JP2550307B2

JP2550307B2 - 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法

Info

Publication number: JP2550307B2
Application number: JP60084353A
Authority: JP
Inventors: ジヨージ・ジエイ・トダロ; シヤーロツテ・エー・フライリング; ケネス・ケー・イワタ
Original assignee: US Department of Energy
Current assignee: US Department of Energy
Priority date: 1984-04-20
Filing date: 1985-04-19
Publication date: 1996-11-06
Anticipated expiration: 2011-11-06
Also published as: CA1311704C; EP0159276A2; JPS6133120A; EP0159276B1; JPH08231593A; US4708948A; JP2702103B2; DE3580607D1; EP0159276A3

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は腫瘍増殖阻害因子（TIF）に係わり、特には
ある種の正常ヒト細胞の増殖に副作用を及ぼさずに、あ
る種の腫瘍細胞の増殖を阻害することができる実質的に
精製されたポリペプチド因子に関する。

〔従来の技術とその問題点〕

多くの種類の腫瘍増殖因子（TGF）および増殖阻害物
質が当該分野で知られている。ホリーらは、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA77,5989（1980）およびCell Biol.Int.Rep
orts7,525−526（1983）で、アフリカミドリザル腎BSC
−１細胞からの強力な増殖阻害物質の単離について報告
している。それは、ヒト乳癌細胞やヒト正常乳腺細胞と
同様な産生細胞の増殖を阻害することがわかった。ミッ
クメイホーンら〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,456−460
（1982）〕は、悪性ラット肝細胞には作用しないが、正
常ラット肝細胞には作用する細胞増殖阻害物質〔Mr（相
対分子量）:26,000〕をラットの肝臓から精製した。他
の増殖阻害物質は培養したヒヨコ脊髄細胞で発見されて
いる〔カーゲンら、エクスペリメンタル・ニューロロジ
ー（Experimental Neurology）、58,347−360（197
8）；ハリントンら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA77,423−4
27（1980）；およびステックら、J.Cell Biol.83,562−
575（1979）〕。

ビカエル〔Nature,231,449−450（1971）〕は、増殖
が平坦域に達した腹水癌をもったマウスから癌細胞のほ
とんどを吸引してしまうと、残っている癌細胞が急激に
増殖することを報告した。十分増殖した腹水癌を担った
マウスから得た、細胞を含まない腹水液を、増殖中の癌
細胞を担ったマウスに注射すると、癌の増殖が著しく抑
制される。ビカエル（上記報文で）は、進行した癌をも
つマウスと、初期癌を担ったマウスを外科手術により結
合（併体結合）させると、初期癌の増殖が著しく抑制さ
れることも観察した。これらの観察〔ビカエル、Europ.
J.Cancer,6,291−296（1970）およびビカエル、上記報
文〕は併体結合のマウス腹膜を通して循環する拡散可能
な阻害因子の存在によって説明され、その因子は充分に
増殖した腹水癌によって産生される、細胞を含まない腹
水中に存在する。この阻害因子の性状は分かっていない
が、腹水癌の増殖率はマウスに存在する癌組織の大きさ
および産生された阻害因子の量を規定する癌組織の大き
さに依存していると推察された。

トダロら〔ブリストル−マイヤーズ・キャンサー・シ
ンポジウム（Bristol−Myers Cancer Symposium）4,222
−223,（1982）〕は、ある種の癌細胞増殖阻害因子の特
性を報告した。トダロら（上記報文で）によるこの観察
は、部分的に精製された製剤に基づけば予備的なもので
あった。そればかりでなく本発明のTIFはいくつかの基
本的な点でこれら先行技術のものとは異なっている。す
なわち、（１）先行技術のTIFがTGF（腫瘍細胞増殖因子）依存性
の正常細胞の増殖を遮断するのに対して、本発明のTIF
はTGF依存性正常細胞の増殖を抑制しない。

（２）先行技術では、阻害因子には異なった群または型
があるかが不明であったが、本発明では、実際、少なく
とも２種類の異なったTIFが単離され、実質的に精製さ
れ、確定された。それらは先行技術のものとは異なって
いるばかりか、互いに区別し得る。

（３）以前に知られているTIFと異なって、本発明のTIF
は新規なマイトジェン（細胞分裂誘起物質）特性および
ヒト細胞増殖刺激特性を有している。

〔問題点を解決するための手段〕

腫瘍増殖阻害因子は、多様な材料から得られる。例え
ば、尿、血清、血漿および羊水のような哺乳類の体液；
肝臓、心臓、肺、脾臓、筋肉、脳、胎盤、臍帯、腎臓お
よび膵臓のような哺乳類の成体および胎児の組織；組織
培養による正常ヒト細胞のコンディションド・メディウ
ム（細胞培養液の上清）のような様々なコンディション
ド・メディウム；組織培養細胞等からの抽出物である。

腫瘍増殖阻害因子は、酸／エタノール抽出、ゲル浸透
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィー等を含めた様々な実験手法
を用いて単離および精製することができる。

添加剤、担体および／またはアジュバンドの中で、当
該分野でよく知られた適当な物質を、もし必要なら用い
ることができる。好ましい物質として、生理食塩水、水
性溶媒、賦形剤、防腐剤、抗菌剤、殺菌剤等が挙げられ
る。

以下に提示されるデータから分かるように、本発明の
腫瘍増殖阻害因子（TIF）は熱安定なタンパクで何種類
も存在する。それはみかけの分子量が3,500ないし45,00
0（ドルトン）の範囲で、等電点（pI）が４ないし８で
あり、TIF−１とTIF−２が代表的である。様々なTIFは
いくぶん疎水的であり、逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（RP−HPLC）のC₁₈カラムからアセトニトリル25ない
し50％の間または２−プロパノール10ないし35％の間で
溶出する。様々なTIFのいくつかの特徴および性質は以
後に記載する。

「実質的に精製された」という言葉の意味は、純度が
80％以上である製剤、好ましくは90％以上、さらに好ま
しくは95％以上である製剤ということである。

材料と方法以後に記載する方法に類似したまたは同等の材料、方
法を使用し得るが、次のものが望ましい。

組織抽出物からの腫瘍増殖阻害因子（TIF）の単離酸／エタノール抽出法〔ダボレン、Biochem.Biophys.
Acta.,63,150（1902）およびロバートら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,77,3494（1980）に記載〕の改良法により、
組織を抽出した。すなわち、95％（V/V）エタノール375
ml、濃塩酸7.5ml、フッ化フェニルメチルスルホニル（P
MSF）33ngおよびアプロチニン〔0.9％NaClおよび0.9％
ベンジルアルコール中の10−20トリプシン阻害剤単位
（TIU）〕1mlから成る溶液に蒸留水192mlを混合した。
組織をこの溶液に懸濁し（6ml/組織1g）、はさみで細か
く切りそしてソルバールオムニミキサーで均質化した。
４℃で一晩抽出後、その混合物を5000gで30分間遠心
し、ペレットを捨てた。その抽出物を濃水酸化アンモニ
ウムでpH5.0に調整し、抽出物100ml当り1mlの2M酢酸ア
ンモニウム緩衝液（pH5.2）を加えた。この抽出物を500
0gで30分間遠心し、沈殿物を除去した。冷無水エーテル
４容と冷無水エタノール２容をただちに加え、この混合
物を−20℃で48時間静置させた。生じた析出物を沈殿さ
せ、液体の大部分をサイホンで吸い出した。残った懸濁
液を5000gで30分間遠心し、ペレットを得た。このペレ
ットを1M酢酸に溶解し、排除分子量3500のスペクトラポ
ール（Spectrapor）管（スペクトラム・メディカル・イ
ンダストリーズ、カリフォルニア州ロサンゼルス）中で
0.2M酢酸に対して徹底的に透析した。この物質は1M酢酸
中に４℃で保存するか、または凍結乾燥した。

コンディションド・メディウム（細胞培養液の上清）細胞を含まないコンディションド・メディウムをヒト
横絞筋腫細胞系A673から採取した。細胞を、10％ウシ胎
児血清を補ったダルベッコーの最少必須培地（DMEM）50
mlの入ったコーニング830cm²回転ボトル（コーニング25
140）中で適当に飽和するまで増殖させた。続いて、そ
の単層を血清を含まないDMEM50mlで２回洗った。各回転
ボトルを血清を含まないワイマウスの培地（メロイ・ラ
ブズ社）50ml中で８時間培養した。その培地を捨て、血
清を含まない新しいワイマウスの培地50mlと置換え、細
胞を48時間培養した。こうして「コンディションド・メ
ディウム」を集め、血清を含まない新しいワイマウスの
培地と置換え、さらに48時間培養した。コンディション
ド・メディウムは、A673細胞の適当に飽和した単層ごと
に３回集め会計した。続いて集めたコンディションド・
メディウムを溜めて、ベックマンCF−32ローターを用い
32,000rpm（流出率5l/時間）で遠心し、透明にした。清
澄になった物質をアミコンDC−10中空糸濾過器（遮断分
子量:5000）を使って100倍に濃縮（例えば50lを500ml
に）した。濃縮した物質を溜め、濾過器を200mlの濾液
で洗い残っている因子を除いた。濃縮液と洗浄液をスペ
クトロフォー（Spectrophor）３透析管（遮断分子量:35
00）に溜め、2lの0.1M酢酸に対して透析した。透析した
物質をベックマン35型ローター上にて27.000rpmで１時
間遠心した。ペレットを捨て、上清を凍結乾燥した。

培養細胞培養細胞を10％FBS（ギブコ）を補ったダルベッコー
の改良型イーグル培地の入った75cm²プラスティック製
組織培養フラスコ（ファルコン3024）中で37℃に維持し
た。ただし10％ウシ血清を要求する細胞系3T3 202,49F
およびキルスタインウイルスで形質転換した正常ラット
腎細胞（KNRK）にはこの条件があてはまらない。A549は
ヒト肺の腺癌である。HuFは組織培養で10ないし25回継
代したヒト包皮線維芽細胞系であり、J.レビー（サンフ
ランシコクのカリフォルニア大学、ガン研究所）から供
与された。3T3 2−２はウィグラー（ニューヨークのコ
ールドスプリングハーバー研究所）から供与されたマウ
スNIH 3T3細胞のなかの１種のクローンである。

ゲル浸透クロマトグラフィー凍結乾燥したコンディションド・メディウム（コンデ
ィションド・メディウム30ないし100lから得た200ない
し300mg）を1M酢酸15ないし20ml中に再び懸濁させ、バ
イオ−ゲルＰ−100（100−200メッシュ、ポリアクリル
アミドゲルバイオ・ラド）をつめたカラム（５×82.5c
m）にかけ、平衡化させて、４℃にて1M酢酸で溶出させ
た。複数の分画（12.4ml）を集めた。そして２本置きの
各分画からアリコート2.5μｌを取り、TIF活性を測定し
た。また２本置きの各分画からアリコート100μｌを取
りTGF活性を測定した。増殖調節活性（各種のTIFおよび
TGF）を含む分画を３種のプールＡないしＣ（第１図）
に分け、凍結乾燥した。

プールＢは凍結乾燥し、バイオ−ゲルＰ−10カラムで
さらに精製した。凍結乾燥した試料（20ないし40mg）を
1M酢酸５ないし7mlに溶解し、不溶物質を除くために４
℃で30分間200gで遠心した。上清をバイオ−ゲルＰ−10
（200ないし400メッシュ、ポリアクリルアミド、バイオ
−ラド）にかけ、平衡化して、４℃にて1M酢酸で溶出さ
せた。複数の分画（4.6ml）を集め、アリコート100μｌ
を２本置きの各分画から取り、TIF活性を測定した。

逆相高圧液体クロマトグラフィー（RP−HPLC）バイオ−ゲルＰ−10カラムからTIF活性のピークを含
む分画を集めた。典型的にはこれら分画は分画44ないし
47であった。コンディションド・メディウム30ないし60
l相当からの物質を各HPLCに使用した。複数のバイオ−
ゲルＰ−10分画を合わせて凍結乾燥した。残渣を0.05％
トリフルオロ酢酸1mlに再び懸濁した。この溶液は、不
溶物質を除くために1000gで５分間遠心した。上清をウ
ォーターズμボンドパーク（μBondapak）C₁₈カラム
（0.39×30cm）に注入した。IBMの濃度勾配液体クロマ
トグラフィー装置（IBM LC/9533）を使用した。カラム
の溶出液を206nmに設定した可変波長紫外（U.V）検出器
（IBM LC/9523）で監視した。206nmで吸収を示す主要ピ
ークの分画を集めた。各分画からアリコートを取り、TI
FまたはTGF活性を測定した。

軟寒天増殖阻害検定試験のための凍結乾燥後の試料を、0.34％寒天（ディ
フコ、アガーノーブル）および２×10⁴のヒト肺癌細胞A
549を含む最終容積1.4mlの完全増殖培地（10％FBSを補
ったDMEM）に溶解した。処理剤み細胞の軟寒天懸濁液
を、60mmシャーレ（ファルコン3002）につくった完全増
殖培地を含む2mlの0.5％寒天基層2ml上にペレットで加
えた。シャーレを、加湿した５％CO₂/95％空気雰囲気中
にて37℃で３週間培養した。７日後、培養物に完全増殖
培地を含む0.34％寒天1.5mlをさらに加えた。２週間後
および３週間後に増殖の様子を顕微鏡写真で撮影した。

腫瘍増殖阻害因子検定試験細胞（３×10³細胞／穴）を、完全培地50μｌの
入った96穴組織培養板（タンク167008）上で二次培養し
た。ヒト肺癌細胞A549は１穴あたり4.5×10³）細胞の播
種密度を必要とした。カラム分画からのアリコートによ
りTIF活性を測定するが、そのアリコートをウシ血清ア
ルブミン（BSA）（シグマＡ−6003）1mg/m1M酢酸溶液50
μｌを含む滅菌済12×75mm試験管に移し、凍結乾燥し
た。検定直前にその凍結乾燥した試料を完全培地200μ
ｌ中に再び懸濁させた。再懸濁させた試料のアリコート
50μｌを試験細胞を含む穴に加えた。各サンプルを３回
検定した。細胞を加湿した５％CO₂/95％空気雰囲気中で
37℃にて72時間培養した。培養期間の終りに各穴を５−
〔¹²⁵I〕アイオド−２−デオキシウリジン（¹²⁵IUdR）
（アメルスハムIM.355V）１μCi/mlを含む完全培地100
μｌで24時間処理した。単層を緩衝液〔1mg/mlBSAおよ
び50mM2−シス（２−ヒドロキシエチル）アミノエタン
スルホン酸を含むダルベッコーの改良型イーグル培地、
pH6.8〕で一度洗浄し、無水メタノール中で10分間固定
し、15分間空気乾燥した。細胞に取込まれた¹²⁵IUdRを1
N NaOH200μｌで可溶化し、60℃で20分間インキュベー
トした。各穴中の細胞によって取込まれ、可変化された
¹²⁵IUdRをタイターテック上澄回収システム（フロ・ラ
ボラトリーズ、78−210−05）を用いて回収・測定し
た。細胞増殖の量を、対数増殖期にある細胞のDNAに取
込まれた¹²⁵IUdRの量から概算した。検定を行なう前
に、細胞の増殖程度を肉眼で確認するために、各穴をラ
イツの倒立顕微鏡を使って観察した。顕微鏡観察による
処理細胞の増殖阻害の程度は、¹²⁵IUdRの取込み量の減
少と一致していた。増殖の阻害は、未処理の対照細胞に
よって取込まれた¹²⁵IUdRに対するTIFで処理した試験細
胞（例えばヒト腫瘍細胞）に取込まれた¹²⁵IUdRの比に
よって表わした。単層培養中で腫瘍細胞の¹²⁵IUdRの取
込みを最も阻害するカラム分画は、軟寒天上で腫瘍細胞
の増殖を最も阻害した。細胞増殖の増大が顕微鏡観察で
認められる条件は¹²⁵IUdRの取込みの増大と一致してい
た。細胞増殖の増大は、パーセント刺激として表わされ
るが、未処理の対照細胞により取込まれた¹²⁵IUdRに対
してTIFで処理した試験細胞（例えば、正常ヒト細胞）
により取込まれた¹²⁵IUdRの比に対応する。

マイトジェン（細胞分裂誘起物質）検定 10％ウシ血清を補ったDMEM100μｌの入った96穴組織
培養板（タンク167008）中で試験細胞（3T3 2−２）を
二次培養（1.5×10⁴細胞／穴）し、37℃で24時間培養し
た。培地を、0.5％ウシ血清を補ったワイマウス培地（1
00μl/穴）で置換え、37℃でもう一回24時間培養した。
試験するカラム分画のアリコートを、1M酢酸50μｌを含
む滅菌済み12×75mm試験管（ファルコン2058）へ移し、
凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を２μCi/mlの¹²⁵IUdR
を含む血清の入っていないワイマウス培地300μｌに再
び懸濁し、３回検定した。再懸濁した試料100μｌを、
0.5％ウシ血清の入ったワイマウス培地100μｌと試験細
胞を含む各穴に加えた。もう一回24時間37℃で培養した
のち、単層を洗い、腫瘍増殖阻害因子検定のために前記
の通りに回収した。

混合実験第４図のRP−HPLC精製段階から得た28ないし33％のア
セトニトリルで溶出する分画、すなわちTIF−１活性を
有する分画をこの実験で使用した。バイオ−ゲルＰ−10
0カラムのプールＡ（第１図）に由来する分子量20,000
のTGFをμボンダパークC₁₈カラムを取付けたRP−HPLCを
用い、0.05％トリフルオロ酢酸（TFA）に溶かした20％
アセトニトリルで直線濃度勾配をかけて溶出させた。そ
れをさらに0.05％トリフルオロ酢酸に溶かした12％プロ
パノールで直線濃度勾配をかけて溶出させながらμボン
ダパークC₁₈カラムで精製した。A549細胞（検定あたり
1.5×10³細胞）を完全培地0.3mlに溶かしたTGFおよび／
またはTIF−１と混合した。0.5％寒天溶液0.64mlと各分
画を混合し、その懸濁液を24穴組織培養シャーレ（タン
ク169690）中の0.5％寒天基層に加えた。シャーレを加
湿した５％CO₂/95％空気雰囲気中で37℃にて培養した。
３週間後、コロニーを0.052％ｐ−アイオドニトロテト
ラゾリウムバイオレット（11）0.5mlで染色した。
（Ａ）：未処理対照細胞。（Ｂ−Ｄ）:TIF−１の1:5逓
減希釈液（Ｂではタンパク15μg/ml）で処理した細胞。
（Ｅ）TGF12ng当量/ml〔ng当量とは、放射線受容体検定
において既知の濃度のEGF（上皮増殖因子）に対して競
合するTGFの濃度と定義する〕で処理された細胞。（Ｆ
−Ｈ）:TGF12ng当量/mlおよびTIF−１の1:5逓減希釈液
（Ｆではタンパク15μl/ml）で処理した細胞。

TIFの特性決定トリプシン感受性は、0.1M酢酸アンモニウム（pH7.
4）0.9ml中のTIF76μｇにトリプシン（シグマT8253）25
0μｇを添加して、それを37℃で１時間培養して試験し
た。トリプシンは、ダイズトリプシンインヒビター（シ
グマ・Ｔ−9003）500μｇを加えることによって不活性
化した。処理したTIFおよび対照TIF両方を室温でもう１
時間培養した。続いて各試料に1M酢酸0.2mlを添加し、
ただちに凍結乾燥した。

還元剤の効果は、0.065Mジチオトレイトール（DTT）
（シュワルツ／マン、90251）を含む0.1MNH₄HCO₃0.9ml
中の76μgTIF（バイオゲルＰ−100のプールＢ）を室温
で１時間培養して試験した。DTT処理のTIFのアリコート
および未処理対照のアリコートをスペクトロフォー３透
析管に移し、１％酢酸（V/V）に対して徹底的に透析し
た。次に、透析後の試料を凍結乾燥し、TIF活性を試験
した。

TIFの熱安定性は、TIFのいくつかのアリコート360μ
ｇを1M酢酸1mlに再懸濁し、１つのアリコートを56℃30
分およびもう１つのアリコートを沸騰水中で３分間処理
して試験した。熱処理したアリコートと熱処理をしない
対照を凍結乾燥し、TIF活性の試験をした。

〔実施例１〕 TGFおよびTIFを含み血清の入っていないコンディショ
ンドメディウム（ヒト腫瘍細胞系A673に由来）はバイオ
ゲルＰ−100カラムにかけられ、分画に分けられた（第
１図）。タンパクの大部分は排除体積の部分に溶出す
る。第１図から明らかなように、分画55ないし68にTGF
活性を明確に示す部分〔プールＡ（Mr＝20,000）と標
示〕があった。TGF活性は、分画から取ったアリコート
の、上皮成長因子（EGF）に対する受容体への結合に拮
抗する能力を測定して決めた。トダロら〔Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,77,5258−5262〕の放射線受容体検定法を使
用した。

第１図に、TIF活性のある３つの主要領域を示す。大
きな分子量をもつTIFはMr＝28,000部分に溶出した。プ
ールＢと標示されたTIF活性（分画69ないし95）は10,00
0ないし16,000のMrに相当した。プールＣと標示されたT
IF活性（分画96ないし133）は5,000ないし10,000のMrに
相当した。TIF活性のある各主要領域にはいくぶん異質
性があった。第１図で観察されたTIF活性のある３領域
はどれも全くTGF活性を含んではいなかった。

軟寒天中での細胞の足場非依存性増殖は腫瘍細胞の１
つの特徴である。バイオゲルＰ−100カラムから得たTIF
活性のある各領域からのいくつかのアリコートを、軟寒
天上のヒト腫瘍細胞増殖に対するそれらの影響について
調べた。第２図は軟寒天中でのヒト癌A549細胞の顕微鏡
写真である。腫瘍細胞の未処理対照懸濁液は軟寒天中で
増殖し大きなコロニーを形成した。プールＢからのTIF
で処理した細胞は、軟寒天中での増殖能が著しく阻害さ
れた。顕微鏡写真（第２図）に見られるように、処理さ
れた腫瘍細胞は軟寒天中で増殖しえないが、細胞死やそ
れに続く自己消化には到らないようであった。プールＢ
をHPLCで精製したTIFに関して、軟寒天中でのA549の増
殖阻害が同様に観察された。これらの結果によれば、TI
Fは細胞毒性があるというよりも増殖阻害作用があると
思われた。

血清の入っていないコンディションド・メディウムか
ら得られた腫瘍増殖阻害活性は、インターフェロン活性
が存在するためであるとは言えない。ヒト肺癌細胞の増
殖阻害は、わずか３国際単位（IU）と低い力価のインタ
ーフェロンで処理した後観察された。これに匹敵する腫
瘍細胞増殖の阻害が、プールＢからのTIF360μg/mlによ
る処理で観察された。しかし、このTIF試料の1000倍濃
縮液を試験したときインターフェロン活性は検出されな
かった。

正常ヒト線維芽細胞（HuF）およびヒト肺癌（A549）
をTIF−１の濃度を順次高めて処理したとき、ヒト腫瘍
細胞の濃度依存性阻害は認められたが、正常ヒト線維芽
細胞の濃度依存性刺激は認められなかった。ヒト腫瘍細
胞はTIF−１により阻害されたが、正常ヒト線維芽細胞
は阻害されなかった。したがってTIF−１はすべての細
胞の増殖を阻害するものではない。

TIF−１は、第４図に示すようにμボンダパークC₁₈カ
ラムを用いたRP−HPLCにより、アセトニトリル/0.05％T
FAを３段階の直線濃度勾配をかけて、プールＢ（第１
図）から精製された。溶出は次のように行なった。まず
0.05％TFA中のアセトニトリル０ないし25％の直線濃度
勾配15分、つぎに0.05％TFA中のアセトニトリル25ない
し45％の直線濃度勾配80分、さらに0.05％TFA中のアセ
トニトリル45ないし100％の直線濃度勾配15分。TIF活性
は、２つの異なったアセトニトリル濃度で溶出したとこ
ろに観察された。すなわち28−33％間のアセトニトリル
濃度のところと、38−42％間のアセトニトリル濃度のと
ころである。これらのTIF活性をTIF−１と標示した。38
％ないし42％間のアセトニトリル濃度で溶出するTIF活
性は、プールＡからのいくつかの重複した分画をプール
Ｂ（第１図）と混ぜてRP−HPLC（第４図）で精製したと
き、観察された。バイオゲルＰ−10カラムの斜線部分か
ら集めた分画を、RP−HPLCにて28％ないし33％間で溶出
させると、TIF−１活性をもつピーク２つのみが生じ
る。

ヒト肺癌細胞の増殖はTIF−１により阻害されるが、
ヒト正常線維芽細胞はTIF−１により刺激されることが
観察された。したがって、TIF−１を使って、血清飢餓
状態の静止期の3T3マウス細胞でのマイトジェン活性の
試験を行なった。

TIF−１を含む分画からのアリコートのTIF量は、観察
されたマイトジェン活性量と一致していた（第４図）。
ヒト腫瘍細胞でのTIFの阻害活性は、正常マウスおよび
正常ヒト細胞でのマイトジェン活性と一致していたが、
この一致はTIF精製のすべての段階で観察された。した
がって、TIF−１は標的細胞の性質に依存する様々な生
物学的特性を有している。

μボンダパークC₁₈カラムを使って28ないし33％間の
アセトニトリルで溶出するTIF−１活性は、さらにμボ
ンダパークC₁₈カラムを使ったRP−HPLCにより精製した
（第５図）。溶出は２−プロパノールの直線濃度勾配を
かけて次のように行なった。すなわち、0.05％TFC中の
２−プロパノール0.18％の直線濃度勾配10分、0.05％TF
C中の２−プロパノール18ないし22％の直線濃度勾配10
分、0.05％TFC中の２−プロパノール22ないし28％の直
線濃度勾配60分、0.05％TFC中の２−プロパノール28な
いし30％の直線濃度勾配10分、0.05％TFC中の２−プロ
パノール30ないし100％の直線濃度勾配15分。TIF−１
は、２−プロパノール18％ないし22％間で溶出すること
が認められた。RP−HPLCを使って２−プロパノールの直
線濃度勾配により精製したTIF−１は、206nmにおける吸
光度から概算されるように一連のng/mlの濃度で著しいT
IF活性を示した。

TIF−１の特性 TIF−１の特性をいくつか第１表に示す。

TIF−１はトリプシンやDTTにより不活化される。この
ことから、TIF−１は活性に完全なジスルフィド結合を
必要とするタンパクであることが示唆される。TIF−１
は、56℃30分および100℃３分の熱処理に対して安定で
ある。ヒト癌細胞の増殖阻害は、TIF−１が１時間以内
に除かれれば、95％可逆的であった。腫瘍細胞をTIF−
１に長く晒すと、増殖の阻害度が対応して高まった。

ヒトおよびヒト以外の様々な細胞系の増殖に対するTI
F−１の阻害活性スペクトルを第２表に示す。正常ヒト
細胞の増殖がTIF−１により刺激されることは注目に価
する。これらの研究には以下の細胞が含まれる。すなわ
ち生体外で10ないし25回継代した正常ヒト線維芽細胞
株、ヒト線維芽細胞の初期継代細胞（組織移植片から６
回の継代）および正常ヒト上皮細胞の初期継代細胞（組
織移植片から３回の継代）。肺腺癌A549および乳癌MCF7
のような何種類かの細胞はTIF−１による増殖阻害に対
して高い感受性を示した。膀胱癌や黒色腫のような他の
腫瘍は増殖阻害に対して感受性が低かった。正常アメリ
カミンク肺上皮細胞も感受性は非常に低かった。

ヒト腫瘍細胞を組織培養で維持したとき、TIF−１の
処理による増殖阻害への感受性に関する影響も同様に調
べた。ヒト腫瘍細胞を組織培養で長く維持すればするほ
ど、TIF−１で処理したとき、それは増殖阻害に対して
より強い抵抗性を示すようになった。TIF−１の供給源
であるヒト横絞筋腫（A673）および肺癌（A549）がこの
効果を示した（第２表）。少ない回数継代した細胞の増
殖阻害に対する感受性は高いが、何回も継代した細胞は
より強い抵抗性を示した。ヒト腫瘍が１次移植片により
類似していればしているほど、それはTIF−１による阻
害に対してより強い反応性を示すと考えられる。

第２表に掲げたヒト腫瘍細胞のすべては、その増殖が
TIF−１処理により阻害された。ウイルスにより形質転
換した細胞に対するTIF−１の効果を第３表に示す。第
２表で見られたように、正常ヒト線維芽細胞Wi38の増殖
はTIF−１の処理により阻害されず、むしろ増殖の刺激
が観察された。しかしながら、他方SV40で形質転換した
細胞の増殖はTIF−１により著しく阻害された。ウイル
スで形質転換した細胞のこのような増殖阻害はラットの
細胞でも同様に観察された。正常ラット腎細胞（NRK）
の増殖はTIF−１により阻害されなかった。しかし、TIF
−１で処理したこれらの細胞の増殖は若干刺激されるこ
とが観察された。ウイルスで形質転換したNRKキルステ
ン肉腫（KNRK）細胞の増殖もTIF−１により阻害され
た。DNAおよびRNAウイルスで形質転換した細胞の増殖は
TIF−１により阻害されるが、一方その親である非形質
転換細胞は増殖が刺激された。

ヒト腫瘍細胞由来のコンディションド・メディウム
は、複数の腫瘍増殖因子（TGF）と複数の腫瘍増殖阻害
因子（TIF）の両方を含むことが観察された。TIF,TGF
（両方とも同一材料の腫瘍細胞コンディションド・メデ
ィウム由来）およびTIFとTGFの混合物の効果を、軟寒天
上でヒト肺癌細胞（A549）の増殖に関して検討した。そ
れを第６図に示す（前記の混合実験参照）。穴ＡはA549
細胞の未処理対照懸濁液で、これは軟寒天中でコロニー
を形成した。穴ＢないしＤはTIF−１の様々な希釈液で
処理した細胞の軟寒天懸濁液を含む。穴ＣおよびＤは、
3.0および0.6μg/mlのTIF−１でそれぞれ処理したもの
であり、TIF濃度が低いほど腫瘍細胞の増殖は阻害され
にくくなることを示している。しかし、0.6μg/mlのTIF
−１で処理したA549細胞の軟寒天懸濁液においても、な
お肉眼で認められる腫瘍細胞の増殖阻害が起きている。
下段の列の穴ＥないしＨは、軟寒天上でのA549細胞の増
殖に関するTGF（穴ＢないしＤにおいて用いられたTIFを
産生したと同じ細胞のコンディションド・メディウムに
由来）の効果を示している。穴Ｅは12ng当量/mlのTGFで
処理したものである。Mr20,000のTGFは軟寒天中でヒト
癌細胞の増殖を高めた。穴ＦはTGF（12ng当量/ml）とTI
F−１（15μg/ml）とで処理したものである。穴Ｅにお
いて、腫瘍細胞の軟寒天中での増殖を高めた濃度のTGF
存在下でさえも、ヒト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖はTI
F−１により著しく阻害された。穴ＦないしＨにおい
て、TIF濃度を下げると、軟寒天中でTGF処理腫瘍細胞の
増殖が高まった。様々な処理による軟寒天中のヒト腫瘍
細胞のコロニーの大きさを第４表に示す。未処理ヒト癌
細胞は、軟寒天中で直径0.3mmのコロニーを形成した。1
2ng当量/mlのTGFで処理したヒト癌細胞は、軟寒天中で
直径0.5mmのより大きなコロニーを形成した。TIFで処理
した腫瘍細胞は、TIF濃度に応じて軟寒天中でより小さ
な大きさのコロニーを形成した。12ng当量/mlのTGFと３
μg/mlのTIF−１の混合物で処理した腫瘍細胞は、軟寒
天中でTGFまたはTIFによって処理されなかった対照の腫
瘍細胞と同じ大きさのコロニーを形成した。

これらの結果から次のことが結論ずけられる。（１）
TIFは軟寒天中での腫瘍細胞の足場非依存性増殖を阻害
する。（２）TGFは軟寒天中での腫瘍細胞の足場非依存
性増殖を亢進させる。（３）TIF−１はEGF受容体への結
合に対して拮抗しないが、それは軟寒天中での腫瘍細胞
の足場非依存性増殖に関するTGFの効果に対して拮抗的
である。同様の混合実験でTGFに換えてEGFを用いた場合
にも、同様の結果が観察された。

混合実験から得られた結果（第４表）によれば、生体
外の軟寒天検定においてTGFはTIF−１の効果を中和し得
るということが示された。第１図において、TGF活性を
含むプールＡにはTIF活性は検出されなかった。Mr18,00
0ないし20,000のTGFを含むプールＡをRP−HPLCで精製し
た場合、TIF活性はTGF活性と分離し、38ないし42％の間
のアセトニトリルで溶出することが観察された。プール
ＡのTGFはMr18,000ないし20,000のTIFの存在を明らかに
遮蔽していた。

第２表に示された如く、TIFは正常細胞の増殖を刺激
する。したがって、TIFはマイトジェンとなり得るし、
血清飢餓状態のマウス細胞のような静止期の細胞におい
てEGF受容体を介した相互作用によりDNA合成を刺激し得
るという可能性が研究の対象となった。EGFとTIF−１の
双方には、マウス細胞系NIHクローン７に対して実質的
にマイトジェン刺激能があることが分った。EGF受容体
が機能しないマウス細胞系NR6/6細胞を用いた同様な実
験によれば、EGFにはマイトジェン活性がないが、TIF−
１はマイトジェンとして作用することが示された。した
がって、増殖刺激性およびマイトジェン活性は、EGF受
容体を介して機能するのではないと考えられる。

要約すると、上記の事実から、何種類かの腫瘍増殖阻
害因子（TIF）はヒト腫瘍細胞系A673から産生され、バ
イオ・ゲルＰ−100ゲル濾過クロマトグラフィーから観
察されるところによれば、分子量が28,000、18,000ない
し22,000、10,000ないし16,000および5,000ないし10,00
0であることが考察し得る。TIF−１と称されるMr10,000
ないし16,000のTIFは部分的に精製されており、その特
性が決定された。TIF−１は酸および熱に安定なタンパ
クであることがわかった。またトリプシンおよびDTTに
より失活した。それは、様々な段階のヒト腫瘍細胞、ウ
イルスにより形質転換されたヒトおよびラット細胞並び
に正常アメリカミンク肺上皮細胞といった幅広い範囲の
細胞の増殖を阻害した。TIF−１は試験に用いられた様
々な正常ヒト線維芽細胞または上皮細胞のいずれの増殖
をも阻害しなかった。事実、TIF−１は様々な正常ヒト
線維芽および上皮細胞の増殖を刺激した。

混合実験（第６図および第４表）によれば、どのよう
に腫瘍細胞がTIFとTGF双方を産生し得るか、そしてさら
に癌の表現型を提示するかということが示唆される。TG
FよりもTIFをより多く産生する腫瘍細胞は、良性となり
得または退行し得るが、一方より進行性および転移性で
ある腫瘍細胞はTIFよりもTGFをより多く産生し得る。様
々なTGFおよびTIFの異常な産生は、結果として腫瘍を発
生し得る。したがって産生されるTIFとTGFの比がわかれ
ば、それが腫瘍細胞増殖程度の重要な決定要素として役
立ち得るであろう。TIFの体外からの投与は、正常細胞
に影響を与えずに腫瘍細胞の増殖を調節する非常に強力
な手段となり得る。

TIF−２の調製培養細胞培養細胞は、上記の如く10％FBS（ギブコ）を添加し
たダルベッコーの改良型イーグル培地（DMEM）の入った
75cm²組織培養フラスコ（ファルコン,3024）中で37℃に
て維持された。

TIFおよびTGFの原料ヒト横絞筋腫細胞系A673から得た血清を含まないコン
ディションド・メディウムを、上記のごとく処理し、1M
酢酸中でバイオ−ゲルＰ−100によりクロマトグラフィ
ーを行なった。

CM−セルロースによるクロマトグラフィー上記の方法によりバイオ−ゲルＰ−100カラムの何回
かの操作から得られた何本かのTGF活性のある分画を集
め、凍結乾燥した。そして1M酢酸5ml中で再調製し、5mM
酢酸アンモニウム（pH4.5）に対して４℃で一晩透析し
た。この試料を22℃にて175,000gで30分間遠心し、カル
ボキシメチル−セルロース（ワットマン、CM−23）のカ
チオン交換カラムに懸けた。溶出は、２つの容器から成
る定レベル装置〔第１番目の溶器には開始緩衝液（5mM
酢酸アンモニウム、pH4.5）200mlおよび第２番目の容器
には限定緩衝液（0.5M酢酸アンモニウム、pH6.8）を含
む〕からポンプで液を引出し（22℃で流出率80ml/時
間）直線濃度勾配をつけて行なった。複数の分画のアリ
コートを1M酢酸0.5mlを添加して滅菌し、試験前に凍結
乾燥した。

逆相高圧液体クロマトグラフィー（RP−HPLC） CM−セルロースカラムから得られたTIF−２の生物学
的活性部分を集め、凍結乾燥した。そして0.05％アセト
ニトリル1ml中に再懸濁し、カラムに懸ける前に1000gで
５分間遠心し不溶物質を取除いた。上清をウオーターズ
μボンドパークC₁₈カラム（0.39×30cm）に懸けた。ウ
オーターズ濃度勾配液体クロマトグラフィー装置を利用
し、カラムからの溶出液を波長可変UV検出装置で214nm
にて監視した。各分画からのアリコートを試験前に凍結
乾燥した。

軟寒天検定 A375Ag5細胞１×10⁴の懸濁液を凍結乾燥したTIF−２
および0.34％寒天（ディフコ、ノーブル）と混合し、10
％FBSを含んだDMEMで合計溶量0.94mlとした。それをた
だちに35mm組織培養シャーレの中の0.5％寒天基層の上
にピペットで播種した。細胞を５％CO₂/95％空気の加湿
した雰囲気中にて37℃で培養した。８日後顕微鏡写真を
撮った。

TIF検定試験細胞を二次培養し、TIF−２で処理して、上記の
如く¹²⁵IUdRの取込みを調べた。阻害と刺激を対照に対
するパーセントで表わした。

マイトジェン活性検定 NIHクローン７およびHuF細胞を、96穴組織培養板（ヌ
ンク167008）中の各穴あたり細胞密度１×10⁴で10％FBS
を含むDMEMに二次培養した。37℃で24時間培養の後、培
地をFBS0.1％を含むワイマウス培地と交換することによ
り72時間血清飢餓状態に維持した。細胞をTIF−２で処
理し、上記の如く¹²⁵IUdR取込みを調べた。

TGF検定 TGF活性は、上記の如く¹²⁵IUdR放射受容体結合検定に
よって拮抗能を調べることにより決定した。

実施例２ A673細胞から得た血清を含まないコンディションド・
メディウム30lを濃縮し、凍結乾燥しそして280mgのタン
パクを1M酢酸で抽出した。これを1M酢酸で平衡化したバ
イオ−ゲルＰ−100カラムに懸けた。２本置きの各分画
からアリコートを取り、TGFおよびTIF活性を測定した。
第７図に示す如く、腫瘍増殖阻害活性の主要ピークは分
子量10,000ないし16,000領域（プールＢ）および分子量
5,000ないし10,000（プールＣ）の領域に見出された。
分子量18,000ないし22,000の領域（プールＡ）には高い
阻害活性は認められなかったが、主なTGF活性を含んで
いた。

何回かのバイオ−ゲルＰ−100カラムから得たTGF分画
（プールＡ）を、さらにCM−セルロースクロマトグラフ
ィーにより精製した。この材料は元をただせば227lのコ
ンディションド・メディウムに由来した。これらを集め
てCMセルロースカラム（第８図）に懸けた。合計タンパ
ク量は85mgであった。１本おきの分画からのアリコート
のTGF活性およびTIF活性を測定した。このカラムの溶出
模様によれば、阻害活性の大きなピークはTGF活性ピー
クと分離し得たので、恐らくTGFはTIF活性を遮蔽してい
たことが示唆される。TIF活性のピークとして表わされ
る斜線部分を集め、凍結乾燥し、アセトニトリルの直線
濃度勾配をかけて逆相ウオーターズμボンドパークC₁₈
カラムによる再クロマトグラフィーを行なった。次のよ
うな溶出手順を踏んだ。すなわち、まず0.05％トリフル
オロ酢酸中のアセトニトリル０ないし25％の直線濃度勾
配15分、続いて0.05％トリフルオロ酢酸中のアセトニト
リル25ないし45％の直線濃度勾配80分、さらに続けて0.
05％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル45ないし100
％の直線濃度勾配15分。これを第９図に示す。各分画を
凍結乾燥し、TIF活性を測定した。TIF活性を含む主要ピ
ークはアセトニトリル38ないし42％の間で溶出した。TI
F−１はアセトニトリル28ないし33％の間で溶出するこ
とが前に確められている。TIF−２をプロパノールの直
線濃度勾配によるHPLCでさらに精製し得た。TIF−１は
２−プロパノール19ないし21％の間で溶出することが確
められているが、一方TIF−２は２−プロパノール29な
いし31％の間で溶出した。

TIF−２の特性 A375Ag5細胞をTIF−２（64μg/ml）で処理し、８日後
に顕微鏡写真を撮った。第10図に示すごとく、未処理細
胞は一般に概略100ないし200の細胞を含む直径0.5ない
し1mmの範囲の大きさまで増殖した。これらの細胞を、C
M−セルロースで精製したTIF−２で処理した場合、コロ
ニーの大きさは著しく減少した。処理後最初の数日で小
さなコロニーが認められたが、典型的には３週間後でさ
えも増殖の回復は認められなかった。細胞は生きていた
ので、TIF−２には細胞毒性はなかった。CM−セルロー
スクロマトグラフィーからHPLCへの精製レベルは、第５
表に示された如く125倍であった。各精製段階からの物
質のTIF活性を測定した。¹²⁵IUdRの取込みを、A549細胞
と正常ヒト線維芽細胞系HuFとを用いて測定した。両試
料においてA549細胞は阻害を、HuF細胞は刺激を受け
た。TIF−１は正常線維芽細胞の増殖を刺激し、マイト
ジェンとしての作用も発揮したので、TIF−２を正常マ
ウス細胞（NIHクローン７）およびHuF細胞を用いてマイ
トジェン検定にかけた。血清飢餓状態の細胞に試験する
因子を添加し、同時に24時間¹²⁵IUdRを加えて検定し
た。54μg/mlのTIF−２処理による細胞は、10％FBSを含
む細胞よりもかなり高レベルの¹²⁵IUdRを取込んだ。ヒ
ト線維芽細胞で同一濃度のTIF−２処理を行なった場
合、10％FBSを含む場合と同じような取込みレベルを示
した。TIF−２はマウスNIHクローン７細胞において500n
g/ml程度の低濃度でさえも強力なマイトジェンとなりう
ることが判明した。他方TIF−１のマイトジェン活性は2
0ng/ml程度の低濃度で誘起され得た。

TIFのインターフェロン活性を、メロイ・ラバラトリ
ーズ社（ヴァージニア州、スプリングフィールド）で行
なわれている抗ウイルスインターフェロン検定法に基づ
いて測定した。そして何種かの白血球インターフェロン
（PIFロットＰ−321）を、A549細胞を使った本発明の腫
瘍増殖阻害検定法により試験した。白血球インターフェ
ロンは、TIF検定（25％阻害）において3IU/mlで検出さ
れ得た。3IU/mlのインターフェロンと同様の阻害を示す
100倍濃度のTIF−２を抗ウイルス検定で試験したが結果
は陰性であった。これにより、TIF−２には抗ウイルス
活性がなく、したがってそれはインターフェロンではな
いことが分かった。

TIF−１のところで記載したように、HPLCで精製したT
IF−２のトリプシン感受性を調べた。それはトリプシン
感受性を示さなかった。TIF−２（13μg/ml、HPLCで精
製）のアリコートを56℃30分間、別のアリコートを100
℃３分熱処理した。対照は室温で放置した。それぞれを
凍結乾燥し、それぞれの腫瘍増殖阻害活性を、試験細胞
としてA549を用いて調べた。活性は50℃では安定であっ
たが、100℃では不安定で阻害度が53％から35％におち
た。

様々な正常および腫瘍細胞を使って、¹²⁵IUdRの取込
みに関するTIF−２の影響を試験した。試験したヒト線
維芽細胞のすべては刺激された。さらに継代回数の少な
いヒト胎児腎細胞系も同様に刺激された。上皮細胞のみ
を、この培養中に認めることができた。これに反して試
験したすべてのヒト腫瘍細胞では様々な阻害が認められ
た。A549およびA673に関して継代回数の多少により阻害
程度の差が見られるように、組織培養における継代の回
数がいくらか阻害程度の変化の原因となっているのかも
しれない。腫瘍が初期培養に近いほど、TIF−２による
阻害に対しての感受性がより強い。乳癌細胞系、MCF−
７およびA549はよく試験細胞として用いられるが、TIF
−２に対して最も強い感受性を有することが観察され
た。正常アメリカミンク肺細胞系はTIF−１によりきわ
めて阻害されやすいことが示されている。反対にTIF−
２はアミリカミンク細胞にはほとんど、あるいは全く効
果を発揮しなかった。

TIF−２に対する感受性に関してSV40ウイルス形質転
換の効果を検討した。ヒト胎児肺細胞Wi−38（CCL75）
およびそれのSV40により形質転換された細胞（CCL75.
1）の両方についてTIF−２処理後、¹²⁵IUdRの取込みを
調べた。Wi−38細胞は刺激（11％）され、Wi−38のSV40
形質転換型細胞は阻害（24％）された。同じ効果がTIF
−１についても見られ、それによれば形質転換された表
現型が、TIFによる阻害に要求されるかもしれないとい
うことが強く支持される。ヒト黒色腫クローン系A375Ag
5およびA375Ag5のTIF−１耐性変異型細胞系（A375Ag5−
IRと称す）を用いて、阻害因子とインターフェロンにつ
いての比較を行なった（第７表）。この細胞系を得るた
めに24穴板に単層で生育しているA375Ag5細胞（１×1
0⁴）をTIF−１の活性分画で処理した。その分画はA673
のコンディションド・メディウムをバイオ−ゲルＰ−10
0カラムに懸けて得られたものである。細胞を一度処理
したが因子は細胞中で10日間残存していた。処理した細
胞は体積を増し、より丸くなり、もはや培養板に接着し
なくなった。これら処理細胞をファルコンの組織培養フ
ラスコ（3013）に移した。細胞は結局定着し、単層状態
で増殖した。単層で数回継代すると、この細胞系は親細
胞系A375Ag5と同じくらい速く増殖した。両細胞系を軟
寒天中に播種すると、A375Ag5は軟寒天中で増殖し直径
0.5ないし1.0mm範囲のコロニーを形成した。ところがA3
75Ag5−IR変異細胞系は軟寒天中でほとんど増殖せず、
コロニーも３ないし５個しか生じなかった。これらの両
細胞系を、腫瘍増殖阻害検定法により試験した。第７表
で明らかなように、親細胞系A375Ag5はTIF−1,TIF−２
および部分的に精製されたインターフェロンにより阻害
を受けた。変異細胞系A375Ag5−IRはTIF−２およびイン
ターフェロンによる阻害には適当な感受性を示したが、
TIF−１に対する感受性を欠いていた。このことによ
り、阻害因子は２種類あり、様々な細胞に対して応答が
異なることが証明された。

さらに、阻害活性に関するTIF−１とTIF−２との間の
差異を第８表のデータによって示す。

TIF−２およびTIF−１は両方ともヒト横絞筋腫細胞系
A673からのコンディションド・メディウムから得られ
た。TIF−２はバイオ−ゲルＰ−100およびCM−セルロー
スクロマトグラフィーにより部分的に精製された。TIF
−１はバイオ−ゲルＰ−100クロマトグラフィーにより
部分的に精製された。試験細胞にはヒト肺腺癌A549およ
び正常アメリカミンク肺細胞を使用した。阻害度は、腫
瘍増殖阻害検定により対照のパーセント（¹²⁵IUdR取込
率）として表わした。

TIF−１とTIF−２を区別する特徴上記のようなTIF−１は、バイオ−ゲルＰ−100カラム
による分子量10,000ないし16,000の領域から単離され、
TIF−２活性はMr18,000ないし22,000のところに見出さ
れる。

TIFとTIF−２双方とも、軟寒天中で試験される多数の
ヒト腫瘍細胞および上記の単層培養細胞の増殖を阻害す
る。しかしながら、TIFによる阻害に対する腫瘍細胞の
感受性は、細胞の型、組織培養における継代および試験
されるTIFの種類に応じて異なっている。単層培養では
両TIFは正常ヒト線維芽細胞および正常ヒト胎児腎細胞
を刺激する。

両TIFはその活性が濃度依存性であって、酸および熱
に安定な低分子量因子である。TIFの阻害活性は、その
因子が処理後１時間以内に細胞から除かれれば、可逆的
である。TIF−１はトリプシンに感受性を示す。一方TIF
−２は、その分子量およびそのTIF−１との多くの類似
特性から推すとタンパクであると言えるが、トリプシン
に感受性を示さない。

TIF−１およびTIF−２は、それらが由来する材料であ
るA673細胞の増殖を阻害し得る。この癌細胞系は、様々
な形質転換増殖因子（TGF）、および対照腫瘍細胞に拮
抗的に作用することが予測される少なくとも２種類の腫
瘍増殖阻害因子を産生する。

TIF−１とTIF−２を区別するいくつかの特徴を要約
し、第９表に揚げる。

本発明のTIFの用途の中には、腫瘍増殖を阻害するま
たは正常細胞の増殖を刺激するTIF量と薬理学的に許容
し得る担体およびアジュバントから成る薬剤組成物のよ
うな製剤等が、当然のこととして含まれる。そのような
薬剤組成物は、当該分野で周知の方法を使って調製し得
る。同様に、本発明の物質の利用法の中には、腫瘍細胞
の増殖を阻害する方法も含まれる。その方法の特徴は、
転移しやすい腫瘍のあるまたはそれを注入された宿主
に、その物質を腫瘍の阻害に足る量だけ投与することで
ある。その物質の投与形態および方法は、例えば錠剤、
溶液、懸濁、ペースト、腹腔内、皮下等いかなるもので
あっても可能と言えよう。本発明に基ずいて、創傷を治
療する方法も、含まれるが、それは創傷部位にTIFを治
癒に足る量だけ投与することを特徴とする。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト横絞筋腫からのコンディションド・メディ
ウムを濃縮し、バイオ−ゲルＰ−100クロマトグラフィ
ーに懸けて溶出させた分画の活性を示すグラフ図、第２
図はヒト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖に対するTIFの効
果を示す顕微鏡写真図、第３図は第１図のプールＢをバ
イオ−ゲルＰ−10クロマトグラフィーに懸けて溶出させ
た分画の活性を示すグラフ図、第４図は第１図のプール
Ｂをバイオ−ゲルＰ−100クロマトグラフィーに懸けて
溶出させた分画の活性を示すグラフ図、第５図はμボン
ダパークC₁₈カラム（0.39×30cm）を用い20プロパノー
ルで溶出させてTIF−１を精製したとき得られる分画の
活性を示すグラフ図、第６図は同一コンディションド・
メディウムに由来するTIF−１とTGFとの間の拮抗関係を
示す顕微鏡写真図、第７図は横絞筋腫細胞系A673からの
コンディションド・メディウムをバイオ−ゲルＰ−100
カラムに懸けて溶出させた分画の活性を示すグラフ図、
第８図は第７図のバイオ−ゲルＰ−100カラム操作を行
なって得られたTGF活性のあるプールＡを集めてCM−セ
ルロースクロマドグラフィーに懸けて溶出させた分画の
活性を示すグラフ図、第９図はCM−セルロースを用いて
精製したTIF−２をRP−HPLCに懸けて溶出させた分画の
活性を示すグラフ図、第10図は軟寒天中でのヒト黒色腫
細胞A375Ag5の増殖に対するTIF−２の効果を示す顕微鏡
写真図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ケネス・ケー・イワタアメリカ合衆国，ニユーヨーク州 11590，ウエストベリー，ナンバー３, サウス・グランド・ストリート 100 (56)参考文献米国特許4261976（ＵＳ，Ａ) 欧州特許公開100641（ＥＰ，Ａ１)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】軟寒天中で、正常ラットの腎臓NRK−49F細
胞のTGF依存性増殖を阻害せず、抗ウイルス効果を発現
させず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を有し、更に以
下の性質、即ち（イ）分子量が10,000ないし16,000の範囲であり、（ロ）４℃で1M酢酸に安定であり、（ハ）約56℃で約30分の熱処理に対して安定であり、（ニ）CCL−64正常ミンク肺細胞を阻害し、及び（ホ）ヒト正常繊維芽細胞の増殖を刺激する、という性質を備えた、実質的に精製されたポリペプチド
腫瘍増殖阻害因子１。
【請求項２】前記腫瘍増殖阻害因子１が、更に以下の性
質、即ち（イ）100℃で３分間の熱処理に対して安定であり、（ロ）等電点が４から８の範囲にあり、（ハ）高速液体クロマトグラフィー（μbondapak C₁₈カ
ラム）にて２−プロパノールで約19から21％、又はアセ
トニトリルで約28から33％の濃度勾配で溶出し、（ニ）ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、（ホ）トリプシン感受性であり、（ヘ）細胞分裂誘起活性を有し、及び、（ト）インターフェロン活性が陰性である、という性質を備えた、特許請求の範囲第１項に記載の腫
瘍増殖阻害因子１。
【請求項３】軟寒天中で、正常ラットの腎臓NRK−49F細
胞のTGF依存性増殖を阻害せず、抗ウイルス効果を発現
させず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を有し、更に以
下の性質、即ち（イ）分子量が10,000ないし16,000の範囲であり、（ロ）４℃で1M酢酸に安定であり、（ハ）約56℃で約30分の熱処理に対して安定であり、（ニ）CCL−64正常ミンク肺細胞を阻害し、及び（ホ）ヒト正常繊維芽細胞の増殖を刺激する、という性質を備えた、実質的に精製されたポリペプチド
腫瘍増殖阻害因子１の調製方法であって、（イ）前記腫瘍増殖阻害因子１を調製するために適した
細胞系を培養し、（ロ）前記腫瘍細胞増殖因子１を水系酸性溶媒又は有機
溶媒で抽出し、及び（ハ）前記腫瘍細胞増殖阻害因子１を精製及び単離する
こと、を具備した腫瘍増殖阻害因子１の調製方法。
【請求項４】特許請求の範囲第３項に記載の腫瘍増殖阻
害因子１の製造方法であって、前記腫瘍増殖阻害因子１
が、更に以下の性質、即ち（イ）100℃で３分間の熱処理に対して安定であり、（ロ）等電点が４から８の範囲にあり、（ハ）高速液体クロマトグラフィー（μbondapak C₁₈カ
ラム）にて２−プロパノールで約19から21％、又はアセ
トニトリルで約28から33％の濃度勾配で溶出し、（ニ）ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、（ホ）トリプシン感受性であり、（ヘ）細胞分裂誘起活性を有し、及び、（ト）インターフェロン活性が陰性である、という性質を備えた製造方法。
【請求項５】軟寒天中で、正常ラットの腎臓NRK−49F細
胞のTGF依存性増殖を阻害せず、抗ウイルス効果を発現
させず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を有し、更に以
下の性質、即ち（イ）分子量が10,000ないし16,000の範囲であり、（ロ）４℃で1M酢酸に安定であり、（ハ）約56℃で約30分の熱処理に対して安定であり、（ニ）CCL−64正常ミンク肺細胞を阻害し、及び（ホ）ヒト正常繊維芽細胞の増殖を刺激する、という性質を備えた、実質的に精製されたポリペプチド
腫瘍増殖阻害因子１の腫瘍阻害量、及び薬剤として許容
しうる担体又はアジュバンドから成る、哺乳動物におい
て腫瘍細胞の増殖性を阻害するための薬剤組成物。
【請求項６】特許請求の範囲第５項に記載の薬剤組成物
であって、前記腫瘍増殖阻害因子１が、更に以下の性
質、即ち（イ）100℃で３分間の熱処理に対して安定であり、（ロ）等電点が４から８の範囲にあり、（ハ）高速液体クロマトグラフィー（μbondapak C₁₈カ
ラム）にて２−プロパノールで約19から21％、又はアセ
トニトリルで約28から33％の濃度勾配で溶出し、（ニ）ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、（ホ）トリプシン感受性であり、（ヘ）細胞分裂誘起活性を有し、及び、（ト）インターフェロン活性が陰性である、という性質を備えた薬剤組成物。