または人工アミノ酸を含むペプチド、ポリマーブラシ、高分子電解質ブラシ、合成炭水化物モノマーおよびオリゴマー、切断可能なリンカーを含んでもよく、これらに限定されない。上記のような核酸－アミノ酸－合成ポリマーなどの任意の組み合わせ等。

一部の実施形態では、各親水性リンカーが独立して以下の式：

を有し、ここでＹ¹はチオール反応性基であり；Ｙ²はそれぞれ独立してＮ、Ｏ、またはＳである１～６個のヘテロ原子を有するＣ_3-20ヘテロアルキレン、または－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m－であり、ここで下付き文字ｍは、１～１００の整数である；およびＹ³はカルボキシ反応性基である。

一部の実施形態では、Ｙ²はそれぞれ独立してＮ、Ｏ、またはＳである１～６個のヘテロ原子を有するＣ_3-20ヘテロアルキレンである。一部の実施形態では、Ｙ²は－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m－であり、ここで下付き文字ｍは、１～１００の整数である。

一部の実施形態では、各親水性リンカーが独立して以下の式：

を有し、ここでＹ¹はチオール反応性基であり；Ｙ³はカルボキシ反応性基であり；および下付き文字ｍは、１～１００の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、１～１０の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、１～５の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、２～５の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、２である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、３である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、４である。

一部の実施形態では、Ｙ¹は、チオール、アリールプロピオロニトリル、またはマレイミドである；およびＹ³はアミンまたはＮ－アシルヒドラジドである。一部の実施形態では、Ｙ¹は、マレイミドである；およびＹ³はアミンまたはＮ－アシルヒドラジドである。一部の実施形態では、Ｙ¹は、マレイミドである；およびＹ³はアミンである。一部の実施形態では、Ｙ¹は、マレイミドである；およびＹ³はＮ－アシルヒドラジドである。一部の実施形態では、Ｙ¹は、アリールプロピオロニトリルである；およびＹ³はアミンまたはＮ－アシルヒドラジドである。一部の実施形態では、Ｙ¹は、アリールプロピオロニトリルである；およびＹ³はアミンである。一部の実施形態では、Ｙ¹は、アリールプロピオロニトリルである；およびＹ³はＮ－アシルヒドラジドである。

一部の実施形態では、親水性リンカーは以下の式：

を有し、ここで下付き文字ｍは、１～１００の整数である。一部の実施形態では、親水性リンカーは以下の式：

を有し、ここで下付き文字ｍは、１～１００の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、１～１０の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、１～５の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、２～５の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、２である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、３である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、４である。

一部の実施形態では、親水性リンカーは以下の式：

を有し、ここで下付き文字ｍは、１～１００の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、１～１０の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、１～５の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、２～５の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｍは、３である。

一部の実施形態では、親水性リンカーは以下の式：

を有する。

一部の実施形態では、親水性リンカーは以下の式：

を有する。

一部の実施形態では、親水性リンカーは以下の式：

を有する。

一部の実施形態では、親水性リンカーは以下の式：

を有する。

生体適合性ポリマー
本発明のコンジュゲートにおいて有用であるポリマーは、任意の生体適合性ポリマーを含む。生体適合性ポリマーは、一般的に免疫応答を引き起こさない親水性ポリマーである。適切な生体適合性ポリマーは、多糖類、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸およびその誘導体、セルロース、カルボキシメチルセルロースおよびその誘導体、ヘパリンおよびその誘導体、デルマチン（ｄｅｒｍａｔｉｎ）、デンプンおよび修飾デンプン、コンドロイチン、キトサン、カルボキシメチルキトサン等を含むが、これらに限定されない。生体適合性ポリマーは、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリウレタン、エチレン酢酸ビニルコポリマー、コラーゲン、ポリイソブチレン、エチレンビニルアルコールコポリマー、ポリエチレンポリカーボネート、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコリド、カルボマー、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアクリレート、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、多糖類（ヒアルロン酸、ヒドロキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、またはそれらの誘導体等）、ポリエーテル、それらの誘導体およびそれらの組み合わせも含む。生体適合性ポリマーは、硫酸化、スルホン化、重水素化等の方法によってさらに修飾することができる。

生体適合性ポリマーとして有用な多糖類は、とりわけセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、キチン、グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロナン（ヒアルロン酸）、ヘパリン、ヘパラン硫酸を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは多糖類である。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーはグリコサミノグリカンである。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーはヒアルロン酸である。

本発明の生体適合性ポリマーは、任意の適切な分子量のものであってもよい。たとえば、適切な生体適合性ポリマーは、約０．１ＭＤａ～約３ＭＤａ、または約１００ｋＤａ～約３，０００ｋＤａの分子量を有していてもよい。ポリマーの分子量は、通常、数平均分子量（Ｍ_n）または重量平均分子量（Ｍ_w）として表すことができる。数平均分子量は、個々の高分子の分子量の数学的平均である。重量平均分子量は、より大きな分子の影響を受けるため、数平均分子量よりも大きな数値になる。Ｍ_w／Ｍ_nの比率は、ポリマーの多分散度であり、ポリマー試料の分子量の幅を表す。本発明における分子量への言及は、特に明記しない限り、重量平均分子量（Ｍ_w）への言及である。

生体適合性ポリマーに有用な分子量は、約０．１ＭＤａ～約３ＭＤａ、約０．１ＭＤａ～約２ＭＤａ、約０．２ＭＤａ～約１．５ＭＤａ、約０．８ＭＤａ～約３ＭＤａ、約１ＭＤａ～約３ＭＤａ、約１．５ＭＤａ～約３ＭＤａ、または約１ＭＤａ～約２ＭＤａを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約０．１ＭＤａ～約３ＭＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約０．１ＭＤａ～約２ＭＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約０．２ＭＤａ～約１．５ＭＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約０．８ＭＤａ～約３ＭＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約０．１ＭＤａ、または０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３ＭＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、少なくとも約０．８５ＭＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、少なくとも約０．９ＭＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、少なくとも約１ＭＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、少なくとも約２ＭＤａの分子量を有する。

生体適合性ポリマーは、ペプチドあたり約２ｋＤａ～約７５０ｋＤａ、またはペプチドあたり約５ｋＤａ～約６００ｋＤａ、ペプチドあたり約５ｋＤａ～５００ｋＤａ、約５ｋＤａ～約４００ｋＤａ、約５ｋＤａ～約３００ｋＤａ、約５ｋＤａ～約２００ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、または約５ｋＤａ～約１０ｋＤａの分子量を有していてもよい。生体適合性ポリマーは、約５ｋＤａ、または６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００ｋＤａのペプチドあたりの分子量を有していてもよい。

コンジュゲート
本発明のペプチド－ポリマーコンジュゲートは、ペプチド対ポリマーのモル比が少なくとも５：１である、ペプチドおよび生体適合性ポリマーの任意の適切な組み合わせを含んでもよい。本発明において有用なペプチド対生体適合性ポリマーの代表的なモル比は、５：１～約１０００：１、５：１～約５００：１、５：１～約４００：１、約１０：１～約５００：１、約１０：１～約４００：１、約１０：１～約１００：１、約２０：１～約１００：１、約３０：１～約１００：１、約５０：１～約１００：１、約１０：１～約５０：１、約２０：１～約５０：１、約３０：１～約５０：１を含む。本発明において有用なペプチド対生体適合性ポリマーの他のモル比は、約５０：１～約５００：１、約５０：１～約４００：１、約５０：１～約３００：１、約５０：１～約２００：１を含む。ペプチドと生体適合性ポリマーの代表的なモル比は、約１０：１、または１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１２５：１、１５０：１、１７５：１、２００：１、２５０：１、３００：１、３５０：１、４５０：１、５００：１、５５０：１、６００：１、６５０：１、７００：１、７５０：１、８００：１、８５０：１、９００：１、９５０：１、または約１０００：１を含む。一部の実施形態では、下付き文字ｎは１０～４００の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｎは１０～１００の整数である。一部の実施形態では、下付き文字ｎは５０～１００の整数である。

本発明の生体適合性ポリマーのペプチドのコンジュゲートは、結合されていないペプチドと比較して、より長い拡散半減期を有することができる。たとえば、コンジュゲートは、ペプチドのそれより少なくとも２倍長い、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、またはペプチドのそれより少なくとも１００倍長い拡散半減期を有することができる。コンジュゲートの拡散半減期は、ペプチドの約２倍～約１００倍、または約２倍～約５０倍、約１０倍～約１００倍、約２５倍～約１００倍、またはペプチドの約５０倍～約１００倍、長くなる可能性がある。一部の実施形態では、コンジュゲートの拡散半減期は、ペプチドの約２倍である。一部の実施形態では、コンジュゲートの拡散半減期は、ペプチドより約２倍～約１００倍長い。

本発明のコンジュゲートはまた、結合されていないペプチドと比較して、より長い関節内半減期を有することができる。たとえば、コンジュゲートは、結合されていないペプチドより少なくとも２０％長い、または少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または結合されていないペプチドより１０００％長い関節内半減期を有することができる。コンジュゲートの関節内半減期は、結合されていないペプチドより約２０％～約１０００％、または約１００％～約１０００％、または約１００％～約５００％、または結合されていないペプチドより約１００％～約３００％長くてもよい。一部の実施形態では、コンジュゲートの関節内半減期は、ペプチドより約２０％長い。一部の実施形態では、コンジュゲートの関節内半減期は、ペプチドより約２０％～約１０００％長い。

一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約０．８ＭＤａ～約３ＭＤａの分子量を有する；および各ペプチドは、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量を有する；ここで各ペプチドは、ポリマーに共有結合している、およびコンジュゲートのペプチド対ポリマーのモル比は少なくとも約１０：１である。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約０．８ＭＤａ～約２ＭＤａの分子量を有する；および各ペプチドは、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量を有する；ここで各ペプチドは、ポリマーに共有結合している、およびコンジュゲートのペプチド対ポリマーのモル比は少なくとも約１０：１である。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約１ＭＤａ～約２ＭＤａの分子量を有する；および各ペプチドは、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量を有する；ここで各ペプチドは、ポリマーに共有結合している、およびコンジュゲートのペプチド対ポリマーのモル比は少なくとも約１０：１である。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約１ＭＤａ～約２ＭＤａの分子量を有する；および各ペプチドは、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量を有する；ここで各ペプチドは、ポリマーに共有結合している、およびコンジュゲートのペプチド対ポリマーのモル比は少なくとも約２０：１である。一部の実施形態では、生体適合性ポリマーは、約２ＭＤａの分子量を有する；および各ペプチドは、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量を有する；ここで各ペプチドは、ポリマーに共有結合している、およびコンジュゲートのペプチド対ポリマーのモル比は少なくとも約５０：１である。

同等の治療機能のためにより頻繁に投与されなければならない医薬品と比較して、より長い硝子体内滞留時間を示す薬物もまた、患者にとって好ましい可能性がある。硝子体内注射は局所麻酔下で行われ、一般的に痛みを伴うとは見なされていないが、患者にとっては負担になる。それは臨床医によって行われなければならないので、薬の投与ごとにオフィス訪問が必要である。通常、涙の増加により、短期間の刺激およびかすみ目がある。また、注射部位の近くで目の外観に短い涙の変化がある可能性がある。最後に、患者が治療を遅らせると、進行性で不可逆的な疾患の損傷が発生する可能性があり、治療を遅らせる機会が少ないほど、全体的な長期的な有効性が向上する。したがって、患者は、硝子体内注射が少なくて済む同等の治療法を好む可能性がある。

医師の観点からは、注射の頻度を減らす必要もある。硝子体内注射は眼科医が行う必要があるため、この手術は臨床時間のかなりの部分を占める可能性がある。実際に硝子体内療法を受けている患者の数は、各患者が硝子体内注射を受けなければならない頻度によって制限される可能性がある。注射の頻度を減らすと、治療法を受けることができる患者の数が増える。デポーまたは長期の薬物送達デバイスよりも長時間作用する薬物も好ましいであろう。なぜなら、これらは通常、より長い移植手術および手術室へのアクセスを必要とし、臨床医にとってより少ない頻度の投与の利点を相殺する可能性があるからである。

生理活性ポリペプチドおよび生体適合性ポリマーを含むコンジュゲートは、生体適合性ポリマーに結合されていない生理活性ポリペプチドの硝子体における半減期よりも長い硝子体における半減期を示す。硝子体におけるコンジュゲートの半減期の増加は、たとえば、患者への負担の軽減；投与の数および／または頻度の減少；安全性の向上；感染の発生率の低下；患者のコンプライアンスの向上；および効果の向上を含む特定の利点をもたらす。さらに、本明細書に記載のコンジュゲートは、眼障害の治療のためのポリペプチドの使用を可能にし、このポリペプチドは、結合されていない形態では、治療に適した期間、眼に保持されない。

一部の実施形態では、有効量のコンジュゲートは、個体の眼の病的血管新生を阻害するのに有効な量である。たとえば、場合によっては、有効量のコンジュゲートは、一回または複数回の用量で投与されたときに、個体の眼の病的血管新生を、コンジュゲートによる治療がない場合、またはコンジュゲートによる治療前の眼の病的血管新生の程度と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または８０％より多く阻害するのに有効な量である。

一部の実施形態では、有効量のコンジュゲートは、個体の眼の眼圧を低下させるのに有効な量である。たとえば、場合によっては、有効量のコンジュゲートは、一回または複数回の用量で投与されたときに、眼圧を、コンジュゲートによる治療がない場合、またはコンジュゲートによる治療前の眼の眼圧と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または８０％より多く低下させるのに有効な量である。

一部の実施形態では、有効量のコンジュゲートは、個体の眼の黄斑浮腫を軽減するのに有効な量である。たとえば、場合によっては、有効量のコンジュゲートは、一回または複数回の用量で投与されたときに、黄斑浮腫を、コンジュゲートによる治療がない場合、またはコンジュゲートによる治療前の眼の黄斑浮腫のレベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または８０％より多く軽減するのに有効な量である。

一部の実施形態では、有効量のコンジュゲートは、個体の眼の視力を高めるのに有効な量である。たとえば、場合によっては、有効量のコンジュゲートは、一回または複数回の用量で投与されたときに、個体の眼の視力を、コンジュゲートによる治療がない場合、またはコンジュゲートによる治療前の眼の視力と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または１０倍より多く高めるのに有効な量である。

一部の実施形態では、有効量のコンジュゲートは、個体の眼疾患の進行を阻害するのに有効な量である。たとえば、場合によっては、有効量のコンジュゲートは、一回または複数回の用量で投与されたときに、個体の眼疾患の進行をコンジュゲートによる治療がない場合、またはコンジュゲートによる治療前の進行と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、またはそれ以上、阻害するのに有効な量である。

たとえば、場合によっては、有効量のコンジュゲートは、一回または複数回の用量で投与されたときに、非滲出性ＡＲＭＤから滲出性ＡＲＭＤへの進行を阻害するため、または非滲出性ＡＲＭＤのより重症な形態への進行を阻害するために効果的である。一部の実施形態では、有効量のコンジュゲートは、初期ＡＲＭＤ（ＡＲＥＤＳ ２）から中期ＡＲＭＤ（ＡＲＥＤＳ ３）または高度のＡＲＭＤ（ＡＲＥＤＳ ４）への進行を阻害するのに有効な量である。一部の実施形態では、有効量のコンジュゲートは、中程度のＡＲＭＤ（ＡＲＥＤＳ ３）から高度のＡＲＭＤ（ＡＲＥＤＳ ４）への進行を阻害するのに有効な量である。

一部の実施形態では、有効量のコンジュゲートは、網膜細胞の生理活性を増強するのに有効な量であり、たとえば、ここで網膜細胞は光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞である。

一部の実施形態では、生理活性ポリペプチドおよび生体適合性ポリマーを含むコンジュゲートは、硝子体で約１２時間から約２４時間、約１日から約３日、約３日から約７日、約１週間から約２週間、約２週間から約４週間、または約１ヶ月から約６ヶ月の半減期を示す。

ポリマー基質に結合したポリペプチドの生理活性は、可溶性形態のポリペプチドの活性と比較して、たとえば、ポリマーに結合していないポリペプチドの活性と比較して、増強される。一部の実施形態では、ポリペプチド－ポリマーコンジュゲートのポリペプチドの生理活性は、可溶性（非結合）形態のポリペプチドの生理活性よりも少なくとも約２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、または１０００倍より大きい。

一部の実施形態では、適切なポリペプチド－ポリマーコンジュゲートのポリペプチドの生理活性は、１：１のモル比でポリマーに結合された場合のポリペプチドの生理活性よりも少なくとも約２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、または１０００倍より大きい。

一部の実施形態では、適切なポリペプチド－ポリマーコンジュゲートのポリペプチドの生理活性は、ポリマーと混合して存在する場合のポリペプチドの生理活性よりも少なくとも約２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、または１０００倍より大きい。

一部の実施形態では、対象のポリペプチド－ポリマーコンジュゲートのポリペプチドの最大有効濃度の半分（ＥＣ５０）は、可溶性（非結合型）のポリペプチドのＥＣ５０よりも少なくとも約２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、または１０００倍以上低い。

一部の実施形態では、対象のポリペプチド－ポリマーコンジュゲートのポリペプチドの最大阻害濃度の半分（ＩＣ５０）は、可溶性（非結合型）のポリペプチドのＩＣ５０よりも少なくとも約２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、または１０００倍以上低い。

ポリペプチド－ポリマーコンジュゲートのポリペプチドの生理活性が、可溶性（非結合）形態のポリペプチドの生理活性と比較して増加するかどうかは、生理活性の適切なアッセイを使用して容易に決定される。

ポリペプチドとポリマーのモル比は、約５：１から約１００：１まで、たとえば約５：１～約７：１、約７：１～約１０：１、約１０：１～約１２：１、約１２：１～約１５：１、約１５：１～約２０：１、約２０：１～約２５：１、約２５：１～約３０：１、約３０：１～約３５：１、約３５：１～約４０：１、約４０：１～約４５：１、約４５：１～約５０：１、約５０：１～約６０：１、約６０：１～約７０：１、約７０：１～約８０：１、約８０：１～約９０：１、または約９０：１～約１００：１まで、変化してもよい。

たとえば、ポリペプチドポリマーコンジュゲートが血管新生を阻害するポリペプチドを含む場合（たとえば、ポリペプチドは抗血管新生ポリペプチドである）、一部の実施形態では、ポリペプチド－ポリマーコンジュゲートの抗血管新生ポリペプチドは、血管新生を、ポリマーと混合して存在する場合、可溶性（非結合）形態である場合、または1：1のモル比でポリマーに結合した場合の抗血管新生ポリペプチドによる血管新生の阻害の程度と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、または１０００倍より多く、またはそれより多く、阻害する。

ＩＶ． 医薬組成物
一部の実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲートおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

Ａ． 製剤化
本発明のコンジュゲートから医薬組成物を調製するために、医薬的に許容される担体は、固体または液体のいずれかであってもよい。固形製剤は、散剤、カシェー（ｃａｃｈｅｔ）、および分散性顆粒剤を含む。固体担体は、一つまたは複数の物質であってもよく、これはまた、希釈剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、またはカプセル化材料として作用することができる。製剤化および投与の技術の詳細は、科学文献および特許文献に詳しく説明されている。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ （「レミントン」）の最新版を参照されたい。

散剤では、担体は細かく分割された固体であり、細かく分割された活性成分と混合されている。錠剤では、活性成分は、適切な比率で必要な結合特性を有する担体と混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。散剤および錠剤は、好ましくは、本発明のコンジュゲートを５％または１０％から７０％含む。

液体形態の製剤は、液剤、懸濁剤、および乳濁剤、たとえば、水または水／プロピレングリコール溶液を含む。非経口注射の場合、液剤は、ポリエチレングリコール水溶液の溶液に製剤化することができる。

経口使用に適した液剤は、本発明のコンジュゲートを水に溶解し、必要に応じて適切な着色剤、香味剤、安定剤、および増粘剤を添加することによって調製することができる。経口使用に適した水性懸濁剤は、天然または合成のガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム等の粘性物質、および天然に存在するホスファチド（たとえば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（たとえば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（たとえば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（たとえば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸塩）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物（たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）等の分散剤または湿潤剤を含む水に細かく分割された活性成分を分散させることによって作製することができる。水性懸濁剤はまた、エチルまたはｎ－プロピルｐ－ヒドロキシベンゾエート等の一つまたは複数の防腐剤、一つまたは複数の着色剤、一つまたは複数の香味剤、およびスクロース、アスパルテーム、またはサッカリン等の一つまたは複数の甘味剤を含んでもい。製剤は浸透圧に合わせて調整することができる。

また、使用直前に経口投与用の液体形態の調製物に変換されることを目的とした固体形態の調製物も含まれる。このような液体形態は、液剤、懸濁剤、およびエマルジョンを含む。これらの製剤は、有効成分に加えて、着色剤、香味剤、安定剤、緩衝剤、人工および天然甘味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含んでもよい。

油性懸濁剤は、本発明のコンジュゲートを、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、またはココナッツ油等の植物油、または液体パラフィン等の鉱油、またはこれらの混合物に懸濁することによって製剤化することができる。油性懸濁剤は、蜜蝋、ハードパラフィン、またはセチルアルコール等の増粘剤を含めることができる。甘味剤を添加して、グリセロール、ソルビトール、またはスクロース等の口当たりの良い経口製剤を提供することができる。これらの製剤は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を添加することで保存することができる。 注射可能な油性媒体の例として、Ｍｉｎｔｏ， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８１ ：９３－１０２， １９９７を参照されたい。本発明の製剤はまた、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、上記の植物油または鉱油、あるいはこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、アカシアガムおよびトラガカントガム等の天然ガム、大豆レシチン等の天然ホスファチド、脂肪酸およびソルビタンモノオレエート等の脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されるエステルまたは部分エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等のこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物を含む。乳濁剤はまた、シロップ剤およびエリキシル剤の製剤の場合のように、甘味剤および香味剤を含んでもよい。そのような製剤はまた、粘滑剤、防腐剤、または着色剤を含んでもよい。

本発明の組成物はまた、体内で徐放するためのミクロスフェアとして送達することができる。たとえば、ミクロスフェアは、皮下に徐放される薬物含有ミクロスフェアの皮内注射を介して投与するために製剤化することができる（Ｒａｏ， Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍ． Ｅｄ． ７：６２３－６４５， １９９５を参照）；生分解性および注射可能なゲル製剤として（たとえば、Ｇａｏ Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １２：８５７－８６３， １９９５を参照）；または、経口投与用のミクロスフェアとして（たとえば、Ｅｙｌｅｓ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４９：６６９－６７４， １９９７を参照）。経皮経路と皮内経路の両方で、数週間または数ヶ月間一定の送達が可能である。

別の実施形態では、本発明の組成物は、関節の関節内空間等の体腔への非経口投与のために製剤化することができる。投与用の製剤は、一般に、薬学的に許容される担体に溶解された本発明の組成物の溶液を含むであろう。使用できる許容可能な媒体および溶媒の中には、水およびリンゲル液、等張塩化ナトリウムがある。さらに、滅菌固定油は、慣習的に、溶媒または懸濁媒体として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激の少ない固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸等の脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質が含まれていない。これらの製剤は、従来法のよく知られた滅菌技術によって滅菌することができる。製剤は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等の生理学的条件を近似するために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含んでもよい。これらの製剤中の本発明の組成物の濃度は大きく変化する可能性があり、選択された特定の投与様式および患者のニーズに従って、主に体液量、粘度、体重等に基づいて選択される。静脈内投与の場合、製剤は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液等の無菌の注射可能な調製物であってもよい。この懸濁剤は、それらの適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の技術に従って製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な液剤または懸濁剤、たとえば、１，３－ブタンジオールの液剤であってもよい。

別の実施形態では、本発明の組成物の製剤は、細胞膜と融合するかまたはエンドサイトーシスされるリポソームの使用によって、すなわち、エンドサイトーシスをもたらす細胞の受容体の表面膜タンパク質に結合する、リポソームに付着した、またはオリゴヌクレオチドに直接付着したリガンドを使用することによって送達することができる。リポソームを使用することにより、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを運搬するか、さもなければ特定の器官に優先的に方向づけされる場合、ｉｎ ｖｉｖｏでの標的細胞への本発明の組成物の送達に焦点を合わせることができる（たとえば、Ａｌ－Ｍｕｈａｍｍｅｄ， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ． １３：２９３－３０６， １９９６； Ｃｈｏｎｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：６９８－７０８， １９９５； Ｏｓｔｒｏ， Ａｍ． Ｊ． Ｈｏｓｐ． Ｐｈａｒｍ． ４６： １５７６－１５８７， １９８９を参照）。

脂質ベースのドラッグデリバリーシステムは、脂質溶液、脂質エマルジョン、脂質分散液、自己乳化型ドラッグデリバリーシステム（ＳＥＤＤＳ）、および自己マイクロ乳化型ドラッグデリバリーシステム（ＳＭＥＤＤＳ）を含む。特に、ＳＥＤＤＳおよびＳＭＥＤＤＳは脂質、界面活性剤、および共界面活性剤の等方性混合物であり、水性媒体に自然に分散し、微細なエマルジョン（ＳＥＤＤＳ）またはマイクロエマルジョン（ＳＭＥＤＤＳ）を形成する。本発明の製剤に有用な脂質は、ゴマ種子油、オリーブ油、ヒマシ油、ピーナッツ油、脂肪酸エステル、グリセロールエステル、Ｌａｂｒａｆｉｌ（登録商標）、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｃａｐｒｙｏｌ（登録商標）、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）、Ｃａｐｔｅｘ（登録商標）、およびＰｅｃｅｏｌ（登録商標）を含むがこれらに限定されない任意の天然または合成脂質を含む。

Ｂ． 投与
本発明のコンジュゲートおよび組成物は、経口、非経口および局所的方法を含む任意の適切な手段によって送達することができる。一部の実施形態では、送達方法は関節内である。

医薬製剤は、好ましくは単位剤形である。そのような形態では、調製物は、適切な量の本発明のコンジュゲートおよび組成物を含む単位用量に細分される。単位剤形は、パッケージ化された製剤であってもよく、パッケージは、パケット化された錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル中の散剤等の個別の量の製剤を含む。

本発明のコンジュゲートおよび組成物は、他の薬剤と同時投与することができる。同時投与は、本発明のコンジュゲートまたは組成物を、他の薬剤の０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、または２４時間以内に投与することを含む。同時投与はまた、同時に、ほぼ同時に（たとえば、互いに約１、５、１０、１５、２０、または３０分以内に）、または任意の順序で連続して投与することを含む。さらに、本発明のコンジュゲートおよび組成物は、それぞれ、１日１回、または１日２、３、またはそれ以上の回数投与して、１日あたりの好ましい投与量レベルを提供することができる。

一部の実施形態では、同時投与は、同時製剤、すなわち、本発明のコンジュゲートおよび組成物および任意の他の薬剤を含む単一の医薬組成物を調製することによって達成することができる。あるいは、様々な成分を個別に配合することもできる。

本発明のコンジュゲートおよび組成物、ならびに任意の他の薬剤は、任意の適切な量で存在することができ、対象の体重および年齢、疾患の状態等を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存していてもよい。投与量の範囲は、約０．１ｍｇ～約１０，０００ｍｇ、または約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、または約１０ｍｇ～約７５０ｍｇ、または約２５ｍｇ～約５００ｍｇ、または約５０ｍｇ～約２５０ｍｇを含む。適切な投与量は、約１ｍｇ、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｍｇも含む。組成物はまた、他の適合性のある治療薬を含んでもよい。本明細書に記載のコンジュゲートは、互いに組み合わせて、糖質コルチコイド受容体を調節するのに有用であることが知られている他の活性剤と、または単独では有効ではないが活性剤の有効性に寄与しうる補助剤と組み合わせて使用することができる。

Ｖ． 眼の治療方法
本開示の方法を使用して治療することができる眼障害は、黄斑変性、脈絡膜血管新生、黄斑浮腫、網膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、緑内障、および眼の炎症を含むが、これらに限定されない。

本開示の方法を使用して治療することができる眼疾患は、急性黄斑神経網膜症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ぶどう膜炎；非感染性ぶどう膜炎；ヒストプラズマ症；急性黄斑変性症、非滲出性年齢関連黄斑変性症および滲出性年齢関連黄斑変性症等の黄斑変性症；黄斑浮腫、嚢胞性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫等の浮腫；多発性脈絡膜炎；後部の眼の部位または場所に影響を与える眼の外傷；眼腫瘍；網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症および糖尿病性黄斑浮腫を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞症、網膜剥離、ぶどう膜網膜症等の網膜障害；交感性眼炎；フォークト・小柳・原田症候群；ぶどう膜拡散（ｕｖｅａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）；眼のレーザー治療によって引き起こされた、または影響を受けた後眼部の状態；光線力学療法によって引き起こされた、または影響を受けた後眼部の状態；光凝固術、放射線網膜症；網膜上膜障害（ｅｐｉｒｅｔｉｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）；網膜静脈分岐閉塞症；前部虚血性視神経症；非網膜症糖尿病性網膜機能障害；網膜分離症；網膜色素変性症；緑内障；アッシャー症候群；錐体桿体ジストロフィー；シュタルガルト病（黄色斑眼底）；遺伝性黄斑変性症；脈絡網膜変性；レーバー先天黒内障；先天性停止性夜盲症；全脈絡膜萎縮；バルデ・ビードル症候群；黄斑部毛細血管拡張症；レーバー遺伝性視神経萎縮症；未熟児網膜症；および色覚異常、１型２色覚、２型２色覚、３型２色覚等の色覚障害を含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、眼疾患は、緑内障、網膜色素変性症、黄斑変性症、網膜分離症、レーバー先天性黒内障、糖尿病性網膜症、色覚異常（ａｃｈｒｏｍｏｔｏｐｓｉａ）、または色覚異常（ｃｏｌｏｒ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）である。一部の実施形態では、眼障害は、黄斑変性症、脈絡膜血管新生、網膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、緑内障、または眼の炎症である。一部の実施形態では、眼障害は、黄斑変性症、脈絡膜血管新生、網膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、または眼の炎症である。

本開示の方法による治療に適した対象は、眼の疾患または障害、たとえば、上記の眼の疾患または障害のいずれかを有すると診断された個体を含む。本開示の方法による治療に適した対象は、眼の疾患または障害の治療を受けた、および治療に応答しなかった個体を含む。

本開示の方法による治療に適した個体は、眼の疾患または障害のために視力が低下した個体を含む。本開示の方法による治療に適した個体は、眼の疾患または障害のために異常に高い眼圧を有する個体を含む。本開示の方法による治療に適した個体は、眼の疾患または障害に起因する眼の病理学的血管新生を有する個体を含む。

視力は、たとえば、スネレンチャート、ベイリー・ロビーチャート、小数進行チャート、フライバーグ視力試験、最小分解能角（ＭＡＲ）の測定、最良矯正視力（ＢＣＶＡ）試験、最小分解能角試験のログ（ＬｏｇＭＡＲ）等を使用して測定することができる。変視症（視覚の歪み）は、アムスラーチャートを使用して測定することができる。コントラスト感度は、ペリロブソンチャートを使用して測定することができる。診断研究は、眼底の標準的な眼科検査、黄斑の立体生体顕微鏡検査、静脈内眼底フルオレセイン血管造影、眼底写真、インドシアニングリーンビデオ血管造影、および光コヒーレンストモグラフィーを含むが、これらに限定されない。これらの診断研究の一つまたは複数で異常を示す対象（たとえば、健康な眼にとって正常であると考えられる範囲外にある対象）は、本開示に従って治療することができる。たとえば、対象は、加齢性眼疾患研究で使用される分類スキームに従って、初期、中期、または進行したＡＲＭＤを有するとして分類することができる。そこに記載されているカテゴリーのいずれかに該当する対象は、本開示の方法に従って治療することができる。

眼の疾患または障害を治療する方法に有用なコンジュゲートは、任意の適切な硝子体半減期を有することができる。たとえば、硝子体半減期は、約１２時間～約２４時間、約１日～約３日、約３日～約７日、１週間～約２週間、約２週間～約4週間、または約１ヶ月～約６ヶ月であってもよい。一部の実施形態では、コンジュゲートの硝子体半減期は少なくとも２週間である。

一部の実施形態では、対象はヒトである。

眼の疾患または障害を治療する方法に有用なコンジュゲートは、任意の適切な間隔で投与することができる。たとえば、コンジュゲートは、少なくとも１日１回、または少なくとも２、３、４、５、６または７日ごとに１回、または少なくとも１、２、３または４週間ごとに１回、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月ごとに１回投与することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは２ヶ月に１回投与することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは３ヶ月に１回投与することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは６ヶ月に１回投与することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは１年に１回投与することができる。

眼の疾患または障害を治療する方法に有用なコンジュゲートは、任意の適切な硝子体半減期を有することができる。たとえば、コンジュゲートの硝子体半減期は、生体適合性ポリマーにコンジュゲートされていない生理活性ポリペプチドの硝子体半減期よりも、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、または１０００倍を超えて、長くなり得る。一部の実施形態では、コンジュゲートの硝子体半減期は、生体適合性ポリマーにコンジュゲートされていない生理活性ポリペプチドの硝子体半減期よりも、少なくとも２倍長い。一部の実施形態では、コンジュゲートの硝子体半減期は、生体適合性ポリマーにコンジュゲートされていない生理活性ポリペプチドの硝子体半減期よりも、少なくとも５倍長い。

ＶＩ． 関節の治療方法
本発明は、本発明のペプチド－ポリマーコンジュゲートを使用して関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）の疾患または障害を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、関節の疾患または障害を治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本発明のコンジュゲートを関節に注射することを含む。

本発明はまた、本発明のコンジュゲートを使用して関節組織の疾患および障害を治療する方法を提供する。関節組織の疾患および障害の例は、関節リウマチ、摩耗関連変形性関節症、加齢性変形性関節症、外傷後変形性関節症、乾癬性関節炎、および無菌性インプラント弛緩（ａｓｅｐｔｉｃ ｉｍｐｌａｎｔ ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）、関節滲出液、強直性脊椎炎、滑液包炎、痛風、反応性関節炎、滑膜炎、および無腐性壊死を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、疾患または障害は、関節リウマチ、摩耗関連変形性関節症、加齢性変形性関節症、外傷後変形性関節症、乾癬性関節炎、および無菌性インプラント弛緩、関節滲出液、強直性脊椎炎、滑液包炎、痛風、反応性関節炎、滑膜炎、または無腐性壊死である。

多くのポリペプチドは、免疫細胞機能を弱めるための薬剤として使用されており、多くの関節障害の治療にかなりの有用性がある。関節組織は、これらの攻撃に対する典型的な細胞応答、すなわち炎症性メディエーターの上方制御もまた、関節軟骨の異化作用および下にある骨組織の吸収を促進するシグナルであるため、傷害および疾患に特に影響を受けやすい。関節面の変性は、関節組織への損傷の悪化を促進し、炎症性メディエーターの調節をさらに促進する。時間の経過とともに、これらのメカニズムはフィードフォワードループを生成し、関節組織に累積的な損傷をもたらす。

ヒトの体または動物の体の任意の関節は、本発明の方法およびコンジュゲートを使用して治療することができる。代表的な関節は、線維性関節、軟骨性関節、滑膜性関節、椎間関節、不動関節（ｓｙｎａｒｔｈｒｏｓｉｓ ｊｏｉｎｔ）、半関節（ａｍｐｈｉａｒｔｈｒｏｓｉｓ ｊｏｉｎｔ）、および可動関節（ｄｉａｒｔｈｒｏｓｉｓ ｊｏｉｎｔ）を含むが、これらに限定されない。関節は、２つの関節面を有する単純な関節、３つ以上の関節面を有する複合関節、または２つ以上の関節面と関節膝または半月板を有する複雑な関節であり得る。本発明のコンジュゲートおよび方法を使用して治療することができる解剖学的関節は、指を含む手関節、肘関節、手首関節、肩関節、胸骨および鎖骨の関節、脊椎関節、顎および頭蓋骨関節、骨盤および股関節、膝関節、足首関節、およびつま先を含む足関節を含むが、これらに限定されない。関節は、平面関節、ボールおよびソケット関節、ヒンジ関節、ピボット関節、顆状関節、および鞍関節として分類することもできる。本発明のコンジュゲートおよび方法は、結合組織、軟骨、関節面、滑膜腔、半月板等を含むがこれらに限定されない関節の組織を治療するために使用することができる。

免疫細胞機能を弱めるように設計された薬剤の例は、腫瘍壊死因子－αおよびＩＬ－１β、ＩＬ－６、またはインターフェロン－γを妨害する可能性のある抗体を含む。他の例は、Ｔ細胞およびＢ細胞機能の選択的抗体阻害剤を含む。これらの抗体は、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体断片、単鎖ｓｃＦｖ抗体、単一ドメイン重鎖ＶＨＨ抗体、またはアドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、および操作されたクニッツ型阻害剤等の操作された抗体様スキャフォールドであってもよい。他の例は、腫瘍壊死因子－αおよびＩＬ－１β、ＩＬ－６、またはインターフェロン－γ等の免疫調節性サイトカインのデコイ受容体も含む。

上記のような抗炎症薬を使用することの一般的な副作用の一つは、感染のリスクが高いことある。それらは体の免疫応答を弱めるので、免疫系は細菌、ウイルス、および寄生虫と戦うために損なわれる。したがって、これらの薬剤の全身使用の利点は、全身免疫抑制に関連するリスクと慎重に比較検討する必要がある。関節リウマチ等の過免疫障害によって全身が影響を受ける疾患の場合、免疫減衰薬の全身使用が正当化される可能性がある。しかし、一つまたは限られた数の関節にのみ影響する状態の場合、感染のシステムリスクは、これらの薬剤の全身使用を正当化しないことがよくある。

別の方法として、変形性関節症に関連する炎症の長期的影響を予防または阻害するために、免疫調節薬の関節内（ＩＡ）投与が提案されている。しかし、これらの薬剤は関節腔から急速に除去され、ＩＡ投与後の適切な治療期間を提供しない。ＩＡ注射後、滑膜における抗炎症タンパク質の半減期は短い（＜１．５時間）。これは、インフリキシマブおよびエタネルセプトを含む炎症抑制剤が、様々な関節障害のためにヒトにＩＡ注射によって投与された臨床研究から明らかである。これらの研究のいくつかは、関節の炎症の有意な減少を報告しているが、成功する転帰のために頻繁な（たとえば毎週の）投与が必要であったことを認めている。したがって、既存の薬剤を使用するＩＡ抗炎症療法は、高コストおよび頻繁なＩＡ投与の不便さによって制限される。明らかに、関節障害を治療するためのこの治療的アプローチを可能にするために、滑液内で抗炎症薬の生理活性を拡張する方法が必要である。

関節障害に関連する主な症状は、痛み、滲出、可動域の制限、および関節の解剖学的構造の病的リモデリングである。関節障害を治療するための治療の有効性は、視覚的評価スコア等の一般化された評価によって測定される痛みの軽減を含む場合がある。有効性は、変形性関節症のＷＯＭＡＣスコア、関節リウマチのＡＣＲ２０、乾癬性関節炎の乾癬性関節炎の生活の質、または強直性脊椎炎のＳＡＳＳＳ等、特定の関節障害に固有のシステムを使用した改善されたスコアに基づいて決定することもできる。有効性は、痛みのない歩行距離の増加または関節の動きの範囲の増加等の機能的な出力を使用して測定することもできる。有効性は、正常な関節の解剖学的構造の回復を示すＸ線写真のエビデンスに基づいて測定することもできる。

関節の疾患または障害を治療する方法は、ペプチドよりも長い拡散半減期を有する本発明のペプチド－ポリマーコンジュゲートを使用することができる。たとえば、コンジュゲートは、ペプチドのそれより少なくとも２倍長い拡散半減期、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、またはペプチドの少なくとも100倍長い拡散半減期を有することができる。コンジュゲートの拡散半減期は、約２～約１００倍ペプチドよりも中＼学、または約２～約５０、約１０～約１００、約２５～約１００、約５０～約１００倍ペプチドよりも長くなりうる。一部の実施形態では、コンジュゲートの拡散半減期は、ペプチドより少なくとも約２倍長い。一部の実施形態では、コンジュゲートの拡散半減期は、ペプチドよりも約２倍～約１００倍長い。

関節の疾患または障害を治療する方法は、ペプチドよりも長い関節内半減期を有する本発明のペプチド－ポリマーコンジュゲートを使用することができる。たとえば、コンジュゲートは、結合されていないペプチドよりも少なくとも２０％長い関節内半減期、または少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または結合されていないペプチドよりも１０００％長い関節内半減期を有することができる。コンジュゲートの関節内半減期は、結合されていないペプチドよりも約２０％～約１０００％長く、または約１００％～約１０００％、または約１００％～約５００％、または約１００％～約３００％、結合されていないペプチドよりも長くなる。一部の実施形態では、コンジュゲートの関節内半減期は、ペプチドよりも少なくとも約２０％長い。一部の実施形態では、コンジュゲートの関節内半減期は、ペプチドよりも約２０％～約１０００％長い。

コンジュゲートは、上記のように任意の適切な頻度または量で投与することができる。 一部の実施形態では、コンジュゲートは、月に約１回以下で関節に注射される。一部の実施形態では、コンジュゲートは、約１ヶ月に１回から６ヶ月に１回まで関節に注射される。一部の実施形態では、コンジュゲートは、２ヶ月に１回または３ヶ月に１回関節に注射される。

Ａ． 変形性関節症
２０１５年には、推定７７５万人のアメリカ人が、既知の関節損傷に関連する可能性のある変形性関節症（ＯＡ）の症状を経験した。外傷後ＯＡ（ＰＴＯＡ）は、すべてのＯＡ症例の少なくとも１５％を占めるが、他の多くのＯＡ診断も以前の関節外傷に関連している可能性があると想定されている。疾患修飾療法がないため、関節置換術は、関連する不快感を取り除き、可動性を回復するための唯一の治療選択肢であることがよくある。しかし、ＰＴＯＡは、関節置換術が実行可能な選択肢ではない若い患者で診断されることがよくある。全体として、これらのＰＴＯＡ患者の治療費は、毎年４０億ドルを超える医療費である。

傷害に関連する炎症の短期的な抑制は、ＰＴＯＡの長期的な症状を制限する。脱臼、靭帯断裂、半月板損傷、および関節内骨折を含む、多くの種類の関節損傷がＰＴＯＡに関連している。最初の損傷は急性である可能性があるが、損傷は炎症性メディエーターのカスケードを開始するのに十分である。結果として生じる慢性の全関節炎症は、関節軟骨の異化作用を促進し、時間の経過とともに蓄積し、ＰＴＯＡとして現れるさらなる組織損傷をもたらす可能性がある。ＴＮＦαおよびＩＬ－１βは、関節の炎症を媒介する上でよく知られている役割を有する。これらのサイトカインは相互作用して軟骨の破壊を促進し、これは、軟骨マトリックス成分の発現を下方制御することと、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を上方制御することの両方によって起こる。ＴＮＦαはまた、破骨細胞の動員を刺激し、炎症性環境で骨形成骨芽細胞のアポトーシスを誘導する。これは、関節軟骨組織の侵食に寄与する。ＴＮＦαおよびＩＬ－１βは、関節損傷に対する炎症反応を緩和するための説得力のある標的である。関節環境におけるこれらの重要な急性炎症性サイトカインの阻害は、ＰＴＯＡの進行を遅らせるための早期介入のために提案されている。

Ｂ． 関節内微粒子に対する免疫応答による炎症
関節の関節面の間に発生する摩耗は、関節の炎症および骨溶解を引き起こすミクロンスケールの粒子を生成する可能性がある。摩耗粒子は、骨化した軟骨病変、骨棘（骨棘）［ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅｓ （ｂｏｎｅ ｓｐｕｒｓ）］、または露出した軟骨下骨病変等の内因性表面間の摩耗によって生成される可能性がある。このタイプの摩耗粒子の生成は、ＯＡの後期に頻繁に発生し、重度の関節痛および不動を引き起こす。この追加の炎症反応は、ＯＡにおける関節組織の変性の速度を加速する。

人工関節の表面間に摩耗粒子が形成されることもある。２０１５年には、７００万人以上のアメリカ人が人工関節を埋め込んで生活していた。これらの固体のほぼ２５万人は、最終的にはデバイスの緩みおよび故障を引き起こす、デバイスを取り巻く骨の骨溶解のために最終的に修正手術を必要としている。

摩耗に関連する炎症は、関節面から放出される不活性な微粒子に対する異物反応に起因する。滑膜内層内のマクロファージは、摩耗微粒子を異物として容易に認識し、他の活性免疫細胞を滑膜に動員する炎症誘発性因子を放出し、破骨細胞の拡大を刺激すると同時に骨形成を阻害する。したがって、持続的な炎症はフィードフォワードサイクルを引き起こし、軟骨の変性および骨溶解が関節面間の擦過傷を増加させ、運動および物理的ストレスを増加させて粒子を増加させる。

一部の実施形態では、ペプチドは、免疫細胞機能の活性を調節する。一部の実施形態では、ペプチドは、腫瘍壊死因子－α、インターロイキン－１β、インターロイキン－６、またはインターフェロン－γを阻害する。一部の実施形態では、ペプチドは、腫瘍壊死因子－αを阻害する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）は、異物反応を制御するための説得力のある標的である。ＴＮＦαは関節の炎症を仲介するというよく知られた役割を有する。ＴＮＦαはまた、破骨細胞の動員を刺激し、炎症性環境で骨形成骨芽細胞のアポトーシスを誘導し、軟骨下骨の骨溶解を引き起こす。全身投与された受容体アンタゴニスト（エタネルセプト）を使用したＴＮＦαの阻害は、マウスの摩耗粒子によって誘発される骨吸収を減少させることが示されているが、全身抗ＴＮＦαに関連するリスクは一般に局所的な状態では許容できるとは見なされていない。代替の方法として、関節内摩耗粒子に対する溶骨性反応を予防または阻害するために、ＩＡ抗ＴＮＦα療法が提案されている。

一部の実施形態では、ペプチドは、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体断片、単鎖可変領域抗体、単一ドメイン重鎖抗体、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、クニッツ型阻害剤、またはデコイ受容体である。

本発明の方法は、約０．１ＭＤａ～約２ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーを含むペプチド－ポリマーコンジュゲートを含む；およびそれぞれが約５ｋＤａ～約１００ｋＤａの分子量を有し、ここで各ペプチドがポリマーに共有結合し、ここですべてのペプチドについて約５０ｋＤａのポリマー～約５ｋＤａのポリマーが存在し、およびここで、ペプチド対ポリマーのモル比は少なくとも５：１である。

一部の実施形態では、コンジュゲートは、配列番号３～配列番号５に記載のＣＤＲを有するペプチドを含む：
ＤＨＳＧＹＴＹＴＩＧ（配列番号３）、
ＡＲＩＹＷＳＳＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４）、および
ＲＤＧＩＰＴ（配列番号５）。

一部の実施形態では、コンジュゲートは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＤＨＳＧＹＴＹＴＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＲＩＹＷＳＳＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＡＩＳＲＤＩＡＫＮＴＶＤＬＴＭＮＮＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＤＧＩＰＴＳＲＳＶＥＳＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１）。

一部の実施形態では、コンジュゲートは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む：
ＳＮＡＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＤＨＳＧＹＴＹＴＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＲＩＹＷＳＳＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＡＩＳＲＤＩＡＫＮＴＶＤＬＴＭＮＮＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＤＧＩＰＴＳＲＳＶＥＳＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＧＧＣ（配列番号２）。

本発明のコンジュゲートは、関節の近くで発生する炎症を改善して、その後の軟骨変性および骨溶解を阻害するように適切に配置されている。これらのコンジュゲートは、関節内に保持されている滑液の高分子に一致する生物物理学的属性を示すように設計されている。さらに、複数のコピーまたは生物活性ポリペプチドを結合することは、それらの標的との多価相互作用に関与することによってそれらの力価を高めるのに十分である。したがって、本発明は、様々な疾患の治療のために関節に局所的に長時間作用型薬物を投与する方法を可能にするのに非常に適している。

バイオコンジュゲート薬のターゲット市場の一例は、関節損傷後に慢性的な炎症および滲出を経験し、したがってＰＴＯＡを発症するリスクがある患者の２５％までの患者である。これらの患者の選択肢は現在、全身鎮痛および局所コルチコステロイド治療に限定されている。長期の炎症段階を解決できないと、関節軟骨の異化作用を引き起こし、時間の経過とともに蓄積するさらなる損傷を引き起こす可能性がある。抗炎症性バイオコンジュゲートに基づいており、３ヶ月ごとに（またはそれよりも少ない頻度で）投与するように設計された治療は、長期の関節炎の影響を軽減し、それによって痛みを軽減し、費用のかかる手術の必要性を遅らせるかまたは防ぐことができる。これらの利点は、感染のリスク、患者の不便、および手術コストを含む可能性のある、ＩＡ注射の繰り返し（１年に４回）の欠点を上回る可能性がある。

バイオコンジュゲート薬の別のターゲット市場の例は、石灰化した軟骨病変、骨棘、または軟骨下骨病変の発症により慢性的な炎症および痛みを経験している患者である。外科的修復は痛みの急性の原因を取り除くかもしれないが、既存の炎症、手術による炎症、および追加の摩耗粒子に対する炎症は、関節の損傷および変性を加速させる。これらの患者の長期的な選択肢は、現在、全身鎮痛および局所コルチコステロイド治療に限定されている。長期の炎症段階を解決できないと、関節面の障害につながる可能性があり、患者を身体活動に戻すために関節置換術が必要になる。抗炎症性バイオコンジュゲートに基づいており、３ヶ月ごとに（またはそれよりも少ない頻度で）投与するように設計された治療は、長期の関節炎の影響を軽減し、それによって痛みを軽減し、費用のかかる手術の必要性を遅らせるか、または防ぐことができる。これらの利点は、感染のリスク、患者の不便、および手術コストを含む可能性のある、ＩＡ注射の繰り返し（１年に４回）の欠点を上回る可能性がある。

バイオコンジュゲート薬の別のターゲット市場の例は、人工関節置換術後に痛みおよび滲出を経験するが、これらの症状を説明するためのインプラント周囲感染のエビデンスを示さない人工関節患者の約２５％までである。これらの患者の選択肢は、現在、その後の骨溶解がデバイスの故障につながるまで、鎮痛および臨床モニタリングに限定されている。３ヶ月ごとまたはそれ以下の頻度で投与するように設計された抗炎症性バイオコンジュゲートに基づく治療は、摩耗粒子への反応を軽減し、それによって痛みを軽減し、費用のかかる修正手術の必要性を遅らせるか、または防ぐことができる。これらの利点は、感染のリスク、患者の不便、および手術コストを含む可能性のある慢性ＩＡ注射（１年に４回）の欠点を上回る可能性がある。

多価抗体コンジュゲートは、関節の損傷または摩耗粒子への曝露によって発生する炎症を改善し、その後の異化組織の損傷を抑制するのに適した位置にある。高い力価を示すことに加えて、コンジュゲートは、特定の高分子特性を備えて操作することができ、関節内に保持される。滑膜で保持されるのに十分な大きさの抗炎症ペプチドをＨｙＡに結合させることにより、結合抗体の生理活性半減期は、同等の非結合抗体と比較して大幅に延長される可能性がある。

ＶＩＩ． 実施例
略語
ＨＡ／ＨｙＡ： ヒアルロン酸
ＥＭＣＨ： Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド
ＭＰ２Ｈ： １－［３－（｛［２－（３－ヒドラジノ－３－オキソプロポキシ）エトキシ］メチル｝アミノ）－３－オキソプロピル］－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン
ＭＰ７７Ｈ （ＭＰ３４００Ｈ）： マレイミドＰＥＧ₇₇ヒドラジド、マレイミド３．４ ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯ－ＮＨＮＨ２
ＢＭＰＨ： Ｎ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド
ＭＨＰＨ： ５－マレイミド－２－ヒドラジニウムピリジン塩酸塩
ｎ－ＡＥＭ： ｎ－アミノエチルマレイミド
ＡＰＮ－ＰＥＧ４－アミン： ３－｛ｐ－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロピオニルアミノ］フェニル｝プロピオロニトリル
ＡＰＮ－アミン： ３－（ｐ－アミノフェニル）プロピオロニトリル
ＡＰＮ－Ｃ４－アミン－ ３－［ｐ－（４－アミノブチリルアミノ）フェニル］プロピオロニトリル
ＭＰ２Ａ： １－（３－｛２－［２－（３－ヒドラジノ－３－オキソプロポキシ）エトキシ］エチルアミノ｝－３－オキソプロピル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオンまたはマレイミド－ＰＥＧ₂－アミン
ＭＰ３Ａ： １－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチルアミノ）－３－オキソプロピル］－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン
ｓＮＨＳ： Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド
ＨＯＢｔ： ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＭＶＰ： 多価ペプチドポリマーコンジュゲート

材料および方法
本発明のペプチドおよびコンジュゲートは、国際公開第２０１７／１００４７０号およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９／２１４６０（国際公開第２０１９／１７３７７７号）に記載されている方法に従って調製することができ、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。

実施例１． ヒドラジドリンカーによるヒアルロン酸の修飾
ヒアルロン酸または他の酸含有糖のジアシルヒドラジン結合ヘテロ二官能性架橋剤修飾を得て、チオール反応性価を約１０～４００（架橋剤に依存）にするために、８３０ｋＤａヒアルロン酸を０．１Ｍ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液ｐＨ５．７に４ｍｇ／ｍＬで、室温で一晩穏やかに回転させるか、または章動運動で混合することにより、懸濁する。溶液中のＨＡの３ｍｇ（３．６ｎｍｏｌ、量はポリマー組成および分子量によって異なる）に、ＤＭＳＯまたはバッファー中の５～２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液として５０～５００当量のヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）水和物またはＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓ－ＮＨＳ）を添加し、続いてＤＭＳＯまたはバッファー中の５０～１０００当量のヒドラジド－Ｘ－チオール反応性リンカー（１０～２５ｍｇ／ｍＬストック）、最後に９５００当量の０．１Ｍ ＭＥＳバッファーｐＨ５．７中の１ｇ／ｍＬストックとしての１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加し、バッファーで最終容量を１ｍＬにする。各試薬の添加の間に穏やかなピペッティングで混合する。章動ミキサーで室温で２時間反応させる。２時間後、１０％ｖ／ｖグリセロールｐＨ６．５ ＤＰＢＳ ０．０１％ｖ／ｖポリソルベート２０で平衡化した７ｋＤａ ＭＷＣＯ ５ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを使用してチオール反応性生体高分子を精製する。室温で遠心分離機を使用して溶出時間～２５～４５分で、生成物をきれいな円錐管に溶出する。チオールまたはアリコートとの反応にすぐに使用し、ドライアイスで瞬間凍結する。

あるいは、ヒドラジドリンカー、ＨＯＢｔまたはｓＮＨＳ、およびＥＤＣの等価物は、反応ｐＨとともに、生体高分子ごとに共有結合するチオール反応性小分子リンカーの数（結合価）を増減するために、より高くまたはより低く変更することができる。活性化されたバイオポリマー中間体は、サイズ排除クロマトグラフィー、他の脱塩カラム、タンジェント流ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、透析、またはアルコール／アセトン沈殿を使用して、反応物から精製することもできる。１０００Ｄａを超えるリンカーは、脱塩によって精製することができず、上記の他の方法のいずれかが必要になる。

実施例２． アミンリンカーによるヒアルロン酸の修飾
ヒアルロン酸または他の酸含有糖のジアシルヒドラジン結合ヘテロ二官能性架橋剤修飾を得て、チオール反応性価を～２～２００（架橋剤に依存）にするために、８３０ｋＤａヒアルロン酸を０．１Ｍ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液ｐＨ６．５に４ｍｇ／ｍＬで、室温で一晩穏やかに回転させるか、または章動運動で混合することにより、懸濁する。溶液中のＨＡの３ｍｇ（３．６ｎｍｏｌ）に、９５００当量の０．１Ｍ ＭＥＳバッファーｐＨ６．５中の１ｇ／ｍＬストックとしての１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加し、続いてＤＭＳＯまたはバッファー中の５～２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液として５０～５００当量のＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓ－ＮＨＳ）またはヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）水和物を添加し、最後に１０００当量のアミン－Ｘ－チオール反応性リンカー（１０～２５ｍｇ／ｍＬストック）または１：１ ＤＭＳＯ：ＨＣｌ塩用０．１Ｍ重炭酸ナトリウムを添加し、バッファーで最終容量を１ｍＬにする。各試薬の添加の間に穏やかなピペッティングで混合する。章動ミキサーで室温で２時間反応させる。２時間後、１０％ｖ／ｖグリセロールｐＨ６．５ ＤＰＢＳ ０．０１％ｖ／ｖポリソルベート２０で平衡化した７ｋＤａ ＭＷＣＯ ５ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを使用してチオール反応性生体高分子を精製する。室温で遠心分離機を使用して溶出時間～２５～４５分で、生成物をきれいな円錐管に溶出する。チオールまたはアリコートとの反応にすぐに使用し、ドライアイスで瞬間凍結する。

あるいは、アミンリンカー、ＨＯＢｔまたはｓＮＨＳ、およびＥＤＣの等価物は、反応ｐＨとともに、生体高分子ごとに共有結合するチオール反応性小分子リンカーの数（結合価）を増減するために、より高くまたはより低く変更することができる。活性化されたバイオポリマー中間体は、サイズ排除クロマトグラフィー、他の脱塩カラム、タンジェント流ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、透析、またはアルコール／アセトン沈殿を使用して、反応物から精製することもできる。

実施例３． ＵＶ吸光度スペクトルまたはエルマン反応を使用した生体高分子あたりのリンカーの決定
生体高分子ごとに生体高分子骨格に共有結合しているリンカーの平均数（結合価）は、精製され、活性化された中間試料のＵＶスペクトルを取得することによって決定された。同じバッファー中の１２００μＭリンカー溶液を精製し、最終的に活性化された中間体を作成し、１：１で６回、段階希釈して、合計７つの試料およびブランクを作成した。Ｂｉｏｔｅｋを使用して各標準（２００～３２４ｎｍ、２ｎｍステップ）のＵＶスペクトルを収集し、サンプルホルダーとして３枚のトリオプレートを取り、試料を２回または４回分析する。このデータによって生成された検量線の傾きは、対象となる任意の波長にわたる適切なバッファーでのリンカーのモル吸光係数および経路長の積を示す。２番目のＵＶスペクトル検量線は、最終的に活性化された中間体が精製されるバッファーを使用して、同じバッファーで生体高分子（つまり、４ｍｇ／ｍＬ ８３０ｋＤａヒアルロン酸、高純度）を使用して作成された。この溶液を１：１で６回、段階希釈し、合計７つの試料およびブランクを作成した。Ｂｉｏｔｅｋを使用して各標準（２００～３２４ｎｍ、２ｎｍステップ）のＵＶスペクトルを収集し、サンプルホルダーとして３枚のトリオプレートを取り、試料を２回または４回分析する。このデータによって生成された検量線の傾きは、様々な波長の適切なバッファーでの生体高分子のモル吸光係数および経路長の積を示す。濃度に対する２０４ｎｍおよび２３０ｎｍでのこれらの各溶液の吸光度値のプロットを使用して、２つの分子のモル吸光係数＊経路長を決定した。ここで、生体高分子の吸光度は基本的にゼロ２３０ｎｍである。未知の試料は、検量線の作成に使用したものと同じバッファーに含まれている必要がある。未知の中間体について、２０４ｎｍおよび２３０ｎｍでの吸光度値を測定した。このデータを使用して、リンカー用に生成された２３０ｎｍの検量線を使用してリンカー濃度を最初に計算することにより、Ｚｅｂａ精製中間体の未知のリンカーおよび生体高分子濃度を計算した。次に、この濃度を使用して、２０４ｎｍでのリンカーの吸光度の寄与を計算した。２０４での総吸光度と２０４ｎｍでのリンカーからの吸光度の寄与の差を使用して、生体高分子濃度を計算した。この情報から、生体高分子または結合価あたりの共有結合したリンカーのｖ総数を概算できるが、これはインタクト／チオール反応性マレイミドの数に関する情報を提供しない。

さらに、ポリマーあたりのチオール反応性基の数は、比色エルマンアッセイの修正版を使用して計算することができる。Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）標準は、４００μＭ ＮＥＭストックの６つの１：１段階希釈液を使用して作成し、これらの溶液をウェルプレートに３反復分添加した。チオール反応性中間体試料は、試料ごとに６回繰り返して２回希釈して３回調製した。２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮＡ）を最終濃度４００μＭですべての試料に添加し、軌道振とう（～２００ｒｐｍ）しながら室温で２時間反応を進行させた。この後、エルマン試薬（５，５－ジチオ－ビス－（２－ニトロ安息香酸）を最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬで各試料に添加し、未反応のＭＥＳＮＡとのエルマン試薬反応から生じる着色生成物を惹起した。エルマン反応を軌道振とうしながら１５分間進行させた後、プレートの４１２ｎｍでの吸光度を分析した。ＮＥＭ検量線では、分子がＮＥＭと同じ速度でチオールと反応すると仮定して、チオール反応性分子を計算することができる。

実施例４． 純度の決定
ＵＶ吸光スペクトルを使用して、続くＺｅｂａ精製後の中間純度を決定し、活性化生体高分子からすべての反応物／副産物を除去するために必要なＺｅｂａスピンカラム精製の数を決定した。粗反応混合物からのスペクトルを、１回または２回のＺｅｂａ精製カラム通過後の試料のスペクトルと比較した。１つおよび２つのＺｅｂａ通過試料のＵＶスペクトルは同じように重ね合わせられ、スペクトルが同じであり、最初と２番目のＺｅｂａ精製ステップ間で変化が発生しなかったことを示している。これにより、０．５ｍＬ Ｚｅｂａカラムを使用した１回目と２回目のＺｅｂａスピンカラムパス間で中間体のＵＶシグナルに変化がないことが確認され、中間合成から反応物を除去するには１回のＺｅｂａ精製で十分であることが示された。逆相ＨＰＬＣを使用して、中間体の純度を評価することもできる。Ｚｅｂａカラム精製前後の中間体の逆相ＨＰＬＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＲＰ－ｍＡｂ－ＳＢ－Ｃ８またはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＯｎｙｘモノリシックＣ１８カラムと、６０ｍＭギ酸アンモニウム中のアセトニトリル０．１％ＴＦＡの勾配からなる移動相のいずれかを使用して実行した。これにより、生成物と反応物／反応副生成物のピークを十分に分離することができる。ＨＰＬＣは、少量の残留反応物（ＥＤＣの可能性が高い）が存在する可能性があることを示しているようであるが、これはさらに検証する必要がある。

実施例５． ペプチド－ポリマーコンジュゲートの調製
異なる小分子リンカーを使用して合成された一連の中間体に結合したペプチドとのバイオコンジュゲートを得るために、固定濃度のペプチドを、マレイミドあたり約０．５～２タンパク質当量を標的とする、またはポリマーあたり固定数のペプチドを標的とするＰＢＳ中のポリマーと組み合わせ、４℃または周囲温度でそれぞれ少なくとも４時間および２時間、回転または章動混合で反応する（ほとんどの反応は溶解性を向上させるために室温で行う）。場合によっては、コンジュゲーション反応の前に、タンパク質当量あたり１０～１００当量のＤＴＴまたはＴＣＥＰ ＨＣｌ等の還元剤を添加して、ペプチド間で生じるジスルフィドを還元することができる。これは、脱塩カラムまたはバッファー交換によって結合の前にタンパク質溶液から除去するか、またはポリマービーズに固定化されたＴＣＥＰの形で結合反応に直接添加することができる。結合反応中に、反応効率を改善するために次の一つまたは複数が追加された： 遊離チオール酸化を最小限に抑える０．５～１０ｍＭ ＥＤＴＡ、タンパク質を安定化する、および／または非特異的相互作用を減らすのに役立つｔｗｅｅｎ２０、炭水化物、共溶媒、またはグリセロール、タンパク質と活性化生体高分子の間で、タンパク質を安定化するため、および／またはタンパク質と活性化生体高分子の間の非特異的相互作用を減らすために増減する塩濃度。未反応のペプチドは、次の一つまたは複数の方法でペプチド－ポリマーコンジュゲートから除去された： 適切なバッファー（ｐＨはペプチドのｐＩより１ユニット以上上または下）に対して５０～１０００ｋＤａ ＭＷＣＯで４℃～室温で４時間ずつ２回、少なくとも４時間１回の透析、ＤＰＢＳ ｐＨ６～８、またはＥＤＴＡおよびトゥイーンまたはトレハロース等の他の添加剤を使用した５０ｍＭ ｔｒｉｓ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８～８．５に対するタンジェント流ろ過ペプチド（ペプチドによる）、サイズ排除カラムを使用したＦＰＬＣ研磨、コンジュゲートのポリマー成分を結合するように設計されたアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用したＦＰＬＣ研磨、またはコンジュゲートの選択的沈殿。反応効率が十分に高い場合（たとえば、未反応のタンパク質が４％未満存在する場合）、精製は必要ない場合がある。

あるいは、活性化ポリマーの各溶液に、ペプチドを適切なペプチド：ポリマーモル供給比およびＴｗｅｅｎ－２０で最終濃度０．０１％になるように添加した。周囲温度で回転（～５ＲＰＭ）または章動運動により撹拌しながら、溶液を２時間反応させた。未反応のペプチドは、次の各緩衝液に対して１００ｋＤａ ＭＷＣＯメンブレンを使用した透析によって除去された： まず、リン酸緩衝生理食塩水または同等のトリス緩衝生理食塩水（ｐＨはペプチドによって異なる）と０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０を少なくとも４時間、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む２番目のリン酸緩衝生理食塩水を一晩、および０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を４℃または室温で４時間。タンパク質の安定性を高めるために、ｔｗｅｅｎ２０、ＥＤＴＡ、炭水化物等の添加物を添加することができる。

市販の抗体を使用したペプチド－ポリマーコンジュゲート形成では、抗体（２～１０ｍｇ／ｍＬ）を最初に５～２０モル当量の２－イミノチオラン（トラウト試薬）で活性化して、章動運動を伴う周囲温度での１時間の周囲反応を経て、抗体表面に遊離チオールを生成する。活性化された抗体は、０．５ｍＬ ７ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａカラムを使用して精製した。チオール表示抗体は、ＴＣＥＰ等の還元剤を使用して抗体を部分的または完全に還元することによっても生成することができる。精製後、活性化抗体をマレイミドあたり０．５～２当量でＥＭＣＨまたはＭＰ２Ｈ中間体と混合し、章動運動で混合しながら周囲温度で２～３時間反応させた。次に、抗体コンジュゲート反応液を８００μＬに希釈し、１０００ｋＤａ ＭＷＣＯ透析カセットを使用して精製し、適切なバッファー（ｐＨはペプチドのｐＩより１ユニット以上上または下）に対して４時間ずつ２回、４℃～室温で少なくとも４時間透析した。別の精製戦略は、ＤＰＢＳ ｐＨ６～８、または５０ｍＭトリス １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８～８．５に対するタンジェント流ろ過、ＥＤＴＡおよびトゥイーンまたはトレハロース等の他の添加剤（ペプチドに応じて）、サイズ排除カラムを使用したＦＰＬＣ研磨、コンジュゲートのポリマー成分を結合するように設計されたアフィニティークロマトグラフィーカラム、またはコンジュゲートの選択的沈殿。反応効率が十分に高い場合（たとえば、未反応のタンパク質が４％未満存在する場合）、精製は必要ない場合がある。

低分子量ペプチド（＜５０００Ｄａ；配列番号２０を参照）を含むコンジュゲートを合成するために、ペプチドをＤＭＳＯ：バッファーミックスで１０ｍｇ／ｍＬに引き上げ、２０当量（ＴＣＥＰ）を使用して室温で６０分間還元した。１５００Ｄａ未満のペプチドの精製を容易にするために、遊離チオールを生成するか、ビーズに結合したＴＣＥＰを使用して還元する。可溶性ＴＣＥＰで還元されたペプチドは、０．５ｍＬ ７ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａ脱塩カラムを使用して精製した。精製された活性化ペプチドは、マレイミドあたり２～５ペプチド当量の比率で中間体と混合され、室温で２時間反応させた。場合によっては、ペプチドあたり０．５当量のＴＣＥＰを添加して、ジスルフィドを含むペプチドが２つのペプチド間のジスルフィド形成または１つのペプチドと２つの異なるポリマー中間体との反応によって架橋しないようにした。未反応のペプチドは、次の一つまたは複数の方法でペプチド－ポリマーコンジュゲートから除去した： 適切なバッファーに対する５０～１００ｋＤａ ＭＷＣＯによる透析（ｐＨはペプチドのｐＩより１ユニット以上高く、ＤＭＳＯのようにコンジュゲートを可溶性に保つ共溶媒が必要な場合がある）各４時間に２回、４℃で少なくとも４時間に１回、４０ｋＤａ ＭＷＣＯの脱塩カラム、ＤＰＢＳ ｐＨ６～８、または５０ｍＭトリス １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８～８．５に対するタンジェント流ろ過、ＥＤＴＡおよびトゥイーンまたはトレハロース等の他の添加剤（ペプチドに応じて）、サイズ排除カラムを使用したＦＰＬＣ研磨、コンジュゲートのポリマー成分を結合するように設計されたアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用したＦＰＬＣ研磨、またはコンジュゲートの選択的沈殿。反応効率が十分に高い場合（たとえば、未反応のタンパク質が４％未満存在する場合）、精製は必要ない場合がある。

結合の検証は、ＳＤＳ ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のいずれかを使用して決定し、精製後のコンジュゲート形成および未反応タンパク質の割合を評価した。検量線に対する濃度測定を使用して、クマシーブルーまたはＳＹＢＲルビーのような蛍光染色で染色された精製コンジュゲートのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で未反応のモノマーを定量化した。２８０ｎｍでのＳＥＣピーク面積を使用して、精製されたコンジュゲートに残っている未反応タンパク質の割合を決定した。ＳＥＣの場合、コンジュゲートを分析前にろ過して粒子を除去し、Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＬＢ－８０４または８０６カラム、または移動相としてＤＰＢＳを使用したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＰｏｌｙＳｅｐ－６０００を使用して分析し、２８０ｎｍでベースライントレースを取得した。さらに、ＳＥＣをマルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）と組み合わせて、精製されたペプチド－ポリマー共役回転半径および分子量を決定することができる。

配列は、標準的な方法に従って調製されたか、または様々な商業的ソースから入手されたか、またはサードパーティによって提供された。たとえば、配列番号１８および配列番号１９は、Ｈｙｂｒｉｇｅｎｉｃｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって提供された。

実施例６． ペプチド－ポリマー結合アッセイ
コンジュゲートの生理活性の結合親和性の検証は、以下の方法の一つまたは複数を使用して決定することができる。一例として、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ； ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ）を使用して、各ペプチドおよびペプチド－ポリマーコンジュゲートの標的への結合親和性を決定した。ビオチンで修飾された標的ペプチドは、ストレプトアビジン表面層で共有結合的に修飾されたガラスＢＬＩプローブに吸着される。次に、標的分子が結合したプローブを、既知の濃度のペプチド－ポリマーコンジュゲートまたはペプチドのみを含む溶液に入れる。レーザー光はＢＬＩプローブの長さを通過し、プローブ先端の標的に結合するペプチドまたはコンジュゲートによって生成される干渉は、結合するペプチドまたはコンジュゲートの質量と直接相関させることができる。ｋ－ｏｎ結合定数は、標的結合中に時間の経過とともに干渉データを収集することで決定することができる。次に、プローブをコンジュゲートまたはペプチドを含まないバッファーの溶液に入れる。ペプチドまたはコンジュゲートがＢＬＩプローブから解離すると、レーザー光の干渉が逆転し、ｋ－ｏｆｆ定数の計算が可能になる。同時に、この方法により、ＢＬＩは各ペプチドの結合親和性（ｋ_d）を測定し、その標的に結合することができる。

コンジュゲート結合を決定するための別の例示的な方法は、プレートベースの比色ＥＬＩＳＡまたはＤｉｓｃｏｖｅｒＸアッセイ（ＥｕｒｏＦｉｎｓ）等の細胞ベースのアッセイを使用することである。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸアッセイでは、標的ペプチド（つまり、ＶＥＧＦ）が修飾された細胞表面受容体に結合し、酵素を活性化する受容体の二量体化をもたらす。この酵素は、化学発光によるペプチド結合の定量化を可能にする。目的のコンジュゲートまたはペプチドは、細胞および標的ペプチドを含む溶液中でインキュベートされる。標的ペプチドと細胞受容体または目的のコンジュゲート／ペプチドのいずれかとの間の競合的結合は、細胞内の受容体活性化の程度を変化させる結果となる。結合および解離定数の強度は、化学発光基質の添加によって定量化され、化学発光の結果として生じる強度が収集され、細胞表面受容体を二量体化するために利用可能な遊離標的ペプチドの量と相関し、ＥＣ５０／ＩＣ５０の計算を可能にする。一般に、親水性リンカーを使用して合成されたコンジュゲートでは、より優れた生理活性が観察される。すべての場合において、ペプチドポリマーコンジュゲートは、未反応のタンパク質と比較して結合速度が改善されている。

実施例７． 安定性の決定
いくつかの方法を使用して、ＭＶＰの安定性を最初に評価し、時間および様々な温度での保管を行うことができる。濁度は、約６６０～７００ｎｍでの可視光の吸光度／散乱によって決定され、相対的な安定性を比較するために使用され、ここで濁度が高いほど安定性が低いことを示す。６６０～７００ｎｍの吸光度に基づく溶液の濁度は、コンジュゲートの安定性が低下するにつれて増加する。濁度または沈殿物／凝集体の存在の定性的測定は、視覚的分析によって行われた。多くの場合、凝集体および沈殿物は目で見ることができるが、顕微鏡画像または光散乱法で分析することもできる。これらの方法を使用して、凝集の検証および凝集体の大きさの評価を行うことができる。

安定性および初期のコンジュゲートの大きさも、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して評価した。この方法は、ＭＶＰ形成、保持時間による相対的大きさ、および精製後の未反応タンパク質の割合を分析するためにも使用された。ＳＥＣを介して安定性を評価するために、ＭＶＰをろ過して粒子を除去し、Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＬＢ－８０４または８０６カラム、または移動相としてＤＰＢＳを使用したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＰｏｌｙＳｅｐ－６０００を使用して分析し、２８０ｎｍでベースライントレースを取得した。様々な時点の後、試料を取り出し、同じＳＥＣ法を使用して分析した。ベースライン試料と比較した保持時間およびピーク幅の増加は、劣化を示している。さらに、ＭＶＰピーク面積の減少、および／または単量体および二量体タンパク質種のピーク面積の増加も、ＭＶＰ分解を示している。コンジュゲートの損失率は、ピーク面積の差を時間と比較することによって定量化された。ＳＥＣ安定性分析は、ＭＡＬＳと組み合わせて、様々な温度での老化に伴うコンジュゲートの分子量および結合価の変化を定量化した。

実施例８． ろ過性の決定
様々な小分子リンカーで生成されたペプチドポリマーコンジュゲートのろ過性を決定するために、生成物をスピンろ過（すなわち、酢酸セルロース、０．２２μｍ）またはシリンジろ過に供した。どちらの方法でも、試料は、フィルターの前後のＵＶ分析およびスペクトル比較のためにろ過前に保存された。スピンろ過では、試料を希釈せずにスピンフィルターにロードするか、１００ｋＤａ ＭＷＣＯスピン濃縮器を使用して事前に濃縮するか、バッファーで１：１に希釈し、遠心分離して溶出した。ろ過された溶離液の吸光度スペクトルを取得し、ろ過前の吸光度スペクトルにプロットして、ペプチド吸光係数を使用して計算されたシグナルの変化または濃度の変化を使用して損失を確認した。損失率は、ろ過前後の２８０ｎｍでの直接タンパク質シグナル、またはろ過前後の計算された濃度に基づいて計算された。場合によっては、精製コンジュゲートまたはコンジュゲート反応を精製またはろ過の前に１：１に希釈した。シリンジベースのろ過では、プランジャーを少量のルアーロックシリンジから取り外し、０．４５～５μｍのシリンジフィルターをルアーロックシリンジにロードした。ろ過する試料をピペットでシリンジの底に入れた。試料をろ過するために、プランジャーをシリンジに再挿入し、試料をフィルターに押し込み、きれいなチューブに移した。このプロセスは、滅菌ろ過用の新しいシリンジを備えた０．２μｍルアーロックシリンジフィルターを使用して繰り返される。ろ過された溶離液の吸光度スペクトルを取得し、ろ過前の吸光度スペクトルにプロットして、損失を確認した。損失率は、ろ過前後の２８０ｎｍでのタンパク質シグナルのタンパク質変化に基づいて計算された。

実施例９． 高結合価ペプチド－ポリマーコンジュゲートの合成
８３０ｋＤａのＨＡ中間体は、ＥＭＣＨまたはＭＰ２Ｈのいずれかを使用して合成され、上記の方法を使用してリンカーとＨＡの等価物を変化させることにより、ＨＡ骨格ごとにマレイミドの範囲を表示した。これにより、上記の方法を使用して、ペプチドの結合価が変化する抗ＴＮＦａペプチド－ポリマーコンジュゲートの合成が可能になった。これらのコンジュゲートを上記の方法を使用して分析し、コンジュゲートペプチドの結合価／力価および取り扱い特性、反応効率、達成可能な最大の結合価、および疎水性または親水性リンカーのいずれかを使用して合成して得られたコンジュゲートの結合反応速度との関係を評価した。

この実験では、ＥＭＣＨベースの高結合価ペプチドタンパク質コンジュゲート（最大結合価７５）が不安定であるため、ＥＭＣＨ生成物はＭＰ２Ｈと比較して達成可能な最大結合価およびろ過回復が制限されていることが見出された。ＭＰ２Ｈコンジュゲート（最大結合価１１０）は、ＥＭＣＨよりも高い薬物負荷でのろ過により滅菌可能であると同時に、全体的に優れた取り扱い特性、ろ過性、および反応効率を示した。ろ過によってより高い結合価のＭＰ２Ｈコンジュゲートを滅菌する能力により、ＭＰ２Ｈは、製造プロセスのスケーリングに関して、ＥＭＣＨコンジュゲートと比較して改善された薬剤候補になる。高結合価のＥＭＣＨコンジュゲートはろ過できないため、ＥＭＣＨコンジュゲートの合成では、達成可能な最高の薬物負荷を得るために時間のかかる滅菌処理が必要であるが、これらのプロセスは臨床規模の薬物生産に対応していない。ＭＰ２Ｈコンジュゲートは、分子あたりのペプチド結合価を高くすることができる。これにより、溶解性によって薬物負荷が制限されるＥＭＣＨコンジュゲートと比較して、同等または改善された生理活性が得られる。ＭＰ２Ｈコンジュゲートの安定性の向上により、最終濃度の高い治療溶液の生成も可能になり、投与量あたりの薬物負荷が大きくなる。

実施例１０． 関節内半減期
周知のラットモデルを使用して、関節からのタンパク質のクリアランス率を評価し、抗ＴＮＦバイオコンジュゲートのＩＡ半減期を測定した（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． １９９９；４２（１０）：２０９４）。このアッセイでは、ラットに麻酔をかけ、後肢の膝を無菌注射用に準備した。３０Ｇの針を使用して、各膝関節の滑膜を介して注射を行い、４０μＬの滅菌緩衝液を滑液に注射した。各右膝において、注射はまた、抗炎症ペプチド、または同等の濃度の総ペプチドの抗炎症ペプチドのいずれかを含んでいた。一般に、この実験に使用されるペプチドは、通常のペプチドタグ付け方法を使用して、近赤外フルオロフォア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０等）でタグ付けされている。注射後最大１０日間の様々時点で、ラットをｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ等）を使用してイメージングし、膝の蛍光シグナルの強度（平均放射効率等）を測定した。各左膝は対側画像対照（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。近赤外線レポーターは、関節内のタンパク質のピコグラム量までの検出を可能にするｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用して、ラットの膝で高感度に検出することができる。各治療の半減期は、光学的ｉｎ ｖｉｖｏイメージングのための確立された指数関数的減衰計算を使用して、ＩＡ注射後に決定された（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１３；３０（１）：２５７）。したがって、ペプチド濃度を使用して、投与後の関節内の各ペプチドまたはコンジュゲートの関節内半減期を推定した。滑液は、膝関節のペプチドの最終濃度を測定するための質量分析によるプロテオミクス分析のために、実験の最後に収集することができる。

投与前に、ペプチドは、製造元のプロトコルに従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０または代替の近赤外蛍光プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でタグ付けされた。簡単に説明すると、ペプチドを、プローブ：ペプチドの２：１の比率でＳｕｌｆｏ－Ｃｙ７またはＡＦ７５０－ＮＨＳエステルと混合した。プローブを室温で１時間ペプチドと反応させた後、反応溶液１０部ごとに１．５Ｍトリス１部を加えてクエンチした。ペプチドは、ＮＡＰ－１０脱塩カラムを使用して精製し、ＰＢＳ、ｐＨ７．０で溶出した。

一組の実験（図７）では、抗ＴＮＦα ＶＨＨ抗体（ｎ＝１０）の関節内半減期を、ＥＭＣＨリンカーを備えた２０００ｋＤＡ ＨｙＡに結合した抗ＴＮＦα ＶＨＨ（ｎ＝４）、およびＭａｌ－ＰＥＧ２－ヒドラジドリンカーを備えた２０００ｋＤＡ ＨｙＡに結合した抗ＴＮＦα ＶＨＨ（ｎ＝４）から作られた抗炎症性バイオコンジュゲートの半減期と比較した。２０００ｋＤａ ＨｙＡで作られたいずれかのバイオコンジュゲートの半減期は、結合していないＶＨＨよりも有意に長かった。この実験では、Ｍａｌ－ＰＥＧ２－ヒドラジスリンカーで作られたバイオコンジュゲートは、両方のコンジュゲートが同じ大きさの生体高分子成分を有するにもかかわらず、ＥＭＣＨで作られたバイオコンジュゲートと比較して関節で約３０％長い保持時間を示した。

実施例１１． 硝子体内半減期
ウサギモデルは、未反応のペプチドと比較したタンパク質－ポリマーコンジュゲートの硝子体内半減期の決定に使用することができ、ＬＣＭＳまたは放射効率を介して分析することができる。ＬＣＭＳの半減期を決定するために、動物は、ペプチドポリマーコンジュゲートまたはペプチドのみの等モル用量を、各眼に５０μＬの硝子体内注射で投与を受けた。１、４、１０、２０、６０、および９０日目に、各群から３匹のウサギを屠殺し、トリプシン消化後の硝子体内ペプチドおよびコンジュゲート濃度のＬＣＭＳ定量のために摘出した眼球を調製した。ＬＣＭＳ濃度測定法は、組織試料マトリックス成分による干渉を受けず、抗ＶＥＧＦペプチドに特有のトリプシン消化物中のペプチドを２ｎＭまで定量化することができる。これは、１０を超える硝子体内半減期を検出するのに十分である。

図１７のデータを生成するために、蛍光標識ペプチドまたはペプチドタンパク質コンジュゲートを合成し、ウサギに硝子体内投与して、硝子体内半減期を決定した。投与前に、ペプチドは製造元のプロトコルに従って近赤外プローブでタグ付けされた。簡単に説明すると、ペプチドを、プローブ：ペプチドの２：１の比率でＳｕｌｆｏ－Ｃｙ７またはＡＦ７５０－ＮＨＳエステルと混合した。プローブを室温で１時間ペプチドと反応させた後、反応溶液１０部ごとに１．５Ｍトリス１部を加えてクエンチした。ペプチドは、ＮＡＰ－１０脱塩カラムを使用して精製し、ＰＢＳ、ｐＨ７．０で溶出した。ペプチドまたはペプチドポリマーコンジュゲートの硝子体内注射を０日目にウサギの眼に注射した。硝子体内注射後の記載された時間にウサギを安楽死させ、眼球全体を取り出し、液体窒素中で急速凍結した。凍結しながら、硝子体、網膜、房水全体を解剖し、黒い２４ウェルプレートに入れた。個々の組織試料の総放射効率［ｐ／ｓ］／［μＷ／ｃｍ²］は、ＩＶＩＳスペクトルイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、励起／発光が７４０／８００ｎｍで、ブランクとしての未注入の対照眼から１秒間露光した組織を使用してイメージングした。次に、硝子体内半減期を、総放射効率線形回帰分析を使用して計算した。

この研究では、ペプチド－ポリマーコンジュゲートが硝子体内半減期をペプチド単独と比較して２～３倍延長することが観察された。タンパク質ポリマーコンジュゲート技術の場合、結合価が高いほど、得られる分子の生理活性が高くなることが実証されている。親水性ＭＰ２Ｈリンカー中間体は、ＥＭＣＨおよび他の疎水性リンカーと比較して、より高い結合価、より高い濃度、より優れた取扱い性のコンジュゲートの合成を可能にするため、これらのコンジュゲートのより高い達成可能な結合価は、ｉｎ ｖｉｖｏで同等以上の生理活性を生成する最大の薬物負荷をもたらす。親水性リンカーによって分配されるより高い薬物濃度は、疎水性リンカーと比較して、最終的な薬物生成物に対してより高い用量を達成することを可能にするであろう。さらに、以前に使用された疎水性リンカーベースのコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏ研究のためにろ過する能力を有していなかったため、これらのコンジュゲートを合成するために滅菌処理法を採用しなければならなかった。滅菌処理法は適時実施するものであり、臨床研究や医薬品製造に必要となる大規模な製造プロセスに拡張することはできない。

前述の発明は、理解を明確にする目的で例示および例としてある程度詳細に説明されてきたが、当業者は、特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることを理解するであろう。さらに、本明細書で提供される各参考文献は、各参考文献が参照により個別に組み込まれた場合と同程度に、その全体が参照により組み込まれる。本出願と本明細書で提供される参考文献との間に矛盾が存在する場合、本出願を優先するものとする。

Claims (45)

1. 各Ｘは、独立して、約５ｋＤａ～約２００ｋＤａの分子量を有するペプチドであり；
   各Ｙは独立して親水性リンカーであり；
   Ｚは、約０．１ＭＤａ～約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーであり；および
   下付き文字ｎは、１０～１０００の整数である、式Ｉ：
   

   

   のコンジュゲート。
2. 前記ペプチドは、血管新生の阻害剤である、請求項１に記載のコンジュゲート。
3. 前記ペプチドは、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、ＶＥＧＦに特異的な抗体、またはＶＥＧＦに特異的なＤＡＲＰｉｎである、請求項２に記載のコンジュゲート。
4. 前記ペプチドは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２、ＰＤＧＦ、またはＰｌＧＦを阻害する、請求項２または３に記載のコンジュゲート。
5. 前記ペプチドは、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体断片、単鎖可変領域抗体、単一ドメイン重鎖抗体、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎ、クニッツ型阻害剤、またはデコイ受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｃｏｙ）である、請求項２～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
6. 前記ペプチドは、免疫細胞機能の活性を調節する、請求項１に記載のコンジュゲート。
7. 前記ペプチドは、腫瘍壊死因子－α、インターロイキン－１β、インターロイキン－６、またはインターフェロン－γを阻害する、請求項６に記載のコンジュゲート。
8. 前記ペプチドは、腫瘍壊死因子－αを阻害する、請求項６または７に記載のコンジュゲート。
9. 前記ペプチドは、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体断片、単鎖可変領域抗体、単一ドメイン重鎖抗体、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、クニッツ型阻害剤、またはデコイ受容体である、請求項６～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
10. 前記ペプチドは、約５ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量を有する、請求項６～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
11. 前記ペプチドは、約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項６～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
12. 前記ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
13. 前記ペプチドは、以下の配列を有する、請求項６～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート：
    ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＤＨＳＧＹＴＹＴＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＲＩＹＷＳＳＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＡＩＳＲＤＩＡＫＮＴＶＤＬＴＭＮＮＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＤＧＩＰＴＳＲＳＶＥＳＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１）。
14. 各親水性リンカーが独立して以下の式：
    

    

    を有し、ここで
    Ｙ¹はチオール反応性基であり；
    Ｙ²はそれぞれ独立してＮ、Ｏ、またはＳである１～６個のヘテロ原子を有するＣ_3-20ヘテロアルキレン、または－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m－であり、ここで下付き文字ｍは、１～１００の整数である；および
    Ｙ³はカルボキシ反応性基である、
    請求項１～１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
15. 各親水性リンカーが独立して以下の式：
    

    

    を有し、ここで
    Ｙ¹はチオール反応性基であり；
    Ｙ³はカルボキシ反応性基であり；および
    下付き文字ｍは、１～１００の整数である、
    請求項１～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
16. Ｙ¹は、チオール、アリールプロピオロニトリル、またはマレイミドである；および
    Ｙ³はアミンまたはＮ－アシルヒドラジドである、
    請求項１５に記載のコンジュゲート。
17. 前記親水性リンカーが以下の式：
    

    

    を有し、ここで下付き文字ｍは、１～１００の整数である、
    請求項１４～１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
18. 前記親水性リンカーが以下の式：
    

    

    を有し、ここで下付き文字ｍは、１～１００の整数である、
    請求項１４～１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
19. 前記親水性リンカーが以下の式を有する、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート：
    

    
20. 前記生体適合性ポリマーは多糖である、請求項１～１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
21. 前記生体適合性ポリマーはグリコサミノグリカンである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
22. 前記生体適合性ポリマーはヒアルロン酸である、請求項１～２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
23. 前記生体適合性ポリマーは、約０．２ＭＤａ～約１．５ＭＤａの分子量を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
24. 前記生体適合性ポリマーは、約０．９ＭＤａの分子量を有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
25. 前記生体適合性ポリマーは、約０．８ＭＤａ～約３ＭＤａの分子量を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
26. 前記生体適合性ポリマーは、約２ＭＤａの分子量を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
27. 下付き文字ｎは１０～４００の整数である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
28. 下付き文字ｎは１０～１００の整数である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
29. 下付き文字ｎは５０～１００の整数である、請求項１～２８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
30. 請求項１～２９のいずれか一項に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
31. 眼の疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象への治療有効量の請求項１～２９のいずれか一項に記載のコンジュゲートの硝子体内投与を含み、それによって眼の疾患または障害を治療する方法。
32. 前記眼の障害は、黄斑変性、脈絡膜血管新生、網膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、または眼の炎症である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記コンジュゲートの硝子体半減期は、少なくとも２週間である、請求項３１または３２に記載の方法。
34. 前記対象はヒトである、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記コンジュゲートは、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回、または１年に１回投与される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記コンジュゲートの前記硝子体半減期は、生体適合性ポリマーに結合されていない（ｎｏｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ）生理活性ポリペプチドの半減期よりも少なくとも２倍を上回る、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）の疾患または障害を治療する方法であって、該関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）に、請求項１～２９のいずれか一項に記載のコンジュゲートの有効量を注射することにより、該関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）の疾患または障害を治療することを含む方法。
38. 前記コンジュゲートの拡散半減期は、前記ペプチドより少なくとも約２倍長い、請求項３７に記載の方法。
39. 前記コンジュゲートの前記拡散半減期は、前記ペプチドより少なくとも約２倍～約１００倍長い、請求項３７または３８に記載の方法。
40. 前記コンジュゲートの関節内半減期は、前記ペプチドよりも少なくとも約２０％長い、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記コンジュゲートの前記関節内半減期は、前記ペプチドよりも少なくとも約２０％～約１０００％長い、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記疾患または障害は、関節リウマチ、摩耗関連変形性関節症、加齢性変形性関節症、外傷後変形性関節症、乾癬性関節炎、および無菌性インプラント弛緩（ａｓｅｐｔｉｃ ｉｍｐｌａｎｔ ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）、関節滲出液、強直性脊椎炎、滑液包炎、痛風、反応性関節炎、滑膜炎、または無腐性壊死である、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記コンジュゲートは、１ヶ月に約１回以下で前記関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）に注射される、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記コンジュゲートは、約１ヶ月に１回から６ヶ月に１回まで前記関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）に注射される、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記コンジュゲートは、２ヶ月に１回または３ヶ月に１回前記関節（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｊｏｉｎｔ）に注射される、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。

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