KR20000015895A

KR20000015895A - 타입-2 케모카인 결합 단백질 및 그 이용방법

Info

Publication number: KR20000015895A
Application number: KR1019980709446A
Authority: KR
Inventors: 그란트 맥파든; 알렉산드라 루카스
Original assignee: 유니버시티 오브 알버타
Priority date: 1996-05-22
Filing date: 1997-05-21
Publication date: 2000-03-15
Also published as: WO1997044054A3; JP2000511535A; EP0901379B1; DK0901379T3; CN1226171A; NO985412L; ATE196091T1; ES2152095T3; PL330149A1; DE69703040T2; IL127166A0; BR9710028A; WO1997044054A2; DE69703040D1; PT901379E; CA2256568A1; GR3034805T3; AU3136197A; HK1017622A1; NZ333456A

Abstract

본 발명은 폭스바이러스에 의해 기호화되고 급성 및 만성 이상 조정된 염증성 반응과 관련된 단백질 대항 질병 증후군의 소프 섬유종 바이러스 T1군과 같은 아미노산 서열 상동성을 갖는 신규한 케모카인 결합 단백질(타입 -2 CBP)의 이용방법을 제공하는 것이다.

Description

타입-2 케모카인 결합 단백질 및 그 이용방법

고등척추동물의 세포내에서 그들의 생존을 유지하게하는 바이러스가 특히 숙주 면역계를 피하기 위하여 진화하여야만 한다는 것이 점점 명백해지고 있다(Gooding, L.,Cell,91:5-7,1992; Marrack, P. and Kappler,J., Cell,76:323-332,1994;Smith,G.,Trends in Micro.,82:80-88,1994). 실제, 바이러스 생존은 외부 침입자에 대한 무수한 숙주 반응을 피할 수 있고, 막을 수 있고, 방해할 수 있거나 아니면 혼동할 수 있는 전략에 달려있다. 면역계의 효과기 아암들에 의해 부여된 선택 압력은 명백히 진화적인 압력의 강력한 요소가 될 수 있고, 현재 모든 유카로틱 바이러스들 존재는 기호화된 단백질 또는 그들의 특별한 생물학적 생존 전략과 같은 면역계를 갖는 그들 투쟁의 흔적 또는 자취를 포함한다.

더 큰 DNA 바이러스들(즉, 아데노신바이러스, 헤르페스바이러스, 이리도바이러스 및 폭스바이러스)은 특히 감염된 숙주에 의한 면역 인식 및/또는 제거로부터 바이러스를 보호하기 위하여 작용하는 단백질을 기호화한다. 그와 같은 "파괴하는(subersive)" 바이러스성의 단백질들은 이제 면역계의 기능적 작용에 관련하는 정보를 제공하고 있고, 새로운 요소들의 이러한 성장군의 더 많은 발견들이 미래에 동정될 것이다.

1980년대에 "바이로킨(virokine)"이라는 용어는 사이토킨과 같은 외부세포 표기 분자들을 모방하여 기능하는 감염된 세포들로부터 분리된 바이러스-유래 단백질이나 숙주 면역목록용으로 중요한 다른 분리된 조절제들을 나타내는 것으로 제안되었다.(Kotwal, G. and Moss,B., Nature, 335: 176-178,1998). 나중 1990년대에 "바이로셉터(viroceptor)"라는 용어는 일부 바이러스 유래 단백질이 중요한 세포수용체를 모방하고, 그들의 정상적인 수용체로부터 숙주 사이토킨을 전환하여 초기 단계에서 면역체계를 방해함으로써 기능한다는 발견을 설명하기 위하여 도입되었다(Upton, et al., Virology, 184:370,1991;Schreiber와 McFadden, Virology, 204:692-705,1994).

최근 특정한 폭스바이러스, 점액종바이러스에 대한 연구들은 바이러스가 다양한 전략로 면역계를 분열시킨다는 것을 밝혔다(McFadden 과 Graham, Seminars in Virology, 5:421-429,1994). 점액종 바이러스는 점액종증이라고 하는 집토끼의 독성 전신성 질병의 전염병인자이다. 원래 19세기에 설명된 점액종은 실험동물용으로 발견된 최초의 바이러스성 병원체였고, 페스트 박멸이라는 명백한 목적을 위하여 자연환경으로 매우 신중히 도입된 최초의 바이러스성 병원체였다. 40년이상 전에 오스트리아와 유럽의 야생 토끼 집단체로의 방출이래로 토끼와 바이러스 양자의 야생 스트레인은 상호 진화론적이고 접종된 영역에서 정상상태 풍토병을 가져온 선택된 압력에 지배를 받았다(Fenner, F. and Ratcliff, F.N., "점액종증", Cambridge University Press, London,1965).

점액종은 다른 폭스바이러스 즉, 세포질 위치 복제와 큰 이중 꼬임 DNA제놈(160킬로베이스)과 관련된 많은 생리학적 현상들을 공유한다. 증거의 다중 라인들은 모든 폭스바이러스와 같은 점액종이 다양한 숙주 조직에서 바이러스의 확장과 번식을 허용하는 기능을 갖는 다중 유전자 생성물들을 기호화한다는 것을 나타낸다. 이들 바이러성 단백질들의 일부는 특히 숙주 염증성 반응과 습득한 세포면역의 성장을 방해 또는 파괴하는데, 일반적으로 폭스바이러스는 그와 같은 면역조절 단백질의 풍부한 원천이 되었다(Tuner, P.C., and Moyer, R.W., Cur. Top. Microbiol.Imm., 163:125-152, 1990;Buller, R.M.L., and Palumbo, G.j., Micro.Dev., 55:80-122, 1991; Smith., G.L., J., Gen.Virol., 94:1725-1740,1993; McFadden, G.,(Ed.), "DNA로 기호화된 바이로셉터, 바이로킨 및 관련 면역 조절자", R.G. Landes Co., 오스틴 텍사스, 1995).

그와 같은 면역조절 유전자 생성물의 예들은 점액종 성장인자(MGF)를 포함하는데, 그것은 세포 표피 성장 인자 수용체를 통하여 파라크린과 같은 방식으로 인접 세포들을 자극한다(Upton, et al., J.Virol., 61:1271-1275,1987;Opgenorth, et al., Virol., 186:185-191,1992; Opgenorth, et al., Virol., 192:701-708, 1992; Opgenorth, et al., J. Virol., 66:4720-4731,1992). 세린 단백질 분해효소 억제 활성을 갖는 분리된 당단백질인 서프 1(Serp 1)은 초기 염증 반응의 성장을 방해한다(Upton, et al., Virol., 179:628-631, 1990; Lomas, et al., JBC, 268:516-521, 1993; Macen, et al., Virol., 195: 348-363, 1993); 세포 종양 괴사 인자(TNF)수용체 상과의 분리된 바이러스성 동족체인 T2는 토끼 TNF를 결합하고 억제한다(Smith et al., BBRC, 176:335-342,1991; Schreiber, M and McFadden,G., supra, 1994: Upton, et al., supra,1991); 세포 인터페론-γ 수용체의 분리된 바이러스성 동족체인 T7은 토끼 인터페론-γ를 결합 및 억제한다 (Upton et al., Science, 258:1369, 1992; Upton and McFadden, Methods in Molecular Genetics, 4:383,1994; Mossman, et al., In: " 바이로셉터, 바이로카인 및 관련된 면역 조절자" p. 41-54 Ed. McFadden, R.G. Landers, Co., 1995): 그리고, 표면 수용체와 같은 단백질인 M11L은 알려지지 않은 메카니즘으로 염증 반응내에서 방해한다(Opgenorth, et al., supra; Graham, et al., Virol, 191: 112-124,1992).

면역 조절 단백질들도 "케모카인"이라는 화학주성의 사이토킨을 포함한다. 케모카인은 특별히 뉴트로필, 호염기성 세포, 단핵세포 및 T세포들과 같은 백혈구용 화학주성인자인 저분자량 면역성 리간드이다. 단백질의 3차원 구조에서 디설파이드 결합을 형성하는 4개의 유지된 시스테인 잔기를 포함하는 2개의 주요한 케모카인 군이 있다. α군은 C-X-C(여기서, X는 임의의 아미노산이다)로 표시되는데, 이것은 Ⅱ-8, CTAP-Ⅲ, gro/MGSA 및 ENA-78을 포함하고; β군은 C-C로 표시되는데, MCP-1, MIP-1α와 β 및 활성에서 조절되고 정상 T발현 및 분리된 단백질(RANTES)을 포함한다. 상기 군들의 표시는 방해잔기가 모티브에서 초기 두 시스테인들에 일정한 간격을 유지하는가에 따른다. 일반적으로, 대부분의 C-X-C 케모카인은 단핵세포들에는 아니지만 뉴트로필에 대하여는 화학주성인자이고, 반면에 C-C 케모카인은 뉴트로필에는 아니지만 단핵세포들에 주성을 나타낸다. 최근에 케모카인의 제 3그룹 "C"기는 림포텍틴(lymphotactin)이라는 새로운 단백질의 발견에 의해 표시되었다(Kelner, et al., Science, 266:1395-1933,1994). 케모카인 군은 염증부위내로의 호염기성 세포 및 단핵세포의 비여과법에 매우 중요하다고 여겨진다.

더 많은 면역조절 바이러스성 유전인자들의 잔존이 발견될 것이 높을 것이다. 이들 및 관련된 유전인자 생성물들은 숙주 항바이러스 방어 메카니즘의 상이한 아암들을 해부하는데 유용한 도구를 제공할 뿐만 아니라, 면역계의 염증 및 비정상 면역계를 억제하기 위한 세포면역 레퍼토리 및 새로운 약제군들의 신규한 요소들을 동정하는 새로운 시도를 제공할 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 백혈구 화학주성에 포함되고, 총괄하여 "케모카인(Chemokine)"으로 불리우는 케모카인군을 위한 용해성 바이러스-특정 억제제의 새로운 군에 관한 것이다. 상기 단백질들은 타입 2 케모카인 결합 단백질(type-2 CBP)로 표시되고, 쇼프(Shope) 섬유종 바이러스와 점액종 바이러스(SFV-T1)로 기호화된 T1 단백질에 관련된 폭스바이러스 단백질군이다. 상기 타입-2 CBP 및 기능적으로 관련된 동족체들은 백혈구의 과잉 유입이 병원성 과정에 관련되는 다양한 염증성 질병의 치료에 유용하다.

본 발명은 일반적으로 면역학에 관련된 것으로, 특히 다양한 폭스바이러스로 기호화된 케모카인 결합 단백질과 그 이용방법에 관한 것이다.

도 1은 화학주성의 사이토킨(케모카인)에 결합하는 폭스바이러스 단백질의 타입-2 CBP군의 알려진 요소들의 서열 정돈을 도시한 것이다.

도 2는 점액종 T1 유전인자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로, 타입-2 CBP를 나타낸다. 박스된 뉴클레오티드 트리플렛은 인접 T2 유전인자(TNF-수용체 동족체)를 위한 정지코돈이고, 화살표는 예상되는 표시 펩티드 분열부위를 가리키고, 밑줄쳐진 아미노산들은 T1 단백질을 위한 두 개의 예상되는 N-포도당화 부위이다(SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2).

도 3은 토끼 폭스바이러스(RPV)의 35KDa 단백질, 타입-2 CBP군의 요소들중 하나, 케모카인의 C-C군의 결합 요소들(MIP-1β,맨위 패널) 및 C-X-C군(Ⅱ-8, 중간패널)을 도시한 것이다. 상부의 두 패널들에서 방사성 라벨된 리간드들은 대조 감염된 BGMK 세포들(MOCK) 또는 점액종(MYX), 점액종의 T7-제거 돌연변이체(MYX-T7-), 토끼 폭스바이러스(RPV) 및 RPV의 35KDa-제거 돌연변이체(RPV-35K-)로 감염된 세포들로부터 선택된 바이러스성 단백질들에 가교결합된다. 리간드와 바이러스성 단백질들 사이에서 가교결합된 복합체들은 화살표로 도시된다. 점액종 타입-1 CBP 단백질(T7)도 케모카인을 결합할지라도 타입-2CBP단백질(T1)은 맨 아래 패널에서 도시한 바와 같이 실질적으로 동일한 크기(ca 35KDa)이다. 점액종의 T1(타입 1)과 T7(타입2) 양 단백질들이 케모카인을 결합하지만 RPV(타입 2)의 35KDa단백질만이 이 활성을 갖는다.

도 4는 벡시니아에서 분리된 35KDa 단백질(스트레인 리스터)을 나타내지만, 스트레인 WR에서 빠져있고, RPV의 분비된 35KDa 단백질과 유사하게 MIP-1β단백질을 결합한다. 화살표는 스트레인 WR이 아닌 벡시니아 스트레인 리스터로 감염된 BGMK 세포들로부터 분리된 MIP-1B와 35KDa 단백질 사이의 복합체를 나타내는 것이다.

본 발명의 발견은 염증 및 손상, 감염 및 다양한 질병상태에 대한 면역 반응동안 순환으로부터 조직부위들로의 호염기성 세포들과 단핵세포들의 트래픽킹과 관련하는 광범위한 면역병리학적 상태를 치료하는 잠재능력을 갖는 항염증 단백질의 중요한 새로운 원천을 제공하는 것이다.

복제되고 서열화된 타입-2 CBP 유전인자들은 알려진 케모카인 수용체들의 동족체들로부터 분리되지 않고, 최근 연구에서 밝혀진 바와 같이 모두 7멤브레인-스페닝 영역(서펜틴(serpentines)이라고 칭한다)을 갖는다(Kelvin, D.J., et al.,J. Leukocyte Biol., 54:604-612, 1993: Murphy, P.M., Ann. Rev. Imm., 12:593-633, 1994: Horuk, R., Imm. Today., 15: 169-174, 1994: 및 Horuk, R., Trends in pharm. Sci., 15:159-165,1994). 비록 일부 DNA 바이러스들이 폭스바이러스에서 최소 한 개의 유전인자 후보(Massung, R.F., et al., Virology, 197: 511-528, 1994)를 포함하는 서펜틴 수용체(Ahuja, S.K., et al., Imm. Today, 15:281-287, 1994)와 같은 동족체를 기호화한다 해도, 본 발명의 타입-2 CBP는 상기 특별한 수용체군의 요소는 아니다.

본 발명의 전형적인 타입-2 케모카인 결합 단백질(type-2 CBP)은 소프 섬유종 바이러스로 감염된 세포들로부터 분리된 단백질중의 하나이고, T1 개방 레딩프레임(reading frame)으로 기호화된다(Upton, et al., Virology, 160:20-3, 1987; 및 GenBank Accession No:P25946). 상기 단백질은 벡시니아의 분리된 35kDa 단백질(스트레인스 코펜하겐 및 리스터)와 토끼 폭스바이러스에 대하여 현저한 서열 유사성을 갖는다. 또한, 타입-2 CBP단백질은 쥐 또는 인간의 IFN-γ은 아니지만(Mossman, et al., J. Biol Chem., 270:3031-3038, 1995)이 아닌 특별히 토끼 IFN-γ를 결합하지만 또한 케모카인을 결합하고 타입-1 케모카인 결합 단백질(CBP-1)(앞서 케모카인 결합 단백질-1(CBP-1)으로 표시)로 표시되 는 점액종 M-T7 단백질과는 구별된다.

용어 "케모카인 결합 단백질(Chemokind binding protein)"은 1종 이상의 케모카인들을 결합하고 억제하는 단백질을 칭한다. "케모카인"은 백혈구 화학주성에 반응성인 사이토킨군이다. 케모카인의 α군은 C-X-C로 표시되고(여기서, X는 임의의 아미노산이다), 인터루킨-8(Ⅱ-8), 연결 조직 활성 단백질 Ⅲ(CTAP-Ⅲ), 멜라닌 생성세포 성장 자극 활성(MGSA) gro/MGSA, IFN-γ유도 단백질(IP-10), 뉴트로필 활성 펩티드 2(NAP2), β-혈전 글로브린 및 상피성-유도 뉴트로필 유인제 -78(ENA-78)를 포함하고; β군은 C-C로 표시되고, T-셀 활성 유전자-3(TCA-3), 단핵세포 화학주성 단백질(MCP-1, 2 및 3), 마크로파지 염증성 단백질(MIP-1α 및 β) 및 란테스(RANTES : regulated on activation, normal T expressed and secreted protein)를 포함한다.

다른 케모카인들은 통상 선행기술에 사용된 방법으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 보이든 챔버(Boyden Chamber)를 사용하여 실험될 수 있는 분자는 화학주성물질의 생체밖(in vitro) 조사를 위한 바람직한 화학주성 분석계이다. 웰의 시리즈는 프랙시 글래스 블록(plexiglass block), 두 개의 챔버, 상부 및 하부로 이루어진 각 웰로 형성되고, 예를 들어 니트로셀룰로오스와 폴리카보네이트같은 몇가지 타입의 다공성 필터중 어느 하나에 의해 분리된다. 매우 흥미있는 세포로 예를 들면 말초 혈액 단핵세포(PBMC)는 각 배지의 상부 챔버에 첨가되고, 시험물질 예를 들면 화학주성인자는 저부 챔버에 첨가된다. 만일 상부 챔버에서 세포들이 하부챔버에 물질로 주입된다면 용액에 존재하는 이론적인 농도 구배를 따라 이행하고 필터의 공극을 통하여 나오고, 그 필터의 저부 측면에 부착할 것이다.

케모카인군의 요소들이라고 예측되는 폴리펩티드는 이제 본 발명의 CBP를 사용함으로써 스크린될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시태양에서 1종 이상의 케모카인을 포함하고 조성물에 대한 CBP의 결합을 검출한다는 것이 예측되는 조성을 가진 본 발명의 비접촉 또는 매트릭스-결합 CBP를 포함하는 신규한 케모카인을 스크린하고 동정하는 방법을 제공한다.

원한다면 다양한 라벨이 케모카인에 대한 CBP의 결합을 검출하기 위한 수단으로써 사용될 수 있다. 케모카인 또는 CBP는 직접 또는 간접적으로 예를 들면 방사성 측정기, 형광화합물, 생물발광화합물, 화학발광화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 검출 라벨될 수 있다. 이 기술분야의 통상의 지식을 가진자들은 다른 적합한 라벨을 알 수 있거나, 일반적인 시험을 이용하여 그와 같은 것을 검출할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시태양에서는 약 30-40kD의 분자량을 갖고, 감소된 SDS-PAGE로 측정되는 포도당화의 정도에 의존하고, SFV T1 또는 RPV 35kDa 동족체를 갖는 아미노산 서열 상동성을 갖고, 감염된 세포로부터 분리되는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 치료학적으로 유효량의 항-염증성 단백질을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 면역병리학적 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 "항-염증성"이라는 용어는 염증성 반응의 감소나 억제를 칭하는 것이다.

본 발명의 타입-2 CBP의 포도당화되고 분리된 형태는 SDS-PAGE에 감소 상태하에서 측정된 것과 같이 약 35-40kD의 겉보기 분자량을 갖는다. 또, 단백질은 SFV T1 및 RPV 35kD 분리된 단백질을 갖는 상동성을 갖는다. "상동성(homology)"라는 용어는 아미노산 레벨에서 타입-2 CBP와 다른군 요소들 사이에서 동정의 정도를 나타낸다. 바람직하게 타입-2 CBP는 SFV T1 단백질을 갖는 50-95% 사이의 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 상동성 요건은 엄격하지는 않지만 타입-2 CBP는 인간 케모카인과 상호작용하는 생물학적 기능을 유지하여야만 한다. 다시말하면, 상동성은 타입-2 CBP가 케모카인을 결합하고 억제하는 한 충분한다.

본 발명은 기능성 폴리펩티드 타입-2 CBP 및 그 기능성 단편들을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "기능성 폴리펩티드"는 정의된 기능성 분석을 통하여 동정되고, 특별한 생물학적, 형태학적 또는 표현형 반응과 관련된 생물학적 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 가리키는 것이다. 타입-2 CBP의 기능성 단편들은 타입-2 CBP의 활성이 남아있는한 타입-2 CBP의 단편을 포함한다(예를들면, 케모카인에 결합). 타입-2 CBP의 생물학적 활성을 포함하는 소폴리펩티드도 본 발명에 포함된다. 그러한 펩티드들은 본 발명의 실시예에 기재되어 있는 방법을 포함하는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 알려진 방법으로 케모카인에 대한 결합으로 분석될 수 있다. 생물학적 기능은 항체 분자가 세포내에서 특징적 유도에 참가하거나 표현학상의 변화를 프로그래밍할 수 있는 다량의 폴리펩티드에 에피토프를 결합할 수 있는 것과 마찬가지로 폴리펩티드 단편들로부터 변화할 수 있다. "기능성 폴리펩티드"는 본 발명에서 기재된 바와 같이 기능성 폴리펩티드를 기호화한 폴리누클레오티드를 나타낸다.

타입-2 CBP 주된 아미노산 서열의 미소한 개량은 본 발명에서 기재한 타입-2 CBP 폴리펩티드와 비교하여 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질이라고 할 수 있다. 그러한 개량은 위치-지정 돌연변이 유발에 의한 것처럼 고의로 될 수 있거나 동시에 일어날 수 있다. 이들 개량에 의해 생산된 모든 폴리펩티드들은 타입-2 CBP의 활성이 유지되는한 본 발명에 포함된다. 또, 1이상의 아미노산 제거가 현저하게 그 활성을 변화시키지 않는다면 생성 분자의 구조 개량이 될 수 있다. 이것은 폭넓은 유용성을 갖는 소 활성 분자의 개량을 유도할 수 있다. 예를 들어 타입 2-CBP 활성에 요구되지 않는 아미노 또는 카르복시 말단 아미노산을 제거할 수 있다는 것이다.

본 발명의 타입-2 CBP 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드 서열의 보존적인 변이를 포함한다. 본 발명에서 사용된 용어 "보존적인 변이(conservative variation)"는 아미노산 잔기를 다른, 생물학적으로 유사한 잔기로 치환한 것을 가르키는 것이다.

보존적인 변이의 예로는 이소류신(isoleucine), 발린(valine) 또는 다른 종류의 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기 치환체 또는 리신용 아르기닌, 아스파르트산용 글루타민의 치환체, 또는 아스파라긴용 글루타민과 같은 다른 부분을 위한 한 개의 극성잔기 치환체 등을 포함한다. 용어 "보존적인 변이"는 항체가 치환 폴리펩티드를 비치환 폴리펩티드와 면역반응시킴으로써 제공된 비치환 모체 아미노산대신에 치환된 아미노산의 용도를 또한 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용된 타입-2 CBP의 바이러스성 기원의 예들은 타입-2 CBP가 약 30-40kD의 분자량을 갖고, SFV T1 단백질 동족체와 상동성을 갖는 포도당화의 정도에 의존하고, 및 단백질들의 상기군의 생물학적 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 생물학적 기능의 항-염증성 단백질을 갖는한 점액종 바이러스, 벡시니아(스트레인스 리스터 및 코펜하겐), 쇼프 섬유상 바이러스, 래빗폭스 및 다른 포유류의 폭스 바이러스들을 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 치료되는 면역 병리학적 질병은 케모카인의 생성물과 병든세포에서 수득된 축적물인 반응성 백혈구와 관련될 수 있다. 상기 방법은 치료학적으로 유효량의 타입-2 CBP를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 용어" 면역 병리학적 질병"이라는 것은 일반적으로 면역반응 또는 면역을 포함하는 임의의 질병을 칭하는 것이다. 본 발명에서 사용된 "치료학적으로 유효한"은 면역병리학적 질병의 원인을 개선하는데 충분한 타입-2 CBP량이 충분하다는 것을 칭하는 것이다. "개선하다"는 치료를 받는 환자에 있어서 질병의 해로운 영향의 감소를 칭하는 것이다. 본 발명의 요지는 바람직하게는 인간 그러나, 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 예를 들면 인간 뼈 골수로 이식된 SCID (인간화된 SCID)마우스와 같은 면역병리학적 질병을 갖는 임의의 동물을 가정할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료 될 수 있는 면역병리학적 질병들의 예들은 후천성 면역 결핍증(AIDS), 독성 쇼크 증후군, 동종이식 거부반응, 관전 플라크성장, 자외선과 방사선반응 및 T세포, B세포, 마이크로파지 및 면역반응 및 급성 상 반응동안의 다른 염증 백혈구 및 종양 괴사 인자-매개된 카텍시(tumor necrosis factor-mediated cachexia)와 같은 전이된 암과 관련된 질병을 포함한다.

본 발명은 패혈증 증상을 나타내거나 패혈증 발현 위험에 있는 환자에게 치료학적으로 유효량의 타입-2 CBP를 투여하는 단계를 포함하는 내독소혈증 또는 패혈증성 쇼크(패혈증), 또는 1이상의 패혈증 증상을 포함하는 면역 병리학적 질병을 치료하거나 개선하는 방법을 제공한다. 용어 "개선하다"는 치료함으로서 질병의 증상을 감소하고 완화시키는 것을 말한다.

면역병리학적 질병의 증상을 나타내는 환자는 항생물질 또는 항바이러스성 약제로 치료하는 것과 더불어 타입-2 CBP로 치료될 수 있다. 통상 항생물질은 젠타마이신 또는 페니실린과 같은 베타락탐 또는 세팔로스포린과 같은 아미노글리코시드를 포함한다. 따라서, 본 발명의 치료방법은 살균량의 항생물질 또는 충분한 양의 항바이러스성 화합물의 투여와 더불어 실질적으로 동시에 치료학적으로 유효량의 타입-2 CBP를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 " 살균량(bactericida amount)"이라는 용어는 치료를 받는 환자에 있어서 박테리아-멸균 혈중농도를 달성하는데 충분한 양을 의미한다. 일반적으로 인간에 투여하기에 안전한 것으로 인식된 항생물질의 살균량은 당해기술분야에서 잘 알려져 있고, 당해 기술분야에서 알려진 바와 같이 특정 항생물질과 치료되는 박테리아 감염의 형태에 따라 변한다. 바람직하게, 타입-2 CBP의 투여는 약 48시간내 바람직하게는 28시간 그리고 가장 바람직하게는 실질적으로 항생물질의 투여와 동시에 발생한다.

본 발명의 발명에서 타입-2 CBP의 투여는 또한 후-재관류상처(post-reperfusion injury)를 개선하기 위하여 이용될 수 있다. 동맥 혈전증을 치료할 때, 조직 플라스미노젠 활성제와 같은 응괴 혈병 용해제에 의한 재관류의 감소는 종종 조직 손상과 관련된다. 그러한 조직 손상은 최소한 일부가 폴리형태핵 백혈구(PMN)를 포함하는 백혈구들에 의해 매개된다고 생각되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 타입-2 CBP의 투여는 백혈구 또는 PMN-내피의 상호작용을 폐쇄하고, 그러므로써 후-재관류 상처를 감소시키거나 방지할 것이다. 또한, 타입-2 CBP의 투여는 동맥 상처후 새로운 발병과 재발 관절플라그 성장을 방지하는데 유용하다. 플라그의 협착과 새로운 성장은 동맥벽의 내부층에 대한 국부적 염증성 반응에 의해 악화된다고 여겨진다.

본 발명의 방법은 또한 알레르기 또는 자가면역 질병에 기인하는 염증의 치료에 유용하다. 알레르기 질병의 예들은 알레르기 비염, 천식, 아토피성 피부염 및 음식 알레르기를 포함한다. 면역계가 숙주의 자가 조직들을 공격하는 자가면역 질병의 예들로는 타입 1 인슐린-종속 당뇨병 멜리투스, 염증성 내장병, 피부염, 뇌막염, 혈전성 혈소판감소 자반염, 스조그렌 증후군, 뇌염, 포도막염, 백혈구유착결핍, 류마티즘성 및 다른 형태의 면역 관절염, 류마티즘 발열, 라이터증후군(Reiter Syndrome), 건선관절염, 진행성 전신 경화증, 초기 담즙 경화증, 천포창, 유천포창, 회사맥관염, 근무력증 그레비스, 다발성 경화증, 루푸스 홍반, 다발성 근염, 유육종증, 육아종증, 맥관염, 악성빈혈증, CNS 염증성 질병, 항원-항체 복합체 매개 질병, 자가면역 용혈성 빈혈증, 하시모토(Hashimoto's) 갑상선염, 그레이브스(Graves) 질병, 습관성 자연 유산, 레이나드 증후군(Reynard's Syndrome), 사구체신염, 피부근염, 만성 활성 간염, 복강질병, AIDS 의 자가면역 합병증, 위축성 위염, 강직 척추염 및 에디슨 질병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법은 또한 건선, 천포창 불가리스, 베켓 증후군(Behcet's), 급성 호흡기 곤란 증후군(ARDS), 허혈성 심장 질환, 아테롬성 동맥경화증, 후-투석 증후군, 백혈병, 후천성 면역 결핍 증후군, 패혈증 쇼크 및 다른 형태의 급성 염증 및 지질 조직구증과 같은 비-악성 또는 면역감시기구-관련 세포증식을 치료하는데 유용하다. 특별히, 케모카인 생성물(예를 들면, IL-8, MIP-1α 또는 β발현의 유도)에 기인하는 프로 염증성 과정과 세포 침투에 병인학적으로 결합된 임의의 질병도 치료하기 쉽다고 여겨진다.

본 발명의 방법은 또한 세균에 의한 감염의 치료에도 유용하다. 박테리아, 리케차, 바이러스 기생충들 및 바이러스와 같은 많은 세균들은 도관 내피 및 백혈구에 결합하고, 예를들어 인터루킨을 생성하는 염증성 반응을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용된 타입-2 CBP는 그와 같은 감염에 관련된 염증을 예방하기 위하여 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 타입-2 CBP의 투여량 범위는 면역 반응의 증상들이 어느 정도의 억제를 나타내는데 요구되는 효과를 생성하기에 충분히 많은 양이다. 투여량은 원하지 않는 가교-반응들, 아나필락시성 반응등과 같은 반대의 효과들을 발생할 만큼 많아서는 안된다. 일반적으로 투여량은 나이, 상태, 성별 및 환자에 있어서 질병의 정도에 따라 달라질 것이고, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해서 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 반대지시의 결과로, 개인 치료자에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 투여량 마다 약 10pg 내지 100μg로 달라질 수 있고, 하루 또는 몇일 동안 매일 1회이상 분량으로 투여될 수 있다.

타입-2 CBP는 비경구적, 피하, 폐내, 동맥내, 직장내, 근육내 및 비강내 투여를 포함하는 임의의 적절한 방법으로 투여된다. 비경구적 투여는 근육내, 정맥내, 동맥내 또는 복강내투여를 포함한다. 타입-2 CBP는 또한 예를들어 서방성 피하 주입의 형태로 피부주입으로 투여될 수 있고 또는 경구적으로 캡슐형태, 파우더 또는 과립형태로 투여될 수 있다. 타입-2 CBP는 또한 흡입형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 폐의 염증성 질병의 치료용으로 치료학적으로 사용되었을 때, 바람직한 경로의 투여는 폐로의 분무로 될 것이다.

치료학적으로 비경구적 투여를 위한 수용가능한 캐리어 조제는 무균의 또는 수용성 또는 비수용성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수용성 용매의 예로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일 및 에틸올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르들이다.

수용성 캐리어들은 물, 알콜/수용성 용액, 에멀젼 또는 식염수 및 완충 매질을 포함하는 현탁액을 포함한다. 비경구적 비히클은 염화나트륨 용액, 링거포도당,포도당과 염화나트륨, 유산염 링거 또는 정착유를 포함한다. 활성 치료 성분은 종종 약제학적으로 활성성분으로 수용할 수 있고 양립할 수 있는 부형제들과 혼합된다. 바람직한 부형제들은 물, 식염수,포도당, 글리세롤 및 에탄올 또는 이들의 조합을 포함한다. 정맥내 비히클은 체액 및 영양물 공급자, 링거 포도당에 기초하는 전해질 공급자등을 포함한다. 방부제와 기타 첨가제 예를 들면 세균방지제, 산화방지제,킬레이트제 및 불활성 기체등과 같은 것이 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 타입-2 CBP를 포함하는 의약 또는 약학 조성물을 제조하는 방법에 관련되고, 상기 의약은 바람직하지 않는 면역반응/염증성 반응의 치료용으로 사용되는 것으로, 상기 면역반응은 본 발명의 타입-2 CBP에 결합하는 케모카인생성물을 생성한다.

본 발명은 약 30-40kD의 분자량을 갖고, 포도당화의 정도에 의존하고, 점액종 T1 인터페론-γ 수용체 동족체와 아미노산 서열 상동성을 갖고, 약제학적 캐리어에 있어서 점액종 T1 인터페론-γ 수용체 동족체의 생물학적 기능을 갖는 면역병리학적으로 유효량의 항-염증성 단백질의 최소 1회 투약을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 본 발명의 타입-2 CBP를 포함하는 임의의 약제학적 조제 및 조성물을 제공한다. 형태는 투여의 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 주사주입을 위한 조성물은 앰풀주사제, 단위투여량을 포함하는 개별적 또는 다중성 투약을 포함하는 용기의 형태로 제공될 수 있다.

타입-2 CBP는 약제학적으로 수용할 수 있는 중화된 염형태와 같은 치료학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이들은 예를 들면 염화수소 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산등과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가 염을 포함한다. 염들은 또한 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제 2철산화물과 같은 무기계 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인등과 같은 유기계로부터 형성된 것들을 포함한다.

대조된 전달은 예를 들어 폴리에스터, 폴리아미노산, 폴리비닐피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복실메틸셀룰로오스, 프로타민 설페이트 또는 락타이드/글리콜리드 공중합체와 같은 적당한 거대분자를 선택함으로써 달성될 수 있다. 타입-2 CBP의 방출속도는 거대분자의 농도를 조절함으로써 제어될 수 있다.

활동의 계속을 유지하기 위한 다른 방법은 타입-2 CBP가 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리락타이드/글리콜리드 공중합체 또는 에틸렌비닐아세테이트 공중합체와 같은 고분자 물질의 입자내로 결합하는 단계를 포함한다. 다른 방법으로 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 하이록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 또는 폴리(메틸메타아크롤레이트)마이크로캡슐의 사용에 의한 계면중합 또는 콜로이드 약제 전달계에 의해 제조된 마이크로캡슐내로 타입-2 CBP를 인트랩할 수 있다. 콜로이드 분산계는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스페어, 비드 및 유수(oil-in-water)에멀젼, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포좀을 포함하는 지질계를 포함한다.

이하의 실시예들은 일례로서 제시되는 것으로 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 실시예들은 통상의 방법을 사용하였지만 당해 기술분야에서 알려져 있는 다른 방법을 대신 사용할 수 있는 것은 물론이다.

실시예 1

물질 및 방법

손상으로 유도된 아테롬성 동맥경화증을 가진 쥐모델:

스프라그 다우리(Sprague Dawlry)쥐를 좌 또는 우 장골대퇴골 동맥에 풍선기구 혈관성형 매개로 상처를 입도록 하였다. 1.5mm USCI 혈관성형 풍선기구는 일반적인 펜토바르비탈 마취제(i.m.주사제로 중량 100g당 6.5mg, Somnotrol, MTC Pharmaceuticals, Cambridge, Ontario)하에서 절단과 동맥절개를 통하여 동맥내로 주입하였다. CBP 또는 식염수 500pg(쥐 6마리)을 CBP의 내부 동맥 주사 또는 대조용액으로 후의 풍선기구 매개된 상처 부위에서 혈관성형 풍선기구 카테테르 상류의 말단 루멘내로 주입하였다. 그리고 나서 풍선기구는 1.0분동안 8bar 압력까지로 부풀게하였다. 혈관성형 풍선기구를 부풀린 후 방치하고 n-부틸시아노아크릴레이트 모노머(Nexaband, Veterinary Products Laboratories, Phoenix, Arizona)의 국부적인 사용으로 동맥절개 부위를 봉합하였다. 각각의 쥐를 정상적인 쥐 음식물 상태로 유지하였고, 외과 수술후 4주동안 관찰하였다. 관찰에서 쥐들은 kg당 2.0ml의 유타닐(euthanyl)로 희생되었고, 조직 시험용으로 대동맥을 채취하였다.

손상으로 유도된 아테롬성 동맥경화증을 가진 쥐모델:

콜레스테롤을 주입한 뉴질랜드 흰쥐 8마리의 말초 복부 동맥을 풍선기구 혈관성형으로 처리하였다. 모든 쥐들(strain New Zealand white)들에게 풍선기구 상처전 초기 2주에, 4일/주동안 10% 땅콩유로 2% 콜레스테롤을 주입하였다. 3-3.5mm 혈관성형 풍선기구 카테테르를(풍선기구 대 동맥직경의 비율 ≥1:1 ) 마취제(근육내 주사로 40mg/kg. 케타린, 8mg/kg 자이라젠 및 0.5mg/kg 아셉로마진) 부여후 대퇴부 동맥 절단을 통하여 주입하였다. 풍선기구는 말초 복부 동맥에서 8bar의 압력으로 부풀려지고, 말초 흉부 동맥에 주입되었다. 풍선기구는 주입된 후 각 쥐에서 내피 나지화를 확보하기 위하여 형광경 제어기하에서 3시간 동안 방치하였다. 대비혈관 촬영도가 풍선기구 혈관성형으로 매개된 외상 전후를 기록하였고 4주동안 관찰하였다. 헤파린(400단위)이 혈전증과 관련된 카테테르를 감소시키는 대퇴부 엑세스를 수득한 후 즉시 수득되었다.

시료당 정제된 타입-2 CBP 500pg를 4마리 쥐의 말초 복부 동맥을 풍선기구로 매개된 상처 후 즉시 주입되었다. 유사한 양의 식염수를 4마리 쥐의 말초 복부 동맥내로 국부적으로 주입하였다. 각각의 주입물에 풍선기구로 인한 상처 후 즉시 무균의 0.9%로 희석된 식염수를 총 10ml부피가 되도록 하여 월린스키 카테테르를 통하여 투여하였다. 모든 주입물은 장골 분기점에 인접하는 복부 동맥내에서 3.25mm 월린스키 풍선기구(2분동안 최종 압력 6±1bar로 부풀려진)을 통한 것이다. 월린스키 풍선기구는 현광경 제어하에서 즉시 장골 분기점 위에 위치하고, 그 결과 주입 풍선기구는 분기점 상부 0.5-2.5cm에 위치하고 1차 주입부위로 표시된다. 상류 2차부위는 장골 분기점에 인접한 상부 2.5cm 영역을 의미한다. 모든 시험에서 주입물에 풍선기구로 인한 상처 후 즉시 무균의 0.9%로 희석된 식염수를 총 10ml부피가 되도록 하여 월린스키 카테테르를 통하여 투여하였다. 모든 주입물들은 장골 분기점에 인접한 복부 동맥에서 3.25mm 월린스키 풍선기구(2분동안 최종압력 6±1bar로 부풀려진)를 통한 것이다.

조직 및 형태학적 분석:

조직학적 분석은 말초 복부 동맥(토끼) 또는 관류 풍선기구의 원래 위치에 의해 정의되는 것과 같은 1차 주입 부위를 나타내는 상부 장골 대퇴골 동맥 분지(쥐)내 월린스키 주입의 1차 부위에서 수행된다. 토끼에서 내부 대조 부분들은 장골 분기점 근처 비-주입부위 상류( 분기점위 0.5cm에서 분기점 아래 0.5cm)및 비-주입부위 하류(상부 복부 동맥, 장골 분기점위 2.5-3.5cm)에서 취해진다. 장골 분기점위 1.5-2.5cm 영역은 풍선기구 위치로 인하여 잠재적으로 변화가능한 주입 용량을 갖는 경계영역이라고 여겨지므로 본 분석에 포함되지 않는다. 쥐에서 T-1 처리되고, 식염수 주입된 쥐용 1차 풍선기구 부위들은 조직학적 평가에 사용되었다. 포르말린 고정된 견본들의 헤마톡실린 및 에오신 착색은 앞서 언급한 것과 같이 수행되었다. 간단하게 각 견본은 10%(v/v)소듐포스페이트 완충 포르말린에서 고정되고, 진행되고, 수정시키고, 파라핀에 보관하였고, 마이크로톰으로 5μm로 절단하였다. 그리고나서 각 견본으로부터의 부분(최소 부위별 2부분)들은 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고, 라이트 현미경 검사로 조사하였다.

실시예 2

신규한 바이러스성 단백질에 사이토킨의 결합

간단하게, 다양한 인간 사이토킨들은¹²⁵I로 방사성라벨하였고, 대조 또는 폭스바이러스 감염된 BGMK세포에서 채취된 분리된 단백질에 노출하였고, 가교결합하였고, 그리고나서 신규한 사이토킨/단백질 복합체용 SDS-PAGE로 분석하였다.

가교결합분석은 신규한 바이러스성 특정 단백질이 테스트된 각각의 인간 케모카인에 결합한다는 것을 밝혔다:IL-8 및 MIP-1β(도 2). 도 2(상부 2개의 패널)는 요오드화 리간드와 조직 배양 상청액을 이용하는 겔 운동성 이동 분석을 나타낸다. 조직배양 상청액(Sups)은 다음과 같은 제조되었다: 처리하지 않은채로 남겨두거나(모의) 3. 분리된 단백질들의 다양한 감염(MOI)에서 점액종(MYX), 점액종의 T7-제거 돌연변이체(myx-T7-), 토끼 폭스(RPV) 또는 RPV의 35kDa-제거로 감염된 BGMK(Baby Green Monkey Kidney Cells)는 감염후 4시간 시점에서 PBS로 단층을 3회 세척하고, 무혈청배지로 다시 채움으로써 제조되었다; 그리고 나서 이들 상청액들을 감염후 18시간 시점에서 채집하였다(L). 모의 상청액들은 바이러스의 비존재하에서 동일한 방법으로 제조하였다. 상청액들은 아미콘 농도기(Amicon concentrator)를 사용하여 약 15배 농축하였다. 인간 케모카인 IL-8과 MIP-1β는 제조자의 프로토콜에 따라 요오드비드(Pierce)를 사용하는¹²⁵I로 라벨되었다.

겔 운동성 이동 분석은 다음과 같은 수행되었다.: 5μl의 요오드화 리간드를 10㎕ SUP와 혼합하고 2시간동안 상온에 방치하였다. 그리고나서 화학가교제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(EDC)(포타슘 포스페이트 100mM에 200mM, pH 7.5) 2㎕를 15분동안 첨가하고 이어서, 추가로 15분 동안 2㎕를 첨가하였다. 그리고나서 반응은 트리스-염산(Tris-HCl) (1.0M, pH 7.5)2㎕를 첨가하여 냉각하였다. 생성 혼합물은 SDS-PAGE 와 오토방사선촬영법으로 분석하였다. 화살표는 이동된 복합체를 나타낸다. 아래 패널은 myx-T7- 감염에서 T7단백질의 손실과 RPV-35k-감염에서 35kDa의 손실을 나타내는 쿠마시(Coomassie)염색 겔을 가르킨다.

실시예 3

쥐 대퇴골 동맥내 혈관성형 풍선기구로 매개된 상처에서 나타낸 것과 같은 항-재발협착증 단백질에서 타입-2 CBP(T1)의 효과분석

염증은 동맥벽에서 촉진된 아테롬성동맥경화증 플라그 발생에 관련된다. 플라그 재발 또는 풍선기구 혈관성형 및 폐색된 동맥을 개방하기 위하여 설계된 다른 관련 혈관성형기구의 사용후의 재발협착증의 비율이 높다. 촉진된 아테롬성 동맥경화증 플라그 성장은 또한 동맥상처, 바이러스성 감염, 맥관염, 호모시스틴뇨증, 당뇨병 멜리티스, 고혈압, 하이퍼리피듀리아, 흡연 및 면역 복합 발생된 질병하에서 보고되었다. 큰 DNA 바이러스는 항-염증성 단백질과 같은 메카니즘을 도출하였는데, 그것은 바이러스가 숙주면역 및 염증성 방어 메카니즘에 의한 감소된 억제를 갖는 숙주내 증식을 허용하는 것이다. 타입-2 CBP(T-1)는 혈관성형후 플라그 성장을 방지하기 위한 잠재적 치료제로서 시험되었다. 타입-2 CBP는 인터페론 감마 수용체 동족체 및 케모카인 억제제로 활동한다고 생각된다. 타입-2 CBP는 유도된 손상 아테롬성 동맥경화증 동물모델에서 시험되었고, 결과는 감염후 플라그 형성 4주에서 현저한 감소를 나타내었다. 백시니아 바이러스에서 분리된 타입-2 CBP인 35kDa 단백질은 단일 정맥 주사후 풍선기구 혈관성형기구 상처후 혈관내막의 증식(아테롬성 동맥경화증 플라그 성장)을 현저하게 감소시켰다(표 1). 이것은 타입-2 CBP가 면역계 질병의 치료 및 방지용 항-염증제로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

10마리의 스프라그 다우리 쥐에게 일반적인 마취하에서 오른쪽 장골대퇴골 동맥을 풍선기구 매개된 상처를 입혔다. 1.5mm 혈관성형 풍선기구가 대퇴골 동맥 절단과 장골분기점에 도입된 풍선기구의 말단을 통하여 주입되었다. 풍선기구를 부풀리기 바로 직전에 식염수(5마리 쥐) 또는 증가된 농도의 정제된 백시니아 35K단백질중 어느 하나 1.0ml를 50pg(5마리 쥐)에 동맥내로 주사하였다. 그리고나서 혈관성형 풍선기구를 2분동안 6-8기압으로 부풀리고, 수축시키고, 제거하였다. 대퇴부 동맥을 카테테르의 제거후 구멍부위에 넥사벤드로 봉합하였다. 쥐들이 회복될 수 있도록 방치하였고, 4주동안 관찰하였다. 4주 시점에 쥐들은 희생되었고, 조직학적 표준을 위하여 동맥을 채집하였다. 혈관내막 영역은 형태학적 분석에 의해 측정되었다. 혈관내막의 고혈압(플라그 영역)에서 현저한 감소가 대조 식염수 주입과 비교하여 25kDa 단백질 주입후 발견되었다(p<0.0089)(표 1).

35kDa투여량	평균 플라그 면적㎟	S.E.	p값 (t테스트)
0	0.055	0.012	NS
50pg	0.014	0.011	0.0089

실시예4

인간 단핵세포의 세포수용체에 결합하는 CBP-Ⅱ억제 케모카인

백시니아(스트레인 리스터)(표2) 및 M-T1(표3)로부터의 35kDa 단백질에 의해주된 인간 단핵세포와 THP-1의 표면수용체에 대한 세포에서 인간 MIP-1α결합억제는 각각 다음과 같은 프로토콜에 의해 설명되었다.(주의: 표 1 및 2의 실험 3은 THP-1세포를 사용하였고, 모든 다른 결과들은 주된 단핵세포에서 수득되었다)

방사성라벨된¹²⁵I MIP-1α(25μCi/ml)이 수득되었고, 적당한 부피의 방사성라벨된(고온)MIP-1α가 첨가되어 각 튜브는 50,000cpm을 포함한다. 대조군으로 비라벨된(냉각) MIP-1α(400ng)가 배경결합을 설명하기 위하여 고온 MIP-1α와 함께 첨가되었다. 35KDa M-T1(CBP-2) 및 M-T7(CBP-1)의 억제성을 측정하기 위하여 변화된 용량의 억제제를 방사선라벨된 리간드와 함께 첨가하였고, 시료들은 37℃(5% CO₂)에서 30분 동안 배양되었다. 인간혈액으로부터 분리되고, 퍼콜 구배로 나누어진 주된 단핵세포들은 1×10⁷세포수/ml의 농도에 대하여 1% BSA를 포함하는 RPMI 1640으로 희석되었고, 2000㎕ 세포들이 각 반응에 첨가되었다. 유사한 농도가 THP-1세포(단핵세포 라인)용으로 사용되었다. 상기 시료 튜브들을 상온에서 1시간 동안 교반시키고, 그후에 세포를 5분동안 13,000rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 10% 수크로스 용액 800㎕로 세척하였다. 세포들을 다시 13,000rpm에서 10분동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 그리고나서, 펠렛으로부터 방사선활성을 감마 카운터를 사용하여 측정하였다. 대조군의 두 번째 세트와 같이 세포수용체에 대한 H3-fMLP 결합하는 물성도 억제자의 존재하에서 시험되었다(표 4). 일정한 부피 1㎕가 각 튜브에 분배된 것을 제외하고는 상기와 같은 프로토콜이 수행되었고 튜브당 약 180,000cpm 수량으로 수득되었다. 35KDa와 M-T1 양자가 정량적으로 세포 수용체 MIP-1α에 대한 케모카인의 결합을 폐쇄하였다는 것을 주목할 수 있다.

표면 결합 MIP-1α
Exp.	35KDa 단백질 질량 과잉	과잉 라벨된 MIP-1α	라벨된 MIP-1α
	1600	800	400	200	50	40	4	2	6500X
1	80	77	107	144	1280	---	---	---	470	4705
2	---	---	---	88	---	2342	10688	9113	410	7708
3	55	---	---	---	---	---	---	---	1038	9944

주의: 실험 3은 THP-1세포를 사용하였고, 실험 1 및 2는 주된 단핵세포를 사용하였다.

표면 결합 MIP-1α
Exp.	200X 질량 과잉 M-T1	200X 질량 과잉 M-T7	6500X과잉 비라벨된 MIP-1α	라벨된 MIP-1α
1	978	10171	444	12206

표면 결합 fMLP
Exp.	라벨된 fMLP	1×10⁶비라벨된fMLP	35KDa(400ng)
1	374	132	507

본 발명은 현재 바람직한 실시예로 기재되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위에서 다양한 개량이 이루어질 수 있다고 이해되어야만 한다. 따라서, 본 발명은 다음 클레임에 의해서만 제한된다.

Claims

(정정)서열 ID NO:2로 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 치료학적으로 유효량의 케모카인 결합 단백질을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 세균성 감염, 악성종양과 전이, 천식, 심장 재발협착증, 자가면역성 질병, 경변증, 내독소혈증, 아테롬성 동맥경화증 및 재관류 상처로 이루어진 군으로부터 선택되는 케모카인-관련 면역병리학적 질병을 치료하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 케모카인은 α군 또는 β군 케모카인인 치료방법.
제 2항에 있어서, 상기 케모카인은 CTAP-Ⅲ, gro/MGSA, ENA-78, MCP-1,인터루킨-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β,PF-4, IP-10 및 NAP-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료방법.
(삭제)
제 1항에 있어서, 환자에게 항생물질 또는 항바이러스성 물질을 추가로 투여하는 치료방법.
제 1항에 있어서, 상기 항-염증성 단백질의 투여는 1회 투여시 약 10pg 내지 100μg로 투여하는 치료방법.
제 1항에 있어서, 상기 항염증성 단백질의 투여는 피하, 정맥내, 동맥내, 근육내, 직장내 및 경피로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료방법.
약제학적으로 수용가능한 캐리에서 서열 ID NO:2로 기재한 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 최소 1도스의 면역병리학적으로 유효량의 항-염증성 단백질을 포함하는 약학조성물.
제 8항에 있어서, 상기 항-염증성 단백질은 타입 2 케모카인 결합 단백질인 조성물.
제 9항에 있어서, 케모카인은 α군 또는 β군 케모카인인 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 케모카인은 CTAP-Ⅲ, gro/MGSA, ENA-78, MCP-1,인터루킨-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β,PF-4, IP-10 및 NAP-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
(정정)분자량이 약 30-40kD이고, 케모카인이라고 여겨지는 조성을 갖는 서열 ID NO:2에 기재한 것과 같은 아미노산 동족체를 갖는 케모카인 결합 단백질을 접촉하는 단계와 케모카인 결합 단백질에 대한 케모카인 조성물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 케모카인의 동정방법.