JP2784272B2 - 腫瘍細胞増殖阻害因子 - Google Patents
腫瘍細胞増殖阻害因子Info
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- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な腫瘍細胞増殖阻害
因子に関する。更に詳細には、３Ｔ３細胞由来株化細胞
の培養上清から得ることができ、腫瘍細胞の増殖を阻害
する作用を有する新規な腫瘍細胞増殖阻害因子に関す
る。
因子に関する。更に詳細には、３Ｔ３細胞由来株化細胞
の培養上清から得ることができ、腫瘍細胞の増殖を阻害
する作用を有する新規な腫瘍細胞増殖阻害因子に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来、抗腫瘍剤として化学療法剤、免疫
療法剤などの合成医薬品が広く用いられているが、一般
に特異性が低く副作用が強いなどの問題がある。これに
対して、組織培養細胞から多くの腫瘍細胞増殖阻害因子
が見出されておりこれらの因子は特異性が高く、副作用
が低い抗腫瘍剤になり得ると考えられている。このよう
な物質としては、例えばインターフェロン、リンフォト
キシン、ガン壊死因子（ＴＮＦ）などが広く知られてい
る。また最近では、ヒト由来の線維芽細胞から得られる
腫瘍細胞障害因子（特開平１−１４８１９７号公報）、
ヒト由来肺癌細胞から得られる腫瘍細胞増殖抑制因子
（特開平１−１８７０９４号公報）などが報告されてい
る。
療法剤などの合成医薬品が広く用いられているが、一般
に特異性が低く副作用が強いなどの問題がある。これに
対して、組織培養細胞から多くの腫瘍細胞増殖阻害因子
が見出されておりこれらの因子は特異性が高く、副作用
が低い抗腫瘍剤になり得ると考えられている。このよう
な物質としては、例えばインターフェロン、リンフォト
キシン、ガン壊死因子（ＴＮＦ）などが広く知られてい
る。また最近では、ヒト由来の線維芽細胞から得られる
腫瘍細胞障害因子（特開平１−１４８１９７号公報）、
ヒト由来肺癌細胞から得られる腫瘍細胞増殖抑制因子
（特開平１−１８７０９４号公報）などが報告されてい
る。
【０００３】一方、Ｓｗｉｓｓマウス胎児から得た細胞
から樹立された線維芽細胞様細胞株３Ｔ３細胞からもい
くつかの細胞増殖阻害因子が単離されている。即ち、例
えば、Ｎａｔｒａｊらは静止期の３Ｔ３細胞の細胞表層
から増殖阻害因子が得られることを報告しており〔Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，６
１１５−６１１９（１９７８）〕、またＨａｒｅｌら
は、３Ｔ３細胞の培養上清から分子量４０ｋＤａの増殖
阻害因子が得られることを報告している〔Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１９，１０１−１０６（１９
８４）；ｉｂｉｄ．，１２３，１３９−１４３（１９８
５）〕。しかしながらこれらの増殖阻害因子はいずれも
腫瘍細胞に対しては有意な阻害活性を示さないことが知
られている。
から樹立された線維芽細胞様細胞株３Ｔ３細胞からもい
くつかの細胞増殖阻害因子が単離されている。即ち、例
えば、Ｎａｔｒａｊらは静止期の３Ｔ３細胞の細胞表層
から増殖阻害因子が得られることを報告しており〔Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，６
１１５−６１１９（１９７８）〕、またＨａｒｅｌら
は、３Ｔ３細胞の培養上清から分子量４０ｋＤａの増殖
阻害因子が得られることを報告している〔Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１９，１０１−１０６（１９
８４）；ｉｂｉｄ．，１２３，１３９−１４３（１９８
５）〕。しかしながらこれらの増殖阻害因子はいずれも
腫瘍細胞に対しては有意な阻害活性を示さないことが知
られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、３Ｔ３細胞
由来株化細胞の培養上清から得ることのできる蛋白質で
あって、腫瘍細胞の増殖を阻害する作用を有する新規な
腫瘍細胞増殖阻害因子を提供することを目的とする。
由来株化細胞の培養上清から得ることのできる蛋白質で
あって、腫瘍細胞の増殖を阻害する作用を有する新規な
腫瘍細胞増殖阻害因子を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、３Ｔ３
細胞由来株化細胞の培養上清から得ることができる蛋白
質であり、以下の性質を有する腫瘍細胞増殖阻害因子が
提供される： (a) 分子量 還元および非還元条件下におけるＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による測定で、３，７００±３７０
ダルトン； (b) カラム特性 pH約７．４で陰イオン交換樹脂カラムに実質的に吸着せ
ず、pH約５．０で陽イオン交換樹脂カラムに実質的に吸
着する； (c) 生理活性 少なくとも、ヒト前骨髄性白血病細胞及びヒト子宮頸癌
由来細胞の増殖を阻害する活性を有する。
細胞由来株化細胞の培養上清から得ることができる蛋白
質であり、以下の性質を有する腫瘍細胞増殖阻害因子が
提供される： (a) 分子量 還元および非還元条件下におけるＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による測定で、３，７００±３７０
ダルトン； (b) カラム特性 pH約７．４で陰イオン交換樹脂カラムに実質的に吸着せ
ず、pH約５．０で陽イオン交換樹脂カラムに実質的に吸
着する； (c) 生理活性 少なくとも、ヒト前骨髄性白血病細胞及びヒト子宮頸癌
由来細胞の増殖を阻害する活性を有する。
【０００６】本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子は以下のよ
うにして得ることができる。
うにして得ることができる。
【０００７】３Ｔ３細胞由来株化細胞の調製 Ｓｗｉｓｓマウス胎児から得られる細胞から樹立された
線維芽細胞様細胞株３Ｔ３細胞の１種である例えばＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞〔Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４，５４９（１９６
９）〕から調製することができる。即ち、例えばＮＩＨ
３Ｔ３細胞を、ダルベッコ改変ＭＥＭ〔Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，８，３９６（１９５９）〕とＨａｍＦ−１２〔Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５３，２８８（１
９６５）〕との混合培養液であるＤＦ培養液に血清を添
加して継代培養し、次いでインスリンなどのホルモンを
含むＤＦ培養液で培養して増殖するクローンを得、この
クローンを更にＤＦ培養液のみで培養し増殖するクロー
ンを得ることにより、目的とする３Ｔ３細胞由来株化細
胞を調製することができる。
線維芽細胞様細胞株３Ｔ３細胞の１種である例えばＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞〔Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４，５４９（１９６
９）〕から調製することができる。即ち、例えばＮＩＨ
３Ｔ３細胞を、ダルベッコ改変ＭＥＭ〔Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，８，３９６（１９５９）〕とＨａｍＦ−１２〔Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５３，２８８（１
９６５）〕との混合培養液であるＤＦ培養液に血清を添
加して継代培養し、次いでインスリンなどのホルモンを
含むＤＦ培養液で培養して増殖するクローンを得、この
クローンを更にＤＦ培養液のみで培養し増殖するクロー
ンを得ることにより、目的とする３Ｔ３細胞由来株化細
胞を調製することができる。
【０００８】培養上清の調製 ３Ｔ３細胞由来株化細胞を、最初に血清を含むＤＦ培養
液で培養し、細胞がコンフルエンスに達した時点で培養
液を除去し、更に一定期間血清を含まないＤＦ培養液で
培養後、この培養液を除去する。次いで、血清を含まな
いＤＦ培養液で、例えば、約９６時間から約１２０時間
培養し、約９６時間から約１２０時間毎に培養液を新鮮
な培養液に交換することによって、培養上清を収集す
る。収集した培養上清を遠心分離することにより培養上
清を調製することができる。
液で培養し、細胞がコンフルエンスに達した時点で培養
液を除去し、更に一定期間血清を含まないＤＦ培養液で
培養後、この培養液を除去する。次いで、血清を含まな
いＤＦ培養液で、例えば、約９６時間から約１２０時間
培養し、約９６時間から約１２０時間毎に培養液を新鮮
な培養液に交換することによって、培養上清を収集す
る。収集した培養上清を遠心分離することにより培養上
清を調製することができる。
【０００９】腫瘍細胞増殖阻害因子の精製 培養上清を、限外濾過に付して分子量分画を行い濃縮す
る。次いで必要に応じて塩析、透析に付す。
る。次いで必要に応じて塩析、透析に付す。
【００１０】次いで、活性成分を含有する適当なバッフ
ァー溶液を、Ｑ−セファロースカラム（ファルマシ
ア）、ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア）などの
陰イオン交換樹脂カラムに付して部分精製する。本発明
の腫瘍細胞増殖阻害因子はpH７．４で陰イオン交換樹脂
カラムに実質的に吸着しない特性を有する。従ってpH約
７．４で陰イオン交換樹脂カラムに付し非吸着画分を採
集することにより部分精製された因子が得られる。
ァー溶液を、Ｑ−セファロースカラム（ファルマシ
ア）、ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア）などの
陰イオン交換樹脂カラムに付して部分精製する。本発明
の腫瘍細胞増殖阻害因子はpH７．４で陰イオン交換樹脂
カラムに実質的に吸着しない特性を有する。従ってpH約
７．４で陰イオン交換樹脂カラムに付し非吸着画分を採
集することにより部分精製された因子が得られる。
【００１１】本発明の因子は、pH約５．０で陽イオン交
換樹脂カラムに実質的に吸着する。従って、pH約５．０
で、Ｓ−セファロースカラム（ファルマシア）、ＣＭセ
ファロースカラム（ファルマシア）、ＴＳＫ gel ＣＭ
−３ＳＷ（東洋ソーダ）などの陽イオン交換樹脂カラム
に付し吸着画分を採集することにより更に精製された因
子が得られる。尚、上記した陰イオン及び陽イオン交換
樹脂カラムによる精製は、必要に応じて適宜それらの精
製順序を変えることもできる。
換樹脂カラムに実質的に吸着する。従って、pH約５．０
で、Ｓ−セファロースカラム（ファルマシア）、ＣＭセ
ファロースカラム（ファルマシア）、ＴＳＫ gel ＣＭ
−３ＳＷ（東洋ソーダ）などの陽イオン交換樹脂カラム
に付し吸着画分を採集することにより更に精製された因
子が得られる。尚、上記した陰イオン及び陽イオン交換
樹脂カラムによる精製は、必要に応じて適宜それらの精
製順序を変えることもできる。
【００１２】次いで、更に、ヒドロキシアパタイトカラ
ムなどを用いた吸着クロマトグラフィー；ＴＳＫ gel
ＣＭ−３ＳＷ、Ｐｅｎｙｌ １５ＰＷ−ＲＰ逆相カラム
などを用いた高速液体クロマトグラフィー等に適宜付す
ことによって高純度に精製された本発明の腫瘍細胞増殖
阻害因子が得られる。
ムなどを用いた吸着クロマトグラフィー；ＴＳＫ gel
ＣＭ−３ＳＷ、Ｐｅｎｙｌ １５ＰＷ−ＲＰ逆相カラム
などを用いた高速液体クロマトグラフィー等に適宜付す
ことによって高純度に精製された本発明の腫瘍細胞増殖
阻害因子が得られる。
【００１３】腫瘍細胞増殖阻害因子の特性 以下に本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子の特性について説
明する。
明する。
【００１４】(a) 分子量 還元および非還元条件下におけるＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による測定で、３，７００±３７０
ダルトンの分子量を示す。還元および非還元条件下にお
いて、分子量に変化がないことから１本鎖の構造を有す
る蛋白質である。
ミドゲル電気泳動法による測定で、３，７００±３７０
ダルトンの分子量を示す。還元および非還元条件下にお
いて、分子量に変化がないことから１本鎖の構造を有す
る蛋白質である。
【００１５】(b) カラム特性 前記したように、pH約７．４で陰イオン交換樹脂カラム
に実質的に吸着せず、他方、pH約５．０で陽イオン交換
樹脂カラムに実質的に吸着する、という特性を有する。
に実質的に吸着せず、他方、pH約５．０で陽イオン交換
樹脂カラムに実質的に吸着する、という特性を有する。
【００１６】(c) 生理活性 ＨＬ−６０などのヒト前骨髄性白血病細胞、及びＨｅＬ
ａ細胞などのヒト子宮頸癌由来細胞に対して少なくとも
増殖阻害活性を有する。従って、本発明の因子は、白血
病、あるいは子宮癌などの固型癌の治療に有用である。
ａ細胞などのヒト子宮頸癌由来細胞に対して少なくとも
増殖阻害活性を有する。従って、本発明の因子は、白血
病、あるいは子宮癌などの固型癌の治療に有用である。
【００１７】（ｄ） アミノ酸配列 気相プロテインシークエンサーを用いた自動エドマン分
解法による解析の結果、以下に示す２つのアミノ酸配列
〔（Ｐ−１）及び（Ｐ−２）〕のうちのいずれかのアミ
ノ酸配列を有する。
解法による解析の結果、以下に示す２つのアミノ酸配列
〔（Ｐ−１）及び（Ｐ−２）〕のうちのいずれかのアミ
ノ酸配列を有する。
【表３】
【表４】
【００１８】
【発明の効果】３Ｔ３細胞由来株化細胞の培養上清から
新規な蛋白である腫瘍細胞増殖阻害因子が得られる。こ
の因子は、ヒト前骨髄性白血病細胞、ヒト子宮頸癌由来
細胞等の増殖を有意に阻害する活性を有する。従って、
白血病あるいは子宮癌などの固型癌等の治療剤として有
用である。
新規な蛋白である腫瘍細胞増殖阻害因子が得られる。こ
の因子は、ヒト前骨髄性白血病細胞、ヒト子宮頸癌由来
細胞等の増殖を有意に阻害する活性を有する。従って、
白血病あるいは子宮癌などの固型癌等の治療剤として有
用である。
【００１９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。 実施例
【００２０】１．３Ｔ３細胞由来株化細胞の調製 ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０％牛胎児血清を含むＤＦ培養液
（ダルベッコウ改変ＭＥＭ：ＨａｍＦ−１２＝１：１）
で継代培養した後、インスリン５μｇ／ml、トランスフ
ェリン５μ／ml、セレン酸塩 ２×１０-8Ｍを含むＤＦ
培養液で培養し、増殖するクローンを得た。
（ダルベッコウ改変ＭＥＭ：ＨａｍＦ−１２＝１：１）
で継代培養した後、インスリン５μｇ／ml、トランスフ
ェリン５μ／ml、セレン酸塩 ２×１０-8Ｍを含むＤＦ
培養液で培養し、増殖するクローンを得た。
【００２１】さらに、このクローンより、ＤＦ培養液の
みで増殖するクローンを得、継代培養して株化した。得
られた株化細胞をＮＩＨ３Ｔ３−ｓｆと命名した。培養
は、３７℃、５％ＣＯ2 の気相下で行った。培養液は３
日毎に７０％の新鮮培養液を交換する方法で行った。継
代は、培養細胞が、サブコンフルエンスに達した時点で
２倍に希釈する方法で行なった。培養液は、コンディシ
ョン メディウム５０％、新鮮培養液５０％の比率の培
養液を調整して用いた。
みで増殖するクローンを得、継代培養して株化した。得
られた株化細胞をＮＩＨ３Ｔ３−ｓｆと命名した。培養
は、３７℃、５％ＣＯ2 の気相下で行った。培養液は３
日毎に７０％の新鮮培養液を交換する方法で行った。継
代は、培養細胞が、サブコンフルエンスに達した時点で
２倍に希釈する方法で行なった。培養液は、コンディシ
ョン メディウム５０％、新鮮培養液５０％の比率の培
養液を調整して用いた。
【００２２】 ２．ＮＩＨ３Ｔ３−ｓｆ細胞の無血清培養上清の調整 ＮＩＨ３Ｔ３−ｓｆ細胞を、１０％牛胎児血清含有ＤＦ
培養液を用い培養した。細胞がコンフルエンスに達した
時点で、この培養液を、除去し、ＰＢＳ（−）で１回洗
浄した後、ＤＦ培養液で４８時間培養した。この培養液
を除去し、新たにＤＦ培養液で９６時間から１２０時間
培養した。９６時間から１２０時間毎に培養液を交換し
１００Ｌ収集した。収集した培養液は、遠心分離（２０
００回転×１０分間）を行ない上清を回収した。
培養液を用い培養した。細胞がコンフルエンスに達した
時点で、この培養液を、除去し、ＰＢＳ（−）で１回洗
浄した後、ＤＦ培養液で４８時間培養した。この培養液
を除去し、新たにＤＦ培養液で９６時間から１２０時間
培養した。９６時間から１２０時間毎に培養液を交換し
１００Ｌ収集した。収集した培養液は、遠心分離（２０
００回転×１０分間）を行ない上清を回収した。
【００２３】３．精製 1) Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィー 回収した培養上清１００Ｌをペリコンカセットシステム
（限外濾過膜システム、分画分子量１０００）を用い
て、約５０倍に濃縮した。さらに９０％硫安飽和により
塩析し、８０００×ｇで６０分間遠心した沈澱を２０mM
トリス・ＨＣｌバッファー（pH７．４）に溶解し、同バ
ッファーに対し透析した。次に、予め同バッファーで平
衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア）（φ
５cm×5 cm）に添加し非吸着画分及び洗浄画分を集め
た。
（限外濾過膜システム、分画分子量１０００）を用い
て、約５０倍に濃縮した。さらに９０％硫安飽和により
塩析し、８０００×ｇで６０分間遠心した沈澱を２０mM
トリス・ＨＣｌバッファー（pH７．４）に溶解し、同バ
ッファーに対し透析した。次に、予め同バッファーで平
衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア）（φ
５cm×5 cm）に添加し非吸着画分及び洗浄画分を集め
た。
【００２４】 溶出条件は以下の通りである。 流速 ８ml／min 分画 ２ml／tube 溶離液 ２０mMトリス．ＨＣｌバッファー（pH７．
４）
４）
【００２５】 2) Ｓ−セファロースカラムクロマトグラフィー 非吸着画分のpHを酢酸で５．０に調整し、２０mM酢酸バ
ッファー（pH５．０）で平衡化したＳ−セファロースカ
ラム（ファルマシア）（φ２．５cm×６cm）に添加し
た。活性成分は吸着し、次いで、２０mMトリス．ＨＣｌ
バッファー（pH７．４）を用いて溶出することで活性画
分を得た。
ッファー（pH５．０）で平衡化したＳ−セファロースカ
ラム（ファルマシア）（φ２．５cm×６cm）に添加し
た。活性成分は吸着し、次いで、２０mMトリス．ＨＣｌ
バッファー（pH７．４）を用いて溶出することで活性画
分を得た。
【００２６】 溶出条件は以下の通りである。 流速 ０．８５ml／min 分画 ４ml／tube 溶離液 ２０mMトリス．ＨＣｌバッファー（pH７．
４）
４）
【００２７】3) ヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフィー ＦＰＬＣＳ−セファロースカラムより溶出
された活性画分を酢酸でpH６．０に調整し、予め２０mM
酢酸バッファー（pH６．０）で平衡化したヒドロキシア
パタイトカラム（ペンタックスφ７．５mm×１０cm 旭
光学）に注入し、非吸着画分を集めた。
グラフィー ＦＰＬＣＳ−セファロースカラムより溶出
された活性画分を酢酸でpH６．０に調整し、予め２０mM
酢酸バッファー（pH６．０）で平衡化したヒドロキシア
パタイトカラム（ペンタックスφ７．５mm×１０cm 旭
光学）に注入し、非吸着画分を集めた。
【００２８】 溶出条件は以下の通りである。 流速 １ml／min 分画 １ml／tube 溶離液 ２０mM酢酸バッファー（pH６．０）
【００２９】4) ＴＳＫｇｅｌＣＭ−３ＳＷ カラムク
ロマトグラフィーＨＰＬＣ活性画分を酢酸でpH５．０に
調整し、予め５％アセトニトリル（ＣＨ3 ＣＮ）含有２
０mM酢酸バッファー（pH５．０）で平衡化したＴＳＫｇ
ｅｌＣＭ−３ＳＷカラム（φ７．５mm×７．５cm 東ソ
ー）に注入した。溶出条件は以下の通りである。
ロマトグラフィーＨＰＬＣ活性画分を酢酸でpH５．０に
調整し、予め５％アセトニトリル（ＣＨ3 ＣＮ）含有２
０mM酢酸バッファー（pH５．０）で平衡化したＴＳＫｇ
ｅｌＣＭ−３ＳＷカラム（φ７．５mm×７．５cm 東ソ
ー）に注入した。溶出条件は以下の通りである。
【００３０】 流速 １ml／min 分画 １ml／tube A) ２０／mM酢酸バッファー（pH５．０）／５％ＣＨ3
ＣＮ B) ２０／mM酢酸バッファー（pH５．０）／５％ＣＨ3
ＣＮ／０．２ＭＮａＣＬ Ａ−−＞Ｂの直線濃度勾配
（１２０分） 活性は、２分画にわかれ、各々ＮａＣｌ濃度８６mM（Ｐ
−１）、１００mM（Ｐ−２）で溶出した（図１参照）。
ＣＮ B) ２０／mM酢酸バッファー（pH５．０）／５％ＣＨ3
ＣＮ／０．２ＭＮａＣＬ Ａ−−＞Ｂの直線濃度勾配
（１２０分） 活性は、２分画にわかれ、各々ＮａＣｌ濃度８６mM（Ｐ
−１）、１００mM（Ｐ−２）で溶出した（図１参照）。
【００３１】5) Ｐｅｎｙｌ ５ＰＷ−ＲＰ 逆相カラ
ムクロマトグラフィー ＨＰＬＣＣＭ−３ＳＷ ＨＰＬ
Ｃ ステップより得られた活性画分を、各々５％ＣＨ3
ＣＮ含有燐酸バッファー（pH７．４）で平衡化したＰｅ
ｎｙｌ−５ＰＷＲＰカラム（φ４．６mm×７．５cm 東
ソー）に注入した。溶出は２０％ＣＨ3 ＣＮ含有５mM燐
酸バッファー（pH７．４）で２０分間溶出した後、２０
％から４０％ＣＨ3 ＣＮ含有同バッファーを用いて８０
分間の直線型濃度勾配で溶出をおこなった。流速は、１
ml／min 、分取は、２ml／tubeで行った。Ｐ−１はリテ
ンションタイム５９分から６０分の位置に、Ｐ−２は６
０分から６１分の位置に溶出した（図２及び図３参
照）。
ムクロマトグラフィー ＨＰＬＣＣＭ−３ＳＷ ＨＰＬ
Ｃ ステップより得られた活性画分を、各々５％ＣＨ3
ＣＮ含有燐酸バッファー（pH７．４）で平衡化したＰｅ
ｎｙｌ−５ＰＷＲＰカラム（φ４．６mm×７．５cm 東
ソー）に注入した。溶出は２０％ＣＨ3 ＣＮ含有５mM燐
酸バッファー（pH７．４）で２０分間溶出した後、２０
％から４０％ＣＨ3 ＣＮ含有同バッファーを用いて８０
分間の直線型濃度勾配で溶出をおこなった。流速は、１
ml／min 、分取は、２ml／tubeで行った。Ｐ−１はリテ
ンションタイム５９分から６０分の位置に、Ｐ−２は６
０分から６１分の位置に溶出した（図２及び図３参
照）。
【００３２】４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 逆相ＨＰＬＣにより得られた２活性画分について、一部
にサンプルバッファー（０．０６２５Ｍトリス・ＨＣｌ
バッファー pH６．８、２％ＳＤＳ、０．３Ｍショ糖）
を添加し、１００℃、３分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に供した。泳動は、０．１％ＳＤＳ含有２０％ポリアク
リルアミドゲル（１mm厚）を用い、Ｌａｅｍｍｌｉの方
法〔Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）〕に準
じて行った。泳動後、タンパク質バンドは、銀染色（銀
染色キット、和光）により検出した。分子量マーカーと
して、ミオグロビン（１７２０１）、ミオグロビンＩ＋
II（１４６３２）、ミオグロビンＩ（８２３５）、ミオ
グロビンII（６３８３）、ミオグロビンIII （２５５
６）、ミオグロビン１−１４（１６９６）を用いた。そ
の結果、Ｐ−１、Ｐ−２とも分子量３，７００±３７０
ダルトンの位置に単一バンドとして検出された。還元、
非還元条件下でも、分子量に変化はなかった。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果は図４に示した。
にサンプルバッファー（０．０６２５Ｍトリス・ＨＣｌ
バッファー pH６．８、２％ＳＤＳ、０．３Ｍショ糖）
を添加し、１００℃、３分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に供した。泳動は、０．１％ＳＤＳ含有２０％ポリアク
リルアミドゲル（１mm厚）を用い、Ｌａｅｍｍｌｉの方
法〔Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）〕に準
じて行った。泳動後、タンパク質バンドは、銀染色（銀
染色キット、和光）により検出した。分子量マーカーと
して、ミオグロビン（１７２０１）、ミオグロビンＩ＋
II（１４６３２）、ミオグロビンＩ（８２３５）、ミオ
グロビンII（６３８３）、ミオグロビンIII （２５５
６）、ミオグロビン１−１４（１６９６）を用いた。そ
の結果、Ｐ−１、Ｐ−２とも分子量３，７００±３７０
ダルトンの位置に単一バンドとして検出された。還元、
非還元条件下でも、分子量に変化はなかった。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果は図４に示した。
【００３３】５．アミノ酸配列の決定 ２種類の精製品について、気相プロテインシークエンサ
ー（モデル４７０Ａアプライドバイオシステムズ社）を
使用した自動エドマン分解法によりアミノ酸配列を決定
した。前記した通りのアミノ酸配列を有することが判っ
た（図５及び図６参照）。
ー（モデル４７０Ａアプライドバイオシステムズ社）を
使用した自動エドマン分解法によりアミノ酸配列を決定
した。前記した通りのアミノ酸配列を有することが判っ
た（図５及び図６参照）。
【００３４】６．生物活性 1) ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０、ヒト肺癌細胞Ａ−５４９に対する増殖阻害
活性 ９６穴プレート（ファルコン）に各細胞を５×１０3 ／
１００μｌ／wellで播種し２４時間３７℃、５％ＣＯ2
気相下で培養した。培養液を、フェニル５ＰＷ−ＲＰ逆
相ＨＰＬＣにより得られる精製品〔（Ｐ−１）あるいは
（Ｐ−２）〕５ng／ml、５０ng／mlを含む培養液に交換
し６日間培養した。培養液は３日間毎に交換した。６日
後、生細胞数をトリパンブルー染色法により計測した。
尚、ＨＬ−６０細胞の培養はＲＤＦ−２％ＦＢＳ、Ｈｅ
Ｌａ細胞、Ａ−５４９細胞の培養はＤＦ−２％ＦＢＳ培
養液を用いた。各細胞に対する増殖阻害効果を図７及び
図８に示した。図７及び図８から明らかなように、本発
明の因子はＨｅＬａ細胞、Ａ−５４９細胞、ＨＬ−６０
細胞の増殖を有意に阻害した。
ＨＬ−６０、ヒト肺癌細胞Ａ−５４９に対する増殖阻害
活性 ９６穴プレート（ファルコン）に各細胞を５×１０3 ／
１００μｌ／wellで播種し２４時間３７℃、５％ＣＯ2
気相下で培養した。培養液を、フェニル５ＰＷ−ＲＰ逆
相ＨＰＬＣにより得られる精製品〔（Ｐ−１）あるいは
（Ｐ−２）〕５ng／ml、５０ng／mlを含む培養液に交換
し６日間培養した。培養液は３日間毎に交換した。６日
後、生細胞数をトリパンブルー染色法により計測した。
尚、ＨＬ−６０細胞の培養はＲＤＦ−２％ＦＢＳ、Ｈｅ
Ｌａ細胞、Ａ−５４９細胞の培養はＤＦ−２％ＦＢＳ培
養液を用いた。各細胞に対する増殖阻害効果を図７及び
図８に示した。図７及び図８から明らかなように、本発
明の因子はＨｅＬａ細胞、Ａ−５４９細胞、ＨＬ−６０
細胞の増殖を有意に阻害した。
【００３５】 2) ヒト子宮癌由来ＨｅＬａ細胞の形態変化 ４８穴プレート（コーニング社）にＨｅＬａ細胞２×１
０4 ／２５０μｌ、１０％ＦＢＳ含有ＤＦ／ｗｅｌｌと
なるように播種し３７℃、５％ＣＯ2 気相下２４時間培
養した。培養液を、フェニル５ＰＷ−ＲＰ逆相ＨＰＬＣ
により得られる精製品（Ｐ−１）１０ng／mlを含むＤＦ
培養液２５０μｌ／wellに交換し、４８時間培養した
後、位相差倒立顕微鏡により形態変化を観察した。得ら
れた結果は図９に示した。図９から、本発明の因子がＨ
ｅＬａ細胞の増殖を有意に阻害することが判る。精製品
（Ｐ−２）を用いた場合にも同様の結果が得られた。
０4 ／２５０μｌ、１０％ＦＢＳ含有ＤＦ／ｗｅｌｌと
なるように播種し３７℃、５％ＣＯ2 気相下２４時間培
養した。培養液を、フェニル５ＰＷ−ＲＰ逆相ＨＰＬＣ
により得られる精製品（Ｐ−１）１０ng／mlを含むＤＦ
培養液２５０μｌ／wellに交換し、４８時間培養した
後、位相差倒立顕微鏡により形態変化を観察した。得ら
れた結果は図９に示した。図９から、本発明の因子がＨ
ｅＬａ細胞の増殖を有意に阻害することが判る。精製品
（Ｐ−２）を用いた場合にも同様の結果が得られた。
【図１】本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子のＣＭ−３ＳＷ
陽イオン交換クロマトグラムの溶出プロファイルを示す
グラフである。
陽イオン交換クロマトグラムの溶出プロファイルを示す
グラフである。
【図２】本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子のフェニル５Ｐ
Ｗ−ＲＰ逆相ＨＰＬＣの溶出プロファイルを示すグラフ
である。
Ｗ−ＲＰ逆相ＨＰＬＣの溶出プロファイルを示すグラフ
である。
【図３】本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子のフェニル５Ｐ
Ｗ−ＲＰ逆相ＨＰＬＣの溶出プロファイルを示すグラフ
である。
Ｗ−ＲＰ逆相ＨＰＬＣの溶出プロファイルを示すグラフ
である。
【図４】本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに付した結果を示す写真である。
ＧＥに付した結果を示す写真である。
【図５】本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子（Ｐ−１）の一
次構造である。
次構造である。
【図６】本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子（Ｐ−２）の一
次構造である。
次構造である。
【図７】ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前骨髄性白血病
細胞ＨＬ−６０、ヒト肺癌細胞Ａ−５４９に対する本発
明の腫瘍細胞増殖阻害因子（Ｐ−１）の増殖阻害効果を
示すグラフである。
細胞ＨＬ−６０、ヒト肺癌細胞Ａ−５４９に対する本発
明の腫瘍細胞増殖阻害因子（Ｐ−１）の増殖阻害効果を
示すグラフである。
【図８】ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前骨髄性白血病
細胞ＨＬ−６０、ヒト肺癌細胞Ａ−５４９に対する本発
明の腫瘍細胞増殖阻害因子（Ｐ−２）の増殖阻害効果を
示すグラフである。
細胞ＨＬ−６０、ヒト肺癌細胞Ａ−５４９に対する本発
明の腫瘍細胞増殖阻害因子（Ｐ−２）の増殖阻害効果を
示すグラフである。
【図９】本発明の腫瘍細胞増殖阻害因子（Ｐ−１）のヒ
ト子宮癌由来ＨｅＬａ細胞に対する阻害活性を示す写真
である。
ト子宮癌由来ＨｅＬａ細胞に対する阻害活性を示す写真
である。
フロントページの続き (72)発明者 花田 和紀 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正 製薬株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/525 C12P 21/02 A61K 38/19 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ３Ｔ３細胞由来株化細胞の培養上清から
得ることができる蛋白質であり、以下の性質を有する腫
瘍細胞増殖阻害因子： （ａ） 分子量 還元および非還元条件下におけるＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による測定で、３，７００±３７０
ダルトン； （ｂ） カラム特性 ｐＨ約７．４で陰イオン交換樹脂カラムに実質的に吸着
せず、ｐＨ約５．０で陽イオン交換樹脂カラムに実質的
に吸着する； （ｃ） 生理活性 少なくとも、ヒト前骨髄性白血病細胞及びヒト子宮頸癌
由来細胞の増殖を阻害する活性を有する。 - 【請求項２】 以下に示す２つのアミノ酸配列〔（Ｐ−
１）及び（Ｐ−２）〕のうちのいずれかのアミノ酸配列
を有する請求項１記載の腫瘍細胞増殖阻害因子。 【表１】 【表２】
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3011950A JP2784272B2 (ja) | 1990-06-06 | 1991-02-01 | 腫瘍細胞増殖阻害因子 |
| TW080104225A TW201755B (ja) | 1990-06-06 | 1991-05-29 | |
| CA002043536A CA2043536C (en) | 1990-06-06 | 1991-05-30 | Tumor cell growth inhibitor |
| EP19910305031 EP0460910A3 (en) | 1990-06-06 | 1991-06-04 | Tumor cell growth inhibitor |
| KR1019910009292A KR100187732B1 (ko) | 1990-06-06 | 1991-06-05 | 종양 세포 성장 억제 인자 |
| US08/193,778 US5384394A (en) | 1990-06-06 | 1994-02-10 | Tumor cell growth inhibitor |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14614390 | 1990-06-06 | ||
| JP2-146143 | 1990-06-06 | ||
| JP3011950A JP2784272B2 (ja) | 1990-06-06 | 1991-02-01 | 腫瘍細胞増殖阻害因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211698A JPH04211698A (ja) | 1992-08-03 |
| JP2784272B2 true JP2784272B2 (ja) | 1998-08-06 |
Family
ID=26347473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3011950A Expired - Fee Related JP2784272B2 (ja) | 1990-06-06 | 1991-02-01 | 腫瘍細胞増殖阻害因子 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0460910A3 (ja) |
| JP (1) | JP2784272B2 (ja) |
| KR (1) | KR100187732B1 (ja) |
| CA (1) | CA2043536C (ja) |
| TW (1) | TW201755B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP0703242A1 (en) * | 1993-06-04 | 1996-03-27 | Taisho Pharmaceutical Co. Ltd | Human-origin tumor cell proliferation inhibiting factor |
| WO2004027419A2 (en) * | 2002-09-19 | 2004-04-01 | National Research Council Of Canada | Method of diagnosing colorectal adenomas and cancer using proton magnetic resonance spectroscopy |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4708948A (en) * | 1984-04-20 | 1987-11-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Substantially purified tumor growth inhibitory factor |
| US5155217A (en) * | 1987-05-29 | 1992-10-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Ongogene encoding polypeptide having growth factor activity |
| JPH01148197A (ja) * | 1987-12-04 | 1989-06-09 | Green Cross Corp:The | 腫瘍細胞障害因子 |
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1991
- 1991-02-01 JP JP3011950A patent/JP2784272B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-29 TW TW080104225A patent/TW201755B/zh active
- 1991-05-30 CA CA002043536A patent/CA2043536C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-04 EP EP19910305031 patent/EP0460910A3/en not_active Withdrawn
- 1991-06-05 KR KR1019910009292A patent/KR100187732B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-10 US US08/193,778 patent/US5384394A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2043536A1 (en) | 1991-12-07 |
| CA2043536C (en) | 2001-02-20 |
| KR920000940A (ko) | 1992-01-29 |
| JPH04211698A (ja) | 1992-08-03 |
| TW201755B (ja) | 1993-03-11 |
| EP0460910A2 (en) | 1991-12-11 |
| EP0460910A3 (en) | 1992-10-28 |
| US5384394A (en) | 1995-01-24 |
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