KR0177519B1

KR0177519B1 - 세포간 점착분자 및 그의 결합리간드의 천식치료에의 이용

Info

Publication number: KR0177519B1
Application number: KR1019910701072A
Authority: KR
Inventors: 디. 웨그너 크레이그; 에이취. 군델 로버트; 로스레인 로버트
Original assignee: 데이비드 이. 프랭크 하우저; 베링거 인겔하임 파머수티칼 인코오포레이티드
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 1999-03-20
Also published as: HUT65843A; CA2047721C; KR920700667A; DE69000248T2; HU216313B; GR3006073T3; ATE79270T1; DK0387701T3; AU638450B2; EP0387701B1; HU902883D0; DE69000248D1; NZ232868A; JP3119483B2; ES2035668T3; CA2047721A1; AU5349990A; JPH04504127A; EP0387701A1; WO1990010453A1

Abstract

본 발명은 세포간 점착 분자(ICAM-1), 그의 기능성 유도체 및 그것들에 결합하는 분자들의 천식치료에의 이용에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

세포간 점착분자 및 그의 결합리간드의 천식치료에의 이용

[발명의 분야]

본 발명은 ICAM-1 과 같은 세포간 점착분자의 천식의 치료에의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 세포간 점착분자에 결합할 수 있는 리간드분자에 관련되며, 천식의 치료에 치료학적 효능을 갖는 약제를 검출하는 분석법(assay)에 관련된다.

[관련기술의 설명]

A. 세포점착

백혈구는 세균 또는 바이러스와 같은 외부침입자에 대해 숙주를 적절히 방어하기 위해서 세포기질에 부착할 수 있어야 한다. 방어시스템의 우수한 문헌은 에이센(Eisen, H.W., In: Microbiology, 3rd Ed., Harper Row, Philadelphia, PA(1980), pp. 290-295 및 381-418) 에 의해 제공된다. 백혈구는 그것들이 순환으로부터 진행하는 염증 부위로 이동할 수 있도록 내피세포에 부착할 수 있어야 한다. 더욱기, 그것들은 정상의 특이적 면역반응이 일어날 수 있도록 항원제공세포에 부착해야하며, 최종적으로 그것들은 바이러스 감염되거나 종양인 세포의 용해가 일어날 수 있도록 적당한 표적세포에 부착해야 한다.

이러한 부착을 중재하는데 수반된 백혈구 표면 분자들이 히브리도마 기술을 사용하여 확인되었다. 간단히, 백혈구표면에 결합되고 상기한 부착 관련기능을 억제시킨 사람 T세포(Davignon, D. et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 78 : 4535-4539(1981))와 마우스 비장세포(Springer, T. et al. Eur. J. Immunol. 9: 301-306(1979))에 대한 모노클로날항체(MAbs')가 확인되었다 ( Springer, T. et al. Fed. Proc. 44 : 2660-2663(1985)). 이들 항체에 의해 확인된 분자들은 Mac-1 및 임파구 기능관련항원-1(LFA-1)이라 불렀다. Mac-1 은 대식세포, 과립세포 및 큰 과립임파구에서 발견된다.

LFA-1 은 대부분의 임파구에서 발견된다(Springer, T.A.,et al. Immunol. Rev. 68 : 111-135(1982)).

이들 두분자 더하기 제3 의 분자, p150,95(이것은 Mac-1과 유사한 조직분포를 갖는다) 는 세포점착에 있어서 역할을 한다(Keizer, G. et al. Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)). LFA-1 족과 같은 분자는 세포 점착의 과정에 수반되는데 점착분자 라 부른다.

상기한 백혈구 분자들은 구조적으로 서로 유사하며 관련 당단백질족의 멤버(member)를 구성하는 것으로 발견되었다(Sanchez-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983). seizer, G.D. et al., Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)). 이 당단백질족은 하나의 알파 서브유니트와 하나의 베타 서브유니트를 갖는 헤테로 이량체로 구성된다. 각각의 항원의 알파 서브유니트가 서로 다를지라도 베타 서브유니트는 크게 보존되는 것으로 발견되었다.(Sanchez-Madrld, F. et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983)). 당단백질족(CDl8 족 이라함) 의 베타 서브유니트는 95 kd의 분자량을 갖는 것으로 발견된 반면에 알파 서브유니트는 150kd 에서 180 kd 로 다양한 것으로 발견되었다(Springer, T. Fed. Proc. 44: 2660-2663(1985)).

막단백질의 알파 서브유니트는 베타 서브유니트에 의해 공유된 광범위한 상동성을 공유하지 않으나, 당단백질의 알파 서브유니트의 정밀분석은 그것들간에 실질적인 유사성이 있는 것으로 나타났다. LFA-1 관련 당단백질의 알파와 베타 서브유니트간의 유사성에 관한 문헌은 산체즈 마드리즈(Sanchez-Madrid, F. et al.,(J. Exper. Med. 158: 586-602 (1983): J. Exper. Med. 158: 1785-1803(1983)) 에 의해 제공된다.

백혈구세포 표면에 대한 이 점착단백질족의 어떤 멤버의 정상량을 발현할 수 없는 개체군이 확인되었다(Anderson, D.C., et al. Fed. Proc. 44: 2671-2677(1985): Anderson, D.C., et al. J.Infect. Dis. 152: 668-689 (1985)). 그 상태는 백혈구점착결핍 또는 LAD 증상으로 공지되어 있다. 이들 환자로부터의 백혈구는 CDl8 족의 분자가 항체에 의해 길항작용된 정상의 대응자와 유사한 시험관내에서의 결함을 나타내었다.

더욱이, 이들 개체는 그들 세포의 세포기질에 부착할 수 없음으로 인해 정상의 면역반응을 개시할수 없다(Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44: 2671-2677(1985); Anderson, D.C., et al. J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985)). LAD 개체들은 현저한 혈액 백혈구 증가 중에도 불구하고, 임상적으로 지연된 탯줄분리, 재발성 및 진행성인 연조직 감염, 및 손상된 고름형성을 나타낸다. LAD 개체의 연구는 CDl8 족의 기능성 점착분자의 결핍으로 인해 임파구가 정상적 방식으로 점착할 수 없을 때 면역 반응이 완화되는 것으로 나타났다.

따라서, 요약하면, 동물의 건강과 생존능력을 유지하는 백혈구, 특히 임파구의 능력은 그것들이 다른 세포(내피세포같은것)에 점착할 수 있을 것을 요한다. 이 점착은 임파구의 세포표면에 존재하는 특이적 수용체 분자를 수반하는 세포-세포 접촉을 요하는 것으로 발견되었다. 이 수용체는 임파구를 다른 임파구 또는 내피 세포, 그리고 다른 비 혈관 세포에 점착할 수 있게 한다. 세포표면 수용체 분자는 서로 크게 관련됨이 발견되었다. 임파구가 이들 세포표면 수용체 분자를 결핍하는 사람은 결함있는 항체반응, 만성 및 재발성의 감염, 또한 기타 임상적 증상을 나타낸다.

B 천식: 임상적특성

천식은 이종의 질환 족이다. 그것은 자극에 대한 기관기관지(tracheobronchi)의 과감응성(hyper-responsiveness)으로 특징지어진다(McFadden, E.R. et al., In: Harrison's Principles of Internal Medicine, 10th Ed., Petersdorf, R.G. et al., Eds., McGraw-Hill, NY (1983), 1512-1519 페이지; Kay, A.B., Allergy and Inflammation, Academic Press, NY (1987); 이들 문헌은 여기에 참고로 포함된다). 임상적으로, 천식은 기관기관지의 광범위한 협착, 진하고 끈끈한 분비물, 호흡곤란, 기침 및 헐떡임의 발작에 의해 명백해진다. 각각의 이들 상태의 상대적 기여도는 미지이나, 순수 결과는 기도 저항성의 증가, 폐 및 흉곽의 과팽창, 통풍 및 폐혈류의 이상분포이다. 이 질환은 증상없는 기간들 사이에 띄엄 띄엄 나타나는 급성증상의 증상발현의(episodic)기간에서 명백해진다. 급성의 증상발현은 저산소증을 가져오고 치명적이 될 수 있다. 대략 3% 의 일반 세계인구가 이 질환을 겪고 있다.

두가지 유형의 천식 즉 알레르기천식 및 특이체질 천식이 기술되었다. 알레르기 천식은 보통 코카타르, 두드러기, 습진 등과 같은 유전성 알레르기 질환과 관련된다. 그 상태는 공수(airborne)항원(꽃가루, 환경상 또는 직업상 오염물질 등과 같은 것)의 피부내 주사에 대한 양성의 월 앤드 플레어(wheal-and-flare) 반응과 IgE의 증가된 혈청수준으로 특징지어진다. 알레르기천식의 발생은 많은 환자들에서 IgE 항체의 존재에 원인적으로 관련되는 것으로 나타난다. 상기한 특성을 나타내지 않는 천식환자는 특이체질 천식을 갖는 것으로 생각된다.

알레르기천식은 T 및 B 임파구에 의해 조절되고 공수 항원의 마스트 세포에 결합된 사전형성된 IgE 분자와의 상호 작용에 의해 활성화된 IgE 반응에 의존하는 것으로 생각된다. 항원의 만남(encounter)은 개체를 민감하게 하기 위하여 연장된 기간동안 IgE 생성을 가져오기에 충분한 농도에서 일어났음에 틀림이 없다. 일단 민감하게 되면 천식환자는 대단히 낮은 수준의 항원에 반응하여 증상을 나타낼 수도 있다.

천식증상은 야기하는 항원, 환경적요인, 직업상요인, 신체적 노력 , 및 정서적긴장의 존재 및 정도에 의해 악화될 수도 있다.

천식은 메틸크산틴(테오필린 같은 것), 베타- 아드레날린 작용제(카테콜아민, 레조르시놀, 살리제닌, 및 에페드린 같은 것), 글루코코르티코이드(히드로코르 티손 같은 것), 마스트 세포 과립제거의 저해제(즉 크로몰린나트륨 같은 크로몬) 및 안티콜린작용제(아트로핀 같은 것)로 처치할 수 있다.

C. 천식: 면역학적 특성

천식은 폐의 조직에 호산성구(eosinophils)의 유입(호산구증가증)을 수반하는 것으로 생각된다(Frigas, E. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 77: 527-537 (1986), 이 문헌은 여기에 참고로 포함된다).

호산성구는 MBP 라 불리운 알기닌이 풍부한 강한 염기성 단백질을 함유한다(Gleich, G.J. et al., J. Exper. Med. 137: 1459(1973)). MBP 는 호산성구의 과립단백질의 50% 이상을 구성한다.

MBP 는 정상의 포유동물 세포에 독성이며, 천식환자의 폐조직과 같은 호산성구를 입증하는 조직에서 독성수준에서 발현되는 것으로 발견되었다(Gleich, G.J et al, J. Immunol. 123: 2925(1975)). MBP 발현과 천식간의 연결은 천식환자의 가래에서 발견된 MBP 수준이 정상의 개체와 비교하여 높았다는 발견에 의해 강조되었다(Frigas, E. et al., Mayo Clin. Proc. 56: 345(1981)). MBP 의 발견이래, 다른 세포독성 호산성구 단백질이 확인되었다(Frigas, E, et al. J. Allergy Clin. Immunol. 77: 527-537(1986)).

상기한 연구로부터, 기관지폐포 세척연구로부터(Godard, P. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 70: 88(1982)), 그리고 상피세포를 잃은 호흡기 평활근의 연구로부터(Flavahan, N.A. et al., J. Appl. Physiol. 58: 834 (1985); Barnes, P.J. et al., Br. J. Pharmacol. 86: 685 (1985)) 천식의 면역학적 기초를 간파하였다. 이들 연구는 천식의 면역학의 기초가 되는 메카니즘의 해명을 가져오지는 못했으나 질환의 면역학적 병원학에 관한 일반적으로 허용되는 가설의 전개를 가져왔다(Frigas, E, et al. J. Allergy Clin. Immunol. 77: 527-537 (1986)참조).

천식의 병리학의 증명은 호산성구에 의한 폐 선세포조직(parenchyma)의 대량침윤과 점액성 섬모용량의 파괴이다. 호산성구 가설 은 폐의 마스트 세포에 의해 방출되는 해로운 중재자를 중화하기 위해 호산성구가 기관지에 끌린다는 것을 제안한다. 가설에 따르면 호산성구는 그들이 과립제거되어 MBP와 다른 세포 독성분자를 방출하는 기관지로 끌린다. 과립제거시, 호산성구는 마스트세포의 해로운 중재자를 효소학적으로 중화하는 히스타미나제, 아릴술파타제 및 포스포리파제 D와 같은 효소를 방출한다. 이들 분자는 또한 점액성 섬모 장치의 파괴를 촉진하며 따라서 기관지 분비의 제거를 방지하며 천식의 특징인 폐손상에 기여한다.

따라서, 천식은 항원 존재의 1차 효과에 이상 반응하여 기관지를 침입하는 호산성구가 원인이 되는 것으로 생각된다. 호산성구의 MBP는 기관지의 내피세포를 손상시킨다. 류코트리엔과 혈소판 활성인자(PAF) 는 호산성구에 의해 생성되며 기관지 비대증을 가져온다. 호산성구에 의해 방출된 분자(MBP 같은 것) 는 또한 마스트 세포를 활성화하여 류코트리엔파 히스타민을 방출할 수 있으며, 이로써 경련성 기관지 천식과 증가된 호산구증가증을 둘다 일으킨다.

천식의 임상적 중요성의 견지에서 천식환자의 치료를 위한 새로운 또는 개선된 요법을 확인하는 것이 크게 바람직하다.

본 발명을 요약하면 다음과 같다.

본 발명은 ICAM-1 과 같은 세포간점착분자('ICAMS) 와 이러한 ICAMs 의 기능성 유도체의 천식치료에의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포간 점착분자(또는 ICAM 분자의 유도체) 에 결합할 수 있는 분자들(항체, 또는 항체단편, 또는 수용체 분자) 의 천식치료에의 이용에 관련된다. 본 발명은 또한 천식의 치료에 치료학적 효능을 갖는 약제를 검출하는 분석법을 포함한다.

본 발명은 추가로 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 약제 치료학적 유효량을 환자에게 제공하는 것으로 이루어지는 환자에서 천식을 치료하는 방법에 속한다:

(a) ICAM-1 에 결합할 수 있는 항체;

(b) 항체 (a)의 단편, 이 단편은 ICAM-1 에 결합할 수 있다;

(c) 천연오염물질이 실질적으로 없는 ICAM-1;

(d) ICAM-1 의 기능성 유도체;

(e) 당단백질의 CD 18 족의 멤버에 결합할 수 있는 항체;

(f) 항체(e) 의 단편, 이 단편은 당단백질의 CDl8 족의 멤버에 결합할 수 있다;

(g) 천연오염물질이 실질적으로 없는 당단백질의 CDl8 족의 멤버; 그리고 (h) 당단백질의 CD 18 족의 멤버의 기능성 유도체.

본 발명은 또한 항원의 수회 흡입을 받은 사람 아닌 포유동물(특히 영장류)에 약제를 투여한 다음 기도 감응성에 있어서 모든 증가를 측정하는 것으로 이루어지는 천식의 치료에 치료학적 효능을 가질 수 있는 약제를 확인하는 방법을 제공한다.

바람직한 구체예를 기술하면 다음과 같다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 ICAM-1 cDNA 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 제1 ATG는 58 위치에 있다. ICAM-1 트립신 펩티드에 해당하는 번역된 서열이 밑줄쳐 있다.

추정상의 소수성 시그널 펩티드 및 막을 통과하는 서열에는 굵은 밑줄을 쳤다. N-연결된 글리코실화 부위는 네모를 쳤고 2976위치에서 폴리아데닐화신호 AATAAA 는 윗선을 쳤다. 도시된 서열은 HL-60 cDNA 클론에 대한 것이다. 내피세포 cDNA 는 그의 길이 대부분에 걸쳐서 열화되어 있고 단지 근소한 차이를 나타내었다.

제2도는 ICAM-1 의 도메인 구조를 나타낸다.

제3도는 자극없이 단백질 피복된 편평한 바닥조직 배양판 웰, PAF(10^-7M)자극과 함께 단백질 피복된 편평한 바닥조직 배양판웰, 면역복합체(IC)피복되고 자극된 편평한 바닥조직 배양판 웰, 그리고 피복되지 않고 자극도 없는 편평한 바닥조직 배양판웰에의 호산성(eosinophil)점착을 나타낸다.

점착된 세포는 평균 EPO 유니트 ± S.D. 로서 호산성 퍼옥시다제(EPO) 에 대한 비색분석법에 의해 정량하였다.

제4도는 면역복합체(IC)로 피복된 편평한 바닥조직 배양판 웰에의 호산성 점착에 대한 각종 모노클로날 항체(MAbs)(상징액 1:4 희석) 의 효과를 나타낸다. 점착된 세포는 호산성 퍼옥시다제(평균 EPO 유니트 ± S.D.)에 대한 비색분석법에 의해 정량하였다. 통계학적으로 중요한 점착 저하는 별표로 표시하였다.

제5도는 LPS(10ng/mℓ)-자극되고 글루타르알데히드 고정된 내피 세포층에의 PAF(10^-7M)유발된 호산성 점착에 대한 각종 모노클로날 항체(MAbs)(상징액 1:4 희석)의 효과를 나타낸다. 점착된 세포는 호산성 퍼옥시다제(EPO 유니트 ± S.D.)에 대한 비색분석법에 의해 정량하였다. 통계학적으로 중요한 점착저하는 별표로 표시하였다.

제6도는 (a)지질다당류(LPS,10ng/mℓ)- 자극된 사람 배꼽정맥 내피세포층에의 혈소판 활성인자(PAF,10^-7M) 유발된 호산성점착과, (b) 회충(Ascaris) 추출물 (자극없음) 또는 면역복합체(IC 자극)로 피복된 편평한 바닥조직배양판웰에의 호산성 점착에 대한 항-ICAM-1(RR1/1), 항-LFA-1베타(R 15.7)및 항-HLA 클라스1(W6/32) 모노클로날 항체(상징액 1:4 희석)의 효과를 나타낸다. 통계학적으로 중요한 점착 저하는 별표로 표시하였다.

제7도는 (a)기공 호산성 침윤과 (b)회충민감성 협비원류(cynomegalus) 원숭이(Macaca fascicularis) 내의 회충의 3회의 격일 흡입에 의해 유발된 기도감응성의 증가(메타콜린 Pc₁₀₀의 감소) 에 대한 항-ICAM-1 모노클로날 항체 R6.5 의 효과를 나타낸다. R6.5 처리로한 연구를 각 동물에 대해 수행한 괄호로 묶은 대조군 연구와 비교했다.

제8도는 (a) 흡입된 메타콜린 Pc₁₀₀, (b) 기관지 폐포세척(BAL) 호산성구, (c) BAL 호중성구, (d) BAL 대식세포/ 단구, 및 (I) BAL 임파구에서 항원의 1회 흡입에 의해 유발된 변화를 나타낸다. Xsq = 크루스칼-왈리스시험(Kruskal-Wallis Test)(카이-스퀘어 근사), NSD = 중요한 차이 없음. 각 글자는 개개의 원숭이를 나타낸다.

제9도는 (a) 흡입된 메타콜린 Pc₁₀₀과 (b) 기관지 폐포세척(BAL) 호산성구, 에서 항원의 수회흡입에 의해 유발된 변화를 나타낸다. Xsq = 크루스칼-왈리스시험(카이-스퀘어 근사). 각 글자는 개개의 원숭이를 나타낸다.

[바람직한 구체예의 설명]

A. 천식의 면역병리학

상기 지적한 바와 같이 가장 중요하고 특징적인 천식의 특성 중 하나는 흡입된 약제(물리적, 화학적 및 생리학적) 에 대한 기관지의 극도의(정상의 10 내지 1000배) 민감성이다(Boushey, H.A. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 121 : 389(1980); Hargreave, F.E. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 68: 347 (1981)).

이 기도 과감응성 의 위중도(흡입된 히스타민, 메타콜린, 찬공기에 또는 운동에 대한 기도의 감응성을 결정함으로써 임상적으로 측정됨) 는 천식증상의 강도(Hargreave, F.E. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 68:347(1981); Boulet, L-P et al.. J. Allergy Clin. Immunol. 71:399(1983); Chan-Yeung, M. et al.. Am. J. Med. 72:411(1982)), 최고유동속도에 있어서 매일의 변동(Ryan G. et al., Thorax 37: 423(1982)) 및 요구되는 요법(Hargreave, F. E. et at., J. Allergy Clin. Immunol. 68 : 347 (1981); Juniper, E.F. et al., Thorax 36: 575 (1981)) 과 상관된다. 천식환자에게서 기도 과감응성은 수년에 걸쳐 안정하게 머무를 수 있으나(Juniper, E.F. et al., Thorax 37: 288-291 (1982)), 감응성은 알레르겐(Boulet L,-P. et al., J. Allergy. Clin. Immunol. 71:399-406(1983), Cartier A. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 70:170-177(1982), Cockcroft D.W. et al., Clinical Allergy 7:503-513(1977), Gundel R.H. et al., Amer. Rev. Respir Dis. (1989), Lanes S. et al, J. Appl. Physiol 61:864-871(1986), Marsh W.R. et al., Amer. Rev Respir. Dis. 131:875-879(1985), Sotomayor H. et al., Amer. Rev. Repair.Dis. 130:56-58(1984)), 공기 공해물질(Golden J.A. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 118.: 287-294(1978)).

바이러스감염(Empey D.W. et al.. Amer. Rev. Respir. Dis. 113: 131-139(1976)) 및 어떠한 직업상의 화학약품(Chan-Yeung M. et al., Amer. J. Med. 72: 411-415(1982), Durham S.R. et al., J. AlIergy Clin. Immunol. 79: 398-406(1987), Lam S. et at., J. A11ergy Clin. Immunol. 72 : 134-139(1983), Lam S, et al., J. Allergy Clin. Immunol. 63: 28-34 (1979)) 에 노출에 의해 증가되는 것으로 나타났다. 사실상, 기도 과감응성이 천식에 걸리게 하는 요인이라기 보다 천식의 결과라고 제안하는 증거가 있다(Boules L.-P. et al., J. Allergy. Clin. Immunol. 71:399-406(1983), Chan-Yeung M. et al., Amer J. Med. 72:411-415(1982), Gundel R.H. et al., Amer. Rev. Respir. Dis.. (1989), Marsh W.R. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 131:875-879(1985), Empey D.W. et al., Amer Rev. Respir. Dis. 113.131-139(1976)), Lam S. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 63:28-34(1979)).

기도 과감응성의 병인론의 기초가 되는 메카니즘은 알려져 있지 않으나, 상기한 바와 같이 많은 연구로부터의 결과는 호산성구 침윤과 기관지상피 세포의 박리가 수반됨을 제안한다(DeMonchy, J.G.R. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 131:373(1985); Laitinen, L.A. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 137:62(1988)). 호산성 중재자는 시험관내에서 기도 상피세포를 손상시키는 것으로 나타났기 때문에 이들 두 사건은 연결될지도 모른다(Frigas, E. et al., J. Allergy Clin. Immunol.77:527(1986)).

B. 천식과 세포간 점착

본 발명은 부분적으로 천식의 치료에서 치료학적 효능을 갖는 약제를 확인할 수 있는 분석법의 개발로부터 유도된다.

여기서 사용한 바와 같이, 천식 은 알레르기 또는 특이체질 천식을 말한다. 약제는 천식증상의 위중도, 크기 또는 지속기간을 감축(즉 저하) 시킨다면 천식의 치료에 치료학적 효능을 갖는다고 한다. 이러한 약제는 바람직하게는 다음의 천식 모델시스템 의 사용을 통해 확인된다. 여기서 사용한 바와 같이, 약제는 환자에 투여했을때 약제가 천식증상의 위중도, 크기 또는 지속기간을 감소시킬 수 있다면 천식을 치료할 수 있다고 한다.

본 발명의 한 관점은 폐로 호산성구의 이동이 세포간 점착에 의존한다는 것과 구체적으로 이러한 점착이 ICAM-1'(세포간 점착분자-1) 상호작용에 의존한다는 발견으로부터 유도된다.

여기서 사용한 바와 같이, 분자는 당단백질의 CD18 족의 멤버이며 그것은 당 단백질의 CD18 족의 멤버의 알파 서브유니트(즉 CD11 서브유니트), 당단백질의 CD18 족의 멤버의 베타 서브유니트(즉 CD18 베타 서브유니트), 또는 당단백질의 CD18 족의 멤버의 알파 서브유니트와 베타 서브유니트 둘 다를 함유한다. 따라서, 여기서 사용된 바와 같이 당단백질의 CD18 족의 멤버는 헤테로이량체(즉 CD18 족의 멤버의 알파와 베타 서브유니트를 둘 다 갖는 분자) 뿐만 아니라 CD18 멤버의 단지 하나의 서브유니트를 갖는 분자를 포함한다. 모든 이러한 분자들은 막 또는 고형지지물에 결합되거나 비결합(즉 용해성)일수도 있다.

ICAM-1은 당단백질 수용체 분자의 CD1 족에 대한 천연리간드이다(Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137: 1270 (1986); Marlin, S.D. et al.,Cell 51:813(1987)). ICAM-1은 76-97kd 당단백질이다. ICAM-1은 헤테로이량체가 아니다. ICAM-1의 확인, 특성화, 및 아미노산 서열, 그리고 ICAM-1 및 다른 점착분자들과 반응성인 항체의 생성이 유럽 특허출원 일련번호 289,949(이 문헌은 여기에 참고로 포함된다) 과 로드레인(Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137:1270-1274(1986)), 스미스(Smith, C.W. et al.), 백혈구 정착에 수반된 분자의 구조와 기능, (A.S. Rosenthal, et al., 편집 (Springer-Verlag, New York, 1989); 스미스(Smith, C.W. et al.), J. Clin. Invest. 82: 1746 (1988) 그리고 바르톤(Barton, R.W. et al.), J. Immunol. 143, (1989)(이들 문헌은 여기에 참고로 포함된다) 에 개시되어 있다.

간단히, ICAM-1은 혈관 내피세포, 흉선 상피세포, 어떤 다른 상피세포 및 섬유 아세포와 같은 비조혈 세포상에와 조직 대식세포, 미토겐자극된 T임파구 아세포, 그리고 편도선, 임파절 및 페이어판(Peyer's patches) 내의 배 중심(germinal centered)B세포와 수상세포와 같은 조혈세포상에서 발현된 세포표면 당단백질이다. ICAM-1은 반응성 과형성을 나타내는 임파절 및 편도선에서의 T세포 영역의 혈관 내피세포상에서 크게 발현된다. ICAM-1은 말초혈 임파구상에서 적은 양으로 발현된다. ICAM-1은 염증이 일어난 조직으로 호중성 이동을 위해 요구되는 것으로 나타난다. 어떤 골수단구 셀라인의 포르볼 에스테르 자극된 분화는 ICAM-1 발현을 크게 증가시킨다. 따라서, ICAM-1은 염증 부위에서 우선적으로 발현되고 휴지세포에 의해 일반적으로 발현되지 않는다. 피부 섬유아세포상의 ICAM-1 발현은 100/mℓ의 수준으로 인터로이킨 1 또는 감마인터페론에 의해 각각 4시간 또는 10 시간의 기간에 걸쳐 3배 내지 5배 증가된다. 유도는 단백질 및 mRNA 합성에 의존하며 가역적이다.

ICAM-1은 섬유아세포에서 97kd, 골수단구 셀라인 U937 에서 114kd 그리고 B 임파구양 세포 JY 에서 90kd 의 분자량으로 다른 세포유형에서 분자량 상동성을 나타낸다. ICAM-1 생합성은 대략 73kd 세포간 전구체를 수반하는 것으로 발견되었다. 투니카마이신처리(이것은 글리코실화를 억제한다) 로부터 결과되는 비 N-글리코실화 형태는 55kd 의 분자량을 갖는다.

포르볼(Phorbol)에스테르 자극된 U937 세포로부터 또는 섬유 아세포로부터 분리된 ICAM-1은 화학적 글리코실제거후 60kd 의 분자량을 갖는 동일한 주생성물을 산출한다. ICAM-1 모노클로날 항체는 피토헤마글루티닌 아세포의 LFA-1 결핍 셀라인에의 점착을 방해한다. 임파구가 아닌 섬유아세포의 ICAM-1을 결합할 수 있는 모노클로날항체와의 전처리는 임파구-섬유아세포 점착을 억제한다. 섬유아세포가 아닌 임파구의 LFA-1에 대한 항체와의 전처리는 임파구-섬유 아세포 점착을 억제하는 것으로 또한 발견되었다.

ICAM-1은 따라서 당단백질의 CD18 족의 분자의 결합 리간드이다. 그것은 체내에서 염증병해로 임파구의 침윤과 일치하는 시간구성에서 IL-1, 감마인터페론 및 종양 괴사인자와 같은 염증 중재자에 의해 체외적으로 섬유 아세포와 내피세포상에서 유도가능하다(Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137:245-254,(1986); Prober, J.S., et al., J. Immunol. 137: 893-1896, (1986)). 또한 ICAM-1 은 혈관 내피 세포, 흉선 상피세포, 다른 상피세포 및 섬유아세포와 같은 비조혈세포상에서와 조직 대식세포 미토겐으로 자극된 T임파구 아세포 및 편도선, 임파절 및 페이어판내의 배중심 B세포와 수상세포와 같은 조혈세포상에서 발현된다(Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137: 245-254(1986)). ICAM-1 은 알레르기성 습진, 편평태선, 발진, 두드러기 및 수포 질환들과 같은 양성의 염증병해에서 각질 세포상에서 발현된다. 알레르기환자 피부에 합텐의 적용에 의해 촉발된 알레르기 피부반응은 또한 각질 세포상에 대량의 ICAM-1 발현을 나타내었다. 한편 피부상의 독성 반점들은 각질상의 ICAM-1 발현을 나타내지 않았다. ICAM-1 은 각종 피부병학적 장해로부터 피부병해의 생검으로부터 유래된 각질세포상에 존재하며 ICAM-1 발현은 알레르기반점 시험으로부터 병해상에서 유도되는 한편 독성반점시험병해로부터의 각질세포는 ICAM-1 을 발현하지 못하였다.

본 발명의 또 다른 관점은 세포점착을 방지 또는 억제하는 약제는 천식의 치료에 사용될 수 있다는 발견이다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 약제의 한예는 ICAM-1 과 ICAM-1 의 기능성 유도체이다. ICAM-1 은 호산성구 세포 표면상에서 수용체분자에 결합함으로써 세포점착을 중재하기 때문에, 호산성구상에 존재하는 ICAM-1 수용체에 결합할 수 있는 ICAM-1의 기능성 유도체는 폐 내피세포상에서 ICAM-1 과 경쟁할 것이며 따라서 호산성구의 세포 점착을 지연시키며 천식의 치료를 제공한다.

ICAM-1 의 기능성유도체 는 ICAM-1 의 생물학적 활성에 실질적으로 유사한 생물학적활성(기능적 또는 구조적) 을 지니는 화합물이다.

용어 기능성유도체 는 분자의 단편, 변종, 유사체, 또는 화학적 유도체 를 포함하는 것을 의도한다. ICAM-1 과 같은 분자의 단편은 분자의 어떤 폴리펩티드 서브세트를 말함을 뜻한다. ICAM-1 활성을 가지며 용해성인(즉 막 결합되지 않는)ICAM-1 의 단편이 특히 바람직하다.

ICAM-1 은 7개의 도메인으로 구성된다(Staunton, D.E. et al., Immunol. Today 9: 213-215 (1988); Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-934(1988); Staunton, D.E. et al., Cell 56:849-854(1989); Staunton, D.E. et al., Tissue Antigens 33: 287(1989), 이들 문헌은 모두 참고로 여기에 포함된다). ICAM-1 의 도메인들을 제2도에 나타내었다. 도메인 1과 2는 ICAM-1 의 그의 수용체분자에의 결합에 중요한 것으로 발견되었다(Staunton, D.E. et al., Tissue Antigens 33: 286(1989); Staunton, D.E. et al., FASEB J. 3: A446(1989), 이들 문헌은 둘 다 여기에 참고로 포함된다).

본 발명에 따르면, ICAM 기능성 유도체, 특히 도메인1 과 2를 둘다-지니는 ICAM-1의 단편 또는 돌연변이체 변종으로 이루어지는 이러한 유도체가 천식의 치료 또는 요법에 사용될 수 있다. 이러한 치료 또는 요법에 더 바람직한 것은 ICAM-1 의 도메인 2를 함유하는 ICAM-1 단편 또는 돌연변이체 변종이다. 이러한 치료 또는 요법에 가장 바람직한 것은 ICAM-1 의 도메인 1을 함유하는 ICAM-1 단편 또는 돌연변이체 변종이다.

ICAM-1과 같은 분자의 변종 은 전체분자에 또는 그의 단편에 구조 및 기능에 있어서 실질적으로 유사한 분자를 말함을 뜻한다.

두 분자가 실질적으로 유사한 구조를 갖든지 또는 두 분자가 유사한 생물학적 활성을 지닌다면 그 분자는 다른 분자와 실질적으로 유사하다고 말한다. 따라서, 두 분자가 유사한 활성을 지닌다면 분자 중 하나의 구조가 다른 것에서 발견되지 않거나 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않을지라도 그 용어가 여기서 사용되기 때문에 그것들은 변종으로 생각한다. ICAM-1 과 같은 분자의 유사체 는 전체분자나 또는 그의 단편에의 기능이 실질적으로 유사한 분자를 의미한다. 여기서 사용된 바와 같이 분자는 그것이 보통 분자의 일부가 아닌 추가의 화학적 부분들을 함유한다. 이러한 부분들은 분자의 용해성, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 부분들은 대신으로 분자의 독성을 감소시킬 수도 있고 분자의 어떤 바람직하지 못한 부작용을 제거 또는 지연시킬 수도 있다. 이러한 효과를 중재할 수 있는 부분들은 Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)에 개시되어 있다.

독소-유도체 화된 분자는 특별한 부류의 화학적 유도체를 구성한다. 독소-유도체화된 분자는 독소부분을 함유하는 분자(ICAM-1 또는 항체와 같은 것) 이다. 이러한 분자의 세포에의 결합은 독소부분을 세포와 밀접한 근접부분으로 가져오며 이로써 세포죽음을 촉진한다. 어떤 적합한 독소부분도 사용될 수 있으나, 그러나 예를 들면 리신(ricin) 독소, 디프테리아독소, 방사성동위원소 독소, 막채널 형성독소 등과 같은 독소들을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 부분들을 분자에 커플링 시키는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다.

천식을 치료하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 약제의 더 이상의 예로는 LFA-1, Mac-1 또는 p150,95, 또는 이들 분자의 기능성 유도체가 있다. 이러한 분자들과 그들의 기능성 유도체는 그들이 내피세포의 ICAM-1 에 결합할 수 있는 능력에 의해 천식의 치료를 제공할 수 있고 따라서 호산성구의 결합 및 점착을 중재하는 이러한 세포의 능력을 손상시킬 수 있다.

본 발명에 대해 특별히 흥미있는 것은 용해성 분자들인 LFA-1, Mac-1 또는 p150,95의 기능성 유도체들이다.

특별히 흥미있는 것은 헤테로이량체(분자의 알파와 베타 서브유니트를 둘 다 함유함)이며 ICAM-1을 결합할 수 있는 단량체 유도체인 이들 분자의 기능성 유도체이다. 용해성 헤테로 이량체가 특히 바람직하다.

ICAM-1 과 분자의 CD18 족 멤버는 면역원성 분자들이다. 따라서, ICAM-1 또는 분자의 CD18 족의 멤버에 결합할 수 있는 항체를 얻는 것이 가능하다. 이러한 항체들은 천식의 치료에 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.

이러한 항체들은 정제된 분자들(또는 이들 분자들을 천연적으로 발현하는 세포들) 중 한가지를 복강내 주사 등에 의해 적절한 동물에 이입시킴으로써 얻어질 수 있다. 원한다면, 이러한 동물의 혈청을 제거하여 이들 분자들을 결합할 수 있는 폴리클로날 항체원으로서 사용할 수도 있다. 그러나 이러한 동물로부터 비장세포를 제거하여 골수종 셀라인과 함께 이러한 비장세포를 융합시키고 이러한 융합세포들을 ICAM-1 또는 분자의 CD18 족의 멤버를 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 분비하는 히브리도마 세포를 형성하도록 허용하는 것이 바람직하다.

상기한 방법으로 얻은 히브리도마 세포는 상기한 바와 같이 스크리닝하여 ICAM-1에 또는 분자의 CD18 족 멤버에 (알파 또는 베타 서브유니트) 결합할 수 있는 항체를 분비하는 원하는 히브리도마 세포를 확인할 수도 있다.

이러한 항체들은 ICAM-1또는 그의 수용체에 결합하는 능력을 갖기 때문에, 그것들(그리고 Fab, F(ab)₂등과 같은 항원 결합 능력을 갖는 그것들의 단편)은 세포 점착을 저하시키기 위해 사용될 수 있으며 천식을 치료하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 약제의 더 이상의 예를 제공한다.

상기한 바와같이 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘 다 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명에 대해 특별한 관심은 재조합 또는 다른 기술에 의해 사람에게 생성되거나 또는 사람의 것처럼 가공된(humanized)(즉, 사람에서 비면역원성) ICAM-1(또는 그의 기능성 유도체) 또는 CD18 족 멤버(또는 그의 기능성 유도체) 에 대한 항체들이다.

사람의 것처럼 가공된 항체는 예를 들면 항체의 면역원성 부분을 대응하는, 그러나 비면역원성부분으로 치환함으로써 제조될 수 있다(즉 키메라 항체)(Robinson, R.R. et al., 국제특허공개 PCT/US 86/02269; Akira, K. et al., 유럽특허출원 184, 187; Taniguchi, M.,유럽특허출원 171,496; Morrison, S. L. et al.,유럽특허출원 173,494; Neuberger, M. S. et al., PCT출원 WO 86/01533; Cabilly, S. et al., 유럽특허출원 125, 023; Better, M. et al., Science 240: 1041-1043(1988); Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443(1987), Liu, A.Y. et al., J. Immunol. 139: 3521-3526(1987); Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84214-218(1987); Nishimura, Y. et al., Canc. Res. 47:999-1005(1987); Wood, C.R. et al., Nature 314: 446-449 (1985)); Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988).

사람의 것처럼 가공된 키메라 항체의 일반적 고찰은 모리슨(Morrison, S. L., Science 229: 1202-1207(1985)) 과 오이(Oi, V.T. et al., BioTechniques 4 : 214(1986)) 에 의해 제공된다.

또한 적합한 사람의 것처럼 가공된 항체는 CDR 또는 CEA 치환에 의해 제조될 수 있다(Jones, P. T. et al., Nature 321: 552-525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239: 1534(1988); Bridler, C.B. et al., J. Immunol. 141:4053-4060(1988)).

본 발명의 항천식 약제는 천연공정에 의해(예를 들면, ICAM-1 의 비면역글로불린 작용제를 생성하도록 동물, 식물, 진균류, 세균 등을 유도함으로써 또는 ICAM-1에 결합할 수 있는 폴리클로날 항체를 생성하도록 동물을 유도함으로써); 합성적 방법에 의해(예를 들면 ICAM-1, ICAM-1의 기능성유도체 또는 ICAM-1의 단백질 길항제(면역글로불린) 이거나 아니면 비면역글로불린)를 합성하기 위한 폴리펩티드를 합성하는 메리필드(Merrifield)법을 사용함으로써; 히브리도마 기술에 의해(예를 들면 ICAM-1에 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 생성하는 것); 또는 재조합 기술에 의해 (예를 들면 다양한 숙주(즉, 효모, 세균, 진균류, 배양된 포유동물세포 등)에서 또는 재조합 플라스미드 또는 바이러스성 벡터로부터 본 발명의 항천식 약제를 생성하는 것), 또는 단백질 분해에 의해 얻어질 수 있다. 어떤 방법을 사용하도록 선택할 것 인가는 편리성과 원하는 수율 등과 같은 요인들에 의존한다. 특정한 항천식 약제를 제조하기 위해 상기한 방법, 공정, 또는 기술 중 단지 한가지만 사용할 필요는 없다. 상기 공정, 방법 및 기술들은 특정한 항천식 약제를 얻기 위해 조합할 수 있다.

약 100개 까지의 잔기를 갖는 ICAM-1의 기능성 유도체, 또는 CD18 족 멤버는 생체외에서 합성에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 원한다면, 이러한 단편들은 정제되거나 미정제된 단백질의 목적하는 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 약제와 반응시킴으로써 변경될 수도 있다. 결과된 공유결합 유도체는 생물학적 활성을 위해 중요한 잔기를 확인하기 위해 사용할 수 있다. 아래에 열거한 구체예에서, 본 발명의 이러한 관점을 ICAM-1의 기능성 유도체를 참조하여 기술한다. 이러한 방법들은 또한 분자의 CD18 족의 어떤 멤버의 기능성 유도체든 제조하는데 사용될 수 있다.

시스테인 잔기는 가장 통상적으로 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 α-할로아세테이트(및 대응아민유)와 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테인 찬기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로판산, 인산 클로로아세틸, N-알킬말레이미드, 이황화 3- 니트로-2- 피리딜, 이황화 메틸 2-피리딜, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로 머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1, 3-디아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.

히스티딘 찬기는 디에틸 프로카보네이트가 비교적 히스티딜 측쇄에 특이적이기 때문에 pH 5.5-7.0 에서 이 약제와 반응시킴으로써 유도체화된다 파라-브로모페나실 브로마이드도 또한 유용하다. 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1M 소디움 카코딜레이트에서 수행된다. 글리신과 아미노 말단잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산의 무수물과 반응시킨다. 이들 약제와의 유도체 화는 리신 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 갖는다. α-아미노함유 잔기를 유도체 화하기 위한 적합한 시약은 메틸 피콜린 이미 데이트와 같은 이미도 에스테르; 피리독살인산염; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠술폰산; 0-메틸이스우레아; 2, 4-펜탄디온; 그리고 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매된 반응을 포함한다.

알기닌 잔기는 한가지 또는 몇 가지의 종래의 시약들, 페닐글리옥살, 2, 3-부탄디온, 1, 2-시클로헥산디온, 및 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 알기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 기능기의 높은 pKa 때문에 알칼리성 조건에서 반응이 수행되는 것을 요한다. 더 나아가서, 이들 시약은 알기닌 엡실론- 아미노기뿐만 아니라 리신의 기들과도 반응할 수 있다.

티로신 잔기 자체의 특정 변형은 광범위하게 연구되었고 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 스펙트럼라벨을 티로신 잔기에 도입하는 점에 특별한 관심이 있었다. 가장 통상적으로 N-아세틸 이미다졸과 테트라 니트로 메탄은 각각 0-아세틸티로신 종과 3-니트로유도체를 형성하기 위해 사용된다. 티로신 잔기는 방사면역 분석법에서 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하기 위해¹²⁵I 또는131I를 사용하여 요오드화하며 클로라민 T법이 적합하다.

카르복실측기(아스파르틸 또는 글루타밀)는 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸) 카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4- 디메틸 펜틸)카보디이미드와 같은 카보디이미드(R'-N-C-N-R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형된다. 더 나아가서, 아스파르틸 및 글루타민 잔기는 암모늄이온과의 반응에 의해 아스파라기닌 및 글루타민 잔기로 전환된다. 2기능성 약제로 유도체화하는 것은 ICAM-1 기능성 유도체 융합 폴리펩티드를 절단하여 절단된 폴리펩티드를 방출 및 회수하는 방법에서 사용하기 위해 수 불용성지지체 매트릭스 또는 표면에 ICAM-1 기능성 유도체 분자를 가교결합하기 위해 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들면, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들면 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 호모(homo) 2기능성 이미도에스테르, 그리고 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 2 기능성 말레이미드를 포함한다. 메틸-3-[(p-아치도페닐) 디티오] 프로피오이미데이트와 같은 유도체화 약제는 빛의 존재하에 가교결합을 형성할 수 있는 광활성화 가능 중간체를 제공한다. 또 다르게는 시아노겐 브로마이드 활성 탄수화물과 같은 반응성 수불용성 매트릭스와 미국 특허 No. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440 에 기술된 반응성 기질이 단백질 고정화를 위해 사용된다.

글루타민 및 아스파라기닌 잔기는 빈번히 아미드 제거되어 대응 글루타민 및 아스파르틸 잔기로 된다. 또 다르게는 이들 잔기는 온화한 산성 조건하에 아미드가 제거된다. 이들 잔기중 어떤 형태든 본 발명의 범위에 든다.

다른 변형은 프롤린과 리신의 히드록실화, 세린 또는 트레오닌 찬기의 히드록실기의 포스포릴화, 리신, 알기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단아민의 아세틸화, 그리고 어떤 경우에는 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

변경된 아미노산 서열을 갖는 ICAM-1의 기능성 유도체는 DNA에서 돌연변이에 의해서 또한 제조될 수 있다. ICAM-1을 코드화하는 뉴클레모티드 서열을 제1도에 나타내었다. 이러한 변종은 예를 들면 제1도에 나타낸 아미노산 서열내의 잔기의 결실, 또는 삽입 또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 어떤 조합도 최종 구성물이 원하는 활성을 지닌다면, 최종 구성물에 이르도록 만들어질 수 있다. 명백히, 변종을 코드화하는 DNA 에서 만들어지게 되는 돌연변이는 리딩 프레임 밖에 서열을 위치하게 해서는 안되며 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 제조할 수 있는 상보 영역들을 만들지는 않을 것이다(유럽특허출원 공개 No. 75,444).

유전학적 수준에서 이들 기능성 유도체는 보통 ICAM-1 분자를 코드화하는 DNA에서 뉴클레오티드의 부위 지정 돌연변이 생성에 의해 제조되며, 이로써 기능성 유도체를 코드화하는 DNA를 생성하며 그후 재조합 세포 배양에서 DNA를 발현한다. 기능성 유도체는 전형적으로 천연발생 유사체로서 같은 정성적 생물학적 활성을 나타낸다. 그러나 그것들은 보통 제조된 ICAM-1 분자와 이러한 특성에 있어서 실질적으로 다를 수도 있다. 아미노산 서열 변동을 도입하기 위한 부위는 지정되는 한편, 돌연변이 자체는 지정될 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 최적화하기 위해 무작위 돌연변이 생성이 표적 코돈 또는 영역과 원하는 활성의 최적조합을 위해 스크리닝된 발현된 ICAM-1 기능성 유도체에서 행해질 수 있다. 기지의 서열을 갖는 DNA에서 소정 부위에서 치환돌연변이를 만들기 위한 기술은 공지이며 예를 들면 부위 지정 돌연변이 생성이다.

지금까지에 따르는 ICAM-1 기능성 유도체 분자의 제조는 바람직하게는 단백질의 더 일찍 제조된 기능성 유도체 또는 변종이 아닌 변형을 코드하는 DNA의 부위 지정 돌연변이 생성에 의해 달성된다. 부위 지정 돌연변이 생성은 결실접합점이 횡단하는 양측에 안정한 이중체(duplex)를 형성하기 위해 충분한 크기 및 서열 복잡성을 갖는 프라이머 서열을 제공하기 위하여 충분한 수의 인접 뉴클레오티드 뿐만 아니라 원하는 돌연변이의 DNA 서열을 코드하는 특이적 올리고뉴클레오티드 서열의 사용을 통해 ICAM-1 기능성 유도체의 생성을 허용한다. 전형적으로, 서열의 접합점의 양측상의 약 5 내지 10개 잔기가 변경되어 있고 길이가 약 20 내지 25개 뉴클레오티드의 프라이머가 바람직하다. 일반적으로, 부위 지정 돌연변이 생성의 기술은 본 분야에 공지이며, Adelman et al., DNA 2: 183(1983) 과 같은 문헌이 예시되며 그 본문은 여기에 참고로 포함된다.

인정되는 바와 같이 부위 지정 돌연변이 생성 기술은 전형적으로 단일스트랜드 및 이중스트랜드형 둘 다에 존재하는 파아지 벡터를 사용한다. 부위 지정 돌연변이생성에 유용한 전형적인 벡터는 예를 들면 메씽(Messing et al., 거대분자 및 재조합 DNA에 대한 제3회 클리블렌드 심포지움 Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam(9181))에 의해 개시된 바와 같이 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 상기 문헌은 여기에 참고로 포함된다. 이들 파아지는 쉽게 시중구입되며 그 용도는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 또 다르게는 복제의 단일 스트랜드 파아지 기원을 함유하는 플라스미드 벡터(Veira et al., Meth Enzymol. 153: 3(1987)가 단일스트랜드 DNA를 얻기 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, 지금까지에 따르는 부위 지정 돌연변인 생성은 서열내에 관련 단백질을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 단일 스트랜드 벡터를 먼저 얻음으로써 수행된다. 원하는 돌연변이된 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 합성적으로 예를 들면 크레아(Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75:5765(1987)) 의 방법에 의해 제조된다: 이 프라이머는 그 다음 단일스트랜드 단백질 서열함유 벡터로 어닐링(anealing)되고 대장균 폴리머라제 I 레노우(Klenow) 단편과 같은 DNA-중합효소를 적용하여 돌연변이를 함유하는 스트랜드의 합성을 완결한다. 따라서, 돌연변이된 서열 및 제2 스트랜드는 원하는 돌연변이를 함유한다. 이 헤테로 이중 벡터는 그다음 JM 101 세포와 같은 적당한 세포를 형질전환시키기 위해 사용되며 돌연변이된 서열배열을 지니는 재조합 벡터를 포함하는 클론이 선정된다.

이러한 클론이 선정된 후, 돌연변이된 단백질 영역이 제거되고 일반적으로 적당한 숙주의 형질전환을 위해 사용될 수 있는 유형의 발현벡터인 단백질 생성을 위한 적당한 벡터에 위치하게 할 수 있다.

아미노산 서열 결실은 일반적으로 1 내지 30 개 잔기 더 바람직하게는 1 내지 10 개 잔기의 범위이며 전형적으로 인접한다.

아미노산 서열 삽입은 한잔기로부터 본질상 제한되지 않은 길이의 폴리펩티드로의 아미노 및/ 또는 카르복실 말단융합과 또한 단일 또는 복수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 서열내 삽입(즉, 완전한 ICAM-1 분자서열내의 삽입) 은 일반적으로 약 1 내지 10 잔기, 더 바람직하게는 1 내지 5잔기의 범위가 될 수 있다. 말단 삽입의 예는 이종이든지 동종이든지 단일서열의 숙주세포에 재조합 숙주로부터 ICAM-1 기능성 유도체의 분비를 용이하게 하기 위해 분자의 N-말단에의 융합을 포함한다.

기능성 유도체의 제3 의 군은 ICAM-1 분자내의 적어도 한 아미노산 잔기, 바람직하게는 단지 하나가 제거되고 다른 관기가 그 자리에 삽입된 것들이다.

이러한 치환은 바람직하게는 ICAM-1 분자의 특성을 미세하게 조정하는 것이 요망될 때 다음 표1 에 따라 만들어진다.

기능상 또는 면역학상 동일성의 실질적 변화들은 표1 의 것들보다 덜 보존적인 치환들을 선택함으로써, 즉, (a) 예를 들면 시이트 또는 나선상 구조와 같은 치환의 영역에서 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 용적을 유지하는 그들의 효과에 있어서 명확히 더 다른 관기들을 선택함으로써 행해진다. 일반적으로 (a)글리신 및/ 또는 프롤린이 다른 아미노산에 의해 치환되거나 결실되거나 삽입되는것; (b) 친수성 잔기, 예를 들면 세린 또는 트레오닌이 소수성잔기, 예를 들면 로이신, 이소로이신, 페닐알라신, 발린, 또는 알라닌으로(또는 의해서) 치환되는것; (c) 시스테인 잔기가 다른 잔기들로(또는 의해서) 치환되는 것, (d) 전기 양성의 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들면 리신, 알기닌, 또는 히스티딘이 전기 음성의 전하를 갖는 잔기, 예를 들면 글루타민 또는 아스파르틸로 치환 되는 것; 또는 (e) 벌키한 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들면 페닐알라닌이 이러한 측쇄를 갖지 않는 것, 예를 들면, 글리신으로(또는 의해서)치환되는 것들로 기대되는 치환들.

대부분의 결실 및 삽입, 그리고 치환들은 특히 ICAM-1 분자의 특성에 근본적인 변화를 일으키는 것으로 기대되지는 않는다. 그러나, 그렇게 하기에 앞서 치환, 결실 또는 삽입의 정확한 효과를 예상하기가 어려울 때 당업자는 일상적인 스크리닝 분석법에 의해 효과가 평가될 것이라는 것을 인정할 것이다. 예를 들면, 기능성 유도체는 전형적으로 천연 ICAM-1 분자를 코드하는 핵산의 부위 지정 돌연변이생성, 재조합세포 배양에서 변종핵산의 발현 그리고 임의적으로 세포배양으로부터의 정제에 의해서, 예를 들면, 항 ICAM-1 분자항체 컬럼상의 면역 친화도 흡착에 의해(적어도 하나의 남아있는 에피토프에 결합시킴으로써 기능성 유도체를 흡착하기 위해서)만들어진다.

세포 용해물 또는 정제된 ICAM-1 분자 기능성 유도체의 활성은 그 다음 소정의 특성을 위한 적합한 스크리닝 분석법에서 스크리닝된다. 예를 들면 주어진 항체에 대한 친화도와 같은 기능적 유도체의 면역학적 특성의 변화는 경쟁형 면역분석법에 의해 측정된다. 면역조정 활성의 변화는 적당한 분석법에 의해 측정된다. 산화환원제 또는 열안정성, 생물학적반감기, 소수성, 단백질 분해에 의해 분해 또는 담체와 응집하거나 다량체로 응집되는 경향과 같은 단백질 성질의 변경은 보통의 당업자에게 공지된 방법에 의해 분석된다.

C. 본 발명 조성물의 투여.

본 발명의 항천식 약제의 치료학적 효과는 어떤 적합한 수단에 의해(즉 정맥내, 근육내, 피하, 장내 또는 비경구적으로) 환자에서 이러한 약제를 제공함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명 약제를 코 스프레이, 솜 등에 의해서와 같이 코안에 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 약제를 경구흡입에 의해서 또는 경구 스프레이 또는 경구 에어로졸을 통해 투여하는 것이 특히 바람직하다. 약제를 주사에 의해 투여할 때 투여는 연속적 주입에 의해서, 또는 1회 또는 수회 큰양으로 할 수 있다.

상기 논의한 모든 약제의 치료학적 이점은 담체에의 커플링을 향상시키거나 약제의 활성을 향상시키기 위해 첨가된 추가의 아미노산 잔기들을 지니는 기능성 유도체의 사용을 통해 증대될 수 있다.

본 발명의 범위는 일정한 아미노산 잔기를 결실하거나 변경된 아미노산잔기를 함유하는 ICAM-1 의 기능성 유도체를 이러한 유도체가 세포점착에 영향을 미치는 능력을 나타내는 한 포함함을 또한 의도한다.

여기 개시된 본 발명 항체들과 ICAM-1 분자 및 CD18 족 멤버들은 그것들을 함유하는 제제가 이들 생성물이 보통 천연적으로 함께 발견되는 물질들이 실질적으로 없다면 실질적으로 천연오염물질이 없다 고 말한다.

본 발명은 ICAM-1에 또는 CD18 족 멤버에 결합할 수 있는 항체와 그의 생물학적 활성단편들(폴리클로날이든지 모노클로날이든지) 의 천식치료에의 사용으로 확장된다.

ICAM-1 에 또는 CD18 족 멤버에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편들을 환자에 제공하는데 있어서, 또는 ICAM-1 또는 CD18 족 멤버(또는 그의 단편, 변종, 또는 유도체) 를 수용환자에 제공할 때, 투여되는 약제의 투여량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 일반적 의료상태, 이전의 의료역사 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 약 1pg/㎏ 내지 10㎎/㎏(환자체중) 의 범위인 약제투여량을 수용인에게 제공하는 것이 바람직하나 더 낮거나 더 높은 투여량이 투여될 수도 있다. 치료학적 유효량은 상기한 약제의 조합을 사용함으로써 낮아질 수 있다(예를들면 항 ICAM-1 항체가 항 LFA-1항체와 함께 추가적으로 투여된다면).

여기서 사용한 바와 같이 두 화합물의 투여가 두 화합물이 모두 환자의 혈청에서 동시에 검출될 수 있는 시간 부근에 있을 때 한 화합물은 제2 의 화합물과 함께 추가적으로 투여된다고 말한다.

본 발명의 항천식 약제는 천식증상의 위중도, 크기 또는 지속기간을 감축 또는 저하시키기에 충분한 양으로 수용환자에 제공됨을 의도한다.

본 발명의 항체약제 또는 그의 단편들은 단독으로 또는 한가지 이상의 추가의 항천식 약제(메틸크산틴 같은 것(테오필린 같은 것), 베타아드레날린 작용제(카테콜아민, 레조르시놀, 살리제닌 및 에피드린 같은 것), 글루코콜티코이드(히드로코르티손 같은 것), 크로몬(크로몰린나트륨염 같은 것) 및 항콜린 작용제(아트로핀 같은 것) 들과의 조합으로 천식증상을 치료하는데 필요한 이러한 약제들의 양을 감소시키기 위하여 투여될 수 있다.

본 발명 약제의 투여는 예방' 아니면 치료 목적을 위해 투여될 수 있다. 예방을 위해 제공될 때, 약제는 어떤 천식 증상에 앞서 제공된다. 예방을 위한 약제의 투여는 어떤 후속되는 천식반응을 방지하거나 저하시키기 위해 제공된다. 치료목적으로 제공될 때, 약제는 천식증상의 개시 때(또는 바로 후에) 제공된다. 치료를 위한 화합물의 투여는 어떤 실제의 천식 증상발현을 저하시키기 위해 제공된다. 본 발명 약제는 따라서 예상되는 천식 증상발현의 개시에 앞서서(예상되는 증상발현의 위중도, 지속시간 또는 크기를 저하시키도록) 아니면 증상발현의 개시 후에 제공될 수 있다.

조성물은 그의 투여를 수용환자가 견딜 수 있다면 약리학적으로 허용 가능하다 고 말한다 이러한 약제는 투여되는 양이 생리학적으로 중요하다면 치료학적 유효량으로 투여된다고 말한다. 약제는 그 존재가 수용환자의 생리학에 검출가능한 변화를 가져온다면 생리학적으로 중요하다.

본 발명 약제는 공지의 방법에 따라 조제하여 약학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있으며, 이로써 이들 물질 또는 그들의 기능성 유도체가 약학적으로 허용되는 담체 부형제와의 혼합물에 조합된다. 다른 사람 단백질, 예를 들면 사람 혈청 알부민을 포함하여 적합한 부형제 및 그들의 조제가 예를 들면 레밍톤(Remington)의 약학지(Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA(1980)) 에 기술되어 있다. 효과적인 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 조성물을 형성하기 위하여 이러한 조성물은 적합한 양의 담체 부형제와 함께 유효량의 항 ICAM항체 또는 ICAM-1분자, 또는 그들의 기능성 유도체를 함유할 것이다.

작용의 지속기간을 조절하기 위해 추가의 약학적 방법을 사용할 수도 있다. 조절 방출 제제는 항 ICAM-1 항체 또는 ICAM-1 또는 그의 기능성 유도체를 복합체화 또는 흡수하는 중합체의 사용을 통해 달성될 수 있다. 조절된 전달은 방출을 조절하기 위하여 혼입방법 뿐 만 아니라 적절한 거대분자(예를 들면, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐, 피롤리돈, 에틸렌 비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시 메틸셀룰로오스, 또는 프로타민 황산염) 및 거대분자의 농도를 선택함으로써 발휘될 수 있다. 조절 방출제제에 의해 작용의 지속기간을 조절하는 또 다른 가능한 방법은 항 ICAM-1 항체 또는 ICAM-1 분자, 또는 그의 기능성 유도체들을 폴리에스테르, 폴리아미노산, 히드로겔, 폴리(젖산) 또는 에틸렌비닐아세테미트 공중합체와 같은 중합체물질의 입자에 혼입시키는 것이다. 또한 이들 약제를 중합체 입자에 혼입시키는 대신에 이들 물질을 코아세르베이션(coacervation)기술에 의해서 또는 계면중합에 의해 제조된 마이크로캡슬, 예를 들면 히드록시메틸 셀룰로오스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 또는 콜로이드성 약품 전달시스템, 예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로유제, 나노(nano)입자 및 나노캡슐에 또는 거대유제(macroemulsion) 집어넣는 것이 가능하다.

이러한 기술은 레밍톤의 약학지(Pharmaceutical Sciences, (1980))에 개시되어 있다.

본 발명을 일반적으로 기술하였으나, 예시로써 제공되며 달리 명시되지 않은 한 본 발명을 제한하는 것을 의도하지 않는 다음의 실시예들을 참고로 더 쉽게 이해될 것이다.

[실시예 1]

폐 호산성 점착반응은 CD11 및 ICAM-1 세포점착분자에 의존한다.

이동 및 세포독성 기능에 있어서, 호산성구의 세포점착의 요구를 평가하기 위하여 시험관내에서 호산성구 점착을 시험하였다. 특히, 단백질 피복된 플라스틱과 사람 내피세포에의 영장류 호산성 점착에 있어서 세포 점착분자의 CD18 족의 역할파 ICAM-1 의 역할을 조사하였다. 호산성구는 성장한 수컷 협비원류 원숭이(Macaca fascicularis) 로부터 기관지 폐포 세척에 의해 얻고 페르콜(Percoll) 연속밀도구배상에서 정제하고(형태학에 의해93%), 세척하고 5×10세포/ 웰의 농도로 96 웰의 편평한 바닥의 조직배양판에 첨가하였다. 37℃에서 60 분 배양 후, 비점착성 세포를 판세척기를 사용하여 제거하였다. 점착성 세포를 시각으로(응집 또는 과립제거가 관찰되지 않았다) 와 호산성 퍼옥시다제(EPO) 를 측정하는 비색분석법에 의해 계수하였다.

호산성구는 미처리된 웰 또는 면역복합체(회충추출물과 회충면역원숭이로부터의 혈청에서 만든것) 로 피복된 웰의 바닥에 자발적으로 부착하여 펼쳐졌다. 반대로, 호산성구는 소혈청알부민, 정상의 원숭이 혈청, 또는 회충 추출물을 포함하는 단백질로 피복된 웰에 잘 부착하지 않았다. 여러 가지 용해성 자극시험 중에서 혈소판활성인자(PAF) 가 단백질 피복된 웰에 호산성구의 가장 현저하고 일치하는 점착을 유도하였다(제3도).

이 점착과정에서 CD18 점착분자의 역할과 ICAM-1 의 역할을 각각의 이들 막당단백질과 반응성인 모노클로날 항체를 사용하여 시험하였다. 사용된 항체는 R3.3 과 R15.7(항 CD18); R3.1(항-CD11a); M1/70과 LM 2/1(항CD11b); RR1/1 과 R6.5. D6(항 ICAM-1); 그리고 W6/32(항 HL-A 글래스I)을 포함하였다.

면역복합체 피복된 웰에 호산성구의 점착은 CD11b- 의존성인 것으로 나타났는데 CD11b 및 CD18 에 대한 mAbs 는 점착을 억제하는 한편 CD11a, ICAM-1및 HL-A에 대한 mAbs는 억제하지 않았기 때문이다(제4도).

PAF를 포함하여 용해성자극에 의해 활성화된 호산성구와 단백질 피복된 웰을 사용하여 동일한 결과를 얻었다.

LPS(10ng/mℓ)에 의해 활성화되고 글루타르 알데히드와 함께 고정된 내피세포에의 호산성구의 점착을 또한 시험하였다.

사람의 배꼽정맥 내피세포를 스미스(Smith, C.W., et al., J. Clin. Invert. 82:1746(1988), 이 문헌은 여기에 참고로 포함된다)에 의해 기술된 대로 제조하였다. 이러한 활성화된 내피세포에 PAF(10M) 에 의해 유발된 호산성구의 점착은 CD 11a, CD 11b 및 ICAM 에 대한 mAbs 에 의해 부분적으로 억제되고 항-CD18에 의해 완전히 억제되며 항 HL-A 에 의해 억제되지 않는다(제5도). 이들 실험은 관찰된 점착이 CD 11a, CD 11b 및 ICAM-1에 부분적으로 의존한 것으로 나타났다.

요약하면, 영장류 폐 호산성구는 CD 11a, CD 11b 및 ICAM-1 을 수반하는 막점착 반응에 있어서 사람 호중성구와 거의 동일하게 작용한다. 그러므로 CAMs 의 CD18족은 호산성구 점착에 주역할을 하며, LAD 환자에서 호산성구의 선택적인 조직 축적을 책임지게 된다.

[실시예 2]

호산성 침윤에 있어서 ICAM-1 의 역할

ICAM-1이 호산성 침윤(infiltration)에 기여했는지 증명하기 위하여, 기관지 천식의 기초가 되는 기도염증을 특징짓는 기도 내피 박리와 증가된 기도 감응성, 영장류에서 천식상에서 ICAM-1과 반응성인 모노클로날 항체의 효과를 조사하였다. 특히, (a) 시험관내에서 혈관 내피세포에의 호산성점착에 ICAM-1 의 기여, (b) 체내에서의 기관지 혈관 내피세포상에서 뿐만 아니라 시험관내에서 및 체내에서 기도상피세포상에서 ICAM-1의 유도, 그리고 (c) 체내에서 항원의 수회 흡입에 의해 유발된 호산성 침윤과 기도 감응성의 증가에의 ICAM-1 의 기여를 조사하였다.

영장류 폐 호산성구를 혈소판 활성인자(PAF, 10M)로 자극시키고 세포점착을 분석하기 위해 지질다당류(LPS, 10ng/mℓ) 자극된 배양된 사람 배꼽정맥 내피세포(HUVECs)의 존재하에 인큐베이션시졌다. 호산성구는 기도 호산구증가증을 가진 성장한 수컷 협비원류 원숭이(Macaca fascicularis)로부터 기관지 폐포 세척에 의해 얻고 Percoll 연속밀도구배(Riding, G.A, et al., J. Immunol. Meth. 46 : 113(1981)) 상에서 정제하고(형태학적으로95% 순수함), 세척하고 96웰 편평바닥의 조직 배양판(5×10세포/웰)에 첨가하였다. 37℃에서 60분 배양 후, 비점착 세포를 자동화된 판 세척기에 의해 제거하였다. 점착성 세포를 시각으로 및 호산성 퍼옥시다제, EPO에 대한 비색분석법(Strath, M. et al., J. Immunol. Meth. 83: 209(1985))에 의해 정량하였다. 사람배꼽정맥 내피세포를 분리하고 각 웰내 융합성 단일층으로 배향하고, LPS로 4시간동안 자극시키고 최종적으로 1% 글루타르 알데히드에 고정시켰다(Smith, C.W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746(1988)). 면역복합체 웰을 회충 추출물로 피복하고 이어서 회충 민감성 원숭이로부터의 혈청에 의해 만들었다.

점착은 항 ICAM-1 모노클로날 항체 RR1/1(Rothein, R. et al., J. Immunol. 137:1270(1986); Marlin, S.D. et al., Cell 51: 813 (1987))에 의해 상당히 억제되는 것으로 발견되었다(제6A도). 반대로, 항-HLA 클래스I 조절 모노클로날 항체 W6/32는 또한 HUVECs (Smith, C.W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746(1988)) 에 결합하는데 호산성 점착을 억제하지 않았다(제6A도).

면역복합체 피복된 플라스틱에 영장류 폐 호산성구의 점착은 RR1/1에 의해 억제 되지 않았고(제6B도) 내피세포에의 점착성 억제의 특이성을 증명하였다. 이들 결과는 ICAM-1 이 내피세포에의 호산성 점착에 중요하며 따라서 체내에서 염증 조직으로 호산성 이동에 기여할 수가 있다는 것을 가리킨다.

조직으로의 이동을 위해 요구되는 외에, 백혈구 점착은 세포독성 조직 손상을 위해 필수요소이다. 생체외에서 임파구와 과립구 중재된 살상과 체내에서 동종이식편 거부를 감소시키는 표적세포에의 효과기(effector)의 점착억제가 보고되었다(Martz, E. et al., J. Immunol. 133: 2972 (1984)). 호산성구와 그의 생성물들은 기도 상피세포 박리에 관련되어 있고(Frigas, E. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 77 : 527(1986)) 기도 상피세포 박리는 차례로 기도 과감응성(Laitinen, L.A. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 137 : 62(1988))과 천식증상에 강하게 관련되어 있기 때문에(Hargreave, F.E. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 68 : 347(1981); Boulet, L-P et al., J. Allergy Clin. Immunol. 71: 399(1983); Chan-Yeung, M. et al., Am J. Med. 72: 411(1982); Frigas, E. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 77 : 527(1986)), 생체외에서 기도 상피세포상에서 ICAM-1 유도에 대한 여러 가지 전(pre)-염증성 시토킨의 효과를 조사하였다.

ELISA 분석법(Rothlein R. et al., J. Immunol. 141: 1665(1988))과 항-ICAM-1 모노클로날 항체 RR 1/1 과 R6.5(Smith, C.W. et al., J. Clin. Invest. 82:1746(1988))를 사용하여 인터로이킨-1 bet (IL-1b), 사람의 재조합 종양괴사인자 알파(TNFa), 그리고 사람의 재조합 인터페론 감마(IFNg)로 16 시간 자극은 배양된 원숭이 기관지 상피세포의 단일층상에서 ICAM-1 발현을 향상시켰다(표2).

표2 는 시험관내에서 기관지 상피세포상의 ICAM-1 의 유도에 대한 전-염증성 시토킨의 효과를 나타낸다. 레서스(rhesus)원숭이 기관지 상피 셀라인 4MBr-5(어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 얻은 것) 을 응합성 단일층으로 배양한 다음 IL-1b, TNFa 또는 IFNg 로 16시간동안 자극시켰다 ICAM-1 [모노클로날항체 RR1/1(Rothlein,R. et al., J. Immunol. 137: 1270(1986); Marlin, S. D. et al., Cell 51: 813 (1987)) 과 R6.5 (Smith C.W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746(1988)] 과 LFA-1알파 [모노클로날항체 R3.1 (Rothleln,R, et al., J. Immunol 141: 1665(1988))] 발현에 대한 ELISA 분석을 앞서 기술한대로 수행하였다 (Rothlein, R. et al., J. Immunol. 141: 1665(1988)). 수는 두벌 배양에 대한 광학 밀도단위의 평균(정상의 마우스 감마글로불린 바탕값에 대한 것) 을 나타내며 4개의 개개 실험들을 나타낸다.

향상된 ICAM-1 발현의 시간과정 (표3)은 시험관내에서 HUVECs(Smith, C.W. et al., J. Clin. Invest. 82:1746(1988)) 와 체내에서 사람피부 각질세포(Wantzin G.L. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 20:782(1989) 에 대해 앞서 보고된 것과 유사함이 발견되었다. 예상한 대로, 항-LFA-1 알파 모노클로날 항체 R3.1(Rothlein, R. et al., J. Immunol. 141:1665(1988)) 은 비자극되거나 자극된 기관지 상피세포에 결합하지 않았다 (표2). 이들 결과는 ICAM-1이 체내에서 기도 상피세포의 백혈구 (예를 들면, 호산성구)중재된 박리에 기여할 수 있음을 제안한다.

표 3은 시험관내에서 기관지 상피세포상의 ICAM-1의 유발에 대한 시간과정을 나 타낸다. 레서스 원숭이 기관지 상피 셀라인 4MBr-5(어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에서 얻은 것) 을 융합성 단일 충으로 배양한 다음 IL-1b(10ng/㎖) 또는 IFNg(10단위/㎖)로 여러가지 시간동안 자극시켰다. ICAM-1 발현 [모노클로날 항체 R6.5(Smith, C.W. et al., J. Clin. Invest. 82:1746(1988)] 에 대한 ELISA 분석을 상기한 바와 같이 수행하였다(Rothlein, R. et al., J. Immunol. 141:1665(1988)). 수는 3벌 배양에 대한 광학밀도 단위의 평균 (정상의 마우스 감마 글로불린 바탕값 에 대한 것) 을 나타내며 두개의 개개 실험들을 나타낸다.

[실시예 3]

[체내에서 박리(desqamation)에 대한 ICAM-1의 기여]

체내에서 기도 상피세포의 호산성 중재된 박리에 기여하는 ICAM-1의 능력을 더 조사하기 위해, 면역조직화학적 염색을 행하여 항원의 수회흡입이 체내에서 기도 상피세포상의 ICAM-1 발현을 유발하는지 측정하였다.

앞서 기술된 프로토콜(Wantzin, G.L. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 20:782(1989))의 수정안을 사용하여 조직을 염색하였다. 간단히, 조직 견본을 제거하고 액체질소에서 동결시켰다. 저온 절개후, 5-10 마이크론의 절편들을 10분간 아세톤에 고정시키고 즉시 염색하거나 -20℃에서 보관하였다. 염색은 제품 프로토콜(BioGenex, CA)에 따라 Biotein-Strept Avidin System 킷트(Biotein-Strept Avidin System kit)를 사용하여 수행하였다. 주로 항체는 희석되지 않은 배양 상등액(10% FBS를 가진 RPMI 1640 배지)으로서 조직과 함께 실온에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 정상의 염소 혈청을 적용시킴으로써 비특이적 단백질 결합에 대한 블로킹을 달성하였다. AEC(3-아미노-9-에틸카바졸)를 기질로서 사용하고 절편들을 메이어(Mayer)의 헤마토크실린으로 역염색시켰다.

ICAM-1에 대한 강한 염색은 3회 격일 회충흡입의 세번째 흡입 20분후 회충항원 민감성 원숭이로부터 취한 기관 절편의 상피세포(기측부만) 상에서와 혈관 내피세포상에서 모두 발견되었다. 기도 상피세포상에서 (표2)가 아닌 LFA-1 알파에 대한 염색(Anderson, D.C et al., J. Inf. Dis. 152:668(1985); Anderson, D.C. et al., Ann. Rev. Med. 38:175(1987); Todd, R.F. et al., Hematol./Oncol. Clinics. N. Amer. 2:13(1988))은 피 기저막 바로 아래에 가장 현저한 것으로.나타난 사이조직에서 백혈구 침윤을 나타내었다. 또한 ICAM-1 염색이 가장 현저한 상피세포의 기측부(basilateral portion)에서 주로 상피세포들 사이에 현저하였다. 마우스 혈청을 사용해서는 비특이적 염색이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. 회충의 1회 흡입 20분후 회충-민감성 원숭이로부터 취한 기관 절편에서 염색(ICAM-1, LFA-1 알파 및 마우스 혈청을 사용한 것) 이 발현에 요구되는 시간을 기준으로 예상된 대로 나타났고 (표 3과 문헌 Wantzin, G.L. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 20:782(1989) ; Smith, C.W. et al., J. Clin. Invest. 82:1746(1988) 참조, 이 문헌들은 여기에 참고로 포함된다), ICAM-1 염색은 이 절편의 상피세포 또는 혈관 내피세포에서 거의 또는 전혀 발견되지 않았다.

게다가, 백혈구 침윤의 포켓(pokects)이 발견되었을지라도, 백혈구는 상피 기저막 바로 아래에 축적되지 않았고 상피세포들 사이에서 발견되지 않았다. 따라서, 이들 면역조직화학적 염색 결과는 또한 ICAM-1 의존 호산성 상피세포 상호작용이 천식환자에서 발견된 기도내피세포의 박리에 기여할 수도 있다는 것을 제안한다.

[실시예 4]

[천식에 대한 ICAM-1의 체내에서의 효과]

시험관내에서의 상기한 면역조직화학적 프로토콜을 사용한 기도 과감응성과 천식의 병인론에서의 ICAM-1에 대한 효능있는 역할을 입증한후, 항 ICAM-1 항체의 체내에서의 효과를 조사하였다. 이들 연구를 위해, 천식 동물모델을 사용하였다. 어떤 포유동물로도 모델이 사용될 수 있으나 모델에 영장류를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 천식 에피소드를 유발하기 위해, 항원의 흡입을 3회 격일로 원숭이에게 제공하였다. 이 방법은 원숭이에서 흡입된 메타콜린에의 기도 감응정의 지속적(보통 8배 이상) 증가를 유도하였다(Wegner, C.D. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 139:A324(1989), 이 문헌은 참고로 여기에 포함된다). 기도 감응성의 이 증가는 강한 호산성 침윤에 의해 선행되며 꽃가루 계절동안(Boulet, L-P et al., J. Allergy Clin. Immunol. 71:399(1983) ; Sotomayer, H. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 130:56(1984)) 또는 직업상 알레르겐에 연속노출시(Chan-Yeung, M. et al., Am. J. Med. 72:(1982) ; Lam, S. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 72:134(1983) ; Lam, S. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 63:28(1979)) 천식환자에서 유도된 것과 크기에 있어서 유사하다. 메타콜린의 대신으로, 히스타민 또는 다른 유사한 화합물과 메타콜린 대등물이 사용될 수 있다.

이 동물모델을 사용하여, 호산상 침윤과 기도 과감응성의 유도에 대한 항 ICAM-1 모노클로날 항체 R6.5의 효과를 조사하였다.

모델에 따르면, 기도 세포 조성물파 기도 감응성을 항원의 3회 격일 (제 3, 5 및 7일) 흡입에 3일 앞서서 (제0일)와 3일 후(제10일)에 측정하였다(Wegner, C. D. et al., Am. Rev. Respir. Dis 139:A324(1989)).

기관지 세포 조성물은 기관지 폐포 세척(BAL) 에 의해 측정하였다.

기도 감응성은 호흡기계 저항의 100% 증가를 일으킨 흡입된 메타콜린의 농도(PC)를 구함으로써 측정하였다.

R6.5는 제2일-제9일에 1일 1.76㎎/㎏으로 정맥내 투여하였다. R6.5 처리로 한 연구를 각 동물에서 수행한 괄호친 대조군 연구와 비교하였다.

R6.5 (항 ICAM-1) 처리는 모든 5마리 동물들의 연구에서 호산성 침윤을 저하시켰다.(제7a도) 기도 감응성의 증가 (흡입된 메타콜린 PC의 감소) 는 또한 모든 5마리 동물들에서, 현저하게는 4마리 동물들에서 억제되었다(제7b도). 놀랍게도, 2마리 동물들(c 및 d)에서 기도 감응성은 증가되지 않았을 뿐만 아니라(대조군 연구에서와 같음) 항원의 수회흡입에도 불구하고 R6.5 처리로 사실상 감소 (메타콜린 PC증가)되어 이들 동물들에서 높아진 기본 기도 감응성의 역전을 증명하였다.

요약하면, 이들 결과는 ICAM-1이 체내에서 만성 염증의 기관혈관 내피세포상에서 선택적으로 유도된다는 것과, ICAM-1은 시험관내에서 혈관 내피세포에의 호산성 점착에 기여하며, 항 ICAM-1 모노클로날 항체는 체내에서 흡입된 항원 유발된 호산성, 침윤을 저하시킴을 증명한다. 더 나아가서, ICAM-1 발현은 시험관내에서 시토킨 자극된 기도 상피세포상에서 유도되며 체내에서 만성염증의 기관지 상피세포상에서 선택적으로 유도되어 ICAM-1은 체내에서 기도상피세포 박리에 기여할 수 있다는 것을 가리킨다. 항 ICAM-1 모노클로날 항체는 원숭이에서 항원의 수회흡입에 의해 유도된 기도 감응성의 증가를 억제할 수 있었다.

이들 결과는 ICAM-1이 기도 과감응성과 천식의 병인론에서 중추적 역할을 한다는 것을 가리킨다. ICAM-1은 마찬가지로 기도염증 [예를들면 만성기관지염, 폐기종, 자발성 폐섬유종 등(Guenter, C. A. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 129:850(1984) ; Hunninghake, G.W. et al., Am. J. Pathol. 97:149(1979) ; Hunninghake, G. W. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 123:407(1981))] 또는 호산성 침윤과 조직 민감화/파괴[예를들면, 코카타르, 코식육증, 만성 두드러기 및 과민성 피부염(Mygind, N., Allergy 34:195(1979) ; Mullarkey, M. F. et al., J. Allergy Clin, Immunol. 65:122(1980) ; Paters, M. S. et al., J. Invest. Dermatol. 81:39(1983) ; Leiferman, K. M. et al., N. Engl. J. Med. 313:282(1985) ; Spry, C. J. F et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77:252(1985))]에 의해 특징지어지는 다른 질환들의 개시 및 진행에 기여한다. 따라서, 이러한 세포 점착을 예방 또는 저하시키는 약제는 그것들이 천식을 치료하는데 사용되는 것과 같은 방법으로 이들 질환의 치료에 사용될 수 있다.

[실시예 5]

[원숭이에서 기도 감응성에 대한 항원의 1회 및 수회 흡입의 영향]

동물에서 (Lanes, 5, et al., J. Appl. Physiol. 61:864-872(1986), Marsh, W. R. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 131:875-879(1985))와 또한 사람에서(Cartier, A. et al., J. Allergy clin. Immunol. 70:170-177(1982), Cockcroft, D.W. etal., Clinical Allergy 7:503-513(1977)), 알레르겐의 1회 흡입은 기도 감응성의 온화한(2-6배) 증가를 일으킬 수 있다. 꽃가루 계절의 동안에 (Boulet, L.-P. et al., J. Allergy. Clin. Immunol. 71:399-406(1983), Sotomayor, H. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 130:56-58(1984)) 또는 직업상 환경에서 (Chan-Yeung, M. et al., Amer. J. Med. 72:411-415(1982), Lam, S et al., J. Allergy Clin. Immunol. 72:134-139(1983), Lam, S. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 63:28-34(1979)), 사람에게서 일어나는 것들과 같은 반복된 알레르겐 노출은 기도 감응성에 있어서 더 큰 (종종 ±10배) 증가를 일으키는 것으로 보고되었다.

항원 피복된 비이드의 수회(매주 4회) 주입은 원숭이에서 기도 감응성의 10배 증가를 유발하였다(Gundel, R.H. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. (1989)이 문헌은 여기에 참고로 포함된다).

유용한 동물 천식모델을 더욱 개발하기 위하여 원숭이에서 흡입된 메타콜린에의 기도 감응성에 대한 1회 및 수회 항원흡입의 영향을 조사하였다. 기도염증(Marsh, W.R. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 131:875-879(1985), Sotomayor, H. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 131:875-58(1984), Lazarus, S., Amer. J. Med. 81:2-7(1986), O'Byrne, P. M., Chest 90:575-577(1986)), 특히 호산성 침윤(Gundel, R.H. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. (1989), DeMonchy, J. G. R. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 131:373-376(1985), Wardlaw, A. J. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 137:62-69(1988))은 기도 과감응성의 병인론에서 역할을 하는 것으로 가정되었기 때문에 기도 세포 조성물을 동시에 조사하였다.

이들 영향을 조사하기 위하여 4.6 내지 8.2㎏ 체중의 7마리의 성장한 수컷 협비 원류 원숭이(Macaca fascicularls, Charles River Primate Imports, Port Washington, NY)를 연구하였다.

모든 동물들은 흡입된 돼지 회충(Ascaris suum) 추출물에 대한 천연발생의 재발생인 호흡기 민감성을 입증하였다. 동물들을 연구하고 케타민 염산염(1㎎/㎏, 근육내 ; Ketaset, Bristol Laboratories)과 크실아진(4㎎/㎏, 근육내; Rompun, Miles Laboratories, Inc)으로 마취시키고 커프스달린 기관내 관(5.5㎜ ID ; Mallinckrodt Critical Care, cat #86048)을 삽입시키고 특별히 설계된 지지 의자에 수직위치로 앉혔다. 케타민(4㎎/㎏, 근육내)만을 필요한만큼 마취제를 보충하기 위해 사용하였다.

기도 감응성(메타콜린 PC/_10100//11)과 이어서 기도 세포조성(BAL)을 회충 추출물의 1회 흡입에 하루 앞서서와 20시간 후 또는 회충 추출물의 3회 격일로(제3, 5 및 7일)흡입에 3일 앞서서(제0일) 와 3일 후(제10일)에 측정하였다. 모든 7마리 동물들을 두 프로토콜로 연구하였다. 결과의 표시를 위해 각 동물에 글자표시를 하였다.

천식환자에서, 기도 감응성의 최고증가가 알레르겐 면역반응의 항원투여후 3 내지 24시간에 일어난다(Carrier, A. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 70:170-177(1982), Cockcroft, D. W. et al., Clinical Allergy 7:503-513(1977), Durham, S. R. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 79:398-406(1987)). 따라서, 기도 과감응성은 항원의 1회 흡입 24시간 후 측정하였다.

그러나, 6일 간격에서 4번째에 각 동물을 마취시키는 것을 피하기 위해, 항원의 수회흡입 24시간후 기도 감응성을 측정하지 않았다. 대신에, 항원의 수회흡입 3일 후 기도 감응성을 측정하였다. 기도염증(즉, 호산성 침윤)은 항원흡입 3일후 여전히 지속함을 발견하였다(Weaner, C. D. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 135:A221(1987), 이 문헌은 여기에 참고로 포함된다).

돼지 회충(Ascaris suum) 추출물(Greer Laboratories, cat #B-33)을 연구에 있어서 항원으로 사용하였다. 추출물을 인산염 완충된 (5mM, pH7.4) 식염수(0.5%)(PBS)에서 희석시키고 압축공기분무시키고(Bird Micronebulizer, model 8158) 대략 2분내에 20㎝ H O로 30회 흡입으로 구성되는 간헐적 양압(Positive pressure) 불어넣기(Bird Mark 7A Respirator)에 의해 투여하였다. 각 동물에 대해, 호흡기 시스템 저항에 있어서 재현적인 150 내지 300% 급격 증가를 일으킨 사전 결정된 농도의 회충 추출물을 사용하였다. 메타콜린 면역반응의 항원투여를 동일한 방법으로 수행하되 그것들은 단지 1분에 15회 불어 넣기로 구성되었다.

호흡기 시스템 임피던스(Zrs)를 웨그너(Weaner, C. D. et al., Respir. Physiol. 55:47-61(1983), 이 문헌은 여기에 참고로 포함된다)에 의해 기술된 바와 같이 주기적 불어넣기 때 겹쳐진 분리된 주파수 (11개의 같은 대수 단계에서 4-40Hz) 정현파 강제 진동들에 의해 측정하였다. 그다음 주파수 범위에 걸쳐 실제 또는 위상내 성분의 평균을 산정하여 호흡기계저항(Rrs)의 단일값 표시를 제공하였다. Rrs는 각 항원면역반응의 항원투여 3, 7, 10, 15, 20 및 30분 후에서와 각 메타콜린 면역반응의 항원투여 1 및 3분 후에서 측정하였다.

기도 감응성은 Rrs에 있어서 100% 증가(PC)를 유도한 분무되고 흡입된 메타콜린의 농도를 구함으로써 산정되었다. 이것은 기저선으로부터 Rrs에 있어서 100% 이상 증가가 얻어질 때까지 반-대수단계(7분 간격으로)에서 증가하는 농도의 메타콜린(PBS로 희석됨)을 투여함으로써 달성되었다. 다음에 PC을 대수 메타콜린 농도 대 Rrs 도시에 있어서 퍼센트 증가상에서 적어도 둘 또는 세 지점의 선형회귀분석에 의해 계산하였다.

기도 세포조성물을 기관지 폐포 세척(BAL)에 의해 분석하였다. 소아과 섬유광학 기관지경(Olympus Corporation, model BF-3C4)을 그것이 전형적으로 제5 내지 제7 세 기관지로 쐐기고정될 때까지 용골을 지나 안내하였다. 그다음 단일의 15㎖ 알리 의 중탄산염 완충된(0.5mM) 보통 식염수(pH 7.4)를 기관지경내 채널을 통해 주입하고 온화하게 흡인시켰다(복귀부피가 7 내지 10㎖에 이름). BAL의 총 백혈구/㎖를 쿨터 계수기(Coulter Electronics, model Z)를 사용하여 측정하였다. 미분세포계수(총 200개 세포가 계수됨)를 라이트 지엠사(Wright-Giemsa) 변형된 세포원심분리기(Shandon Cytospin, 모델 2) 제제상에서 수행하였다 후속 BAL 측정에서 앞의 BAL의 영향을 방지하기 위해, 면역반응의 창원투여에 앞서서와 후에 수행되는 BAL을 폐의 양쪽에서 행하였다.

변화의 분석은 파라미터없는 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험 (카이스퀘어 근사)을 사용하여 수행하였다. 상관성은 변수의 페어슨 생성물-모멘트 및 스페어맨 등급을 사용하여 수행하였다. 0.05의 p값은 중요하지 않은 것으로 생각되었다.

항원의 1회흡입은 면역반응의 항원투여후 10-15분후 피크를 이룬 Rrs(307±62%)의 급격한 증가, 기도 백혈구의 증가(267±19 내지 694±142×10/㎖ BAL, pX=0.018)와 두 동물에 있어서는 중간(8배)인 3마리 동물들에서 메타콜린 PC의 감소를 일으켰다 (제8a도). 기도 백혈구의 증가는 모든 동물에서 호산성구(제8b도), 3마리 동물에서 호중성구(제8c도), 5마리 동물에서 대식세포/ 단구(제8d도) 및 4마리 동물에서 임파구(제8e도)의 흡입으로 구성되었다. 기도 감응성 (메타콜린 PC)의 변화의 크기 및 방향은 Rrs에서 급격증가의 강도 또는 어떤 백혈구 아형의 침윤의 크기/ 존재와 상관되지 않았다.

항원의 수회흡입은 Rrs에 있어서 급격한 증가 (각각 178±48%, 380±83% 및 331±63%)와, 기도 백혈구의 증가(209±42 내지 553±129×10/㎖ BAL, pX=0.0088) 그리고 두마리에서는 중간(8배)이며 3마리에서는 심각한(80배) 모두 7마리 동물에서 메타콜린 PC/_10100//11의 감소를 일으켰다 (제9a도). 기도 백혈구의 증가는 현저한 호산성구 침윤(제9b도)과 호중성구의 약간의 침윤(8.5±2.6 내지 31.0±7.5×103/㎖ BAL, p X= 0.010)으로 구성되었다.

대식세포/단구(179±36 내지 209±40×103/㎖ BAL) 또는 임파구(3.0±1.2 내지 3.0± 1.3×103/㎖ BAL)의 중요한 침윤은 없었다. 기도 반응성의 증가(PC의 감소)의 크기는 호산성 침윤이나 항원의 1회 흡입에 의해 유도된 기도반응성(PC)에 있어서 변화의 크기/방향과 상관되지 않았다.

축약의 정의 : Log.=대수 기수 10; PC₁₀₀=Rrs의 100% 증가를 일으키는데 요구되는 메타콜린의 유발농도 Rrs=호흡기계저항, BAL=기관지 폐포세척; Eosin=호산성구; Neut=호중성구, Mac./Mono.=대식세포/단구;Lympho=임파구.

^*중요한 상관관계가 발견되지 않았다.

축약의 정의: Log.=대수 기수 10; PC₁₀₀=호흡기계저항의 100% 증가를 일으키는데 요구되는 메타콜린의 유발농도; BAL=기관지 폐포 세척

^*중요한 상관관계가 발견되지 않았다.

이들 실험은 흡입된 히스타민, 메타콜린, 운동 또는 찬공기에 대한 기도의 감응성에 의해 임상적으로 산정된 바와 같이 비특이적 기도 과감응성은 천식의 특징임을 증명한다(Boushey, H. A. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 121:389-413(1980), Hargrave, F. E. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 68:347-355(1981)). 기도 과감응성의 병인론의 기초가 되는 메카니즘은 알려져 있지 않은 한편, 많은 연구들로부터의 결과는 백혈구 침윤(Gundel, R.H. et al., Amer. Rev. Respir. Dis.(1989), Marsh, W.R. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 131:875-879(1985), Lazarus, S., Amer. J. Med. 81:2-7(1986), O'Byrne, P.M., Chest 90:575-577(1986), DeMonchy J. G. R et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 131:373-376(1985), Wardlaw, A. J. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 137:62-69(1988), Metzger, W.J. et al., Chest 89:477-483(1986)) 및/ 또는 내재 하거나 또는 침윤하는 세포들에 의해 방출된 중재자(Lanes, 5. et al., J. Appl. Physiol. 61:864-872(1986), Lazarus, S., Amer. J. Med. 81:2-7(1986) O'Byrne, P.M., Chest 90:575-577(1986), Wardlaw, A. J. et al., Amer. Rev. Respir. Dis, 137:62-69(1988), Aizawa, H. et at., J. Appl. Physiol. 59:1918-1923(1985), O'Byrne, P.M. et al., Prostaglandins 4: 537-543(1984), Schulman, E. S., Chest 90:578-586(1986))를 수반한다고 제안한다.

항원흡입은 급성 호중성 및 더 만성의 호산성 기도 침윤을 유도하는 것으로 공지되어 있다(Wagner, C. D. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 135:A22l(1987)). 만성 자발성 기도 호산구증가증은 심한(80배) 기도 과감응성과 관련됨이 발견되었다.(Wegner, C. D. et al., Amer. Rev. Respir. Dis. 135:A222(1987)). 항원피복된 비이드의 수회(매주 4회) 기관내 주입은 기도 호산성구 및 감응성의 현저한 증가(8배)를 유발함이 발견되었다 (Gundel. R.H. et al., Amer. Rev. Respir. Dis.(1989)). 위에 제공된 실험들은 알레르기 원숭이에서 기도 과감응성 및 백혈구 조성에 대한 돼지 회충 추출물의 1회 대 수회(격일로 3회) 흡입의 영향의 비교를 제공한다.

항원의 1회 흡입은 급성 기관지 수축과 20시간후 측정한 바 두마리에서는 중간인(8배) 7마리 동물 중 3마리에서 기도 감응성의 증가 (흡입된 메타콜린 PC₁₀₀의 감소)뿐만 아니라 백혈구 (주로 가장 일치하게 호산성구)의 침윤을 가져왔다. 그것들이 일어난 주파수 뿐만 아니라 이들 효과는 사람에 대해 보고된 것과 유사하다.

즉, 알레르기 천식환자에서 항원의 1회 흡입은 지배적으로 호산성인 백혈구 침윤(DeMonchy, J. G. R et al., Amer. Rev. Respir. Dis 131:373-376(1985))과 몇 개체들의 기도 감응성의 증가(보통 온화함, 〈8배)를 유도한다 (Cattier, A. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 70:170-177)1982), Cockcroft, D. W. et al., Clinical Allergy 7:503-513(1977)).

반대로, 항원의 수회흡입은 마지막 면역반응의 항원투여 3일후 분석한 바와같이, 두 마리는 중간이고(〉8배) 3마리에서는 심한(〉80배) 모두 7마리 원숭이에서 기동감응성의 증가를 유도하였다. 이들 효과는 사람에 대해 보고된 것과 또한 일치한다. 꽃가루 계절의 동안에 알레르기 천식환자의 기도감응성은 정도는 다양할지라도 모든 개체에서 증가하는 것으로 보고되었다(Boulet, L. -P. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 71:399-406(1983), Sotomayor, H. et al., Amer. Rev. ResBir. Dis. 130:56-58(1984)) 마찬가지로, 직업상 알레르겐에 반복된 노출은 민감한 개체들에서 기도감응성을 증가시키는 것으로 나타났다(Chan-Young M., et al., Amer. J. Med. 72:411-415(1982), Lam. S. et al., J. Allergy Clin. Immunol, 72:134-139(1983), Lam, S. et al,. J. Allergy Clin. Immunol. 63:28-34(1979)).

항원 프로토콜의 1회 및 수회 흡입 모두에서, 기도 감응성의 변화의 크기/방향은 백혈구 침윤의 강도와 상관되지 않았다. 이 발견은 백혈구 침윤만으로는 기도 과반응성의 병인론에 직접적 수반을 초래하기에 충분하지 못함을 강조한다. 도리어, 침윤하고 내재하는 세포들 (예를들면, 호산성구 및 기도상피세포) 간에 일어나는 상호작용 뿐만 아니라 침윤하고 내재하는 세포들에 의해 방출된 중재자의 양 및 유형 (자극제 또는 억제제) 은 중요한 요인들이다.

요약하면, 천식환자에 대해 앞서 보고된 대로, 항원의 수회(1회가 아님)흡입은 원숭이에서 기도 감응성의 지속적인 증가(보통 8배)를 유발한다. 이 발견은 이 동물모델이 천식의 치료법을 제공할 수 있는 약제를 스크리닝 및 검출(Identify)하는데 사용될 수 있음을 가리킨다.

본 발명을 특정 구체예와 관련하여 기술하였으나, 더 이상의 수정을 할 수 있으며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르는 발명의 어떤 변동, 사용 또는 개작을 커버함을 의도하며 본 명세서로부터 이러한 이탈은 본 발명이 속하는 분야의 공지 또는 관행안에 오며 첨부된 청구범위에서 다음과 같이 지금까지 제안된 필수 특징들에 적용될 수 있음을 포함한다.

Claims

ICAM-1에 결합할 수 있는 항체 또는 ICAM-1에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 천식 치료제.
제2항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 모노클로날 항체 R6.5인 것을 특징으로 하는 천식치료제.
천연오염물질이 없는 ICAM-1을 포함하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
ICAM-1의 기능성 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제5항에 있어서, 상기 기능성 유도체가 ICAM-1 도메인 1을 함유하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제5항에 있어서, 상기 기능성 유도체가 ICAM-1 도메인 2를 함유하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제5항에 있어서, 상기 기능성 유도체가 ICAM-1의 용해성 유도체인 것을 특징으로 하는 천식치료제.
당단백질의 CD18족의 멤버에 결합할 수 있는 상기 항체의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제9항에 있어서, 상기 항체는 상기 당단백질의 CD18족의 멤버의 알파 서브유니트에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제9항에 있어서, 상기 항체는 상기 당단백질의 CD18족의 멤버의 베 타 서브유니트에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
천연오염물질이 없는 당단백질의 CD18족의 멤버를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제12항에 있어서, 상기 당단백질의 CD18족의 멤버는 당단백질의 CD18족의 멤버의 알파 서브유니트를 함유하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제12항에 있어서, 상기 당단백질의 CD18족의 멤버는 당단백질의 CD18족의 멤버의 베타 서브유니트를 함유하는 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제12항에 있어서, 상기 당단백질의 CD18족의 멤버는 당단백질의 CD18족의 멤버의 알파 및 베타 서브유니트를 둘 다 함유하는 헤테로이량체인 것을 특징으로 하는 천식치료제.
제12항에 있어서, 상기 치료제는 당단백질의 CD18족의 멤버의 기능성 유도체인 것을 특징으로 하는 천식치료제.
항원의 수회 흡입을 받은 인간을 제외한 포유동물에 약제를 투여하고 상기 포유동물의 기도감응성에서의 증가를 측정하는 것으로 이루어지는 천식의 치료에 치료학적 효능이 있는 약제를 감별하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 포유동물에서 기도 감응성의 증가를 메타콜린 또는 히스타민으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.