JPH06504426A - 抗イディオタイプ抗体を用いる炎症の治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗イデイオタイプ抗体を用いる炎症の治療法発明の技術分野 本発明は抗ＩＣＡＭ−１抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントを利用し たＩＣＡＭ−１−依存性炎症応答を阻止する方法に関する。特に本発明はＩＣＡ Ｍ−１担持細胞に対する免疫応答を引き起こすに十分な量の抗−ＩＣＡＭ−１抗 イデイオタイプ抗体で患者を免疫化することにより患者のＩＣＡＭ−１−依存性 炎症を治療する方法に関する。

発明の背景 細胞接着は循環系から炎症発生部位へ移動してホストを外部侵害者、例えば細菌 やウィルスから適切に保護するために白血球が細胞基買、例えば内皮細胞に付着 する工程である。防御システムに関する優れた著書はエイチ・ダブリュー・アイ ゼン（イン：マクロバイオロジー、第３版、ハーバ−、アンド・ラウ、フィラデ ルフィア、ＰＡ（１９８０’ｌ、ｐｐ、２９０−２９５および３８１−４１８） により提供されている。接着工程に関与している内皮細胞表面上の分子の一つは 細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１である。ロスラインら著ジャーナル・オフ・イムノ ロジー１３７＋１２７０（１９８６Ｘ以下、「ロスラインら」と呼ぶ）を参照さ れたい。これを本明細書の内容の一部とする。この分子は、白血球の細胞表面上 に存在するＣＤ１８群の糖蛋白質分子と結合して接着を仲介しているものと考え られる（エフ・サンチェツツーマドリッドらジャーナル・オフ・エキスベリメン タル・メジイシン１５８：１７８５−１８０３（１９８３）＋ジー・ディー・カ イザーら、ユーロピアン・ジャーナル・オフ・イムノロジー１５＋１１４２−１ １４７（１９８５））。

この一群の糖蛋白質は１ケのα−鎖（“ＣＤ１１”と呼ぶ）と１ケのβ−鎖（“ ＣＤｌ８”と呼ぶ）を有するヘテロダイマーから構成される。ＣＤ１８群には３ 種の主要なメンバー：Ｐ２Ｓ５．９５．Ｍａｃ−１およびＬＦＡ−１がある。Ｍ ａｃ−１は大食細胞、顆粒細胞および巨大顆粒リンパ球上に最初に見出されたヘ テロダイマーで１３５（１９８２））。ｐ１５０．９５はＭａｃ−１に類似の組 織分布を有し、同じく細胞接着の役割を果たす（ジー・カイザーらユーロピアン ・ジャーナル・オフ・イムノロジー１５：１Ｍ２−１１４７（１９８５））。

しかしながら、しばしばＩＣＡＭ−１により仲介された接着は望ましくない炎症 、例えば関節炎、ぜん息、移植組織の拒絶または破壌、または血液が先に破損（ 閉塞）した動脈の再入し得る際に生ずる再環流損傷をもたらす。従って、適当な 環境では、ＩＣＡＭ−１がそのＣＤ１８リセプター分子へ結合するのを阻止また は防止することによりＩＣＡＭ−１仲介液着を阻止または除去するのが望ましい 。

ＩＣＡＭ−１がそのＣＤ１８リセプターに結合するのを防止するための一つの方 策は、ＩＣＡＭ−１に結合するためのＣＤ１８リセプターと競合する分子を利用 する方法である。その様な競合分子の一つは抗−ＩＣＡＭ−１抗体である。ＩＣ ＡＭ−１に対するマウスのモノクローン抗体は細胞／細胞間相互反応を必要とし 、かつインビトロでの内皮細胞の単層を介して、顆粒球接触およびそれに続く移 動を阻止するリンパ球増殖性の応答を阻止することがわかった。マウス抗−ＩＣ ＡＭ−１抗体はまた白血球がラビットの炎症を生じた肺、霊長類の抗原惹起型気 道過敏症および腎異型移植反応への移行を阻止することが知られている。例えば ダスティンら著、ジャーナル・オフ・イムノロジー１３７：２４５（１９８６） およびウニブナ−らサイエンス２４７＋４５６（１９９０）を参照されたい。マ ウスモノクローン抗−ＩＣＡＭ−１抗体の使用は治療上有効である。何故ならマ ウス抗−ＩＣＡＭ−１はＩＣＡＭ−１に結合し、かつ白血球接着と干渉すること により炎症応答性を減少し得る。しかしながら、治療は霊長類におけるマウス免 疫グロブリンの生来の免疫原性により、短期間でなければならない。

「ネットワーク」理論「エフ・ケイ・ヤーン、アン・イムツール（インスト・パ スツール）１２５Ｃ：３７３（１９７４）］によると、イディオタイプと抗−イ ディオタイプ抗体のネットワークは免疫応答性の発現を抑制する。抗イデイオタ イプ抗体（または抗イデイオタイプ）は、別のくプライマリ−）抗体に対して生 じた抗体であり、これは、そのプライマリ−抗体に特有のエピトープを認識する 。実際にある種の抗イデイオタイプはそのプライマリ−抗体が指向されているエ ピトープをまねる。例えばある種の抗−インシュリン抗イデイオタイプはインシ ュリン・リセブターのアゴニストとして作用する［シエヒターら、アンテイーイ デイオタイブス、リセブターズ・アンド・モレキュラー・ミミクリー、ｐ７３（ ディー・ニス・リンチカム・アンド・エン・アール・ファリツド、ニブイス、ニ ューヨーク、１９８ｇ）］。ある種の抗−モルヒネ抗イデイオタイプはオピエー ト・リセプターと結合するであろう（エンジーら、ユーロビアン・ジャーナル・ オフ・ファーマコロジ−１０２：１８７，１９８４）。ある種の抗−ウイルス抗 イデイオタイプはホストが抗イデイオタイプで免疫化されたウィルスに対して免 疫応答性を惹起した（例えばガウルトンら、ジャーナル・オフ・イムノロジー、 １３７−２９３０．１９８６）。米国特許第４，９１８．１６４明細書は抗−腫 瘍抗−イディオタイプおよびそれらの免疫治療および免疫予防への使用を記載し ている。モノクローン抗−ＣＤ１８抗−ＣＤ１８抗イディオタイプ抗体は、ヒル ドレスら、モレキュラー・イムノロジー、２６：１１５５（１９８９）に記載さ れている。

従って本発明の目的は抗−ＩＣＡＭ−１抗−イディオタイプ抗体を用いるＩＣＡ Ｍ−１依存性炎症の治療法を提供する点にある。本発明の目的はまた抗−ＩＣＡ Ｍ−１抗−イディオタイプを提供することにある。

ＣＡ３のＲ６，５Ｆ（ａｂ）フラグメントに対する特異的結合コントロールマウ スＩｇ（黒棒状グラフ）またはＣＡ３（斜線棒状グラフ）のＲ６゜５およびＲＲ Ｉ　Ｆ　（ａｂ）フラグメントに対する結合をＥＬＩＳＡア・ソセイ中で／く一 オキシダーゼ共役抗−マウスＩｇＧにより検出した。

ＥＬＩＳＡアッセイにおいて種々の濃度の精製ＣＡ３の、Ｒ６，５のＦ　（ａｂ ）フラグメント（実線）、ＲＲＩ（点線）；および通常のマウスＩｇＧ（破線） に対する結合を定量した。

図３ Ｒ６，５に結合したＣＡ３および抗−カッパ・ライト・チェーンに及ぼすｓｌｃ ＡＭ−１の効果 ＣＡ３単独（黒棒グラフ）；ＣＡ３＋ｓＩＣＡＭ−１（斜線棒状グラフ）：抗− カッパのみ（クロス・ハツチ棒グラフ）：抗−カッｔ＜＋ｓＩＣＡＭ−１（）Ｅ ＬＩＳＡアッセイにおける種々の濃度のラビット抗−ＣＡ３と正常なラビットＩ ｇＧとの固相ｓＩＣＡＭ−１への結合を定量した。抗−ＣＡ３は黒：正常なラビ ットＩｇＧはクロス・ハツチで表わす。

図５ 正常なラビットＩｇＧ（レーン１−５）、ラビット抗−ＣＡ３（レーン６−１０ ）およびＲ６，５（レーン１１）のネイティブおよび還元ｓＩＣＡＭ−１への結 合の免疫プロット比較 図６ 還元ｓ−ＩＣＡＭ−１（左手プロット）に対して結合した抗−ＣＡ３とネイティ ブｓｌｃＡＭ−１（右手プロット）に結合したＲ６，５のウェスターン・プロッ ト分析の核部ロットの右手のレーンは固定された分子量標準を示す。

図７ ＪＹセルに結合したラビット抗−ＣＡ３および正常ラビットＩｇＧのＦＡＣ８分 析。点線は抗−ＣＡ３　１：１０；破線は抗−ＣＡ３　１：２０；粗点線は正常 ラビットＩｇＧ１：１０；および実線は正常ラビット１：２０を示す。

発明の説明 本発明は治療上有効な量の抗−ＩＣＡＭ−１抗−イディオタイプ（Ａｂ２β）ま たはそれらのフラグメントを患者に投与することを特徴とし、このＡｂ２βまた はフラグメントが炎症に関与するＩＣＡＭ−１リセブターへのＩＣＡＭ−１の結 合を阻止する抗−ＩＣＡＭ−１抗体（Ａｂｌ）イディオタイプであると認識する 。

患者のＩＣＡＭ−１依存性炎症を治療するための方法に関する。Ａｂ２βはＩＣ ＡＭ−１の抗原エピトープと構造上の相同性を有する。この構造上の相同性（ま たは内部イメージ）の由にＡｂ２βの患者への投与は患者に抗Ａｂ２β抗体（ａ ｂ３）を生じさせる。少なくとも１つのａｂ３（Ａｂ３’）はＡｂｌをまねる。

Ａｂ３’は、ＩＣＡＭ−１に結合して接着においてＩＣＡＭ−１の機能を阻害す る。即ち、ａｂ３゛は、ＩＣＡＭ−１が炎症に関与する白血球リセブターに結合 するのを阻止する。結果として炎症は減少し、除かれる。ＡｂｌとＡｂ２抗体は 抗体を製造するための公知の方法、例えばポリクローン血清の免疫精製法、ハイ ブリドーマ技術または組替型細胞培養技術を用いることにより調製できる。例え ばコーラ−ら、ピー・エン・エイ・ニス　ＵＳＡ７７（４）：２１９７（１９８ ０）および米国特許第４、８１６．５６７号明細書参照。

モノクローンＡｂｌを調製するために例えばマウスをまずＩＣＡＭ−１で免疫化 し、このマウスを次いで殺してその膵臓を取出す。膵臓細胞を骨髄腫細胞と融合 してハイブリドーマを調製する。このハイブリドーマを培養し、その上清みをラ ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンチーム・リンクド・イムノアッセイ（ＥＬ ＩＳＡ）または好ましくはロスレインらに記載された凝集アッセイによって、抗 −ＩＣＡＭ−１活性に対してスクリーンする。モノクローン抗体（ｍＡｂ）を所 望の抗−ＩＣＡＭ−１活性と共に分泌するハイブリドーマをクローンし、培養し てＡｂｌを得る。好ましくはＡｂ２βはモノクローン抗体である。モノクローン Ａｂ２βは、モノクローンＡｂｌの調製と同様の方法で調製できる。マウスをま ずＡｂｌで免疫化する。このマウスを次いで殺し、その膵臓を取出す。この膵臓 細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを得る。このハイブリドーマを培養 し、その上清みを例えばＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより抗−Ａｂｌ活性に対して スクリーンする。所望の抗−Ａｂｌ活性を有するＭａｂを分泌するハイブリドー マをクローンし、培養してＡｂ２βを調製する。

Ａｂ２βを患者に投与する方法としては多くの方法、例えば皮肉、筋肉内、腹腔 内、静脈内、皮下および鼻腔内を経由する方法がある。好ましくは、Ａｂ２βの 投与は種々のアジュバントの存在下でＡｂ２βの皮下または筋肉内注射を利用す る。投与されるＡｂ２βの量は投与ルート、炎症の種類、患者の応答性などによ り著しく異なるが、一般にはＡｂ２β０．１ｍｇから１００ｍｇ１好ましくはＡ ｂ２β約２βｇを患者に投与する。Ａｂ２βは免疫応答性を増強するに適したア ジュ／＜ンド、例えば鉱物ゲル例えば水酸化アルミニウム：界面活性剤、例えば リゾレシチン；ブルロニック・ポリオール類、ポリアニオン類：ペプチド類；お よび油性エマルジョンなどと共に配合する。

本発明に有用なＡｂ２βは、Ａｂｌのイディオタイプに結合する所望のＩＣＡＭ −１結合部位をまねる。全ての抗体およびフラグメントまたはそれらの全ての化 学変性物を含む。Ａｂ２βフラグメントは当該技術分野における種々の技術、例 えばＡｂ２βの蛋白分解によって、あるいは、組替構成により得ることもできる 。

本発明を以下の実施例により説明する。

実施例Ｉ Ａ、ＣＡ３履Ａｂの調製 ハイブリドーマ・セル・ラインＲ６’５０６’Ｅ９°Ｂ２（ＡＴＣＣＨＢ９５８ ０）により製造したモノクローン抗−ＩＣＡＭ−１抗体Ｒ６，５（以下“Ｒ６， ５”と言う）をｌ　ｍｇ／ｍｌの濃度においてキーホール・リンペット・ヘモシ アニン（ＫＬＨ）（シグマ・ケミカル、ニス・ティー・ルイス、ＭＯ）１ｍｇ／ ｍｌおよび０．０５％ゲルタールアルデヒド（シグマ）と共に室温で２時間イン キュベートし、りん酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、ＫＬＨ−Ｒ ５，５複合体を得た。６〜８週令の雌Ｂａ１ｂ／ｃマウス（チアールス・リバー ・ラボラトリーズ、ケンブリッジ。

ＭＡ）に腹腔内注射（ｉ、　ｐ、　）シた。投与量はマウス当り、ＫＬＨ−Ｒ６ ，５複合体１００μｇの完全フロインズ・アジュバント（ＣＦＡＸディフコ・ラ ボズ）合計０゜４ｇ＋１であった。３週間後、マウスを不完全フロインズ・アジ 二ノくンド（ＩＦＡＸディフコ・ラボズ）と共にＫＬＨ−Ｒ６，５複合体１００ μｇで追加免疫した。最終追加免疫（３週間後）はマウス当り５　Ｘ　１０’Ｒ ６，５／％イブリドーマ細胞（ＡＴＣＣＨＢ９５８０）をｉ、　ｐ、注射して行 なった。細胞を注射前照射（１００ＯＲ）ｌ。

た。

最終追加免疫後マウスを殺して融合のため膵臓を取出した。膵臓細胞をＰ３ｘ６ ３Ａｇ８．６５３骨髄腫と４：１の比率でＰＥＧ４０００（ブイ・ダブリュー・ アール、フィラデルフィアＰＡ）と共に融合した。融合混合物を９６−ウェル・ マイクロタイター・プレート（コスタ−、ケンブリッジ・ＭＡ）中にアリコート した。

得られたハイブリドーマ上清みをＥＬＩ　ＳＡにより抗−Ｒ６，５活性に対して スクリーンした。簡単に述べるとＥ、１．　Ａ、、プレート（フロー・ラボズ、 マクリーン、ＶＡ）をＭａｂＲ６、５Ｆ　（ａｂ）’　！（ジャクジン・ラボス 、ウェスト・グループ、ＰＡ）または適当なコントロール抗体で１μｇ／ウェル の割合で、ドウブレニス・りん酸塩緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中、４℃で１晩 コートした。このプレートをＤＰＢＳで２回洗浄し、２％ＢＳＡ溶液で３７℃１ 時間ブロックし、ＤＰＢＳで３回洗浄し、次いでラビット抗−マウスＩｇＧ−Ｆ ｃ−特異的バーオキシダーゼ複合抗体を加え（アキュレイト、ウェストバリー、 ＮＹ）、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＤＰＢＳで４回洗 浄し、基質、０，１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４，２に溶かした２、２−アジノ ージ（３−エチルベンズチオゾリン・スルホニツク・アシドＸＡＢＴＳ）および 過酸化水素０．０３％（ザイムド・サン・フランチェスコ、（Ａ）を加えた。随 時濃度を４１０ｎｍ（ダイナチック・プレート・リーダー・ＭＲ６００）で読ん だ。興味あるハイブリドーマの一つをクローンし、限界希釈法によりサブクロー ンした。このクローン、ＣＡ３／ＨＩＯは、Ｔ　ｇＧ、ｍＡｂクラス（以下“Ｃ Ａ３”と言う）をオークターロ二一およびＥＬＩＳＡにより測定したごとく分泌 した。

ブリスタイン感作Ｂａ１ｂ／ｃｖウスに０．５＋Ｉ　ＤＰＢＳ中５Ｘ１０６ＣＡ ３／Ｈ１０細胞と共に注射（１、ｐ、）シた。注射１４日後、腹水腫張の発生が みられ、マウスを首を脱臼させて殺した。ＣＡ３−富腹水を集め、遠心分離して 細胞を取出した。

ロスラインらの方法に従って定量的な凝集を実施した。要約するとハイブリドー マ・セル・ラインＣＡ３／ＨＩＯからの培地上清み１００μ】をマイクロタイタ ー、プレート中３７℃で３０分間、完全なメディア中に０．１μｇＲ６，５１ｇ 溶液を含む５０μｍでプリインキュベートした。その際フォルボール１２−ミリ ステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、（シグマ・ケミカル・コ、エステイ−、 ルイス、ＭＯ）Ｌｏｎｇを含むメディア５０μｍ中のｌＸ１０’ＪＹセルを加え た。セルを０．５〜２０時間３７℃でインキュベートし、凝集を数えるため、倒 立顕微鏡で観察した。

Ｃ１競合結合の検討 ＥＩＡマイクロタイター・プレートを、Ｒ６，５または正常なマウスＩｇＧＦ　 （ａｂ’　）ｚ　１　μｇ／ウェルで、ＤＰＢＳ中、４℃で一晩コートした。こ のプレートを３回洗浄し、２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で３７℃１時間ブロ ックした。次いでＢＳＡを払いのけて可溶性ＩＣＡＭ−１（ｓＩＣＡＭ−１）の ５０μｍ（ニス・マーリンら、ネイチャ一旦４４．７Ｏ−７２（１９９０）に記 載のごとくして調製した）、またはコントロール溶液（最終濃度２５μｇ／膳１ ）と置換し、３７℃で３０　・分間インキュベートした。溶液を除去することな く、適当なｍＡｂ溶液５０μｍを加え（１０μｍ／ｍ１最終濃度）を加え、３７ ℃で１時間インキュベートした。このプレートを４回洗浄し、パーオキシダーゼ 複合ラビット抗−マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異性抗体の適当な希釈液を加え、インキ ュベートし、再び洗浄した。ＡＢＴＳ基質を加え、発色を４１０ｎＭで読んだ。

Ｄ、抗−ＣＡ３免疫化 ２．５〜３．５ｋｇの白色（ＮＺＷ）ラビット（ハーレ・マーランド、ヘライツ ト、Ｎ、Ｊ、　）をＣＡ３．０．５ｍｇのＣＦＡ溶液を皮下注射で追加免疫化し 、３週間毎にＣＡ３　０．５ｍｇのＩＦＡ溶液で追加免疫化した。血液と血清試 料を第２追加免疫後に取出した。

Ｅ、抗−ＣＡ３抗体の結合 ＥＩＡプレートをネイティブなまたは還元ｓＩＣＡＭ−１の１μｇ／ウェルで４ ℃でコートした。還元ｓｌｃＡＭ−１を、マーリンら（前出）に記載のごとく調 製したネイティブｓＩＣＡＭ−１を１Ｍ２−メルカプトエタノール（最終濃度） 中、室温で３０分間インキュベートすることにより調製した。オボアルブミン（ ２％）コート・フレート（ＯＡ）を陰性のコントロールとして調製した。プレー トをＤＰＢＳで３回洗浄し、２％ＯＡで３７℃１時間ブロックした。アッセイ・ プレートに抗−ＣＡ３−抗体または正常ラビットＩｇＧ（コントロール）を加え る前にブロック化溶液を２％ＯＡ、Ｒ３，１（１００μｇ／ａｌ、コントロール ＩｇＧ１）、ｍＡｂ（スミスら、ジエイ・タリノ・インベスティゲーンヨン８２ ＋１７４６−１７５６（１９８８）の方法で調製）またはＣＡ３．１００μｇ／ ａｌのいずれかを１ウェル当り５０μｌで置換した。次いでマイクロタイター・ プレートを３７℃で１．５時間インキュベートし、３回洗浄し、ヤギの抗−ラビ ットＩｇＧ−パーオキシダーゼ酵素複合体で３７℃、１時間インキュベートし、 さらに４回洗浄し、１００μｍ／ウェルＡＢＴＳ基質でインキュベートした。４ １０ｎＭで光学濃度を測定した。

Ｆ、ウェスターン・プロット・分析 可溶性ＩＣＡＭ−１を、６％ＳＤＳ、　４ＩＩＩＭ尿素、１２５＋Ｍ）リス、４ ｍＭＥＤＴＡ、０．２５％ブロモフェニル・ブルーおよび１０％グリセロールを 含むｐＨ６，９のサンプル緩衝液で８％レムリ５ＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲ ル上で展開した。ｓＩＣＡＭ−１に最終容積１５０μｍ中レーン当し５μｇの濃 度で負荷し、４５ボルトで１６時間展開した。２５ｍＭトリス、１９２＋ａＭが グリセリン、０゜１％ＳＤＳおよび２０％Ｖ／Ｖメタノールを含む溶液中のトラ ンス・プロット（バイオ−ラド、リッチモンド、ＣＡ）中で４℃で２時間５０ボ ルトかけてニトロセルロース膜に移動させた。

次いでニトロセルローズ膜を０．０５％ツイン−２０（ＴＢＳＴ）を含む１０ａ Ｍトリス緩衝１５０ｍＭ　ＮａＣ１溶液中で洗浄し、５％牛の血清アルブミン（ ＢＳＡ）（シグマ）中で３７℃、２時間ブロック化した。

次いで個々のレーンを切り取り、正常なラビットＩｇＧ、ポリクローン抗体抗− ＣＡ３、Ｒ６，５または無抗体のうちいずれかと共に濃度２０μｇ／ｍｌにおい て、室温で１時間インキュベートした。次いで膜をＴＢＳＴ中で３回洗浄し、適 当なセカンダリ−抗体複合抗−ＩｇＧアルカリ燐酸塩（プロメガ、メディスン、 ＷＴ）と共に室温で１時間インキュベートした。ニトロセルロース膜を再びＴＢ ＳＴで３回洗浄し、０．３３ｍｇ／扉１ニトロブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ ）、０゜１５ｍｇＺｍ１５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート （ＢＣＩＰ）、１００１Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ９，５，１００ｍＭ　ＮａＣ１ および５ｍＭ　ＭｇＣ１＊を含む溶液で可視化した。

Ｇ、ドツト・プロット分析 バイオ−ドツト・マイクロフィルトレージョン装置（バイオ・ラド）を用い、ネ イティブｓｌｃＡＭ−１、還元ｓＩＣＡＭ−１またはＴＢＳのいずれかをニトロ セルローズ膜上に容積１００１１１中、１　ａ＋ｇ／ウェルの濃度でスポットし た。試料を重量により膜を通して濾過し、５％オボアルブミン（シグマ）４００ μｍを加えてブロックし、ＴＢＳＴ４００μｌで洗浄した。正常なラビットＩｇ Ｇ、ポリクローン抗体ＣＡ３または無ｍＡｂいずれかのプライマリ−抗体溶液を １：２０．１：５０．１：２５０．１：１０００および１：１０，０００の希釈 濃度で加えた。還元ｓＩＣＡＭ−１に結合しなかったのでＲ６，５をポジティブ ・コントロールとして２０μｍ／ｍｌの濃度で使用した。プライマリ−抗体を濾 過した後、膜をＴＢＳＴ４００μｍで洗浄し、適当に希釈したセカンダリ−抗− ＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ複合抗体を加えた。この膜を次いでＴＢＳで３ 回洗浄し、過剰のツイン−２０を除去し、ＮＢＴとＢＣＩＰ含有基質の添加によ り発色を達成した。発色を脱イオン水を加えることにより停止させた。

上述のごと（Ｂａｌｂ／ｃマウスをＫＬＨ−Ｒ６，５複合体と照射Ｒ６，５ハイ ブリドーマ細胞で免疫化した。免疫化マウスからの血清はコントロールマウスＩ ｇに対してではなく、Ｒ６，５Ｆ（ａｂ）に対して検出可能な結合を示した。Ｐ ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞で免疫化されたＢａ１ｂ／ｃマウス牌臓細胞 の融合から得られるバイブ＋Ｊドーマは検出用のパーオキシダーゼ複合抗−マウ スＩｇＧＦｃを用いてＥＬＩＳＡによりＲ６，５Ｆ（ａｂ）フラグメントに結合 する抗体製造用にスクリーンされた。全ての陽性のハイブリドーマの上清はＲＲ Ｉ　Ｆ（ａｂ）フラグメント、セカンド抗−ＩＣＡＭ−１■Ａｂ（ロスレインら ）への結合に対して試験した。一つのハイブリドーマ、ＣＡ３／ＨＩＯを選択し 、次いで限界希釈法によりクローンし、ＩｇＧ、、ｍＡｂ、ＣＡ３が得られるこ とがわがうた。

２、抗−ＩＣＡＭ−１抗−イディオタイプ、■Ａｂ、ＣＡ３の特徴図１の結果は ２種の抗−ＩＣＡＭ−１■ＡｂｓのＦ　（ａｂ）フラグメントに対するＣＡ３の 結合を示す。Ｒ６，５Ｆ（ａｂ）フラグメントに結合しているがＲＲＩ　Ｆ（ａ ｂ）に対しては結合していないＣＡ３は検出できる。ＣＡ３の滴定は濃度１５ｎ ｇ／ｍｌ（図２）でＲ６，５に対し検出できる結合を示した。マウスＩｇＧ　Ｆ （ａｂ）フラグメントをコントロールするためのＣＡ３の結合は陰性であった。

抗−ＩＣＡＭ−１ｍＡｂｓ、Ｒ６，５およびＲＲＩは官能性の抗−接着性を示し た。人のリンパ球セルライン、ＪＹからのセル凝集はＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１ ０血球接着分子に依存し、ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１に対する抗体は凝集を阻止 する（ロスレインら）。

表１に示すごとく、Ｒ６，５とＲＲＩの両者はＪＹ細胞の凝集を６０％阻止し： ＣＡ３はＲＲＩではなくＲ６，５のＪＹ細胞の凝集を阻害させる能力をブロック した。ＣＡ３単独では凝集に対して顕著な効果を示さなかった。ＣＡ３の滴定は ０．７８μｇ／■１のごとき低濃度でＪＹ細胞凝集のＲ６，５阻止を完全にブロ ックするであろうことを示した。可溶性ＩＣＡＭ−１は抗−ＩＣＡＭ−１ｍＡｂ ’ｓＲ６，５およびＲＲＩに対し特異的に結合することを示した。ＣＡ３のＲ６ ，５Ｆ（８ｂ）フラグメントに対する結合に及ぼすｓＩＣＡＭ−１の効果を図３ に示す。ＣＡ３とコントロール抗−カツバライト・チェーン抗体の両者はＲ６， ５フラグメントに結合した。ＣＡ３の結合はｓＩＣＡＭ−１により約７０％阻止 されたが抗−カッパ結合の顕著な阻止は検出されなかった。

ンに対しても特異的である。

表１ ＪＹ凝集におけるＲ６．５活性のＣＡ３阻止試料　凝集 メディア　１００％ Ｒ６，５４０％ ＲＲＩ　４０％ ＣＡ３　１００％ Ｒ６，５およびＣＡ３　１００％ ＲＲＩおよびＣＡ３　４０％ ３、免疫原としてのＣＡ３ ＣＡ３の特性からみて、それがＲ６，５により結合したエピトープとの構造類似 性を有しているものと思われる。ラビットはＣＡ３で免疫化され異形抗−抗イデ ィオタイプ（ａｂ３）応答性を惹起する。ラビット抗−ＣＡ３血清のＩｇＧ調製 はｓＩＣＡＭ−１への結合のために試験された。図４に示すごとく、スフリッド 相ＳＩＣＡＭ−１とのＥＬＩＳＡアッセイでは２００μｇ／■１においてＩＣＡ Ｍ−１に対し顕著な結合が検出された。免疫プロット法におけるネイティブおよ び還元ｓｌｃＡＭ−１に対する結合を比較すると、ネイティブｓＩＣＡＭ−１で 検出されるよりも１０−ホールド低いＩｇＧ濃度において、還元ｓＩＣＡＭ−１ に対する顕著な結合がみられた（図５）。ネイティブｓＩＣＡＭ−１に結合して いるが、還元ＳＩＣＡＭ−１に結合していないＲ６，５が検出された。ウェスタ ーン・プロット分析は予想されたごと（明らかにより高い分子量において移行す る還元ＩＣＡＭ−１に対する抗ＣＡ３の結合のあることを支持している（図６） 。

ラビット抗−ＣＡ３はまたはＩＣＡＭ−１を発現する細胞に対するその結合能を 試験した。図７に示すごとくラビット抗−ＣＡ３のＪＹ細胞に対する顕著な結合 は抗体濃度が減少するにつれて減少する特徴を示した。抗−ＣＡ３の結合はＲ６ ，５のそれのごとくラビット抗−ＣＡ３がＪＹ細胞凝集を阻止すると言う事実で 示されるごとく、ＩＣＡＭ−１のみならず凝集において機能する分子のドメイＦ ＩＧ、２ （Ｎｉ　り＊′ｔＩ４＋　ｍ±）　１暑黍＊ｌｓ＝＋ＵｕＯＴしＦＩＧ、　３ ｃ＊ｖｎ＊麟；ｍ±）　′Ｘｉ暑黍某９＋Ｌ￥：ＩＩＪＪｕＯＴ　ｔ’ＦＩＧ、 ４ （！！を四１：ｉ：［９±）　夏ｍｔ、？＋Ｇ９＃＋Ｒ＝ｌＵｌｕ　ＯＴ　ＰＩ Ｇ−５ 正常　抗−ｃＡ３　Ｒ６，５ ・　１−　・　・　・　［Ｆ］ 還元　・　―　、／％４　・　・　・　・　′（’（’（”　ｒ　ｒ　・　＠ｅ ＠” １２　３　４　５　６　７　８　９　１ｏ　１１ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理ｍ号Ｃｌ２Ｎ　１５１０６ （７２）発明者　ケネディ、チャールズアメリカ合衆国０６７０６コネチカツト 、ウォーターバリー、イースト・サイド・ブールバード９９番 Ｉ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．患者に治療上有効な量の抗−ＩＣＡＭ−１抗−イディオタイブ（Ａｂ２β） またはそれらのフラグメントを投与する方法であって、Ａｂ２βまたはそのフラ グメントが炎症におけるＩＣＡＭ−１の機能を阻止する抗−ＩＣＡＭ−１抗体（ Ａｂ１）を特異的に認識する、患者のＩＣＡＭ−１依存性炎症を治療する方法。
2. ２．Ａｂ２βがモノクローン抗体である請求項１の方法。
3. ３．モノクローンＡｂ２βがＣＡ３である請求項２の方法。
4. ４．Ａｂ２βのフラグメントがＡｂ２βのＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２またはＦｖフ ラグメントである請求項１の方法。
5. ５．Ａｂ２βがＲ６．５として指定されたモノクローン抗体のイディオタイブと 結合し、このイディオタイブがＩＣＡＭ−１の抗原エピトープに指向されている 請求項２の方法。
6. ６．その抗原結合部位が、ＩＣＡＭ−１のＩＣＡＭ−１白血球リセプターに対す る結合を阻止する抗−ＩＣＡＭ−１抗体のイディオタイブに結合する、抗−ＩＣ ＡＭ−１抗−イディオタイブ抗体。
7. ７．モノクローン抗体である請求項６の抗−ＩＣＡＭ−１抗イディオタイブ抗体 。
8. ８．モノクローン抗体ＣＡ３である請求項７の抗−ＩＣＡＭ−１抗−イディオタ イブ抗体。
9. ９．請求項６の抗−ＩＣＡＭ抗−イディオタイブ抗体のＦｖフラグメントＦａｂ またはＦ（ａｂ′）２。
10. １０．ハイブリドーマ・セル・ラインＣＡ３／Ｈ１０により生産される抗−ＩＣ ＡＭ−１抗イディオタイブ抗体。
11. １１．ＩＣＡＭ−１白血球リセプターがＬＦＡ−１である請求項６の抗−ＩＣＡ Ｍ−１抗−イディオタイブ抗体。
12. １２．ＩＣＡＭ−１白血球リセプターがＭａｃ−１である請求項６の抗−ＩＣＡ Ｍ−１抗−イディオタイブ抗体。