PT901379E - Proteinas de ligacao da quimoquina tipo 2 e metodos para a sua utilizacao - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DA QUIMOQUINA TIPO 2 E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO" PANORAMA DA INVENÇÃO Campo da invenção

Este invenção refere-se, de forma geral, ao campo da imunologia e, especificamente. a uma proteína de ligação da quimoquina, codificada por uma variedade de poxvirus. c aos métodos para a sua utilização.

Descrição de descobertas relacionadas

Cada vez se torna mais claro que vírus que vivem dentro de células de vertebrados de ordem superior, devem ter evoluído para evitar de forma específica o sistema imunitário do hospedeiro (Gooding, L., Cell, 91:5-7, 1992; Marrack. P. and Kappler. .1.. Cell. 76:323-332, 1994; Smith, G., Trends in Micro., 82:80-88, 1994). De tacto, a « sobrevivência dos vírus depende de estratégias que possibilitem evadir-se, suprimir, contrariar ou então confundir a multiplicidade de respostas do hospedeiro ao invasor estranho. A pressão de selecção conferida pelas armas do agente actuante do sistema imunitário poderá constituir claramente um forte elemento de pressão evolucionária, e todos os vírus eucarióticos que existem hoje contêm inscrições ou vestígios das suas batalhas com o sistema imunitário, ou como proteínas codificadas ou como evidenciado pelas suas estratégias biológicas particulares de sobrevivência.

Os vírus com ADN maior (ou seja, os adenovírus, os vírus da herpes, os iridovírus e os poxvirus) codificam especificamente proteínas que têm por função proteger o vírus do reconhecimento e/ou acção imunitária por parte do hospedeiro infectado. Estas proteínas virais "subversivas" fornecem agora informação acerca das operações funcionais do sistema imunitário e é provável que muito mais descobertas de novos membros desta família crescente sejam identificadas no futuro.

Nos anos 80, o termo "viroquina" foi proposto para descrever proteínas codificadas por vírus segregadas a partir de células infectadas, que funcionam imitando as moléculas de transmissão de sinal extracelulares, como citoquinas ou outros reguladores segregados importantes para o quadro imunitário do hospedeiro (Kotwal, G. And Moss, B., Nature, 335:176-178, 1988). Mais tarde, nos anos 90, o termo "viroceptor" foi introduzido para explicar a observação de que alguns vírus codificavam proteínas que imitam receptores celulares importantes e cujo funcionamento consiste em desviar as citoquinas do hospedeiro dos respectivos receptores normais, interrompendo assim o circuito imunitário nas suas etapas iniciais (Upton, et ai, Virology. 184:370. 1991: Schreihcr and McFadden, Virology, 204:692-705, 1994).

Estudos recentes sobre um poxvírus particular, o vírus mixoma, demonstraram que o vírus rompe o sistema imunitário recorrendo a uma série de estratégias (McFadden and Graham, Seminars in Virology, 5:421-429, 1994). O vírus mixoma é o agente infeccioso de uma doença sistémica virulenta dos coelhos domésticos chamada mixomatose. Descrito originalmente no século passado, o mixoma foi o primeiro vírus patogénico descoberto para um animal de laboratório e foi o primeiro agente virai de sempre a ser introduzido de forma deliberada no ambiente com o propósito explícito de erradicar a peste. Desde a libertação do vírus nas populações australianas e europeias de coelhos selvagens há mais de 40 anos, as estirpes de coelhos e vírus no campo foram sujeitas a pressões evolucionárias e selectivas mútuas, cujo resultado foi um enzoótico estável nas áreas inoculadas (Fenner, F. e Ratcliffe, F.N., "Myxomatosis". Cambridge University Press, London, 1965). O mixoma partilha muitas das características biológicas associadas a outros poxvírus, nomeadamente o local citoplasmático de replieação e um genoma de ADN de grandes dimensões de cadeia dupla (160 quilobases). Múltiplas linhas de evidência indicam que o mixoma, como todos os poxvírus, codifica vários produtos genéticos, cuja função é

permitir a reprodução e propagação do vírus numa variedade de tecidos hospedeiros. Algumas destas proteínas virais contrariam ou subvertem de forma específica a evolução da resposta inflamatória do hospedeiro e a imunidade celular adquirida, e os poxvírus têm sido, de forma geral, uma fonte rica nestas proteínas imunomodulantes (Turner, P.C., and Moyer, R.W., Cur Top. Microbiol. Imm., J_63:125-1 52, 1990: Buller. R.M.L., and Palumbo, G.J., Micro. Dev., 55:80-122, 1991; Smith, G.L.,./, Gen. Viroi. 94:1725-1740, 1993; McFadden, G., (Ed.), "Viroceptors, virokines and related immune modulators encoded by DNA viruses", R.G. Landes Co., Austin Texas, 1995).

Entre os exemplos de produtos genéticos imunomodulantes encontram-se o factor de crescimento do mixoma (FCM), que estimula as células vizinhas de uma forma semelhante à paracrina, através do receptor do factor de crescimento epidérmico celular (Upton, et al., J. Virol, 61_: 1271 -1275, 1987; Opgenorth, et ai. Virol., .186:185-191, 1992; Opgenorth, et al., Virol., 192:701-708, 1992; Opgenorth, et ai, J. Virol., 66:4720-4731, 1992); Serp 1, uma glicoproteína segregada com actividade de inibidor da serina protease, que evita a evolução da primeira resposta inflamatória (Upton, et ai, Viroi, 179:628-631, 1990; Lomas, et ai, JBC, 268:516-521, 1993; Macen, et al., Viroi, 195:348-363, 1993); T2, um homólogo virai segregado da superfamília dos receptores do factor de necrose tumoral celular (FNT), que liga e inibe o FNT dos coelhos (Smith, et al., BBRC, J76:335-342, 1991; Schreiber, M. and McFadden, G., supra, 1994; Upton, et al. supra, 1991); T7, um homólogo virai segregado do receptor de interferão-γ celular, que liga e inibe o interferão-γ do coelho (Upton, et ai, Science, 258:1369, 1992; Upton e Mcfadden, Methods in Molecular Geneíics, 4:383, 1994; Mossman, et al., em: "Viroceptors, virokines and related immune modulators" p. 41-54 Ed. McFadden, R.G. Landers, Co., 1995); and M11L, uma proteína semelhante ao receptor da superfície que interfere na resposta inflamatória através de um mecanismo desconhecido (Opgenorth, et ai, supra-, Graham, et ai, Virol, 191: 112-124, 1992);

Entre as proteínas imunomodulantes também se encontram citoquinas quimiotácticas, designadas por "quimoquinas". As quimoquinas são ligandos imunitários de baixo peso molecular que são quimioatractivos de leucócitos, tais como, em especial, neutrófilos, basófilos, monócitos e células T. Existem duas classes principais de quimoquinas, contendo as duas quatro resíduos de cisteína conservados, que formam ligações dissulfureto na estrutura terciária das proteínas. A classe α é designada C-X-C (em que X é um aminoácido qualquer), incluindo IL-8, PATC-III, cresc/AECM e ENA-78; e a classe β, designada C-C, incluindo PQM-1, PIM-Ια e β, e proteína expressa por T normais, segregada e regulada por activação (RANTES). As designações das classes são em função do facto de um resíduo interveniente espaçar ou não as primeiras duas cisteínas no motivo. Em geral, a maioria das quimoquinas C-X-C são quimioatractivas para os neutrófilos mas não para os monócitos, enquanto as quimoquinas C-C parecem atrair os monócitos mas não os neutrófilos. Recentemente, um terceiro grupo de quimoquinas, o grupo "C", após a descoberta de uma nova proteína foi designado com o nome de linfotacina (Kelner, et al., Science, 266:1395-1933, 1994). Pensa-se que a família das quimoquinas é de importância vital na infiltração de linfócitos e monócitos nos locais de inflamação. É altamente provável que ainda existam mais genes virais imunomodulantes por descobrir. Estes e os produtos genéticos relacionados não só irão constituir ferramentas de grande utilidade para examinar as diferentes armas dos mecanismos de defesa antiviral do hospedeiro, mas também poderão proporcionar novas amosirns de identificação de elementos novos do conjunto imunitário celular e novas classes de medicamentos para suprimir a inflamação e a desregulação do sistema imunitário.

Sumário da Invenção A presente invenção descreve uma nova família de inibidores específicos para vírus solúveis para uma classe de citoquinas, que estão envolvidas na quimotaxia de leucócitos e são no seu conjunto designadas por "quimoquinas". Estas proteínas são designadas por proteínas de ligação de quimoquina tipo 2 (PLQ tipo 2) e são uma família de proteínas dos poxvírus aparentadas com a proteína TI codificada pelo vírus do fibroma Shope e pelo vírus mixoma (VFS-T1). A PLQ tipo 2 e homólogos funcionalmente aparentadas são de utilidade no tratamento de um série de distúrbios 5

inflamatórios, em que um influxo excessivo de leucócitos está associado ao processo patogénico.

Descrição breve dos desenhos A FIGURA 1 mostra o alinhamento da sequência dos membros conhecidos da PLQ tipo 2 das proteínas do poxvírus, que se ligam a citoquinas quimiotácticas (quimoquinas). A sequência 35 KDa do PVC está incompleta. A FIGURA 2 mostra a sequência de nucleótidos do gene TI do mixoma, que expressa uma PLQ tipo 2. O tripleto de nucleótidos na caixa é o codão de paragem para o gene T2 adjacente (homólogo do receptor TNF), a seta indica o local previsto de clivagem peptídica do sinal e os aminoácidos sublinhados são os dois locais previstos da N-glicosilação para a proteína TI (ID SEQ N.° 1 e ID SEQ N.° 2). A FIGURA 3 mostra que a proteína de 35 KDa dos poxvírus do coelho (PVC), um dos membros da família da PLQ tipo 2, liga os membros da família C-C das quimoquinas (PIM-Ιβ, painel superior) e a família C-X-C (IL-8, painel médio). Nos dois painéis superiores, os ligandos radio-rotulados encontram-se reticulados com proteínas virais segregadas a partir de células RMVB infectadas de controlo (SIMULADAS), ou células infectadas com o mixoma (MIX), um mutante de supressão da T7 do mixoma (M1X-T7-), poxvírus dos coelhos (PVC) e um mutante de supressão de 35 KDa do PVC (PVC-35K-). Os complexos reticulados entre o ligando e as proteínas virais encontram-se indicados pelas setas. Embora a proteína da PLQ tipo 1 (T7) também ligue as quimoquinas, a proteína da PLQ tipo 2 (Tl) tem virtualmente o mesmo tamanho (cerca de 35 KDa), como demonstrado pelo painel inferior. Tanto a proteína Tl (tipo 2) como a proteína T7 (tipo 1) do mixoma fazem assim a ligação das quimoquinas. mas só a proteína de 35 KDa do PVC (tipo 2) tem esta actividade. A FIGURA 4 mostra que a proteína de 35 KDa segregada da vacina (estirpe Lister), mas que falta à estirpe de CB, liga a quimoquina PIM-Ιβ de forma semelhante à proteína de 35 KDa segregada do PVC. A seta marca o complexo entre a PIM-Ιβ e a proteína de 35 6

KDa segregada das células RMVB infectadas com a vacina da estirpe Lister, mas não a estirpe de CB.

Descrição detalhada da invenção

As descobertas da presente invenção fornecem uma nova fonte importante de proteínas anti-imunitárias, com a capacidade de tratar uma grande variedade de condições imunopatológicas associadas ao movimento de linfócitos e monócitos da circulação para locais do tecido durante a inflamação e às respostas imunitárias a danos, infecção e vários estados de doença.

Os genes da PLQ tipo 2 clonados e sequenciados não são homólogos segregados dos receptores de quimoquina conhecidos, possuindo todos sete domínios de tensionamento da membrana (designados por "serpentinas") como descrito em artigos recentes (Kelvin. D.J., et al, J. Leukocyte Biol., 54:604-612, 1993; Murphy, P.M., Ann. Rev. ímm J_2:593-633, 1994; Horuk, R., Ímm. Today., 15:169-174, 1994; e Horuk, R., Trends in Pharm. Sei., L5:159-165, 1994). Embora alguns vírus do ADN codifiquem os homólogos desses receptores de serpentina (Ahuja, S.K., et ai, ímm. Today, 15:281-287, 1994), englobando pelo menos um candidato genético num poxvírus (Massung, R.F., et al, Virology, 197:511-528, 1994), a PLQ tipo 2 da presente invenção não é um membro desta família particular de receptores. A proteína de ligação da quimoquina tipo 2 (PLQ tipo 2) exemplificativa da invenção é uma das proteínas segregadas a partir de células infectadas com vírus do fibroma de Shope e é codificada pela estrutura de leitura aberta TI (Upton, et al, Virology, 160:20-30, 1987; e Número de Acesso do Banco de Genes GenBank Accession No): P25946). Esta proteína tem semelhança da sequência significativa com as proteínas de 35 KDa segregadas da vacina (estirpes Copenhagen e Lister) e de poxvírus de coelhos. Para além disso, as proteínas da PLQ tipo 2 distinguem-se da proteína M-T7 do mixoma, que liga especificamente o INTF-γ do coelho, mas não o INTF-γ do rato ou do homem (Mossman, et al, J. Biol. Chem., 270:3031-3038, 1995) mas que também liga as 7

quimoquinas e é designada por proteína de ligação da quimoquina tipo 1 (anteriormente denominada proteína-1 de ligação da quimoquina (PLQ-1)). O termo "proteína de ligação da quimoquina" refere-se a uma proteína que liga e inibe uma ou mais quimoquinas. Uma "quimoquina" é uma classe de citoquinas responsáveis pela quimotaxia dos leucócitos. A classe α das quimoquinas é designada por C-X-C (em que X é um aminoácido qualquer), que inclui interleuquina-8 (IL-8), proteína 111 de activação do tecido conectivo (PATC-III), actividade de estimulação do crescimento de melanócitos (AECM) cresc/AECM, proteína de indução do INTF-γ (PI-10), péptido 2 de activação dos neutrófilos (PAN2), β-tromboglobulina e atraente 78 de neutrófilos derivados do epitélio (ANE-78); e a classe β, designada C-C, que engloba o gene-3 de activação das células T (ACT-3), proteínas quimiotácticas dos monócitos (PQM-1, 2 e 3), proteínas inflamatórias de macrófagos (PIM-Ια e β), e proteína segregada e expressa por T normal regulada por activação (RANTES). É possível detectar outras quimoquinas recorrendo a métodos comuns usados nesta especialidade. Por exemplo, é possível testar uma molécula utilizando a câmara de Boyden, que é o sistema de ensaio de microquimotaxia preferido para a investigação in vitro de substâncias quimioatractivas. Uma série de poços é formada num bloco de vidro acrílico, em que cada um dos poços é constituído por duas câmaras, superior e inferior, separadas por um filtro poroso dentre vários tipos de filtro como, por exemplo, nitrocelulose e policarbonato. A célula que interessa, por exemplo, as células mononucleares sanguíneas periféricas (CMSP), é adicionada à câmara superior de cada poço e a substância de teste, por exemplo, a substância quimioatractiva, é adicionada à câmara inferior. Se as células na câmara superior forem atraídas pela substância existente na câmara inferior, então migram ao longo do gradiente de concentração teórico que existe na solução e penetram nos poros do filtro, aderindo ao lado do fundo desse mesmo filtro.

Polipéptidos que se suspeita serem membros da família das quimoquinas podem agora ser submetidos a triagem utilizando a PLQ da invenção. Por isso, numa realização, a invenção proporciona um método para triar e identificar novas quimoquinas, pondo a PLQ livre ou de ligação matriz da invenção em contacto com uma composição que se suspeita conter uma ou mais quimoquinas e detectando a ligação da PLQ à composição.

Se tal se pretender, é possível utilizar diversos rótulos como meio detectar a ligação da PLQ a uma quimoquina. Quimoquinas ou a PLQ podem ser rotuladas directa ou indirectamente de forma a poderem ser detectadas, por exemplo, com um radioscópio. um composto fluorescente, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, um quelador de metal ou uma enzima. Os especialistas nesta área saberão que outros rótulos serão apropriados ou saberão como o averiguar recorrendo à experimentação de rotina.

Numa realização, a invenção proporciona um método para tratar uma disfunção imunopatológica num paciente, em que se administra a esse paciente uma quantidade terapêutica eficaz de uma proteína anti-inflamatória, caracterizada por ter um peso molecular de aproximadamente 30 a 40 kD, dependendo do grau de glicosilação como determinado por SDS-PAGE reduzido, com homologia da sequência de aminoácidos com o homólogo da TI do VFS ou da PVC, de 35 kDa e com a propriedade de ser segregada a partir de células infectadas. O termo "anti-inflamatório" refere-se à redução ou à supressão de uma resposta inflamatória. A forma glicosilada e segregada da PLQ tipo 2 da invenção tem um peso molecular aparente de aproximadamente 35 a 40 kD, como determinado sob condições redutoras num SDS-PAGE. Além disso, a proteína tem homologia com as proteínas segregadas TI de VFS e 35 kDa de PVC. O termo "homologia" refere-se ao grau de identidade entre a PLQ tipo 2 e outros membros da família a nível de aminoácidos. De preferência, a PLQ tipo 2 tem 50 a 95% de homologia da sequência de aminoácidos com a proteína TI do VFS. O grau de homologia necessário não é rígido mas, no entanto, a PLQ tipo 2 terá de manter a função biológica de interacção com quimoquinas humanas. Por outras palavras, a homologia é suficiente desde que a PLQ tipo 2 ligue e iniba as quimoquinas. 9 9

A invenção inclui um polipéptido funcional da PLQ tipo 2 e fragmentos funcionais deste. Aqui, a expressão "polipéptido funcional" refere-se a um polipéptido com uma função ou actividade biológica identificada por meio de um ensaio funcional definido e que está associada a uma resposta biológica, morfológica ou fenotípica particular. Os fragmentos funcionais do polipéptido da PLQ tipo 2 incluem fragmentos da PLQ tipo 2 desde que a actividade da PLQ tipo 2 se mantenha (por exemplo, ligação de quimoquinas). Os péptidos mais pequenos que contêm actividade biológica da PLQ tipo 2 encontram-se incluídos na invenção. Estes péptidos podem ser sujeitos a ensaio para ligar as quimoquinas, através de métodos comumente conhecidos dos especialistas nesta área, incluindo métodos descritos nos EXEMPLOS incluídos nesta memória. A função biológica pode variar de um fragmento polipeptídico, bem assim como um epitopo, ao qual uma molécula de anticorpo pode ligar um polipéptido grande, capaz de participar na indução característica ou programação de modificações fenotípicas dentro de uma célula. Um "polinucleótido funcional" designa um polinucleótido que codifica um polipéptido funcional, como descrito nesta memória.

Pequenas modificações da sequência de aminoácidos primária da PLQ tipo 2 poderá resultar em proteínas com uma actividade fundamentalmente equivalente em comparação com o polipéptido da PLQ tipo 2 aqui descrito. Estas modificações poderão ser deliberadas, como as provocadas por mutagénese induzida num determinado local, ou podem ser espontâneas. Todos os polipéptidos originados por estas modificações encontram-se aqui incluídos, desde que se mantenha a actividade da PLQ tipo 2. Além disso, a supressão de um ou mais aminoácidos poderá também ter como por resultado a modificação da estrutura da molécula resultante, sem alterar de forma significativa a sua actividade. Isto pode levar ao desenvolvimento de uma molécula activa mais pequena, que seria de maior utilidade. Por exemplo, é possível remover os aminoácidos dos terminais amino ou carboxilo, que poderão não ser necessários para a actividade da Pl.Q tipo 2. O polipéptido da PLQ tipo 2 da invenção também inclui variações moderadas da sequência do polipéptido. O termo "variação moderada" designa, nesta memória

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descritiva, a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente similar.

Entre os exemplos de variações moderadas encontra-se a substituição de um resíduo hidrofóbico, como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico, ou de glutamina por asparagina, e semelhantes. O termo "variação moderada" também inclui a utilização de um aminoácido substituído em vez de um aminoácido paterno não substituído, desde que os anticorpos produzidos para o polipeptido substituído também imuno-reajam com o polipéptido não substituído.

Exemplos de fontes virais da PLQ tipo 2 utilizadas no método da presente invenção são vírus mixoma, vacina (estirpes Lister e Copenhagen), vírus do fibroma de Shope, poxvírus de coelho e outros poxvírus de mamíferos, desde que a PLQ tipo 2 tenha a função biológica de uma proteína anti-inflamatória, caracterizada por ter um peso molecular de aproximadamente 30 a 40 kD, dependendo do grau de glicosilação que tem homologia com o homólogo da proteína TI do VFS, e que tem a função biológica desta família de proteínas.

Um disfunção imunopatológica tratada pelo método da invenção poderá ser associada à produção de quimoquinas e à acumulação resultante de leucócitos reactivos nos tecidos atingidos. O método engloba a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz da PLQ tipo 2. O termo "disfunção imunopatológica" refere-se a qualquer doença que implique uma resposta imunitária ou imunidade em geral. Terapeuticamente eficaz significa na presente memória a quantidade de PLQ tipo 2 que é suficiente para melhorar a causa da disfunção imunopatológica . "Melhorar" refere-se a uma redução do efeito prejudicial da disfunção no paciente sujeito à terapia. O sujeito da invenção é de preferência um ser humano mas, no entanto, é possível prever que qualquer animal com uma disfunção imunopatológica poderá ser tratado com o método da invenção, por exemplo, um rato SCID enxertado com medula óssea humana (SCID humanizado). Entre os exemplos de disfunções imunopatológicas que podem ser 11

tratadas com o método da invenção, encontram-se a disfunção da imunodeficiência adquirida (SIDA), o síndroma do choque tóxico, rejeição de aloenxertos, crescimento da placa arteroesclerótica, reacções a ultravioletas e a radiação e disfunções associadas à activação das células T, das células B, dos macrófagos e de outros leucócitos inflamatórios durante a resposta imunitária e a resposta na fase aguda, e disfunções associadas a uma situação cancerígena avançada como a caquexia provocada pelo factor de necrose tumoral. A invenção proporciona um método para tratar ou melhorar uma disfunção imunopatológica, incluindo a endotoxemia ou o choque séptico (sepsia), ou um ou mais sintomas da sepsia, que compreender a administração a um sujeito, que apresente sintomas de sepsia ou que esteja em risco de desenvolver sepsia, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de PLQ tipo 2. O termo "melhorar" refere-se a uma redução ou atenuação dos sintomas da disfunção que está a ser tratada.

Um paciente que apresente os sintomas de uma disfunção imunopatológica pode ser tratado com um antibiótico ou com um agente antiviral para além do tratamento com PLQ tipo 2. Os antibióticos habituais incluem um aminoglicósido, como gentamicina ou uma β-lactama como a penicilina ou a cefalosporina. Por isso, o método terapêutico da invenção engloba a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da PLQ tipo 2 em simultâneo, de forma substancial, com a administração de uma quantidade bactericida de um antibiótico ou de uma quantidade suficiente de um composto antiviral. O termo "quantidade bactericida" como utilizado de acordo com esta memória, refere-se a uma quantidade suficiente para atingir uma concentração no sangue do paciente que está a receber o tratamento suficiente para matar as bactérias. A quantidade bactericida de antibiótico geralmente reconhecida como segura para ser administrada a um ser humano, é bem conhecida nesta área de especialidade e, como se sabe, varia com o antibiótico específico e com o tipo de infecção bacteriana que se está a tratar. De preferência, a administração da PLQ tipo 2 decorre no espaço de 48 horas e, com maior preferência, entre 2 e 8 horas e, mais preferivelmente, substancialmente ao mesmo tempo que a administração do antibiótico. A administração da PLQ tipo 2 no método da invenção, também poderá ser utilizada para melhorar os danos de pós-reperfusão. Quando se trata a trombose arterial, a indução de reperfusão por agentes que lisam os coágulos, como o activador plasminogénio dos tecidos (AP-t), encontra-se frequentemente associada à danificação do tecido. Considera-se que esta danificação do tecido é provocada, pelo menos em parte, por leucócitos, englobando, mas não só, os leucócitos polimorfonucleares (PMN). Por isso, a administração da PLQ tipo 2 iria bloquear os interacções dos leucócitos ou do endotélio PMN, e assim diminuir ou evitar as lesões de pós-reperfusão. A administração da PLQ tipo 2 também é útil como prevenção contra um novo ataque e um crescimento recorrente da placa arteroesclerótica após lesões arteriais. Pensa-se que a restenose e o novo crescimento da placa sejam exacerbados pela resposta inflamatória local na camada interna da parede arterial. O método da invenção também é útil para tratar a inflamação devido a disfunções alérgicas ou autoimunitárias. Entre os exemplos de disfunções alérgicas encontram-se a rinite alérgica, asma, dermatite atópica e alergias alimentares. Entre os exemplos de disfunções autoimunitárias, em que o sistema imunitário ataca os tecidos do próprio hospedeiro, encontram-se, mas não só, a diabetes mellitus insulino-dependente tipo 1, doença intestinal inflamatória, dermatite, meningite, púrpura trombocitopénica trombótica, síndroma de Sjõgren, encefalite, uveíte, deficiência de adesão dos leucócitos, arterite reumatóide e outras formas de artrite imunitária, febre reumática, síndroma de Reiter, artrite psoriática, esclerose sistémica progressiva, cirrose biliar primária, penfigo, vasculete penfigóide e necrotizante, miastenia grave, esclerose múltipla, lupus eritematosos, polimiosite, sarcoidose, granulomatose, vasculite, anemia perniciosa, disfunção inflamatória do sistema nervoso central, doenças mediadas pelo complexo antigénio-anticorpo, anemia hemolítica autoimune, tiroidite de Hashimoto, doença de Graves, abortos espontâneos habituais, síndroma de Reynard, nefrite 13

glomerular, dermatomiosite, hepatite activa crónica, doença celíaca, complicações autoimunes da SIDA, gastrite atrófica, espondilose anquilosante e doença de Addison. O método também é de utilidade no tratamento de doenças de proliferação de células não malignas, ou relacionadas com o sistema imunitário, tais como a psoríase, "pemphigus vulgaris", síndroma de Behcet, síndroma da dificuldade respiratória aguda (SDRA), doença coronária isquémica, arteroesclerose, síndroma da pós-diálise, leucemia, síndroma da imunodeficiência adquirida, choque séptico e outros tipos de inflamação aguda, e histiocitose lipídica. Essencialmente, qualquer disfunção que esteja etiologicamente ligada com o processo proinflamatório e à infiltração celular devido à produção de quimoquinas (por exemplo, indução de IL-8, PIM-lct ou de expressão β), será considerada susceptível de receber tratamento. O método da invenção também é útil para o tratamento de infecções microbianas. Muitos micróbios, tais como bactérias, riquétsia, diversos parasitas e vírus, ligam-se ao endotélio vascular e aos leucócitos, induzindo uma reacção inflamatória que resulta, por exemplo, na produção de interleuquinas. Assim, a PLQ tipo 2 utilizada no método da invenção poderá ser administrada a um paciente para evitar a inflamação associada a estas infecções.

As gamas das dosagens para a administração da PLQ tipo 2 da invenção são as que são suficientemente grandes para produzir o efeito pretendido, em que os sintomas da resposta imunitária mostram algum grau de supressão. A dosagem não deverá ser grande ao ponto de provocar efeitos secundários adversos, tais como as indesejáveis reacções cruzadas, reacções anafiláticas e outras semelhantes. De forma geral, a dosagem irá variar de acordo com a idade, condição, sexo e estádio da doença no paciente, e poderá ser determinada por um especialista. A dosagem poderá ser ajustada pelo médico em questão no caso de haver contra-indicações. A dosagem poderá variar de cerca de 10 pg a 100pg por dosagem, numa ou mais administrações da dosagem por dia, durante um ou mais dias. 14

A PLQ tipo 2 é administrada através de meios adequados, incluindo administração parenteral, subcutânea, intrapulmonar, intra-arterial, intra-rectal, intramuscular e intranasal. As infusões parenterais incluem a administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial ou intraperitoneal. A PLQ tipo 2 poderá também ser administrada de forma transdérmica, sob a forma de um implante subcutâneo de libertação lenta, por exemplo, ou oralmente sob a forma de cápsulas, pós ou granulados. A PLQ tipo 2 também poderá ser administrada por inalação. Por exemplo, quando utilizada terapeuticamente para o tratamento de uma disfunção inflamatória dos pulmões, uma forma preferencial de administração seria um aerossol pulmonar.

Preparações veiculares farmacologicamente aceitáveis para a administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões estéreis ou aquosas ou não-aquosas. Exemplos de solventes não-aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis como oleato de etilo.

Entre os veículos aquosos encontram-se água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólico/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactado ou óleos fixados. O ingrediente terapêutico activo é frequentemente misturado com excipientes farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes adequados incluem água, soluções salinas, dextrose, glicerol e etanol ou as combinações. Veículos intravenosos incluem agentes de reposição de fluidos e nutrientes, agentes de reposição de electrólitos, como aqueles com base em dextrose de Ringer e semelhantes. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos como, por exemplo, agentes antimicrobianos, agentes antioxidantes, agentes de quelação, gases inertes e outros do género. A invenção também se refere a um método para preparar um medicamento ou composição farmacêutica contendo a PLQ tipo 2 da invenção, sendo o medicamento utilizado para a terapia de um resposta imunitária/reacção inflamatória indesejável, 5

resultando essa resposta imunitária na produção de quimoquinas que se ligam à PI..Q tipo 2 da presente invenção. A invenção proporciona uma composição farmacêutica contendo pelo menos uma dose de uma quantidade, imunoterapeuticamente eficaz de uma proteína anti-inflamatória com um peso molecular de aproximadamente 30 a 40 kD, em função do grau de glicosilação, tendo a sequência de aminoácidos em homologia com o homólogo receptor interferão-γ da TI do mixoma, e a função biológica do homólogo receptor inierferão-y da TI do mixoma, num portador farmacológico. A invenção proporciona as preparações e composições farmacêuticas que contenham a PLQ tipo 2 da invenção para serem utilizadas no método da invenção. A forma variará em função da via de administração. Por exemplo, as composições injectáveis podem ser fornecidas sob a forma de uma ampola, cada uma contendo uma dose unitária, ou sob a forma de um recipiente contendo várias doses. A PLQ tipo 2 pode ser formulada como composição terapêutica sob formas de sal neutralizadas farmaceuticamente aceitáveis. Entre estas encontram-se os sais de adição de ácido, que se formam com os ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico e semelhante. Os sais também englobam aqueles que se formaram a partir de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrea, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e outras do género. É possível conseguir uma entrega controlada através da selecção de macromoléculas apropriadas como, por exemplo, poliésteres, poliamino ácidos, polivinil-pirrolidona, etileno/acetato de vinilo, metilcelulose, carboximetilcelulose, sulfato de protamina, ou copolímeros de lactidos/glicolidos. É possível controlar a velocidade de libertação da PLQ tipo 2 alterando a concentração da macromolécula.

Outro método de controlar a duração da acção consiste em incorporar a PLQ tipo 2 nas partículas de uma substância polimérica, como poliésteres, poliamino ácidos, hidrogeles, copolímeros de poliláctidos/glicólidos ou copolímeros de etileno/acetato de vinilo. Em alternativa, é possível incorporar a PLQ tipo 2 em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, por utilização de microcápsulas de hidroximetilcelulose, gelatina ou microcápsulas de poli(metilmetacrolato), respectivamente, ou num sistema coloidal de fornecimento do medicamento. Os sistemas de dispersão coloidal englobam complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, gotas e sistemas com base lipídica, incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. O exemplos que se seguem destinam-se a ilustrar a invenção sem, no entanto, a limitar. Embora ilustrem os procedimentos normalmente empregues, os especialistas na matéria poderão, em alternativa, recorrer a outros procedimentos. EXEMPLO 1

MATERIAIS E MÉTODOS

Modelo de rato com arteroesclerose provocada por lesões:

Em ratos Sprague Dawley, foram provocadas, por meio de angioplastia de balão, lesões na artéria iliofemoral direita ou esquerda. Um balão de angioplastia USCI de l,5mm foi introduzido de forma retrocedente na artéria, por meio de corte e arteriotomia sob anestesia com pentobarbital (6,5mg por lOOg de peso por meio de injecçào intramuscular, Somnotrol, MTC Pharmaceuticals, Cambridge, Ontario). 500pg de PLQ (6 ratos) ou meio salino (6 ratos) foram administrados por meio de injecção intra-arterial da PLQ, ou da solução de controlo, no lúmen distai do catéter do balão de angioplastia a montante do local das lesões subsequentes provocadas pelo balão. O balão foi depois insuflado até 8 bares de pressão durante 1,0 minutos. Depois da angioplastia, o balão foi esvaziado e retirado, e o local da arteriotomia foi fechado com a aplicação local do monómero de cianoacrilato de n-butilo (Nexaband, Veterinary Products Laboratories, Phoenix, Arizona). Todos os ratos foram mantidos com uma dieta normal para ratos e foram seguidos durante 4 semanas após a cirurgia. Depois dessas quatro semanas, os 17

ratos foram sacrificados com 2,0ml de eutanilo por kg e a aorta foi recolhida para exame histológico.

Modelo de coelho com arteroesclerose provocada por lesões:

Oito coelhos brancos da Nova Zelândia alimentados com colesterol são tratados com angioplastia de balão da aorta abdominal distante. Todos os coelhos (estirpe de coelhos brancos da Nova Zelândia) são alimentados com uma dieta de 2% de colesterol em 10% de óleo de amendoim durante 4 dias/semana, com início 2 semanas antes das lesões provocadas pelo balão. Um catéter com balão de angioplastia com 3 a 3.5mm (relação do balão para o diâmetro da aorta é > 1:1) é introduzido através de um corte arterial femoral, após anestesia (40mg/kg de cetalina, 8mg/kg de xilazeno e 0,5mg/kg de acepromazina por injecção intramuscular). O balão é insuflado com 8 bares de pressão na aorta abdominal distante e introduzido de forma retrocedente na aorta torácica distante. O balão é introduzido e retirado três vezes sob controlo fluoroscópico em cada um dos coelhos para garantir a desnudação do endotélio. Angiogramas de contraste são registados antes e depois do trauma provocado por angioplastia de balão e no seguimento durante 4 semanas. E administrada heparina (400 unidades) imediatamente depois de se obter acesso femoral, de modo a diminuir a trombose associada ao catéter. PLQ tipo 2 purificada, 500 pg por amostra, é administrada por infusão imediatamente após as lesões provocados pelo balão na aorta abdominal mais distante de 4 coelhos. Uma infusão paralela de solução salina é administrada por infusão local mente na aorta abdominal mais distante de 4 coelhos. Cada infusão é administrada por meio de um catéter de Wolinsky num volume total de 10 ml diluídos em 0,9% de solução salina estéril logo após as lesões provocadas pelo balão. Todas as infusões são administradas por meio de um balão de Wolinsky de 3,25 mm (insuflado até atingir uma pressão final de 6±1 bares durante 2 minutos) na aorta abdominal perto da bifurcação ilíaca. O balão de Wolinsky é posicionado imediatamente acima da bifurcação ilíaca sob controlo fluoroscópico, de forma a que o balão de perfusão fique, como habitual, 0,5 a 2,5 cm acima da bifurcação e passe a ser designado por local de infusão primário. Os locais secundários a montante são definidos na região 2,5 cm acima perto da bifurcação ilíaca.

Em todas as experiências, as infusões são administradas por meio de um catéter de Wolinsky num volume total de 10 ml diluídos em solução salina a 0.9% estéril, logo após as lesões provocadas pelo balão. Todas as infusões são administradas por meio de um balão de Wolinsky de 3,25mm (insuflado até atingir uma pressão final de 6±1 bares durante 2 minutos) na aorta abdominal perto da bifurcação ilíaca.

Histologia e análise morfométrica: A análise histológica é efectuada no local primário da infusão de Wolinsky na aorta abdominal distante (coelhos) ou nas ramificações arteriais iliofemorais (rutoj. que representa o local primário de infusão, como definido pelo posicionamento original do balão de perfusão. Nos coelhos, as secções de controlo internas são retiradas de um local não sujeito a infusão, a jusante e perto da bifurcação ilíaca (desde 0,5cm acima da bifurcação até 0,5cm abaixo da bifurcação) e de um local não sujeito a infusão e a montante (a aorta abdominal superior, 2,5cm a 3,5cm acima da bifurcação ilíaca). A área situada entre l,5cm e 2,5cm acima da bifurcação ilíaca é considerada uma zona de fronteira, com doser de infusão potencialmente variáveis devido à colocação do balão e, por isso, não se encontra contemplada nesta análise. Nos ratos, os locais primários do balão tanto para os ratos tratados com T-l como para os ratos sujeitos a infusão com solução salina foram utilizados para uma avaliação histológica. A coloração com hematoxilina e eosina dos espécimes fixados com formalina decorreu como anteriormente descrito. Resumidamente, cada espécime foi fixado em 10% (v/v) de formalina tamponada com fosfato de sódio, processado, impregnado e embebido em parafina e cortado em secções de 5pm por microtomo. As secções de cada espécime (no mínimo 2 secções por local) foram depois coradas com hematoxilina e eosina e examinadas a microscópio óptico. EXEMPLO 2

LIGAÇÃO DE CITOQUINAS A UMA NOVA PROTEÍNA VIRAL

Em resumo, uma variedade de citoquinas humanas foi radiar rotulada com * ^5[ exposta às proteínas segregadas recolhidas de células de RMVB de controlo ou infectadas com 19 19

poxvirus, reticuladas e, depois, analisada por SDS-PAGE relativamente a novos complexos de citoquina/proteína. O ensaio de reticulada pôs a descoberto o que era claramente uma nova proteína específica de vírus, que se liga a cada uma das quimoquinas humanas testadas: IL-8 e PIM-Ιβ (FIGURA 2). A FIGURA 2 (os dois painéis superiores) demonstra ensaios de mudança de mobilidade do gel utilizando ligandos iodados e sobrenadantes da cultura de tecido. Os sobrenadantes da cultura de tecido (Sups) foram preparados como se segue: CRMVB (Células de Rim de Macaco Verde Bebé) foram deixadas não tratadas (simuladas) ou foram infectadas com mixoma (MIX), mutante de supressão T7 do mixoma (mix-T7), poxvirus de coelho (PVC) ou uma supressão de 35 kDa do PVC numa multiplicidade de infecções (MDI) de 3. As proteínas segregadas foram preparadas por lavagem da monocamada três vezes com PBS e a sua reposição com um meio isento de soro 4 horas após a infecção; estes sobrenadantes foram depois colectados 18 horas após a infecção (L). Sobrenadantes simulados foram preparados da mesma forma na ausência de virus. Os sobrenadantes foram concentrados aproximadamente 15 vezes utilizando concentradores Amicon. As quimoquinas humanas IL-8 e PIM-Ιβ foram rotuladas com l25I utilizando esferas de iodo (Pierce), de acordo com os protocolos do fabricante.

Os ensaios de mudança de mobilidade do gel foram efectuados como se segue: 5μ1 de ligando iodetado foram misturados com 10μ1 de SUP, e deixados estar à temperatura ambiente durante 2 horas. Depois, 2μ1 do reagente químico de reticulação 1 -etilo-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) (200mM em lOOmM de fosfato de potássio, pH 7,5) foram adicionados durante 15 minutos, seguidos de mais 2μ1 durante 15 minutos. A reacção foi depois extinguida pela adição de 2μ1 de Tris-HCl (1,0M, pH 7,5). A mistura resultante foi analisada utilizando SDS-PAGE e autoradiografia. As setas indicam os complexos mudados. O painel inferior indica os geles de Coomassie corados, demonstrando a perda da proteína T7 na infecção com mixoma-T7 e a perda da proteína 35 KDa na infecção com PVC-35k. 20

EXEMPLO 3

ANÁLISE DA EFICÁCIA DA PLQ TIPO 2 (Tl) COMO PROTEÍNA ANTI-RESTENOSE TAL COMO DEMONSTRADO PELAS LESÕES NAS ARTÉRIAS FEMORAIS DOS RATOS PROVOCADAS POR BALÃO DE ANGIOPLASTIA A inflamação encontra-se associada com desenvolvimento acelerado da placa de arteroesclerose na parede arterial. Existe uma elevada velocidade de recorrência da placa, ou restenose, após a utilização do balão de angioplastia e outros dispositivos de angioplastia semelhantes concebidos para abrir artérias obstruídas. O crescimento acelerado da placa arteroesclerótica também foi relatado sob condições que originam lesões arteriais, infecções virais, vasculite, homocistinuria, diabetes melitus, hipertensão, hiperlipiduria, disfunções derivadas do fumo e geradas pelo complexo imunitário. Os virus com um maior ADN desenvolveram mecanismos, tais como proteínas anti-inflamatórias que permitem ao vírus proliferar no hospedeiro com uma inibição reduzida por parte dos mecanismos de defesa imunitária e inflamatória. A PLQ tipo 2 (T-l) foi testada como um agente terapêutico potencial para a prevenção do crescimento da placa após a angioplastia. Pensa-se que a PLQ tipo 2 age como um homólogo do receptor gama do interferão e como um inibidor da quimoquina. A PLQ tipo 2 foi testada em modelos de animais com arteroesclerose provocada por lesões, e os resultados demonstraram uma redução significativa na formação da placa quatro semanas após a infusão. A proteína de 35 KDa, uma PLQ tipo 2 isolada do virus da Vacina, reduziu de forma significativa a hiperplasia intimai (crescimento da placa arteroesclerótica) após as lesões provocadas pelo balão de angioplastia, depois de uma única injecção intravenosa (Tabela 1). Isto mostra que a PLQ tipo 2 pode ser utilizada como um agente anti-inflamatório para o tratamento ou para prevenir as disfunções com base no sistema imunitário. 10 ratos Sprague Dawley foram sujeitos a ter lesões da artéria iliofemoral direita provocadas por balão, sob anestesia geral. Um balão de angioplastia de l,5mm foi introduzido, através de um corte arterial femoral, e a ponta mais distante do balão foi feita progredir até à bifurcação ilíaca. Imediatamente antes de insuflar o balão, 1,0 ml de solução salina (5 ratos) ou concentrações crescentes de proteína de 35K de vacina I 21

purificada, a 50 pg (5 ratos), foram injectados na artéria. O balão de angioplastia foi depois insuflado até atingir 6 a 8 atm durante 2 minutos, esvaziado e retirado. A artéria femoral foi fechada com uma Nexaband no local da punctura após a remoção do eaiéier. Deixou-se os ratos recuperarem e foram monitorizados durante 4 semanas. Ao chegar às 4 semanas, os ratos foram sacrificados e as artérias foram recolhidas para uma análise histológica. A área íntima foi medida por análise morfométrica. Uma redução significativa na hiperplasia íntima (área da placa) foi detectada após a infusão da proteína de 35 KDa, em comparação com as infusões salinas de controlo (p<0,0089) (Tabela 1). TABELA 1

Dose de 35 KDa Área média da placa mm^ S.E. Valor p (teste t) 0 0,055 0,012 NS 50pg 0,014 0,011 0,0089 EXEMPLO 4

PLQ-II INIBE A LIGAÇÃO DA QUIMOQUINA A RECEPTORES CELULARES DE MONÓCITOS HUMANOS A inibição da ligação da PIM-Ια ao receptor da superfície dos monócitos humanos primários e das células THP-1 pela proteína de 35 KDa da vacina (estirpe Lister) (Tabela 2) e M-Tl (Tabela 3), respectivamente, foi demonstrada de acordo com o seguinte protocolo. (Nota: a experiência 3 nas Tabelas 1 e 2 utilizou células THP-1, todos os outros resultados foram obtidos de monócitos primários.)

Obteve-se l25I PIM-Ια (25pCi/ml) rádio rotulada e adicionou-se um volume apropriado de PIM-Ια rádio-rotulada (quente), passando cada tubo a conter 50.000cpm. Como controlo, adicionou-se (400ng) de PIM-Ια não rotulada (fria) juntamente com a PIM-la quente para mostrar a ligação de fundo. Para a medir as propriedades inibidoras da 35 KDa da M-Tl (CBP-2) e da M-T7 (CBP-1), foram adicionadas doses variáveis do inibidor com o ligando rádio-rotulado e as amostras foram incubadas a uma temperatura de 37°C (5% de C02) durante 30 minutos. Os monócitos primários, isolados do sangue humano e separados num gradiente Percoll, foram diluídos com RPMI 1640, contendo

22 1% de BSA numa concentração de lxlO7 células/ml, e 200μ1 destas células foram adicionadas a cada mistura reaccional. Concentrações similares foram utilizadas para células THP-1 (linha da célula do monócito). Os tubos das amostras foram rodados durante uma hora à temperatura ambiente, sendo as células depois centrifugadas a 13.000 rpm durante 5 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e as células foram lavadas com 800μ1 de uma solução de sacarose a 10%. As células foram novamente centrifugadas a 13.000 rpm durante 10 minutos e os sobrenadantes foram retirados. Depois, mediu-se a radioactividade dos grãos utilizando um contador gama. Como um segundo conjunto de controlos, procedeu-se também ao teste das propriedades de ligação da H3-fMLP ao respectivo receptor celular, na presença de inibidores (Tabela 4). Seguiu-se o referido protocolo, à excepção de se ter distribuído um volume uniforme de Ιμΐ por cada tubo, resultando em contagens de aproximadamente 180.000 cpm por tubo. Note-se que tanto a 35 KDa como a M-Tl bloquearam quantitativamente a ligação da quimoquina aos receptores celulares da PIM-la. TABELA 2

Ligação da superfície da PIM-la Ex. Excesso molar de proteína 35 KDa Excesso de PIM-1 α não rotulada PIM-la rotulada 1600 800 400 200 50 40 4 2 6500X 1 80 77 107 144 1280 — — — 470 4705 2 — — ... 88 ... 2342 10688 9113 410 7708 3 55 — — — — --- — — 1038 9944

Nota: Na Experiência 3 utilizaram-se células THP-1; na Experiência 1 e 2 utilizaram-se monócitos primários. TABELA 3

Ligação da superfície da PIM-1 α Ex. 200X de excesso 200X de excesso 6500X de excesso molar PIM-la molar da M-Tl molar da M-T7 da PIM-la não rotulada rotulada 1 978 10171 444 12206 23

1-- TABELA 4 Ligação da superfície da fMLP Ex. fMLP rotulada lxlO6 M de fMLP não rotulada 35 KDa (400ng) 1 374 132 507

Lisboa, 1 7 -MOV. 2000

Dr. Américo da Silva Caralho

Agente Οί.'ώ! J; Pr-;::!: j

R-. Cest-ího. LlíicA

Teteís. 213 £5>1 SS9 - 21% 854 6)3

Claims (10)

1. REIVINDICA ÇÕES 1. Uma composição farmacêutica contendo pelo menos uma dose de uma quantidade imunoterapeuticamente, eficaz, de uma proteína unu-inflamatória, com uma sequência de aminoácidos como mostrada na ID SEQ N.° 2 ou uma variação moderada da sequência polipeptídica, num veículo farmacologicamente aceitável.
2. 2. A composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a proteína anti-inflamatória ser uma proteína de ligação de quimoquina tipo 2.
3. 3. A composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a quimoquina ser uma quimoquina da classe α ou da classe β.
4. 4. A composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de a quimoquina ser seleccionada do grupo que consiste em PATC-III, cresc/AECM, ANE-78, PQM-1, interleuquina-8, RANTES, ΡΙΝ/1-Ια e PIM-1β, PF-4, PI-10 e PAN-2.
5. 5. Um método para a identificação duma quimoquina, caracterizado pelo facto de a proteína de ligação da quimoquina, com uma sequência de aminoácidos, como na ID SEQ N.° 2, ou uma variação moderada da sequência polipeptídica, ser posta em contacto com uma composição que se suspeita ser uma quimoquina e se detectar a ligação da composição de quimoquina com a proteína de ligação da quimoquina.
6. 6. Utilização de uma quantidade terapeuticamente, eficaz de uma proteína de ligação da quimoquina, com uma sequência de aminoácidos como na ID SEQ N.° 2 ou uma variação moderada da sequência polipeptídica para a fabricação de um medicamento, com vista ao tratamento de uma disfunção imunopatológica relacionada com a quimoquina, seleccionada do grupo 2

   constituído por infecção microbiana, tumores malignos e metasteses, asma, restenose coronária, doenças autoimunes, cirrose, endotoxemia, arteroesclerose, ferimento de reperfusão e respostas inflamatórias.
7. 7.
8. 8.
9. 9.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de a quimoquina ser uma quimoquina da classe α ou da classe β. Utilização de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de a quimoquina ser seleccionada do grupo constituído por PATC-III, cresc/AECM, ENA-78, PQM-1, interleuquina-8, RANTES. PIM-Ια e ΡΪΜ-1β, PF-4, PI-10ePAN-2. Utilização de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de a composição farmacêutica poder ser administrada com um antibiótico ou um anti virai. Utilização de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de a composição farmacêutica poder ser administrada por via subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intra-rectal e transdérmica. Lisboa, | 7 2000

    Dr. Américo da Silva Carvalho AgenieOlic.ol-í f R. Casfiso, 201-3-

    Telels. 213 851339 - 213 654 613