JPH08231593A - 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 - Google Patents
腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】腫瘍増殖阻害因子（ＴＩＦ）、特にある種の正
常ヒト細胞の増殖に副作用を及ぼさずに、ある種の腫瘍
細胞の増殖を阻害することができる実質的に精製された
ポリペプチド因子を提供することにある。 【解決手段】本発明のＴＩＦはＴＧＦ依存性正常細胞の
増殖を抑制しない。また、本発明では、少なくとも２種
類の異なったＴＩＦが単離され、実質的に精製され、確
定された。それらは先行技術のものとは異なっているば
かりか、互いに区別し得る。以前に知られているＴＩＦ
と異なって、本発明のＴＩＦは新規なマイトジェン（細
胞分裂誘起物質）特性およびヒト細胞増殖刺激特性を有
している。
常ヒト細胞の増殖に副作用を及ぼさずに、ある種の腫瘍
細胞の増殖を阻害することができる実質的に精製された
ポリペプチド因子を提供することにある。 【解決手段】本発明のＴＩＦはＴＧＦ依存性正常細胞の
増殖を抑制しない。また、本発明では、少なくとも２種
類の異なったＴＩＦが単離され、実質的に精製され、確
定された。それらは先行技術のものとは異なっているば
かりか、互いに区別し得る。以前に知られているＴＩＦ
と異なって、本発明のＴＩＦは新規なマイトジェン（細
胞分裂誘起物質）特性およびヒト細胞増殖刺激特性を有
している。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は腫瘍増殖阻害因子
（ＴＩＦ）に係わり、特にある種の正常ヒト細胞の増殖
に副作用を及ぼさずに、ある種の腫瘍細胞の増殖を阻害
することができる実質的に精製されたポリペプチド因子
に関する。
（ＴＩＦ）に係わり、特にある種の正常ヒト細胞の増殖
に副作用を及ぼさずに、ある種の腫瘍細胞の増殖を阻害
することができる実質的に精製されたポリペプチド因子
に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの種類の腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）お
よび増殖阻害物質が当該分野で知られている。ホリーら
は、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77, 5989 (1980 ）および
Cell Biol.Int.Reports 7, 525-526 (1983) で、アフリ
カミドリザル腎ＢＳＣ−１細胞からの強力な増殖阻害物
質の単離について報告している。それは、ヒト乳癌細胞
やヒト正常乳線細胞と同様な産生細胞の増殖を阻害する
ことがわかった。ミックメイホーンら［Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, 79, 456-460 (1982)］は、悪性ラット肝細
胞には作用しないが、正常ラット肝細胞には作用する細
胞増殖阻害物質［Ｍｒ（相対分子量）＝２６，０００］
をラットの肝臓から精製した。他の増殖阻害物質は培養
したヒヨコ脊髄細胞で発見されている［カーゲンら、エ
クスペリメンタル・ニューロロジー（Experimental Neu
rology）,58,347-360 (1978)；ハリントンら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 77,423-427 (1980); およびステック
ら、J.Cell Biol. 83, 562-575 (1979) ］。
よび増殖阻害物質が当該分野で知られている。ホリーら
は、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77, 5989 (1980 ）および
Cell Biol.Int.Reports 7, 525-526 (1983) で、アフリ
カミドリザル腎ＢＳＣ−１細胞からの強力な増殖阻害物
質の単離について報告している。それは、ヒト乳癌細胞
やヒト正常乳線細胞と同様な産生細胞の増殖を阻害する
ことがわかった。ミックメイホーンら［Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, 79, 456-460 (1982)］は、悪性ラット肝細
胞には作用しないが、正常ラット肝細胞には作用する細
胞増殖阻害物質［Ｍｒ（相対分子量）＝２６，０００］
をラットの肝臓から精製した。他の増殖阻害物質は培養
したヒヨコ脊髄細胞で発見されている［カーゲンら、エ
クスペリメンタル・ニューロロジー（Experimental Neu
rology）,58,347-360 (1978)；ハリントンら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 77,423-427 (1980); およびステック
ら、J.Cell Biol. 83, 562-575 (1979) ］。
【０００３】ビカエル［Nature, 231, 449-450 (1971)
］は、増殖が平坦域に達した腹水癌をもったマウスか
ら癌細胞のほとんどを吸引してしまうと、残っている癌
細胞が急激に増殖することを報告した。十分増殖した腹
水癌を担ったマウスから得た、細胞を含まない腹水液
を、増殖中の癌細胞を担ったマウスに注射すると、癌の
増殖が著しく抑制される。ビカエル（上記報文で）は、
進行した癌をもつマウスと、初期癌を担ったマウスを外
科手術により結合（併体結合）させると、初期癌の増殖
が著しく抑制されることも観察した。これらの観察［ビ
カエル、Europ.J.Cancer, 6, 291-296 (1970) およびビ
カエル、上記報文］は併体結合のマウス腹膜を通して循
環する拡散可能な阻害因子の存在によって説明され、そ
の因子は充分に増殖した腹水癌によって産生される、細
胞を含まない腹水中に存在する。この阻害因子の性状は
分かっていないが、腹水癌の増殖率はマウスに存在する
癌組織の大きさおよび産生された阻害因子の量を規定す
る癌組織の大きさに依存していると推察された。
］は、増殖が平坦域に達した腹水癌をもったマウスか
ら癌細胞のほとんどを吸引してしまうと、残っている癌
細胞が急激に増殖することを報告した。十分増殖した腹
水癌を担ったマウスから得た、細胞を含まない腹水液
を、増殖中の癌細胞を担ったマウスに注射すると、癌の
増殖が著しく抑制される。ビカエル（上記報文で）は、
進行した癌をもつマウスと、初期癌を担ったマウスを外
科手術により結合（併体結合）させると、初期癌の増殖
が著しく抑制されることも観察した。これらの観察［ビ
カエル、Europ.J.Cancer, 6, 291-296 (1970) およびビ
カエル、上記報文］は併体結合のマウス腹膜を通して循
環する拡散可能な阻害因子の存在によって説明され、そ
の因子は充分に増殖した腹水癌によって産生される、細
胞を含まない腹水中に存在する。この阻害因子の性状は
分かっていないが、腹水癌の増殖率はマウスに存在する
癌組織の大きさおよび産生された阻害因子の量を規定す
る癌組織の大きさに依存していると推察された。
【０００４】トダロら［ブリストル−マイヤーズ・キャ
ンサー・シンポジウム（Bristol-Myers Cancer Symposi
um）4, 222-223, (1982)] は、ある種の癌細胞増殖阻害
因子の特性を報告した。トダロら（上記報文で）による
この観察は、部分的に精製された製剤に基づけば予備的
なものであった。そればかりでなく本発明のＴＩＦはい
くつかの基本的な点でこれら先行技術のものとは異なっ
ている。すなわち、 （１）先行技術のＴＩＦがＴＧＦ（腫瘍細胞増殖因子）
依存性の正常細胞の増殖を遮断するのに対して、本発明
のＴＩＦはＴＧＦ依存性正常細胞の増殖を抑制しない。
ンサー・シンポジウム（Bristol-Myers Cancer Symposi
um）4, 222-223, (1982)] は、ある種の癌細胞増殖阻害
因子の特性を報告した。トダロら（上記報文で）による
この観察は、部分的に精製された製剤に基づけば予備的
なものであった。そればかりでなく本発明のＴＩＦはい
くつかの基本的な点でこれら先行技術のものとは異なっ
ている。すなわち、 （１）先行技術のＴＩＦがＴＧＦ（腫瘍細胞増殖因子）
依存性の正常細胞の増殖を遮断するのに対して、本発明
のＴＩＦはＴＧＦ依存性正常細胞の増殖を抑制しない。
【０００５】（２）先行技術では、阻害因子には異なっ
た群または型があるかが不明であったが、本発明では、
実際、少なくとも２種類の異なったＴＩＦが単離され、
実質的に精製され、確定された。それらは先行技術のも
のとは異なっているばかりか、互いに区別し得る。
た群または型があるかが不明であったが、本発明では、
実際、少なくとも２種類の異なったＴＩＦが単離され、
実質的に精製され、確定された。それらは先行技術のも
のとは異なっているばかりか、互いに区別し得る。
【０００６】（３）以前に知られているＴＩＦと異なっ
て、本発明のＴＩＦは新規なマイトジェン（細胞分裂誘
起物質）特性およびヒト細胞増殖刺激特性を有してい
る。
て、本発明のＴＩＦは新規なマイトジェン（細胞分裂誘
起物質）特性およびヒト細胞増殖刺激特性を有してい
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は腫瘍増殖阻害
因子（ＴＩＦ）に係わり、特にある種の正常ヒト細胞の
増殖に副作用を及ぼさずに、ある種の腫瘍細胞の増殖を
阻害することができる実質的に精製されたポリペプチド
因子を提供することにある。
因子（ＴＩＦ）に係わり、特にある種の正常ヒト細胞の
増殖に副作用を及ぼさずに、ある種の腫瘍細胞の増殖を
阻害することができる実質的に精製されたポリペプチド
因子を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】腫瘍増殖阻害因子は、多
様な材料から得られる。例えば、尿、血清、血漿および
羊水のような哺乳類の体液；肝臓、心臓、肺、脾臓、筋
肉、脳、胎盤、臍帯、腎臓および膵臓のような哺乳類の
成体および胎児の組織；組織培養による正常ヒト細胞の
コンディションド・メディウム（細胞培養液の上清）の
ような様々なコンデイションドメディウム；組織培養細
胞等からの抽出物である。
様な材料から得られる。例えば、尿、血清、血漿および
羊水のような哺乳類の体液；肝臓、心臓、肺、脾臓、筋
肉、脳、胎盤、臍帯、腎臓および膵臓のような哺乳類の
成体および胎児の組織；組織培養による正常ヒト細胞の
コンディションド・メディウム（細胞培養液の上清）の
ような様々なコンデイションドメディウム；組織培養細
胞等からの抽出物である。
【０００９】腫瘍増殖阻害因子は、酸／エタノール抽
出、ゲル浸透クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を含めた様
々な実験手法を用いて単離および精製することができ
る。
出、ゲル浸透クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を含めた様
々な実験手法を用いて単離および精製することができ
る。
【００１０】添加剤、担体および／またはアジュバンド
の中で、当該分野でよく知られた適当な物質を、もし必
要なら用いることができる。好ましい物質として、生理
食塩水、水性溶媒、賦形剤、防腐剤、抗菌剤、殺菌剤等
が挙げられる。
の中で、当該分野でよく知られた適当な物質を、もし必
要なら用いることができる。好ましい物質として、生理
食塩水、水性溶媒、賦形剤、防腐剤、抗菌剤、殺菌剤等
が挙げられる。
【００１１】以下に提示されるデータから分かるよう
に、本発明の腫瘍増殖阻害因子（ＴＩＦ）は熱安定なタ
ンパクで何種類も存在する。それはみかけの分子量が
３，５００ないし４５，０００（ドルトン）の範囲で、
等電点（ｐＩ）が４ないし８であり、ＴＩＦ−１とＴＩ
Ｆ−２が代表的である。様々なＴＩＦは、いくぶん疎水
的であり、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ）のＣ18カラムからアセトニトリル２５ないし５
０％の間または２−プロパノール１０ないし３５％の間
で溶出する。様々なＴＩＦのいくつかの特徴および性質
は以後に記載する。
に、本発明の腫瘍増殖阻害因子（ＴＩＦ）は熱安定なタ
ンパクで何種類も存在する。それはみかけの分子量が
３，５００ないし４５，０００（ドルトン）の範囲で、
等電点（ｐＩ）が４ないし８であり、ＴＩＦ−１とＴＩ
Ｆ−２が代表的である。様々なＴＩＦは、いくぶん疎水
的であり、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ）のＣ18カラムからアセトニトリル２５ないし５
０％の間または２−プロパノール１０ないし３５％の間
で溶出する。様々なＴＩＦのいくつかの特徴および性質
は以後に記載する。
【００１２】「実質的に精製された」という言葉の意味
は、純度が８０％以上である製剤、好ましくは９０％以
上、さらに好ましくは９５％以上である製剤ということ
である。
は、純度が８０％以上である製剤、好ましくは９０％以
上、さらに好ましくは９５％以上である製剤ということ
である。
【００１３】材料と方法 以後に記載する方法に類似したまたは同等の材料、方法
を使用し得るが、次のものが望ましい。
を使用し得るが、次のものが望ましい。
【００１４】組織抽出物からの腫瘍増殖阻害因子（ＴＩ
Ｆ）の単離 酸／エタノ−ル抽出法［ダボレン、Biochem. Biophys.
Acta., 63, 150 (1902) およびロバー卜ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 77, 3494 (1980) に記載］の改良
法により、組織を抽出した。すなわち、９５％（Ｖ／
Ｖ）エタノール３７５ｍｌ、濃塩酸７．５ｍｌ、フッ化
フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）３３ｎｇおよび
アプロチニン［０．９％ＮａＣｌおよび０．９％ベンジ
ルアルコール中の１０−２０トリプシン阻害剤単位（Ｔ
ＩＵ）］１ｍｌから成る溶液に蒸留水１９２ｍｌを混合
した。組織をこの溶液に懸濁し（６ｍｌ／組織１ｇ）、
はさみで細かく切りそしてソルバールオムニミキサーで
均質化した。４℃で一晩抽出後、その混合物を５０００
ｇで３０分間遠心し、ペレットを捨てた。その抽出物を
濃水酸化アンモニウムでｐＨ５．０に調整し、抽出物１
００ｍｌ当り１ｍｌの２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．２）を加えた。この抽出物を５０００ｇで３０分
間遠心し、沈殿物を除去した。冷無水エーテル４容と冷
無水エタノール２容をただちに加え、この混合物を−２
０℃で４８時問静置させた。生じた析出物を沈殿させ、
液体の大部分をサイホンで吸い出した。残った懸濁液を
５０００ｇで３０分間遠心し、ペレットを得た。このペ
レットを１Ｍ酢酸に溶解し、排除分子量３５００のスペ
クトラポール（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）管（スペクトラ
ム・メデイカル・インダストリーズ、カリフォルニア州
ロサンゼルス）中で０．２Ｍ酢酸に対して徹底的に透析
した。この物質は１Ｍ酢酸中にて４℃で保存するか、ま
たは凍結乾燥した。
Ｆ）の単離 酸／エタノ−ル抽出法［ダボレン、Biochem. Biophys.
Acta., 63, 150 (1902) およびロバー卜ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 77, 3494 (1980) に記載］の改良
法により、組織を抽出した。すなわち、９５％（Ｖ／
Ｖ）エタノール３７５ｍｌ、濃塩酸７．５ｍｌ、フッ化
フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）３３ｎｇおよび
アプロチニン［０．９％ＮａＣｌおよび０．９％ベンジ
ルアルコール中の１０−２０トリプシン阻害剤単位（Ｔ
ＩＵ）］１ｍｌから成る溶液に蒸留水１９２ｍｌを混合
した。組織をこの溶液に懸濁し（６ｍｌ／組織１ｇ）、
はさみで細かく切りそしてソルバールオムニミキサーで
均質化した。４℃で一晩抽出後、その混合物を５０００
ｇで３０分間遠心し、ペレットを捨てた。その抽出物を
濃水酸化アンモニウムでｐＨ５．０に調整し、抽出物１
００ｍｌ当り１ｍｌの２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．２）を加えた。この抽出物を５０００ｇで３０分
間遠心し、沈殿物を除去した。冷無水エーテル４容と冷
無水エタノール２容をただちに加え、この混合物を−２
０℃で４８時問静置させた。生じた析出物を沈殿させ、
液体の大部分をサイホンで吸い出した。残った懸濁液を
５０００ｇで３０分間遠心し、ペレットを得た。このペ
レットを１Ｍ酢酸に溶解し、排除分子量３５００のスペ
クトラポール（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）管（スペクトラ
ム・メデイカル・インダストリーズ、カリフォルニア州
ロサンゼルス）中で０．２Ｍ酢酸に対して徹底的に透析
した。この物質は１Ｍ酢酸中にて４℃で保存するか、ま
たは凍結乾燥した。
【００１５】コンデイションド・メディウム（細胞培養
液の上清） 細胞を含まないコンディションド・メディウムをヒト横
絞筋腫細胞系Ａ６７３から採取した。細胞を、１０％ウ
シ胎児血清を補ったダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥ
Ｍ）５０ｍｌの入ったコーニング８５０ｃｍ2 回転ボト
ル（コーニング２５１４０）中で適当に飽和するまで増
殖させた。続いて、その単層を血清を含まないＤＭＥＭ
５０ｍｌで２回洗った。各回転ボトルを血清を含まない
ワイマウスの培地（メロイ・ラブズ社）５０ｍｌ中で８
時問培養した。その培地を捨て、血清を含まない新しい
ワイマウスの培地５０ｍｌと置換え、細胞を４８時間培
養した。こうして「コンディションド・メディウム」を
集め、血清を含まない新しいワイマウスの培地と置換
え、さらに４８時間培養した。コンディンョンド・メデ
ィウムは、Ａ６７３細胞の適当に飽和した単層ごとに３
回集め合計した。続いて集めたコンディションド・メデ
ィウムを溜めて、ベックマンＣＦ−３２ローターを用い
３２，０００ｒｐｍ（流出率５ｌ／時間）で遠心し、透
明にした。清澄になった物質をアミコンＤＣ−１０中空
糸濾過器（遮断分子量：５０００）を使って１００倍に
濃縮（例えば５０ｌを５００ｍｌに）した。濃縮した物
質を溜め、濾過器を２００ｍｌの濾液で洗い残っている
因子を除いた。濃縮液と洗浄液をスペクトロフォー（Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｐｈｏｒ）３透析管（遮断分子量：３５０
０）に溜め、２ｌの０．１Ｍ酢酸に対して透析した。透
析した物質をベックマン３５型ローター上にて２７，０
００ｒｐｍで１時間遠心した。ペレットを捨て、上清を
凍結乾燥した。
液の上清） 細胞を含まないコンディションド・メディウムをヒト横
絞筋腫細胞系Ａ６７３から採取した。細胞を、１０％ウ
シ胎児血清を補ったダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥ
Ｍ）５０ｍｌの入ったコーニング８５０ｃｍ2 回転ボト
ル（コーニング２５１４０）中で適当に飽和するまで増
殖させた。続いて、その単層を血清を含まないＤＭＥＭ
５０ｍｌで２回洗った。各回転ボトルを血清を含まない
ワイマウスの培地（メロイ・ラブズ社）５０ｍｌ中で８
時問培養した。その培地を捨て、血清を含まない新しい
ワイマウスの培地５０ｍｌと置換え、細胞を４８時間培
養した。こうして「コンディションド・メディウム」を
集め、血清を含まない新しいワイマウスの培地と置換
え、さらに４８時間培養した。コンディンョンド・メデ
ィウムは、Ａ６７３細胞の適当に飽和した単層ごとに３
回集め合計した。続いて集めたコンディションド・メデ
ィウムを溜めて、ベックマンＣＦ−３２ローターを用い
３２，０００ｒｐｍ（流出率５ｌ／時間）で遠心し、透
明にした。清澄になった物質をアミコンＤＣ−１０中空
糸濾過器（遮断分子量：５０００）を使って１００倍に
濃縮（例えば５０ｌを５００ｍｌに）した。濃縮した物
質を溜め、濾過器を２００ｍｌの濾液で洗い残っている
因子を除いた。濃縮液と洗浄液をスペクトロフォー（Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｐｈｏｒ）３透析管（遮断分子量：３５０
０）に溜め、２ｌの０．１Ｍ酢酸に対して透析した。透
析した物質をベックマン３５型ローター上にて２７，０
００ｒｐｍで１時間遠心した。ペレットを捨て、上清を
凍結乾燥した。
【００１６】培養細胞 培養細胞を１０％ＦＢＳ（ギブコ）を補ったダルベッコ
の改良型イーグル培地の入った７５ｃｍ2 プラスティッ
ク製組織培養フラスコ（ファルコン３０２４）中で３７
℃に維持した。ただしｌ０％ウシ血清を要求する細胞系
３Ｔ３ ２０２，４９Ｆおよびキルスタインウイルスで
形質転換した正常ラット腎細胞（ＫＮＲＫ）にはこの条
件があてはまらない。Ａ５４９はヒト肺の腺癌である。
ＨｕＦは組織培養でｌ０ないし２５回継代したヒト包皮
線維芽細胞系であり、Ｊ．レビー（サンフランシコクの
カリフォルニア大学、ガン研究所）から供与された。３
Ｔ３ ２−２はウィグラー（ニューヨークのコールドス
プリングハーバー研究所）から供与されたマウスＮＩＨ
３Ｔ３細胞のなかの１種のクローンである。
の改良型イーグル培地の入った７５ｃｍ2 プラスティッ
ク製組織培養フラスコ（ファルコン３０２４）中で３７
℃に維持した。ただしｌ０％ウシ血清を要求する細胞系
３Ｔ３ ２０２，４９Ｆおよびキルスタインウイルスで
形質転換した正常ラット腎細胞（ＫＮＲＫ）にはこの条
件があてはまらない。Ａ５４９はヒト肺の腺癌である。
ＨｕＦは組織培養でｌ０ないし２５回継代したヒト包皮
線維芽細胞系であり、Ｊ．レビー（サンフランシコクの
カリフォルニア大学、ガン研究所）から供与された。３
Ｔ３ ２−２はウィグラー（ニューヨークのコールドス
プリングハーバー研究所）から供与されたマウスＮＩＨ
３Ｔ３細胞のなかの１種のクローンである。
【００１７】ゲル浸透クロマトグラフィー 凍結乾燥したコンディションド・メディウム（コンディ
ションド・メディウム３０ないし１００ｌから得た２０
０ないし３００ｍｇ）を１Ｍ酢酸１５ないし２０ｍｌ中
に再び懸濁させ、バイオ−ゲルＰ−１００（１００−２
００メッシュ、ポリアクリルアミドゲルバイオ・ラド）
をつめたカラム（５×８２．５ｃｍ）にかけ、平衡化さ
せて、４℃にて１Ｍ酢酸で溶出させた。複数の分画（１
２．４ｍｌ）を集めた。そして２本置きの各分画からア
リコート２．５μｌを取り、ＴＩＦ活性を測定した。ま
た２本置きの各分画からアリコート１００μｌを取りＴ
ＧＦ活性を測定した。増殖調節活性（各種のＴＩＦおよ
びＴＧＦ）を含む分画を３種のプールＡないしＣ（第１
図）に分け、凍結乾燥した。
ションド・メディウム３０ないし１００ｌから得た２０
０ないし３００ｍｇ）を１Ｍ酢酸１５ないし２０ｍｌ中
に再び懸濁させ、バイオ−ゲルＰ−１００（１００−２
００メッシュ、ポリアクリルアミドゲルバイオ・ラド）
をつめたカラム（５×８２．５ｃｍ）にかけ、平衡化さ
せて、４℃にて１Ｍ酢酸で溶出させた。複数の分画（１
２．４ｍｌ）を集めた。そして２本置きの各分画からア
リコート２．５μｌを取り、ＴＩＦ活性を測定した。ま
た２本置きの各分画からアリコート１００μｌを取りＴ
ＧＦ活性を測定した。増殖調節活性（各種のＴＩＦおよ
びＴＧＦ）を含む分画を３種のプールＡないしＣ（第１
図）に分け、凍結乾燥した。
【００１８】プールＢは凍結乾燥し、バイオ−ゲルＰ−
１０カラムでさらに精製した。凍結乾燥した試料（２０
ないし４０ｍｇ）を１Ｍ酢酸５ないし７ｍｌに溶解し、
不溶物質を除くために４℃で３０分間２００ｇで遠心し
た。上清をバイオ−ゲルＰ−１０（２００ないし４００
メッシユ、ポリアクリルアミド、バイオ・ラド）にか
け、平衡化して、４℃にて１Ｍ酢酸で溶出させた。複数
の分画（４．６ｍｌ）を集め、アリコート１００μｌを
２本置きの各分画から取り、ＴＩＦ活性を測定した。
１０カラムでさらに精製した。凍結乾燥した試料（２０
ないし４０ｍｇ）を１Ｍ酢酸５ないし７ｍｌに溶解し、
不溶物質を除くために４℃で３０分間２００ｇで遠心し
た。上清をバイオ−ゲルＰ−１０（２００ないし４００
メッシユ、ポリアクリルアミド、バイオ・ラド）にか
け、平衡化して、４℃にて１Ｍ酢酸で溶出させた。複数
の分画（４．６ｍｌ）を集め、アリコート１００μｌを
２本置きの各分画から取り、ＴＩＦ活性を測定した。
【００１９】逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−
ＨＰＬＣ） バイオ−ゲルＰ−１０カラムからＴＩＦ活性のピークを
含む分画を集めた。典型的にはこれら分画は分画４４な
いし４７であった。コンディションド・メディウム３０
ないし６０ｌ相当からの物質を各ＨＰＬＣに使用した。
複数のバイオ−ゲルＰ−１０分画を合わせて凍結乾燥し
た。残渣を０．０５％トリフルオロ酢酸１ｍｌに再び懸
濁した。この溶液は、不溶物質を除くために１０００ｇ
で５分間遠心した。上清をウォーターズμボンドパーク
（μＢｏｎｄａｐａｋ）Ｃ18カラム（０．３９×３０ｃ
ｍ）に注入した。ＩＢＭの濃度勾配液体クロマトグラフ
ィー装置（ＩＢＭ ＬＣ／９５３３）を使用した。カラ
ムの溶出液を２０６ｎｍに設定した可変波長紫外（Ｕ．
Ｖ．）検出器（ＩＢＭ ＬＣ／９５２３）で監視した。
２０６ｎｍで吸収を示す主要ピークの分画を集めた。各
分画からアリコートを取り、ＴＩＦまたはＴＧＦ活性を
測定した。
ＨＰＬＣ） バイオ−ゲルＰ−１０カラムからＴＩＦ活性のピークを
含む分画を集めた。典型的にはこれら分画は分画４４な
いし４７であった。コンディションド・メディウム３０
ないし６０ｌ相当からの物質を各ＨＰＬＣに使用した。
複数のバイオ−ゲルＰ−１０分画を合わせて凍結乾燥し
た。残渣を０．０５％トリフルオロ酢酸１ｍｌに再び懸
濁した。この溶液は、不溶物質を除くために１０００ｇ
で５分間遠心した。上清をウォーターズμボンドパーク
（μＢｏｎｄａｐａｋ）Ｃ18カラム（０．３９×３０ｃ
ｍ）に注入した。ＩＢＭの濃度勾配液体クロマトグラフ
ィー装置（ＩＢＭ ＬＣ／９５３３）を使用した。カラ
ムの溶出液を２０６ｎｍに設定した可変波長紫外（Ｕ．
Ｖ．）検出器（ＩＢＭ ＬＣ／９５２３）で監視した。
２０６ｎｍで吸収を示す主要ピークの分画を集めた。各
分画からアリコートを取り、ＴＩＦまたはＴＧＦ活性を
測定した。
【００２０】軟寒天増殖阻害検定 試験のための凍結乾燥後の試料を、０．３４％寒天（デ
ィフコ、アガーノーブル）および２×１０4 のヒト肺癌
細胞Ａ５４９を含む最終容積１．４ｍｌの完全増殖培地
（１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ）に溶解した。処理済
み細胞の軟寒天懸濁液を、６０ｍｍシャーレ（ファルコ
ン３００２）につくった完全増殖培地を含む２ｍｌの
０．５％寒天基層２ｍｌ上にピペットで加えた。シャー
レを、加湿した５％ＣＯ2 ／９５％空気雰囲気中にて３
７℃で３週間培養した。７日後、培養物に完全増殖培地
を含む０．３４％寒天１．５ｍｌをさらに加えた。２週
間後および３週間後に増殖の様子を顕微鏡写真で撮影し
た。
ィフコ、アガーノーブル）および２×１０4 のヒト肺癌
細胞Ａ５４９を含む最終容積１．４ｍｌの完全増殖培地
（１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ）に溶解した。処理済
み細胞の軟寒天懸濁液を、６０ｍｍシャーレ（ファルコ
ン３００２）につくった完全増殖培地を含む２ｍｌの
０．５％寒天基層２ｍｌ上にピペットで加えた。シャー
レを、加湿した５％ＣＯ2 ／９５％空気雰囲気中にて３
７℃で３週間培養した。７日後、培養物に完全増殖培地
を含む０．３４％寒天１．５ｍｌをさらに加えた。２週
間後および３週間後に増殖の様子を顕微鏡写真で撮影し
た。
【００２１】腫瘍増殖阻害因子検定 試験細胞（３×ｌ０3 細胞／穴）を、完全培地５０μｌ
の入った９６穴組織培養板（タンク１６７００８）上で
二次培養した。ヒト肺癌細胞Ａ５４９は１穴あたり４．
５×１０3 細胞の播種密度を必要とした。カラム分画か
らのアリコートによりＴＩＦ活性を測定するが、そのア
リコートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマＡ−
６００３）１ｍｇ／ｍｌ１Ｍ酢酸溶液５０μｌを含む滅
菌済み１２×７５ｍｍ試験管に移し、凍結乾燥した。検
定直前にその凍結乾燥した試料を完全培地２００μｌ中
に再び懸濁させた。再懸濁させた試料のアリコート５０
μｌを試験細胞を含む穴に加えた。各サンプルを３回検
定した。細胞を加湿した５％ＣＯ2 ／９５％空気雰囲気
中で３７℃にて７２時間培養した。培養期間の終りに各
穴を５−［ 125Ｉ］アイオド−２−デオキシウリジン（
125ＩＵｄＲ）（アメルスハムＩＭ． ３５５Ｖ）１μ
Ｃｉ／ｍｌを含む完全培地１００μｌで２４時間処理し
た。単層を緩衝液［１ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび５０ｍＭ
２−シス（２−ヒドロキシエチル）アミノエタンスルホ
ン酸を含むダルベッコの改良型イーグル培地、ｐＨ６．
８］で一度洗浄し、無水メタノール中で１０分間固定
し、１５分間空気乾燥した。細胞に取込まれた 125ＩＵ
ｄＲを１ＮＮａＯＨ２００μｌで可溶化し、６０℃で２
０分間インキュベートした。各穴中の細胞によって取込
まれ、可溶化された 125ＩＵｄＲをタイターテック上澄
回収システム（フロ・ラボラトリーズ、７８−２１０−
０５）を用いて回収・測定した。細胞増殖の量を、対数
増殖期にある細胞のＤＮＡに取込まれた 125ＩＵｄＲの
量から概算した。検定を行なう前に、細胞の増殖程度を
肉眼で確認するために、各穴をライツの倒立顕徴鏡を使
って観察した。顕微鏡観察による処理細胞の増殖阻害の
程度は、 125ＩＵｄＲの取込み量の減少と一致してい
た。増殖の阻害は、未処理の対照細胞によって取込まれ
た 125ＩＵｄＲに対するＴＩＦで処理した試験細胞（例
えばヒト腫瘍細胞）に取込まれた 125ＩＵｄＲの比によ
って表わした。単層培養中で腫瘍細胞の 125ＩＵｄＲの
取込みを最も阻害するカラム分画は、軟寒天上で腫瘍細
胞の増殖を最も阻害した。細胞増殖の増大が顕微鏡観察
で認められる条件は 125ＩＵｄＲの取込みの増大と一致
していた。細胞増殖の増大は、パーセント刺激として表
わされるが、未処理の対照細胞により取込まれた 125Ｉ
ＵｄＲに対してＴＩＦで処理した試験細胞（例えば、正
常ヒト細胞）により取込まれた 125ＩＵｄＲの比に対応
する。
の入った９６穴組織培養板（タンク１６７００８）上で
二次培養した。ヒト肺癌細胞Ａ５４９は１穴あたり４．
５×１０3 細胞の播種密度を必要とした。カラム分画か
らのアリコートによりＴＩＦ活性を測定するが、そのア
リコートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマＡ−
６００３）１ｍｇ／ｍｌ１Ｍ酢酸溶液５０μｌを含む滅
菌済み１２×７５ｍｍ試験管に移し、凍結乾燥した。検
定直前にその凍結乾燥した試料を完全培地２００μｌ中
に再び懸濁させた。再懸濁させた試料のアリコート５０
μｌを試験細胞を含む穴に加えた。各サンプルを３回検
定した。細胞を加湿した５％ＣＯ2 ／９５％空気雰囲気
中で３７℃にて７２時間培養した。培養期間の終りに各
穴を５−［ 125Ｉ］アイオド−２−デオキシウリジン（
125ＩＵｄＲ）（アメルスハムＩＭ． ３５５Ｖ）１μ
Ｃｉ／ｍｌを含む完全培地１００μｌで２４時間処理し
た。単層を緩衝液［１ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび５０ｍＭ
２−シス（２−ヒドロキシエチル）アミノエタンスルホ
ン酸を含むダルベッコの改良型イーグル培地、ｐＨ６．
８］で一度洗浄し、無水メタノール中で１０分間固定
し、１５分間空気乾燥した。細胞に取込まれた 125ＩＵ
ｄＲを１ＮＮａＯＨ２００μｌで可溶化し、６０℃で２
０分間インキュベートした。各穴中の細胞によって取込
まれ、可溶化された 125ＩＵｄＲをタイターテック上澄
回収システム（フロ・ラボラトリーズ、７８−２１０−
０５）を用いて回収・測定した。細胞増殖の量を、対数
増殖期にある細胞のＤＮＡに取込まれた 125ＩＵｄＲの
量から概算した。検定を行なう前に、細胞の増殖程度を
肉眼で確認するために、各穴をライツの倒立顕徴鏡を使
って観察した。顕微鏡観察による処理細胞の増殖阻害の
程度は、 125ＩＵｄＲの取込み量の減少と一致してい
た。増殖の阻害は、未処理の対照細胞によって取込まれ
た 125ＩＵｄＲに対するＴＩＦで処理した試験細胞（例
えばヒト腫瘍細胞）に取込まれた 125ＩＵｄＲの比によ
って表わした。単層培養中で腫瘍細胞の 125ＩＵｄＲの
取込みを最も阻害するカラム分画は、軟寒天上で腫瘍細
胞の増殖を最も阻害した。細胞増殖の増大が顕微鏡観察
で認められる条件は 125ＩＵｄＲの取込みの増大と一致
していた。細胞増殖の増大は、パーセント刺激として表
わされるが、未処理の対照細胞により取込まれた 125Ｉ
ＵｄＲに対してＴＩＦで処理した試験細胞（例えば、正
常ヒト細胞）により取込まれた 125ＩＵｄＲの比に対応
する。
【００２２】マイトジェン（細胞分裂誘起物質）検定 １０％ウン血清を補ったＤＭＥＭ１００μｌの入った９
６穴組織培養板（タンク１６７００８）中で試験細胞
（３Ｔ３ ２−２）を二次培養（１．５×１０4細胞／
穴）し、３７℃で２４時間培養した。培地を、０．５％
ウン血清を補ったワイマウス培地（１００μｌ／穴）で
置換え、３７℃でもう一回２４時間培養した。試験する
カラム分画のアリコートを、１Ｍ酢酸５０μｌを含む減
菌済み１２×７５ｍｍ試験管（ファルコン２０５８）へ
移し、凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を２μＣｉ／ｍ
ｌの 125ＩＵｄＲを含む血清の入っていないワイマウス
培地３００μｌに再び懸濁し、３回検定した。再懸濁し
た試料１００μｌを、０．５％ウシ血清の入ったワイマ
ウス培地１００μｌと試験細胞を含む各穴に加えた。も
う一回２４時問３７℃で培養したのち、単層を洗い、腫
瘍増殖阻害因子検定のために前記の通りに回収した。
６穴組織培養板（タンク１６７００８）中で試験細胞
（３Ｔ３ ２−２）を二次培養（１．５×１０4細胞／
穴）し、３７℃で２４時間培養した。培地を、０．５％
ウン血清を補ったワイマウス培地（１００μｌ／穴）で
置換え、３７℃でもう一回２４時間培養した。試験する
カラム分画のアリコートを、１Ｍ酢酸５０μｌを含む減
菌済み１２×７５ｍｍ試験管（ファルコン２０５８）へ
移し、凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を２μＣｉ／ｍ
ｌの 125ＩＵｄＲを含む血清の入っていないワイマウス
培地３００μｌに再び懸濁し、３回検定した。再懸濁し
た試料１００μｌを、０．５％ウシ血清の入ったワイマ
ウス培地１００μｌと試験細胞を含む各穴に加えた。も
う一回２４時問３７℃で培養したのち、単層を洗い、腫
瘍増殖阻害因子検定のために前記の通りに回収した。
【００２３】混合実験 第４図のＢＰ−ＨＰＬＣ精製段階から得た２８ないし３
３％アセトニトリルで溶出する分画、すなわちＴＩＦ−
１活性を有する分画をこの実験で使用した。バイオ−ゲ
ルＰ−１００カラムのプールＡ（第１図）に由来する分
子量２０，０００のＴＧＦをμボンダパークＣ18カラム
を取付けたＲＰ−ＨＰＬＣを用い、０．０５％トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かした２０％アセトニトリルで
直線濃度勾配をかけて溶出させた。それをさらに０．０
５％トリフルオロ酢酸に溶かした１２％プロパノールで
直線濃度勾配をかけて溶出させながらμボンダパークＣ
18カラムで精製した。Ａ５４９細胞（検定あたり１．５
×１０5 細胞）を完全培地０．３ｍｌに溶かしたＴＧＦ
および／またはＴＩＦ−１と混合した。０．５％寒天溶
液０．６４ｍｌと各分画を混合し、その懸濁液を２４穴
組織培養シャーレ（タンク１６９６９０）中の０．５％
寒天基層に加えた。シャーレを加湿した５％ＣＯ2 ／９
５％空気雰囲気中で３７℃にて培養した。３週間後、コ
ロニーを０．０５２％ｐ−アイオドニトロテトラゾリウ
ムバイオレット（１１）０．５ｍｌで染色した。
（Ａ）：未処理対照細胞。（Ｂ−Ｄ）：ＴＩＦ−１の
１：５逓減希釈液（Ｂではタンパク１５μｇ／ｍｌ）で
処理した細胞。（Ｅ）ＴＧＦ １２ｎｇ当量／ｍｌ［ｎ
ｇ当量とは、放射線受容体検定において既知の濃度のＥ
ＧＦ（上皮増殖因子）に対して競合するＴＧＦの濃度と
定義する］で処理された細胞。（Ｆ−Ｈ）：ＴＧＦ１２
ｎｇ当量／ｍｌおよびＴＩＦ−１の１：５逓減希釈液
（Ｆではタンパク１５μｌ／ｍｌ）で処理した細胞。
３％アセトニトリルで溶出する分画、すなわちＴＩＦ−
１活性を有する分画をこの実験で使用した。バイオ−ゲ
ルＰ−１００カラムのプールＡ（第１図）に由来する分
子量２０，０００のＴＧＦをμボンダパークＣ18カラム
を取付けたＲＰ−ＨＰＬＣを用い、０．０５％トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かした２０％アセトニトリルで
直線濃度勾配をかけて溶出させた。それをさらに０．０
５％トリフルオロ酢酸に溶かした１２％プロパノールで
直線濃度勾配をかけて溶出させながらμボンダパークＣ
18カラムで精製した。Ａ５４９細胞（検定あたり１．５
×１０5 細胞）を完全培地０．３ｍｌに溶かしたＴＧＦ
および／またはＴＩＦ−１と混合した。０．５％寒天溶
液０．６４ｍｌと各分画を混合し、その懸濁液を２４穴
組織培養シャーレ（タンク１６９６９０）中の０．５％
寒天基層に加えた。シャーレを加湿した５％ＣＯ2 ／９
５％空気雰囲気中で３７℃にて培養した。３週間後、コ
ロニーを０．０５２％ｐ−アイオドニトロテトラゾリウ
ムバイオレット（１１）０．５ｍｌで染色した。
（Ａ）：未処理対照細胞。（Ｂ−Ｄ）：ＴＩＦ−１の
１：５逓減希釈液（Ｂではタンパク１５μｇ／ｍｌ）で
処理した細胞。（Ｅ）ＴＧＦ １２ｎｇ当量／ｍｌ［ｎ
ｇ当量とは、放射線受容体検定において既知の濃度のＥ
ＧＦ（上皮増殖因子）に対して競合するＴＧＦの濃度と
定義する］で処理された細胞。（Ｆ−Ｈ）：ＴＧＦ１２
ｎｇ当量／ｍｌおよびＴＩＦ−１の１：５逓減希釈液
（Ｆではタンパク１５μｌ／ｍｌ）で処理した細胞。
【００２４】ＴＩＦの特性決定 トリプシン感受性は、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ
７．４）０．９ｍｌ中のＴＩＦ７６μｇにトリプシン
（シグマＴ８２５３）２５０μｇを添加して、それを３
７℃で１時間培養して試験した。トリプシンは、ダイズ
トリプシンインヒビター（シグマＴ−９００３）５００
μｇを加えることによって不活性化した。処理したＴＩ
Ｆおよび対照ＴＩＦ両方を室温でもう１時間培養した。
続いて各試料に１Ｍ酢酸０．２ｍｌを添加し、ただちに
凍結乾燥した。
７．４）０．９ｍｌ中のＴＩＦ７６μｇにトリプシン
（シグマＴ８２５３）２５０μｇを添加して、それを３
７℃で１時間培養して試験した。トリプシンは、ダイズ
トリプシンインヒビター（シグマＴ−９００３）５００
μｇを加えることによって不活性化した。処理したＴＩ
Ｆおよび対照ＴＩＦ両方を室温でもう１時間培養した。
続いて各試料に１Ｍ酢酸０．２ｍｌを添加し、ただちに
凍結乾燥した。
【００２５】還元剤の効果は、０．０６５Ｍジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）（シュワルツ／マン、９０２５１）
を含む０．１ＭＮＨ4 ＨＣＯ3 ０．９ｍｌ中の７６μｇ
ＴＩＦ（バイオゲルＰ−１００のプールＢ）を室温で１
時間培養して試験した。ＤＴＴ処理のＴＩＦのアリコー
トおよび未処理対照の了リコートをスペクトロフォー３
透析管に移し、１％酢酸（Ｖ／Ｖ）に対して徹底的に透
析した。次に、透析後の試料を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性
を試験した。
イトール（ＤＴＴ）（シュワルツ／マン、９０２５１）
を含む０．１ＭＮＨ4 ＨＣＯ3 ０．９ｍｌ中の７６μｇ
ＴＩＦ（バイオゲルＰ−１００のプールＢ）を室温で１
時間培養して試験した。ＤＴＴ処理のＴＩＦのアリコー
トおよび未処理対照の了リコートをスペクトロフォー３
透析管に移し、１％酢酸（Ｖ／Ｖ）に対して徹底的に透
析した。次に、透析後の試料を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性
を試験した。
【００２６】ＴＩＦの熱安定性は、ＴＩＦのいくつかの
アリコート３６０μｇを１Ｍ酢酸１ｍｌに再懸濁し、１
つのアリコートを５６℃３０分およびもう１つのアリコ
ートを沸騰水中で３分間処理して試験した。熱処理した
アリコートと熱処理をしない対照を凍結乾燥し、ＴＩＦ
活性の試験をした。
アリコート３６０μｇを１Ｍ酢酸１ｍｌに再懸濁し、１
つのアリコートを５６℃３０分およびもう１つのアリコ
ートを沸騰水中で３分間処理して試験した。熱処理した
アリコートと熱処理をしない対照を凍結乾燥し、ＴＩＦ
活性の試験をした。
【００２７】
【００２８】
実施例１ ＴＧＦおよびＴＩＦを含み血清の入っていないコンディ
ションド・メディウム（ヒト腫瘍細胞系Ａ６７３に由
来）はバイオゲルＰ−１００カラムにかけられ、分画に
分けられた（第１図）。タンパクの大部分は排除体積の
部分に溶出する。第１図から明らかなように、分画５５
ないし６８にＴＧＦ活性を明確に示す部分［プールＡ
（Ｍｒ＝２０，０００）と標示］があった。ＴＧＦ活性
は、分画から取ったアリコートの、上皮成長因子（ＥＧ
Ｆに対する受容体への結合に拮抗する能力を測定して決
めた。トダロら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77, 5258-5
262 ］の放射線受容体検定法を使用した。
ションド・メディウム（ヒト腫瘍細胞系Ａ６７３に由
来）はバイオゲルＰ−１００カラムにかけられ、分画に
分けられた（第１図）。タンパクの大部分は排除体積の
部分に溶出する。第１図から明らかなように、分画５５
ないし６８にＴＧＦ活性を明確に示す部分［プールＡ
（Ｍｒ＝２０，０００）と標示］があった。ＴＧＦ活性
は、分画から取ったアリコートの、上皮成長因子（ＥＧ
Ｆに対する受容体への結合に拮抗する能力を測定して決
めた。トダロら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77, 5258-5
262 ］の放射線受容体検定法を使用した。
【００２９】第１図に、ＴＩＦ活性のある３つの主要領
域を示す。大きな分子量をもつＴＩＦはＭｒ＝２８，０
００部分て溶出した。プールＢと標示されたＴＩＦ活性
（分画６９ないし９５）は１０，０００ないし１６，０
００のＭｒに相当した。プールＣと標示されたＴＩＦ活
性（分画９６ないし１３３）は５，０００ないし１０，
０００のＭｒに相当した。ＴＩＦ活性のある各主要領域
にはいくぶん異質性があった。第１図で観察されたＴＩ
Ｆ活性のある３領域はどれも全くＴＧＦ活性を含んでは
いなかった。
域を示す。大きな分子量をもつＴＩＦはＭｒ＝２８，０
００部分て溶出した。プールＢと標示されたＴＩＦ活性
（分画６９ないし９５）は１０，０００ないし１６，０
００のＭｒに相当した。プールＣと標示されたＴＩＦ活
性（分画９６ないし１３３）は５，０００ないし１０，
０００のＭｒに相当した。ＴＩＦ活性のある各主要領域
にはいくぶん異質性があった。第１図で観察されたＴＩ
Ｆ活性のある３領域はどれも全くＴＧＦ活性を含んでは
いなかった。
【００３０】軟寒天中での細胞の足場非依存性増殖は腫
瘍細胞の１つの特徴である。バイオゲルＰ−１００カラ
ムから得たＴＩＦ活性のある各領域からのいくつかのア
リコートを、軟寒天上のヒト腫瘍細胞増殖に対するそれ
らの影響について調べた。第２図は軟寒天中でのヒト癌
Ａ５４９細胞の顕微鏡写真である。腫瘍細胞の未処理対
照懸濁液は中軟寒天中で増殖し大きなコロニーを形成し
た。プールＢからのＴＩＦで処理した細胞は、軟寒天中
での増殖能が著しく阻害された。顕微鏡写真（第２図）
に見られるように、処理された腫瘍細胞は軟寒天中で増
殖しえないが、細胞死やそれに続く自己消化には至らな
いようであった。プールＢをＨＰＬＣで精製したＴＩＦ
に関して、軟寒天中でのＡ５４９の増殖阻害が同様に観
察された。これらの結果によれば、ＴＩＦは細胞毒性が
あるというよりも増殖阻害作用があると思われた。
瘍細胞の１つの特徴である。バイオゲルＰ−１００カラ
ムから得たＴＩＦ活性のある各領域からのいくつかのア
リコートを、軟寒天上のヒト腫瘍細胞増殖に対するそれ
らの影響について調べた。第２図は軟寒天中でのヒト癌
Ａ５４９細胞の顕微鏡写真である。腫瘍細胞の未処理対
照懸濁液は中軟寒天中で増殖し大きなコロニーを形成し
た。プールＢからのＴＩＦで処理した細胞は、軟寒天中
での増殖能が著しく阻害された。顕微鏡写真（第２図）
に見られるように、処理された腫瘍細胞は軟寒天中で増
殖しえないが、細胞死やそれに続く自己消化には至らな
いようであった。プールＢをＨＰＬＣで精製したＴＩＦ
に関して、軟寒天中でのＡ５４９の増殖阻害が同様に観
察された。これらの結果によれば、ＴＩＦは細胞毒性が
あるというよりも増殖阻害作用があると思われた。
【００３１】血清の入っていないコンディションド・メ
ディウムから得られた腫瘍増殖阻害活性は、インターフ
ェロン活性が存在するためであるとは言えない。ヒト肺
癌細胞の増殖阻害は、わずか３国際単位（ＩＵ）と低い
力価のインターフェロンで処理した後観察された。これ
に匹敵する腫瘍細胞増殖の阻害が、プールＢからのＴＩ
Ｆ３６０ｎｇ／ｍｌによる処理で観察された。しかし、
このＴＩＦ試料の１０００倍濃縮液を試験したときイン
ターフェロン活性は検出されなかった。
ディウムから得られた腫瘍増殖阻害活性は、インターフ
ェロン活性が存在するためであるとは言えない。ヒト肺
癌細胞の増殖阻害は、わずか３国際単位（ＩＵ）と低い
力価のインターフェロンで処理した後観察された。これ
に匹敵する腫瘍細胞増殖の阻害が、プールＢからのＴＩ
Ｆ３６０ｎｇ／ｍｌによる処理で観察された。しかし、
このＴＩＦ試料の１０００倍濃縮液を試験したときイン
ターフェロン活性は検出されなかった。
【００３２】正常ヒト線維芽細胞（ＨｕＦ）およびヒト
肺癌（Ａ５４９）をＴＩＦ−１の濃度を順次高めて処理
したとき、ヒト腫瘍細胞の濃度依存性阻害は認められた
が、正常ヒト線維芽細胞の濃度依存性刺激は認められな
かった。ヒト腫瘍細胞はＴＩＦ−１により阻害された
が、正常ヒト線維芽細胞は阻害されなかった。したがっ
てＴＩＦ−１はすべての細胞の増殖を阻害するものでは
ない。
肺癌（Ａ５４９）をＴＩＦ−１の濃度を順次高めて処理
したとき、ヒト腫瘍細胞の濃度依存性阻害は認められた
が、正常ヒト線維芽細胞の濃度依存性刺激は認められな
かった。ヒト腫瘍細胞はＴＩＦ−１により阻害された
が、正常ヒト線維芽細胞は阻害されなかった。したがっ
てＴＩＦ−１はすべての細胞の増殖を阻害するものでは
ない。
【００３３】ＴＩＦ−１は、第４図に示すようにμボン
ダパークＣ18カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより、ア
セトニトリル／０．０５％ＴＦＡを３段階の直線濃度勾
配をかけて、プールＢ（第１図）から精製された。溶出
は次のように行なった。まず０．０５％ＴＦＡ中のアセ
トニトリル０ないし２５％の直線濃度勾配１５分、つぎ
に０．０５％ＴＦＡ中のアセトニトリル２５ないし４５
％の直線濃度勾配８０分、さらに０．０５％ＴＦＡ中の
アセトニトリル４５ないし１００％の直線濃度勾配１５
分。ＴＩＦ活性は、２つの異なったアセトニトリル濃度
で溶出したところに観察された。すなわち２８−３３％
間のアセトニトリル濃度のところと、３８−４２％間の
アセトニトリル濃度のところである。これらのＴＩＦ活
性をＴＩＦ−１と標示した。３８％ないし４２％間のア
セトニトリル濃度で溶出するＴＩＦ活性は、プールＡか
らのいくつかの重複した分画をプールＢ（第１図）と混
ぜてＲＰ−ＨＰＬＣ（第４図）で精製したとき、観察さ
れた。バイオゲルＰ−１０カラムの斜線部分から集めた
分画を、ＲＰ−ＨＰＬＣにて２８％ないし３３％間で溶
出させると、ＴＩＦ−１活性をもつピーク２つのみが生
じた。
ダパークＣ18カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより、ア
セトニトリル／０．０５％ＴＦＡを３段階の直線濃度勾
配をかけて、プールＢ（第１図）から精製された。溶出
は次のように行なった。まず０．０５％ＴＦＡ中のアセ
トニトリル０ないし２５％の直線濃度勾配１５分、つぎ
に０．０５％ＴＦＡ中のアセトニトリル２５ないし４５
％の直線濃度勾配８０分、さらに０．０５％ＴＦＡ中の
アセトニトリル４５ないし１００％の直線濃度勾配１５
分。ＴＩＦ活性は、２つの異なったアセトニトリル濃度
で溶出したところに観察された。すなわち２８−３３％
間のアセトニトリル濃度のところと、３８−４２％間の
アセトニトリル濃度のところである。これらのＴＩＦ活
性をＴＩＦ−１と標示した。３８％ないし４２％間のア
セトニトリル濃度で溶出するＴＩＦ活性は、プールＡか
らのいくつかの重複した分画をプールＢ（第１図）と混
ぜてＲＰ−ＨＰＬＣ（第４図）で精製したとき、観察さ
れた。バイオゲルＰ−１０カラムの斜線部分から集めた
分画を、ＲＰ−ＨＰＬＣにて２８％ないし３３％間で溶
出させると、ＴＩＦ−１活性をもつピーク２つのみが生
じた。
【００３４】ヒト肺癌細胞の増殖はＴＩＦ−１により阻
害されるが、ヒト正常線維芽細胞はＴＩＦ−１により刺
激されることが観察された。したがって、ＴＩＦ−１を
使って、血清飢餓状態の静止期の３Ｔ３マウス細胞での
マイトジェン活性の試験を行なった。ＴＩＦ−１を含む
分画からのアリコートのＴＩＦ量は、観察されたマイト
ジェン活性量と一致していた（第４図）。ヒト腫瘍細胞
でのＴＩＦの阻害活性は、正常マウスおよび正常ヒト細
胞でのマイトジェン活性と一致していたが、この一致は
ＴＩＦ精製のすべての段階で観察された。したがって、
ＴＩＦ−１は標的細胞の性質に依存する様々な生物学的
特性を有している。
害されるが、ヒト正常線維芽細胞はＴＩＦ−１により刺
激されることが観察された。したがって、ＴＩＦ−１を
使って、血清飢餓状態の静止期の３Ｔ３マウス細胞での
マイトジェン活性の試験を行なった。ＴＩＦ−１を含む
分画からのアリコートのＴＩＦ量は、観察されたマイト
ジェン活性量と一致していた（第４図）。ヒト腫瘍細胞
でのＴＩＦの阻害活性は、正常マウスおよび正常ヒト細
胞でのマイトジェン活性と一致していたが、この一致は
ＴＩＦ精製のすべての段階で観察された。したがって、
ＴＩＦ−１は標的細胞の性質に依存する様々な生物学的
特性を有している。
【００３５】μボンダパークＣ18カラムを使って２８な
いし３３％間のアセトニトリルで溶出するＴＩＦ−１活
性は、さらにμボンダパークＣ18カラムを使ったＲＰ−
ＨＰＬＣにより精製した（第５図）。溶出は２−プロパ
ノールの直線濃度勾配をかけて次のように行なった。す
なわち、０．０５％ＴＦＣ中の２−プロパノール０．１
８％の直線濃度勾配１０分、０．０５％ＴＦＣ中の２−
プロパノール１８ないし２２％の直線濃度勾配１０分、
０．０５％ＴＦＣ中の２−プロパノール２２ないし２８
％の直線濃度勾配６０分、０．０５％ＴＦＣ中の２−プ
ロパノール２８ないし３０％の直線濃度勾配１０分、
０．０５％ＴＦＣ中の２−プロパノール３０ないし１０
０％の直線濃度勾配１５分。ＴＩＦ−１は、２−プロパ
ノール１８％ないし２２％間で溶出することが認められ
た。ＲＰ−ＨＰＬＣを使って２−プロパノールの直線濃
度勾配により精製したＴＩＦ−１は、２０６ｎｍにおけ
る吸光度から概算されるように一連のｎｇ／ｍｌの濃度
で著しいＴＩＦ活性を示した。
いし３３％間のアセトニトリルで溶出するＴＩＦ−１活
性は、さらにμボンダパークＣ18カラムを使ったＲＰ−
ＨＰＬＣにより精製した（第５図）。溶出は２−プロパ
ノールの直線濃度勾配をかけて次のように行なった。す
なわち、０．０５％ＴＦＣ中の２−プロパノール０．１
８％の直線濃度勾配１０分、０．０５％ＴＦＣ中の２−
プロパノール１８ないし２２％の直線濃度勾配１０分、
０．０５％ＴＦＣ中の２−プロパノール２２ないし２８
％の直線濃度勾配６０分、０．０５％ＴＦＣ中の２−プ
ロパノール２８ないし３０％の直線濃度勾配１０分、
０．０５％ＴＦＣ中の２−プロパノール３０ないし１０
０％の直線濃度勾配１５分。ＴＩＦ−１は、２−プロパ
ノール１８％ないし２２％間で溶出することが認められ
た。ＲＰ−ＨＰＬＣを使って２−プロパノールの直線濃
度勾配により精製したＴＩＦ−１は、２０６ｎｍにおけ
る吸光度から概算されるように一連のｎｇ／ｍｌの濃度
で著しいＴＩＦ活性を示した。
【００３６】ＴＩＦ−１の特性 ＴＩＦ−１の特性をいくつか第１表に示す。ＴＩＦ−１
はトリプシンやＤＴＴにより不活化される。このことか
ら、ＴＩＦ−１は活性に完全なジスルフィド結合を必要
とするタンパクてあるごとが示唆される。ＴＩＦ−１
は、５６℃３０分および１００℃３分の熱処理に対して
安定である。ヒト癌細胞の増殖阻害は、ＴＩＦ−１が１
時間以内にて除かれれば、９５％可逆的であった。腫瘍
細胞をＴＩＦ−１に長く晒すと、増殖の阻害度が対応し
て高まった。
はトリプシンやＤＴＴにより不活化される。このことか
ら、ＴＩＦ−１は活性に完全なジスルフィド結合を必要
とするタンパクてあるごとが示唆される。ＴＩＦ−１
は、５６℃３０分および１００℃３分の熱処理に対して
安定である。ヒト癌細胞の増殖阻害は、ＴＩＦ−１が１
時間以内にて除かれれば、９５％可逆的であった。腫瘍
細胞をＴＩＦ−１に長く晒すと、増殖の阻害度が対応し
て高まった。
【００３７】
【表１】 ヒトおよびヒト以外の様々な細胞系の増殖に対するＴＩ
Ｆ−１の阻害活性スペクトルを第２表に示す。正常ヒト
細胞の増殖がＴＩＦ−１により刺激されることは注目に
価する。これらの研究には以下の細胞が含まれる。すな
わち生体外で１０ないし２５回継代した正常ヒト線維芽
細胞株、ヒト線維芽細胞の初期継代細胞（組織移植片か
ら６回の継代）および正常ヒト上皮細胞の初期継代細胞
（組織移植片から３回の継代）。肺腺癌Ａ５４９および
乳癌ＭＣＦ７のような何種類かの細胞はＴＩＦ−１によ
る増殖阻害に対して高い感受性を示した。膀胱癌や黒色
腫のような他の腫瘍は増殖阻害に対して感受性が低かっ
た。正常アメリカミンク肺上皮細胞も感受性は非常に低
かった。
Ｆ−１の阻害活性スペクトルを第２表に示す。正常ヒト
細胞の増殖がＴＩＦ−１により刺激されることは注目に
価する。これらの研究には以下の細胞が含まれる。すな
わち生体外で１０ないし２５回継代した正常ヒト線維芽
細胞株、ヒト線維芽細胞の初期継代細胞（組織移植片か
ら６回の継代）および正常ヒト上皮細胞の初期継代細胞
（組織移植片から３回の継代）。肺腺癌Ａ５４９および
乳癌ＭＣＦ７のような何種類かの細胞はＴＩＦ−１によ
る増殖阻害に対して高い感受性を示した。膀胱癌や黒色
腫のような他の腫瘍は増殖阻害に対して感受性が低かっ
た。正常アメリカミンク肺上皮細胞も感受性は非常に低
かった。
【００３８】
【表２】 ヒト腫瘍細胞を組織培養で維持したとき、ＴＩＦ−１の
処理による増殖阻害への感受性に関する影響も同様に調
べた。ヒト腫瘍細胞を組織培養で長く維持すればするほ
ど、ＴＩＦ−１で処理したとき、それは増殖阻害に対し
てより強い抵抗性を示すようになった。ＴＩＦ−１の供
給源であるヒト横絞筋腫（Ａ６７３）および肺癌（Ａ５
４９）がこの効果を示した（第２表）。少ない回数継代
した細胞の増殖阻害に対する感受性は高いが、何回も継
代した細胞はより強い抵抗性を示した。ヒト腫瘍が１次
移殖片により類似していればしているほど、それはＴＩ
Ｆ−１による阻害に対してより強い反応性を示すと考え
られる。
処理による増殖阻害への感受性に関する影響も同様に調
べた。ヒト腫瘍細胞を組織培養で長く維持すればするほ
ど、ＴＩＦ−１で処理したとき、それは増殖阻害に対し
てより強い抵抗性を示すようになった。ＴＩＦ−１の供
給源であるヒト横絞筋腫（Ａ６７３）および肺癌（Ａ５
４９）がこの効果を示した（第２表）。少ない回数継代
した細胞の増殖阻害に対する感受性は高いが、何回も継
代した細胞はより強い抵抗性を示した。ヒト腫瘍が１次
移殖片により類似していればしているほど、それはＴＩ
Ｆ−１による阻害に対してより強い反応性を示すと考え
られる。
【００３９】第２表に掲げたヒト腫瘍細胞のすべては、
その増殖がＴＩＦ−１処理により阻害された。ウイルス
により形質転換した細胞に対するＴＩＦ−１の効果を第
３表に示す。第２表で見られたように、正常ヒト線維芽
細胞Ｗｉ ３８の増殖はＴＩＦ−１の処理により阻害さ
れず、むしろ増殖の刺激が観察された。しかしながら、
他方ＳＶ４０で形質転換した細胞の増殖はＴＩＦ−１に
より著しく阻害された。ウィルスで形質転換した細胞の
このような増殖阻害はラットの細胞でも同様に観察され
た。正常ラット腎細胞（ＮＲＫ）の増殖はＴＩＦ−１に
より阻害されなかった。しかし、ＴＩＦ−１で処理した
これらの細胞の増殖は若干刺激されることが観察され
た。ウィルスで形質転換したＮＲＫキルステン肉腫（Ｋ
ＮＲＫ）細胞の増殖もＴＩＦ−１により阻害された。Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡウィルスで形質転換した細胞の増殖は
ＴＩＦ−１により阻害されるが、一方その親である非形
質転換細胞は増殖が刺激された。
その増殖がＴＩＦ−１処理により阻害された。ウイルス
により形質転換した細胞に対するＴＩＦ−１の効果を第
３表に示す。第２表で見られたように、正常ヒト線維芽
細胞Ｗｉ ３８の増殖はＴＩＦ−１の処理により阻害さ
れず、むしろ増殖の刺激が観察された。しかしながら、
他方ＳＶ４０で形質転換した細胞の増殖はＴＩＦ−１に
より著しく阻害された。ウィルスで形質転換した細胞の
このような増殖阻害はラットの細胞でも同様に観察され
た。正常ラット腎細胞（ＮＲＫ）の増殖はＴＩＦ−１に
より阻害されなかった。しかし、ＴＩＦ−１で処理した
これらの細胞の増殖は若干刺激されることが観察され
た。ウィルスで形質転換したＮＲＫキルステン肉腫（Ｋ
ＮＲＫ）細胞の増殖もＴＩＦ−１により阻害された。Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡウィルスで形質転換した細胞の増殖は
ＴＩＦ−１により阻害されるが、一方その親である非形
質転換細胞は増殖が刺激された。
【００４０】
【表３】 ヒト腫瘍細胞由来のコンディションド・メディウムは、
複数の腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）と複数の腫瘍増殖阻害因
子（ＴＩＦ）の両方を含むことが観察された。ＴＩＦ、
ＴＧＦ（両方とも同一材料の腫瘍細胞コンディションド
・メディウム由来）およびＴＩＦとＴＧＦの混合物の効
果を、軟寒天中でヒト肺癌細胞（Ａ５４９）の増殖に関
して検討した。それを第６図に示す（前記の混合実験参
照）。穴ＡはＡ５４９細胞の未処理対照懸濁液で、これ
は軟寒天上でコロニーを形成した。穴ＢないしＤはＴＩ
Ｆ−１の様々な希釈液で処理した細胞の軟寒天懸濁液を
含む。穴ＣおよびＤは、３．０および０．６μｇ／ｍｌ
のＴＩＦ−ｌでそれぞれ処理したものであり、ＴＩＦ濃
度が低いほど腫瘍細胞の増殖は阻害されにくくなること
を示している。しかし、０．６μｇ／ｍｌのＴＩＦ−１
で処理したＡ５４９細胞の軟寒天懸濁液においても、な
お肉眼で認められる腫瘍細胞の増殖阻害が起きている。
下段の列の穴ＥないしＨは、軟寒天上でのＡ５４９細胞
の増殖に関するＴＧＦ（穴ＢないしＤにおいて用いられ
たＴＩＦを産生したと同じ細胞のコンディションド・メ
ディウムに由来）の効果を示している。穴Ｅは１２ｎｇ
当量／ｍｌのＴＧＦで処理したものである。Ｍｒ２０，
０００のＴＧＦは軟寒天中でヒト癌細胞の増殖を高め
た。穴ＦはＴＧＦ（１２ｎｇ当量／ｍｌ）とＴＩＦ−１
（１５μｇ／ｍｌ）とで処理したものである。穴Ｅにお
いて、腫瘍細胞の軟寒天中での増殖を高めた濃度のＴＧ
Ｆ存在下でさえも、ヒト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖は
ＴＩＦ−１により著しく阻害された。穴ＦないしＨにお
いて、ＴＩＦ濃度を下げると、軟寒天中でＴＧＦ処理腫
瘍細胞の増殖が高まった。様々な処理による軟寒天中の
ヒト腫瘍細胞のコロニーの大きさを第４表に示す。未処
理ヒト癌細胞は、軟寒天中で直径０．３ｍｍのコロニー
を形成した。１２ｎｇ当量／ｍｌのＴＧＦで処理したヒ
ト癌細胞は、軟寒天中で直径０．５ｍｍのより大きなコ
ロニーを形成した。ＴＩＦで処理した腫瘍細胞は、ＴＩ
Ｆ濃度に応じて軟寒天中でより小さな大きさのコロニー
を形成した。１２ｎｇ当量／ｍｌのＴＧＦと３μｇ／ｍ
ｌのＴＩＦ−１の混合物で処理した腫瘍細胞は、軟寒天
中でＴＧＦまたはＴＩＦによって処理されなかった対照
の腫瘍細胞と同じ大きさのコロニーを形成した。
複数の腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）と複数の腫瘍増殖阻害因
子（ＴＩＦ）の両方を含むことが観察された。ＴＩＦ、
ＴＧＦ（両方とも同一材料の腫瘍細胞コンディションド
・メディウム由来）およびＴＩＦとＴＧＦの混合物の効
果を、軟寒天中でヒト肺癌細胞（Ａ５４９）の増殖に関
して検討した。それを第６図に示す（前記の混合実験参
照）。穴ＡはＡ５４９細胞の未処理対照懸濁液で、これ
は軟寒天上でコロニーを形成した。穴ＢないしＤはＴＩ
Ｆ−１の様々な希釈液で処理した細胞の軟寒天懸濁液を
含む。穴ＣおよびＤは、３．０および０．６μｇ／ｍｌ
のＴＩＦ−ｌでそれぞれ処理したものであり、ＴＩＦ濃
度が低いほど腫瘍細胞の増殖は阻害されにくくなること
を示している。しかし、０．６μｇ／ｍｌのＴＩＦ−１
で処理したＡ５４９細胞の軟寒天懸濁液においても、な
お肉眼で認められる腫瘍細胞の増殖阻害が起きている。
下段の列の穴ＥないしＨは、軟寒天上でのＡ５４９細胞
の増殖に関するＴＧＦ（穴ＢないしＤにおいて用いられ
たＴＩＦを産生したと同じ細胞のコンディションド・メ
ディウムに由来）の効果を示している。穴Ｅは１２ｎｇ
当量／ｍｌのＴＧＦで処理したものである。Ｍｒ２０，
０００のＴＧＦは軟寒天中でヒト癌細胞の増殖を高め
た。穴ＦはＴＧＦ（１２ｎｇ当量／ｍｌ）とＴＩＦ−１
（１５μｇ／ｍｌ）とで処理したものである。穴Ｅにお
いて、腫瘍細胞の軟寒天中での増殖を高めた濃度のＴＧ
Ｆ存在下でさえも、ヒト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖は
ＴＩＦ−１により著しく阻害された。穴ＦないしＨにお
いて、ＴＩＦ濃度を下げると、軟寒天中でＴＧＦ処理腫
瘍細胞の増殖が高まった。様々な処理による軟寒天中の
ヒト腫瘍細胞のコロニーの大きさを第４表に示す。未処
理ヒト癌細胞は、軟寒天中で直径０．３ｍｍのコロニー
を形成した。１２ｎｇ当量／ｍｌのＴＧＦで処理したヒ
ト癌細胞は、軟寒天中で直径０．５ｍｍのより大きなコ
ロニーを形成した。ＴＩＦで処理した腫瘍細胞は、ＴＩ
Ｆ濃度に応じて軟寒天中でより小さな大きさのコロニー
を形成した。１２ｎｇ当量／ｍｌのＴＧＦと３μｇ／ｍ
ｌのＴＩＦ−１の混合物で処理した腫瘍細胞は、軟寒天
中でＴＧＦまたはＴＩＦによって処理されなかった対照
の腫瘍細胞と同じ大きさのコロニーを形成した。
【００４１】
【表４】 これらの結果から次のことが結論づけられる。
【００４２】（１）ＴＩＦは軟寒天中での腫瘍細胞の足
場非依存性増殖を阻害する。（２）ＴＧＦは軟寒天中で
の腫瘍細胞の足場非依存性増殖を亢進させる。（３）Ｔ
ＩＦ−１はＥＧＦ受容体への結合に対して拮抗しない
が、それは軟寒天中での腫瘍細胞の足場非依存性増殖に
関するＴＧＦの効果に対して拮抗的である。同様の混合
実験でＴＧＦに換えてＥＧＦを用いた場合にも、同様の
結果が観察された。
場非依存性増殖を阻害する。（２）ＴＧＦは軟寒天中で
の腫瘍細胞の足場非依存性増殖を亢進させる。（３）Ｔ
ＩＦ−１はＥＧＦ受容体への結合に対して拮抗しない
が、それは軟寒天中での腫瘍細胞の足場非依存性増殖に
関するＴＧＦの効果に対して拮抗的である。同様の混合
実験でＴＧＦに換えてＥＧＦを用いた場合にも、同様の
結果が観察された。
【００４３】混合実験から得られた結果（第４表）によ
れば、生体外の軟寒天検定においてＴＧＦはＴＩＦ−１
の効果を中和し得るということが示された。第１図にお
いて、ＴＧＦ活性を含むプールＡにはＴＩＦ活性は検出
されなかった。Ｍｒ１８，０００ないし２０，０００の
ＴＧＦを含むプールＡをＲＰ−ＨＰＬＣで精製した場
合、ＴＩＦ活性はＴＧＦ活性と分離し、３８ないし４２
％の間のアセトニトリルで溶出することが観察された。
プールＡのＴＧＦはＭｒｌ８，０００ないし２０，００
０のＴＩＦの存在を明らかに遮蔽していた。
れば、生体外の軟寒天検定においてＴＧＦはＴＩＦ−１
の効果を中和し得るということが示された。第１図にお
いて、ＴＧＦ活性を含むプールＡにはＴＩＦ活性は検出
されなかった。Ｍｒ１８，０００ないし２０，０００の
ＴＧＦを含むプールＡをＲＰ−ＨＰＬＣで精製した場
合、ＴＩＦ活性はＴＧＦ活性と分離し、３８ないし４２
％の間のアセトニトリルで溶出することが観察された。
プールＡのＴＧＦはＭｒｌ８，０００ないし２０，００
０のＴＩＦの存在を明らかに遮蔽していた。
【００４４】第２表に示された如く、ＴＩＦは正常細胞
の増殖を刺激する。したがって、ＴＩＦは、マイトジェ
ンとなり得るし、血清飢餓状態のマウス細胞のような静
止期の細胞にわいてＥＧＦ受容体を介した相互作用によ
りＤＮＡ合成を刺激し得るという可能性が研究の対象と
なった。ＥＧＦとＴＩＦ−１の双方には、マウス細胞系
ＮＩＨクローン７に対して実質的にマイトジェン刺激能
があることが分った。ＥＧＦ受容体が機能しないマウス
細胞系ＮＲ６／６細胞を用いた同様な実験によれば、Ｅ
ＧＦにはマイトジェン活性がないが、ＴＩＦ−１はマイ
トジェンとして作用することが示された。したがって、
増殖刺激性およびマイトジェン活性は、ＥＧＦ受容体を
介して機能するのではないと考えられる。
の増殖を刺激する。したがって、ＴＩＦは、マイトジェ
ンとなり得るし、血清飢餓状態のマウス細胞のような静
止期の細胞にわいてＥＧＦ受容体を介した相互作用によ
りＤＮＡ合成を刺激し得るという可能性が研究の対象と
なった。ＥＧＦとＴＩＦ−１の双方には、マウス細胞系
ＮＩＨクローン７に対して実質的にマイトジェン刺激能
があることが分った。ＥＧＦ受容体が機能しないマウス
細胞系ＮＲ６／６細胞を用いた同様な実験によれば、Ｅ
ＧＦにはマイトジェン活性がないが、ＴＩＦ−１はマイ
トジェンとして作用することが示された。したがって、
増殖刺激性およびマイトジェン活性は、ＥＧＦ受容体を
介して機能するのではないと考えられる。
【００４５】要約すると、上記の事実から、何種類かの
腫瘍増殖阻害因子（ＴＩＦ）はヒト腫瘍細胞系Ａ６７３
から産生され、バイオ・ゲルＰ−１００ゲル濾過クロマ
トグラフィーから観察されるところによれば、分子量が
２８，０００、１８，０００ないし２２，０００、１
０，０００ないし１６，０００および５，０００ないし
ｌ０，０００であることが考察し得る。ＴＩＦ−１と称
されるＭｒｌ０，０００ないし１６，０００のＴＩＦは
部分的に精製されており、その特性が決定された。ＴＩ
Ｆ−１は酸および熱に安定なタンパクであることがわか
った。またトリプシンおよびＤＴＴにより失活した。そ
れは、様々な段階のヒト腫瘍細胞、ウイルスにより形質
転換されたヒトおよびラット細胞並びに正常アメリカミ
ンク肺上皮細胞といった幅広い範囲の細胞の増殖を阻害
した。ＴＩＦ−１は試験に用いられた様々な正常ヒト線
維芽細胞または上皮細胞のいずれの増殖をも阻害しなか
った。事実、ＴＩＦ−１は様々な正常ヒト線維芽および
上皮細胞の増殖を刺激した。
腫瘍増殖阻害因子（ＴＩＦ）はヒト腫瘍細胞系Ａ６７３
から産生され、バイオ・ゲルＰ−１００ゲル濾過クロマ
トグラフィーから観察されるところによれば、分子量が
２８，０００、１８，０００ないし２２，０００、１
０，０００ないし１６，０００および５，０００ないし
ｌ０，０００であることが考察し得る。ＴＩＦ−１と称
されるＭｒｌ０，０００ないし１６，０００のＴＩＦは
部分的に精製されており、その特性が決定された。ＴＩ
Ｆ−１は酸および熱に安定なタンパクであることがわか
った。またトリプシンおよびＤＴＴにより失活した。そ
れは、様々な段階のヒト腫瘍細胞、ウイルスにより形質
転換されたヒトおよびラット細胞並びに正常アメリカミ
ンク肺上皮細胞といった幅広い範囲の細胞の増殖を阻害
した。ＴＩＦ−１は試験に用いられた様々な正常ヒト線
維芽細胞または上皮細胞のいずれの増殖をも阻害しなか
った。事実、ＴＩＦ−１は様々な正常ヒト線維芽および
上皮細胞の増殖を刺激した。
【００４６】混合実験（第６図および第４表）によれ
ば、どのように腫瘍細胞がＴＩＦとＴＧＦ双方を産生し
得るか、そしてさらに癌の表現型を提示するかというこ
とが示唆される。ＴＧＦよりもＴＩＦをより多く産生す
る腫瘍細胞は、良性となり得、または退行し得るが、一
方より進行性および転移性である腫瘍細胞はＴＩＦより
もＴＧＦをより多く産生し得る。様々なＴＧＦおよびＴ
ＩＦの異常な産生は、結果として腫瘍を発生し得る。し
たがって産生されるＴＩＦとＴＧＦの比がわかれば、そ
れが腫瘍細胞増殖程度の重要な決定要素として役立ち得
るであろう。ＴＩＦの体外からの投与は、正常細胞に影
響を与えずに腫瘍細胞の増殖を調節する非常に強力な手
段となり得る。
ば、どのように腫瘍細胞がＴＩＦとＴＧＦ双方を産生し
得るか、そしてさらに癌の表現型を提示するかというこ
とが示唆される。ＴＧＦよりもＴＩＦをより多く産生す
る腫瘍細胞は、良性となり得、または退行し得るが、一
方より進行性および転移性である腫瘍細胞はＴＩＦより
もＴＧＦをより多く産生し得る。様々なＴＧＦおよびＴ
ＩＦの異常な産生は、結果として腫瘍を発生し得る。し
たがって産生されるＴＩＦとＴＧＦの比がわかれば、そ
れが腫瘍細胞増殖程度の重要な決定要素として役立ち得
るであろう。ＴＩＦの体外からの投与は、正常細胞に影
響を与えずに腫瘍細胞の増殖を調節する非常に強力な手
段となり得る。
【００４７】ＴＩＦ−２の調製 培養細胞 培養細胞は、上記の如く１０％ＦＢＳ（ギブコ）を添加
したダルベッコーの改良型イーグル培地（ＤＭＥＭ）の
入った７５ｃｍ2 組織培養フラスコ（ファルコン、３０
２４）中で３７℃にて維持された。
したダルベッコーの改良型イーグル培地（ＤＭＥＭ）の
入った７５ｃｍ2 組織培養フラスコ（ファルコン、３０
２４）中で３７℃にて維持された。
【００４８】ＴＩＦおよびＴＧＦの原料 ヒト横絞筋腫細胞系Ａ６７３から得た血清を含まないコ
ンディションド・メディウムを、上記のごとく処理し、
１Ｍ酢酸中でバイオゲルＰ−１００によりクロマトグラ
フィーを行なった。
ンディションド・メディウムを、上記のごとく処理し、
１Ｍ酢酸中でバイオゲルＰ−１００によりクロマトグラ
フィーを行なった。
【００４９】ＣＭ−セルロースによるクロマトグラフィ
ー 上記の方法によりバイオゲルＰ−１００カラムの何回か
の操作から得られた何本かのＴＧＦ活性のある分画を集
め、凍結乾燥した。そして１Ｍ酢酸５ｍｌ中で再調製
し、５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）に対して４
℃で一晩透析した。この試料を２２℃にて１７５，００
０ｇで３０分間遠心し、カルボキシメチル−セルロース
（ワットマン、ＣＭ−２３）のカチオン交換カラムにか
けた。溶出は、２つの容器から成る定レベル装置〔第１
番目の容器には開始緩衝液（５ｍＭ酢酸アンモニウム、
ｐＨ４．５）２００ｍｌおよび第２番目の容器には限定
緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．８）を含
む）からポンプで液を引出し（２２℃で流出率８０ｍｌ
／時間）直線濃度勾配をつけて行なった。複数の分画の
アリコートを１Ｍ酢酸０．５ｍｌを添加して滅菌し、試
験前に凍結乾燥した。
ー 上記の方法によりバイオゲルＰ−１００カラムの何回か
の操作から得られた何本かのＴＧＦ活性のある分画を集
め、凍結乾燥した。そして１Ｍ酢酸５ｍｌ中で再調製
し、５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）に対して４
℃で一晩透析した。この試料を２２℃にて１７５，００
０ｇで３０分間遠心し、カルボキシメチル−セルロース
（ワットマン、ＣＭ−２３）のカチオン交換カラムにか
けた。溶出は、２つの容器から成る定レベル装置〔第１
番目の容器には開始緩衝液（５ｍＭ酢酸アンモニウム、
ｐＨ４．５）２００ｍｌおよび第２番目の容器には限定
緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．８）を含
む）からポンプで液を引出し（２２℃で流出率８０ｍｌ
／時間）直線濃度勾配をつけて行なった。複数の分画の
アリコートを１Ｍ酢酸０．５ｍｌを添加して滅菌し、試
験前に凍結乾燥した。
【００５０】逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−
ＨＰＬＣ） ＣＭ−セルロースカラムから得られたＴＩＦ−２の生物
学的活性部分を集め、凍結乾燥した。そして０．０５％
アセトニトリル１ｍｌ中に再懸濁し、カラムにかける前
に１０００ｇで５分間遠心し、不溶物質を取除いた。上
清をウォーターズμボンドパークＣ18カラム（０．３９
×３０ｃｍ）にかけた。ウォーターズ濃度勾配液体クロ
マトグラフィー装置を利用し、カラムからの溶出液を波
長可変ＵＶ検出装置で２１４ｎｍにて監視した。各分画
からのアリコートを試験前に凍結乾燥した。
ＨＰＬＣ） ＣＭ−セルロースカラムから得られたＴＩＦ−２の生物
学的活性部分を集め、凍結乾燥した。そして０．０５％
アセトニトリル１ｍｌ中に再懸濁し、カラムにかける前
に１０００ｇで５分間遠心し、不溶物質を取除いた。上
清をウォーターズμボンドパークＣ18カラム（０．３９
×３０ｃｍ）にかけた。ウォーターズ濃度勾配液体クロ
マトグラフィー装置を利用し、カラムからの溶出液を波
長可変ＵＶ検出装置で２１４ｎｍにて監視した。各分画
からのアリコートを試験前に凍結乾燥した。
【００５１】軟寒天検定 Ａ３７５Ａｇ５細胞ｌ×１０4 の懸濁液を凍結乾燥した
ＴＩＦ−２および０．３４％寒天（ディフコ、ノーブ
ル）と混合し、１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭで合計溶
量０．９４ｍｌとした。それをただちに３５ｍｍ組織培
養シャーレの中の０．５％寒天基層の上にピペット播種
した。細胞を５％ＣＯ2 ／９５％空気の加湿した雰囲気
中にて３７℃で培養した。８日後顕微鏡写真を撮った。
ＴＩＦ−２および０．３４％寒天（ディフコ、ノーブ
ル）と混合し、１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭで合計溶
量０．９４ｍｌとした。それをただちに３５ｍｍ組織培
養シャーレの中の０．５％寒天基層の上にピペット播種
した。細胞を５％ＣＯ2 ／９５％空気の加湿した雰囲気
中にて３７℃で培養した。８日後顕微鏡写真を撮った。
【００５２】ＴＩＦ検定 試験細胞を二次培養し、ＴＩＦ−２で処理して、上記の
如く 125ＩＵｄＲの取込みを調べた。阻害と刺激を対照
に対するパーセントで表わした。
如く 125ＩＵｄＲの取込みを調べた。阻害と刺激を対照
に対するパーセントで表わした。
【００５３】マイトジェン活性検定 ＮＩＨクローン７およびＨｕＦ細胞を、９６穴組織培養
板（ヌンク１６７００８）中の各穴あたり細胞密度１×
１０4 で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに二次培養した。
３７℃で２４時間培養の後、培地をＦＢＳ０．１％を含
むワイマウス培地と交換することにより７２時間血清飢
餓状態に維持した。細胞をＴＩＦ−２で処理し、上記の
如く 125ＩＵｄＲ取込みを調べた。
板（ヌンク１６７００８）中の各穴あたり細胞密度１×
１０4 で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに二次培養した。
３７℃で２４時間培養の後、培地をＦＢＳ０．１％を含
むワイマウス培地と交換することにより７２時間血清飢
餓状態に維持した。細胞をＴＩＦ−２で処理し、上記の
如く 125ＩＵｄＲ取込みを調べた。
【００５４】ＴＧＦ検定 ＴＧＦ活性は、上記の如く 125ＩＵｄＲ放射受容体結合
検定によって拮抗能を調べることにより決定した。
検定によって拮抗能を調べることにより決定した。
【００５５】実施例２ Ａ６７３細胞から得た血清を含まないコンディションド
・メディウム３０ｌを濃縮し、凍結乾燥しそして２８０
ｍｇのタンパクを１Ｍ酢酸で抽出した。これを１Ｍ酢酸
で平衡化したバイオ−ゲルＰ−１００カラムにかけた。
２本置きの各分画からアリコートを取り、ＴＧＦおよび
ＴＩＦ活性を測定した。第７図に示す如く、腫瘍増殖阻
害活性の主要ピークは分子量１０，０００ないし１６，
０００領域（プールＢ）および分子量５，０００ないし
１０，０００（プールＣ）の領域に見出された。分子量
１８，０００ないし２２，０００の領域（プールＡ）に
は高い阻害活性は認められなかったが、主なＴＧＦ活性
を含んでいた。
・メディウム３０ｌを濃縮し、凍結乾燥しそして２８０
ｍｇのタンパクを１Ｍ酢酸で抽出した。これを１Ｍ酢酸
で平衡化したバイオ−ゲルＰ−１００カラムにかけた。
２本置きの各分画からアリコートを取り、ＴＧＦおよび
ＴＩＦ活性を測定した。第７図に示す如く、腫瘍増殖阻
害活性の主要ピークは分子量１０，０００ないし１６，
０００領域（プールＢ）および分子量５，０００ないし
１０，０００（プールＣ）の領域に見出された。分子量
１８，０００ないし２２，０００の領域（プールＡ）に
は高い阻害活性は認められなかったが、主なＴＧＦ活性
を含んでいた。
【００５６】何回かのバイオ−ゲルＰ−１００カラムか
ら得たＴＧＦ分画（プールＡ）を、さらにＣＭ−セルロ
ースクロマトグラフィーにより精製した。この材料は元
をただせば２２７ｌのコンディションド・メディウムに
由来した。これらを集めてＣＭセルロースカラム（第８
図）にかけた。合計タンパク量は８５ｍｇであった。１
本おきの分画からのアリコートのＴＧＦ活性およびＴＩ
Ｆ活性を測定した。このカラムの溶出模様によれば、阻
害活性の大きなピークはＴＧＦ活性ピークと分離し得た
ので、恐らくＴＧＦはＴＩＦ活性を遮蔽していたことが
示唆される。ＴＩＦ活性のピークとして表わされる斜線
部分を集め、凍結乾燥し、アセトニトリルの直線濃度勾
配をかけて逆相ウオーターズμボンドパークＣ18カラム
による再クロマトグラフィーを行なった。次のような溶
出手順を踏んだ。すなわち、まず０．０５％トリフルオ
ロ酢酸中のアセトニトリル０ないし２５％の直線濃度勾
配１５分、続いて０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセ
トニトリル２５ないし４５５の直線濃度勾配８０分、さ
らに続けて０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセトニト
リル４５ないし１００％の直線濃度勾配１５分。これを
第９図に示す。各分画を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性を測定
した。ＴＩＦ活性を含む主要ピークはアセトニトリル３
８ないし４２％の間で溶出した。ＴＩＦ−１はアセトニ
トリル２８ないし３３％の間で溶出することが前に確め
られている。ＴＩＦ−２をプロパノールの直線濃度勾配
によるＨＰＬＣでさらに精製し得た。ＴＩＦ−１は２−
プロパノール１９ないし２１％の間で溶出することが確
められているが、一方ＴＩＦ−２は２−プロパノール２
９ないし３ｌ％の間で溶出した。
ら得たＴＧＦ分画（プールＡ）を、さらにＣＭ−セルロ
ースクロマトグラフィーにより精製した。この材料は元
をただせば２２７ｌのコンディションド・メディウムに
由来した。これらを集めてＣＭセルロースカラム（第８
図）にかけた。合計タンパク量は８５ｍｇであった。１
本おきの分画からのアリコートのＴＧＦ活性およびＴＩ
Ｆ活性を測定した。このカラムの溶出模様によれば、阻
害活性の大きなピークはＴＧＦ活性ピークと分離し得た
ので、恐らくＴＧＦはＴＩＦ活性を遮蔽していたことが
示唆される。ＴＩＦ活性のピークとして表わされる斜線
部分を集め、凍結乾燥し、アセトニトリルの直線濃度勾
配をかけて逆相ウオーターズμボンドパークＣ18カラム
による再クロマトグラフィーを行なった。次のような溶
出手順を踏んだ。すなわち、まず０．０５％トリフルオ
ロ酢酸中のアセトニトリル０ないし２５％の直線濃度勾
配１５分、続いて０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセ
トニトリル２５ないし４５５の直線濃度勾配８０分、さ
らに続けて０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセトニト
リル４５ないし１００％の直線濃度勾配１５分。これを
第９図に示す。各分画を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性を測定
した。ＴＩＦ活性を含む主要ピークはアセトニトリル３
８ないし４２％の間で溶出した。ＴＩＦ−１はアセトニ
トリル２８ないし３３％の間で溶出することが前に確め
られている。ＴＩＦ−２をプロパノールの直線濃度勾配
によるＨＰＬＣでさらに精製し得た。ＴＩＦ−１は２−
プロパノール１９ないし２１％の間で溶出することが確
められているが、一方ＴＩＦ−２は２−プロパノール２
９ないし３ｌ％の間で溶出した。
【００５７】ＴＩＦ−２の特性 Ａ３７５Ａｇ ５細胞をＴＩＦ−２（６４μｇ／ｍｌ）
で処理し、８日後に顕微鏡写真を撮った。第１０図に示
すごとく、未処理細胞は一般に概略１００ないし２００
の細胞を含む直径０．５ないし１ｍｍの範囲の大きさま
で増殖した。これらの細胞を、ＣＭ−セルロースで精製
したＴＩＦ−２で処理した場合、コロニーの大きさは著
しく減少した。処理後最初の数日で小さなコロニーが認
められたが、典型的には３週間後でさえも増殖の回復は
認められなかった。細胞は生きていたので、ＴＩＦ−２
には細胞毒性はなかった。ＣＭ−セルロースクロマトグ
ラフィーからＨＰＬＣへの精製レベルは、第５表に示さ
れた如く１２５倍であった。各精製段階からの物質のＴ
ＩＦ活性を測定した。 125ＩＵｄＲの取込みを、Ａ５４
９細胞と正常ヒト線維芽細胞系ＨｕＦとを用いて測定し
た。両試料においてＡ５４９細胞は阻害を、ＨｕＦ細胞
は刺激を受けた。ＴＩＦ−ｌは正常線維芽細胞の増殖を
刺激し、マイトジェンとしての作用も発揮したので、Ｔ
ＩＦ−２を正常マウス細胞（ＮＩＨクローン７）および
ＨｕＦ細胞を用いてマイトジェン検定にかけた。血清飢
餓状態の細胞に試験する因子を添加し、同時に２４時間
125ＩＵｄＲを加えて検定した。５４μｇ／ｍｌのＴＩ
Ｆ−２処理による細胞は、１０％ＦＢＳを含む細胞より
もかなり高レベルの 125ＩＵｄＲを取込んだ。ヒト線維
芽細胞で同一濃度のＴＩＦ−２処理を行なった場合、１
０％ＦＢＳを含む場合と同じような取込みレベルを示し
た。ＴＩＦ−２はマウスＮＩＨクローン７細胞において
５００ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度でさえも強力なマイトジ
ェンとなりうることが判明した。他方ＴＩＦ−１のマイ
トジェン活性は２０ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度で誘起され
得た。
で処理し、８日後に顕微鏡写真を撮った。第１０図に示
すごとく、未処理細胞は一般に概略１００ないし２００
の細胞を含む直径０．５ないし１ｍｍの範囲の大きさま
で増殖した。これらの細胞を、ＣＭ−セルロースで精製
したＴＩＦ−２で処理した場合、コロニーの大きさは著
しく減少した。処理後最初の数日で小さなコロニーが認
められたが、典型的には３週間後でさえも増殖の回復は
認められなかった。細胞は生きていたので、ＴＩＦ−２
には細胞毒性はなかった。ＣＭ−セルロースクロマトグ
ラフィーからＨＰＬＣへの精製レベルは、第５表に示さ
れた如く１２５倍であった。各精製段階からの物質のＴ
ＩＦ活性を測定した。 125ＩＵｄＲの取込みを、Ａ５４
９細胞と正常ヒト線維芽細胞系ＨｕＦとを用いて測定し
た。両試料においてＡ５４９細胞は阻害を、ＨｕＦ細胞
は刺激を受けた。ＴＩＦ−ｌは正常線維芽細胞の増殖を
刺激し、マイトジェンとしての作用も発揮したので、Ｔ
ＩＦ−２を正常マウス細胞（ＮＩＨクローン７）および
ＨｕＦ細胞を用いてマイトジェン検定にかけた。血清飢
餓状態の細胞に試験する因子を添加し、同時に２４時間
125ＩＵｄＲを加えて検定した。５４μｇ／ｍｌのＴＩ
Ｆ−２処理による細胞は、１０％ＦＢＳを含む細胞より
もかなり高レベルの 125ＩＵｄＲを取込んだ。ヒト線維
芽細胞で同一濃度のＴＩＦ−２処理を行なった場合、１
０％ＦＢＳを含む場合と同じような取込みレベルを示し
た。ＴＩＦ−２はマウスＮＩＨクローン７細胞において
５００ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度でさえも強力なマイトジ
ェンとなりうることが判明した。他方ＴＩＦ−１のマイ
トジェン活性は２０ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度で誘起され
得た。
【００５８】
【表５】 ＴＩＦのインターフェロン活性を、メロイ・ラバラトリ
ーズ社（ヴァージニア州、スプリングフィールド）で行
なわれている抗ウイルスインターフェロン検定法に基づ
いて測定した。そして何種かの白血球インターフェロン
（ＰＩＦロットＰ−３２ｌ）を、Ａ５４９細胞を使った
本発明の腫瘍増殖阻害検定法により試験した。白血球イ
ンタフェロンは、ＴＩＦ検定（２５％阻害）において３
ＩＵ／ｍｌで検出され得た。３ＩＵ／ｍｌのインターフ
ェロンと同様の阻害を示す１００倍濃縮のＴＩＦ−２を
抗ウイルス検定で試験したが結果は陰性であった。これ
により、ＴＩＦ−２には抗ウイルス活性がなく、したが
ってそれはインターフェロンではないことが分かった。
ーズ社（ヴァージニア州、スプリングフィールド）で行
なわれている抗ウイルスインターフェロン検定法に基づ
いて測定した。そして何種かの白血球インターフェロン
（ＰＩＦロットＰ−３２ｌ）を、Ａ５４９細胞を使った
本発明の腫瘍増殖阻害検定法により試験した。白血球イ
ンタフェロンは、ＴＩＦ検定（２５％阻害）において３
ＩＵ／ｍｌで検出され得た。３ＩＵ／ｍｌのインターフ
ェロンと同様の阻害を示す１００倍濃縮のＴＩＦ−２を
抗ウイルス検定で試験したが結果は陰性であった。これ
により、ＴＩＦ−２には抗ウイルス活性がなく、したが
ってそれはインターフェロンではないことが分かった。
【００５９】ＴＩＦ−１のところで記載したように、Ｈ
ＰＬＣで精製したＴＩＦ−２のトリプシン感受性を調べ
た。それはトリプシン感受性を示さなかった。ＴＩＦ−
２（１３μｇ／ｍｌ、ＨＰＬＣで精製）のアリコートを
５６℃３０分間、別のアリコートを１００℃３分熱処理
した。対照は室温で放置した。それぞれを凍結乾燥し、
それぞれの腫瘍増殖阻害活性を、試験細胞としてＡ５４
９を用いて調べた。活性は５０℃では安定であったが、
１００℃では不安定で阻害度が５３％から３５％におち
た。
ＰＬＣで精製したＴＩＦ−２のトリプシン感受性を調べ
た。それはトリプシン感受性を示さなかった。ＴＩＦ−
２（１３μｇ／ｍｌ、ＨＰＬＣで精製）のアリコートを
５６℃３０分間、別のアリコートを１００℃３分熱処理
した。対照は室温で放置した。それぞれを凍結乾燥し、
それぞれの腫瘍増殖阻害活性を、試験細胞としてＡ５４
９を用いて調べた。活性は５０℃では安定であったが、
１００℃では不安定で阻害度が５３％から３５％におち
た。
【００６０】様々な正常および腫瘍細胞を使って、 125
ＩＵｄＲの取込みに関するＴＩＦ−２の影響を試験し
た。試験したヒト線維芽細胞のすべては刺激された。更
に継代回数の少ないヒト胎児腎細胞系も同様に刺激され
た。上皮細胞のみを、この培養中に認めることができ
た。これに反して試験したすべてのヒト腫瘍細胞では様
々た阻害が認められた。Ａ５４９およびＡ６７３に関し
て継代回数の多少により阻害程度の差が見られるよう
に、組織培養における継代の回数がいくらか阻害程度の
変化の原因となっているのかもしれない。腫瘍が初期培
養に近いほど、ＴＩＦ−２による阻害に対しての感受性
がより強い。乳癌細胞系、ＭＣＦ−７およびＡ５４９は
よく試験細胞として用いられるが、ＴＩＦ−２に対して
最も強い感受性を有することが観察された。正常アメリ
カミンク肺細胞系はＴＩＦ−１によりきわめて阻害され
やすいことが示されている。反対にＴＩＦ−２はアメリ
カミンク細胞にはほとんどあるいは全く効果を発揮しな
かった。
ＩＵｄＲの取込みに関するＴＩＦ−２の影響を試験し
た。試験したヒト線維芽細胞のすべては刺激された。更
に継代回数の少ないヒト胎児腎細胞系も同様に刺激され
た。上皮細胞のみを、この培養中に認めることができ
た。これに反して試験したすべてのヒト腫瘍細胞では様
々た阻害が認められた。Ａ５４９およびＡ６７３に関し
て継代回数の多少により阻害程度の差が見られるよう
に、組織培養における継代の回数がいくらか阻害程度の
変化の原因となっているのかもしれない。腫瘍が初期培
養に近いほど、ＴＩＦ−２による阻害に対しての感受性
がより強い。乳癌細胞系、ＭＣＦ−７およびＡ５４９は
よく試験細胞として用いられるが、ＴＩＦ−２に対して
最も強い感受性を有することが観察された。正常アメリ
カミンク肺細胞系はＴＩＦ−１によりきわめて阻害され
やすいことが示されている。反対にＴＩＦ−２はアメリ
カミンク細胞にはほとんどあるいは全く効果を発揮しな
かった。
【００６１】
【表６】 ＴＩＦ−２に対する感受性に関してＳＶ４０ウイルス形
質転換の効果を検討した。ヒト胎児肺細胞Ｗｉ−３８
（ＣＣＬ７５）およびそれのＳＶ４０により形質転換さ
れた細胞（ＣＣＬ７５．１）の両方についてＴＩＦ−２
処理後、 125ＩＵｄＲの取込みを調べた。Ｗｉ−３８細
胞は刺激（１１％）され、Ｗｉ−３８のＳＶ４０形質転
換型細胞は阻害（２４％）された。同じ効果がＴＩＦ−
１についても見られ、それによれば形質転換された表現
型が、ＴＩＦによる阻害に要求されるかもしれないとい
うことが強く支持される。ヒト黒色腫クローン系Ａ３７
５Ａｇ ５およびＡ３７５Ａｇ ５のＴＩＦ−１耐性変
異型細胞系（Ａ３７５Ａｇ５−ＩＲと称す）を用いて、
阻害因子とインターフェロンについての比較を行なった
（第７表）。この細胞系を得るために２４穴板に単層で
生育しているＡ３７５Ａｇ ５細胞（１×１０4 ）をＴ
ＩＦ−１の活性分画で処理した。その分画はＡ６７３の
コンディションド・メディウムをバイオ−ゲルＰ−１０
０カラムにかけて得られたものである。細胞を一度処理
したが因子は細胞中で１０日間残存していた。処理した
細胞は体積を増し、より丸くなり、もはや培養板に接着
しなくなった。これら処理細胞をファルコンの組織培養
フラスコ（３０１３）に移した。細胞は結局定着し、単
層状態で増殖した。単層で数回継代すると、この細胞系
は親細胞系Ａ３７５Ａｇ ５と同じくらい速く増殖し
た。両細胞系を軟寒天中に播種すると、Ａ３７５Ａｇ
５は軟寒天中で増殖し直径０．５ないし１．０ｍｍ範囲
のコロニーを形成した。ところがＡ３７５Ａｇ ５−Ｉ
Ｒ変異細胞系は軟寒天中でほとんど増殖せず、コロニー
も３ないし５個しか生じなかった。これらの両細胞系
を、腫瘍増殖阻害検定法により試験した。第７表で明ら
かなように、親細胞系Ａ３７５Ａｇ ５はＴＩＦ−１、
ＴＩＦ−２および部分的に精製されたインターフェロン
により阻害を受けた。変異細胞系Ａ３７５Ａｇ ５−Ｉ
ＲはＴＩＦ−２およびインターフェロンによる阻害には
適当な感受性を示したが、ＴＩＦ−１に対する感受性を
欠いていた。このことにより、阻害因子は２種類あり、
様々な細胞に対して応答が異なることが証明された。
質転換の効果を検討した。ヒト胎児肺細胞Ｗｉ−３８
（ＣＣＬ７５）およびそれのＳＶ４０により形質転換さ
れた細胞（ＣＣＬ７５．１）の両方についてＴＩＦ−２
処理後、 125ＩＵｄＲの取込みを調べた。Ｗｉ−３８細
胞は刺激（１１％）され、Ｗｉ−３８のＳＶ４０形質転
換型細胞は阻害（２４％）された。同じ効果がＴＩＦ−
１についても見られ、それによれば形質転換された表現
型が、ＴＩＦによる阻害に要求されるかもしれないとい
うことが強く支持される。ヒト黒色腫クローン系Ａ３７
５Ａｇ ５およびＡ３７５Ａｇ ５のＴＩＦ−１耐性変
異型細胞系（Ａ３７５Ａｇ５−ＩＲと称す）を用いて、
阻害因子とインターフェロンについての比較を行なった
（第７表）。この細胞系を得るために２４穴板に単層で
生育しているＡ３７５Ａｇ ５細胞（１×１０4 ）をＴ
ＩＦ−１の活性分画で処理した。その分画はＡ６７３の
コンディションド・メディウムをバイオ−ゲルＰ−１０
０カラムにかけて得られたものである。細胞を一度処理
したが因子は細胞中で１０日間残存していた。処理した
細胞は体積を増し、より丸くなり、もはや培養板に接着
しなくなった。これら処理細胞をファルコンの組織培養
フラスコ（３０１３）に移した。細胞は結局定着し、単
層状態で増殖した。単層で数回継代すると、この細胞系
は親細胞系Ａ３７５Ａｇ ５と同じくらい速く増殖し
た。両細胞系を軟寒天中に播種すると、Ａ３７５Ａｇ
５は軟寒天中で増殖し直径０．５ないし１．０ｍｍ範囲
のコロニーを形成した。ところがＡ３７５Ａｇ ５−Ｉ
Ｒ変異細胞系は軟寒天中でほとんど増殖せず、コロニー
も３ないし５個しか生じなかった。これらの両細胞系
を、腫瘍増殖阻害検定法により試験した。第７表で明ら
かなように、親細胞系Ａ３７５Ａｇ ５はＴＩＦ−１、
ＴＩＦ−２および部分的に精製されたインターフェロン
により阻害を受けた。変異細胞系Ａ３７５Ａｇ ５−Ｉ
ＲはＴＩＦ−２およびインターフェロンによる阻害には
適当な感受性を示したが、ＴＩＦ−１に対する感受性を
欠いていた。このことにより、阻害因子は２種類あり、
様々な細胞に対して応答が異なることが証明された。
【００６２】
【表７】 さらに、阻害活性に関するＴＩＦ−１とＴＩＦ−２との
間の差異を第８表のデータによって示す。
間の差異を第８表のデータによって示す。
【００６３】
【表８】 ＴＩＦ−２およびＴＩＦ−１は両方ともヒト横絞筋腫細
胞系Ａ６７３からのコンディションド・メディウムから
得られた。ＴＩＦ−２はバイオ−ゲルＰ−１００および
ＣＭ−セルロースクロマトグラフィーにより部分的に精
製された。ＴＩＦ−１はバイオ−ゲルＰ−１００クロマ
トグラフィーにより部分的に精製された。試験細胞には
ヒト肺腺癌Ａ５４９および正常アメリカミンク肺細胞を
使用した。阻害度は、腫瘍増殖阻害検定により対照のパ
ーセント（ 125ＩＵｄＲ取込率）として表わした。
胞系Ａ６７３からのコンディションド・メディウムから
得られた。ＴＩＦ−２はバイオ−ゲルＰ−１００および
ＣＭ−セルロースクロマトグラフィーにより部分的に精
製された。ＴＩＦ−１はバイオ−ゲルＰ−１００クロマ
トグラフィーにより部分的に精製された。試験細胞には
ヒト肺腺癌Ａ５４９および正常アメリカミンク肺細胞を
使用した。阻害度は、腫瘍増殖阻害検定により対照のパ
ーセント（ 125ＩＵｄＲ取込率）として表わした。
【００６４】ＴＩＦ−１とＴＩＦ−２を区別する特徴 上記のようなＴＩＦ−１は、バイオ−ゲルＰ−１００カ
ラムによる分子量１０，０００ないしｌ６，０００の領
域から単離され、ＴＩＦ−２活性はＭｒｌ８，０００な
いし２２，０００のところに見出される。
ラムによる分子量１０，０００ないしｌ６，０００の領
域から単離され、ＴＩＦ−２活性はＭｒｌ８，０００な
いし２２，０００のところに見出される。
【００６５】ＴＩＦとＴＩＦ−２双方とも、軟寒天中で
試験される多数のヒト腫瘍細胞および上記の単層培養細
胞の増殖を阻害する。しかしながら、ＴＩＦによる阻害
に対する腫瘍細胞の感受性は、細胞の型、組織培養にお
ける継代および試験されるＴＩＦの種類に応じて異なっ
ている。単層培養では両ＴＩＦは正常ヒト線維芽細胞お
よび正常ヒト胎児腎細胞を刺激する。
試験される多数のヒト腫瘍細胞および上記の単層培養細
胞の増殖を阻害する。しかしながら、ＴＩＦによる阻害
に対する腫瘍細胞の感受性は、細胞の型、組織培養にお
ける継代および試験されるＴＩＦの種類に応じて異なっ
ている。単層培養では両ＴＩＦは正常ヒト線維芽細胞お
よび正常ヒト胎児腎細胞を刺激する。
【００６６】両ＴＩＦはその活性が濃度依存性であっ
て、酸および熱に安定な低分子量因子である。ＴＩＦの
阻害活性は、その因子が処理後１時間以内に細胞から除
かれれば、可逆的である。ＴＩＦ−１はトリプシンに感
受性を示す。一方ＴＩＦ−２は、その分子量およびその
ＴＩＦ−１との多くの類似特性から推すとタンパクであ
ると言えるが、トリプシンに感受性を示さない。
て、酸および熱に安定な低分子量因子である。ＴＩＦの
阻害活性は、その因子が処理後１時間以内に細胞から除
かれれば、可逆的である。ＴＩＦ−１はトリプシンに感
受性を示す。一方ＴＩＦ−２は、その分子量およびその
ＴＩＦ−１との多くの類似特性から推すとタンパクであ
ると言えるが、トリプシンに感受性を示さない。
【００６７】ＴＩＦ−１およびＴＩＦ−２は、それらが
由来する材科であるＡ６７３細胞の増殖を阻害し得る。
この癌細胞系は、様々な形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、
および対照腫瘍細胞に拮抗的に作用することが予測され
る少なくとも２種類の腫瘍増殖阻害因子を産生する。
由来する材科であるＡ６７３細胞の増殖を阻害し得る。
この癌細胞系は、様々な形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、
および対照腫瘍細胞に拮抗的に作用することが予測され
る少なくとも２種類の腫瘍増殖阻害因子を産生する。
【００６８】ＴＩＦ−１とＴＩＦ−２を区別するいくつ
かの特徴を要約し、第９表に掲げる。
かの特徴を要約し、第９表に掲げる。
【００６９】
【表９】 本発明のＴＩＦの用途の中には、腫瘍増殖を阻害するま
たは正常細胞の増殖を刺激するＴＩＦ量と薬理学的に許
容し得る担体およびアジュバントから成る薬剤組成物の
ような製剤等が、当然のこととして含まれる。そのよう
な薬剤組成物は、当該分野で周知の方法を使って調製し
得る。同様に、本発明の物質の利用法の中には、腫瘍細
胞の増殖を阻害する方法も含まれる。その方法の特徴
は、転移しやすい腫瘍のある、またはそれを注入された
宿主に、その物質を腫瘍の阻害に足る量だけ投与するこ
とである。その物質の投与形態および方法は、例えば錠
剤、溶液、懸濁、ぺースト、腹腔内、皮下等いかなるも
のであっても可能と言えよう。本発明に基づいて、創傷
を治療する方法も含まれるが、それは創傷部位にＴＩＦ
を治癒に足る量だけ投与することを特徴とする。
たは正常細胞の増殖を刺激するＴＩＦ量と薬理学的に許
容し得る担体およびアジュバントから成る薬剤組成物の
ような製剤等が、当然のこととして含まれる。そのよう
な薬剤組成物は、当該分野で周知の方法を使って調製し
得る。同様に、本発明の物質の利用法の中には、腫瘍細
胞の増殖を阻害する方法も含まれる。その方法の特徴
は、転移しやすい腫瘍のある、またはそれを注入された
宿主に、その物質を腫瘍の阻害に足る量だけ投与するこ
とである。その物質の投与形態および方法は、例えば錠
剤、溶液、懸濁、ぺースト、腹腔内、皮下等いかなるも
のであっても可能と言えよう。本発明に基づいて、創傷
を治療する方法も含まれるが、それは創傷部位にＴＩＦ
を治癒に足る量だけ投与することを特徴とする。
【図１】第ｌ図はヒト横絞筋腫からのコンディションド
・メディウムを濃縮し、バイオ−ゲルＰ−１００クロマ
トグラフィーにかけて溶出させた分画の活性を示すグラ
フ図である。
・メディウムを濃縮し、バイオ−ゲルＰ−１００クロマ
トグラフィーにかけて溶出させた分画の活性を示すグラ
フ図である。
【図２】第２図はヒト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖に対
するＴＩＦの効果を示す顕微鏡写真図である。
するＴＩＦの効果を示す顕微鏡写真図である。
【図３】第３図は第１図のプールＢをバイオ−ゲルＰ−
１００クロマトグラフィーにかけて溶出させた分画の活
性を示すグラフ図である。
１００クロマトグラフィーにかけて溶出させた分画の活
性を示すグラフ図である。
【図４】第４図は第１図のプールＢをバイオ−ゲルＰ−
１００クロマトグラフィーにかけて溶出させた分画の活
性をすグラフ図である。
１００クロマトグラフィーにかけて溶出させた分画の活
性をすグラフ図である。
【図５】第５図はμボンダパークＣ18カラム（０．３９
×３０ｃｍ）を用い２−プロパノールで溶出させてＴＩ
Ｆ−１を精製したときに得られる分画の活性を示すグラ
フ図である。
×３０ｃｍ）を用い２−プロパノールで溶出させてＴＩ
Ｆ−１を精製したときに得られる分画の活性を示すグラ
フ図である。
【図６】第６図は同一コンディションド・メディウムに
由来するＴＩＦ−１とＴＧＦとの間の拮抗関係を示す顕
微鏡写真図である。
由来するＴＩＦ−１とＴＧＦとの間の拮抗関係を示す顕
微鏡写真図である。
【図７】第７図は横絞筋腫細胞系Ａ６７３からのコンデ
ィションド・メディウムをバイオ−ゲルＰ−１００カラ
ムにかけて溶出させた分画の活性を示すグラフ図であ
る。
ィションド・メディウムをバイオ−ゲルＰ−１００カラ
ムにかけて溶出させた分画の活性を示すグラフ図であ
る。
【図８】第８図は第７図のバイオ−ゲルＰ−１００カラ
ム操作を行なって得られたＴＧＦ活性のあるプールＡを
集めてＣＭ−セルロースクロマトグラフィーにかけて溶
出させた分画の活性を示すグラフ図である。
ム操作を行なって得られたＴＧＦ活性のあるプールＡを
集めてＣＭ−セルロースクロマトグラフィーにかけて溶
出させた分画の活性を示すグラフ図である。
【図９】第９図はＣＭ−セルロースを用いて精製したＴ
ＩＦ−２をＲＰ−ＨＰＬＣにかけて溶出させた分画の活
性を示すグラフ図である。
ＩＦ−２をＲＰ−ＨＰＬＣにかけて溶出させた分画の活
性を示すグラフ図である。
【図１０】第１０図は軟寒天中でのヒト黒色腫細胞Ａ３
７５Ａｇ ５の増殖に対するＴＩＦ−２の効果を示す顕
徴鏡写真図である。
７５Ａｇ ５の増殖に対するＴＩＦ−２の効果を示す顕
徴鏡写真図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シヤーロツテ・エー・フライリング アメリカ合衆国、バージニア州 22207、 アーリントン、ノース・ツウエンテイーフ イフス・ロード 4519 (72)発明者 ケネス・ケー・イワタ アメリカ合衆国、ニューヨーク州 11590、 ウエストベリー、ナンバー３、サウス・グ ランド・ストリート100
Claims (6)
- 【請求項１】 軟寒天中で、抗ウイルス効果を発現させ
ず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を有し、更に以下の
性質、即ち （イ）分子量が１８，０００ないし２２，０００の範囲
であり、 （ロ）４℃で１Ｍ酢酸に安定であり、 （ハ）約５６℃で約３０分の熱処理に対して安定であ
り、 （ニ）ＣＣＬ−６４正常ミンク肺細胞を阻害せず、及び （ホ）ヒト正常繊維芽細胞の増殖を刺激する、という性
質を備えた、実質的に精製されたポリペプチド腫瘍増殖
阻害因子２。 - 【請求項２】 前記腫瘍増殖阻害因子２が、更に以下の
性質、即ち （イ）１００℃で３分間の熱処理に対して部分的に不安
定であり、 （ロ）等電点が４から８の範囲にあり、 （ハ）高速液体クロマトグラフィー（μｂｏｎｄａｐａ
ｋ Ｃ18カラム）にて２−プロパノールで約２９から３
１％、又はアセトニトリルで約３８から４２％の濃度勾
配で溶出し、 （ニ）ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、 （ホ）トリプシン感受性を示さず、 （へ）細胞分裂誘起活性を有し、及び、 （ト）インターフェロン活性が陰性である、という性質
を備えた、請求項１記載の腫瘍増殖阻害因子２。 - 【請求項３】 軟寒天中で、抗ウイルス効果を発現させ
ず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を有し、更に以下の
性質、即ち （イ）分子量が１８，０００ないし２２，０００の範囲
であり、 （ロ）４℃で１Ｍ酢酸に安定であり、 （ハ）約５６℃で約３０分の熱処理に対して安定であ
り、 （ニ）ＣＣＬ−６４正常ミンク肺細胞を阻害せず、 及び （ホ）ヒト正常繊維芽細胞の増殖を刺激する、 という性質を備えた、実質的に精製されたポリペプチド
腫瘍増殖阻害因子２の調製方法であって、 （イ）前記腫瘍増殖阻害因子２を調製するために適した
細胞系を培養し、 （ロ）前記腫瘍細胞増殖因子２を水系酸性溶媒又は有機
溶媒で抽出し、及び （ハ）前記腫瘍細胞増殖阻害因子２を精製及び単離する
こと、を具備した腫瘍増殖阻害因子２の調製方法。 - 【請求項４】 請求項３に記載の腫瘍増殖阻害因子２の
調製方法であって、前記腫瘍増殖阻害因子２が、更に以
下の性質、即ち （イ）１００℃で３分間の熱処理に対して部分的に不安
定であり、 （ロ）等電点が４から８の範囲にあり、 （ハ）高速液体クロマトグラフィー（μｂｏｎｄａｐａ
ｋ Ｃ18カラム）にて２−プロパノールで約２９から３
１％、又はアセトニトリルで約３８から４２％の濃度勾
配で溶出し、 （ニ）ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、 （ホ）トリプシン感受性を示さず、 （ハ）細胞分裂誘起活性を有し、及び、 （ト）インターフェロン活性が陰性である、という性質
を備えた調製方法。 - 【請求項５】 軟寒天中で、抗ウイルス効果を発現させ
ず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を有し、更に以下の
性質、即ち （イ）分子量が１８，０００ないし２２，０００の範囲
であり、 （ロ）４℃で１Ｍ酢酸に安定であり、 （ハ）約５６℃で約３０分の熱処理に対して安定であ
り、 （ニ）ＣＣＬ−６４正常ミンク肺細胞を阻害せず、及び （ホ）ヒト正常繊維芽細胞の増殖を刺激ずる、という性
質を備えた、実質的に精製きれたポリペプチド腫瘍増殖
阻害因子２の腫瘍阻害量、及び薬剤として許容しうる担
体又はアジュバンドから成る、哺乳動物において腫瘍細
胞の増殖性を阻害するための薬剤組成物。 - 【請求項６】 請求項５に記載の薬剤組成物であって、
前記腫瘍増殖阻害因子２が、更に以下の性質、即ち （イ）１００℃で３分間の熱処理に対して部分的に不安
定であり、 （ロ）等電点が４から８の範囲にあり、 （ハ）高速液体クロマトグラフィー（μｂｏｎｄａｐａ
ｋ Ｃ18カラム）にて２−プロパノールで約２９から３
１％、又はアセトニトリルで約３８から４２％の濃度勾
配で溶出し、 （ニ）ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、 （ホ）トリプシン感受性を示さず、 （ハ）細胞分裂誘起活性を有し、及び、 （ト）インタ−フェロン活性が陰性である、という性質
を備えた薬剤組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/602,520 US4708948A (en) | 1984-04-20 | 1984-04-20 | Substantially purified tumor growth inhibitory factor |
| US602520 | 1984-04-20 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60084353A Division JP2550307B2 (ja) | 1984-04-20 | 1985-04-19 | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08231593A true JPH08231593A (ja) | 1996-09-10 |
| JP2702103B2 JP2702103B2 (ja) | 1998-01-21 |
Family
ID=24411683
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60084353A Expired - Lifetime JP2550307B2 (ja) | 1984-04-20 | 1985-04-19 | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 |
| JP7346642A Expired - Lifetime JP2702103B2 (ja) | 1984-04-20 | 1995-12-13 | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60084353A Expired - Lifetime JP2550307B2 (ja) | 1984-04-20 | 1985-04-19 | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 |
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| EP (1) | EP0159276B1 (ja) |
| JP (2) | JP2550307B2 (ja) |
| CA (1) | CA1311704C (ja) |
| DE (1) | DE3580607D1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4920196A (en) * | 1982-07-30 | 1990-04-24 | Genentech, Inc. | Human lymphotoxin |
| US5656587A (en) * | 1982-09-24 | 1997-08-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Promotion of cell proliferation by use of transforming growth factor beta (TGF-β) |
| US5104977A (en) * | 1982-09-24 | 1992-04-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Purified transforming growth factor beta |
| US5705477A (en) * | 1982-09-24 | 1998-01-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Compositions of transforming growth factor β(TGF-β) which promotes wound healing and methods for their use |
| US4849506A (en) * | 1984-04-13 | 1989-07-18 | Akzo N.V. | Leukoregulin, an antitumor lymphokine, and its therapeutic uses |
| US5284763A (en) * | 1985-03-22 | 1994-02-08 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding TGF-β and its uses |
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