CZ378998A3 - Vázací proteiny chemokinu typ-2 a způsoby jejich využití - Google Patents

Description

Vázací proteiny chemokinu typ-2 a způsoby jejich využití

Oblast techniky

Vynález se obecně týká oblasti imunologie a přesněji vázacích proteinů cytokinů, které jsou kódovány různými proxviry a způsobů jejich použití pro vázání cytokinů.

Dosavadní stav technikv

Je stále více jasné, že viry, které žijí uvnitř buněk vyšších obratlovců musí mít vyvinutý zvláštní způsob obcházení imunitního systému hostitelské buňky (Gooding L., Cell, 91; 5-7, 1992; Marrack P. a Kappler J., Cell, 76; 323-332, 1994; Smith G., Trends in Micro., 82: 80-88, 1994). Opravdu, přežití virů je závislé na strategiích, které mohou obejít, potlačit, paralyzovat nebo jinak zmást nesčetné odezvy hostitele na cizího vetřelce. Je zřejmé, že tlak selekce uskutečňované prostřednictvím imunitního systému může být podstatnou součástí evolučního procesu a všechny dnes existující eukaryotní viry obsahují otisky nebo zbytky jejich boje proti imunitnímu systému, a to jak v podobě kódovaných proteinů tak i ve formě jejich konkrétních strategií biologického přežití.

Větší DNA viry (to jest adenoviry, herpesviry, iridoviry a poxviry) specificky kódují proteiny, které fungují jako ochrana viru před jeho rozpoznáním imunitním systémem a před zničením hostitelem. Tyto „subversivní“ virální proteiny nám dnes poskytují informace týkající se fungování imunitního systému a je velmi pravděpodobné, že v blízké budoucnosti budou objeveny další členové této rostoucí rodiny.

V 80-tých letech tohoto století byl navržen termín „virokiny“ k popisu proteinů kódovaných viry, vylučovaných napadenými buňkami, které fungují tak, že napodobují extracelulární signalizační molekuly jako jsou cytokiny nebo další vylučované regulátory, důležité pro imunitní repertoár hostitele (Kotwal G. a Moss B., Nátuře, 335: 176-178, 1988). Později v 90-tých letech byl zaveden termín „viroceptor“ k vysvětlení pozorování, že některé viry kódují proteiny, které napodobují důležité celulární receptory a fungují tak, že odchylují hostitelské cytokiny pryč od jejich normálních receptorů, čímž přerušují imunitní cyklus v jeho ranném stádiu (Upton et al., Virology, 184: 370, 1991; Schreiber a McFadden, Virology, 204: 692-705, 1994).

·· <»· ·· • · · · • · · · ··* 0·· ·· · » · · • » · · · »··· ·· »·

Moderní studie určitého proxviru, myxoma viru, ukázaly, že virus přerušuje imunitní systém různými strategiemi (McFadden a Graham, Seminars in Virology, 5: 421-429, 1994). Myxoma virus je infekční činitel zhoubné systémové nemoci domácích králíků, zvané myxomatóza. Myxoma virus, původně popsaný v minulém století, byl prvním pathogenním virem objeveným u laboratorních zvířat a byl prvním virálním činidlem uvedeným po zralé úvaze do přírodního prostředí za účelem vyhubení škodlivých zvířat. Protože byl uvolněn do evropské a australské králičí populace před více než 40 lety, jak králík tak i vir byly podrobeny vzájemnému evolučnímu a selektivnímu tlaku, který vyústil v ustálený enzootický stav v infikovaných oblastech (Fenner F. a Racliffe F. N., „Myxomatosis“, Cambridge University Press, London, 1965).

Myxoma sdílí mnoho biologických rysů spojovaných s jinými poxviry, jmenovitě cytoplasmatické umístění replikace a velký genom z dvojpramenné DNA (160 kilobází). Četné důkazy naznačují, že myxoma, stejně jako všechny proxviry, kódují Četné genové produkty, jejichž funkcí je umožnit rozšíření a rozmnožování virů v různých hostitelských tkáních. Některé z těchto virálních proteinů specificky paralyzují nebo potlačují rozvoj hostitelské odezvy (zánět) a získané celulární imunity, přičemž proxviry jsou obecně bohatým zdrojem těchto imunomodulátorových proteinů (Turner P. C. a Moyer R. W., Cur. Top. Microbiol. Imm., 163: 125-152, 1990; Buller R. M. L. a Palumbo G. J., Micro. Dev., 55: 80-122, 1991; Smith G. L., J. Gen. Virol., 94: 1725-1740, 1993; McFadden G., (Ed.), „Viroceptors, virokines and related immune modulators encoded by DNA viruses“, R. G. Landes Co., Austin Texas, 1995).

Příklady těchto imunomodulátorových genovýchproduktů zahrnují růstový faktor Myxoma (MGF), který stimuluje sousední buňky podobným způsobem jako paraerin prostřednictvím celulárního epidermálního receptoru růstového faktoru (Upton et. al., J. Virol., 61: 1271-1275, 1987; Opgenorth et. al., Virol., 186, 185-191, 1992; Opgenorth et. al., Virol., 192: 701-708, 1992; Opgenorth et. al., J. Virol., 66: 4720-4731, 1992); Serpl, vylučovaný glykoprotein s inhibiční aktivitou na serin proteázu, který brání rozvoji ranné zánětlivé odezvy (Upson et. al., Virol., 179, 628-631, 1990; Lomas et. al., JBC, 268: 516-521, 1993; Macen et al., Virol., 195: 348-363, 1993); T2, vylučovaný virální homolog receptoru rodiny faktorů celulární nádorové nekrózy (TNF), který váže a inhibuje králičí TNF (Smith et al., BBRC, 176: 335-342, 1991; Schreiber M. a McFadden G., supra, 1994; Upton et. al., supra, 1991); T7, vylučovaný virální homolog receptoru celulárního γ-interferonu, který váže inhibuje králičí γ-interferon (Upton et. al., Science, 258: 1369, 1992; Upton a McFadden, Methods in Molecular Genetics, 4:

« · · · 9 9 · · · · • 9 · 9 · · · · · · • · 9 9 9 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 9 ·

9999 99 99 999 99 99

383, 1994; Mossman et. al., v „Viroceptors, virokines and related immune modulátore“, str. 4154, Ed. McFadden R. G. Landers, Co., 1995) a M11L, povrchový protein podobný receptoru, který neznámým mechanismem interferuje během zánětlivé odezvy (Opgenorth et. al., supra; Graham et. al., Virol, 191; 112-124, 1992).

Imunomodulátorové proteiny také zahrnují ehemotaktické cytokiny, zvané „chemokiny“. Chemokiny jsou imunitní ligandy malé molekulové hmotnosti, které jsou chemoatraktanty pro leukocyty, jako zvláště neutrofíly, basofily, monoeyty a T buňky. Existují dvě hlavní třídy chemokinů, které obě obsahují čtyři konservovaná cysteinová residua, tvořící disulfídické vazby v terciálriích strukturách proteinů. Třída a, označovaná jako C-X-C (kde X je jakákoliv aminokyselina), zahrnuje 11-8, CTAP-III, gro/MGSA a ENA-78, a třída β, označovaná jako C-C, která zahrnuje MCP-1, ΜΙΡ-Ια a β a normální T exprimovaný a vylučovaný protein, regulovaný po aktivaci (RANTES). Určení tříd je podle toho, zda jsou v motivu dva cysteiny proloženy intervenujícím zbytkem. Obecně, většina C-X-C chemokinů jsou chemoatraktanty pro neutrofíly ovšem ne pro monoeyty, zatímco se zdá, že C-C chemokiny přitahují monoeyty ovšem ne neutrofíly. Nedávno byla nalezena třetí třída chemokinů , „C“ skupina, která byla určena po objevení nového proteinu, zvaného lymfotaktin (Kelner et. al., Science, 266: 1395-1933, 1994). Má se za to, že rodina chemokinů je kriticky důležitá při infiltraci lymfocytů a monocytů do místa zánětu.

Je vysoce pravděpodobné, že bude objeveno více imunomodulátorovýeh virálních genů. Tyto a příbuzné genové produkty budou nejen poskytovat důležitý nástroj pro analýzu různých zbraní mechanismu hostitelské antivirální obrany, ale mohou také poskytnout nové prostředky pro identifikaci nových součástí celulárního imunitního repertoáru a nové léky pro potlačení zánětů a poruch regulace imunitního systému.

Krátký popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje srovnání sekvence známých členů typ-2 CBP rodiny proxivirových proteinů, které se váží k chemotaktíckým cytokinům.

Obrázek 2 zobrazuje sekvenci nukleotidů TI genu myxomy, který exprimuje typ-2 CBP. Triplet nukleotidů označený obdélníkem je stop kodón pro připojený T2 gen (homolog TNFreceptoru), šipka označuje předpokládané místo signálu štěpení peptidů a podtržené ·» 44 4 44 44 • 444 · * · · · · · · • 44 ·· 4 · 4 · 4

4 444 4 · 4444 444

444444 4 4

4444 44 44 444 4« 44 aminokyseliny jsou dvě předpokládaná místa N-glykosylace u TI proteinu (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2).

Obrázek 3 ukazuje, že 35 KDa protein králičího proxviru (RPV), jeden ze členů rodiny typ-2 CBP, váže členy C-C skupiny chemokinů (MIP-lbeta, horní panel) a C-X-C skupiny (11-8, střední panel). Na horních dvou panelech jsou radioznacené ligandy zesíťovány s virálními proteiny vylučovanými z kontrolních infikovaných BGMK buněk (MOCK) nebo buněk infikovaných s myxomou (MYX), T7-vymazaným mutantem myxomy (MYX-T7-), králičím poxvirem (RPV) a 35I<Da-vymazaným mutantem RPV (RPV-35K-). Zesíťované komplexy mezi ligandem a virálními proteiny jsou naznačeny šipkami. Ačkoliv myxoma typ-1 protein (T7) také váže chemokiny, typ-2 CBP protein (TI) je vlastně téže velikosti (asi 35 KDa), jak je ukázáno na spodním panelu. Jak TI (typ 2) tak i T7 (typ 1) proteiny myxomy tedy váží chemokiny, ovšem pouze 35KDa protein RPV (typ 2) má tuto aktivitu.

Obrázek 4 ukazuje, že 35RDa protein vylučovaný z vakcínie (kmen Lister), ovšem který chybí u kmenu WR, váže chemokin ΜΓΡ-1β podobně, jako 35KDa vylučovaný protein RPV. Šipky označují komplex mezi MIP-1B a 35KDa proteinem vylučovaném z BGMK buněk, infikovaných s vakcinou kmene Lister, ovšem nikoliv u kmene WR.

Podstata vynálezu

Tento vynález zajišťuje důležitý nový zdroj antiimunních proteinů, které mají schopnost léčit široké spektrum imunopatologických podmínek spojených s odváděním lymfocytů a monocytů od cirkulace do tkání během zánětlivé a imunitní odezvy, infekce a různých dalších nemocí.

Klonované a sekvencované CBP geny typ-2 nejsou vylučovány homologicky se známými receptory chemokinů, které všechny vykazují sedm oblastí obepínajících membránu (nazvaných „serpentiny“), jak bylo nedávno popsáno v review (Kelvin D. J. et. al., J. Leukocyte Biol., 54: 604-612, 1993; Murphy P. M., Ann. Rev. Imm., 12: 593-633, 1994; Horuk R., Imm. Today, 15: 169-174, 1994 a Horuk R., Trends in Pharm. Sci., 15: 159-165, 1994). Ačkoliv některé DNA viry skutečné kódují homology takovýchto serpentinových receptorů (Ahuja S. K. et. al, Imm. Today, 15: 281-287, 1994), včetně nejméně jednoho genového kandidáta poxvirů (Massung R. F. et. al., Virology, 197: 511-528, 1994), typ-2 CBP podle tohoto vynálezu není člen této zvláštní rodiny receptorů.

Příkladem vázacího proteinu typ-2 (typ-2 CBP) podle tohoto vynálezu je jeden z proteinů vylučovaných buňkami infikovanými virem Shopeho fibromu a je zakódován TI otevřeným • · • · · · čtecím rámcem (Upton et al., Virology, 160; 20-30, 1987 a GenBank Accession No; P25946). Tento protein má významnou shodu sekvence s vylučovaným 35KDa proteinem vakcínie (kmeny Copenhagen a Lister) a králičím poxvirem. Dále jsou typ-2 CBP proteiny odlišné od myxoma IFN-γ proteinu, který specificky váže králičí IFN-γ, ale neváže králičí nebo lidský IFN-γ (Mossman et. al., J. Biol. Chem., 270: 3031-3038, 1995), ovšem váže také chemokiny a je označován jako vázací protein chemokinu typ-1 (předtím označovaný jako vázací protein chemokinu-1 (CBP-1).

Termín „vázací protein chemokinu“ označuje protein, který váže a inhibuje jeden nebo více chemokinu. Termín „chemokin“ označuje třídu cytokinů, které jsou zodpovědné za chemotaxy leukocytů. Třída α chemokinu je označována C-X-C (kde X je libovolná aminokyseliny) a zahrnuje interleukin-8 (11-8), spojovací, tkáň aktivující protein ΙΠ (CTAP-IH), stimulátor aktivity růstu melanocytu (MGSA) gro/MGSA, IFN-γ indukovatelný protein (IP-10), neutrofíl aktivující peptid 2 (NAP2), β-thromboglobulin a epitheliální neutrofilní atraktant 78 (ENA-78) a třída β, označovaná jako C-C, která zahrnuje gen-3 pro aktivaci T buněk (TCA-3), chemotaktické proteiny monocytů (MCP-1,2 a 3), makrofagové zánětlivé proteiny (Mff-la a 1 β) a normální T exprimovaný a vylučovaný protein, regulovaný po aktivaci (RANTES).

Další chemokiny mohou být detekovány metodami běžně používanými v daném oboru. Například, molekuly mohou být testovány s využitím Boydenovy komory, což je preferovaný systém zkoušení mikrochemotaxe pro in vitro zkoumání chemoatraktantů. V bloku plexiskla je připravena série vln, přičemž každá vlna obsahuje dvě komory, horní a dolní, které j sou odděleny libovolným typem porézního filtru, jako například nitroeelulózou nebo polycarbonátem. Zkoumaná buňka, např. mononukleární buňka periferální kr ve (PBMC) se přidá do horní komory každé vlny a testovací substance, např. chemoatraktant, se přidá do spodní komory. Jsou-li buňky v horní komoře přitahovány k substanci ve spodní komoře, budou migrovat podle teoretického koncentračního gradientu, který existuje v roztoku a budou procházet přes póry filtru a lepí se na spodní stranu tohoto filtru.

Polypeptidy, které jsou podezřelé z toho, že jsou členy rodiny chemokinu, mohou být podrobeny screeningu s využitím CBP podle tohoto vynálezu. Jedno z provedení tohoto vynálezu tedy poskytuje způsob screeningu a identifikace nových chemokinů, zahrnující spojení volného CPB nebo CPB vázaného na matrici podle tohoto vynálezu s přípravkem, který je podezřelý z toho, že obsahuje jeden nebo více chemokinů, a detekci vázání tohoto CBP na přípravek.

·· ·· ► · · 4 • · 4

Je-li potřeba, mohou být použity různé stupně jako prostředek detekce vázání CBP na chemokin. Chemokiny nebo CBP mohou být přímo nebo nepřímo označeny pro detekci, například s radioizotopy, fluorescenční látkou, s bioluminiscenční látkou, chemiluminiscenční látkou, chelátorem kovu nebo s enzymem. Odborníci v tomto oboru budou znát další vhodné značky nebo budou schopni zjistit vázání s pomocí rutinních experimentů.

Jedno provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob léčení imunopathologiekýeh nemocí u subjektů, zahrnujících podávání therapeuticky efektivního množství protizánětlivého proteinu, charakteristického tím, že má molekulovou hmotnost přibližně 30-40 kD, v závislosti na rozsahu glykosylace jak bylo určeno pomocí redukované SDS-PAGE, a mající homologii sekvence aminokyselin s SFV TI nebo RPV 35kDa homologem, přičemž je vylučovaný z infikovaných buněk. Termín „protizánětlivý“ označuje redukci nebo potlačení zánětlivé odezvy.

Glykosylovaná a vylučovaná forma typ-2 CBP podle tohoto vynálezu má zjevnou molekulovou hmotnost 30-40 kD, jak bylo určeno za redukčních podmínek pomocí SDS-PAGE. Kromě toho, protein vykazuje homologii s SFV TI a RPV 35kDa vylučovaným proteinem. Termín „homologie“ označuje stupeň identity mezi typ-2 CBP a členem jiné skupiny na aminokyselinové úrovni. Přednostně má typ-2 CBP homologii sekvence s proteinem SFV-T1 mezi 50 až 95%. Požadavky na homologii nejsou přísné, ovšem typ-2 CBP musí zachovávat biologickou funkci interakce s lidskými chemokiny. Jinými slovy, homologie je dostatečná pokud typ-2 CBP váže a inhibuje chemokiny.

Vynález zahrnuje funkční polypeptidy, Typ-2 CBP a jejich funkční fragmenty. Termín „funkční polypeptid“ zde označuje polypeptid vykazující biologickou funkci nebo aktivitu, která je identifikována prostřednictvím definovaného funkčního stanovení a která je spojena s určitou biologickou, morfologickou nebo fenotypiekou odezvou. Funkční fragmenty polypeptidu CBP typu-2 zahrnují fragmenty CBP typ-2 pokud jim zbývá aktivita CBP typ-2 (např. vázání k chemokinům). Menší peptidy obsahující biologickou aktivitu CBP typ-2 jsou také zahrnuty do vynálezu. Tyto peptidy mohou být stanoveny na vázání k chemokinům metodami známými odborníkům v oboru, včetně metod popsaných v Příkladech provedení tohoto vynálezu. Biologická funkce se může lišit od polypeptidového fragmentu popř. od epitopu, ke kterému se může molekula protilátky vázat až po velký polypeptid, který je schopen participace v charakteristické indukci nebo programování fenotypickýeh změn v buňce. „Funkční polynukleotid“ označuje polynukleotid, který kóduje funkční polypeptid podle výše uvedeného popisu.

• 9 · •9 9 · 9» 9 ·· • 9 9 · 9 9 · 9 · 9 9

9 9 9 · 9 · 9 · •9 9 9 9 9 9 9 999 • 9 9 9 *)* 9 9 • 99 4 ·· 99 999 99 9 9

Malé změny primární aminokyselinové sekvence CBP typ-2 může vést k proteinu, který má v podstatě ekvivalentní aktivitu jako zde popsaný polypeptid CBP typ-2. Tyto modifikace mohou být úmyslné, jako třeba postraní mutageneze nebo mohou být spontánní. Všechny polypeptidy produkované těmito modifikacemi jsou zahrnuty v tomto vynálezu a aktivita CBP typ-2 je zachována. Dále, vymazání jedné nebo více aminokyselin může také vést k modifikacím struktury výsledné molekuly bez významné změny aktivity. To může vést k rozvoji menších aktivních molekul, které by měly širší využití. Například, je možné odstranit N-koncovou nebo C-koncovou aminokyselinu, která nemusí být nezbytná pro aktivitu CBP typ-2.

Polypeptid CBP typ-2 podle tohoto vynálezu také zahrnuje konservativní variace polypetidové sekvence. Termín „konservativní variace“ v tomto vynálezu označuje nahrazení aminokyselinových zbytků jinými, biologicky podobnými zbytky.

Příklady konservativních variací zahrnují substituci hydrofobních zbytků jako je isoleucin, valin nebo methionin za jiné, nebo substituci jednoho polárního zbytku za jiný, jako třeba substituci argininu za lysin, glutaminu za aspartamovou kyselinu nebo glutaminu za asparagin a pod. Termín „konservativní variace“ také zahrnuje použití substituované aminokyseliny namísto nesubstituované matečné aminokyseliny, a to za předpokladu, že protilátky reagující se substituovaným polypeptidem také imunoreagují s nesubstituovaným polypeptidem.

Příklady virálních zdrojů CBP typ-2 použité v tomto vynálezu zahrnují virus myxoma, vakcínii (kmeny Lister a Copenhagen), virus Shopeho fibromu, králičí pox a další savčí poxviry, do té doby, pokud má CBP typ-2 biologickou funkci protizánětlivého proteinu, charakterizovaného tím, že má molekulovou hmotnost přibližně 30 až 40 kD, v závislosti na stupni glykosilace, mající homologii s SFV TI proteinovým homologem a mající biologickou funkci této třídy proteinů.

Imunopathologické onemocnění léčené podle tohoto vynálezu může být spojováno s produkcí chemokinů a výslednou akumulací leukocytů v zasažených tkáních. Metoda zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství CBP typ-2 subjektu. Termín „imunopathologické onemocnění“ označuje libovolnou nemoc, zahrnující imunitní odezvu nebo imunitu obecně. „Terapeuticky účinné“ množství označuje množství CBP typ-2, které je dostatečné ke zlepšení imunopathologického onemocnění. „Zlepšení“ označuje zmírnění škodlivých efektů nemoci u pacienta podrobeného terapii. Subjektem vynálezu je přednostně člověk, je však zřejmé, že způsobem podle tohoto patentu může být léčen jakýkoliv živočich s imunopathologickým φ φ φ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφφ φφ φ φ φ φ φ φφ φφφ φ « φ φφφ φφφ φ φ · φ φ φ φ φφφφ φφ φφ φφφ φφ φφ onemocněním, například SCID myš roubovaná s lidskou kostní dření (humanizovaná SCID). Příklady imunopathologických onemocnění, které mohou být léčeny způsobem podle tohoto vynálezu, zahrnují získaný syndrom imunitní nedostatečnosti (AIDS), syndrom toxického šoku, odmítnutí alloimplantátu, růst arteriosklerotického plátu, odezvy na ultrafialové světlo a radiaci a onemocnění spojená s aktivací T buněk, B buněk, makrofágů a dalších zánětových leukocytů během imunitní odezvy a během akutní fáze odezvy a dále nemoci spojené s pokročilou rakovinou jako třeba nádorová nekrotická kachexie.

Vynález zajišťuje způsob léčení nebo zlepšování imunopathologických onemocnění včetně endotoxemie nebo septického šoku (sepse) nebo jednoho či více symptomů sepse, zahrnující podávání terapeuticky účinného množství CBP typ-2 subjektu, vykazujícímu symptomy sepse nebo rizika septického vývoje. Termín „zlepšování“ označuje snížení nebo zmenšení symptomů léčené nemoci.

Pacient, který vykazuje symptomy imunopathologické nemoci může být kromě léčení s CBP typ-2 léčen také antibiotiky nebo antivirotiky. Typická antibiotika zahrnují aminoglykosid, jako je gentamycin nebo betalaktam jako je penicilín nebo cefalosporin. Terapeutická metoda podle tohoto vynálezu tedy zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství CBP typ-2 prakticky simultánně s podáváním baktericidních množství antibiotik nebo dostatečného množství antivirové sloučeniny.

Termín „baktericidní množství“ označuje v tomto vynálezu množství dostatečné pro dosažení takové koncentrace v krvi léčených pacientů, které zabíjí baktérie. Baktericidní množství antibiotik, obecně uznané jako bezpečné pro podávání lidem, je velmi dobře známo v daném oboru a liší se podle konkrétního antibiotika a typu léčené bakteriální infekce. Přednostně, k podávání CBP typ-2 dochází během 48 h, s výhodou během 2-8 h a nejvýhodněji prakticky souběžně s podáváním antibiotik.

Podávání CBP typ-2 ve způsobech léčení podle tohoto vynálezu může být také využito pro zlepšení post-reperfůzních zraněních. Při léčení arteriální trombózy je indukce reperfuze, pomocí činidel pro rozpouštění krevních sraženin, jako třeba aktivátor tkáňového plasminogenu (t-PA), často spojena s poškozením tkáně. Má se za to, že toto poškození tkání je alespoň částečně zprostředkováno leukocyty včetně polymorfonukleámími leukocytů (PMN). Podávání CBP typ-2 by tedy blokovalo leukocyty nebo PMN-endotheliální interakce a tím by zmenšovalo nebo zabraňovalo post-reperfuzních zranění. Podávání CBP typ-2 je také užitečné pro prevenci nového útoku nebo opakování růstu arteriosklerotického plátu po arteriálním poranění. Má se za • 0 00 00 0 · 0 00 • 00 0 · 0 00 0 00 0

0 0 0 0 0 «000

0 000 0 0 0 000 000

00U000 0 0

000 0 00 00 ·0» 0 0 00 to, že restenóza a nový růst plátu se vybudí lokální zánětlivou odezvou na vnitřní vrstvě stěny artérie.

Způsoby léčení podle tohoto vynálezu jsou také užitečné pro léčení zánětů vyvolaných alergickými nebo autoimunitními nemocemi. Příklady alergických nemocí zahrnují alergickou rhinitidu, astma, atopickou dermatitidu a potravní alergii. Příklady autoimunitních nemocí, kde imunitní systém napadá vlastní tkáně hostitele, zahrnují (nejde o úplný výčet) diabetes mellitus vyvolanou insulinem typ-1, zánětlivou nemoc střev, dermatitidu, meningitidu, trombotickou trombocytopenickou purpuru, Sjogrensův syndrom, encefalitidu, uveitidu, nedostatečnou adhezi leukocytů, revmatickou a další formy imunitní artritidy, revmatickou horečku, Reiterův syndrom, psoriatickou artritidu, progresivní systematickou sklerózu, primární biliámí cirhózu, pemfigus, pemfigoid, nekrotizujíčí vaskulitidu, myastenii gravis, vícenásobnou sklerózu, lupus erythromatosus, polymyositís, sarcoidózu, granulomatosis, vasculitis, pemiciózní anémii, CNS zánětlivé onemocnění, onemocnění zprostředkované komplexem antigen-protilátka, autoimunitní hemolytickou anémii, Hashimotovu thyroditu, Gravesovu nemoc, habituální spontánní potrat, Reynardsův syndrom, glomerulonefritidu, dermatomyositidu, chronickou aktivní hepatitidu, celiakii, autoimunitní komplikace AIDS, atrofickou gastritidu, ankylozující spondylitidu a Addisonovu nemoc.

Způsob léčení je také užitečný při léčení nezhoubných nebo imunologických buněčných proliferativních odezev jako jsou např. psoriáza, pemphigus vulgaris, Behcetův syndrom, syndrom akutní respirační nouze (ARDS), ischemická srdeční choroba, arterioskleróza, postdialýzový syndrom, leukemie, získaný syndrom imunitní nedostatečnosti, septický šok a další typy akutních zánětů a tuková histiocytóza. V podstatě libovolná nemoc, která je etiologicky spojena s prozánětlivými procesy a celulární infiltrací způsobenou produkcí chemokinů (např. indukce exprese IL-8, ΜΙΡ-Ια nebo β) by mohla být považována za přístupnou léčení.

Způsob léčení podle tohoto vynálezu je také vhodný pro léčení mikrobiální infekce. Mnohé mykroby, jako třeba baktérie, rickettsie, různí parazité a viry se vážou na vaskulámí endothelium a leukocyty a indukují zánětlivou reakci, která vede k produkci např. interleukinů. CBP typ-2 použitý v tomto vynálezu tedy může být podáván pacientům za účelem prevence zánětů spojených s takovýmito infekcemi.

Podávané dávky CBP typ-2 podle tohoto vynálezu jsou takové, které jsou dostatečně vysoké k zajištění požadovaného efektu, kdy symptomy imunitní odezvy vykazují jistý stupeň potlačení. Dávka by neměla být tak velká, aby způsobila nepříznivé postranní efekty, jako např.

nechtěné zkřížené reakce, anafylaktické reakce a pod. Obecně se budou dávky lišit s věkem, kondicí, pohlavím a rozsahem nemoci u pacienta a mohou být určeny odborníkem v oboru. Dávka může být přizpůsobena lékařem v případě jakékoliv kontraindikace. Dávka se může pohybovat od 10 pg do 100 pg na dávku, v jedné nebo více dávkách denně, jeden nebo několik dní.

CBP typ-2 je podáván libovolným způsobem, včetně parenterálním, subkutánním, intrapulmonárním, intraarteriálním, intrarektálním, intramuskulámím a intranasálním podáváním. Parenterálni infuze zahrnují intramuskulámí, intravenózní, intraarteriální nebo intraperitoneální podávání. CBP typ-2 může být také podáván transdermálně, např. ve formě pomalu uvolňovaného subkutánního implantátu nebo orálně ve formě kapslí, prášků nebo granulí. CBP typ-2 může být také podáván inhalací. Například, je-li použit therapeutický pro léčení zánětlivých onemocnění plic, byl by preferovaným způsobem podávání pulmonámí aerosol.

Farmaceuticky akceptovatelný nosič preparátů pro parenterálni podávání zahrnuje sterilní nebo vodný nebo ne vodný roztok, suspenze a emulze. Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykól, polyethylenglykol, rostlinný olej jako např. olivový olej a injekto vatelné organické estery jako třeba ethyloleát.

Vodné nosiče zahrnují vodu, alkoholické/vodné roztoky, emulze nebo suspenze, včetně solného roztoku a pufrových médií. Parenterálni přenašeče zahrnují roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrózu, dextrózu a chlorid sodný nebo fixované oleje. Aktivní therapeutická složka se často míchá s excipientem, který je farmaceuticky přijatelný a kompatibilní s aktivní složkou. Vhodné excipienty zahrnují vodu, solný roztok, dextrózu, glycerol a ethanol nebo jejich kombinace. Intravenózní vehiculum zahrnuje fluidní a živný zásobní roztok, alektrolytické roztoky, jako třeba ty, které jsou založené na Ringerově dextróze a pod. Mohou být přítomny také preservativa a další přídavné látky jako třeba antimikrobiální látky, antioxidanty, chelatující činidla, inertní plyny a pod.

Vynález se také vztahuje ke způsobu přípravy léků nebo farmaceutických přípravků zahrnujících CBP typ-2 podle tohoto vynálezu, přičemž léky se používají pro terapii nežádoucí imunitní odezvy/zánětlivé reakce, kde imunitní odezva vede k produkci chemokinů, které se váží k CBP typ-2 podle tohoto vynálezu.

Vynález zajišťuje farmaceutické přípravky, zahrnujících nejméně jednu dávku therapeutický účinného množství protizánětlivého proteinu, majícího molekulární hmotnost • φ · · · * φ ·· ·» • · · φ · φ · · · φφ φ • « φ φ φ φ φ φ φ φ • φ φφφφ · · « φ φ φφφ φφφφφφ φ φ φφφ» φφ φφ φφφ φ» φ· přibližně 30-40 kD, v závislosti na rozsahu glykosylace, majícího aminokyselinovou sekvenční homologii s homologem interferonu-γ myxomy Tl.

Vynález poskytuje libovolný farmaceutický preparát a přípravek, obsahující CBP typ-2 podle tohoto vynálezu pro použití ve způsobu léčení podle tohoto vynálezu. Forma se bude lišit v závislosti na způsobu podávání. Například, přípravky pro injekci mohou být připraveny ve formě ampulí, z nichž každá obsahuje množství dávkové jednotky, nebo ve formě zásobníku, obsahujícího mnohočetné dávky.

GBP typ-2 může být formulován do therapeutických přípravků jako neutralizované farmaceuticky akceptovatelné soli. Ty zahrnují adiční soli kyselin, tvořené anorganickými kyselinami jako jsou např. chlorovodíková nebo fosforečná kyselina nebo organickými kyselinami jako jsou kyselina octová, šťavelová, vinná a pod. Soli také zahrnují takové formy anorganických bází jako jsou např. hydroxid sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý a organické báze jako jsou isopropylamin, triethylamin, histidin, prokain a pod.

5ízená dodávka může být provedena výběrem příslušných makromolekul, např. polyesterů, polyaminokyselin, polyvinylpyrrolidonu, ethylenvinylacetátu, methyleelulózy, karboxymethylcelulózy, protaminsulfátu nebo laktid/glykolid kopolymerů. Rychlost uvolňování GBP typ-2 může být kontrolována změnou koncentrace makromolekul.

Další způsob kontroly délky trvání zahrnuje zabudování GBP typ-2 do částic polymemí látky, jako jsou polyestery, polyaminokyseliny, hydrogely, polyaktid/glykolid kopolymery nebo ethylenvinylacetátové kopolymery. Alternativně je možné zachytit CBP typ-2 do mikrokapslí, připravených např. koaeervačními technikami nebo interfaciální polymerizací, třeba s využitím hydroxymethyleelulózy nebo želatinových mikrokapslí nebo poly(methylmethakrolátových) mikrokapslí, popřípadě vkoloidních systémech pro dodávku léků. Koloidní disperzní systémy zahrnují makromolekulární komplexy, nanokapsle, mikiokuličky, kuličky a systémy založené na lipidech zahrnujících emulze olej ve vodě, micely, směsné micely a lipozómy.

Následující příklady jsou zamýšleny jako ilustrace a nikoliv coby vyčerpávající výčet. I když jsou pro dané použití typické, odborníkům v oboru jsou zřejmá i další alternativní použití.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Kiysí model artheriosklerózy vyvolané poraněním ♦ · ·· « · · • · · · · ·

Krysám Sprague Dawley bylo pomocí balónové angioplastie indukováno poranění levé nebo pravé iliofemorální artérie. USCI angioplastický balónek (1,5 mm) byl zaveden retrográdně do artérie přes seříznutí a byla provedena arteriotomie pod celkovým pentobarbitalovým anestetikem (6,5 mg na 100 g hmotnosti pomocí intramuskulární injekce, Somnotrol, MTC Pharmaceuticals, Cambridge, Ontario), 500 pg CBP (6 krys) nebo solný roztok (6 krys) bylo podáno intraarteriální injekcí CBP nebo kontrolního roztoku do distálního lumenu angioplastického balónkového katětru směrem proti proudu od místa následného poškození vyvolaného balónkem. Balónek byl poté nafouknut na tlak 8 bar po dobu 1 min. Po angioplastii byl balónek vypuštěn a vyndán a bylo provedeno postranní uzavření místa arteriotomie pomocí lokální aplikace monomeru n-butylkyanoakrylátu (Nexaband, Veterinary Products Laboratories, Pboenix, Arizona). Každá krysa byla udržována na normální krysí stravě a byla sledována 4 týdny po operaci. Následně byly krysy zabity pomocí 2,0 ml eutlianylu na kg a aorta byla vyňata pro histologický výzkum.

Králičí model arteriosklerózy indukované poraněním

Osm bílých králíků z Nového Zélandu, krmených cholesterolem, bylo podrobeno balónkové angioplastii distální abdominální aorty. Všichni králíci byly krmení 2% cholesterolem v 10% arašídovém oleji po dobu 4 dnů/týden, počínaje 2 týdny před balónkovou angioplastii. Angioplastický balónkový katétr o velikosti 3-3,5 mm (1:1 poměr průměru balónku k průměru aortyjbyl zaveden přes femorální arteriální průřez po aplikaci anestetik (40 mg/kg ketalan, 8 mg/kg xylazen a 0,5 mg/kg acepromazin pomocí intramuskulární injekce). Balónek byl nafouknut na tlak 8 bar v distální abdominální aortě a posunut retrográdně do distální thoraktické aorty. Balónek je u každého králíka posunut a opět vrácen třikrát s využitím fluoroskopické kontroly, aby byla zajištěna endotheliální denudaee. Jsou zaznamenány kontrastní angiogramy před a po traumatu vyvolaném balónkovou angioplastii a dále po 4 týdnech. Ihned po získání femorálriího přístupu byl podán heparin (400 jednotek), aby se snížila katétrem vyvolaná trombosa.

Čištěný CBP typ-2, 500 pg na vzorek, je infuzován ihned po poranění vyvolaném balónkem do distální abdominální aorty čtyřech králíků. Zároveň je podána infuze solného roztoku lokálně do distální abdominální aorty čtyřech králíků. Každá infuzní dávka je podávána přes Wolinského katétr v celkovém objemu 10 ml ředěného sterilního 0,9% solného roztoku ihned po poranění vyvolaném balónkem. Všechny infuze jsou prováděny přes 3,25 mm veliký

4 9 9 9 9 » · 9 9 9 • 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 · 9 Λ «·· 999

9 9 9 9 9 9 · •«•4 99 9 9 999 99 9 9

Wolinského balónek (nafouknutý na konečný tlak 6+/-1 bar po dobu 2 minut) do abdominální aorty blízko kyčelního rozdvojení. Wolinského balónek je umístěn těsně nad kyčelní rozdvojení pomocí fluoroskopické kontroly takovým způsobem, že perfuzní balónek je rutinně lokalizován 0,5 až 2,5 cm nad rozdvojením a je určen jako primární infuzní místo. Druhé místo proti proudu je definováno v oblasti 2,5 cm proximálně ke kyčelnímu rozdvojení. Ve všech experimentech jsou infuze podávány Wolinského katétrem v celkovém objemu 10 ml ředěného sterilního 0,9% roztoku soli ihned po poranění způsobeném balónkem. Všechny infuze jsou podávány přes 3,25 mm Wolinského katétr (nafouknutý na konečný tlak 6+/-1 bar po dobu 2 minut) do abdominální aorty blízko kyčelního rozdvojení.

Histologická a morfometrická analýza

Histologická analýza je prováděna v primárním místě Wolinského infuze v distální abdominální aortě (králíci) nebo horních iliofemorálních arteriálních větvích (krysa) reprezentujících primární místi infuze definovaně původním umístěním perfuzního balónku. U králíků jsou odebírány kontrolní řezy ze směru po proudu z neinfuzovaného místa blízko kyčelního rozdvojení (0,5 cm nad rozdvojením až do 0,5 cm pod rozdvojením) a ze směru proti proudu z neinfuzovaného místa (horní abdominální aorta, 2,5 až 3,5 cm nad rozdvojením). Oblast od 1,5-2,5 cm nad kyčelním rozdvojením je vzhledem k umístění balónku, považována za hraniční zónu s potenciálně variabilní infuzní dávkou a není tedy zahrnuta do této analýzy. U kryse primární místo balónku u T-l testovaných i u krys se solným roztokem použito pro histologickou zkoušku. Barvení hematoxylinem a eosinem bylo u formalinových preparátů provedeno podle dřívějšího popisu. V krátkosti, každý vzorek byl fixován v 10% formalinovém pufru fosforečnanu sodného, zpracován, impregnován, napuštěn parafinem a krájen na 5 pm řezy pomocí mikrotomu. Řezy z každého vzorku (minimálně dva řezy z jednoho místa) byly poté barveny hematoxylinem a eosinem a zkoumány pomocí optické mikroskopie.

Příklad 2

Vázání cytokinů na nový virální protein

V krátkosti, množství lidských cytokinů bylo radioznačeno s I, vystaveno vylučovaným proteinům odebraným z kontrolních nebo z poxvirem infikovaných BGMK buněk, zesíťováno a analyzováno pomocí SDS-PAGE na nové cytokin/protein komplexy.

49

4 4 4 • 4 ·

4 9

4 9

9 4 · 9

9 4 4

4 4 9

449 449 ft «

Zkouška zesíťování jasně odhalila nový virálně-specifický protein, který se váže na každý z testovaných lidských chemokinů: IL-8 a ΜΙΡ-1β (Obrázek 2). Obrázek 2 (horní dva panely) ukazuje zkoušku změny gelové mobility s využitím iodovaných ligandů a kapaliny z tkáňové kultury. Kapaliny z tkáňových kultur (SUP) byly připraveny podle následujícího popisu: BGMK (Baby Green Monkey Kidney Cells) buňky byly ponechány bez zpracování (moek) nebo byly infikovány s Myxoma (ΜΎΧ), s T7-vymazaným mutantem myxomy (myx-T7), králičím poxem (RPV) nebo 35kD výmazem RPV při trojnásobně infekci (MOI). Vylučované proteiny byly připraveny trojnásobným pro mytím mono vrstev s PBS a opětným doplněním s médiem bez séra 4 h po infekci; tyto kapaliny byly poté sbírány 18 h po infikování (L). Mock kapaliny byly připraveny stejným způsobem ale bez přítomnosti viru. Kapaliny byly 15 krát koncentrovány s pomocí Amicon koncentrátorů. Lidské chemokiny IL-8 a MIP-1 β byly značeny se ¹²⁵I s využitím jodových kuliček (Pierce) podle návodu výrobce.

Zkouška na změnu gelové mobility byla provedena podle následujícího popisu: 5 pl iodovaného ligandu bylo smícháno s 10 pl SUP a směs byla ponechána stát 2 h při laboratorní teplotě. Poté byly přidány 2 μΐ chemického síťujícího činidla l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) (200 mM ve 100 mM fosforečnanu draselného, pH 7,5) během 15 minut a poté další 2 μΐ během 15 min. Reakce byla zastavena přídavkem 2 μΐ Tris-HCl (1,0 M, pH 7,5). Vzniklá směs je poté analyzována s využitím SDS-PAGE autoradiografie. Šipky naznačují posunuté komplexy. Spodní panel ukazuje gely barvené Coomassií, přičemž je vidět ztráta T7 proteinu v myx-T7 infekci a ztrátu 35kDa proteinu v RPV-35k infekci.

Příklad 3

Analýza účinnosti CBP typ-2 coby proteinu proti restenóze, jak je ukázáno na angioplastii balónkem vyvolaného poranění krysích femorálních arterií

Záněty jsou spojované s urychleným rozvojem arteriosklerotického plátu v arteriální stěně. Po použití balónkové angioplastie a dalších příbuzných angioplastických přístrojů, určených k otevírání uzavřených artérií, je značné riziko opakování plátu nebo restenózy. Urychlení růstu arteriosklerotického plátu bylo také popsáno za podmínek, vedoucích k arteriálnímu poranění, při virálních infekcích, vaskulitidě, homocystinurii, diabetes melitis, hypertensi, hyperlipideurii, kouření a poruchách vyvolaných imunitním komplexem. Větší DNA viry vyvinuly mechanismus, jako jsou protizánětlivé proteiny, který dovoluje virům proliferaci v hostiteli se sníženou inhibici hostitelských imunitních a zánětových obranných mechanismů.

• · · · · * fc · fc fcfc fcfc fcfcfc fc fcfc · fc · fcfc·· • · * fcfcfcfc·· • · · · fcfc fcfcfc fcfc fcfc

CBP typ-2 (T-l) byl testován jako potenciální terapeutické činidlo pro prevenci růstu plátu po angioplastii. Má se za to, že CBP typ-2 hraje roli homologu receptoru interferonu gama a inhibitoru chemokinu. CBP typ-2 byl testován na zvířecích modelech arteriosklerózy vyvolané poraněním a výsledky ukázaly významné snížení vzniku plátu 4 týdny po infuzi. 35KDa protein, CBP typ-2 izolovaný z viru Vakcínie, významně snížil intimální hyperplasii (růst arteriosklerotického plátu) po zranění, způsobeném balónkovou angioplastii po jediné intravenózní injekci (Tabulka 1). To ukazuje, že CBP typ-2 může být použit jako protizánětlivé činidlo pro léčení nebo prevenci poruch imunity.

U 10 krys Sprague Dawley bylo balónkovou angioplastii pod úplnou anestezií vyvoláno poranění pravé iliofemorální artérie. Angioplastický balónek (1,5 mm) byl zaveden přes femorální arteriální výřez a distální špička balónku byla zavedena do kyčelního rozdvojení. Těsně před nafouknutím balónku bylo do artérie injektováno buď 1,0 ml solného roztoku (5 krys) nebo zvyšující se množství čištěné vakcínie 35K proteinu, po 50 pg (5 krys). Angioplastický balónek byl poté nafouknut na 6-8 atm po dobu 2 min, vypuštěn a vyjmut. Femorální artérie byla zacelena nexabandem v bodě propíchnutí po vyjmutí katétru. Krysy byly ponechány zotavit se a byly sledovány po dobu 4 týdnů. Po 4 týdnech byly krysy zabity a byly vyjmuty artérie pro histologický výzkum. Intimální oblast byla měřena morfometrickou analýzou. Významné snížení intimální hyperplasmie (plocha plátu) bylo pozorováno po infuzi 35KDa proteinu ve srovnání s infuzi kontrolního vzorku solného roztoku (p <0,0089) (Tabulka 1).

Tabulka 1

Dávka 35KDa	2 střední plocha platu mm	S.E.	p hodnota (t test)
0	0,055	0,012	NS
50 pg	0,014	0,011	0,0089

Příklad 4

CBP-Π inhibuj e vázání chemokinu k celulárním receptorům lidských monocytů

Inhibice vázání lidského MIP-lcc k povrchovému receptoru v primárních lidských monocytech a THP-1 buňkách pomocí 35KDa proteinu z vakcínie (kmen Lister) (Tabulka 2) a M-Tl (Tabulka 3) byla demonstrována podle následujícího protokolu. (Poznámka: experiment 3 v Tabulce 1 a 2 byl s využitím THP-1 buněk, všechny ostatní výsledky byly získány z primárních monocytů.

·0 ·· ·

0 0 0

000 »00

0

0« 00 • * ·0 ♦ 0 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 « 0 0 0 0 • 0 0 0 ·

0000 00 00 ·

Byl získán radioznačený ¹²⁵I ΜΙΡ-Ια (25pCi/ml) a příslušené množství radioznačeného (horký) ΜΙΡ-Ια bylo přidáno do každé zkumavky, obsahující 50000 cpm. Pro kontrolu bylo přidáno 400 ng neznačeného (studený) ΜΙΡ-Ια společně s horkým MIP-loc, aby bylo demonstrováno vázání pozadí. K měření inhibičních vlastností 35KDa M-Tl (CBP-2) a M-T7 (CBP-1) byly různé dávky inhibitoru přidány k radioznačenému ligandu a vzorky byly inkubovány při 37°C (5% CO2) po dobu 30 min. Primární monocyty izolované z lidské krve a separované na Percoll gradientu byly naředěny v RPMl 1640, obsahujícím 1% BSA na koncentraci lxlO⁷ buněk/mla 200 μΐ těchto buněk bylo přidáno do každé reakce. Podobné koncentrace byly použity pro THP-1 buňky (monocytická buněčná linie). Zkumavky byly 1 h rotovány, načež byly buňky odstředěny při 13000 otáěkách/min po dobu 5 min. Kapaliny byly odstraněny a buňky byly promyty s 800 ml 10% roztoku sacharózy. Buňky byly opět odstředěny při 13000 otáček/min po dobu 10 min a kapalina byla odstraněna. Radioaktivita zbytku pak byla měřena pomocí gamma počítače. Stejně jako druhý kontrolní soubor, vázací vlastnosti H -ÍMLP k jejich eelulárnímu byly také testovány v přítomnosti inhibitorů (Tabulka 4). Výše uvedený protokol byl dodržen s tou výjimkou, že do každé zkumavky bylo distribuován jednotný objem 1 μΐ, což vedlo k počtům přibližně 180 000 cpm na zkumavku. Je třeba si povšimnout, že jak 35KDa tak i M-Tl oba kvantitativně blokuji vázání chemokinů k celulámím receptorům MIPlct.

Tabulka 2

Povrchově vázaný MIP-loc
Exp.	Molární přebytek 35 KDa proteinu	Přebytek neznačeného ΜΙΡ-Ια	Značený MIP-lcc
	1600	800	400	200	50	40	4	2	6500X
1	80	77	107	144	1280	-.	-		470	4705
2	-	-	-	88	-	2342	10688	9113	410	7708
3	55	-	-	-	-	-	-	-	1038	9944

Poznámka: V experimentu 3 byly použity THP-1 buňky; V experimentech 1 a 2 byly použity primární monocyty.

··· ···

Tabulka 3

Povrchově vázaný ΜΙΡ-Ια
Exp.	200x molární přebytek M-Tl	200x molární přebytek M-T7	6500x molární přebytek neznačeného MIP- Ια	Značený ΜΙΡ-Ια
1	978	10171	444	12206

Tabulka 4

Povrchově vázaný fMLP
Exp.	Značený fMLP	lxlO6 M značeného fMLP	35 KDa (400ng)
1	374	132	507

Ačkoliv vynález byl popsán s odkazy na preferovaná provedení, mělo by být zřejmé, že jsou možné různé modifikace bez toho, aniž bychom překročili rozsah vynálezu. Vynález je tedy omezen pouze níže uvedenými nároky.

Průmyslová využitelnost

Tento vynález představuje nový zdroj antiimunních proteinů, které mají schopnost léčit široké spektrum imunopatologických poruch, což by mohlo být využito při výrobě nových léčiv pro léčení nemocí spojených s nesprávnou funkcí imunitního systému.

Claims (12)

1. Použití chemokinů třídy alfa nebo třídy beta pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení imunopathologických onemocnění vyvolaných chemokiny kde uvedené léčení zahrnuje podávání subjektu terapeuticky účinného množství uvedeného prostředku.

2. Použití podle nároku 1, kde chemokin má sekvenci aminokyselin popsanou v SEQ ID NO: 2.

3. Použití podle nároku 1, kde chemokin je vybrán ze skupiny obsahující CTAP-III, gro/MGSA, ENA-78, MCP-1, mterleukin-8, RANTES, MIP-1 a, MlP-lb, PF-4, IP-10 a NAP-2.

4. Použití podle nároku 1, kde imunopathologické onemocnění je vybráno ze skupiny obsahující mikrobiální infekci, zhoubné bujení a metastáze, astma, koronární restenózu, autoimunní nemoci, cirhózu, endotoxemii, arteriosklerózu, reperfúzní poranění a zánětlivé odezvy.

5. Použití podle nároku 1, kde uvedené léčení dále zahrnuje podávání subjektu antibiotika nebo antivirotika.

6. Použití podle nároku 1, kde podávání uvedeného chemokinu je v dávkách od 10 pg do 100 mg na jedno podání.

9 9 9 • · • ··· · β · ···· · 999 999 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 99 9 99 99

- 19

7. Použití podle nároku 1, kde prostředky podávání uvedeného prostředku jsou vybrány ze skupiny zahrnující subkutánní, intravenózní, intraarteriální, intramuskulární, intrarektální a transdermální podávání.

8. Farmaceutický přípravek, vyznačující se t í m, že obsahuje nejméně jednu dávku imunoterapeuticky účinného množství protizánětlivého proteinu, majícího sekvenci aminokyselin popsanou v SEQ ID NO:2, ve farmaceuticky akceptovatelném nosiči.

9. Farmaceutický přípravek podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m, že protizánětlivý protein je chemokin vázající protein typu 2.

10. Farmaceutický přípravek podle nároku 8, v y z n a č u j í c í se tím, že chemokin je třídy a nebo třídy b.

11. Farmaceutický přípravek podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se tím, že chemokin je vybrán ze skupiny obsahující CTAP-III, gro/MGSA, ENA-78, MCP-1, interleukin-8, RANTES, MIP-1a, ΜΙΡ-lb, PF-4, IP-10 a NAP-2.

12. Způsob identifikace chemokinu, vyznačující se t í m, že zahrnuje kontaktování chemokin vázajícího proteinu, majícího molekulární hmotnost přibližně 30 až 40 kD a aminokyselinovou homologii s SFV-T1 skupinou proteinů, s přípravkem podezřelým z výskytu chemokinu a detekci vázání chemokinového přípravku na protein vázající chemokin.