HU216313B - Eljárás asztma kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás asztma kezelésére alkalmasgyógyszerkészítmények előállítására, őly módőn, hőgy hatóanyagkéntvalamely következő szert a) ICAM-1 megkötésére alkalmas antitest; b)az előző, a) pőnt szerinti antitestfragmens, amely képes ICAM-1megkötésére; c) természetes szennyeződésektől lényegében mentes ICAM-1; d) ICAM-1 fűnkciőnális származéka; e) a glikőprőteinek CD18családjának valamely tagjáhőz kötődni képes antitest; f) az előző, e)pőnt szerinti antitest fragmense, amely fragmens a glikőprőteinek CD18családjának valamely tagjáhőz kötődni képes; g) a glikőprőteinek CD18családjának valamely tagja, amely lényegében természetesszennyeződésektől mentes; és vagy h) a glikőprőteinek CD18 családjavalamely tagjának fűnkciőnális származéka a gyógyszerészetben szőkásőshőrdőzóanyagőkkal elkevernek és adagőlásra alkalmas készítménnyéalakítanak. ŕ

Description

A találmány sejtközti adhéziós molekulák, így például ICAM-1 alkalmazására vonatkozik asztma gyógyítására. A találmány vonatkozik továbbá az ilyen sejtközti adhéziós molekulákat megkötni képes ligandumokra, továbbá asztma kezelésénél hatásos szerek kimutatására szolgáló vizsgálati eljárásra.

A. Sejtközti adhézió

A leukocitáknak a sejtszubsztrátumhoz kell tudni kötődni annak érdekében, hogy a szervezetet idegen fertőzések, így például baktériumok vagy vírusok által okozott fertőzések ellen megvédje. E védelmi rendszer kiváló összefoglaló ismertetése található például a következő irodalmi helyen: (Microbiology, 3. kiadás, Harper & Row, Philadelphia, PA [1980], 290-295 és 381-418). A leukociták képesek kell, hogy legyenek továbbá az endoteliális sejtekhez való kapcsolódásra is, hogy lehetővé tegyék a keringési rendszerből a meglévő gyulladásos helyre való migrációjukat. Továbbá, kell, hogy kapcsolódni tudjanak az antigént tartalmazó sejtekhez is, hogy normál specifikus immunválasz következzen be, végül kapcsolódni kell, hogy tudjanak a megfelelő célsejthez is, hogy a vírussal fertőzött vagy tumoros sejt lízise bekövetkezhessen.

A leukocita felületi molekulákat, amelyek az ilyen kapcsolódást közvetítik, hibridóma technikával azonosították. Megállapították, hogy monoklonális antitestek (MAb), amelyek a humán T-sejtek ellen irányulnak (Davignon, D. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4535-4539 [1981]) és az egér lépsejtek (Springer, T. és munkatársai, Eur. Immunoi. 9: 301-306 [1979]) a leukocita felülethez kötődnek és gátolják a fentiek szerinti funkciós részek kapcsolódását (Springer, T. és munkatársai, Fed. Prodc. 44: 2660-2663 [1985]). Az ilyen antitestekkel azonosított molekulákat Mac-1 és „Lymphocyte Function associated Antigén-1” (LFA-1) néven ismerjük. Az Mac-1 megtalálható a makrofágokban, a granulocitákban és a nagyszemcsés (sarjadzó) limfocitákban. Az LFA-1 megtalálható a legtöbb limfocitában (Springer, T. és munkatársai, Immunoi. Rév. 68: 111-135 [1982]). Ez a két molekula, valamint egy harmadik molekula a pl50,95 (amelynek szöveteloszlása hasonló az Mac-1-éhez) szerepet játszanak a sejtközi adhézióban (Kreizer, G. és munkatársai, Eur. J. Immunoi. 15: 1142-1147 [1985]). Azokat a molekulákat, például az LFA-1 családhoz tartozó molekulákat, amelyek részt vesznek a sejtközti adhézióban, adhéziós molekuláknak nevezzük.

A fentiek szerinti leukocitamolekulákról megállapították, hogy szerkezetük egymáshoz hasonló, és hasonlóak a glikoproteinek rokon famíliáját alkotó tagokhoz (Sanchez-Madrid, F. és munkatársai, J. Exper. Med. 158: 1785-1803 [1983]). Ez a glikoproteincsalád heterodimerekből áll, amelyek egy α-alegységet és egy β-alegységet tartalmaznak. Bár mindegyik antigén α-alegysége egymástól különbözik, a B-alegységről megállapították, hogy jelentős mértékben konzerváltak (Sanchez-Madrid, F. és munkatársai, J. Exper. Med, 158: 1785-1803 [1983]). A glikoproteincsalád B-alegysége („CD 18” családként nevezik) 95 kd molekulatömegű, míg az α-alegységek molekulatömege 150 kd és 180 kd között változik (Springer, T. Fed. Proc. 44: 2660-2663 [1985]). Bár a membrán proteinek «-alegységeinek nincs része a nagy kiteijedésű homológiában, amelyet a B-alegységek hoznak létre, a glikoproteinek α-alegységeinek részletes vizsgálata kimutatta, hogy lényeges hasonlatosság van közöttük. Az LFA-1 rokon glikoproteinek a- és B-alegységei közötti hasonlatosságot részletesen Sanchez-Madrid és munkatársai írták le (J. Exper. Med. 158: 1785-1803 [1983]).

Egyének csoportját azonosították, akiknek leukocitái képtelenek ezen adhéziós proteincsalád bármelyik tagjának normál mennyiségét kifejezni a leukociták sejtfelületén (Anderson, D. C. és munkatársai, Fed. Proc. 44: 2671-2677 [1985]; Anderson D. C. és munkatársai, J. Infect. Dis. 152: 668-689 [1985]). Ezt a tünetet „Leukocyte Adhesion Defíciency” vagy „LAD” szindrómaként ismerik. Az ilyen betegek leukocitái in vitro hiányosságokat mutattak, hasonlóan olyan normál megfelelőikhez, melyeknek CD 18 családhoz tartozó molekuláit antitestekkel antagonizálták. Továbbá ezek a betegek képtelenek normál immunválasz adására annak következtében, hogy sejtjeik nem képesek a celluláris szubsztrátumhoz kötődni (Anderson, D. C. és munkatársai, Fed. Proc. 44: 2671-2677 [1985]; Anderson, D. C. és munkatársai, J. Infect. Dis. 152: 668-689 [1985]). Az LAD-betegek klinikai tünetei: késleltetett köldökzsinór-elválasztás, kiújuló és súlyosbodó lágyszövetfertőzések, valamint rendellenes gennyképződés, az erős leukocitózis ellenére. Az LAD-betegek tanulmányozása során megállapították, hogy az immunreakciók csökkennek, ha a limfociták nem képesek normál módon kötődni a CD 18 család funkcionális adhéziós molekuláinak hiánya következtében.

Összefoglalva tehát, ahhoz, hogy a limfociták, különösen a leukociták képesek legyenek az állatok egészségét és életképességét fenntartani, szükséges, hogy képesek legyenek más sejtekhez (így például endoteliális sejtekhez) való kötődésre. Ehhez a kötődéshez sejt-sejt kapcsolat szükséges, amelyhez viszont a limfociták sejtfelszínén specifikus receptormolekulák jelenléte kell. Ezek a receptorok lehetővé teszik, hogy a limfociták más limfocitákhoz vagy endoteliális vagy más nemvaszkuláris sejtekhez kötődjenek. A sejtfelületi receptormolekulákról megállapították, hogy igen hasonlóak egymáshoz. Azok a betegek, akiknek limfocitái nem tartalmaznak ilyen sejtfelszíni receptormolekulákat, hibás antitestválaszt, krónikus és kiújuló fertőzéseket, valamint más egyéb klinikai tüneteket mutatnak.

B. Asztma: klinikai jellemzők

Az asztma a betegségek egy igen heterogén családja. Jellemző rá a különböző hatásokra bekövetkező légcsőhörgő-túlérzékenység (McFadden, E. R. és munkatársai, Harrison’s Principles of International Medicine, 10. kiadás, Petersdorf, R. G. és munkatársai, kiadó McGrawHill, NY [1983], 1512-1519; Kay, A. B. Allergy and Inflammation, Academic Press, NY [1987]). Klinikailag az asztma a légcsőhörgő jelentős, kiteijedt szűkületével, ragadós váladékképződéssel, nehézlégzéses rohamokkal, köhögéssel és zihálással jelentkezik. Bár ezen tünetek egymáshoz viszonyított eloszlása nem ismeretes, a végeredmény a légúti ellenállás megnövekedése, a tüdő és a mellkas jelentős tágulása, a légcsere és a pulmonáris véráram abnormális eloszlása. A betegség az akut szimptómák véletlenszerű periódusaiban jelentkezik, amelyeket tünetmentes periódusok szakítanak meg. Az akut periódusok hypoxiát eredményeznek, amely végzetes lehet. A Föld lakosságának körülbelül 3%-a szenved ebben a betegségben.

Az asztmának két típusa ismeretes, úgymint az allergiás asztma és az idioszinkráziás asztma. Az allergiás asztmát általában örökletes allergiás betegségek, így például nátha, csalánkiütés, ekcéma stb. kísérik. A tünetek: hólyagos-bőrpirosodás a levegőben lévő antigénekre (így például virágpor, környezeti vagy foglalkozási szennyező anyagok stb.) és az IgE megnövekedett szérumszintje. Allergiás asztma sok beteg esetében feltehetően ok-okozati összefüggésben van az IgE antitestek jelenlétével. Azokat az asztmás betegeket, akik nem mutatják az említett jellemzőket idioszinkráziás asztmabetegeknek tekintjük.

Úgy gondolják, hogy az allergiás asztma függ a Tés B-limfocitákkal szabályozott IgE-választól és a levegőben lévő antigének és a fehérvérsejthez kötött előformált IgE molekulák közötti kölcsönhatás révén aktivizálódik. Az antigéntalálkozás olyan koncentrációnál kell, hogy bekövetkezzen, amely elegendő, hogy hosszabb időn át IgE-képződés történjen, amelynek következtében az egyén érzékennyé válik. Ha ez az érzékennyé válás bekövetkezett, az asztmás beteg tünetei előjönnek, az antigén különösen alacsony szintjének következtében.

Az asztmás tünetek súlyosbodhatnak a kiváltó antigén jelenlétében, valamint annak szintjétől függően, továbbá a tünetek fokozódását okozhatják különböző környezeti, valamint foglalkozási faktorok, fizikai megerőltetés, valamint stresszhatások.

Az asztma kezelésére alkalmasak például metilxantinek, így például teofilin, B-adrenergiás agonisták, így például katekol-aminok, rezorcinok, szaligeninek és efedrin, glikokortikoidok, így például hidrokortizon, fehérvérsejt-kicsapódást gátló szerek, így például kromének, így például kromolin-nátriumsó, valamint antikolinergikumok, így például atropin.

C. Asztma: immunológiai jellemzők

Az asztmás betegség során eozinofil sejtek áramlanak a tüdőszövetbe („eozinofilia”, Frigas, E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 77: 527-537 [1986]). Az eozinofil sejtek argininben gazdag, erősen bázikus proteint tartalmaznak, amelyet „MPB”-nek neveznek (Gleich, G. J. és munkatársai, J. Exper. Med. 137: 1459 [1973]). Az MBP több mint 50% mennyiségben tartalmaz eozinofil szemcsés proteint.

Az MPB-ről ismert, hogy toxikus hatású normál emlőssejtekre és toxikus mértékben fejeződik ki az eozinofiliát mutató szövetekben, így például asztmás betegek tüdőszövetében (Gleich, G. J. és munkatársai, J. Immunoi. 123: 2925 [1975]). Az MBP-expresszió és az asztma közötti kapcsolatot erősítette az a felismerés is, hogy az asztmás betegek köpetében az MBP-szint magasabb volt, mint a normál egyéneknél (Frigas, E. és munkatársai, Mayo Clin. Proc. 56: 345 [1981]). Az MBP felismerése óta más citotoxikus eozinofil proteint is azonosítottak (Frigas, E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 77: 527-537 [1986]).

Az asztma immunológiai alapjainak megismerését a fentiekben említett tanulmányok, továbbá a következő összefoglaló munkák: „Basic and Clinical Immunology” (1980), szerk.: Fundenberg, Η. H., Lángé Medical Publications (Los Altos) és „Fundamentals Immunology” (1984) szerk.: Paul, W. A., Raven Press, valamint a pneumóniával összefüggő tanulmányok (Godard, P. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 70: 88 [1982]) és a légzőszervi sima izmokkal összefüggő tanulmányok (Flavahan, N. A. és munkatársai, J. Appl. Physiol. 58: 824 [1985]) tették lehetővé. Bár ezek a tanulmányok nem vezettek az asztma immunológiai mechanizmusának magyarázatához, azonban egy általánosan elfogadott, a betegség immunológiai etiológiájára vonatkozó általános hipotézis kifejlesztését eredményezték (Frigas, E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 77: 527-537 [1986]).

Az asztma patológiájának fontos jellemzői az eozinofil sejtek által létrehozott tüdő parenchyma jelentős mértékű beszivárgása, valamint a mukociliáris kapacitás károsodása. Az „eozinofil hipotézis” szerint az eozinofil sejtek kötődnek a hörgőhöz annak érdekében, hogy a tüdő fehérvérsejtjei által felszabadított káros közvetítőket semlegesítsék. A hipotézis szerint az eozinofil sejtek a hörgőhöz kötődve degranulálódnak és MBP, valamint más citotoxikus molekulák szabadulnak fel. A degranulálódás hatására az eozinofil sejtekből enzimek, így például hisztamináz, aril-szulfatáz és foszfolipáz D szabadul fel, amelyek enzimatikusan semlegesítik a fehérvérsejt káros közvetítőit. Ezek a molekulák elősegítik továbbá a mukociliáris berendezés károsodását, és ily módon megakadályozzák a hörgőváladékok tisztulását és hozzájárulnak a tüdő károsodásához asztmás tünetek megjelenésével.

Ily módon úgy gondolják, hogy az asztmát az eozinofil sejtek váltják ki, amelyek a hörgőt a jelen lévő antigén primer hatására egy abnormális válaszra kényszerítik. Az eozinofil sejtek MBP-alkotója károsítja a hörgő epitéliás sejtjeit. A leukotriéneket és a lemezkeaktiváló faktort, Piatelet Activating Factor (PAF), az eozinofil sejtek termelik és ezek a hörgőtágulást eredményezik. Az eozinofil sejtek által felszabadított molekulák, így például az MBP a fehérvérsejteket is aktivizálhatják leukotriének és hisztamin felszabadítására és ily módon mind hörgőgörcsöt, mind megnövekedett eozinofiliát okozhatnak.

Az asztma fontosságára való tekintettel igen kívánatos új és továbbfejlesztett gyógymódok kifejlesztése az asztmás betegek kezelésére.

A fentiek szerint találmányunk sejtközti adhéziós molekulák (ICÁM), így például ICAM-1, valamint ezek reakcióképes származékainak alkalmazására vonatkozik asztma kezelésénél. A találmány vonatkozik továbbá olyan molekulák (így például antitestek vagy antitestfragmensek vagy receptormolekulák) alkalma3 zására is, amelyek a sejtközti adhéziós molekulákhoz vagy azok származékaihoz kötődni képesek. Továbbá, a találmány vonatkozik az asztma kezelésénél hatásos szerek vizsgálati eljárására is.

A találmány tárgyköréhez tartozik egy asztmakezelési eljárás, amelynél a betegnek hatásos mennyiségben valamely következő szert adagolunk:

a) egy antitest, amely képes az ICÁM-1 -hez kötődni,

b) az előző, a) pont szerinti antitestfragmense, amely képes az ICÁM-1-hez kötődni,

c) ICAM-1, amely természetes szennyező anyagoktól lényegében mentes,

d) az ICAM-1 reakcióképes származéka,

e) egy antitest, amely képes a glikoproteinek CD 18 családjának valamely tagjához kötődni,

f) az előző, e) pont szerinti antitestfragmense, amely képes a glikoproteinek CD 18 családjának valamely tagjához kötődni,

g) a glikoproteinek CD 18 családjának valamely tagja, amely lényegében természetes szennyezésektől mentes, és/vagy

h) a glikoproteinek CD 18 családja valamely tagjának reakcióképes származéka.

A találmány tárgya az asztma kezelésére alkalmas, valamely fenti szert tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítási eljárása.

A találmány vonatkozik továbbá egy vizsgálati eljárásra, amely alkalmas valamely asztma kezelésénél hatásos szer azonosítására oly módon, hogy a szert valamely nemhumán emlősnek (például főemlősnek) adagoljuk, amelynek többszöri inhaláció útján antigént adagoltunk, majd méijük a légúti érzékenység növekedését.

Az 1. ábrán bemutatjuk az ICAM-1 cDNS-jének nukleotid- és aminosavszekvenciáját. Az első ATG az 58 helyzetben van. Az ICAM-1 tripszines hasításával kapott peptidek transzlációs szekvenciáját aláhúzással jelöltük. A hidrofób feltételezett szignálpeptid- és a transzmembrán-szekvenciákat kiemelt aláhúzással jelöljük. A N-kapcsolódású glikozilált helyeket keretbe foglalással jelöljük. A 2976 helyen lévő AATAAA poliadenilezési jelt felső vonallal jelöljük. A bemutatott szekvencia a HL-60 cDNA klón szekvenciája. Az endotéliális sejt cDNS-t a hossz legnagyobb részében szekvenáltuk és csupán kevés kivételt mutatott.

A 2. ábrán bemutatjuk az ICAM-1 dómén szerkezetét.

A 3. ábrán bemutatjuk az eozinofil sejtek tapadását a lapos fenekű szövettenyésztő lemez lyukainak aljához, amikor a lyukak: fehéijebevonatúak stimulus nélkül, fehéijével bevontak PAF (10 ⁷ mól) stimulussal, immunkomplexszel (IC) bevontak stimulus nélkül és bevonat nélküliek stimulus nélkül. A tapadt sejtek mennyiségét kolorimetriás vizsgálattal határoztuk meg eozinofil peroxidázra (EPO) (átlag EPO egység±S. D.)

A 4. ábrán a különböző monoklonális antitestek (MAb, felülúszó 1:4 hígítás) hatását az eozinofil tapadásra lapos fenekű szövettenyésztő lemez lyukaiban, amelyek immunkomplexszel (IC) bevontak. A tapadt sejtek mennyiségét kolorimetriás vizsgálattal határoztuk meg eozinofil peroxidázra (átlag EPO egység±S.

D.). A tapadás statisztikusan szignifikáns gyengülését csillaggal jelöljük.

Az 5. ábrán a különböző monoklón antitestek (MAb, felülúszó 1:4 hígítás) hatását mutatjuk be PAF (10 ⁷ mol)-indukált eozinofil tapadásra LPS (10 ng/ml)-stimulált és glutáraldehiddel rögzített endotéliumhoz. A tapadt sejtek mennyiségét kolorimetriás vizsgálattal határoztuk meg eozinofil peroxidázra (EPO egység±S. D.). A tapadás statisztikusan szignifikáns gyengülését csillaggal jelöljük.

A 6. ábrán az anti-ICAM-1 (RR1/1) az anti-LFA1 β (R15.7) és az anti-HLA osztály 1 (W6/32) monoklonális antitestek (felülúszó 1:4 hígítás) hatását mutatjuk be: (A) lemezkeaktiváló faktorral (PAF, 10 ⁷ mól) indukált eozinofil adhéziójára lipopoliszachariddal (LPS, 10 mg/ml) stimulált humán köldökvéna endotéliumhoz, és (B) eozinofil adhézióra lapos fenekű szövettenyésztő lemezek lyukaiban, amelyek Ascaris extraktummal (stimulus nélkül) vagy immunkomplexszel (IC-stimulus) voltak bevonva. A tapadás statisztikusan szignifikáns gyengülést csillaggal jelöljük.

A 7. ábrán bemutatjuk az anti-ICAM-1 monoklonális antitest (R6.5) hatását: (A) a légúti eozinofil beszűrődésre és (B) a légúti érzékenység növekedésére (metakolin PC₁₀₍₎ csökkenés), amelyet háromszori különböző napon végzett Ascaris-inhalációval váltottunk ki, a vizsgálatokat Ascaris-érzékeny szinomegalus majmokon (Macaca fascicularis) végeztük. Az R6.5 kezelések eredményeit kontrollvizsgálatokhoz hasonlítottuk.

A 8. ábrán bemutatjuk az antigén egyszeri inhalálásával, a következőkben beálló változásokat: (C) BAL neutrofilek, (D) BAL makrofágok/monociták, és (E) BAL limfociták. NSD=szignifikáns különbség nincs.

A 9. ábrán bemutatjuk az antigén többszöri inhalálásával, a következőkben beálló változásokat: (A) inhalált metakolin PC₁₀₀, (B) bronchopneumoniás (BAL) eozinofilek. A jelölések a következők: Xsq=KruskalWallis-teszt (X-négyzetes közelítés). Minden betű egyegy majomra vonatkozó vizsgálatot jelent.

A. Az asztma immunopatológiája

Mint már a fentiekben említettük, az asztma egyik legfontosabb jellemzője a kiemelten magas (a normálhoz viszonyított 10-100-szoros nagyságú) hörgőérzékenység a különböző belélegzett szerekkel (fizikai, kémiai és fiziológiai) szemben (Boushey, H. A. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 121: 389 [1980]; Hargreave, F. E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 68: 347 [1981]).

Az ilyen „légúti túlérzékenységnek”, amelyet klinikailag a légutak belélegzett hisztaminnal, metakolinnal, hideg levegővel vagy testmozgással szembeni érzékenysége alapján határoznak meg, a mértéke összefüggésben van az asztmás tünetek intenzitásával (Hargreave, F. E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 68 : 347 [1981]; Boulet, L-P és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 71: 399 [1983]; Chan-Yeung, M. és munkatársai, Am. J. Med. 72: 411 [1982]), folyások mennyiségének napi változásával (Ryan G. és munkatársai, Thorax 37: 423 [1982]), valamint a kívánt kezeléssel (Hargreave, F. E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 68: 347 [1981]); Juniper, E. F. és munkatársai, Thorax 36: 575 [1981]).

HU 216 313 Β

Bár asztma esetén a légúti túlérzékenység több éven át stabil is maradhat (Juniper, E. F. és munkatársai, Thorax 37: 288-291 [1982]) kimutatták, hogy az érzékenység az allergének jelenlétében növekszik (Boulet,

L. P. és munkatársai, J. Allergy, Clin. Immunoi. 71: 399-406 [1983]; Cartier A. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 70: VIQ-ΥΠ [1982]; Cockfort D. W. és munkatársai, Clinical Allergy 7: 503-513 [1977]; Gundel R. H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. [1989]; Lanes S. és munkatársai, J. Appl. Physiol. 63: 864-872 [1986]; Marsh W. R. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 131: 875-879 [1985]; Sotomayor H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 130: 56-58 [1984]), növekszik továbbá légszennyezők jelenlétében (Golden J. A. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 118: 287-294 [1978]), vírusfertőzések esetén (Empey D. W. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. Ili: 131-139 [1976]), valamint bizonyos foglalkozási kemikáliák jelenlétében (Chan-Yeung M. és munkatársai, Amer. J. Med. 72: 411-415 [1982], Durham S. R. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 78: 398-406 [1987], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 72, 134-139 [1983], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 63: 28-34 [1979]). Mindezek ténylegesen bizonyítják, hogy a légúti túlérzékenység inkább következmény, mint az előre hajlamosító faktora az asztmának (Boulet L. P. és munkatársai, J. Allergy. Clin. Immunoi. 71: 399-406 [1983], ChanYeung M. és munkatársai, Amer. J. Med. 72: 411-415 [1982], Gundel R. H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. [1989], Marsh W. R. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 131: 875-879 [1985], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 63: 28-34 [1979]).

Bár -az a mechanizmus, amely a légúti túlérzékenység kialakulásához vezet nem ismert, számos, például a fenti tanulmányok alapján arra lehet következtetni, hogy a létrejöttében eozinofil sejtek infiltrációja és a bronchiális epitélium hámlása játszik közre (DeMonchy, J. G. R. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 131: 373 [1985], Laitinen, L. A. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 137: 62 [1988]). Miután kimutatták, hogy az eozinofil közvetítők károsítják a légúti epitéliás sejteket in vitro, ez a két jelenség kapcsolatban lehet (Frigas E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 77: 527 [1986]).

B. Asztma és sejtközti adhézió

A jelen találmány részben egy olyan vizsgálatra is vonatkozik, amely alkalmas az asztma kezelésében hatásos szerek azonosítására.

Az „asztma” kifejezés vagy allergiás, vagy idioszinkráziás asztmára vonatkozik. Valamely szerről akkor mondjuk, hogy gyógyhatással rendelkezik asztma esetében, ha az csökkenti (azaz gyengíti) az asztmás tünetek erősségét, mértékét és idejét. Az ilyen szereket előnyösen a következő „asztmamodellrendszer” segítségével lehet azonosítani. Mint már említettük, egy szer akkor alkalmas az asztma kezelésére, ha az a betegnek adagolva képes az asztmás tüneteket vagy gyengíteni, vagy azok erősségét és idejét csökkenteni.

A találmányunk ezen része azon a felismerésen alapszik, hogy az eozinofil sejtek migrációja a tüdőbe a sejtközti adhéziótól függ, és különösen, hogy az ilyen adhézió egy „ICAM-1” („Intercellular Adhesion Molecule-1”) kölcsönhatástól függ.

A találmány értelmében ez a molekula a glikoproteinek CD18 családjának tagja, és vagy egy, a glikoproteinek CD 18 családja tagjának a-alegységét (CD11 alegység), vagy a glikoproteinek CDI 8 családja tagjának B-alegységét (azaz CD 18 B-alegység), vagy a glikoproteinek CDI 8 családja tagjának a- és B-alegységét is tartalmazza. A találmány értelmében tehát a glikoproteinek CD 18 családja valamely tagja olyan molekulákat tartalmaz, amelyekben csak a CDI 8 tagok egy alegysége van, vagy ezek a molekulák lehetnek heterodimerek is, azaz a molekula mind az a- és mind a B-alegységet tartalmazza. Az ilyen molekulák mindegyike lehet vagy membránhoz, vagy szilárd hordozóanyaghoz kötött, vagy lehet nem kötött is (azaz „oldható”).

Az „ICAM-1” természetes ligandum a glikoprotein receptormolekulák CD18 családja számára (Torhlein R. és munkatársai, J. Immunoi. 137: 1270 [1986], Mariin S. D. és munkatársai, Cell 51: 813 [1987]). Az ICAM-1 egy 76-97 kd molekulatömegű glikoprotein. Az ICAM-1 nem heterodimer. Az ICÁM-1 jellemzése, azonosítása és aminosavszekvenciája, valamint az ICAM-l-el és más adhéziós molekulákkal szemben reakcióképes antitestek előállítása a 289949 számú európai szabadalmi bejelentésben, valamint a következő irodalmi helyeken van ismertetve: (Rothlein, R. és munkatársai, J. Immunoi. 137: 1270-1274 [1986], Smith C. W. és munkatársai, Structure and Function of Molecules Involved in Leukocyte Adhesion, A. S. Rosenthal és munkatársai, kiadó Springer-Verlag, New York, [1989], Smith C. W. és munkatársai, J. Clin. Invest. 82: 1746 [1988] és Barton, R. W. J. Immunoi. 143, [1989]), Mariin és Springer: Cell 57, 813-819(1987)

Az ICAM-1 egy sejtfelszíni glikoprotein, amely a következő sejtekben expresszálódik: nem vérképző sejtek, így például vaszkuláris endoteliális sejtek, thymus epitéliás sejtek, bizonyos más epitéliás sejtek és fibroblasztok, továbbá vérképző sejtek, így például szövetmakrofágok, mitogénstimulált T-limfocita vérsejtek, germinális központú B-sejtek, mandulában lévő dendrites sejtek, nyirokcsomó, valamint Peyer-féle foltok Az ICAM-1 nagy mennyiségben expresszálódik vaszkuláris endoteliális sejteken, amelyek reaktív hiperpláziát mutató nyirokmirigyek és mandulák T-sejtjeiben vannak. Az ICAM-1 kis mennyiségben expresszálódik perifériális vérlimfocitákban. Úgy tűnik, hogy az ICAM-1 szükséges a neutrofil sejtek gyulladásos szövetekbe való migrációjához. Bizonyos mielomonocita sejtvonalak phorbol-észterrel stimulált elkülönülése nagymértékben növeli az ICAM-1-expressziót. Ily módon az ICAM-1 különösen expresszálódik a gyulladás helyén és általában nem expresszálódik nyugodt sejtekben. Az ICAM-l-expresszió dermális fibroblasztokon három-ötszörösére növekszik 10 U/ml mennyiségű interleukin 1 vagy gamma-interferon hatására 4 vagy 10 óra alatt. Az indukció függ a protein- és mRNS-szintézistől és reverzibilis.

HU216313 Β

Az ICAM-1 molekulatömege a különböző sejttípusokban eltéréseket mutat, így például a molekulatömeg értéke fibroblasztok esetén 97 kd, U937 jelű mielomonocitikus sejtvonal esetén 114 kd és JY limfoblasztoid B sejt esetén 90 kd az ICAM-1 bioszintézise folyamán egy körülbelül 73 kd molekulatömegű intracelluláris prekurzor képződik. A tunicamicinkezelés (amely a glikozilálást gátolja) hatására képződött nem-N-glikozilált forma molekulatömege 55 kd.

A phorbol-észterrel stimulált U937 sejtekből vagy a fibroblasztsejtekből izolált ICAM-1 azonos termék, amelynek molekulatömege 60 kd kémiai deglikoziláció után. Az ICAM-1 monoklonális antitestek akadályozzák (befolyásolják) a fitohemaglutimin vérsejtek adhézióját az LFA-1 hibás sejtvonalakhoz. A fibroblasztok, de nem a limfociták ICAM-1 megkötésére képes monoklonális antitestekkel való előkezelése gátolja a limfocita-fibroblaszt adhéziót. A limfociták, de nem a fibroblasztok előkezelése LFA-1 elleni antitestekkel szintén gátolja a limfocita-fibroblaszt adhéziót.

Az ICAM-1 ily módon a glikoproteinek CD18 családja molekuláinak kötőliganduma. Kialakítható in vitro fibroblasztokon és endoteliális sejteken gyulladás közvetítők, így például IL-1, gammainterferon és tumor necrosis faktor segítségével olyan időtartam alatt, amely összemérhető a limfocitáknak a gyulladásos helyre való in vivő infiltrációjával (Dustin, M. L. és munkatársai, J. Immunoi. 137: 246-254 [1986], Prober, J. S. és munkatársai, J. Immunoi. 137: 1893-1896 [1986]). Az ICAM-1 expresszálódni képes továbbá nem vérképző sejtekben is, így például vaszkuláris endoteliális sejtekben thymus epitéliális sejtekben, más epitéliális sejtekben és fibroblasztokban, továbbá vérképző sejtekben, így például szövetmakrofágokban, mitogénstimulált T-limfocita sejtekben, valamint germinális központú B-sejtekben és dendrites sejtekben a mandulákban, nyirokmirigyekben és Peyer-féle foltokban (Dustin, M. L. és munkatársai, J. Immunoi. 137: 245-254, [1986]). Az ICAM-1 expresszálódik továbbá keratinocitákban is, amelyek jóindulatú gyulladásos helyeken vannak jelen, így például a következő betegségek esetén: allergiás ekcéma, sömör, kiütéses bőrbetegségek, csalánkiütés, továbbá különböző hólyagosodások. A bőrre felvitt olyan hapten, amelyre a beteg allergiás, szintén allergiás bőrreakciót válthat ki, ami erős ICAM-1-expressziót eredményez a keratinocitákon. Ugyanakkor a bőrőn lévő toxikus foltok nem váltanak ki ICAM-1expressziót a keratinocitákon. ICAM-1 van jelen különböző bőrbetegségek elváltozásaiból származó biopsziákban található keratinocitákban és ICAM-1-expresszió indukálódik az allergiásfolt-tesztekből származó elváltozásokban, míg a toxikusfolt-teszt elváltozásokból származó keratinocitákban ICAM-1-expresszió nincs.

Találmányunk egy további része azon a felismerésen alapszik, hogy a celluláris adhéziót gátló vagy megakadályozó szerek alkalmazhatók az asztma kezelésére.

Egyike ezen szereknek találmányunk értelmében az ICÁM-1, valamint ezek funkcionális származékai. Miután az ICAM-1 a celluláris adhéziót oly módon hozza létre, hogy az eozinofil sejtfelszíni receptormolekulához kötődik, azon ICAM-1 funkcionális származékok, amelyek az eozinofil sejteken jelen lévő ICAM-1-receptorokhoz képesek kötődni, kompetícióban vannak a tüdő endoteliális sejteken lévő ICAM-1-gyei, és ily módon gyengítik az eozinofil sejtek celluláris adhézióját és ennek következtében alkalmasak asztma kezelésére.

Az ICAM-1 funkcionális származéka olyan vegyületet jelent, amely olyan biológiai aktivitással (funkcionális vagy szerkezeti) rendelkezik, amely lényegében hasonló az ICAM-1 biológiai aktivitásához. A funkcionális származék kifejezés magában foglalja a fragmenseket, változatokat, analógokat, valamint kémiai származékokat egyaránt. Olyan molekula alatt, mint az ICAM-1 fragmense, a molekula bármelyik polipeptid részét értjük. Különösen előnyösek az ICAM-1 aktivitásával rendelkező fragmensek és azok, amelyek oldhatók (azaz nem membránhoz kötöttek).

Az ICAM-1 7 doménból áll (Staunton, D. E. és munkatársai, Immunoi. Today 9: 213-215 [1988], Staunton D. E. és munkatársai, Cell 52: 925-934 [1988], Staunton D. E. és munkatársai, Cell 56: 849-854 [1989], Staunton D. E. és munkatársai, Tissue Antigens 33: 287 [1989]). Az ICAM-1 doménjeit a 2. ábrán mutatjuk be. Azt állapítottuk meg, hogy az 1 és 2 domének különösen fontosak az ICAM-1 receptormolekulájához való kötődéshez (Staunton D. E. és munkatársai, Tissue Antigens 33: 286 [1989], Staunton D. E. és munkatársai, FASEB J. 3: A446 [1989]). A találmány értelmében az ICAM-1 funkcionális származékok, és különösen azok a származékok, amelyek olyan ICAM-1 fragmenseket vagy mutáns variánsokat tartalmaznak, amelyek az 1. és 2. doméneket tartalmazzák, különösen előnyösen alkalmazhatók asztma kezelésére. Még előnyösebbek az asztma kezelésénél azok az ICAM-1-fragmensek vagy mutáns variánsok, amelyek a 2. domént tartalmazzák. Még ennél is előnyösebbek az asztma kezelésére azok az ICAM-1-fragmensek vagy mutáns variánsok, amelyek az 1. domént tartalmazzák.

Az ICÁM-1 -molekula variánsa alatt azt a molekulát értjük, amely molekula szerkezetében és hatásában hasonló vagy a teljes molekulához, vagy annak fragmenséhez.

Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy lényegében hasonló egy másik molekulához, ha a két molekula szerkezete hasonló, vagy mindkét molekula hasonló biológiai hatást mutat. így, feltéve, hogy két molekula azonos aktivitású, ezek variánsoknak tekinthetők a fentiek értelmében akkor is, ha az egyik molekula szerkezete nem található meg a másikéban, vagy az aminosavmaradékok szekvenciája nem azonos. Az ICAM-1 analógok alatt olyan molekulákat értünk, amelyek hatásukban hasonlóak vagy a teljes molekulához, vagy annak fragmenséhez. A fentiekben említett kémiai származékok alatt olyan molekulákat értünk, amelyek olyan további kémiai csoportokat tartalmaznak, amelyek normál esetben nem részei a molekulának. Ilyen csoportok általában növelik a molekulák oldhatóságát, abszorpcióképességét, biológiai felezési idejét stb. A csoportok ugyanak6 kor csökkenthetik a molekula toxicitását, eliminálhatják vagy gyengíthetik bármely mellékhatást is. Ilyen hatások kifejtésére alkalmas csoportokat közölnek például a következő irodalmi helyen: (Remington’s Pharmaceutical Sciences [1990]). A „toxinderivatizált” molekulák a kémiai származékok egy speciális csoportját képezik. A „toxinhoz kapcsolt molekula” olyan molekula (például ICAM-1 vagy egy antitest), amely toxinegységhez van kapcsolva. Az ilyen molekuláknak a sejthez való kötődése a toxinrészt szoros közelségbe hozza a sejttel és ily módon elősegíti a sejt pusztulását. Bármely alkalmas toxinrész alkalmazható erre a célra, de különösen előnyösen a következő toxinokat alkalmazzuk például: ricintoxin, diftériatoxin, radioizotoptoxinok, membráncsatoma-képző toxinok stb. Az ilyen részeknek a molekulához való kapcsolása a szakterületen ismert.

További szerek, amelyek a találmány értelmében asztma kezelésére alkalmazhatók az LFA-1, Mac-1 és pl50,95 vagy ezen molekulák funkcionális származékai. Az ilyen molekulák, valamint ezek funkcionális származékai oly módon alkalmasak az asztma kezelésére, hogy képesek az endoteliális sejtek ICAM-1 molekulájához kötődni, és így gyengítik ezen sejtek azon képességét, hogy az eozinofil sejtek kötését és adhézióját közvetítsék.

A találmány értelmében különösen előnyösek az LFA-1, az Mac-1 vagy pl50,95 funkcionális származékai, mivel ezek oldható molekulák. Különösen előnyösek ezen molekulák azon funkcionális származékai, amelyek heterodimerek, azaz a molekula a- és B-alegységeit egyaránt tartalmazzák, valamint az ICAM-1 megkötésére alkalmas monomer származékok. Az oldható heterodimerek különösen előnyösek. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint oldható ICAM1 származékként az ICAM-1-molekula 1-5. doménjeit tartalmazó funkcionális származékot alkalmazunk.

Az ICAM-1 és a molekulák CD 18 családjának tagjai immunogén molekulák. Ily módon lehetséges olyan antitestek kialakítása, amelyek képesek az ICÁM-1-hez vagy a molekula CD 18 családjának tagjaihoz kötődni. Az ilyen antitestek a találmány értelmében szintén alkalmasak asztma kezelésére.

Ezeket az antitesteket előállíthatjuk, ha például intraperitoneális formában alkalmas állatokba bejuttatjuk vagy a tisztított molekulákat, vagy a sejteket, amelyek ezen molekulák expresszálására képesek. Kívánt esetben egy ilyen állat szérumát eltávolíthatjuk és alkalmazhatjuk poliklonális antitestek forrásaként, amelyek ezen molekulák megkötésére képesek. Előnyösebb azonban ezen állatok lépsejtjeit eltávolítani, az így nyert lépsejteket mieloma sejtvonalakkal fuzionálni, és biztosítani, hogy az így fuzionált sejtek hibridóma sejteket képezzenek, amelyekből olyan monoklonális antitestek szekretálódnak, amelyek képesek az ICAM-1 vagy a molekulák CD 18 családja tagjainak megkötésére.

A fentiekben leírtak szerint előállított hibridóma sejteket a fentiek szerint vizsgálhatjuk a kívánt hibridóma sejtek azonosítására, amelyek olyan antitestet választanak ki, amely képes ICÁM-1-hez vagy a molekulák CD 18 családjának tagjaihoz kötődni (vagy a- vagy B-alegységek).

Mivel az ilyen antitestek alkalmasak ICÁM-1-hez vagy ezek receptorához kötődni, felhasználhatók [antigénkötő képességgel rendelkező fragmenseikkel együtt, így például az FAB, F(ab)₂ stb. fragmensekkel együtt] a celluláris adhézió gyengítésére és ily módon a találmány értelmében szintén alkalmasak asztma kezelésére.

Mint már a fentiekben említettük, a találmány értelmében mind a poliklonális, mind a monoklonális antitestek alkalmazhatók. Különösen előnyösek az ICAM-1 (vagy ezek funkcionális származékai) elleni antitestek vagy a CDI8 család tagjai (vagy ezek funkcionális származékai) elleni antitestek, amelyek emberi eredetűek, vagy amelyek „humanizáltak” (azaz nemimmunogének embereknél) rekombináns vagy más technikával. A humanizált antitesteket például úgy állíthatjuk elő, hogy az antitest egy immunogén részét egy megfelelő, de nemimmunogén résszel helyettesítjük (azaz kiméra antitestek) (Robinson R. R. és munkatársai, PCT/US86/02269 számú nemzetközi nyilvánosságra hozatali irat, Akira K. és munkatársai, 184187 számú európai szabadalmi bejelentés, Taniguchi M., 171496 számú európai szabadalmi bejelentés, Morrison S. L. és munkatársai, 173494 számú európai szabadalmi bejelentés, Neuberger M. S. és munkatársai, WO 86/01533 számú PCT bejelentés, Cabilly S. és munkatársai, 125023 számú európai szabadalmi bejelentés, Better M. és munkatársai, Science 240; 1041-1043 [1988], Liu A. Y. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 [1987], Liu A. Y. és munkatársai, J. Immunoi. 139: 3521-3526 [1987], Sun L. K. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 [1987], Nishimura Y. és munkatársai, Canc. Rés. 47: 999-1005 [1987], Wood C. R. és munkatársai Natúré 314: 446-449 [1985], Shaw és munkatársai. J. Natl. Cancerlnst. 80: 1553-1559 [1988]).

A humanizált kiméra antitestek általános ismertetése a következő irodalmi helyeken található: (Science, 229: 1202-1207 [1985] és Oi, V. T. és munkatársai, BioTechniques 4: 214 [1986]).

Alkalmas humanizált antitesteket állíthatunk még elő a CDR- vagy CEA-szubsztitúcióval is (Jones P. T. és munkatársai, Natúré 321: 552-525 [1986], Verhoeyan és munkatársai, Science 239: 1534 [1988], Beidler

C. B. és munkatársai, J. Immunoi. 141: 4053-4060 [1988]).

A találmány szerinti asztmaellenes szereket előállíthatjuk természetes úton (így például állatokban, növényekben, gombákban, baktériumokban stb. az ICAM1 nemimmunglobulin antagonisták termelését indukáljuk, vagy pedig állatokban az ICAM-1 megkötésére alkalmas poliklonális antitestek termelését indukáljuk), szintetikus módszerekkel [így például a Merrifield-féle szintetikus módszer alkalmazásával ICAM-l-et, funkcionális származékát vagy proteinantagonistákat állíthatjuk elő (immunglobulinokat és nem immunglobulinokat is)], hibridómatechnológiával (például úgy, hogy ICAM-1 megkötésére alkalmas monoklonális antitesteket állítunk elő) vagy rekombináns technológiával (például úgy, hogy a találmány szerinti asztmaellenes szere7 két különböző gazdaszervezetekben, például gombákban, baktériumokban, élesztőben, tenyésztett emlőssejtekben stb., vagy rekombináns plazmidokból vagy vírusvektorokból állítjuk elő) vagy proteolízist alkalmazunk az előállításukra. A módszer kiválasztását különböző szempontok alapján végezzük, így például a kívánt hozam stb. alapján. Nem szükséges csupán a fentiekben említett egyetlen módszert alkalmazni, a különböző említett eljárásokat és technológiákat egymással kombináltan is alkalmazhatjuk a kívánt asztmaellenes szer előállítására.

Az ICAM-1 funkcionális származékait vagy a CD 18 család olyan tagjait, amelyek maximum 100 aminosavból állnak, általában in vitro szintézissel állítjuk elő. Kívánt esetben az ilyen fragmenseket módosíthatjuk is oly módon, hogy a tisztított vagy nyers protein kívánt aminosavcsoportját valamely olyan szerves reagenssel reagáltatjuk, amely alkalmas a kiválasztott oldallánccal vagy terminális csoporttal reakcióba lépni. Az így kapott kovalens származékot alkalmazhatjuk a biológiai aktivitás szempontjából fontos csoportok azonosítására. A következőkben leírásra kerülő megvalósítási formáknál a találmány ezen részére az ICAM-1 funkcionális származékainak említésével utalunk. Ezzel a módszerrel a molekula CDI8 családja bármely tagjának funkcionális származékát előállíthatjuk.

A ciszteinilcsoportot általában a-halogén-acetátokkal (és a megfelelő aminokkal), így például klór-ecetsavval vagy klór-acetamiddal reagáltatjuk a karboximetil- vagy karboxi-amido-metil-származékok előállítására. A ciszteinilcsoportot átalakíthatjuk továbbá bróm-trifluor-acetonnal, a-bróm-B-(5-imidozoil)-propionsavval, klór-acetil-foszfáttal, N-alkil-maleinimiddel, 3-nitro-2-piridil-diszulfiddal, metil-2-piridil-diszulfíddal, p-klór-higany-benzoáttal, 2-klór-higany-4nitrofenollal, vagy klór-7-nitrobenzo-2-oxa-l ,3-diazollal végzett reakcióval is.

A hisztidilcsoportot dietil-pirokarbonáttal pH = 5,5-7 közötti tartományban való reakcióval alakíthatjuk át, mivel ez a reagens relatíve specifikus a hisztidiloldalláncra. Parabróm-fenacil-bromidot szintén alkalmazhatunk, ezt a reakciót előnyösen 0,1 mólos nátrium-kakodilátban végezzük pH=6 értéken.

A lizinilcsoportot és a terminális aminocsoportokat borostyánkősav- vagy más karbonsavanhidriddel alakítjuk át. Ezekkel a szerekkel végzett reakció során megváltozik a lizinilcsoport töltése. Más alkalmas szerek az α-aminocsoportok átalakítására például a következők: imidoészterek, így például metil-pikolinimidát, piridoxál-foszfát, piridoxál, klór-bórhidrid, trinitro-benzoesav, O-metil-karbamid, 2,4-pentándion, továbbá glioxilát, transzaminázzal katalizálva.

Az arginilcsoportot egy vagy több ismert reagenssel alakíthatjuk át, ezek közül megemlítjük például a fenilglioxált, a 2,3-butándiont, az 1,2-ciklohexándiont és a ninhidrint. Az arginincsoport átalakítása során alkálikus közeget kell fenntartani a guanidin-funkcionális csoport magas pKa-értéke miatt. Továbbá, ezek a reagensek reagálni képesek a lizinnel, valamint az arginin epszilon-aminok csoportjával.

A tirozilcsoport egy specifikus módosítását igen részletesen tanulmányoztuk különös tekintettel arra, hogy aromás diazoniumvegyületekkel vagy tetranitrometánnal végzett reakcióval a tirozincsoportra spektrális jeleket viszünk be. Legismertebben N-acetil-imidazolt és tetranitro-metánt alkalmazunk a O-acetil-tirozil és a 3-nitro-származékok előállítására. A tirozilcsoportot ¹²⁵I vagy ^l31I alkalmazásával jódozzuk, és ily módon jelzett proteineket nyerünk a radioimmunvizsgálatok, különösen a klóramin T módszerhez. A karboxil-oldalláncokat (aszpartil- vagy glutamilcsoport) szelektíven módosíthatjuk karbodiimidekkel (R’-N-C-N-R’), így például l-ciklohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)-karbodiimiddel vagy 1 -etil-3-(4-azonia-4-dimetil-pentil)-karbodiimiddel végzett reakcióval. Az aszpartil- és glutamilcsoportokat továbbá átalakíthatjuk aszparaginil- és glutaminilcsoportokká is ammóniumionokkal végzett reakcióval.

Bifunkciós vegyületekkel végzett átalakítások alkalmasak arra, hogy egy ICAM-1 funkcionális származékot egy vízben oldhatatlan hordozóanyaghoz vagy valamely olyan anyag felületéhez kössünk, amelyet egy ICAM-1 funkcionális származék fúziós polipeptidjének hasításához alkalmazunk, amelyből azután a hasított polipeptidet felszabadíthatjuk és kinyerhetjük. Ilyen térhálósító szerként például a következőket alkalmazhatjuk: 1,1bisz(diazoacetil)-2-fenil-etán, glutáraldehid, N-hidroxiszukcinimid-észterek, így például 4-azido-szalicilsawal képzett észterek, továbbá homobifunkcionális imidoészterek, így például diszukcinimidil-észterek, így például 3,3’-ditio-bisz(szukcinimidil-propionát), továbbá bifunkcionális maleinimidek, így például bisz-N-maleinimido-l,8-oktán. A metil-3-[(p-azido-fenil)-ditio]-propioimidát reagens alkalmazásával fotoaktiválható intermediereket nyerünk, amelyek azután fény hatására képesek a térhálósítás kialakítására. A protein immobilizálására alkalmazhatók különböző reakcióképes, részben oldhatatlan anyagok, így például cianogén bromidaktivált szénhidrátok, valamint a következő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett reakcióképes szubsztrátumok: (3969287, 3691016, 4195 128,4 247 642,4 229 537 és 4 330 440 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások).

A glutaminil- és aszparaginilcsoportokat gyakran deamidáljuk a megfelelő glutamil- és aszpartilcsoportok előállítására. Más módszer szerint ezeket a csoportokat enyhén savas körülmények között lehet deamidálni. Ezen csoportok bármelyik formája a találmány oltalmi körébe tartozik.

Az átalakítások közé tartozik a prolin és a lizin hidroxilezése, a szeril- vagy teonilcsoportok hidroxilcsoportjának foszforilezése, a lizin, arginin és hisztidin oldal láncok aminocsoportjainak metilezése (T.

E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco. 79-86 [1983]), az N-terminális amincsoport acetilezése és bizonyos vonatkozásban a C-terminális karboxilcsoportok amidálása is.

A megváltozott aminosavszekvenciájú funkcionális ICAM-1-származékokat is elő lehet állítani a DNS-ben végzett mutációval. Az 1. ábrán egy olyan nukleotidszekvenciát mutatunk be, amely az ICAM-1 gént kódolja. Az ilyen variánsok közé tartoznak például azok, amelyekben az 1. ábra szerint bemutatott aminosavszekvencia bizonyos csoportjai törölve vannak, pluszcsoportokba be vannak építve vagy alcsoportok szubsztituálva vannak. A deléció, az inszerció és a szubsztitúció bármilyen kombinációjával szintén a végső konstrukciót nyerhetjük, feltéve, hogy ez a konstrukció a kívánt aktivitással rendelkezik. Nyilvánvalóan a mutációk, amelyeket a variánst kódoló DNS-ben végzünk, nem helyezik a szekvenciát a leolvasási kereten kívül, és előnyösen nem alkotnak komplementer régiókat, amelyek másodlagos nRNS-szerkezeteket alkothatnak (lásd 75444 számú európai közzétett szabadalmi bejelentés).

Genetikai úton, ezeket a funkcionális származékokat általában az ICÁM-1-molekulát kódoló DNS-ben lévő nukleotidek helyspecifikus mutagenezisével állítjuk elő, amikor is a funkcionális származékot kódoló DNS-t termelünk, majd a DNS-t rekombináns sejttenyészetben expresszáljuk. A funkcionális származék tipikusan azonos kvalitatív biológiai aktivitással rendelkezik mint a természetben előforduló analóg. Azonban, bizonyos jellemzőkben lényegesen eltérhetnek a normálisan előállított ICÁM-1-molekulától.

Míg a megváltoztatott aminosavszekvencia bevezetésének helye predeterminált, magát a mutációt nem szükséges előre meghatározni. így például annak érdekében, hogy egy adott helyen a mutáció kivitelezését optimalizáljuk, a kiválasztott kodonon vagy régión véletlenszerű (random) mutagenezist lehet végezni, és az expresszált ICAM-1 funkcionális származékokat a kívánt aktivitás optimális kombinációja szerint választjuk ki. Egy ismert szekvenciájú DNS kiválasztott helyén végzett szubsztitúciós mutáció kivitelezése a szakterületen ismert, ilyen eljárás például a helyspecifikus rautagenezis.

A találmány szerinti ICAM-1 funkcionális származékok előállítását előnyösen olyan DNS-molekula helyspecifikus mutagenezisével végezzük, amely a protein korábban előállított funkcionális származékait vagy non variáns változatait kódolja. A helyspecifikus mutagenezis lehetővé teszi az ICAM-1 funkcionális származékainak előállítását olyan specifikus oligonukleotidszekvenciák alkalmazásával, amelyek a kívánt mutáció DNS-szekvenciáját, valamint megfelelő számú szomszédos nukleotidokat kódolnak, és ily módon megfelelő méretű és szekvenciakomplexitású primer szekvenciát nyerünk ahhoz, hogy a keresztezett deléciós kapcsolás mindkét oldalán stabil duplexet biztosítsunk. Általában előnyösek a 20-25 nukleotidot tartalmazó orimer szekvenciák, amelyek a megváltoztatott szekvenciakapcsolás mindkét oldalán 5-10 nukleotidot tartalmaznak. A helyspecifikus mutagenezis a szakterületen ismert, így például a következő publikációkban ismertetik: (Adelman és munkatársai, DNA 2; 183 [1983]).

A helyspecifikus mutagenezisnél általában fágvektort alkalmaznak, amelyek egyszálú és kétszálú formában egyaránt előfordulnak. A helyspecifikus mutagenezishez felhasználásra kerülő tipikus vektor például az

M13 fág, amelyet például a következő irodalmi helyen ismertetnek: (Messing és munkatársai, Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, szerk. A. Walton, Elsevier, Amsterdam [1981]). A felhasználható fágok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők és a szakember számára ismertek. Más módszer szerint plazmidvektorokat is alkalmazhatunk, amelyek a replikációs eredetű egyszálú fágot tartalmazzák, ekkor egyszálú DNS-t nyerünk (Veira és munkatársai, Meth. Enzymol. 153: 3 [1987]).

Általában a helyspecifikus mutagenezist úgy végezzük, hogy először egyszálú vektort állítunk elő, amely a kívánt proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza a szekvenciájában. A kívánt mutációs szekvenciát tartalmazó oligonukleotidot általában szintetikusan állítjuk elő, így például a következő irodalmi helyen ismertetett módszer szerint: (Crea és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 5765 [1978]). Az így kapott primer szekvenciát ezután az egyszálú, proteinkódoló szekvenciát tartalmazó vektorhoz kapcsoljuk, majd DNS-polimerizáló enzim hatásának tesszük ki (így például E. coli polimeráz I Klenow-fragmens), amikor is a mutációt hordozó szál szintézisét befejezzük. így a mutációs szekvencia és a második szál hordozza a kívánt mutációt. Az így kapott heteroduplex vektort alkalmazzuk ezután a kívánt sejtek (így például JM 101 sejtek) transzformálására, majd a mutációs szekvenciákat hordozó rekombináns vektorokat tartalmazó kiónokat elválasztjuk.

Miután a kiónt kiválasztottuk, a mutációt hordozó proteinkódoló régiót eltávolítjuk és egy megfelelő vektorba építjük a proteintermelés érdekében, vektorként általában olyan típusú expressziós vektort alkalmazunk, amely a megfelelő gazda transzformálására alkalmazható.

A törölt aminosavszekvenciák általában 1-30 csoportot, előnyösen 1-10 csoportot tartalmaznak és általában összefuggőek.

Az inszerciós aminosavszekvencia lehet egy, az amino-észter vagy karboxil-terminálishoz kapcsolt egyetlen csoport, vagy akár a lényegében nem hasított hosszúságú polipeptid, valamint lehet egy egyetlen vagy több aminosavcsoportból álló inszerciós intraszekvencia. Az inszerciós intraszekvenciák (azaz teljes ICAM-1-molekula szekvenciáján belüli inszerciók) tartalmazhatnak 1-10 csoportot, előnyösen 1-5 csoportot. A terminális inszerciók közé tartozik például egy szignálszekvencia, amely lehet a gazdasejttel heterológ vagy homológ, amely a molekula Nterminális részéhez kapcsolódik, és ily módon lehetővé teszi a rekombináns gazdasejtből az ICAM-1 funkcionális származékának kiválasztását.

A funkcionális származékok harmadik csoportját alkotják azok, amelyekben az ICAM-1-molekula legalább egy aminosava, előnyösen egyetlen aminosava el van távolítva és helyére egy másik aminosav van inszertálva. Az ilyen szubsztitúciókat előnyösen például a következő 1. táblázatban felsoroltak szerint végezzük, amennyiben kívánatos, hogy a végső ICAM-1-molekula jellemzőit finoman változtassuk.

1. táblázat

Eredeti csoport	Példa a cserére
Alá	gly; ser
Arg	lys
Asn	gin;his
Asp	glu
Cys	ser
Gin	asn
Glu	asp
Gly	ala; pro
His	asn; gin
Ile	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gin; glu
Met	leu; tyr; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

A funkcionális vagy immunológiai tulajdonságok jelentős változtatását úgy lehet elvégezni, hogy az előző

1. táblázatban felsorolt cserék helyett azoktól lényegesebben eltérő cseréket alkalmazunk, azaz amelyek jelentősebb mértékben befolyásolják a következőket: (a) a polipeptid vázszerkezetét a szubsztitúció helyén, így például lap vagy hélix alakzatot formáznak, (b) a kiválasztott helyen a molekula töltését vagy hidrofobitását, vagy (c) az oldallánc terjedelmét. Ilyen változtatásokra alkalmasak például a következő szubsztitúciók: (a) a glicin és/vagy prolin egy másik aminosawal van kicserélve, vagy törölve vagy inszertálva van; (b) egy hidrofil aminosav, például a szerin vagy treonin hidrofób aminosavra van cserélve, így például valamely következő aminosavra: leucin, izoleucin, fenil-alanin, valin vagy alanin; (c) egy cisztein valamely más aminosavra van cserélve; (d) egy elektropozitív oldalláncot tartalmazó aminosav, például lizin, arginin vagy hisztidin egy elektronegatív töltésű aminosavra van cserélve, így például glutaminra vagy aszparaginsavra; (e) egy terjedelmes oldalláncú aminosav, például fenil-alanin oldalláncot nem tartalmazó aminosavra, így például glicinre van cserélve.

A legtöbb deléció vagy inszerció vagy szubsztitúció esetében nem várható, hogy az radikális változást okoz az ICÁM-1-molekula jellemzőiben. Mindazonáltal, amennyiben nehéz előre megítélni, hogy a szubsztitúció, a deléció vagy az inszerció milyen konkrét hatást vált ki, a szakember a rutinvizsgálatokkal határozhatja meg. így például egy funkcionális származékot előállíthatunk a natív ICÁM-1-molekulát kódoló nukleinsav helyspecifikus mutagenezisével, a nukleinsav-variánsnak egy rekombináns sejtkultúrában való expresszálásával, majd adott esetben a sejtkultúrából való elválasztással, amely műveleteket például egy anti-ICAM-1-molekulát tartalmazó antitestoszlopon immunoaffmitásos adszorpcióval végzünk, amikor is a funkcionális származék abszorbeálódik oly módon, hogy a legalább egy visszamaradó immunepitophoz kötődik.

Az ily módon nyert sejtlizátum vagy a tisztított ICÁM-1-molekula funkcionális származékának aktivitását ezután alkalmas vizsgáló módszerrel vizsgáljuk a kívánt jellemzőre. így például a funkcionális származék immunológiai karakterének változását, azaz például egy adott antitesthez való affinitását kompetitív immunovizsgálattal határozzuk meg. Az immunomodulációs aktivitásban bekövetkező változást alkalmas módszerrel mérjük. A proteintulajdonságok változását, így például a redoxtulajdonságokat vagy hőstabilitást, a biológiai felezési időt, a hidrofobicitást, a proteolitikus degradációval szembeni érzékenységet vagy a hordozókhoz való kötődést vagy multimerek képzésére való hajlamot a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel végezzük.

C. A találmány szerinti kompozíciók adagolása

A találmány szerinti asztmaellenes szerekkel való kezelést úgy végezzük, hogy a betegnek a megfelelő hatóanyagokat tartalmazó készítményeket adagoljuk bármely alkalmas módon, így például intravénásán, intramuszkulárisan, szubkután, orálisan vagy parenterálisan. Különösen előnyös ezen készítmények adagolása intranazálisan, orrsprayk, tamponok stb. útján. Különösen előnyös az adagolás orális inhaláció, orális spray vagy orális aeroszolkészítmények útján. Injekciókészítményeket alkalmazunk, az adagolást végezhetjük folyamatos infúzió vagy egyetlen vagy többszöri bolus készítmény formájában.

A fentiek szerinti szerek gyógyhatásút fokozhatjuk azáltal, hogy további aminosavcsoportokat tartalmazó funkcionális származékokat alkalmazunk, amely csoportokat a hordozóhoz való jobb kötődés vagy a szer aktivitásának fokozása érdekében viszünk be. A találmány oltalmi körébe tartoznak az ICAM-1 funkcionális származékai, amelyekben bizonyos aminosavcsoportok hiányoznak, vagy amelyek megváltozott aminosavcsoportot tartalmaznak, azonban ezen származékok még rendelkeznek a celluláris adhéziót befolyásoló képességgel.

A találmány értelmében felhasználásra kerülő antitesteket ICÁM-1-molekulák, valamint a CD 18 család tagjaival kapcsolatban akkor mondjuk, hogy „természetes szennyezésektől megtisztítottuk”, ha az ezeket tartalmazó készítmények mentesek azon kimutatható anyagoktól, amelyekkel ezek a termékek normál esetben és a természetben együtt találhatók.

A találmány vonatkozik az antitestek, valamint ezek biológiailag aktív fragmenseinek (akár poliklonális, akár monoklonális) alkalmazására, amelyek alkalmasak az ICÁM-1-molekulához vagy a CD 18 család valamely tagjához kötődni.

A találmány szerinti készítményekkel végzett gyógykezelések során a betegnek az antitesteket, vagy azoknak az ICÁM-1-molekulához vagy a CD 18 család valamely

HU 216 313 Β tagjához kötődni képes fragmenseit az ICÁM-1-molekulát vagy a CD 18 család valamely tagját (vagy fragmensét, variánsát vagy származékát) adagoljuk, az alkalmazott dózis különböző faktoroktól függ, így például a betegek korától, tömegétől, magasságától, nemétől, általános kondíciójától, korábbi gyógykezelésektől stb. Általában a hatóanyagot egy pg/kg-10 mg/kg mennyiségben alkalmazzuk, bár ennél alacsonyabb vagy magasabb dózisokat is alkalmazhatunk. A gyógyászatilag hatásos dózis mennyiségét csökkenthetjük, ha a fentiekben említett szerek kombinációját alkalmazzuk, így például egy anti-ICAM-1-antitestet, egy anti-LFA-1-antitesttel együtt adagolunk. Akkor mondjuk a találmány értelmében, hogy egy vegyületet egy másik vegyülettel együtt alkalmazunk, ha a két vegyület adagolását olyan időintervallumban végezzük, hogy mindkét vegyület egyidejűleg a beteg vérszérumában kimutatható.

A találmány szerinti asztmaellenes készítményeket a betegeknek olyan mennyiségben adagoljuk, hogy azok az asztmás tüneteket csökkentsék, azok komolyságát gyengítsék, vagy azok időtartamát lerövidítsék.

A találmány szerinti antitestszereket vagy azok fragmentjeit adagolhatjuk önmagukban, vagy egy vagy több valamely következő asztmaellenes szenei kombináltan: metil-xantinok, így például teofílin, β-adrenergiás agonisták, így például katekolaminok, rezorcinok, szaligeninek, efedrin, glikokortikoidok, így például hidrokortizon, kromonok, így például kromolin-nátrium, továbbá antikolinergiás szerek, így például atropin. Ezek a kombinációk lehetővé teszik a szükséges szerek mennyiségének csökkentését.

A találmány szerinti készítményeket adagolhatjuk profílaktikus vagy terápiás célból. Amennyiben profilaktikus kezelést alkalmazunk, a szereket az asztmás tünetek előtt adagoljuk. A profílaktikus adagolás esetén a találmány szerinti készítmények csökkentik vagy gyengítik bármilyen bekövetkező asztmatikus tünet erősségét. Terápiás kezelés esetén a találmány szerinti készítményeket asztmás tünetek megjelenésekor vagy röviddel ez után adagoljuk. Ebben az esetben a készítmény bármilyen meglévő asztmás tünet gyengítésére szolgál. A találmány szerinti készítményeket először vagy a várható asztmás tünetek megjelenése előtt kell adagolni, ily módon gyengítjük a tünetek várható komolyságát, időtartamát és erősségét, vagy pedig a tünetek megjelenése után végezzük az adagolást.

A készítményről akkor mondjuk, hogy gyógyászatilag elfogadható, ha az adagolása a beteg számára elviselhető. Egy ilyen szerről akkor mondjuk, hogy gyógyászatilag hatásos mennyiségben adagoljuk, ha a beadagolt mennyiség fiziológiailag hatásos. Egy szerről akkor mondjuk, hogy fiziológiailag hatásos, ha jelenlétében a beteg fiziológiai állapotában kimutatható változás következik be.

A találmány szerinti készítményeket ismert módon állítjuk elő, oly módon, hogy a hatóanyagokat vagy azok fünkcionális származékait gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal vagy hordozóanyagokkal keverjük el. Az ilyen hordozóanyagok, a formulázás, beleértve más humánproteineket is, így például a humán szérumalbumint, a következő helyen vannak ismertetve: (16. kiadás, Osol A. szerk. Mack, Easton PA [1980]). Gyógyászatilag elfogadható hatásos készítmény az anti-ICAM-1-antitest vagy ICAM-1-molekula vagy ezek funkcionális származékainak hatásos mennyiségét tartalmazza megfelelő mennyiségű hordozóanyaggal elkeverve. További, a gyógyszerészeiben ismert módszereket is alkalmazhatunk a hatás időtartamának szabályozására. Szabályozott felszabadulású készítményeket állíthatunk elő például olyan polimerek alkalmazásával, amelyek komplexálni vagy abszorbeálni képesek az anti-ICAM-1-i antitestet vagy az ICÁM-1-molekulát vagy ezek fünkcionális származékait. A hatóanyag szabályozott továbbítására alkalmasan megválasztott makromolekulákat, így például poliésztereket, poliaminosavakat, polivinileket, pirrolidont, etilén-vinil-acetátot, metil-ceilulózt, karboxi-metil-cellulózt, továbbá protamint vagy szulfátot alkalmazhatunk, és ezen makromolekulák mennyisége vagy a beépítés révén ezen makromolekulák mennyiségének szabályozása révén vagy a beépítésre alkalmazott módszer révén szabályozott felszabadulást biztosíthatunk. Egy másik lehetséges módszer a hatás időtartamának szabályozására a szabályozott felszabadulású készítmények révén az, hogy az anti-ICAM-antitestet vagy az ICÁM-1-molekulákat vagy ezek fünkcionális származékait polimer anyagú részecskékbe foglaljuk, amely célra például poliésztereket, poliaminosavakat, hidrogéleket, politejsavat vagy etilén/vinil-acetát kopolimereket alkalmazunk. Eljárhatunk úgy is, hogy a polimer részecskékbe való befoglalás helyett az anyagot mikrokapszulákba foglaljuk, amelyeket például koacerválási technikával vagy határfelületi polimerízációval állítottunk elő, ilyen kapszulák lehetnek például hidroxi-metil-cellulóz vagy zselatin vagy poli(metil-metakrilát) anyagú mikrokapszulák. A hatóanyagot kolloidális hordozórendszerbe is befoglalhatjuk, ilyenek például a liposzómák, az alumin mikrogömböcskék, mikroemulziók, nanorészecskék, valamint nanokapszulák vagy mikroemulziók. Ilyen eljárásokat ismertetnek például a következő irodalmi helyen: (Remington’s Pharmaceutical Sciences [1980]).

A találmányt közelebbről a következő, nem korlátozó példák segítségével illusztráljuk.

7. példa

A CD11 és ICAM-1 sejtadhéziós molekuláktól fiiggő tüdő eozinofiladhéziós reakciók

Annak érdekében, hogy az eozinofilek sejtadhéziójával kapcsolatos követelményeket a migrációs, fitotoxikus hatásukkal kapcsolatban megállapítsuk, in vitro vizsgáltuk az eozinofiladhéziót. Közelebbről a celluláris adhéziós molekulák CD18 családjának és az ICÁM-1-molekulának szerepét vizsgáltuk főemlősök eozinofil sejtjeinek proteinnel bevont műanyaghoz és humánendotéliumhoz való adhéziójára.

Az eozinofil sejteket kifejlett hím, cynomegalus majmok (Macaca fascicularis) bronchopneumóniás mosása révén nyertük, tisztítottuk (>93% morfológia) Percoll folyamatos sűrűséggradienssel, majd mostuk, és 96 lyukú,

HU 216 313 Β lapos fenekű szövettenyésztő lemezre adagoltuk lyukanként 5 χ 10^{2 3 * * *} sejt koncentrációban. A tenyészetet ezután 60 percen át 37 °C-on inkubáltuk, a nem letapadt sejteket lemezmosó segítségével eltávolítottuk. A letapadt sejteket vizuálisan megszámoltuk (aggregáció vagy degranuláció nem volt megfigyelhető), majd kolorimetriás vizsgálattal meghatároztuk az eozinofil peroxidázt (EPO).

Az eozinofil sejtek spontán tapadnak és szétoszlanak a kezeletlen felületi lyukak aljára, vagy pedig az immunkomplexekkel kezelt lyukak aljára (a komplex Ascaris extraktumból, valamint az Ascaris-immun majmok szérumából készült). Ezzel szemben az eozinofilek nem kötődnek megfelelően a proteinekkel bevont lyukakhoz, amely bevonathoz szarvasmarha-szérumalbumint, normál majomszérumot vagy Ascaris extraktumot alkalmaztunk. A különböző vizsgált anyagok közül a Piatelet Activating Factor (PAF) váltotta ki az eozinofilek legkifej ezettebb tapadását a proteinbevonatú lyukakhoz (lásd 3. ábra).

A CD 18 adhéziós molekulák, valamint az ICAM-1molekula szerepét a fenti tapadási folyamatban monoklonális antitestek alkalmazásával vizsgáltuk, amely antitestek mindegyike membrán glikoproteinnel szemben reakcióképes. Antitestként a következőket alkalmaztuk: R3.3 és R15.7 (anti-CD18); R3.1 (anti-CDl la); Ml/70 és LM2/1 (anti-CDl lb); RR1/1 és R6.5D6 (anti-ICAM-1); és W6/32 (anti-HL-A I osztály).

Az eozinofil sejtek immunkomplex-bevonatú lyukakhoz való adhéziója CDI lb-függőnek tűnt, mivel a CDI lb és CDI 8 elleni mAb-k gátolták az adhéziót, míg a CDI la, ICAM-1 és HL-A elleni mAb-k nem (lásd 4. ábra). Hasonló eredményt kaptunk oldható stimulusokkal aktivált eozinofilek esetén, így például PAF és proteinbevonatú lyukak esetén.

Vizsgáltuk az eozinofilek adhézióját endoteiiális sejtekhez is, amelyeket LPS-sel aktiváltunk (10 ng/ml) és glutáraldehiddel rögzítettünk. A humán köldökvéna endoteiiális sejtet ismert módon készítettük (Smith C. W. és munkatársai, J. Clin. Invest. 82: 1746 [1988]). A PAF segítségével (10 ⁷) mól indukált eozinofil sejtek adhézióját az így nyert aktivált endoteiiális sejtekhez, részlegesen gátoltuk CDI la, CDI lb és ICÁM elleni Mab antitestekkel és teljesen gátoltuk anti-CDl 8-cal, továbbá egyáltalán nem gátoltuk anti-HL-A-val (lásd 5. ábra). Ezek a kísérletek eredményei azt mutatták, hogy a megfigyelt adhézió részben függ a CDI la, CDI lb és ICAM-1 esetén. Összefoglalva, a főemlős tüdőeozinofilek közel azonosan viselkednek a humán neutrofilekkel membránadhéziós reakciók során, amelyeknél CDI la, CDI lb és ICAM-1 kerül alkalmazásra. A CAM-molekulák CDI8 családja ezért fontos főszerepet játszik az eozinofil sejtek kötődésében, és felelős az eozinofil sejtek szelektív szövet akkumulációjáért LAD-betegek esetében.

2. példa

ICAM-1-molekula szerepe az eozinofil sejtek infiltrációjában

Annak érdekében, hogy demonstráljuk az ICAM-1nek szerepe van az eozinofil infiltrációban, a légúti epitélium hámlásában, valamint a megnövekedett légúti érzékenységben, amely a bronchiális asztma kísérőjeként a légúti gyulladást jellemzi, vizsgáltuk főemlősökön, az ICAM-1-molekulával szemben reakcióképes monoklón antitestek hatását az asztmára. Közelebbről a következőket vizsgáltuk: (a) az ICAM-1 hatását az eozinofil adhéziójára vaszkuláris endotéliumhoz in vitro, (b) ICAM-1 indukcióját légúti epitéliumon in vitro és in vivő, valamint ugyanezt bronchiális, vaszkuláris endotéliumon in vivő, továbbá (c) az ICAM-1 hatását az eozinofil infiltrációra és egy antigén többszöri inhalálásával indukált légúti érzékenység növekedésére in vivő.

A főemlősből nyert tüdőeozinofil sejteket plateletactivating factorral stimuláltuk (PAF, 10 ⁷ mól), majd lipopoliszachariddal (LPS, 10 ng/ml) stimulált tenyésztett humán köldökvéna endoteiiális sejtek (HUVEC) jelenlétében inkubáltuk a celluláris adhézió vizsgálatához. Az eozinofil sejteket légúti eozinofiliás kifejlett hím cynomolgus majmoktól (Macaca fascicularis) nyertük bronchopneumoniás mosással, majd Percoll folyamatos sűrűséggradienssel tisztítottuk (>95%-os morfológiás tisztaság) (Riding G. A. és munkatársai, J. Immunoi. Metz. 46: 113 [1981]), majd mostuk, és 96 lyukú lapos fenekű szövettenyésztő lemez lyukaiba adagoltuk (5xl0³ sejt/lyuk). A lemezeket ezután 60 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk, a nem megkötött sejteket automatizált lemezmosó segítségével eltávolítottuk, a megkötött sejteket vizuálisan mennyiségileg meghatároztuk, az eozinofil peroxidáz (EPO) kolorimetriás meghatározásával (Strath M. és munkatársai, J. Immunoi. Meth. 83: 209 [1985]). Humán köldökvéna endoteiiális sejteket izoláltunk, minden lyukban összefolyó monoréteggé tenyésztettük, 4 órán át LPS-sel stimuláltuk, végül 1%-os glutáraldehidben rögzítettük (Smith C. W. és munkatársai, J. Clin. Invest. 82: 1746 [1988]). A lyukak immunkomplexes bevonásához Ascaris extraktumot, majd Ascaris-érzékeny majmok szérumát alkalmaztuk.

Megállapítottuk, hogy az adhézió jelentős mértékben gátolt az anti-ICAM-1 monoklonális antitest RR1/1 esetén (Ropthlein R. és munkatársai, J. Immunoi. 137: 1270 [1986], Mariin S. D. és munkatársai, Cell 51: 813 [1987]), lásd 6a. ábra. Ezzel szemben az anti-HLA I osztály kontrol] monoklonális antitest W6/32 esetén, amely szintén kötődik a HUVEC-hez (Smith C. W. és munkatársai, J. Clin. Invest. 82: 1746 [1988]) nem gátolja az eozinofil kötődést (6a. ábra).

Az immunkomplex bevonatú lyukak esetén a főemlős tüdőeozinofil sejtek tapadását az RR1/1 nem gátolta (lásd 6b. ábra), jelezve az endotéliumhoz való tapadás gátlásának specificitását. Ezek az eredmények mutatják, hogy az ICAM-1 fontos szerepet játszik az eozinofil sejtek adhéziójában az endotéliumhoz, és ily módon hozzájárul az eozinofilek gyulladt szövetekbe való migrációjához in vivő.

A szövetekbe való migráció mellett előfeltétel a leukociták adhéziója is a citotoxikus szövetek károsodása szempontjából. Az effektorok adhéziójának gátlása a kívánt sejtekhez csökkenti mind a limfociták, mind a granulociták által közvetített pusztítást, valamint az idegentest-elutasítást in vivő (Martz E. és munkatársai, J. Immunoi. 133: 2972 [1984]). Miután az eozinofilek12

HU 216 313 Β nek, valamint ezek termékeinek része van a légúti epitélium hámlásában (Frigas E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 77: [1986]), ami viszont szoros kapcsolatban van a légúti hiperérzékenységgel (Laitinen L. A. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 137: 62 [1988]), valamint az asztmás tünetekkel (Hargreave F. E. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 68: 347 [1981]), vizsgáltuk a különböző progyulladásos citokinek hatását az ICAM-1 indukcióra légúti epitéliás sejteken in vitro. Az ELISA-teszt (Rothlein R. és munkatársai, J. Immunoi. 141: 1665 [1988]), valamint az RR1/1 és R6.5 antí-ICAM-1 monoklón antitestek (Smith C. W. és munkatársai, J. Clin. Invest. 82: 1746 [1988]) alkalmazásával azt tapasztaltuk, hogy 16 órás, interleukin-l-bet (IL-lb) humán rekombináns tumor necrosis faktor a (TNFa) és humán rekombináns interferon gamma (IFNg) alkalmazásával végzett stimuláció növelte az ICÁM-1-expresszióját tenyésztett majomhörgő epitéliás sejtjeinek monorétegén (2. tábla).

A 2. táblázatban bemutatjuk a progyulladásos citokinek hatását bronchiális epitéliás sejteken az ICAM1 indukciójára in vitro. Rhesus majom hörgő epitéliás 4MBr-5 sejtvonalat (American Type Culture Collection5 bői származó) tenyésztettünk összefüggő monoréteggé, majd 16 órán át IL-lb, TNFa vagy IFNg alkalmazásával stimuláltuk. Az ICÁM-1-expressziójára az ELISA-vizsgálatot [monoklonális antitest RR1/1 (Rothlein R. és munkatársai, 137: 1270 (1986), Mariin S. D. és munka10 társai, Cell 51: 813 (1987)) és R6.5 (Smith C. W. és munkatársai, J. Clin. Invest. 82: 1746 (1988)) és LFAa-a monoklonális antitest R3.1 (Rothlein R. és munkatársai, J. Immunoi. 141: 1665 (1988))] az előzőekben leírtak szerint végeztük (Rothlein R. és munkatársai, J.

Immunoi. 141: 1665 [1988]). A táblázatban megadott számértékek négy vizsgálat alapján az optikai sűrűség átlagos mértékeit jelentik (viszonyítva a normál egér gammaglobulin háttérhez) kettős tenyészetek esetén.

2. táblázat

	Optikai sűrűség egységek
Stimulátor	Koncentráció	RR1/1 (anti-ICAM-1)	R6.5 (anti-ICAM-1)	R3.1 (anti-LFA-la)
nincs	-	92	206	-27
IL-lb	0,1 egység/ml	130	253	-33
	1 egység/ml	166	253	-32
	10 egység/ml	149	322	-37
TNFa	1 egység/ml	100	236	-30
	10 egység/ml	131	266	-29
	100 egység/ml	159	346	-31
	1000 egység/ml	178	416	-36
IFNg	0,1 egység/ml	138	276	-16
	1 egység/ml	263	423	-17
	10 egység/ml	413	673	-26
	100 egység/ml	576	940	-27

A megnövelt ICÁM-1-expresszió időbeli lefutása (3. táblázat) hasonló a korábban közölt HUVEC in vitro adatokhoz (Smith C. W. és munkatársai, J. Clin. Invest. 82: 1746 [1988]), valamint a humán bőr keratinociták in vivő vizsgálathoz (Wantzin G. L. és munkatársai, J. Am. Acad. Dermatol. 20: 782 [1989]). Mint várható volt, az anti-LFA-1-α monoklonális antitest R3.1 (Rothlein R. és munkatársai, J. Immunoi. 141: 1665 [1988]) nem kötődik a nem stimulált vagy stimulált bronchiális epitéliumhoz (2. táblázat). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ICAM-1 hozzájárulhat a leukociták (például eozinofílek) által közvetített légúti epitélium hámláshoz in vivő.

A 3. táblázatban összefoglaljuk a bronchiális epiteliális sejteken az ICAM-1 indukciójának időbeli lefutását in vitro. Rhesus majom bronchus epiteliális 4MBr-5 sejtvonalat (American Type Culture Collectionből származó, nyilvántartási szám: ATCC CCL208, deponálva: 1979. március 19-én) tenyésztettünk összefüggő monoréteggé, majd különböző időtartamokon keresztül IL-lb (10 ng/ml) vagy IFNg (10 egység/ml) segítségével stimuláltuk. Az ICAM-1-expressziójára vonatkozó ELISA-tesztet [monoklón R6.5 antitest (Smith C. W. és munkatársai, J. Clin.

Invest. 82: 1746 (1988))], az előzőekben leírtak szerint végeztük (Rothlein R. és munkatársai, J. Immunoi. 141: 1665 [1988]). A táblázatban szereplő számértékek két párhuzamos mérésben kapott átlagos optikai sűrűséget jelentik (viszonyítva a normál egér gam60 maglobulin háttérhez) három tenyészet esetén.

3. táblázat

Stimulálás ideje (óra)	Stimulátor
IL-lb	IFNg
0	215	215
2	240	250
4	296	349
8	364	349
16	417	826
24	369	812
48	472	672

3. példa

Az ICAM-1 in vivő szerepe bőrhámlásban

Annak további vizsgálatára, hogy az ICAM-1 hogyan járul hozzá az eozinofilközvetített légúti epitélium hámláshoz in vivő, immunohisztokémiai festést végeztünk annak megállapítására, hogy egy antigén többszöri inhalálása kiváltja-e az ICAM-1-expressziót a légúti epitéliumon in vivő.

Szöveteket festettünk meg az előzőekben már ismertetett vizsgálat módosítása szerint (Wantzin G. L. és munkatársai, J. Am. Acad. Dermatol. 20: 782 [1989]). A bőrmintákat eltávolítottuk, és folyékony nitrogénben megfagyasztottuk. Fagyasztott állapotban való darabolás után az 5-10 μ-os darabokat acetonban 10 percig rögzítettük, majd vagy rögtön megfestettük, vagy -20 °C hőmérsékleten tároltuk. A festést a Biotein-Strept Avidin System szerinti kittel végeztük a gyártó cég előírásai szerint (BioCenex, CA). Először az antitesteket inkubáltuk a szövettel hígítás nélküli tenyészet felülúszóként (RPMI 1640 közeg + 10% FBS) 1 órán át szobahőmérsékleten. A nemspecifikus proteinek kötését normál kecskeszérummal végeztük. Szubsztrátként AECt (3-amino-9-etil-karbazol) alkalmaztunk és a szeleteket Mayer-féle hematoxilinnal utánszíneztük.

Intenzív színeződést állapítottunk meg az ICAM-1re mind az epitéliumon (csak a bazilaterális rész), mind a vaszkuláris endotéliumon, amelyet Ascaris antigénérzékeny majmok légcsőrészéből vettünk 20 perccel a harmadik, háromnaponként változó inhaláció után. Az LFA-1-α festése (Anderson D. C. J. Inf. Dis. 152: 668 [1985], Anderson D. C. és munkatársai, Ann. Rév. Med. 38: 175 [1987], Todd R. F. és munkatársai, Hematol./Oncol. Clinics N. Amer. 2: 13 [1988]), de nem a légúti epitéliumon (2. táblázat) kimutatta a leukocita infiltrációt az interstitiumba, amely a legjellegzetesebbnek közvetlenül az epitéliális alapmembrán alatt mutatkozott. A leukociták továbbá igen jól kivehetők voltak az epitéliális sejtek között, különösen az epitélium bazilaterális részén, ahol az ICAM-1-festés a legkifejezettebb volt. Kevés vagy semmi nem specifikus festést figyeltünk meg egérszérum esetén. A festések (ICAM-1, LFA-1-α és egérszérum felhasználásával), amelyeket Ascaris-érzékeny majmok lépcsőszelvényein, amelyeket 20 perccel egyetlen Ascaris-inhaláció után vettünk, kimutatták, mint ahogy az várható volt az expresszióhoz szükséges idő alapján (Wantzin G. L. és munkatársai, J. Am. Acad. Dermatol. 20: 782 [1989], Smith C. W. és munkatársai, J. Clin. Invest. 82: 1746 [1988]), hogy kevés vagy egyáltalán semmi ICAM-1festés található az epitéliumon vagy a vasculáris endotéliumon ezen szelvényen.

Továbbá, bár számos leukocita infiltrálódását állapítottuk meg, a leukociták nem akkumulálódtak az epiteliális alapvonalmembrán közvetlen közelében, és nem voltak megtalálhatók az epitéliális sejtek között. Ily módon ezek az immunohisztokémiai festési vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy egy ICAM-1-függő eozinofil-epiteliális sejt kölcsönhatás hozzájárulhat az asztmás betegeknél kimutatott légúti epitélium hámláshoz.

4. példa

ICAM-1 in vivő hatása asztmára

Miután kimutattuk az ICAM-1 potenciális szerepét a légúti hiperérzékenység patogenezisében, valamint az asztmában, a fentiek szerinti in vitro immunohisztokémiai vizsgálatok segítségével, vizsgáltuk az antiICAM-1-antitestek in vivő hatását. Ezen vizsgálatokhoz egy asztmatikus megbetegedések vizsgálatára alkalmas állatmodellt alkalmaztunk. A modell alkalmazható bármilyen emlős esetében, de különösen előnyösen főemlősöket alkalmazunk e modellben. Az asztmatikus tünetek kiváltására a majmokkal háromszor másodnaponként antigént inhaláltatunk. Ez az adag egy jellegzetes, általában (>8-szoros) légúti érzékenységet indukált az inhalált metakolinhoz viszonyítva (Wegner C. D. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 139: A324 [1989]). A légúti érzékenység ezen növekedését megelőzte egy intenzív eozinofil infiltráció és a növekedés nagyságrendben hasonló ahhoz, amelyet asztmás betegek esetében figyelnek meg a pollenszezonban (Boulet L. P. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 71: 399 [1983], Sotomayor H. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 130: 56 [1984]), vagy amikor a betegek folyamatosan foglalkozási allergéneknek vannak kitéve (Chan-Yeung M. és munkatársai, Am. J. Med. 72: 411 [1982], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 72: 134 [1983], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 63 : 28 [1979]). A metakolin helyett hisztamint vagy más hasonló vegyületeket és metakolinekvivalenseket lehet alkalmazni.

Ezen állatmodell alkalmazásával vizsgáltuk az antiICAM-1 monoklonális R6.5 antitest (nyilvántartási szám: ATCC MB9580, deponálva: 1987. október 30án) hatását az eozinofil infiltrációra és a légúti hiperérzékenység kiváltására in vivő.

A vizsgálatnál meghatároztuk a légúti sejtek összetételét és a légúti érzékenységet 3 nappal az antigén inhalálása előtt (0. nap), (10. nap), háromszor másodnaponként (3., 5. és 7. nap), valamint 3 nappal ez után (Wegner C. D. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 139: A324 [1989]). A légúti sejtösszetételt bronchopneumoniás mosással (BAL) határoztuk meg, a légúti érzékenységet azon inhalált metakolin koncentrációjá14 nak meghatározásával végeztük (PC_]00), amely a légúti rendszer ellenállásának 100%-os növekedését eredményezte. Az R6.5 antitestet intravénásán 1,76 mg/kg napi mennyiségben a 2-9. napokon adagoltuk. Az R6.5 antitesttel végzett vizsgálat eredményeit a minden állaton végzett kontrollvizsgálat eredményeihez hasonlítottuk.

Az R6.5 (anti-ICAM-1) kezelés gyengítette az eozinofil infiltrációt mind az öt vizsgált állat esetében (lásd 7a. ábra). A megnövekedett légúti érzékenység (az inhalált metakolin PC₁₀₀ csökkenése) szintén gátolva volt mind az öt állatnál, különösen négy esetében (lásd 7b. ábra). Meglepetésszerűen két állatnál (c és d) nemcsak hogy nem növekedett a légúti érzékenység, (mint ahogy az a kontrollvizsgálatoknál látható), hanem ténylegesen csökkent (növekedett a metakolin PC₁₀₀) az R6.5 kezelés esetén, a többszöri antigéninhaláció ellenére, mutatva, hogy ezen állatoknál a megnövekedett alap légúti ellenállás érzékenysége megszűnik.

Összefoglalva, ezek a kísérleti eredmények mutatják, hogy az ICAM-1 szelektíve indukálódik a krónikusan gyulladt tracheális vaszkuláris endotéliumon in vivő, hogy az ICAM-1 hozzájárul az eozinofilek vaszkuláris endotéliumhoz való kötődéshez in vitro, és hogy az anti-ICAM-1 monoklonális antitest gyengíti az inhalált antigénnel indukált eozinofil infiltrációt in vivő. Továbbá, az ICAM-1-expresszió megnövekszik a citokinnel stimulált légúti epitéliumon in vitro és szelektíve indukálódik krónikusan gyulladt tracheális epitéliumon in vivő, jelezve, hogy az ICAM-1 hozzájárulhat a légúti epitélium hámláshoz in vivő. Egy anti-ICAM-1 monoklonális antitest képes gátolni a légúti érzékenység növekedését, amelyet majmok esetében többszöri antigéninhalációval indukálunk.

Az eredmények mutatják, hogy az ICAM-1 döntő fontosságú szerepet játszik a légúti hiperérzékenység patogenezisében és az asztmában. Az ICAM-1 ugyancsak hozzájárul más egyéb, légúti gyulladással jellemzett betegségek kiváltásához és kifejlődéséhez (például krónikus bronchitis, emphysema, idiopatikus pulmonáris fibrosis stb. (Guenter C. A. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 123: 79 [1981], Rossi G. A. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 129: 850 [1984], Hunninghake G. W. és munkatársai, Am. J. Pathol. 97: 149 [1979], Hunninghake G. W. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 123: 407 [1981]), valamint hozzájárul az eozinofil infiltrációhoz és a szövetek érzékenyítéséhez/roncsolásához (például nátha, nazális poliposis, krónikus csalánkiütés és atopiás dermatitis (Mygind N. Allergy 34: 195 [1979], Mullarkey M. F. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 65: 122 [1980], Peters

M. S. és munkatársai, J. Invest. Dermatol. 81: 39 [1983], Leiferman, K. M. és munkatársai, N. Engl. J. Med. 313: 282 [1985], Spry C. J. F. és munkatársai, Int. Archs. Allergy appl. Immun. 77: 252 [1985]). Ily módon azok a szerek, amelyek megakadályozzák vagy gyengítik az ilyen celluláris adhéziót, alkalmazhatók ezen betegségek kezelésére hasonlóképpen, mint az asztmánál.

5. példa

Egyszeri vagy többszöri antigéninhaláció hatása a légúti érzékenységre majmok esetében Valamely allergén egyszeri inhalálása állatok esetében (Lanes S. és munkatársai, J. Appl. Physiol. 61: 864-872 [1986], March W. R. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 131: 875-879 [1985]), valamint embereknél is (Cartier A. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 70: 170-177 [1982], CockroftD. W. és munkatársai, Clinical Allergy 7: 503-513 [1977]) a légúti érzékenység enyhe (2-6-szoros) növekedését eredményezheti. Ismételt allergén hatás, mint amilyen például a pollenidőszakban fennáll (Boulet L. P. és munkatársai, J. Allergy. Clin. Immunoi. 71: 399-406 [1983], Sotomayor H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 130: 56-58 [1985]), vagy mint ami foglalkozási ártalomként jelen van (Chan-Yeung M. és munkatársai, Amer. J. Med. 72: 411-415 [1982], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 72: 134-139 [1983], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 63: 28-34 [1979]) sokkal nagyobb (gyakran 10-szeres) légúti érzékenység növekedést eredményez. Majmok esetében többszöri (4 hetenkénti) antigénnel bevont szemcsék adagolása 10-szeres légúti érzékenység növekedést eredményezett (Gundel R. H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. [1989]).

Annak érdekében, hogy még hasznosabb állatasztmamodellt fejlesszünk ki, vizsgáltuk az egyszeri és többszöri antigéninhalációk hatását a légúti érzékenységre az inhalált metakolinhoz viszonyítva. Miután a feltételezések szerint a légúti hiperérzékenység patogenezisében a légúti gyulladások (Marsh W. R. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 131: 875-879 [1985], Sotomayor H. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 130: 56-58 [1984], Lazarus S. Amer. J. Med. 81: 2-7 [1986], O’Byme P. M„ Chest 90: 575-577 [1986]) és különösen az eozinofil infiltráció (Gundel R. H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. [1989], DeMonchy J. G. R. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 131: 373-376 [1985]), Wardlaw A. J. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 137: 62-69 [1988]) szerepet játszik, egyidejűleg vizsgáltuk a légúti celluláris összetételt is.

A vizsgálatokhoz 7 kifejlett hím cynomolgus majmot (Macaca fascicularis, Charles River Primate Imports, Port Washington, NY) alkalmaztunk, amelyek tömege 4,6-8,2 kg volt. Mindegyik állat természetes előfordulással reprodukálható légúti érzékenységet mutatott inhalált Ascaris suum extrakttal szemben. Az állatokat altatott állapotban vizsgáltuk, az altatást ketamin hidrokloriddal (1 mg/kg, i.m., Ketaset, Bristol Laboratories) és xilazinnal (4 mg/kg i.m. Rompun, Miles Laboratories Inc.) végezve, majd mandzsettás endotracheális csővel intubáltuk (5,5 mm ID, Mallinckrodt Critical Care, cat 86048), majd az állatokat függőleges helyzetben speciálisan képzett székbe ültettük. Szükség esetén kiegészítő altatáshoz ketamint alkalmaztunk (4 mg/kg, i.m.)

A légúti érzékenységet (metakolin PC₁₀₀), majd ezt követően a légúti sejtösszetételt (BAL) meghatároztuk nappal, majd 20 órával az egyetlen Ascaris extraktum inhaláció után vagy 3 nappal (0. nap) a többszöri Ascaris extraktum inhaláció előtt, valamint háromszor másodnaponként (3., 5. és 7. nap), majd 3 nappal ez után (10. nap). Mindegyik kísérletnél mind a hét állatot vizsgáltuk. Az állatokat az eredmények értékelésénél betűvel jelöltük.

Asztmás betegeknél a légúti érzékenység növekedésének maximuma 3-24 órával az allergénes kezelés után következik be (Cartier A. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 70: 170-177 [1982], Crockcroft D. W. és munkatársai, Clinical Allergy 7: 503-513 [1977], Durham S. R. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 79: 398-406 [1987]). így a légúti érzékenységet 24 órával az antigén egyszeri inhalálása után mértük.

Mindazonáltal, annak elkerülése érdekében, hogy az állatokat a 6 napos intervallumon belül negyedszer is ne kelljen elaltatni, a légúti érzékenységet nem mértük 24 órával a többszöri antigéninhaláció után. Ehelyett a légúti érzékenységet 3 nappal a többszöri antigéninhaláció után határoztuk meg. Megállapítottuk, hogy a légúti gyulladás (azaz eozinofil infíltráció) 3 nappal az antigéninhaláció után is fennáll (Wegner C. D. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 135: A221 [1987]).

A kísérleteknél antigénként Ascaris suum extraktumot (Greer Laboratories, cat B-33) alkalmaztunk. Az extraktumot foszfáttal pufferolt (5 mmol, pH 7,4) sóoldattal (0,5%), (PBS) hígítottuk, sűrített levegővel porlasztottuk (Bírd Micronebulizer, model 8158) és megszakított, túlnyomásos belégzéssel (Bírd Mark 7A Respirator) adagoltuk, ami 2 perc alatt körülbelül 30 inhalációt (20 H₂O cm) tartalmazott. Minden állatnak egy előzőleg meghatározott koncentrációjú Ascaris extraktumot adagoltunk, amely extraktum reprodukálhatóan a légzőrendszer ellenállásának 150-300%-os növekedését eredményezte. A metakolinkiváltást hasonlóképpen végeztük azzal a kivétellel, hogy ott 1 perc alatt 15 belégzést alkalmaztunk.

A légzőrendszer impedanciáját (Zrs) meghatározott frekvenciájú (4-40 Hz 11 azonos logaritmikus lépésben), a ki-be légzésekre szuperponált szinuszos rezgésekkel mértük (Wegner C. D. és munkatársai, Respir. Physiol. 55: 47-61 [1983]). Ezután kiszámítottuk a teljes frekvenciatartományban a Zrs-ek tényleges vagy azonos fázisú komponensének átlagát, ily módon egyetlen értéket kaptunk a légzőrendszer ellenállásának jellemzésére (Rrs). Az Rrs-értékeket 3, 5, 10, 15, 20 és 30 perccel az antigén kihívása és 1, valamint 3 perccel a metakolinkihívás után határoztuk meg.

A légúti érzékenységet azon porlasztóit és inhalált metakolinkoncentráció alapján határoztuk meg, amely az Rrs-érték 100%-os növekedését okozta (PC₁₀₀). Ezt a metakolin növekvő koncentrációban való adagolása követte (PBS-sel végzett hígítás), féllogaritmikus lépésekben (7 perces intervallumok), egész addig, amíg a bázisvonaltól számítva több mint 100%-os növekedés következett be az Rrs-ben. Ezután kiszámítottuk a PC_1ÜOértékeket, a görbe lineáris regressziós analízisével, amely görbét a logaritmikus metakolinkoncentráció két vagy három utolsó pontjának az Rrs %-os növekedésével szembeni ábrázolásával nyertük.

A légúti sejtösszetételt bronchopneumoniás mosással (BAL) határoztuk meg. A vizsgálathoz gyermekgyógyászati száloptikás bronchoszkópot (Olympus Corporation, model BF-3C4) vezettünk be a taraj mellett addig, amíg az elérte a hörgő 5-7. generációját. Ezután 15 ml 0,5 mmol hidrogén-karbonáttal pufferolt normál sóoldatot (pH=7,4) vezettünk be és gyengén kiszívattuk (kiszívott térfogat 7-10 ml) egy csatornán keresztül a bronchoszkópba. A leukocita/ml BAL összmennyiséget Coulter-számlálóval (Coulter Electronics, model Z_B]) határoztuk meg. Differenciális sejtszám (összesen 200 sejt) meghatározását Wright-Giemsa festett citocentrifugán (Shandon Cytospin, model 2) végeztük. Annak érdekében, hogy meggátoljuk egy BAL előtti vizsgálat hatását egy következő BAL-vizsgálatra, az antigénkihívás előtti és utáni BAL-vizsgálatokat a tüdő ellentétes oldalain végeztük.

A variációs analízist a nemparametrikus KrukalWallis-teszttel végeztük (x-négyzetes közelítés). A korrelációt a Pearson-szorzatmomentum, valamint a változók Spearman-sorának alkalmazásával határoztuk meg. A p>0,05 érték nem tekinthető szignifikánsnak.

Egyszeri antigéninhaláció az Rrs-érték akut növekedését okozza (307±62%), amely a kiváltás után 10-15 perccel éri el a maximumot, továbbá növekedést okoz a légúti leukocitákban (267±19-694±142x 10³/ml BAL, p>X²=0,018) és csökkenést a metakolin PC_i00-értékben 3 állat esetében, amely mérsékelt (>8szoros) volt 2 esetben (8a. ábra). A légúti leukociták növekedése az eozinofilek infiltrációjából áll minden állat esetében (8b. ábra), neutrofilekből 3 állat esetében (8c. ábra) és makrofágokból/monocitákból 5 állat esetében (8d. ábra) és limfocitákból 4 állat esetében (8e. ábra). A légúti érzékenység (metakolin PC₁₀₀) változásának nagyságrendje és iránya nincs összefüggésben az Rrs-érték akut növekedésének intenzitásával vagy bármilyen leukocita altípus infiltrációjának nagyságrendjével/meglétével (4. táblázat).

Az antigén többszöri inhalálása az Rrs akut növekedését (178±48%, 380±83% és 331 ±63%) és a légúti leukociták növekedését (209±42-553±129-szer 10³/ml BAL, p>X²=0,0088) váltja ki és csökkenti a metakolin PC100-értéket 7 állat esetében, ami mérsékelt (>8-szoros) két esetben és komoly (>80-szoros) három esetben (9a. ábra). A légúti leukociták növekedése jellegzetes eozinofil infiltrációból (9b. ábra) és enyhe neutrofil infiltrációból áll (8,5±2,6-31 ±7,5 χ 10³/ml BAL, p>X²= 0,010). A makrofágok/monociták (179±36-209± 40xl0³/ml BAL) vagy a limfociták (3±1,2 —3± 1,3 χ 103/ml BAL) infiltrációja nem szignifikáns. A légúti reaktivitás növekedésének nagyságrendje (PC100csökkenés) nem függ össze az eozinofil infíltráció intenzitásával vagy a légúti reaktivitás (PC₁₀₀) változásának nagyságrendjével/irányával, amelyet az antigén egyszeri inhalálásával indukáltunk (lásd 5. táblázat).

4. táblázat

A metakolin PC_l00-ban bekövetkező változás összehasonlítása a hörgőszűkülettel és az egyetlen antigéninhalációval indukált leukocitainfiltrációval

			Leukocitainfiltráció
Állat	Lóg· PC100 változása	Rrs-növckedés%	Eosin.	Ncut.	Mac./Mono.	Lympho.
a	-1,02	494	23	297	105	3,3
b	-0,95	278	266	-33	421	20,5
c	-0,75	181	668	87	104	2,7
d	0,16	244	242	6	253	18,6
e	0,21	525	38	-6	-73	-1,6
f	0,24	66	124	-2	-78	-3,0
g	0,36	360	221	178	264	-0,4
átlag	-0,25	307	226	76	142	5,8
S. E.	±0,24	±63	±82	±46	±69	±3,7

* Szignifikáns korrelációt nem találtunk

A rövidítések jelentése: Log=10-es alapú logaritmus;

PC₁₀₀=mctakolin provokációs koncentrációja, amely az Rrs-érték 100%-os növekedéséhez szükséges; Rrs=légzőrendszeri ellenállás; BAL=bronchoalveoláris mosás; eozin.=eozinofilck; neut=neutrofilck; Mac./Mono=makrofág/monocita; limfo=limfociták

5. táblázat

A metakolin PCioo-értékben bekövetkező változás összehasonlítása az eozinofil infiltrációval, amelyet többszöri antigéninhalációval indukáltunk, valamint az egyszeri antitestinhalációval indukált metakolin PC₁₀₀-értékben bekövetkező változással

	Antigén többszöri inhalációja
Állat	Lóg. PC |00 változása	Eosin. infiltráció (xKP/ml BAL)	Lóg. PC!oo változása
d	-2,66	144	0,16
b	-2,13	352	-0,95
e	-1,95	409	0,21
a	-1,07	135	-1,02
g	-0,97	174	0,36
c	-0,43	206	-0,75
f	-0,27	109	0,24
átlag	-1,36	218	-0,25
S. E.	±0,34	±44	±0,24

A rövidítések jelentése: Lóg=10-es alapú logaritmus; PCi₀₀=metakolin provokációs koncentrációja, BAL=bronchoalveoláris mosás; eozin.=eozinofilck; Ag.=antigén ‘Szignifikáns korrelációt nem találtunk

Ezek a kísérletek demonstrálják, hogy a nem specifikus légúti túlérzékenység, amely klinikaiig a légutak belélegzett hisztaminnal, metakolinnal, fizikai igénybevétellel vagy hideg levegővel szembeni érzékenységben jelentkezik, az asztma jellemző tünete (Bousehy H. A. és munkatársai, Am. Rév. Respir. Dis. 121: 389-413 [1980]). Miután a légúti túlérzékenység kialakulásának mechanizmusa még nem ismert, számos tanulmányból arra lehet következtetni, hogy leukocitainfiltrációról (Gundel R. H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis.

[1989], Marsh W. R. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. 131: 875-879 [1985], Lazarus S. Amer. J. Med. 81: 2-7 [1986], O’Byme P. M., Chest 90: 575-577 [1986], DeMonchy J. G. R. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 131: 373-376 [1985], Wardlaw A. J. és munka60 társai, Amer. Rév. Respir. Dis. 137: 62-69 [1988],

HU 216 313 Β

Metzger W. J. és munkatársai, Chest 89: 477-483 [1986]) és/vagy a meglévő vagy infiltrálódó sejtek által felszabadított közvetítőkről (Lanes S. és munkatársai, J. Appl. Physiol. 61: 864-872 [1986], Lazarus S. Amer. J. Med. 81: 2-7 [1986] O’Byrne P. M., Chest 90: 575-577 [1986], Wardlaw A. J. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 137: 62-69 [1988], Aizawa H. és munkatársai, J. Appl. Physiol. 59: 1918-1923 [1985], O’Byrne P. M. és munkatársai, Protsagalndins 4: 537-543 [1984]) van szó.

Ismert, hogy az antigéninhaláció akut neutrofil és még inkább krónikus eozinofil légúti infiltrációt vált ki (Wegner C. D. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 135: A221 [1987]). A krónikus idiopatikus légúti eozinofilia komoly (>80-szoros) légúti hiperérzékenységgel kapcsolatos (Wegner C. D. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 135: A222 [1987]). Antigénbevonatú gyöngyök többszöri (4 hetenkénti) hörgőbe való helyezéséről kimutatták, hogy jelentős mértékben növeli a légúti eozinofileket és az érzékenységet (>8-szoros) (Gundel R. H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. [1989]). A fentiekben ismertetett kísérletekben összehasonlítjuk az egyszeri és többszöri (háromszor másodnaponkénti) Ascaris suum extraktum inhalációjának hatását a légúti érzékenységre és a leukociták összetételére „allergiás” majmok esetén.

Az egyszeri antigéninhaláció akut hörgőszűkületet okozott (20 órával később mérve), továbbá a leukociták infiltrációját (elsődlegesen és főleg eozinofilekét) és a légúti érzékenység (az inhalált metakolin PC_10o) csökkenését váltotta ki a kísérleti állatok közül háromban, ami két esetben mérsékelt volt (>8-szoros). Ezek a hatások, valamint az előfordulás gyakorisága hasonló, mint amilyeneket emberekkel kapcsolatban leírtak. Azaz, allergiásasztma-betegek esetében az antigén egyszeri inhalációja túlnyomórészt eozinofil leukociták infiltrációját váltja ki (DeMonchy J. G. R. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 131: 373 -376 [1985]) és néhány beteg esetében növeli (általában enyhén, >8-szoros) a légúti érzékenységet (Cartier A. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 70: 170-177 [1982], Cockcroft D. W. és munkatársai, Clinical Allergy 7: 503-513 [1977]).

Ezzel ellentétben az antigén többszöri inhalálása mint azt a legutolsó kiváltás után 3 nappal meghatároztuk - növekedést eredményez a légúti érzékenységben mind a hét majomnál, ami mérsékelt volt (>8-szoros) két esetben és komoly (>8-szoros) három esetben. Ezek a hatások szintén hasonlóak az emberekkel kapcsolatban leírt hatásokhoz. A pollenidőszak alatt az allergiás asztmás betegek légúti érzékenysége minden vizsgált beteg esetében nő, bár különböző mértékben (Boulet L. P. és munkatársai, J. Allergy. Clin. Immunoi. 71: 399-406 [1983], Sotomayor H. és munkatársai, Amer. Rév. Respir. Dis. 130: 56-58 [1984]). Hasonlóképpen a foglalkozási allergének hatásának ismételten kitett érzékeny egyedek esetében nő a légúti érzékenység (Chan-Yeung M. és munkatársai, Amer. J. Med. 72: 411-415 [1982], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 72: 134-139 [1983], Lám S. és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi. 63: 28-34 [1979]).

Mind az egyszeri, mind a többszöri antigéninhalációs vizsgálatokban a légútiérzékenység-változás nagyságrendje/iránya nem függ össze a leukocitainfiltráció intenzitásával. Ez a megállapítás alátámasztja, hogy a leukocitainfiltráció önmagában nem elegendő, hogy arra következtessünk, hogy közvetlen szerepe van a légúti hiperreaktivitás kórtünetének kialakításában. Inkább fontos faktornak tűnik az infiltrálódó, valamint a jelen lévő sejtek által felszabadított közvetítők mennyisége és típusa (stimulátor vagy inhibitor), valamint az infiltrálódó és jelen lévő sejtek (például eozinofilek és légúti epitélium) között bekövetkező kölcsönhatás.

Összefoglalva, mint már korábban is említettük, asztmás betegek esetében az antigén többszöri (de nem egyszeri) inhalálása majmok esetében a légúti érzékenység jellegzetes (általában >8-szoros) növekedését váltja ki. Ezek a megállapítások jelzik, hogy az ilyen állatmodellt alkalmazhatjuk az asztma kezelésére alkalmas szerek kiválasztására és azonosítására.

Bár a találmányt a fentiekben specifikus megvalósítási módozatokkal kapcsolatban ismertettük, a szakterületen meglévő ismeretek keretén belül létrehozott bármilyen változtatás vagy adaptálás lévén létrejövő megoldások szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Claims (24)

1. Eljárás hatóanyagként

a) ICÁM-1-hez kötődni képes antitestet;

b) az a) pont szerinti antitest ICÁM-1-hez kötődni képes fragmensét;

c) a természetes szennyeződésektől megtisztított ICÁM-1 -molekulát;

d) az ICAM-1-molekula funkcionális származékát;

e) a glikoproteinek CD 18 családjának egy tagjához kötődni képes antitestet;

f) az e) pont szerinti antitestnek a glikoproteinek CDI 8 családja egy tagjához kötődni képes fragmensét;

g) a glikoproteinek CDI 8 családjának bármely, természetes szennyeződésektől megtisztított tagját; és/vagy

h) a glikoproteinek CD18 családja bármely tagjának funkcionális származékát tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyago(ka)t gyógyászatilag szokásos hordozóanyagokkal és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítünk, és az elegyet asztma kezelésére alkalmas készítménnyé alakítjuk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a) pont szerinti, ICÁM-1-hez kötődni képes antitestet vagy az antitest ICÁM-1-hez kötődni képes fragmensét alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptemberi.)

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a) pont szerinti antitestként monoklonális antitestet alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként az R.6.5 jelű monoklonális antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként természetes szennyeződésektől megtisztított ICÁM-1-molekulát alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptemberi.)

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az ICÁM-1-molekula funkcionális származékát alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális ICÁM-1-származékként az ICAM-1molekula 1. doménját tartalmazó funkcionális származékot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális ICÁM-1-származékként az ICAM-1molekula 2. doménját tartalmazó funkcionális származékot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális ICÁM-1-származékként az ICAM-1molekula oldható származékát alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oldható ICÁM-1-származékként az ICÁM-1-molekula 1-5. doménjait tartalmazó funkcionális származékot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként e) pont szerinti, a glikoproteinek CD 18 családjának egy tagjához kötődni képes antitestet vagy az antitest glikoproteinek CD 18 családjának egy tagjához kötődni képes fragmensét alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy e) pont szerinti antitestként a glikoproteinek CD18 családja egy tagjának α-alegységéhez kötődni képes antitestet alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy e) pont szerinti antitestként a glikoproteinek CD 18 családja egy tagjának B-alegységéhez kötődni képes antitestet alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a glikoproteinek CD 18 családjának egy tagját alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoproteinek CD 18 családjának tagjaként a

CD 18 család egy tagjának α-alegységét tartalmazó CD 18 családtagot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptemberi.)

16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoproteinek CD18 családjának tagjaként a CD 18 család egy tagjának B-alegységét tartalmazó CD 18 családtagot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoproteinek CD 18 családjának tagjaként a CD 18 család egy-egy tagjának a- és B-alegységét egyaránt tartalmazó heterodimer CD 18 családtagot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoproteinek CD 18 családjának tagjaként a glikoproteinek CD 18 családja egy tagjának funkcionális származékát alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1989. szeptemberi.)

19. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoproteinek CD 18 családjának tagjaként egy, a Mac-1 α-alegységét tartalmazó glikoproteint alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. március 9.)

20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoproteinek CD 18 családjának tagjaként egy, a Mac-1 B-alegységét is tartalmazó glikoproteint alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. március 9.)

21. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glikoproteinek CD 18 családjának tagjaként egy, az LFA-1 B-alegységét tartalmazó glikoproteint alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1989. március 9.)

22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként

a) ICÁM-1-hez kötődni képes antitestet;

b) az a) pont szerinti antitest ICÁM-1-hez kötődni képes fragmensét;

c) a természetes szennyeződéstől megtisztított ICÁM-1-molekulát; és/vagy

d) az ICÁM-1-molekula funkcionális származékát tartalmazó gyógyászati készítményt állítunk elő. (Elsőbbsége: 1989. március 16.)

23. Eljárás asztma kezelésére alkalmas hatóanyag azonosítására, azzal jellemezve, hogy a vizsgált anyagot többszöri antigéninhaláción átesett nemhumán emlősnek beadjuk, és mérjük a légúti érzékenység változását.

(Elsőbbsége: 1989. szeptember 1.)

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a légúti érzékenység változását metakolin vagy hisztamin alkalmazásával méljük.