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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen von kolorektalen
Adenomen und von kolorektalem Krebs und insbesondere ein Verfahren
zum Feststellen solcher Adenome und solchem Krebs unter Verwendung
der Protonenmagnetresonanzspektroskopie.
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Kolorektaler
Krebs ist eine der häufigsten Krebsarten,
in den USA und Kanada mit ungefähr 146.000
neuen Fällen
in 1999. Das lebenslange Risiko, dass ein Individuum in Nordamerika
kolorektalen Krebs entwickeln wird, beträgt ungefähr 5–6 %. Mit kolorektalem Krebs
verbundene Symptome, einschließlich
Blut im Stuhl, Anämie,
Schmerzen im Unterleib und Veränderung
des Eingeweideverhaltens („bowel
habits"), werden
nur offensichtlich, wenn die Krankheit deutlich vorangeschritten
ist. Bekanntlich hängt
die Prognose für
einen Patienten großteils
vom Stadium der Krankheit zur Zeit der Diagnose ab. Während die
Fünf-Jahres-Überlebensrate für einen Patienten,
dessen kolorektaler Krebs zu einem frühen Zeitpunkt entdeckt wird,
92 % ist, sinkt die Überlebensrate
bei Patienten mit regionaler Ausbreitung auf ungefähr 60 %
und bei denen mit entfernten Metastasen auf ungefähr 6 %.
Daher ist es wichtig, die Vorläuferadenome
und Vorläuferkrebszellen
so früh wie
möglich
zu entdecken, um die Chancen eines erfolgreichen therapeutischen
Eingriffs zu erhöhen.
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Das „Screening" nach einer Krankheit
erfordert, dass die Krankheit in einem großen Teil der Population verbreitet
ist und dass eine frühzeitige
Erkennung der Krankheit die Sterblichkeit verringert und die Lebensqualität verbessert.
Kolorektaler Krebs erfüllt
diese Anforderungen (Mandel JS, Church TR, Ederer F, Bond JH, Colorectal
cancer mortality: effectiveness of biennial screening for fecal occult
blond. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 434–437 and Mandel JS, Bond JH,
Church TR, Snover DC, Bradley GM, Schuman LH, Ederer F, Reducing
mortality from colorectal cancer by screening for fecal occult blond.
Minnesota colon cancer control study, N Eng J Med 1993; 328; 1365–1371) und
ist daher ein idealer Kandidat für
solch ein Programm. Die Entwicklungsgeschichte von kolorektalem
Krebs, nämlich
der Verlauf vom Adenom zum Adenkarzinom, der über eine Zahl von Jahren (5–15) erfolgt,
macht es auch zu einem geeigneten Ziel. Die Kosten-Nutzen-Analyse
für die
Früherkennung
von kolorekta lem Krebs wurde ebenfalls als günstig dargestellt (Bolin, TD.
Cost benefit of early diagnosis of colorectal cancer, Scand J Gastroenterol
1996; 31 Suppl 220: 142–146).
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Die
Screeningmethode als solche muss auch eine Serie von Kriterien,
wie etwa hohe Sensitivität
und Spezifität,
geringe Kosten, sichere Durchführung
und Einfachheit, erfüllen.
Derzeit werden für diesen
Zweck digitale Rektaluntersuchung (digital rectal examination; DER),
Test auf okkultes Blut im Stuhl (fecal occult blond test; FOBT),
Bariumeinlauf und direkte Kolonvisualisierung (Sigmoidoskopie und Kolonoskopie)
verwendet.
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DER
schließt
das Untersuchen des Rektums unter Verwendung eines Fingers ein.
Dieses Verfahren stellt Krebs fest, der ertastet werden kann und
in Reichweite des Fingers ist. Eine negative DER bietet eine geringe
Rückversicherung,
dass ein Patient frei von Krebs ist, weil weniger als 10 % von kolorektalem Krebs
mit dem Untersuchungsfinger ertastet werden können.
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FORT
stellt mit chemischen Mitteln verborgenes Blut im Stuhl fest. Obwohl
es die am wenigsten teure und einfachste Methode ist, hat FORT eine
geringe Sensitivität,
eine moderate Spezifität
und ist gewöhnlich
für die
Früherkennung
nicht ausreichend. Gemäß der zur
Verfügung
stehenden Daten ist es ein großer
Nachteil dieses Verfahrens, dass mehr als die Hälfte der durch dieses Verfahren
entdeckten Krebsgeschwüre,
gefolgt von Röntgenuntersuchung
oder Endoskopie, in der Regel über
die Grenze eines frühen
Stadiums hinaus ist. Eine falsch positive Rate von 10–12 % wird
erwartet, wenn die Patienten bei uneingeschränkter Ernährung untersucht werden. Einschätzungen
der positiven Voraussagewerte reichen von 2,2 bis 50 %. Die Guaiac-Tests
haben eine sehr geringe Sensitivität, allgemein etwa 50 % (Ransohoff
DF, Lang CA. Screening for colorectal cancer with the fecal occult
blond test; a background paper. Ann Intern Med 1997; 126: 811–822). Die
Verwendung von FORT basiert auf der Annahme, dass kolorektaler Krebs
mit Blutungen assoziiert ist. Jedoch bluten einige kolorektale Krebsarten
periodisch und andere überhaupt
nicht.
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Ein
Bariumeinlauf bringt eine Röntgenuntersuchung
der Eingeweide unter Verwendung eines Kontrastmittels mit sich.
Der Einlauf kann ein Einfach- oder ein Doppelkontrasteinlauf sein.
Die wesentlichen radiologischen Anzeichen eines Malignoms beinhalten
Unterbrechungen der Schleimhaut, abrupte Trennung und Schulterbildung
und lokale Läsionen
mit scharfer Abgrenzung von nichtbeteiligten Arealen. Die geschätzte Sensitivität eines
Doppelkontrastbariumeinlaufs für
Krebs und große
Polypen beträgt
nur ungefähr
65–75
% und noch weniger für kleine
Adenome. Ungeachtet seines besseren diagnostischen Ergebnisses hat
der Doppelkontrastbariumeinlauf eine falsch negative Rate von 2–18 %. Darüber hinaus
beinhaltet dieses Verfahren die Belastung mit Strahlung, wobei wiederholte
Anwendung nicht sicher sein mag. Perforation durch Bariumeinläufe ist
extrem selten, aber wenn sie erfolgt, kann sie tödlich sein oder zu schweren
Langzeitproblemen aufgrund des Eindringens von Barium in die Bauchhöhle führen.
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Eine
Vielzahl von Instrumenten (allgemein als Endoskope bezeichnet) wird
zum Untersuchen der Eingeweide verwendet. Endoskope können starr oder
flexibel mit unterschiedlicher Länge
sein. Flexible Sigmoidoskope sind 60 cm lang. Ein Kolonoskop ist
ein 130–160
cm langes flexibles Untersuchungsinstrument zum Untersuchen des
gesamten Darms. Biopsien können
von verdächtig
aussehenden Arealen genommen werden, während der Darm durch das Endoskop
betrachtet wird. Die flexible Sigmoidoskopieuntersuchung ist auf
die linke Seite des Kolons und des Rektums begrenzt. Wenigstens
ein Drittel der krebsartigen Tumore tritt in Bereichen nahe der Flexura
coli sinistra („splenic
flexure") auf, die
mit der Sigmoidoskopie nicht erreichbar ist. Kolonoskopie hat eine
hohe Sensitivität
und bleibt der Goldstandard zur Visualisierung des Kolons und dem
Feststellen krebsartiger Abnormalitäten. Jedoch ist sie invasiv,
recht teuer und setzt den Untersuchten dem Risiko einer Perforation
der Eingeweide aus. Magnetresonanzspektroskopie (magnetic resonance
spectroscopy; MRS) ist ein Verfahren, dass das Potential hat, kleine
und frühe
biochemische Veränderungen,
die mit Vorgängen
einer Krankheit assoziert sind, zu erkennen und hat sich als nützlich bei
der Untersuchung von Gewebebiopsien von Krebspatienten erwiesen.
(Smith I.C.P, Bezabeh T. Tissue NMR Ex Vivo. In: Young IR, ed Methods
in Biomedical magnetic resonance imaging and spectroscopy, Chichester, UK;
Wiley, 2000: 891-7). Es ist insbesondere nützlich, um kleine mobile chemische
Spezies in einer gegebenen biologischen Probe festzustellen, die
von diagnostischem Interesse sind. Das Erhalten von Gewebeproben
für solch
eine Untersuchung jedoch schließt
gewöhnlich
ein invasives Vorgehen ein.
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Es
gibt eine Anzahl von zur Zeit verfügbaren Verfahren zum Feststellen
von Krebs in seinen Stadien. Biophysikalische Verfahren wie etwa
herkömmliche
Röntgenuntersuchungen,
Nuk learmedizin, geradlinige Scanner, Ultraschall, CAT und MRI, spielen alle
eine wichtige Rolle bei der Früherkennung
und Behandlung von Krebs. Klinische Labortests für Tumormarker können ebenso
als Unterstützung
in der Früherkennung
von Krebs verwendet werden. Tumormarkertests messen entweder tumorassoziierte Antigene
oder andere bei Krebspatienten vorhandene Substanzen, die bei der
Diagnose, der Einteilung in Stadien, dem Krankheitsfortschritt,
dem Überwachen
der Antwort auf eine Therapie und dem Feststellen einer wiederkehrenden
Krankheit helfen. Unglücklicherweise
weisen die meisten Tumormarkertests keine ausreichende Spezifität auf, um
in kosteneffektiver Weise als Screening-Werkzeuge verwendet zu werden.
Selbst hochspezifische Tests leiden an einem geringen Vorhersagewert,
weil die Prävalenz
eines bestimmten Krebs in der Gesamtpopulation relativ gering ist.
Die Mehrzahl von erhältlichen Tumormarkertests
ist bei der Diagnose von Krebs bei Patienten mit Symptomen nicht
nützlich,
weil erhöhte Mengen
von Markern ebenso in einer Vielzahl von leichten Erkrankungen beobachtet
werden. Der hauptsächliche
klinische Wert von Tumormarkern liegt in der Einteilung von Tumoren
nach ihrem Verlauf, Überwachen
therapeutischer Antworten, Vorhersagen der Patientenentwicklung
und Feststellen von wiederkehrendem Krebs.
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Die
US Patente 4,912,050 und
4,918,021 , erteilt für E.T. Fossel
am 27. März
1990 und 17. April 1990 offenbaren eine Methode zum Feststellen
von Krebs durch Protonkernmagnetresonanztomographie (nuclear magnetic
resonance; NMR) von Blut, Blutserum oder Blutplasma.
US Patent Nr. 5,261,405 , erteilt für denselben
Erfinder am 16. November 1993, beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren
zum Automatisieren dieses Prozesses.
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US Patent Nr. 5,318,031 ,
erteilt für
Mountford et al. am 7. Juni 1997, beschreibt ein Verfahren zum Bestimmen
chemischer Zustände
von lebenden Tieren oder menschlichem Gewebe unter Verwendung eindimensionaler
NMR und 2D-COSY (zweidimensionale Korrelations) NMR Spektroskopie
und Vergleichen der gemessenen Werte mit Referenzmessungen von normalem,
abnormalem und Übergangszustandsgewebe.
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C.
L. Lean et al. (Magn Reson Med 20: 306–311, 1991; Biochemistry 3:
11095–11105,
1992 and Magn Reson Med 30: 525–533,
1992) beschreiben die Verwendung von Magnetresonanzspektroskopie,
um Kolonzellen und Gewebeproben zu untersuchen.
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Jedoch
besteht noch immer ein Bedarf an einem kostengünstigen nicht-invasiven Verfahren
zum Feststellen von kolorektalem Krebs und kolorektalen Adenomen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein relativ einfaches,
nicht-invasives Verfahren zum Feststellen kolorektaler Adenome und
von kolorektalem Krebs bereitzustellen, das die oben definierten
Kriterien von hoher Sensitivität
und Spezifität,
geringen Kosten und sicherer Durchführung erfüllt.
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Die
internationale PCT Veröffentlichung
Nr.
WO 02/12879 A2 am
14. Februar 2002 beschreibt ein Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit
von kolorektalen Adenomen und kolorektalem Krebs in einem Patienten
mit den Schritten Unterwerfen einer Stuhlprobe eines Patienten der
Magnetresonanzspektroskopie; und Vergleiches des resultierenden Spektrums
mit den Magnetresonanzspektra von Stuhl von nicht von Krebs betroffenen
Subjekten, wobei die beobachteten Unterschiede in den Spektren indikativ
für Krebs
oder klinisch signifikante Adenome sind.
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Das
Durchführen
der Spektralanalyse von menschlichem Stuhl bietet gegenüber anderen
Verfahren einen deutlichen Vorteil, weil das Aufnehmen der Probe
nicht-invasiv ist und kein Risiko für den Patienten darstellt.
Darüber
hinaus ist vor der Analyse keine besondere Verarbeitung der Probe
erforderlich.
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Eine
Alternative zu dem in der oben genannten PCT Veröffentlichung beschriebenen
Verfahren, bei der eine flüssige
Suspension der Stuhlprobe der Magnetresonanzspektroskopie unterworfen
wird, wurde durch den Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelt.
Der Grundgedanke hinter diesem neuen Verfahren ist derjenige, dass
die diagnostischen Marker in einer Probe mehr als wahrscheinlich
kleine, wasserlösliche
Spezies sind.
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Speziell
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Feststellen des
Vorhandenseins von kolorektalen Adenomen und kolorektalem Krebs
bei einem Patienten bereit, bei dem eine Stuhlprobe eines Patienten
Gegenstand der Magnetresonanzspektroskopie ist und das resultierende
Spektrum mit den Magnetresonanzspektren von nicht an Krebs erkrankten
Patienten verglichen wird, wobei beobachtete Unterschiede in den
Spektren indikativ für
Krebs oder klinisch signifikante Adenome sind, dadurch gekennzeichnet,
dass die Stuhlprobe des Patien ten mit einem Puffer zum Bilden einer
flüssigen
Suspension gemischt wird und die Suspension zentrifugiert wird, um
einen Überstand
zu erhalten, der der Magnetresonanzspektroskopie unterworfen wird.
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METHODE
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Eine
Zentrifuge wurde verwendet, um Überstandsproben
aus dem Stuhl der Patienten zu präparieren. Der Stuhl wurde homogenisiert
und dann heruntergedreht. Wie oben erwähnt, besteht der Grundgedanke,
dass die diagnostischen Marker in der Probe mehr als wahrscheinlich
kleine, wasserlösliche Spezies
sind. Vom Überstand
wird angenommen, dass dieser die diagnostische Information enthält und die
Spektren durch Beseitigung fester Materie verbessert werden.
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Die
verwendeten Stuhlproben waren diejenigen, die in der oben genannten
PCT Veröffentlichung
WO 02/12879 A2 beschrieben
sind, i. e. Stuhlproben von Personen, die für Kolonoskopie oder Operation vorgesehen
waren. Sogenannte „Normal-Proben" schließen diejenigen
von Personen mit einem Zustand des Darms ein, der nicht krebsartig
ist. Beispiele sind Divertikulose, hyperplastische Polypen und innere
Hämorrhoiden.
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PROBENPRÄPARATION
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Speziell
wurde eine homogenisierte Rohstuhlprobe einer –70° C Tiefkühltruhe entnommen und für ungefähr 14–15 Minuten
in eine Sterilbank („biohood") (bei Raumtemperatur)
gestellt. Während dieser
Zeit taute die Probe nicht vollständig auf, aber wurde etwas
weicher und ein kleines Stück
konnte leicht abgeschnipselt werden. Ungefähr 2 g der Probe wurden unter
Verwendung eines Spatels entnommen und in ein kleines Glasgefäß gebracht.
Nach vollständigem
Auftauen wurden 6 ml PBS/D2O Puffer zum
Gefäß hinzugegeben,
wodurch ein Verhältnis von
Puffer zu Stuhl von ungefähr
3:1 entstand. Die Suspension wurde dann (unter Verwendung von Vortex-2
Genie) für
2 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 5 gemischt (gevortext).
Die Suspension wurde in mehrere 1,5 ml Zentrifugenröhrchen gegossen
und für
3 Minuten in einer Labortischzentrifuge (Biofuge Pico) bei 3200
UpM zentrifugiert. Der Überstand
wurde sorgfältig
abgenommen und in 3–4
Kryogefäßen gesammelt
und in einer –70°C Tiefkühltruhe
eingefroren.
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Nach
einem Gefrierzeitraum von wenigstens 12 Stunden wurden die Gefäße herausgenommen und
in eine Sterilbank gestellt. Nachdem eine Probe vollständig aufgetaut
war, wurden 600 μl
entnommen und in ein 5 mm NMR Röhrchen überführt (das
bereits 50 μl
TSP/D2O enthielt). Das TSP wurde als eine chemische
Verschiebungsbezugsgröße (0 ppm)
und zum Abgleich der Spektren während
der Datenvorverarbeitung verwendet.
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MRS EXPERIMENTE
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Alle
Proben wurden mit einem Avance 360 Spektrometer (Bruker Instruments)
ohne Drehen ausgeführt.
Ein Standard wurde jeden Morgen vor den aktuellen Proben ausgeführt, um
sicherzustellen, dass das Spektrometer richtig arbeitet. War dies
geschehen, wurde die Probe in den Magneten eingeführt und
die Zeit notiert. Die Temperatur wurde auf 298 K gesetzt und die
Verriegelung auf das Deuteriumsignal ausgeführt (Verriegelungskraft = –20dB, Phase
= 113,5, Verstärkung
= 100). Manueller Ausgleich wurde ausgeführt mit dem Fokus auf Z, Z2, Z3, X und Y. Der
Sondenkopf wurde dann abgestimmt und angepasst. Ein neues Experiment
wurde für
jede Probe geschrieben und darauf wurden die Erfassungsparameter
eingestellt. Wassersuppression wurde durch Verwendung der Vorsättigungsmethode („presaturation
technique") ausgeführt. Die
Linienbreite und O1 (Wasserfrequenz) wurden für jedes Experiment notiert.
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Die
Erfassungsparameter waren: Pulsprogramm Zgpr, Temperatur, TE = 298
K; Senderfrequenz, SF01 = 360,3316979 MHz, Anzahl von Scans, NS
= 32; Dummy Scans, DS = 2; 90 Grad Pulsbreite, P1 = μsec; Vorsättigungsenergiegrad, PL9
= 40 dB; Zeitbereichsdatenpunkte, TD = 16K; Größe des tatsächlichen Spektrums, SI = 16K;
Interscan Verzögerung,
D1 = 3,0 sec; Spektralbreite, SW = 4990,02 Hz; Erfassungszeit, AQ
= 1,64; Verzögerungszeit,
D9 = 60 ms.
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DATENVERARBEITUNG
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Insgesamt
wurden bis heute 271 Proben (MR Spektren) vollständig analysiert unter Verwendung
der dreistufigen statistischen Klassifikationsstrategie. Zweihundertfünfundvierzig
von diesen (147 normal, 98 Krebs und/oder Adenome) wurden (im Trainingssatz)
verwendet, um die Klassifizierer zu entwickeln. Die insgesamte Genauigkeit
der Trainingsdaten (einschließlich
Fuzzy Klassifikationen) war 87 %. Die insgesamte Genauigkeit des
Validierungssatzes (n = 26; 11 normal und 15 Krebs/Polypen) war
88,5 %. Die Sensitivität
war 93,3 % und die Spezifität
war 81,8 %.
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In
der oben genannten dreistufigen statistischen Klassifikationsstrategie
ist die erste Stufe ein Vorverarbeitungsschritt, der sich für eine zuverlässige Klassifizierung
als essentiell erwiesen hat. Er besteht aus Auswählen einiger maximal diskriminatorischer
Teilregionen aus den Spektren unter Verwendung eines optimalen Regionsauswahlalgorithmus (optimal
region selection; ORS) basierend auf einer von einem Genetischen
Algorithmus (GA) angetriebenen Optimierungsmethode (Nikulin A E,
Dolenko B, Bezabeh T, Smorjai R L, NMR in Biomedicine 11, 209–217 (1998) „Near-optimal
region selection for feature space reduction: Novel preprocessing
methods for classifying MR Spectra". Bezabeh, T et al. The use of
1H Magnetic Resonance Spectroscopy in Inflammatory
Bowel Disease, Am. J. Gastroenterol 2001; 96:442-448 and Somorjai, R.L. et al, Distinguishing
Normal from Rejecting Renal Allographs; Application of a Three-Stage
Classification Strategy to MR and IR Spectra of Urine, Vibrational
Spectroscopy 28 (1) 97–102
(2002)). Für
die Verlässlichkeit
der Klassifikation sollte die Anzahl dieser Subregionen in einer
Größenordnung
kleiner als die Anzahl der zu klassifizierenden Proben sein. Um
zu sehr optimistische Klassifizierungsergebnisse zu vermeiden, die ein
direkter Resubstitutionsansatz liefern würde, entwickelten die in der
oben genannten PCT Veröffentlichung
WO 02/12879 A2 genannten
Erfinder eine Vergleichsprüfung
unter Verwendung einer Bootstrap-Methodik.
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Das
Bootstrap-Verfahren teilt die Daten (mit Ersetzungen) wiederholt
in ungefähr
gleich große
zufällige
Trainings- und Testuntersätze
auf. Für
jeden der zufälligen
Trainingsuntersätze
wird ein optimaler Klassifizierer gefunden und dessen Genauigkeit
anhand des zufälligen Testuntersatzes
validiert. Dieser Vorgang wird eine Anzahl wiederholt (1000 Mal
bei der am wenigstens kritischen ORS Präprozessierungsstufe, 5000 Mal
für den
endgültigen
Klassifizierer). Wurden die optimalen Subregionen einmal identifiziert,
findet die zweite Stufe den letzten Klassifizierer als das gewichtete
Mittel der Klassifiziererkoeffizienten der 5000 individuellen Komponentenklassifizierer.
Diese Herangehensweise verwendet effektiv alle n Proben. Ein standardmäßiges multivariates statistisches
Verfahren, Lineare Diskriminanzanalyse (LDA) ist die Wahl für alle Klassifizierer
in allen Stufen aufgrund ihrer Geschwindigkeit und Robustheit. Das Konzept
der Festigkeit („crispness") eines Klassifizierers
wird auch verwendet, weil die Klassifizierer Klassenwahrscheinlichkeiten
produzieren. Eine 2-Klassenklassifikation
einer Probe wird fest („crisp") genannt, wenn die
Klassen-Zuordnungswahrscheinlichkeit
für diese
Probe größer als
75% ist.
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Für schwierige
Klassifizierungsprobleme besteht eine dritte Stufe aus dem Kombinieren
der Ergebnisse mehrerer Klassifizierer über Aggregationsverfahren (computerisierte
Consensus-Diagnose, CCD)
in einem Gesamtklassifizierer, der mehr zuverlässig und genauer als die individuellen
Klassifizierer ist. Die speziell verwendete Klassifiziereraggregation ist
Wolperts Gestapelter Generalisierer (Wolpert's Stacked Generalizer; WSG). WSG verwendet
die von den individuellen Klassifizierern erhaltene Ausgabe-Klassenwahrscheinlichkeiten
als Eingangsmerkmale für
den letzten Klassifizierer. Für
2-Klassen-Probleme ist die Zahl von Merkmalen 1 pro Klassifizierer
(mit K-unabhängigen
Klassifizierem ergibt dieses K Wahrscheinlichkeiten als Eingabemerkmale).
Die Gesamtklassifizierungsqualität
ist generell höher.
Die Festigkeit der Klassifizierer ist immer größer. Dieses ist in einer klinischen
Umgebung wichtig, weil weniger Patienten wiederholt untersucht werden müssen.
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Die
multivariate Analyse der eindimensionalen Spektren ist besonders
erfolgreich für
Krebsbiopsien (Somorjai, R. et al, J Mag Reson Imaging 6, 437 (1996)).
Diese Spektren benötigen
nur Minuten zur Aufnahme, bieten eine große Vielfalt von Datenpunkten
und können
automatisch analysiert werden, wenn der diagnostische Algorithmus
gesichert ist.