JPS6133120A - 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 - Google Patents
腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法Info
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- JPS6133120A JPS6133120A JP8435385A JP8435385A JPS6133120A JP S6133120 A JPS6133120 A JP S6133120A JP 8435385 A JP8435385 A JP 8435385A JP 8435385 A JP8435385 A JP 8435385A JP S6133120 A JPS6133120 A JP S6133120A
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は腫瘍増殖阻害因子（ＴＩＦ ）に係わり、特に
はある種の正常ヒト細胞の増殖に副作用を及ぼさずに、
ある種の腫瘍細胞の増殖を阻害することができる実質的
に精製されたポリイプチド因子に関する。
はある種の正常ヒト細胞の増殖に副作用を及ぼさずに、
ある種の腫瘍細胞の増殖を阻害することができる実質的
に精製されたポリイプチド因子に関する。
多くの種類の腫瘍増殖因子（ＴＧＦ ）および増殖阻害
物質が当該分野で知られている。ホリーらは、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ ７７
．５９８９（１９８０）およびＣｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、Ｉ
ｎｔ、Ｒｅｐｏｒｔｓ７．５２５−５２６ （１９８３
）で、アメリカミンクプル腎Ｂ８Ｃ−１細胞からの強力
な増殖阻害物質の単離について報告している。それは、
ヒト乳癌細胞やヒト正常孔線細胞と同様な産生細胞の増
殖を阻害することがわかった。ミックメイホーンら（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ＋７９
＋４５６−４６０（１９８２）］は、悪性ラット肝細胞
には作用しないが、正常ラット肝細胞には作用する細胞
増殖阻害物質［Ｍｒ（相対分子量） ： ２．６，００
０：］をラットの肝臓から精製した。他の増殖阻害物質
は培養したヒヨコを髄細胞で発見されている［カー１’
７ｃ）、エクスペリメンタル・ニエーロロジー（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ）、 ５８
＋３４７−３６０（１９７８）； バリントンら、Ｐ
ｒｏｃ。
物質が当該分野で知られている。ホリーらは、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ ７７
．５９８９（１９８０）およびＣｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、Ｉ
ｎｔ、Ｒｅｐｏｒｔｓ７．５２５−５２６ （１９８３
）で、アメリカミンクプル腎Ｂ８Ｃ−１細胞からの強力
な増殖阻害物質の単離について報告している。それは、
ヒト乳癌細胞やヒト正常孔線細胞と同様な産生細胞の増
殖を阻害することがわかった。ミックメイホーンら（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ＋７９
＋４５６−４６０（１９８２）］は、悪性ラット肝細胞
には作用しないが、正常ラット肝細胞には作用する細胞
増殖阻害物質［Ｍｒ（相対分子量） ： ２．６，００
０：］をラットの肝臓から精製した。他の増殖阻害物質
は培養したヒヨコを髄細胞で発見されている［カー１’
７ｃ）、エクスペリメンタル・ニエーロロジー（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ）、 ５８
＋３４７−３６０（１９７８）； バリントンら、Ｐ
ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−８ｃｉ、ＵＳＡ ７７．４２３−
４２７ （１９８０）；およびステックら、Ｊ、Ｃｅ１
ｌ Ｂｉｏｌ 、８３ 、５６２−５７５（１９７９）
）。
４２７ （１９８０）；およびステックら、Ｊ、Ｃｅ１
ｌ Ｂｉｏｌ 、８３ 、５６２−５７５（１９７９）
）。
ビカエル（Ｎａｔｕｒｅ、２３１．４４９−４５０ （
１９７１））は、増殖が平坦域に達した腹水癌をもつ九
マウスから癌細胞のｉｔとんどを吸引してしまうと、残
っている癌細胞が急激に増殖することを報告した。十分
増殖した腹水癌を狙ったマウスから得た、細胞を含まな
い腹水液を、増殖中の癌細しく抑制される。ビカエル（
上記雑文で）は、と、初期癌の増殖が著しく抑制される
ことも観察した。これらの観察〔ビカエル、Ｅｕｒｏｐ
、Ｊ。
１９７１））は、増殖が平坦域に達した腹水癌をもつ九
マウスから癌細胞のｉｔとんどを吸引してしまうと、残
っている癌細胞が急激に増殖することを報告した。十分
増殖した腹水癌を狙ったマウスから得た、細胞を含まな
い腹水液を、増殖中の癌細しく抑制される。ビカエル（
上記雑文で）は、と、初期癌の増殖が著しく抑制される
ことも観察した。これらの観察〔ビカエル、Ｅｕｒｏｐ
、Ｊ。
Ｃａｎｃｅｒ、６，２９１−２９６（１９７０）および
ビカエル、上記雑文〕は併体結合のマウス腹膜を通して
循環する拡散可能な阻害因子の存在によって説明され、
その因子は充分に増殖した腹水癌によって産生される、
細胞を含まない腹水中に存在する０この阻害因子の性状
は分かりていないが、腹水癌の増殖率はマウスに存在す
る癌組織の大きさおよび産生された阻害因子の量を規定
する癌組織の大きさく依存していると、推察されｆｃ。
ビカエル、上記雑文〕は併体結合のマウス腹膜を通して
循環する拡散可能な阻害因子の存在によって説明され、
その因子は充分に増殖した腹水癌によって産生される、
細胞を含まない腹水中に存在する０この阻害因子の性状
は分かりていないが、腹水癌の増殖率はマウスに存在す
る癌組織の大きさおよび産生された阻害因子の量を規定
する癌組織の大きさく依存していると、推察されｆｃ。
トダロラ〔グリストルーマイヤーズ・キャンサー・シン
ポジウＬ、（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｇ Ｃａｎｃｅ
ｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ ） ４．２２２２２３ 、 （
１９８２）、）は、ある種の癌細胞・増殖阻害因子の特
性を報告した。
ポジウＬ、（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｇ Ｃａｎｃｅ
ｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ ） ４．２２２２２３ 、 （
１９８２）、）は、ある種の癌細胞・増殖阻害因子の特
性を報告した。
トダロら（上記雑文で）によるこの観察は、部分的に精
製された製剤に基づけば予備的なものであった。それば
かりでなく本発明のＴＩＦはいくつかの基本的な点でこ
れら先行技術のものとは異なっている。すなわち、 （１）先行技術のＴＩＦがＴＧＦ （腫瘍細胞増殖因子
）依存性の正常細胞の増殖を遮断するのに対して、本発
明（７；） ＴＩＦはＴＧＦ依存性正常細胞の増殖を抑
制しない。
製された製剤に基づけば予備的なものであった。それば
かりでなく本発明のＴＩＦはいくつかの基本的な点でこ
れら先行技術のものとは異なっている。すなわち、 （１）先行技術のＴＩＦがＴＧＦ （腫瘍細胞増殖因子
）依存性の正常細胞の増殖を遮断するのに対して、本発
明（７；） ＴＩＦはＴＧＦ依存性正常細胞の増殖を抑
制しない。
（２）先行技術では、阻害因子には異なった群または型
があるかが不明であったが、本発明では、実際、少なく
とも２種類の異なったＴＩＦが単離され、実質的に精製
され、確定された。それらは先行技術のものとは異なっ
ているばかりか、互いに区別し得る。
があるかが不明であったが、本発明では、実際、少なく
とも２種類の異なったＴＩＦが単離され、実質的に精製
され、確定された。それらは先行技術のものとは異なっ
ているばかりか、互いに区別し得る。
（３）以前に知られているＴＩＦと異なって、本発明の
ＴＩＦは新規なミドダン（細胞分裂誘起物質）％性およ
びヒト細胞増殖刺激特性を有している。
ＴＩＦは新規なミドダン（細胞分裂誘起物質）％性およ
びヒト細胞増殖刺激特性を有している。
腫瘍増殖阻害因子は、多様な材料から得られる。例えば
、尿、血清、血漿および羊水のよりな哺乳類の体液；肝
臓、心臓、肺、膵臓、筋肉、脳、胎盤、屓帯、腎臓およ
び膵臓のような哺乳類の成体および胎児の組織；組織培
養による正常ヒト細胞のコンディジ日ンド・メディウム
（細胞培養液の上清）のような様々なコンディションド
・メディウム；組織培養細胞等からの抽出物である。
、尿、血清、血漿および羊水のよりな哺乳類の体液；肝
臓、心臓、肺、膵臓、筋肉、脳、胎盤、屓帯、腎臓およ
び膵臓のような哺乳類の成体および胎児の組織；組織培
養による正常ヒト細胞のコンディジ日ンド・メディウム
（細胞培養液の上清）のような様々なコンディションド
・メディウム；組織培養細胞等からの抽出物である。
腫瘍増殖阻害因子は、酸／エタノール抽出、グル浸透ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー等を含めた様々な実験手法を
用いて単離および精製することができる。
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー等を含めた様々な実験手法を
用いて単離および精製することができる。
添加剤、担体および／またはアジュノくンドの中で、当
該分野でよく知られた適当な物質を、もし必要なら用い
ることができる。好ましい物質として、生理食塩水、水
性溶媒、賦形剤、防腐剤、抗菌剤、殺菌剤等が挙げられ
る。
該分野でよく知られた適当な物質を、もし必要なら用い
ることができる。好ましい物質として、生理食塩水、水
性溶媒、賦形剤、防腐剤、抗菌剤、殺菌剤等が挙げられ
る。
以下に提示されるデータから分かるように、本発明の腫
瘍増殖阻害因子（ＴＩＦ ）は熱安定なタンパクで何種
類も存在する。それはみかけの分子量が３，５００ない
し４５，０００ （ドルトン）の範囲で、等電点（ｐＩ
）が４ないし８であり、ＴＩＦ−ＺとＴＩＦ−２が代表
的である。様々なＴＩＦはいくぶん疎水的であり、逆相
高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のＣ７
８カラムからアセトニトリル２５ないし５０％の間また
は２−プロ・やノールｌＯないし３５％の間で溶出する
。
瘍増殖阻害因子（ＴＩＦ ）は熱安定なタンパクで何種
類も存在する。それはみかけの分子量が３，５００ない
し４５，０００ （ドルトン）の範囲で、等電点（ｐＩ
）が４ないし８であり、ＴＩＦ−ＺとＴＩＦ−２が代表
的である。様々なＴＩＦはいくぶん疎水的であり、逆相
高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のＣ７
８カラムからアセトニトリル２５ないし５０％の間また
は２−プロ・やノールｌＯないし３５％の間で溶出する
。
様々なＴＩＦのいくつかの特徴および性質は以後に記載
する。
する。
「実質的に精製された」という言葉の意味は、純度が８
０チ以上である製剤、好ましくは９０チ以上、さらに好
ましくは９５チ以上である製剤ということである。
０チ以上である製剤、好ましくは９０チ以上、さらに好
ましくは９５チ以上である製剤ということである。
材料と方法
以後に記載する方法に類似したまたは同等の材料、方法
を使用し得るが、次のものが望ましい。
を使用し得るが、次のものが望ましい。
組織抽出物からの腫瘍増殖阻害因子 ＴＩＦ の祖
酸／エタノール抽出法〔ダゲレン、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙａ、Ａｃｔａ、、６３ ｒ １５０（１９
０２）およびロバ−ト ら 、 Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ
ｌ 、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ ＊ ７二
乙 、 ３４９４（１９８０）に記載〕の改良法によ
り、組織を抽出した。すなわち、９５ ％ （Ｖ／Ｖ）
エタノール３７５ｍ、濃塩酸７．５ｍ７！、フッ化フェ
ニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ ） ３３１ｇおよび
アグロチニン（０，９％ＮａＣ６およヒ０．’ ９％ベ
ンジルアルコール中の１Ｏ−２０）リプシン阻害剤単位
（ＴＩＵ ） ） １−から成る溶液に蒸留水１９２ゴ
を混合した。組織をこの溶液に懸濁しく６ｍ／！／組織
１ｇ）、はさみで細かく切りそしてツルバールオムニミ
キサーで均質化した。４℃で一晩抽出後、その混合物を
５０００．９で３０分間遠心し、ペレットを捨てた。そ
の抽出物を濃水酸化アンモニウムでｐＨ５，０に調整し
、抽出物１００ゴ当り１−の２Ｍ蛭蛭子アンモニウム緩
衝液ｐＨ５４２）を加えた。この抽出物を５０００ｇで
３０分間遠心し、沈殿物を除去した。冷無水エーテル４
容と冷無水エタノール２容をただちに加え、この混合物
を一２０℃で４８時間静置させた。生じた析出物を沈殿
させ、液体の大部−分をサイホンで吸い出した。残った
懸濁液を５０００Ｆで３０分間遠心し、ペレットを得た
。
０２）およびロバ−ト ら 、 Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ
ｌ 、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ ＊ ７二
乙 、 ３４９４（１９８０）に記載〕の改良法によ
り、組織を抽出した。すなわち、９５ ％ （Ｖ／Ｖ）
エタノール３７５ｍ、濃塩酸７．５ｍ７！、フッ化フェ
ニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ ） ３３１ｇおよび
アグロチニン（０，９％ＮａＣ６およヒ０．’ ９％ベ
ンジルアルコール中の１Ｏ−２０）リプシン阻害剤単位
（ＴＩＵ ） ） １−から成る溶液に蒸留水１９２ゴ
を混合した。組織をこの溶液に懸濁しく６ｍ／！／組織
１ｇ）、はさみで細かく切りそしてツルバールオムニミ
キサーで均質化した。４℃で一晩抽出後、その混合物を
５０００．９で３０分間遠心し、ペレットを捨てた。そ
の抽出物を濃水酸化アンモニウムでｐＨ５，０に調整し
、抽出物１００ゴ当り１−の２Ｍ蛭蛭子アンモニウム緩
衝液ｐＨ５４２）を加えた。この抽出物を５０００ｇで
３０分間遠心し、沈殿物を除去した。冷無水エーテル４
容と冷無水エタノール２容をただちに加え、この混合物
を一２０℃で４８時間静置させた。生じた析出物を沈殿
させ、液体の大部−分をサイホンで吸い出した。残った
懸濁液を５０００Ｆで３０分間遠心し、ペレットを得た
。
このペレットを１Ｍ酢酸に溶解し、排除分子量３５００
のスペクトラポール（５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ ）管（ス
ペクトラム・メディカル・インダストリース手、カリフ
ォルニア州ロサンゼルス）中で０．２Ｍ酢酸に対して徹
底的に透析した。この物質は１Ｍ酢酸中に４℃で保存す
るか、または凍結乾燥した。
のスペクトラポール（５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ ）管（ス
ペクトラム・メディカル・インダストリース手、カリフ
ォルニア州ロサンゼルス）中で０．２Ｍ酢酸に対して徹
底的に透析した。この物質は１Ｍ酢酸中に４℃で保存す
るか、または凍結乾燥した。
コンディジミント・メディウム（細胞培養液の上溝）
細胞を含まないコンディジミント・メディウムをヒト横
絞筋腫細胞系Ａ６７３から採取した。
絞筋腫細胞系Ａ６７３から採取した。
細胞を、１０チウシ胎児血清を補ったダルベツコ−の最
少必須培地（ＤＭＥＭ ） ５０ ｌ１１７！の入った
コーニング８５０ ｃｍ 回転♂トル（コーニング２
５１４０）中で適当に飽和するまで増殖させた。続いて
、その単層を血清を含まないＤＭＥＭ５０−で２回洗っ
た。各回転Ｒトルを血清を含まないワイマウスの培地（
メロイ・ラプズ社）５０ゴ中で８時間培養した。その培
地を捨て、血清を含まない新しいワイマウスの培地５〇
−と置換え、細胞を４８時間培養した。こうして「コン
ディジミント・メｆイウムＪ’ｅ集め、血清を含まない
新しいワイマウスの培地と置換え、さらに４８時間培養
した。コンディジミント・メディウムは、Ａ６７３細胞
の適当に飽和した単層ごとに３回集め合計した。続いて
集めたコンディジミント・メディウムを溜めて、ベック
マンＣＦ−３２１１：Ｉ−ターを用い３２．００ Ｏｒ
ｐｍ（流出率５．８／時間）で遠心し、透明にした。
少必須培地（ＤＭＥＭ ） ５０ ｌ１１７！の入った
コーニング８５０ ｃｍ 回転♂トル（コーニング２
５１４０）中で適当に飽和するまで増殖させた。続いて
、その単層を血清を含まないＤＭＥＭ５０−で２回洗っ
た。各回転Ｒトルを血清を含まないワイマウスの培地（
メロイ・ラプズ社）５０ゴ中で８時間培養した。その培
地を捨て、血清を含まない新しいワイマウスの培地５〇
−と置換え、細胞を４８時間培養した。こうして「コン
ディジミント・メｆイウムＪ’ｅ集め、血清を含まない
新しいワイマウスの培地と置換え、さらに４８時間培養
した。コンディジミント・メディウムは、Ａ６７３細胞
の適当に飽和した単層ごとに３回集め合計した。続いて
集めたコンディジミント・メディウムを溜めて、ベック
マンＣＦ−３２１１：Ｉ−ターを用い３２．００ Ｏｒ
ｐｍ（流出率５．８／時間）で遠心し、透明にした。
清澄になった物質をアミコンＤＣ−１０中空糸濾過器（
遮断分子量：５０００）ｋ使って１００倍に濃縮（例え
ば５０２を５００７！に）した。濃縮した物質を溜め、
濾過器を２００−の１憚液で洗い残っている因子を除い
た。濃縮液と洗浄液をスペクトロフォー（８ｐｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒ ） ３透析管（遮断分子量：３５００）に
溜め、２．Ｉ３の０．１Ｍ酢酸に対して透析した。透析
した物質をベックマン３５型ローター上にて２７．００
Ｏｒｐｍで１時間遠心した。ベレットヲ捨て、上清を
凍結乾燥した。
遮断分子量：５０００）ｋ使って１００倍に濃縮（例え
ば５０２を５００７！に）した。濃縮した物質を溜め、
濾過器を２００−の１憚液で洗い残っている因子を除い
た。濃縮液と洗浄液をスペクトロフォー（８ｐｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒ ） ３透析管（遮断分子量：３５００）に
溜め、２．Ｉ３の０．１Ｍ酢酸に対して透析した。透析
した物質をベックマン３５型ローター上にて２７．００
Ｏｒｐｍで１時間遠心した。ベレットヲ捨て、上清を
凍結乾燥した。
培養細胞
培養細胞全１０％ＦＢＳ （ギプコ）を補ったダルベツ
コ−の改良型イーグル培地の入った７５ｍ２ｆラステイ
ツク製組織培養フラスコ（フアシヨン３０２４）中で３
７℃に維持した。ただし１０チウシ血清を要求する細胞
系３７３２０２゜４９Ｆおよびキルスタインウィルスで
形質転換した正常ラット腎細胞（ＫＮＲＫ ）にはこの
条件があてはまらない。Ａ３４９はヒト肺の腺癌である
。ＨｕＦは組織培養で１０ないし２５回継代したヒト包
皮線維芽細胞系であり、Ｊ’レビー（サンフランジコク
のカリフォルニア大学、がン研究所）から供与された。
コ−の改良型イーグル培地の入った７５ｍ２ｆラステイ
ツク製組織培養フラスコ（フアシヨン３０２４）中で３
７℃に維持した。ただし１０チウシ血清を要求する細胞
系３７３２０２゜４９Ｆおよびキルスタインウィルスで
形質転換した正常ラット腎細胞（ＫＮＲＫ ）にはこの
条件があてはまらない。Ａ３４９はヒト肺の腺癌である
。ＨｕＦは組織培養で１０ないし２５回継代したヒト包
皮線維芽細胞系であり、Ｊ’レビー（サンフランジコク
のカリフォルニア大学、がン研究所）から供与された。
３Ｔ３２−２はウィグラー（二ニーヨークのコールトス
ゾリングツ１−バー研究所）から供与されたマウスＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞のなかの１種のクローンである。
ゾリングツ１−バー研究所）から供与されたマウスＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞のなかの１種のクローンである。
ダル浸透クロマトグラフィー
凍結乾燥したコンディションド・メディウム（コンディ
ションド・メディウム３０ないし１００２から得た２０
０ないし３００■）を１Ｍ酢酸１５ないし２０ゴ中に再
び懸濁させ、ノ（イオーグルＰ−１００（１００−２０
０メツシユ、ポリアクリルアミドゲルバイオ・ラド）を
つめたカラム（５Ｘ ８２．５ ｃｍ ）にかけ、平衡
化させて、４℃にて１Ｍ酢酸で溶出させた。複数の分画
（１２，４ゴ）を集めた。そして２本置きの各分画から
アリコート２．５μｔを取り、ＴＩＦ活性を測定した。
ションド・メディウム３０ないし１００２から得た２０
０ないし３００■）を１Ｍ酢酸１５ないし２０ゴ中に再
び懸濁させ、ノ（イオーグルＰ−１００（１００−２０
０メツシユ、ポリアクリルアミドゲルバイオ・ラド）を
つめたカラム（５Ｘ ８２．５ ｃｍ ）にかけ、平衡
化させて、４℃にて１Ｍ酢酸で溶出させた。複数の分画
（１２，４ゴ）を集めた。そして２本置きの各分画から
アリコート２．５μｔを取り、ＴＩＦ活性を測定した。
また２本置きの各分画からアリコート１００μｔを取り
ＴＧＦ活性を測定した。増殖調節活性（各種のＴＩＦお
よびＴＧＦ ） ’！ｉ含む分画を３種のプール人ない
しＣ（第１図）に分け、凍結乾燥した。
ＴＧＦ活性を測定した。増殖調節活性（各種のＴＩＦお
よびＴＧＦ ） ’！ｉ含む分画を３種のプール人ない
しＣ（第１図）に分け、凍結乾燥した。
プールＢは凍結乾燥し、パイオーダルＰ−１０カラムで
さらに精製した。凍結乾燥した試料（２０ないし４０１
りｔ１Ｍ酢酸５ないし７ｒｎｌに溶解し、不溶物質を除
くために４℃で３０分間２００Ｉ！で遠心した。上清を
）（イオーグルＰ−１０（２００ないし４００メツシユ
、ポリアクリルアミド、バイオ−ラド）にかけ、平衡化
し２本置きの各分画から取り、ＴＩＦ活性を測定したＯ 逆相高圧液体クロマトグラフィー（Ｒｐ−ａｐｉ、ｃ）
バイオ−ダルＰ−１０カラムからＴＩＦ活性のピークを
含む分画を集めた。典型的にはこれら分画は分画４４な
いし４７であった。コンディジ９ンド・メディウム３０
ないし６０−ｅ相当力）らの物質を各ＨＰＬＣに使用、
シタ。複数のノ（イオーグルＰ−１０分画を合わせて凍
結乾燥した。残渣’ｔＯ，０５％）リフルオロ酢酸１−
に再び懸濁した。この溶液は、不溶物質を除くために１
０００ｇで５分間遠心した。上溝を２ウオーターズμが
ンド・ダーク（μＢｏｎｄａｐａｋ ） Ｃ，Ｂカラム
（０，３９Ｘ３０ａｎ ）に注入した。ＩＢＭの濃度勾
配液体クロマトグラフィー装置（ＩＢＭ ＬＣ／９５３
３ ）を使用した。カラムの溶出液を２０６ ｎｍに設
定した可変波長紫外（ｔｙ、ｖ、）検出器（１，ＢＭ
ＬＣ／９５２３ ）テ監視した。２０６ ｎｍで吸収を
示す主要ピークの分画を集めた。各分画からアリコート
を取り、ＴＩＦまたはＴＧＦ活性を測定した。
さらに精製した。凍結乾燥した試料（２０ないし４０１
りｔ１Ｍ酢酸５ないし７ｒｎｌに溶解し、不溶物質を除
くために４℃で３０分間２００Ｉ！で遠心した。上清を
）（イオーグルＰ−１０（２００ないし４００メツシユ
、ポリアクリルアミド、バイオ−ラド）にかけ、平衡化
し２本置きの各分画から取り、ＴＩＦ活性を測定したＯ 逆相高圧液体クロマトグラフィー（Ｒｐ−ａｐｉ、ｃ）
バイオ−ダルＰ−１０カラムからＴＩＦ活性のピークを
含む分画を集めた。典型的にはこれら分画は分画４４な
いし４７であった。コンディジ９ンド・メディウム３０
ないし６０−ｅ相当力）らの物質を各ＨＰＬＣに使用、
シタ。複数のノ（イオーグルＰ−１０分画を合わせて凍
結乾燥した。残渣’ｔＯ，０５％）リフルオロ酢酸１−
に再び懸濁した。この溶液は、不溶物質を除くために１
０００ｇで５分間遠心した。上溝を２ウオーターズμが
ンド・ダーク（μＢｏｎｄａｐａｋ ） Ｃ，Ｂカラム
（０，３９Ｘ３０ａｎ ）に注入した。ＩＢＭの濃度勾
配液体クロマトグラフィー装置（ＩＢＭ ＬＣ／９５３
３ ）を使用した。カラムの溶出液を２０６ ｎｍに設
定した可変波長紫外（ｔｙ、ｖ、）検出器（１，ＢＭ
ＬＣ／９５２３ ）テ監視した。２０６ ｎｍで吸収を
示す主要ピークの分画を集めた。各分画からアリコート
を取り、ＴＩＦまたはＴＧＦ活性を測定した。
軟寒天増殖阻害検定
試験のための凍結乾燥後の試料を、０．３４％寒天（デ
ィフコ、アが一ノープル）および２ Ｘ １０’のヒト
肺癌細胞Ａ３４９を含む最終容積１．４−の完全増殖培
地（１０％ ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ ）に溶解した。
ィフコ、アが一ノープル）および２ Ｘ １０’のヒト
肺癌細胞Ａ３４９を含む最終容積１．４−の完全増殖培
地（１０％ ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ ）に溶解した。
処理剤み細胞の軟寒天懸濁液を、６０ｍｍシャーレ（フ
ァルコン３００２）につくった完全増殖培地を含む２＃
！Ｉ！の０．５チ寒天加湿した５％Ｃｏ２／９５’％空
気雰囲気中にて３７℃で３週間培養した。７日後、培養
物に完全増殖培地を含む０，３４％寒天１．５コをさら
に加えた。２週間後および３週間後に増殖の様子を顕微
鏡写真で撮影した。
ァルコン３００２）につくった完全増殖培地を含む２＃
！Ｉ！の０．５チ寒天加湿した５％Ｃｏ２／９５’％空
気雰囲気中にて３７℃で３週間培養した。７日後、培養
物に完全増殖培地を含む０，３４％寒天１．５コをさら
に加えた。２週間後および３週間後に増殖の様子を顕微
鏡写真で撮影した。
腫瘍増殖阻害因子検定
試験細胞（３×１０３細胞／穴）を、完全培地５０μＬ
の入った９６穴組織培養板（タンク１６７００８）上で
二次培養した。ヒト肺癌細胞Ａ３４９はｌ穴あたり４．
５Ｘ１０３細胞の播種密度を必要とした。カラム分画か
らのアリコートによｆｉ ＴＩＦ活性を測定するが、そ
のアリコート全ウシ血清アルグミン（ＢＳＡ ） （シ
グマＡ−６００３）１η／ゴＩＭ酢酸溶液５０μｔを含
む滅菌済み１２ Ｘ ７５ ｍｍ試験管に移し、凍結乾
燥した。検定直前にその凍結乾燥した試料を完全培地２
００μを中に再び懸濁させた。再懸濁させた試料のアリ
コート５０μｔ２試験細胞を含む穴に加えた。各サンプ
ルを３回検定した。
の入った９６穴組織培養板（タンク１６７００８）上で
二次培養した。ヒト肺癌細胞Ａ３４９はｌ穴あたり４．
５Ｘ１０３細胞の播種密度を必要とした。カラム分画か
らのアリコートによｆｉ ＴＩＦ活性を測定するが、そ
のアリコート全ウシ血清アルグミン（ＢＳＡ ） （シ
グマＡ−６００３）１η／ゴＩＭ酢酸溶液５０μｔを含
む滅菌済み１２ Ｘ ７５ ｍｍ試験管に移し、凍結乾
燥した。検定直前にその凍結乾燥した試料を完全培地２
００μを中に再び懸濁させた。再懸濁させた試料のアリ
コート５０μｔ２試験細胞を含む穴に加えた。各サンプ
ルを３回検定した。
釧杓歩加儒１奇へ４Ｃｎ−／ｑ５ギ窄偵窺囲ケ中〒′
３７℃にて７２時間培養した。培養期間の終りに各人
を５（Ｉ）アイオド−２−デオキシウリ＆７（ＩＵｄＲ
）（７メ＃スハムＩＭ、３５５Ｖ）１μＣｉ／−を含む
完全培地１００μｔで２４時間処理した。単層を緩衝液
［ｌＩｎ９／１ｎｔＢ８Ａおよび５０ ｍＭ ２−シス
（２−とドロキシエチル）アミノエタンスルホン酸を含
むダルベツコ−の改良型イーグル培地、ｐＨ６，８］で
一度洗浄し、無水メタノール中で１０分間固定し、１５
分間空気乾燥した。細胞に取込まれた ＩＵｄＲをｌ
ＮＮａ０ｆ（２００μｔで可溶化し、６０℃で２０分間
インキエベートした。各穴中の細胞によって取込まれ、
可溶化された Ｉ［ＪｄＲをタイターチック上澄回収
システム（７０・ラボラトリーズ、７８−２１０−０５
） ｔ−用いて回収・測定した。細胞増殖の量を、対
数増殖期にある細胞のＤＮＡ Ｋ取込まれた１２５ＩＵ
ｄＲの量から概算した。検定を行なう前に、細胞め増殖
程度を肉眼で確認するために、各穴をラインの倒立顕微
鏡を使って観察した。顕微鏡観察による処理細胞の増殖
阻害の程度は、 ＩＵｄＲの取込み量の減少と一致し
ていた。増殖の阻害は、未処理の対照細胞によって取込
まれた ＩＵｄＲに対するＴＩＦで処理した試験細胞
（例えばヒト腫瘍細胞）に取込まれた１２５ＩＵｄＲの
比によって表わした。単層培養中で腫瘍細胞の、”５Ｉ
ＵｄＲの取込みを最も阻害するカラム分画は、軟寒天上
で腫瘍細胞の増殖を最も阻害した。細胞増殖の増大が顕
微鏡観察で認められる条件は１２５ＩＵｄＲの取込みの
増大と一致していた。細胞増殖の増大は、・り−セント
刺激として表わされるが、未処理の対照細胞により取込
まれた’ ２５ＩＵｄＲに対してＴＩＦで処理した試験
細胞（例えば、正常ヒト細胞）により取込まれた１２５
１ＵｄＲの比に対応する。
３７℃にて７２時間培養した。培養期間の終りに各人
を５（Ｉ）アイオド−２−デオキシウリ＆７（ＩＵｄＲ
）（７メ＃スハムＩＭ、３５５Ｖ）１μＣｉ／−を含む
完全培地１００μｔで２４時間処理した。単層を緩衝液
［ｌＩｎ９／１ｎｔＢ８Ａおよび５０ ｍＭ ２−シス
（２−とドロキシエチル）アミノエタンスルホン酸を含
むダルベツコ−の改良型イーグル培地、ｐＨ６，８］で
一度洗浄し、無水メタノール中で１０分間固定し、１５
分間空気乾燥した。細胞に取込まれた ＩＵｄＲをｌ
ＮＮａ０ｆ（２００μｔで可溶化し、６０℃で２０分間
インキエベートした。各穴中の細胞によって取込まれ、
可溶化された Ｉ［ＪｄＲをタイターチック上澄回収
システム（７０・ラボラトリーズ、７８−２１０−０５
） ｔ−用いて回収・測定した。細胞増殖の量を、対
数増殖期にある細胞のＤＮＡ Ｋ取込まれた１２５ＩＵ
ｄＲの量から概算した。検定を行なう前に、細胞め増殖
程度を肉眼で確認するために、各穴をラインの倒立顕微
鏡を使って観察した。顕微鏡観察による処理細胞の増殖
阻害の程度は、 ＩＵｄＲの取込み量の減少と一致し
ていた。増殖の阻害は、未処理の対照細胞によって取込
まれた ＩＵｄＲに対するＴＩＦで処理した試験細胞
（例えばヒト腫瘍細胞）に取込まれた１２５ＩＵｄＲの
比によって表わした。単層培養中で腫瘍細胞の、”５Ｉ
ＵｄＲの取込みを最も阻害するカラム分画は、軟寒天上
で腫瘍細胞の増殖を最も阻害した。細胞増殖の増大が顕
微鏡観察で認められる条件は１２５ＩＵｄＲの取込みの
増大と一致していた。細胞増殖の増大は、・り−セント
刺激として表わされるが、未処理の対照細胞により取込
まれた’ ２５ＩＵｄＲに対してＴＩＦで処理した試験
細胞（例えば、正常ヒト細胞）により取込まれた１２５
１ＵｄＲの比に対応する。
ミドダン（細胞分裂誘起物質）検定
１０％ウシ血清を補ったＤＭＥＭ １００μｔの入った
９６穴組織培養板（タンク１６７００８ ）中で試験細
胞（−３Ｔ３２−２ ）を二次培養（１，５Ｘ１０’細
胞／穴）Ｌ、３７℃で２４時間培養した。培地を、０．
５１ウシ血清を補ったワイマウス培地（１００μｔ／穴
）で置換え、３７℃でもう一回２４時間培養した。試験
するカラム分画のアリコートを、１Ｍ酢酸５０μｔを含
む滅菌済み１２Ｘ７５ｍ試験管（ファルコン２０５８）
へ移し、凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を２μＣｉ／
−の１２５ＩＵｄＲを含む血清の入っていないワイマウ
ス培地３００μｔに再び懸濁し、３回検定した。
９６穴組織培養板（タンク１６７００８ ）中で試験細
胞（−３Ｔ３２−２ ）を二次培養（１，５Ｘ１０’細
胞／穴）Ｌ、３７℃で２４時間培養した。培地を、０．
５１ウシ血清を補ったワイマウス培地（１００μｔ／穴
）で置換え、３７℃でもう一回２４時間培養した。試験
するカラム分画のアリコートを、１Ｍ酢酸５０μｔを含
む滅菌済み１２Ｘ７５ｍ試験管（ファルコン２０５８）
へ移し、凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を２μＣｉ／
−の１２５ＩＵｄＲを含む血清の入っていないワイマウ
ス培地３００μｔに再び懸濁し、３回検定した。
再懸濁した試料１００μｔを、０，５％ウシ血清の入っ
たワイマウス培地１００μｔと試験細胞を含む各穴に加
えた。もう−回２４時間３７℃で培養したのち、単層を
洗い、腫瘍増殖阻害因子検定のために前記の通りに回収
した。
たワイマウス培地１００μｔと試験細胞を含む各穴に加
えた。もう−回２４時間３７℃で培養したのち、単層を
洗い、腫瘍増殖阻害因子検定のために前記の通りに回収
した。
混合実験
第４図のＲＰ−ＨＰＬＣ精製段階から得た２８ないし３
３チアセトニトリルで溶出する分画、すなわちＴＩＦ−
１活性を有する分画をこの実験で使用した。バイオ−ｒ
ルＰ−１００カラムのゾールＡ（第１図）に由来する分
子量２０，０００のＴＧＦをμゲンダノ！−りＣ１８カ
ラムを取付けたＲＰ−ｆ（ＰＬＯを用い、０．０５チド
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かした２０％アセトニト
リルで直線濃度勾配をかけて溶出させた。それをさらに
０．０５チドリフルオロ酢酸に溶かした１２チゾＤ ／
４’ノールで直線濃度勾配をかけて溶出させながらμメ
ンダノｆ−りＣ１８カラムで精製した。
３チアセトニトリルで溶出する分画、すなわちＴＩＦ−
１活性を有する分画をこの実験で使用した。バイオ−ｒ
ルＰ−１００カラムのゾールＡ（第１図）に由来する分
子量２０，０００のＴＧＦをμゲンダノ！−りＣ１８カ
ラムを取付けたＲＰ−ｆ（ＰＬＯを用い、０．０５チド
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かした２０％アセトニト
リルで直線濃度勾配をかけて溶出させた。それをさらに
０．０５チドリフルオロ酢酸に溶かした１２チゾＤ ／
４’ノールで直線濃度勾配をかけて溶出させながらμメ
ンダノｆ−りＣ１８カラムで精製した。
Ａ３４９細胞（検定あたり１．５Ｘ１０ 細胞）を完全
培地０．３ ｙｔに溶かしたＴＧＦおよび／またはＴＩ
Ｆ−１と混合した。０．５％寒天溶液０．６４−と各分
画を混合し、その懸濁液を２゛４穴組織培養シャーレ（
タンク１６９６９０ ）中の０．５％寒天基層に加えた
。シャーレを加湿した５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気中
で３７℃に繍培養した。３週間後、コロニーを０．０５
２％ｐ−アイオドニトロテトラゾリウムバイオレット（
１１） ０．５ ｄで染色した。（Ｎ：未処理対照細胞
。（Ｂ−Ｄ） ： ＴＩＦ−１の１：５逓減希釈液（Ｂ
ではタンｔ４り１５μＩ／ＩＩＩｔ）で処理した細胞。
培地０．３ ｙｔに溶かしたＴＧＦおよび／またはＴＩ
Ｆ−１と混合した。０．５％寒天溶液０．６４−と各分
画を混合し、その懸濁液を２゛４穴組織培養シャーレ（
タンク１６９６９０ ）中の０．５％寒天基層に加えた
。シャーレを加湿した５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気中
で３７℃に繍培養した。３週間後、コロニーを０．０５
２％ｐ−アイオドニトロテトラゾリウムバイオレット（
１１） ０．５ ｄで染色した。（Ｎ：未処理対照細胞
。（Ｂ−Ｄ） ： ＴＩＦ−１の１：５逓減希釈液（Ｂ
ではタンｔ４り１５μＩ／ＩＩＩｔ）で処理した細胞。
（Ｅ） ＴＧＦ １２ ｎｌ当量／１ｄｃｎｉ当量とは
、放射線受容体検定において既知の濃度のｇＧＦ （上
皮増殖因子）に対して競合するＴＧＦの濃度と定義する
〕で処理された細胞。（Ｆ−Ｈ） ：ＴＧＦ １２ ｎ
１当量／−およびＴＩＦ−７の１＝５逓減希釈液（Ｆで
はタンパク１５μｔ ／ ｒｒｔ ）で処理した細胞。
、放射線受容体検定において既知の濃度のｇＧＦ （上
皮増殖因子）に対して競合するＴＧＦの濃度と定義する
〕で処理された細胞。（Ｆ−Ｈ） ：ＴＧＦ １２ ｎ
１当量／−およびＴＩＦ−７の１＝５逓減希釈液（Ｆで
はタンパク１５μｔ ／ ｒｒｔ ）で処理した細胞。
ＴＩＦの特性決定
トリノシシ感受性は、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ
７，４）０．９−中のＴＩＦ ７６μｇにトリプシン（
シグマＴ８２５３）２５０μｇを添加して、それを３７
℃で１時間培養して試験した。トリプシンは、ダイズト
リグシンインヒビター（シグマ・Ｔ−９００３） ５０
０μＩを加えることによって不活性化した。処理したＴ
ＩＦおよび対照ＴＩＦ両方を室温でもう１時間培養した
。続いて各試料に１Ｍ酢酸０．２Ｆｎｔを添加し、ただ
ちに凍結乾燥した。
７，４）０．９−中のＴＩＦ ７６μｇにトリプシン（
シグマＴ８２５３）２５０μｇを添加して、それを３７
℃で１時間培養して試験した。トリプシンは、ダイズト
リグシンインヒビター（シグマ・Ｔ−９００３） ５０
０μＩを加えることによって不活性化した。処理したＴ
ＩＦおよび対照ＴＩＦ両方を室温でもう１時間培養した
。続いて各試料に１Ｍ酢酸０．２Ｆｎｔを添加し、ただ
ちに凍結乾燥した。
還元剤の効果は、０．０６５Ｍジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ ） （シュワルツ／マン、９０２５１）を含む０
．１ Ｍ ＮＨ４ＨＣ０，０，９ゴ中の７６μｇＴＩＦ
（バイオダルＰ−１００のゾールＢ）を室温で１時間培
養して試験した。ＤＴＴ処理のＴＩＦのアリコートおよ
び未処理対照のアリコートをスペクトロフォー３透析管
に移し、１チ酢酸（ｖ／ｖ）に対して徹底的に透析した
。次に、透析後の試料を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性を試験
した。
ＴＴ ） （シュワルツ／マン、９０２５１）を含む０
．１ Ｍ ＮＨ４ＨＣ０，０，９ゴ中の７６μｇＴＩＦ
（バイオダルＰ−１００のゾールＢ）を室温で１時間培
養して試験した。ＤＴＴ処理のＴＩＦのアリコートおよ
び未処理対照のアリコートをスペクトロフォー３透析管
に移し、１チ酢酸（ｖ／ｖ）に対して徹底的に透析した
。次に、透析後の試料を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性を試験
した。
ＴＩＦの熱安定性は、ＴＩＦのいくつかのアリコ−）３
６０μｙを１Ｍ酢酸１−に再懸濁し、１つのアリコート
を５６℃３０分およびもう１つのアリコートを沸騰水中
で３分間処理して試験した。熱処理したアリコートと熱
処理をしない対照を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性の試験をし
た。
６０μｙを１Ｍ酢酸１−に再懸濁し、１つのアリコート
を５６℃３０分およびもう１つのアリコートを沸騰水中
で３分間処理して試験した。熱処理したアリコートと熱
処理をしない対照を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性の試験をし
た。
〔実施例１〕
ＴＧＦおよびＴＩＦ ｔ−含み血清の入っていないコン
ディションドメディウム（ヒト腫瘍細胞系Ａ６７３に由
来）はバイオダルＰ−１００カラムにかけられ、分画に
分けられた（第１図）。タンパクの大部分は排除体積の
部分に溶出する。第１図から明らかなように、分画５５
ないし６８にＴＧＦ活性を明確に示す部分〔ゾールＡ
（Ｍｒ ＝２０．０００）と標示〕があった。ＴＧＦ活
性は、分画から取ったアリコートの、上皮成長因子（Ｅ
ＧＦ’）に対する受容体への結合に拮抗する能力を測定
して決めた。トダロら［Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ 、Ａｃ
ａｄ 、Ｓｃｌ ＊ＵＳＡ 、 ７７ 、５２５８−５
２６２ ）の放射線受容体検定法を使用した。
ディションドメディウム（ヒト腫瘍細胞系Ａ６７３に由
来）はバイオダルＰ−１００カラムにかけられ、分画に
分けられた（第１図）。タンパクの大部分は排除体積の
部分に溶出する。第１図から明らかなように、分画５５
ないし６８にＴＧＦ活性を明確に示す部分〔ゾールＡ
（Ｍｒ ＝２０．０００）と標示〕があった。ＴＧＦ活
性は、分画から取ったアリコートの、上皮成長因子（Ｅ
ＧＦ’）に対する受容体への結合に拮抗する能力を測定
して決めた。トダロら［Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ 、Ａｃ
ａｄ 、Ｓｃｌ ＊ＵＳＡ 、 ７７ 、５２５８−５
２６２ ）の放射線受容体検定法を使用した。
第１図に、ＴＩＦ活性のある３つの主要領域を示す。大
きな分子量をもつＴＩＦはＭｒ ＝ ２８，０００部分
に溶出した。プールＢと標示されたＴＩＦ活性（分画６
９ないし９５）は１０，０００ないし１６．０００のＭ
ｒに相当した。ゾールＣと標示されたＴＩＦ活性（分画
９６ないし１３３）は５，０００ないし１０，０００の
Ｍｒに相当した。ＴＩＦ活性のある各主要領域にはいく
ぶん異質性があった。
きな分子量をもつＴＩＦはＭｒ ＝ ２８，０００部分
に溶出した。プールＢと標示されたＴＩＦ活性（分画６
９ないし９５）は１０，０００ないし１６．０００のＭ
ｒに相当した。ゾールＣと標示されたＴＩＦ活性（分画
９６ないし１３３）は５，０００ないし１０，０００の
Ｍｒに相当した。ＴＩＦ活性のある各主要領域にはいく
ぶん異質性があった。
第１図で観察されたＴＩＦ活性のある３領域はどつかの
アリコートを、軟寒天上のヒト腫瘍細胞増殖に対するそ
れらの影響について調べた。第２図は軟寒天中でのヒト
癌Ａ３４９細胞の顕微鏡写真である。腫瘍細胞の未処理
対照懸濁液は中での増殖能が著しく阻害された。顕微鏡
写真（第２図）に見られるように、処理された腫瘍細胞
は軟寒天中で増殖しえないが、細胞死やそれに続く自己
消化には至らないようであった。
アリコートを、軟寒天上のヒト腫瘍細胞増殖に対するそ
れらの影響について調べた。第２図は軟寒天中でのヒト
癌Ａ３４９細胞の顕微鏡写真である。腫瘍細胞の未処理
対照懸濁液は中での増殖能が著しく阻害された。顕微鏡
写真（第２図）に見られるように、処理された腫瘍細胞
は軟寒天中で増殖しえないが、細胞死やそれに続く自己
消化には至らないようであった。
プールＢをＨＰＬＣで精製したＴＩＦに関して、軟寒天
中でのＡ３４９の増殖阻害が同様に観察された。これら
の結果によれば、ＴＩＦは細胞毒性があるというよりも
増殖阻害作用があると思われた。
中でのＡ３４９の増殖阻害が同様に観察された。これら
の結果によれば、ＴＩＦは細胞毒性があるというよりも
増殖阻害作用があると思われた。
血清の入っていないコンディションド・メディウムから
得られた腫瘍増殖阻害活性は、インターフェロン活性が
存在するためであるとは言えない。ヒト肺癌細胞の増殖
阻害は、わずか３国際年位（ＩＵ）と低い力価のインタ
ーフェロンで処理した後観察された。これに匹敵する腫
瘍細胞増殖の阻害が、ゾールＢからのＴＩＦ ３６０ｎ
、ｐ／ｍ／による処理で観察された。しかし、このＴＩ
Ｆ試料の１０００倍濃縮液を試験したときインターフェ
ロン活性は検出されなかった。
得られた腫瘍増殖阻害活性は、インターフェロン活性が
存在するためであるとは言えない。ヒト肺癌細胞の増殖
阻害は、わずか３国際年位（ＩＵ）と低い力価のインタ
ーフェロンで処理した後観察された。これに匹敵する腫
瘍細胞増殖の阻害が、ゾールＢからのＴＩＦ ３６０ｎ
、ｐ／ｍ／による処理で観察された。しかし、このＴＩ
Ｆ試料の１０００倍濃縮液を試験したときインターフェ
ロン活性は検出されなかった。
正常ヒト線維芽細胞（ＨＩＩＦ ）およびヒト肺癌（Ａ
５４９）をＴＩＰ−７の濃度を順次高めて処理したとき
、ヒト腫瘍細胞の濃度依存性阻害は認められたが、正常
ヒト線維芽細胞の濃度依存性刺激は認められなかった。
５４９）をＴＩＰ−７の濃度を順次高めて処理したとき
、ヒト腫瘍細胞の濃度依存性阻害は認められたが、正常
ヒト線維芽細胞の濃度依存性刺激は認められなかった。
ヒト腫瘍細胞はＴＩＦ−７により阻害されたが、正常ヒ
ト線維芽細胞は阻害されなかった。したがってＴＩＦ−
１はすべての細胞の増殖を阻害するものではない。
ト線維芽細胞は阻害されなかった。したがってＴＩＦ−
１はすべての細胞の増殖を阻害するものではない。
ＴＩＦ−７は、第４図に示すようにμ？ンダａＪ？ −
りＣ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより、アセト
ニトリル／ ０．０５ ％ ＴＦＡを３段階の直線濃度
勾配をかけて、プールＢ（第１図）から精製された。溶
出は次のように行なった。まず０．０５１ＴＦＡ中のア
セトニトリルＯないし２５％の直線濃度勾配置５分、つ
ぎに０．０５１ ＴＦＡ中のアセトニ） ＩＪル２５な
いし４５チの直線濃度勾配８０分、さらに０．０５％Ｔ
ＦＡ中のアセトニトリル４５ないし１００％の直線濃度
勾配置５分。
りＣ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより、アセト
ニトリル／ ０．０５ ％ ＴＦＡを３段階の直線濃度
勾配をかけて、プールＢ（第１図）から精製された。溶
出は次のように行なった。まず０．０５１ＴＦＡ中のア
セトニトリルＯないし２５％の直線濃度勾配置５分、つ
ぎに０．０５１ ＴＦＡ中のアセトニ） ＩＪル２５な
いし４５チの直線濃度勾配８０分、さらに０．０５％Ｔ
ＦＡ中のアセトニトリル４５ないし１００％の直線濃度
勾配置５分。
ＴＩＦ活性は、２つの異なったアセトニトリル濃度で溶
出したところに観察された。すなわち２８−３３％間の
アセトニトリル濃度のところと、３８−４２％間のアセ
トニトリル濃度のところである。これらのＴＩＦ活性を
ＴＩＦ−１と標示した。
出したところに観察された。すなわち２８−３３％間の
アセトニトリル濃度のところと、３８−４２％間のアセ
トニトリル濃度のところである。これらのＴＩＦ活性を
ＴＩＦ−１と標示した。
３８チないし４２％間のアセトニトリル濃度で溶出する
ＴＩＦ活性は、ノールＡからのいくつかの重複した分画
をプールＢ（第１図）と混ぜてＲＰ−ＨＰＬＣ（第４図
）で精製したとき、観察された。バイオダルＰ−１０カ
ラムの斜線部分かう集めた分画を、ＲＰ−ＨＰＬＣにて
２８％ないし３３チ間で溶出させると、ＴＩＦ−７活性
をもつピーク２つのみが生じた。
ＴＩＦ活性は、ノールＡからのいくつかの重複した分画
をプールＢ（第１図）と混ぜてＲＰ−ＨＰＬＣ（第４図
）で精製したとき、観察された。バイオダルＰ−１０カ
ラムの斜線部分かう集めた分画を、ＲＰ−ＨＰＬＣにて
２８％ないし３３チ間で溶出させると、ＴＩＦ−７活性
をもつピーク２つのみが生じた。
ヒト肺癌細胞の増殖はＴ、ＩＦ−７により阻害されるが
、ヒト正常ヒト細胞はＴＩＦ−１により刺激されること
が観察された。したがって、ＴＩＦ−２を使って、血清
飢餓状態の静止期の３Ｔ３マウス細胞でのミトゲン活性
の試験を行なった。
、ヒト正常ヒト細胞はＴＩＦ−１により刺激されること
が観察された。したがって、ＴＩＦ−２を使って、血清
飢餓状態の静止期の３Ｔ３マウス細胞でのミトゲン活性
の試験を行なった。
ＴＩｒ−ｒを含む分画からのアリコートのＴＩＦ量は、
観察されたミ）ｆン活性量と一致していた（第 、４図
）。ヒト腫瘍細胞でのＴＩＦの阻害活性は、正常マウス
および正常ヒト細胞でのミトゲン活性と一致していたが
、この一致はＴＩＦ精製のすべての段階で観察された。
観察されたミ）ｆン活性量と一致していた（第 、４図
）。ヒト腫瘍細胞でのＴＩＦの阻害活性は、正常マウス
および正常ヒト細胞でのミトゲン活性と一致していたが
、この一致はＴＩＦ精製のすべての段階で観察された。
したがって、ＴＩＦ−２は標的細胞の性質に依存する様
々な生物学的特性を有している。
々な生物学的特性を有している。
μボンダパークＣ１８カラムを使って２８ないし３３チ
間のアセトニトリルで溶出するＴＩＦ−７活性は、さら
にμゴンダノや−りｃ、８カラムを使ったＲＰ−ＨＰＬ
Ｃにょシ精製した（第５図）。溶出は２−ｆ口Ａノール
の直線濃度勾配をかけて次のように行なった。すなわち
、０．０５％ＴＦＣ中の２−プロパノール０．１８％の
直線濃度勾配置０分、０．０５係ＴＦＣ中の２−ゾロノ
母ノール１８ないし２２チの直線濃度勾配６０分、０．
０５ｆｉ ＴＦＣ中の２−７°ｃ１パノール２２ないし
２８チの直線濃度勾配６０分、０，０５チＴＦＣ中の２
−プロ・臂ノール２８ないし３０％の直線濃度勾配置０
分、０．０５チＴＦＣ中の２−ゾロノぐノール３０ない
し１００％の直線濃度勾配置５分。
間のアセトニトリルで溶出するＴＩＦ−７活性は、さら
にμゴンダノや−りｃ、８カラムを使ったＲＰ−ＨＰＬ
Ｃにょシ精製した（第５図）。溶出は２−ｆ口Ａノール
の直線濃度勾配をかけて次のように行なった。すなわち
、０．０５％ＴＦＣ中の２−プロパノール０．１８％の
直線濃度勾配置０分、０．０５係ＴＦＣ中の２−ゾロノ
母ノール１８ないし２２チの直線濃度勾配６０分、０．
０５ｆｉ ＴＦＣ中の２−７°ｃ１パノール２２ないし
２８チの直線濃度勾配６０分、０，０５チＴＦＣ中の２
−プロ・臂ノール２８ないし３０％の直線濃度勾配置０
分、０．０５チＴＦＣ中の２−ゾロノぐノール３０ない
し１００％の直線濃度勾配置５分。
ＴＩＦ−７は、２−ノロパノー ル１８チないし２２−
間で溶出することが認められた。ＲＰ−１（ＰＬＣを使
って２−グロΔノールの直線濃度勾配により精製したＴ
ＩＦ−７は、２０６ ｎｍにおける吸光度から概算され
るように一連のｎ１７ｍ１．の濃度で著しいＴＩＦ活性
を示した０ ＴＩＦ−７の特性 ＴＩＦ−７の特性をいくつか第１表に示す。
間で溶出することが認められた。ＲＰ−１（ＰＬＣを使
って２−グロΔノールの直線濃度勾配により精製したＴ
ＩＦ−７は、２０６ ｎｍにおける吸光度から概算され
るように一連のｎ１７ｍ１．の濃度で著しいＴＩＦ活性
を示した０ ＴＩＦ−７の特性 ＴＩＦ−７の特性をいくつか第１表に示す。
ＴＩＦ−１はトリプシンやＤＴＴにより不活化される。
このことから、ＴＩＦ−７は活性に完全なジスルフィド
結合を必要とするタンパクであることが示唆される。Ｔ
ＩＦ−１は、５６℃３０分および１００℃３分の熱処理
に対して安定である。ヒト癌細胞の増殖阻害は、ＴＩＦ
−１が１時間以内に除かれれば、９５チ可逆的であった
。腫瘍細胞をＴＩＦ−２に長く晒すと、増殖の阻害度が
対応して高まった。
結合を必要とするタンパクであることが示唆される。Ｔ
ＩＦ−１は、５６℃３０分および１００℃３分の熱処理
に対して安定である。ヒト癌細胞の増殖阻害は、ＴＩＦ
−１が１時間以内に除かれれば、９５チ可逆的であった
。腫瘍細胞をＴＩＦ−２に長く晒すと、増殖の阻害度が
対応して高まった。
第 １ 表
７６ 対照 ５１
７６ トリジシン １２７６
対照 ５７ ７６ ＤＴＴ １６３
６０ 対照 ６３ ３６０ ５６℃３ケ今 ６２３６
０ １００℃３分 ５５ ヒトおよびヒト以外の様々な細胞系の増殖に対するＴＩ
Ｆ−１の阻害活性スペクトルを第２表に示す。正常ヒト
細胞の増殖がＴＩＦ−７により刺激されることは注目に
価する。これらの研究には以下の細胞が含まれる。すな
わち生体外でｌＯないし２５回継代した正常ヒト線維芽
細胞株、ヒト線維芽細胞の初期継代細胞（組織移植片か
ら６回の継代）および正常ヒト上皮細胞の初期継代細胞
（組織移植片から３回の継代）。肺腺癌Ａ３４９および
乳癌ＭＣＦ ７のような何種類かの細胞はＴＩＦ−７に
よる増殖阻害に対して高い感受性を示した。膀胱癌や黒
色腫のような他の腫瘍は増殖阻害に対して感受性が低か
った。正常アメリカミンク肺上皮細胞も感受性は非常に
低かった。
対照 ５７ ７６ ＤＴＴ １６３
６０ 対照 ６３ ３６０ ５６℃３ケ今 ６２３６
０ １００℃３分 ５５ ヒトおよびヒト以外の様々な細胞系の増殖に対するＴＩ
Ｆ−１の阻害活性スペクトルを第２表に示す。正常ヒト
細胞の増殖がＴＩＦ−７により刺激されることは注目に
価する。これらの研究には以下の細胞が含まれる。すな
わち生体外でｌＯないし２５回継代した正常ヒト線維芽
細胞株、ヒト線維芽細胞の初期継代細胞（組織移植片か
ら６回の継代）および正常ヒト上皮細胞の初期継代細胞
（組織移植片から３回の継代）。肺腺癌Ａ３４９および
乳癌ＭＣＦ ７のような何種類かの細胞はＴＩＦ−７に
よる増殖阻害に対して高い感受性を示した。膀胱癌や黒
色腫のような他の腫瘍は増殖阻害に対して感受性が低か
った。正常アメリカミンク肺上皮細胞も感受性は非常に
低かった。
ヒト腫瘍細胞を組織培養で維持したとき、ＴＩＦ −１
の処理による増殖阻害への感受性に関する影響も同様に
調べた。ヒト腫瘍細胞を組織培養で長く維持すればする
ほど、ＴＩＦ、−１で処理したとき、それは増殖阻害に
対してより強い抵抗性を示すようになった。ＴＩＦ −
１の供給源であるヒト横絞筋腫（Ａ６７３）および肺癌
（Ａ５４９）がこの効果を示した（第２表）。少ない回
数継代した細胞の増殖阻害に対する感受性は高いが、何
回も継代した細胞はより強い抵抗性を示した。ヒト腫瘍
が１次移殖片により類似していればしているほど、それ
はＴＩＦ −１による阻害に対してより強い反応性を示
すと考えられる。
の処理による増殖阻害への感受性に関する影響も同様に
調べた。ヒト腫瘍細胞を組織培養で長く維持すればする
ほど、ＴＩＦ、−１で処理したとき、それは増殖阻害に
対してより強い抵抗性を示すようになった。ＴＩＦ −
１の供給源であるヒト横絞筋腫（Ａ６７３）および肺癌
（Ａ５４９）がこの効果を示した（第２表）。少ない回
数継代した細胞の増殖阻害に対する感受性は高いが、何
回も継代した細胞はより強い抵抗性を示した。ヒト腫瘍
が１次移殖片により類似していればしているほど、それ
はＴＩＦ −１による阻害に対してより強い反応性を示
すと考えられる。
第２表に掲げたヒト腫瘍細胞のすべては、その増殖がＴ
ＩＦ −１処理により阻害された。ウィルスにより形質
転換した細胞に対するＴＩＦ −１の効果を第３表に示
す。第２表で見られたように、正常ヒト線維芽細胞Ｗ１
３８の増殖はＴＩＦ−１の処理により阻害されず、むし
ろ増殖の刺激が観察された。しかしながら、他方ＳＶ４
０で形質転換した細胞の増殖はＴＩＦ −１により著し
く阻害された。ウィルスで形質転換した細胞のこのよう
な増殖阻害はラットの細胞でも同様に観察された。正常
ラット腎細胞（ＮＲＫ ）の増殖はＴＩＦ −１により
阻害されなかった。しかし、ＴＩＦ −１で処理したこ
れらの細胞の増殖は若干刺激されることが観察された。
ＩＦ −１処理により阻害された。ウィルスにより形質
転換した細胞に対するＴＩＦ −１の効果を第３表に示
す。第２表で見られたように、正常ヒト線維芽細胞Ｗ１
３８の増殖はＴＩＦ−１の処理により阻害されず、むし
ろ増殖の刺激が観察された。しかしながら、他方ＳＶ４
０で形質転換した細胞の増殖はＴＩＦ −１により著し
く阻害された。ウィルスで形質転換した細胞のこのよう
な増殖阻害はラットの細胞でも同様に観察された。正常
ラット腎細胞（ＮＲＫ ）の増殖はＴＩＦ −１により
阻害されなかった。しかし、ＴＩＦ −１で処理したこ
れらの細胞の増殖は若干刺激されることが観察された。
ウィルスで形質転換したＮＲＫキルステン肉腫（ＫＮＲ
Ｋ ）細胞の増殖もＴＩＦ −１により阻害された。Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡウィルスで形質転換した細胞の増殖は
ＴＩＦ−１により阻害されるが、一方その親である非形
質転換細胞は増殖が刺激された。
Ｋ ）細胞の増殖もＴＩＦ −１により阻害された。Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡウィルスで形質転換した細胞の増殖は
ＴＩＦ−１により阻害されるが、一方その親である非形
質転換細胞は増殖が刺激された。
第 ３ 表
Ｗｉ−３８：ヒト胎児肺 ３２５ ０ １
８（ＣＣＬ ７５） Ｗｉ−３８： ５ｖａｏ形質転換型 ３２５ ３０
０（ＣＣＬ ７５．１） ＮＲＫ−４９Ｆ ：正常ラット腎 ５８ ０
１８（ＣＲＬ １５７０） ＫＮＲＫ：キルステン形質転換 ５８ ４５
０型ＮＲＫ （ＣＲＬ １５６９） ヒト腫瘍細胞由来のコンディションド・メディウムは、
複数の腫瘍増殖因子（ＴＧＦ ）と複数の腫瘍増殖阻害
因子（ＴＩＦ ）の両方を含むことが観察された。ＴＩ
Ｆ 、 ＴＧＦ （両方とも同一材料の腫瘍細胞コンデ
ィションド・メディウム由来〕およびＴＩＦとＴＧＦの
混合物の効果を、軟寒天上でヒト肺癌細胞（Ａ５４９）
の増殖に関して検討した。それを第６図に示す（前記の
混合実験参照）。穴ＡはＡ３４９細胞の未処理対照懸濁
液で、胞の軟寒天懸濁−液を含む。穴ＣおよびＤは、３
．０および０．６μｇ／ゴのＴＩＦ −１でそれぞれ処
理したものであり、ＴＩＦ濃度が低いほど腫瘍細胞の増
殖は阻害されにくくなることを示している。しかし、０
，６μｇ／ｍｌのＴＩＦ −１で処理したＡ３４９細胞
の軟寒天懸濁液においても、なお肉眼で認められる腫瘍
細胞の増殖阻害が起きている。下段の列の穴ＥないしＨ
は、軟寒天上でのＡ３４９細胞の増殖に関するＴＧＦ
（穴ＢないしＤにおいて用いられたＴＩＦを産生じたと
同じ細胞のコンディションド・メディウムに由来）の効
果を示している。穴Ｅは１２ ｎｇ当量／ゴのＴＧＦで
処理したものである。Ｍｒ ２０，０００のＴＧＦは軟
寒天中でヒト癌細胞の増殖を高めた。穴ＦはＴＧＦ （
１２ｎｇ当量／ｄ）とＴＩＦ −１（１５μｇ／ｄ）と
で処理したものである。穴Ｅにおいて、腫瘍細胞の軟寒
天中での増殖を高めた濃度のＴＧＦ存在下でさえも、ヒ
ト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖はＴＩＦ −１により著
しく阻害された。穴ＦないしＨにおいて、ＴＩＦ濃度を
下げると、軟寒天中でＴＧＦ’処理腫瘍細胞の増殖が高
まった。様々な処理による軟寒天中のヒト腫瘍細胞のコ
ロニーの大きさを第４表に示す。未処理ヒト癌細胞は、
軟寒天中で直径０．３ｖｍのコロニーを形成した。１２
ｎｇ当量／ゴのＴＧＦで処理したヒト癌細胞は、軟寒天
中で直径０．５ ｍのより大きなコロニーを形成した。
８（ＣＣＬ ７５） Ｗｉ−３８： ５ｖａｏ形質転換型 ３２５ ３０
０（ＣＣＬ ７５．１） ＮＲＫ−４９Ｆ ：正常ラット腎 ５８ ０
１８（ＣＲＬ １５７０） ＫＮＲＫ：キルステン形質転換 ５８ ４５
０型ＮＲＫ （ＣＲＬ １５６９） ヒト腫瘍細胞由来のコンディションド・メディウムは、
複数の腫瘍増殖因子（ＴＧＦ ）と複数の腫瘍増殖阻害
因子（ＴＩＦ ）の両方を含むことが観察された。ＴＩ
Ｆ 、 ＴＧＦ （両方とも同一材料の腫瘍細胞コンデ
ィションド・メディウム由来〕およびＴＩＦとＴＧＦの
混合物の効果を、軟寒天上でヒト肺癌細胞（Ａ５４９）
の増殖に関して検討した。それを第６図に示す（前記の
混合実験参照）。穴ＡはＡ３４９細胞の未処理対照懸濁
液で、胞の軟寒天懸濁−液を含む。穴ＣおよびＤは、３
．０および０．６μｇ／ゴのＴＩＦ −１でそれぞれ処
理したものであり、ＴＩＦ濃度が低いほど腫瘍細胞の増
殖は阻害されにくくなることを示している。しかし、０
，６μｇ／ｍｌのＴＩＦ −１で処理したＡ３４９細胞
の軟寒天懸濁液においても、なお肉眼で認められる腫瘍
細胞の増殖阻害が起きている。下段の列の穴ＥないしＨ
は、軟寒天上でのＡ３４９細胞の増殖に関するＴＧＦ
（穴ＢないしＤにおいて用いられたＴＩＦを産生じたと
同じ細胞のコンディションド・メディウムに由来）の効
果を示している。穴Ｅは１２ ｎｇ当量／ゴのＴＧＦで
処理したものである。Ｍｒ ２０，０００のＴＧＦは軟
寒天中でヒト癌細胞の増殖を高めた。穴ＦはＴＧＦ （
１２ｎｇ当量／ｄ）とＴＩＦ −１（１５μｇ／ｄ）と
で処理したものである。穴Ｅにおいて、腫瘍細胞の軟寒
天中での増殖を高めた濃度のＴＧＦ存在下でさえも、ヒ
ト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖はＴＩＦ −１により著
しく阻害された。穴ＦないしＨにおいて、ＴＩＦ濃度を
下げると、軟寒天中でＴＧＦ’処理腫瘍細胞の増殖が高
まった。様々な処理による軟寒天中のヒト腫瘍細胞のコ
ロニーの大きさを第４表に示す。未処理ヒト癌細胞は、
軟寒天中で直径０．３ｖｍのコロニーを形成した。１２
ｎｇ当量／ゴのＴＧＦで処理したヒト癌細胞は、軟寒天
中で直径０．５ ｍのより大きなコロニーを形成した。
ＴＩＦで処理した腫瘍細胞は、ＴＩＦ濃度に応じて軟寒
天中でより小さな大きさのコロニーを形成した。１２ｎ
ｇ尚量／１のＴＧＦと３μｇ／ａｔのＴＩＦ −１の混
合物で処理した腫瘍細胞は、軟寒天中でＴＧＦまたはＴ
ＩＦによって処理されなかった対照の腫瘍細胞と同じ大
きさのコロニーを形成した。
天中でより小さな大きさのコロニーを形成した。１２ｎ
ｇ尚量／１のＴＧＦと３μｇ／ａｔのＴＩＦ −１の混
合物で処理した腫瘍細胞は、軟寒天中でＴＧＦまたはＴ
ＩＦによって処理されなかった対照の腫瘍細胞と同じ大
きさのコロニーを形成した。
第 ４ 表
同−コンディションド・メディウム由来のＴＩＦとＴＧ
Ｆとの間の拮抗関係の定量ＴＩＦ添加 １５ Ａｇ ／ｍｌ ０．０８±０．０２ｍｍ ０
．１８±０．１３ａｍ３μｇ〜 ０．１４±０．０５簡
０．３７±０．０６団０．６μｇ〜 ０．２８±０．
１１蝙 ０．６２±０．０４震０．１２ｆｉｇ／ｍｌ
Ｏ，２２±０．０５＋ａ＋ ０．５赤±０．０７
＋ｍａ０．０２４ ｔｔｇ／ｍｌ ０．３０±０．０
６＋ｍ Ｏ，６１±０．２１ ｔｅａこれらの結果か
ら次のことが結論ずけられる。
Ｆとの間の拮抗関係の定量ＴＩＦ添加 １５ Ａｇ ／ｍｌ ０．０８±０．０２ｍｍ ０
．１８±０．１３ａｍ３μｇ〜 ０．１４±０．０５簡
０．３７±０．０６団０．６μｇ〜 ０．２８±０．
１１蝙 ０．６２±０．０４震０．１２ｆｉｇ／ｍｌ
Ｏ，２２±０．０５＋ａ＋ ０．５赤±０．０７
＋ｍａ０．０２４ ｔｔｇ／ｍｌ ０．３０±０．０
６＋ｍ Ｏ，６１±０．２１ ｔｅａこれらの結果か
ら次のことが結論ずけられる。
（１） ＴＩＦは軟寒天中での腫瘍細胞の足場非依存性
増殖を阻害する。（２） ＴＧＦは軟寒天中での腫瘍細
胞の足場非依存性増殖を光通させる。（３） ＴＩＦ−
りはＥＧＦ受容体への結合に対して拮抗しないが、それ
は軟寒天中での腫瘍細胞の足場非依存性増殖に関するＴ
ＧＦの効果に対して拮抗的である。
増殖を阻害する。（２） ＴＧＦは軟寒天中での腫瘍細
胞の足場非依存性増殖を光通させる。（３） ＴＩＦ−
りはＥＧＦ受容体への結合に対して拮抗しないが、それ
は軟寒天中での腫瘍細胞の足場非依存性増殖に関するＴ
ＧＦの効果に対して拮抗的である。
同様の混合実験でＴＧＦに換えてＥＧＦを用いた場合に
も、同様の結果が観察された。
も、同様の結果が観察された。
混合実験から得られた結果（第４表）によれば、生体外
の軟寒天検定においてＴＧＦはＴＩＦ−１の効果を中和
し得るということが示された。第１図にお−て、ＴＧＦ
活性を含むプールＡにはＴＩＦ活性は検出されなかった
。Ｍｒ１８，０００ないし２０，０００のＴＧＦを含む
ゾールＡをＲＰ −ＨＰＬＣで精製した場合、ＴＩＦ活
性はＴＧＦ活性と分離し、３８ないし４２係の間のアセ
トニトリルで溶出することが観察された。ゾールＡのＴ
ＧＦはＭｒ１８．０００ないし２０，０００のＴＩＦの
存在を明らかに遮蔽していた。
の軟寒天検定においてＴＧＦはＴＩＦ−１の効果を中和
し得るということが示された。第１図にお−て、ＴＧＦ
活性を含むプールＡにはＴＩＦ活性は検出されなかった
。Ｍｒ１８，０００ないし２０，０００のＴＧＦを含む
ゾールＡをＲＰ −ＨＰＬＣで精製した場合、ＴＩＦ活
性はＴＧＦ活性と分離し、３８ないし４２係の間のアセ
トニトリルで溶出することが観察された。ゾールＡのＴ
ＧＦはＭｒ１８．０００ないし２０，０００のＴＩＦの
存在を明らかに遮蔽していた。
第２表に示された如く、ＴＩＦは正常細胞の増殖を刺激
する。したがって、ＴＩＦはミトゲンとなり得るし、血
清飢餓状態のマウス細胞のような静止期の細胞において
ＥＧＦ受容体を介した相互作用によりＤＮＡ合成を刺激
し得るという可能性が研究の対象となった。ＥＧＦとア
ＩＦ −１の双方には、マウス細胞系ＮＩＨクローン７
に対して実質的にミドダン刺激能があることが分った。
する。したがって、ＴＩＦはミトゲンとなり得るし、血
清飢餓状態のマウス細胞のような静止期の細胞において
ＥＧＦ受容体を介した相互作用によりＤＮＡ合成を刺激
し得るという可能性が研究の対象となった。ＥＧＦとア
ＩＦ −１の双方には、マウス細胞系ＮＩＨクローン７
に対して実質的にミドダン刺激能があることが分った。
ＥＧＦ受容体が機能しないマウス細胞系ＮＲ６／６細胞
を用いた同様な実験によれば、ＫＧＦにはミトゲン活性
がないが、ＴＩＦ −１はミトゲンとして作用すること
が示された。したがって、増殖刺激性およびミトゲン活
性は、ＥｄＦ受容体を介して機能するのではないと考え
られる。
を用いた同様な実験によれば、ＫＧＦにはミトゲン活性
がないが、ＴＩＦ −１はミトゲンとして作用すること
が示された。したがって、増殖刺激性およびミトゲン活
性は、ＥｄＦ受容体を介して機能するのではないと考え
られる。
要約すると、上記の事実から、何種類かの腫瘍増殖阻害
因子（ＴＩＦ ）はヒト腫瘍細胞系Ａ６７３から産生さ
れ、バイオ・ダルＰ−１００グル濾過クロマトグラフィ
ーから観察されるところによれば、分子量が２８，００
０．１８，０００ないし２２，０００．１０．０００な
いし１６，０００および５，０００ないしｉｏ、ｏｏｏ
であることが考察し得る。ＴＩＦ −１と称されるＭｒ
ｌｏ、０００ないし１６，０００のＴＩＦは部分的に精
製されており、その特性が決定された。
因子（ＴＩＦ ）はヒト腫瘍細胞系Ａ６７３から産生さ
れ、バイオ・ダルＰ−１００グル濾過クロマトグラフィ
ーから観察されるところによれば、分子量が２８，００
０．１８，０００ないし２２，０００．１０．０００な
いし１６，０００および５，０００ないしｉｏ、ｏｏｏ
であることが考察し得る。ＴＩＦ −１と称されるＭｒ
ｌｏ、０００ないし１６，０００のＴＩＦは部分的に精
製されており、その特性が決定された。
ＴＩＦ −１は酸および熱に安定なタンパクであること
がわかった。またトリジシンおよびＤＴＴにより失活し
た。それは、様々な段階のヒト腫瘍細胞、ウィルスによ
り形質転換されたヒトおよびラット細胞並びに正常アメ
リカミンク肺上皮細胞といった幅広い範囲の細胞の増殖
を阻害した。ＴＩＦ −１は試験に用いられた様々な正
常ヒト線維芽細胞または上皮細胞のいずれの増殖をも阻
害しなかった。事実、ＴＩＦ −１は様々な正常ヒト線
維芽および上皮細胞の増殖を刺激した。
がわかった。またトリジシンおよびＤＴＴにより失活し
た。それは、様々な段階のヒト腫瘍細胞、ウィルスによ
り形質転換されたヒトおよびラット細胞並びに正常アメ
リカミンク肺上皮細胞といった幅広い範囲の細胞の増殖
を阻害した。ＴＩＦ −１は試験に用いられた様々な正
常ヒト線維芽細胞または上皮細胞のいずれの増殖をも阻
害しなかった。事実、ＴＩＦ −１は様々な正常ヒト線
維芽および上皮細胞の増殖を刺激した。
混合実験（第６図および第４表）によれば、どのように
腫瘍細胞がＴＩＦとＴＧＦ双方を産生じ得るか、そして
さらに癌の表現型を提示するかということが示唆される
。ＴＧＦよりもＴＩＦをより多く産生ずる腫瘍細胞は、
良性となり得または退行し得るが、一方より進行性およ
び転移性である腫Ｓ細胞はＴＩＦよりもＴＧＦをより多
く産生じ得る。様々なＴＧＦおよびＴＩＦの異常な産生
は、結果として腫瘍を発生し得る。したがりて産生され
るＴＩＦとＴＧＦの比がわかれば、それが腫瘍細胞増殖
程度の重要な決定要素として役立ち得るであろう。ＴＩ
Ｆの体外からの投与は、正常細胞に影響を与えずに腫瘍
細胞の増殖を調節する非常に強力な手段となり得る。
腫瘍細胞がＴＩＦとＴＧＦ双方を産生じ得るか、そして
さらに癌の表現型を提示するかということが示唆される
。ＴＧＦよりもＴＩＦをより多く産生ずる腫瘍細胞は、
良性となり得または退行し得るが、一方より進行性およ
び転移性である腫Ｓ細胞はＴＩＦよりもＴＧＦをより多
く産生じ得る。様々なＴＧＦおよびＴＩＦの異常な産生
は、結果として腫瘍を発生し得る。したがりて産生され
るＴＩＦとＴＧＦの比がわかれば、それが腫瘍細胞増殖
程度の重要な決定要素として役立ち得るであろう。ＴＩ
Ｆの体外からの投与は、正常細胞に影響を与えずに腫瘍
細胞の増殖を調節する非常に強力な手段となり得る。
ＴＩＦ −２の調製
培養細胞
培養細胞は、上記の如＜ １０１ ＦＢＳ （ギプコ）
を添加したダルベツコ−の改良型イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ ）の入りた７ ５ ｃｍ”組織培養フラスコ（ファ
ルコン、３０２４ ）中で３７℃にて維持された。
を添加したダルベツコ−の改良型イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ ）の入りた７ ５ ｃｍ”組織培養フラスコ（ファ
ルコン、３０２４ ）中で３７℃にて維持された。
ヒト横絞筋腫細胞系Ａ６７３から得た血清を含まないコ
ンディションド・メディウムを、上記のごとく処理し、
１Ｍ酢酸中でバイオ−ｒルＰ−１００によりクロマトグ
ラフィーを行なった。
ンディションド・メディウムを、上記のごとく処理し、
１Ｍ酢酸中でバイオ−ｒルＰ−１００によりクロマトグ
ラフィーを行なった。
上記の方法によりバイオ−ダルＰ−１００カラムの何回
かの操作から得られた何本かのＴＧＦ活性のある分画な
集め、凍結乾燥した。そして１Ｍ酢酸５ｄ中で再調製し
、５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，５）に対して４℃
で一晩透析した。この試料を２２℃にて１７５，０ＯＯ
Ｆで３０分間遠心し、カル？キシメチルーセルロー、ス
（ワットマン、ＣＭ’−２３）のカチオン交換カラムに
懸けた。溶出は、２つの溶器から成る定レベル装置〔第
１番目の溶器には開始緩衝液（５ｍＭ酢酸アンモニウム
、ｐＨ４，５） ２ ｏ Ｏｄおよび第２番目の溶器に
は限定緩衝液（０，５Ｍ酢酸アンモニウム、−６，８）
を含む〕からポンプで液を引出しく２２℃で流出率８０
ｍ１！／時間〕直線濃度勾配をつけて行なった。複数の
分画のアリコートを１Ｍ酢酸０．５ ｒｆＬｌを添加し
て滅菌し、試験前に凍結乾燥した。
かの操作から得られた何本かのＴＧＦ活性のある分画な
集め、凍結乾燥した。そして１Ｍ酢酸５ｄ中で再調製し
、５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，５）に対して４℃
で一晩透析した。この試料を２２℃にて１７５，０ＯＯ
Ｆで３０分間遠心し、カル？キシメチルーセルロー、ス
（ワットマン、ＣＭ’−２３）のカチオン交換カラムに
懸けた。溶出は、２つの溶器から成る定レベル装置〔第
１番目の溶器には開始緩衝液（５ｍＭ酢酸アンモニウム
、ｐＨ４，５） ２ ｏ Ｏｄおよび第２番目の溶器に
は限定緩衝液（０，５Ｍ酢酸アンモニウム、−６，８）
を含む〕からポンプで液を引出しく２２℃で流出率８０
ｍ１！／時間〕直線濃度勾配をつけて行なった。複数の
分画のアリコートを１Ｍ酢酸０．５ ｒｆＬｌを添加し
て滅菌し、試験前に凍結乾燥した。
ＣＭ−セルロースカラムから得られたＴＩＦ−２の生物
学的活性部分を集め、凍結乾燥した。そして０．０５１
アセトニトリル１ゴ中に再懸濁し、カラムに懸ける前に
１００Ｏ１１で５分間遠心し不溶物質を取除いた。上清
をウォーターズμプントパークＣ１８カラム（０，３９
Ｘ３０６ｎ）に懸けた。ウォーターズ濃度勾配液体クロ
マトグラフィー装置を利用し、カラムからの溶出液を波
長可変ＵＶ検出装置で２１４ ｎｍにて監視した。
学的活性部分を集め、凍結乾燥した。そして０．０５１
アセトニトリル１ゴ中に再懸濁し、カラムに懸ける前に
１００Ｏ１１で５分間遠心し不溶物質を取除いた。上清
をウォーターズμプントパークＣ１８カラム（０，３９
Ｘ３０６ｎ）に懸けた。ウォーターズ濃度勾配液体クロ
マトグラフィー装置を利用し、カラムからの溶出液を波
長可変ＵＶ検出装置で２１４ ｎｍにて監視した。
各９画かちのアリコートなぽ騎前ｆ凄枯敵楊またＯ
軟寒天検定
Ａ３７５°−ｇ５細胞ｌ×１０の懸濁液を凍結乾燥した
ＴＩＦ −２および０．３４１寒天（ディフコ、ノープ
ル）と混合し、１０４ ＦＢＳを含んだＤＭＥＭテ合計
溶量０，９４ｍ１！とじた。それをただちに３５ｍ組織
培養シャーレの中の０．５係寒天基層の上に♂イツトで
播種した。細胞を５１ Ｃｏ２／９５係空気の加湿した
雰囲気中にて３７℃で培養した。８日後顕微鏡写真を撮
った。
ＴＩＦ −２および０．３４１寒天（ディフコ、ノープ
ル）と混合し、１０４ ＦＢＳを含んだＤＭＥＭテ合計
溶量０，９４ｍ１！とじた。それをただちに３５ｍ組織
培養シャーレの中の０．５係寒天基層の上に♂イツトで
播種した。細胞を５１ Ｃｏ２／９５係空気の加湿した
雰囲気中にて３７℃で培養した。８日後顕微鏡写真を撮
った。
ＴＩＦ検定
試験細胞を二次培養し、ＴＩＦ −２で処理して、上記
の如（ＩＵｄＲの取込みを調べた。阻害と刺激を対照に
対するパーセントで表わした。
の如（ＩＵｄＲの取込みを調べた。阻害と刺激を対照に
対するパーセントで表わした。
ＮＩＩ（クローン７およびＨｕＦ細胞を、９６大組織培
養板（タンク１６７００８）中の各穴あたり細胞密度ｌ
Ｘ１０４で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに二次増養した
。３７℃で２４時間培養の後、培地をＦＢＳ Ｏ，１’
１を含むワイマウス培地と交換することにより７２時間
血清飢餓状態に維持した。細胞をＴＩＦ −２で処理し
、上記の如（ＩＵｄＲ取込みを調べた。
養板（タンク１６７００８）中の各穴あたり細胞密度ｌ
Ｘ１０４で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに二次増養した
。３７℃で２４時間培養の後、培地をＦＢＳ Ｏ，１’
１を含むワイマウス培地と交換することにより７２時間
血清飢餓状態に維持した。細胞をＴＩＦ −２で処理し
、上記の如（ＩＵｄＲ取込みを調べた。
十〇Ｆ検定
ＴＧＦ活性は、上記の如（ＩＵｄＲ放射受容体結合検定
によって拮抗能を調べることにより決定した。
によって拮抗能を調べることにより決定した。
実施例２
Ａ６７３細胞から得た血清を含まないコンディションド
・メディウム３０Ｊｌｌを濃縮し、凍結乾燥しそして２
８０ｒｎ９のタンパクを１Ｍ酢酸で抽出した。これを１
Ｍ酢酸で平衡化したバイオ−ダルＰ−１００カラムに懸
けた。２本置きの各分画からアリコートを取り、ＴＧＦ
およびＴＩＦ活性を測定した。第７図に示す如く、腫瘍
増殖阻害活性の主要ピークは分子量１０，０００ないし
１６．０００領域（ノールＢ）および分子量５，０００
ないし１０，０００（ノールＣ）の領域に見出された。
・メディウム３０Ｊｌｌを濃縮し、凍結乾燥しそして２
８０ｒｎ９のタンパクを１Ｍ酢酸で抽出した。これを１
Ｍ酢酸で平衡化したバイオ−ダルＰ−１００カラムに懸
けた。２本置きの各分画からアリコートを取り、ＴＧＦ
およびＴＩＦ活性を測定した。第７図に示す如く、腫瘍
増殖阻害活性の主要ピークは分子量１０，０００ないし
１６．０００領域（ノールＢ）および分子量５，０００
ないし１０，０００（ノールＣ）の領域に見出された。
分子量１８，０００ないし２２，０００の領域（ｆ−ル
Ａ）には高い阻害活性は認められなかったが、主なＴＧ
Ｆ活性を含んでいた。
Ａ）には高い阻害活性は認められなかったが、主なＴＧ
Ｆ活性を含んでいた。
何回かのバイオ−ダルＰ−１００カラムかう得たＴＧＦ
分画（ノールＡ）を、さらにＣＭ−セルロースクロマト
グラフィーにより精製した。この材料は元をただせば２
２７ｇのコンディションド・メディウムに由来した。こ
れらを集めてＣＭセルロースカラム（第８図〕に懸けた
。合計タンパク量は８５ｍ９であった。１本おきの分画
からのアリコートのＴＧＦ活性およびＴＩＦ活性を測定
した。このカラムの溶出模様によれば、阻害活性の大き
なピークはＴＧＦ活性ピークと分離し得たので、恐ら＜
ＴＧＦはＴＩＦ活性を遮蔽していたことが示唆される
。ＴＩＦ活性のピークとして弄わされる斜線部分を集め
、凍結乾燥し、アセトニトリルの直線濃度勾配をかけて
逆相ウォーターズμボンド１４−りＣ１８カラムによる
再クロマトグラフィーを行なった。次のような溶出手順
を踏んだ。すなわち、まず０．０５％）リフルオロ酢酸
中のアセトニトリルＯないし２５俤の直線濃度勾配置５
分、続いて０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセトニト
リル２５ないし４５悌の直線濃度勾配８０分、さらに続
けて０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル４
５ないし１００係の直線濃度勾配置５分。これを第９図
に示す。各分画を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性を測定した。
分画（ノールＡ）を、さらにＣＭ−セルロースクロマト
グラフィーにより精製した。この材料は元をただせば２
２７ｇのコンディションド・メディウムに由来した。こ
れらを集めてＣＭセルロースカラム（第８図〕に懸けた
。合計タンパク量は８５ｍ９であった。１本おきの分画
からのアリコートのＴＧＦ活性およびＴＩＦ活性を測定
した。このカラムの溶出模様によれば、阻害活性の大き
なピークはＴＧＦ活性ピークと分離し得たので、恐ら＜
ＴＧＦはＴＩＦ活性を遮蔽していたことが示唆される
。ＴＩＦ活性のピークとして弄わされる斜線部分を集め
、凍結乾燥し、アセトニトリルの直線濃度勾配をかけて
逆相ウォーターズμボンド１４−りＣ１８カラムによる
再クロマトグラフィーを行なった。次のような溶出手順
を踏んだ。すなわち、まず０．０５％）リフルオロ酢酸
中のアセトニトリルＯないし２５俤の直線濃度勾配置５
分、続いて０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセトニト
リル２５ないし４５悌の直線濃度勾配８０分、さらに続
けて０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル４
５ないし１００係の直線濃度勾配置５分。これを第９図
に示す。各分画を凍結乾燥し、ＴＩＦ活性を測定した。
ＴＩＦ活性を含む主要ピークは憾の間で溶出することが
前に確められている。
前に確められている。
ＴＩＦ −２をプロパツールの直線濃度勾配によるＨＰ
ＬＣでさらに精製し得た。ＴＩＦ −１は２−プロパツ
−ル１９ないし２１係の間で溶出することが確められて
いるが、一方ＴＩＦ −２は２−プロパツール２９ない
し３１係の間で溶出した。
ＬＣでさらに精製し得た。ＴＩＦ −１は２−プロパツ
−ル１９ないし２１係の間で溶出することが確められて
いるが、一方ＴＩＦ −２は２−プロパツール２９ない
し３１係の間で溶出した。
Ａ３７５Ａｇ５ 細胞をＴＩＦ −２（６４μｇ／ｍｌ
）で処理し、８日後に顕微鏡写真を撮った。第１０図に
示すごとく、未処理細胞は一般に概略１００ないし２０
０の細胞を含む直径０．５ないし１■の範囲の大きさま
で増殖した。これらの細胞を、ＣＭ−セルロースで精製
したＴＩＦ −２で処理した場合、コロニーの大きさは
著しく減少した。
）で処理し、８日後に顕微鏡写真を撮った。第１０図に
示すごとく、未処理細胞は一般に概略１００ないし２０
０の細胞を含む直径０．５ないし１■の範囲の大きさま
で増殖した。これらの細胞を、ＣＭ−セルロースで精製
したＴＩＦ −２で処理した場合、コロニーの大きさは
著しく減少した。
処理後最初の数日で小さなコロニーが認められたが、典
型的には３週間後でさえも増殖の回復は認められなかっ
た。細胞は生きていたので、ＴＩＦ −２には細胞毒性
はなかった。ＣＭ−セルロースクロマトグラフィーから
ＨＰＬＣへの精製レベルは、第５表に示された如く１２
５倍であった。各精製段階からの物質のＴＩＦ活性を測
定した。 ＩＵｄＲの取込みを、Ａ３４９細胞と正常
ヒト線維芽細胞系ＨｕＦとを用いて測定した。両試料に
おいてＡ３４９細胞は阻害を、ＨｕＦ細胞は刺激を受け
た。ＴＩＦ −１は正常線維芽細胞の増殖を刺激し、ミ
トゲンとしての作用も発揮したので、ＴＩＦ −２を正
常マウス細胞（ＮＩ゛Ｈクローン７）およびＩ（ｕＦ細
胞を用いてミドダン検定にかけた。血清飢餓状態の細胞
に試験する因子を添加し、同時に２４時間１２５ＩＵｄ
Ｒを加えて検定した。５４／ｊｇ／Ｉ／ＬｌｏＴＩＦ
−２処理ニヨルＭＪ胞ハ、１０１ ＦＢＳを含む細胞よ
りもかなり高レベルの１２５ＩＵｄＲを取込んだ。ヒト
線維芽細胞で同一濃度のＴＩＦ −２処理を行々りた場
合、１０４ＦＢＳを含む場合と同じような取込みレベル
を示した。
型的には３週間後でさえも増殖の回復は認められなかっ
た。細胞は生きていたので、ＴＩＦ −２には細胞毒性
はなかった。ＣＭ−セルロースクロマトグラフィーから
ＨＰＬＣへの精製レベルは、第５表に示された如く１２
５倍であった。各精製段階からの物質のＴＩＦ活性を測
定した。 ＩＵｄＲの取込みを、Ａ３４９細胞と正常
ヒト線維芽細胞系ＨｕＦとを用いて測定した。両試料に
おいてＡ３４９細胞は阻害を、ＨｕＦ細胞は刺激を受け
た。ＴＩＦ −１は正常線維芽細胞の増殖を刺激し、ミ
トゲンとしての作用も発揮したので、ＴＩＦ −２を正
常マウス細胞（ＮＩ゛Ｈクローン７）およびＩ（ｕＦ細
胞を用いてミドダン検定にかけた。血清飢餓状態の細胞
に試験する因子を添加し、同時に２４時間１２５ＩＵｄ
Ｒを加えて検定した。５４／ｊｇ／Ｉ／ＬｌｏＴＩＦ
−２処理ニヨルＭＪ胞ハ、１０１ ＦＢＳを含む細胞よ
りもかなり高レベルの１２５ＩＵｄＲを取込んだ。ヒト
線維芽細胞で同一濃度のＴＩＦ −２処理を行々りた場
合、１０４ＦＢＳを含む場合と同じような取込みレベル
を示した。
’ｌ’ＩＦ −２はマウスＮＩＨクローン７細胞におい
て５００ ｎｇ／ｍＡ’程度の低濃度でさえも強力なミ
トゲンとなりうろことが判明した。他方ＴＩＦ −１の
ミトゲン活性は２０ ｎｇ／Ｉｄ程度の低濃度で誘起さ
れ得た。
て５００ ｎｇ／ｍＡ’程度の低濃度でさえも強力なミ
トゲンとなりうろことが判明した。他方ＴＩＦ −１の
ミトゲン活性は２０ ｎｇ／Ｉｄ程度の低濃度で誘起さ
れ得た。
第５表
Ａ６７３コンディションド壷メディウムをＣＭ−セルロ
ースおよびＨＰＬＣで精製したＴＩＦ−２の比較ＴＩＦ
のインターフェロン活性を、メロイ・ラバラドリーズ社
（ヴアージニア州、スジリングフィールド）で行なわれ
ている抗ウィルスインターフェロン検定法に基づいて測
定した。そして何種かの白血球インターフェロン（ＰＩ
Ｆロッ）Ｐ−３２１・）を、Ａ３４９細胞を使った本発
明の腫瘍増殖阻害検定法により試験した。白血球インタ
ーフェロンは、ＴＩＦ検定（２５４阻害）において３Ｉ
Ｕ／ｄで検出され得た。３ＩＵ／ｄのインターフェロン
と同様の阻害を示す１００倍濃縮のＴＩＦ −２を抗ウ
ィルス検定で試験したが結果は陰性であった。どれによ
り、’ｌ”ＩＦ −２には抗ウィルス活性がなく、した
がってそれはインターフェロンではないことが分かった
。
ースおよびＨＰＬＣで精製したＴＩＦ−２の比較ＴＩＦ
のインターフェロン活性を、メロイ・ラバラドリーズ社
（ヴアージニア州、スジリングフィールド）で行なわれ
ている抗ウィルスインターフェロン検定法に基づいて測
定した。そして何種かの白血球インターフェロン（ＰＩ
Ｆロッ）Ｐ−３２１・）を、Ａ３４９細胞を使った本発
明の腫瘍増殖阻害検定法により試験した。白血球インタ
ーフェロンは、ＴＩＦ検定（２５４阻害）において３Ｉ
Ｕ／ｄで検出され得た。３ＩＵ／ｄのインターフェロン
と同様の阻害を示す１００倍濃縮のＴＩＦ −２を抗ウ
ィルス検定で試験したが結果は陰性であった。どれによ
り、’ｌ”ＩＦ −２には抗ウィルス活性がなく、した
がってそれはインターフェロンではないことが分かった
。
ＴＩＦ −１のところで記載したように、ＨＰＬＣで精
製したＴＩＦ −２のトリジシン感受性を調べた。
製したＴＩＦ −２のトリジシン感受性を調べた。
それはトリジシン感受性を示さなかった。ＴＩＦ−２（
１３μｇ／ａｕ、 ＨＰＩ、Ｃで精製）のアリコートを
５６℃３０分間、別のアリコートを１００℃３分熱処理
した。゛対照は室温で放置した。それぞれを凍結乾燥し
、それぞれの腫瘍増殖阻害活性を、試験細胞としてＡ３
４９を用いて調べた。
１３μｇ／ａｕ、 ＨＰＩ、Ｃで精製）のアリコートを
５６℃３０分間、別のアリコートを１００℃３分熱処理
した。゛対照は室温で放置した。それぞれを凍結乾燥し
、それぞれの腫瘍増殖阻害活性を、試験細胞としてＡ３
４９を用いて調べた。
活性は５０℃では安定であったが、１００℃では不安定
で阻害塵が５３係から３５憾におちた０様々な正常およ
び腫瘍細胞を使って、１２５Ｉ ＵａＲの取込みに関す
るＴＩＦ −２の影響を試験した。
で阻害塵が５３係から３５憾におちた０様々な正常およ
び腫瘍細胞を使って、１２５Ｉ ＵａＲの取込みに関す
るＴＩＦ −２の影響を試験した。
試験したヒト線維芽細胞のすべては刺激された。
さらに継代回数の少ないヒト胎児腎細胞系も同様に刺激
された。上皮細胞のみを、この培養中に認めることがで
きた。これに反して試験したすべてのヒト腫瘍細胞では
様々な阻害が認められた。Ａ３４９およびＡ６７３に関
して継代回数の多少により阻害程度の差が見られるよう
に、組織培養における継代の回数がいくらか阻害程度の
変化の原因となっているのかもしれない。腫瘍が初期培
養に近いほど、ＴＩＦ −２による阻害に対しての感受
性がより強い。乳癌細胞系、ＭＣＦ −７およびＡ３４
９はよく試験細胞として用いられるが、ＴＩＦ二２に対
して最も強い感受性を有することが観察された。正常ア
メリカミンク肺細胞系はＴＩＦ −１によりきわめて阻
害されやすいことが示さリシている。反対にＴＩＦ −
２はアメリカミンク細胞にはほとんど、あるいは全く効
果を発揮しなかった。
された。上皮細胞のみを、この培養中に認めることがで
きた。これに反して試験したすべてのヒト腫瘍細胞では
様々な阻害が認められた。Ａ３４９およびＡ６７３に関
して継代回数の多少により阻害程度の差が見られるよう
に、組織培養における継代の回数がいくらか阻害程度の
変化の原因となっているのかもしれない。腫瘍が初期培
養に近いほど、ＴＩＦ −２による阻害に対しての感受
性がより強い。乳癌細胞系、ＭＣＦ −７およびＡ３４
９はよく試験細胞として用いられるが、ＴＩＦ二２に対
して最も強い感受性を有することが観察された。正常ア
メリカミンク肺細胞系はＴＩＦ −１によりきわめて阻
害されやすいことが示さリシている。反対にＴＩＦ −
２はアメリカミンク細胞にはほとんど、あるいは全く効
果を発揮しなかった。
ＴＩＦ −２に対する感受性に関してＳＶ４０ウィルス
形質転換の効果を検討した。ヒト胎児肺細胞Ｗｉ−３８
（ＣＣＬ ７５）オ！びそれの５Ｖ４０に！り形質転換
された細胞（ＣＣＬ ７５．１ ）の両方についてＴＩ
Ｆ −２処理後、”’ＩＵｄＲの取込みを調べた。
形質転換の効果を検討した。ヒト胎児肺細胞Ｗｉ−３８
（ＣＣＬ ７５）オ！びそれの５Ｖ４０に！り形質転換
された細胞（ＣＣＬ ７５．１ ）の両方についてＴＩ
Ｆ −２処理後、”’ＩＵｄＲの取込みを調べた。
Ｗｉ−３８細胞は刺激（１１係）され、Ｗｉ −３８の
ＳＶ４０形質転換型細胞は阻害（２４％）された。
ＳＶ４０形質転換型細胞は阻害（２４％）された。
同じ効果がＴＩＦ −１についても見られ、それによれ
ば形質転換された表現型が、ＴＩＦによる阻害に要求さ
れるかもしれないということが強く支持される。ヒト黒
色腫クローン系Ａ３７５Ａｇ５およびＡ３７５Ａｇ５の
ＴＩＦ −１耐性変異型細胞系（Ａ３７５ Ａｇ ５−
ＩＲと称す）を用いて、阻害因子とインターフェロン
についての比較を行々りだ（第７表）。この細胞系を得
るために２４穴板に単層で生育しているＡ３７５Ａｇ５
細胞（ＩＸＩＯ’）をＴＩＦ −１の活性分画で処理し
た。
ば形質転換された表現型が、ＴＩＦによる阻害に要求さ
れるかもしれないということが強く支持される。ヒト黒
色腫クローン系Ａ３７５Ａｇ５およびＡ３７５Ａｇ５の
ＴＩＦ −１耐性変異型細胞系（Ａ３７５ Ａｇ ５−
ＩＲと称す）を用いて、阻害因子とインターフェロン
についての比較を行々りだ（第７表）。この細胞系を得
るために２４穴板に単層で生育しているＡ３７５Ａｇ５
細胞（ＩＸＩＯ’）をＴＩＦ −１の活性分画で処理し
た。
その分画はＡ６７３のコンディションド・メディウムを
バイオーグ／Ｉ／Ｐ −１００カラムに懸けて得られた
ものである。細胞を一度処理したが因子は細胞中で１０
日間残存していた。処理した細胞は体積を増し、より丸
くなり、もはや培養板に接着しなくなった。これら処理
細胞をファルコンの組織培養フラスコ（３０１３）に移
した。
バイオーグ／Ｉ／Ｐ −１００カラムに懸けて得られた
ものである。細胞を一度処理したが因子は細胞中で１０
日間残存していた。処理した細胞は体積を増し、より丸
くなり、もはや培養板に接着しなくなった。これら処理
細胞をファルコンの組織培養フラスコ（３０１３）に移
した。
細胞は結局定着し、単層状態で増殖した。単層で数回継
代すると、この細胞系は親細胞系Ａ３７５Ａｇ５と同じ
くらシラ速く増殖した。両細胞系を軟寒天中に播種する
と、Ａ３７５Ａｇ５は軟寒天中で増殖し直径０．５ない
し１．０ ｗａ範囲のコロニーを形成した。ところがＡ
３７５ Ａｇ５−ＩＲ変異細胞系は軟寒天中でほとん
ど増殖せず、コロニーも３ないし５個しか生じなかった
。これらの両細胞系を、腫瘍増殖阻害検定法により試験
した。第７表で明らかなように、親細胞系Ａ３７５Ａｇ
５はＴＩＦ −１、ＴＩＦ −２および部分的に精製さ
れたインターフェロンにより阻害を受けた。変異細胞系
Ａ３７５ Ａｇ ５−ＩＲはＴＩＦ−２およびインター
フェロンによる阻害には適当な感受性を示したが、ＴＩ
Ｆ −１に対する感受性を欠いていた。このことＫより
、阻害因子は２種類おり、様々な細胞に対して応答が異
なることが証明された。
代すると、この細胞系は親細胞系Ａ３７５Ａｇ５と同じ
くらシラ速く増殖した。両細胞系を軟寒天中に播種する
と、Ａ３７５Ａｇ５は軟寒天中で増殖し直径０．５ない
し１．０ ｗａ範囲のコロニーを形成した。ところがＡ
３７５ Ａｇ５−ＩＲ変異細胞系は軟寒天中でほとん
ど増殖せず、コロニーも３ないし５個しか生じなかった
。これらの両細胞系を、腫瘍増殖阻害検定法により試験
した。第７表で明らかなように、親細胞系Ａ３７５Ａｇ
５はＴＩＦ −１、ＴＩＦ −２および部分的に精製さ
れたインターフェロンにより阻害を受けた。変異細胞系
Ａ３７５ Ａｇ ５−ＩＲはＴＩＦ−２およびインター
フェロンによる阻害には適当な感受性を示したが、ＴＩ
Ｆ −１に対する感受性を欠いていた。このことＫより
、阻害因子は２種類おり、様々な細胞に対して応答が異
なることが証明された。
第 ７ 表
Ａ３７５Ａｇ５およびＴＩＦ−１耐性Ａ３７５Ａｇ５−
ＩＲに対して様々な腫瘍増殖阻害因子の比較μｇ／ゴ
の阻害（チ）ＩＲＱ狙害（憾）ＴＩＦ−１１７３５
４２０ １７，３４４２ ＴＩＦ−２９７５９７９３ ９７，５３４２５ インターフエロン １０００’ＩＵＡ／Ｌ１５５
５４（部分精製） さらに、阻害活性に関するＴＩＦ −１とＴＩＦ −２
との間の差異を第８表のデータによって示す。
ＩＲに対して様々な腫瘍増殖阻害因子の比較μｇ／ゴ
の阻害（チ）ＩＲＱ狙害（憾）ＴＩＦ−１１７３５
４２０ １７，３４４２ ＴＩＦ−２９７５９７９３ ９７，５３４２５ インターフエロン １０００’ＩＵＡ／Ｌ１５５
５４（部分精製） さらに、阻害活性に関するＴＩＦ −１とＴＩＦ −２
との間の差異を第８表のデータによって示す。
第８表
ヒト肺癌細胞および正常ミンク肺細胞に対するＴＩＦ
−１およびＴＩＦ −２の阻害活性の比較ＴＩＦ−２３
２５５５ ２，２５０９ ０，３２３３１４ ０，０３２８６ ＴＩＦ−１５，７７５７８ ０，５７５９７Ｂ ｏ、０５７ ３７ ４５ ０．００５７ ０ ２３ ＴＩＦ −２およびＴＩＦ −１は両方ともヒト横絞筋
腫細胞系Ａ６７３からのコンディションド・メチラムか
ら得られた。ＴＩＦ −２はパイオーグルｐ−１ｏｏお
よびＣＭ−セルロースクロマトグラフィーにより部分的
に精製された。ＴＩＦ −１はパイオー？ ／Ｌ／Ｐ
−１００クロマトグラフイーにより部分的に精製された
。試験細胞にはヒト肺腺癌Ａ３４９および正常アメリカ
ミンク肺細胞を使用した。阻害塵は、腫瘍増殖阻害検定
により対照のノ４−セント（ＩＵｄＲ取込率）として表
わした。
−１およびＴＩＦ −２の阻害活性の比較ＴＩＦ−２３
２５５５ ２，２５０９ ０，３２３３１４ ０，０３２８６ ＴＩＦ−１５，７７５７８ ０，５７５９７Ｂ ｏ、０５７ ３７ ４５ ０．００５７ ０ ２３ ＴＩＦ −２およびＴＩＦ −１は両方ともヒト横絞筋
腫細胞系Ａ６７３からのコンディションド・メチラムか
ら得られた。ＴＩＦ −２はパイオーグルｐ−１ｏｏお
よびＣＭ−セルロースクロマトグラフィーにより部分的
に精製された。ＴＩＦ −１はパイオー？ ／Ｌ／Ｐ
−１００クロマトグラフイーにより部分的に精製された
。試験細胞にはヒト肺腺癌Ａ３４９および正常アメリカ
ミンク肺細胞を使用した。阻害塵は、腫瘍増殖阻害検定
により対照のノ４−セント（ＩＵｄＲ取込率）として表
わした。
上記のようなＴＩＦ −１は、パイオーグルｐ−１００
カラムによる分子量１０，０００ないし１６，０００の
領域から単離され、ＴＩＦ −２活性はＭｒ １８，０
００ないし２２，０００のところに見出される。
カラムによる分子量１０，０００ないし１６，０００の
領域から単離され、ＴＩＦ −２活性はＭｒ １８，０
００ないし２２，０００のところに見出される。
ＴＩＦとＴＩＦ −２双方とも、軟寒天由で試験さ中
れる多数のヒト腫瘍細胞および上記の単層培養細胞の増
殖を阻害する。しかしながら、ＴＩＦによる阻害に対す
る腫瘍細胞の感受性は、細胞の型、組織培養における継
代および試験されるＴＩＦの種類に応じて異なっている
。単層培養では両ＴＩＦは正常ヒト繊維芽細胞および正
常ヒト胎児腎細胞を刺激する。
殖を阻害する。しかしながら、ＴＩＦによる阻害に対す
る腫瘍細胞の感受性は、細胞の型、組織培養における継
代および試験されるＴＩＦの種類に応じて異なっている
。単層培養では両ＴＩＦは正常ヒト繊維芽細胞および正
常ヒト胎児腎細胞を刺激する。
両ＴＩＦはその活性が濃度依存性であって、酸および熱
に安定な低分子量因子である。ＴＩＦの阻害活性は、そ
の因子が処理後１時間以内に細胞から除かれれば、可逆
的である。ＴＩＦ −１はトリジシンに感受性を示す。
に安定な低分子量因子である。ＴＩＦの阻害活性は、そ
の因子が処理後１時間以内に細胞から除かれれば、可逆
的である。ＴＩＦ −１はトリジシンに感受性を示す。
一方ＴＩＦ −２は、その分子量およびそのＴＩＦ −
１との多くの類似特性から推すとタンノヤクであると言
えるが、トリジシンに感受性を示さない。
１との多くの類似特性から推すとタンノヤクであると言
えるが、トリジシンに感受性を示さない。
ＴＩＦ −１およびＴＩＦ −２は、それらが由来する
材料であるＡ６７３細胞の増殖を阻害し得る。
材料であるＡ６７３細胞の増殖を阻害し得る。
この癌細胞系は、様々な形質転換増殖因子（ＴＧＦ ）
、および対照腫瘍細胞に拮抗的に作用することが予測さ
れる少なくとも２種類の腫瘍増殖阻害因子を産生ずる。
、および対照腫瘍細胞に拮抗的に作用することが予測さ
れる少なくとも２種類の腫瘍増殖阻害因子を産生ずる。
ＴＩＦ −１とＴＩＦ −２を区別するいくつかの特徴
を要約し、第９表に掲げる。
を要約し、第９表に掲げる。
第 ９ 表
ＴＩＦ−，１およびＴＩＦ−２の特徴（要約）インター
フェロン活性 − 熱安定性 ５６℃ ３０分 十 干１０
０℃ ３分 十 部分的に不安定トリプシ
ン感受性 十 −ヒト腫瘍細胞増殖阻
害 ＋ 十線維芽細胞刺激
十 ＋アメリカミンク肺細胞阻害
十 −ミトゲン活性 ＋
十分子量＊１０ρ００−１６ρ００１８，０００
−２２ρｏ。
フェロン活性 − 熱安定性 ５６℃ ３０分 十 干１０
０℃ ３分 十 部分的に不安定トリプシ
ン感受性 十 −ヒト腫瘍細胞増殖阻
害 ＋ 十線維芽細胞刺激
十 ＋アメリカミンク肺細胞阻害
十 −ミトゲン活性 ＋
十分子量＊１０ρ００−１６ρ００１８，０００
−２２ρｏ。
＊ 概略の分子量はバイオ−ダルＰ−１００カラムの溶
出により測定 本発明のＴＩＦの用途の中には、腫瘍増殖を阻害するま
たは正常細胞の増殖を刺激するＴＩＦ量と薬理学的に許
容し得る担体およびアジュバントから成る薬剤組成物の
ような製剤等が、当然のこととして含まれる。そのよう
な薬剤組成物は、当該分野で周知の方法を使って調製し
得る。
出により測定 本発明のＴＩＦの用途の中には、腫瘍増殖を阻害するま
たは正常細胞の増殖を刺激するＴＩＦ量と薬理学的に許
容し得る担体およびアジュバントから成る薬剤組成物の
ような製剤等が、当然のこととして含まれる。そのよう
な薬剤組成物は、当該分野で周知の方法を使って調製し
得る。
同様に、本発明の物質の利用法の中には、腫瘍細胞の増
殖を阻害する方法も含まれる。その方法の特徴は、転移
しやすい腫瘍のあるまたはそれを注入された宿主に、そ
の物質を腫瘍の阻害に足る量だけ投与することである。
殖を阻害する方法も含まれる。その方法の特徴は、転移
しやすい腫瘍のあるまたはそれを注入された宿主に、そ
の物質を腫瘍の阻害に足る量だけ投与することである。
その物質の投与形態および方法は、例えば錠剤、＊依、
懸濁、ペースト、腹腔内、皮下等いかなるものであって
も可能と言えよう。本発明に基すいて、創傷を治療する
方法も、含まれるが、それは創傷部位にＴＩＦを治癒に
足る量だけ投与することを特徴とする。
懸濁、ペースト、腹腔内、皮下等いかなるものであって
も可能と言えよう。本発明に基すいて、創傷を治療する
方法も、含まれるが、それは創傷部位にＴＩＦを治癒に
足る量だけ投与することを特徴とする。
第１図はヒト横絞筋腫からのコンディションド・メディ
ウムを濃縮し、パイオーダルｐ−ｉｏ。 クロマトグラフィーに懸けて溶出させた分画の活性を示
すグラフ図、第２図はヒト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖
に対するＴＩＦの効果を示す顕微鏡写真図、第３図は第
１図のゾールＢをバイオ−ダルＰ−１０クロマトグラフ
ィーに懸けて溶出させた分画の活性を示すグラフ図、第
４図はトゲラフイーに懸けて溶出させた分画の活性を示
すグラフ図、第５図はμデンジパーク０１８カラム（０
，３９ｘ３０ｃｎ１）を用い２−７°ロ／千ノールで溶
出させてＴＩＦ −１を精製したとき得られる分画の活
性を示すグラフ図、第６図は同一コンディションド・メ
ディウムに由来するＴＩＦ−１とＴＧＦとの間の拮抗関
係を示す顕微鏡写真図、第７図は横絞筋腫細胞系Ａ６７
３がらのコンディションド・メディウムをパイオーデル
Ｐ−１００カラムに懸けて溶出させた分画の活性を示す
グラフ図、第８図は第７図のパイオーグルＰ−１００カ
ラム操作を行なって得られたＴＧＦ活性のあるゾールＡ
を集めてＣＭ−セルロースクロマトグラフィーに懸けて
溶出させた分画の活性を示すグラフ図、第９図はＣＭ−
セルロースを用いて精製したＴＩＦ −２をＲＰ −Ｈ
ＰＬＣに懸けて溶出させた分画の活性を示すグラフ図、
第１０図は紗寒天中でのヒト黒色腫細胞Ａ３７５Ａｇ５
の増殖に対するＴＩＦ −２の効果を示す顕微鏡写真図
。 出願人代理人 弁理士 鈴 江 武 彦図面（７）予調
（内’ｆｉ’ ｉ−り−ψな１−５）ＦＥ宥 ％（ｏ） Ａ２８０ ｎｍ （Δ） ””Ｉ−ＥＧＦ ：＋−ｒｒ 梢」 ％（−）ＦＩ
Ｇ、’［ ＦＩＧ、 ３ ｉ２ｓｉｕｄＲ ｅｐｒｎ ｘ １Ｏ−３（ｓ ） ア１）−＝７−ゾル’７ｏ （−−−−−）阻害 ％（
０） ２−７°ロバ０ノ一ル％ （−一） ７＋ａ舎 ％（０） １２５１−ＥＧＦＪ舌 Ｊ九 ％（−）勅）虱′＠
う Ｙ旦害 ％（０） アｔ）ニトリル％←−−−） 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 特願昭６０−０８４３５３号 ４■件との関係 特許出願人 アメリカ合衆国
ウムを濃縮し、パイオーダルｐ−ｉｏ。 クロマトグラフィーに懸けて溶出させた分画の活性を示
すグラフ図、第２図はヒト腫瘍細胞の軟寒天中での増殖
に対するＴＩＦの効果を示す顕微鏡写真図、第３図は第
１図のゾールＢをバイオ−ダルＰ−１０クロマトグラフ
ィーに懸けて溶出させた分画の活性を示すグラフ図、第
４図はトゲラフイーに懸けて溶出させた分画の活性を示
すグラフ図、第５図はμデンジパーク０１８カラム（０
，３９ｘ３０ｃｎ１）を用い２−７°ロ／千ノールで溶
出させてＴＩＦ −１を精製したとき得られる分画の活
性を示すグラフ図、第６図は同一コンディションド・メ
ディウムに由来するＴＩＦ−１とＴＧＦとの間の拮抗関
係を示す顕微鏡写真図、第７図は横絞筋腫細胞系Ａ６７
３がらのコンディションド・メディウムをパイオーデル
Ｐ−１００カラムに懸けて溶出させた分画の活性を示す
グラフ図、第８図は第７図のパイオーグルＰ−１００カ
ラム操作を行なって得られたＴＧＦ活性のあるゾールＡ
を集めてＣＭ−セルロースクロマトグラフィーに懸けて
溶出させた分画の活性を示すグラフ図、第９図はＣＭ−
セルロースを用いて精製したＴＩＦ −２をＲＰ −Ｈ
ＰＬＣに懸けて溶出させた分画の活性を示すグラフ図、
第１０図は紗寒天中でのヒト黒色腫細胞Ａ３７５Ａｇ５
の増殖に対するＴＩＦ −２の効果を示す顕微鏡写真図
。 出願人代理人 弁理士 鈴 江 武 彦図面（７）予調
（内’ｆｉ’ ｉ−り−ψな１−５）ＦＥ宥 ％（ｏ） Ａ２８０ ｎｍ （Δ） ””Ｉ−ＥＧＦ ：＋−ｒｒ 梢」 ％（−）ＦＩ
Ｇ、’［ ＦＩＧ、 ３ ｉ２ｓｉｕｄＲ ｅｐｒｎ ｘ １Ｏ−３（ｓ ） ア１）−＝７−ゾル’７ｏ （−−−−−）阻害 ％（
０） ２−７°ロバ０ノ一ル％ （−一） ７＋ａ舎 ％（０） １２５１−ＥＧＦＪ舌 Ｊ九 ％（−）勅）虱′＠
う Ｙ旦害 ％（０） アｔ）ニトリル％←−−−） 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 特願昭６０−０８４３５３号 ４■件との関係 特許出願人 アメリカ合衆国
Claims (17)
- （１）正常細胞の増殖を阻害することなく、抗ウィルス
効果を発現させず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を有
し、さらに以下の性質、すなわち （イ）分子量は約３，５００ないし約４５，０００の範
囲、（ロ）約５６℃で約３０分の熱処理に対して安定、
（ハ）等電点は４ないし８の範囲、および （ニ）高圧液体クロマトグラフィーにて２−プロパノー
ル約１０ないし約３５％またはアセトニトリル約２５な
いし約５０％の濃度勾配で溶出、を備えた、実質的に精
製された腫瘍増殖阻害因子。 - （２）ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害する特許請求の範囲第
１項記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （３）ポリペプチドである特許請求の範囲第２項記載の
腫瘍増殖阻害因子。 - （４）分子量が１０，０００ないし１６，０００の範囲
である特許請求の範囲第３項記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （５）分子量が１８，０００ないし２２，０００の範囲
である特許請求の範囲第３項記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （６）アセトニトリル約２８ないし約３３％の濃度勾配
で溶出する特許請求の範囲第４項記載の腫瘍増殖阻害因
子。 - （７）アセトニトリル約３８ないし約４２％の濃度勾配
で溶出する特許請求の範囲第５項記載の腫瘍増殖阻害因
子。 - （８）トリプシン感受性である特許請求の範囲第６項記
載の腫瘍増殖阻害因子。 - （９）１００℃で３分の熱処理に対して安定である特許
請求の範囲第８項記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （１０）アメリカミンクの肺細胞を阻害する特許請求の
範囲第９項記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （１１）トリプシン感受性を欠く特許請求の範囲第７項
記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （１２）１００℃で３分の熱処理に対して部分的に不安
定である特許請求の範囲第１１項記載の腫瘍増殖阻害因
子。 - （１３）アメリカミンクの肺細胞を阻害しない特許請求
の範囲第１２項記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （１４）細胞分裂誘起活性を有する特許請求の範囲第２
項記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （１５）正常ヒト細胞の増殖を刺激する特許請求の範囲
第２項記載の腫瘍増殖阻害因子。 - （１６）正常細胞の増殖を阻害することなく、抗ウィル
ス効果を発現させず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を
有し、さらに以下の性質、すなわち （イ）分子量は約３，５００ないし約４５，０００の範
囲、 （ロ）約５６℃で約３０分の熱処理に対して安定、 （ハ）等電点は４ないし８の範囲、および （ニ）高圧液体クロマトグラフィーにて２−プロパノー
ル約１０ないし約３５％またはアセトニトリル約２５な
いし約５０％の濃度勾配で溶出、 を備えた、実質的に精製された腫瘍増殖阻害因子の調製
方法であって、 （イ）前記腫瘍増殖阻害因子を調製するために適した細
胞系を培養し、 （ロ）前記腫瘍増殖阻害因子を水系酸性溶媒または有機
溶媒で抽出し、および （ハ）前記腫瘍増殖阻害因子を精製および単離すること
からなる腫瘍増殖阻害因子の調製方法。 - （１７）正常細胞の増殖を阻害することなく、抗ウィル
ス効果を発現させず、腫瘍細胞の増殖を阻害する特性を
有し、さらに以下の性質、すなわち （イ）分子量は約３，５００ないし約４５，０００の範
囲、 （ロ）約５６℃で約３０分の熱処理に対して安定、 （ハ）等電点は４ないし８の範囲、および （ニ）高圧液体クロマトグラフィーにて２−プロパノー
ル約１０ないし約３５％またはアセトニトリル約２５な
いし約５０％の濃度勾配で溶出、 を備えた実質的に精製された腫瘍増殖阻害因子の腫瘍阻
害量、および薬剤として許容し得る担体またはアジュバ
ンドから成る、哺乳動物において腫瘍細胞の増殖性を阻
害するための薬剤組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/602,520 US4708948A (en) | 1984-04-20 | 1984-04-20 | Substantially purified tumor growth inhibitory factor |
| US602520 | 1996-02-20 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7346642A Division JP2702103B2 (ja) | 1984-04-20 | 1995-12-13 | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6133120A true JPS6133120A (ja) | 1986-02-17 |
| JP2550307B2 JP2550307B2 (ja) | 1996-11-06 |
Family
ID=24411683
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60084353A Expired - Lifetime JP2550307B2 (ja) | 1984-04-20 | 1985-04-19 | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 |
| JP7346642A Expired - Lifetime JP2702103B2 (ja) | 1984-04-20 | 1995-12-13 | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7346642A Expired - Lifetime JP2702103B2 (ja) | 1984-04-20 | 1995-12-13 | 腫瘍増殖阻害因子およびその調製方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4708948A (ja) |
| EP (1) | EP0159276B1 (ja) |
| JP (2) | JP2550307B2 (ja) |
| CA (1) | CA1311704C (ja) |
| DE (1) | DE3580607D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05124977A (ja) * | 1990-07-10 | 1993-05-21 | Univ Bar Ilan | 腫瘍細胞増殖阻害因子 |
| EP0821969A2 (en) | 1992-07-16 | 1998-02-04 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Medicinal Composition comprising TCF-II |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4920196A (en) * | 1982-07-30 | 1990-04-24 | Genentech, Inc. | Human lymphotoxin |
| US5705477A (en) * | 1982-09-24 | 1998-01-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Compositions of transforming growth factor β(TGF-β) which promotes wound healing and methods for their use |
| US5104977A (en) * | 1982-09-24 | 1992-04-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Purified transforming growth factor beta |
| US5656587A (en) * | 1982-09-24 | 1997-08-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Promotion of cell proliferation by use of transforming growth factor beta (TGF-β) |
| US4849506A (en) * | 1984-04-13 | 1989-07-18 | Akzo N.V. | Leukoregulin, an antitumor lymphokine, and its therapeutic uses |
| US4886747A (en) * | 1985-03-22 | 1989-12-12 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding TGF-β and its uses |
| US5284763A (en) * | 1985-03-22 | 1994-02-08 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding TGF-β and its uses |
| US6586394B1 (en) | 1985-04-19 | 2003-07-01 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Tissue-derived tumor growth inhibitor |
| US6559123B1 (en) * | 1985-04-19 | 2003-05-06 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Tissue-derived tumor growth inhibitors, methods of preparation and uses thereof |
| US5618715A (en) * | 1985-12-20 | 1997-04-08 | Oncogen Limited Partnership | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity |
| DE3750664T2 (de) * | 1986-07-15 | 1995-06-22 | Kowa Co | Throminbindende Substanz und Verfahren zu ihrer Herstellung. |
| NZ222168A (en) * | 1986-10-20 | 1991-05-28 | Oncogene Science Inc | Tumour growth inhibiting protein related to tgf-#b#1 and tgf-#b#2, preparation by genetic engineering methods, antibodies and pharmaceutical compositions |
| US5221620A (en) * | 1987-10-06 | 1993-06-22 | Oncogen | Cloning and expression of transforming growth factor β2 |
| US5196334A (en) * | 1988-09-02 | 1993-03-23 | Baylor College Of Medicine | Urogenital sinus derived growth inhibitory factor |
| US4983699A (en) * | 1989-01-03 | 1991-01-08 | Ppg Industries, Inc. | Silylated addition polymers with pendant ionic moieties |
| DE3907822A1 (de) * | 1989-03-10 | 1990-09-13 | Adolf Dr Loefflmann | Verwendung einer peroxidaseaktivitaet zeigenden proteinfraktion aus dem photosyntheseapparat von pflanzen als arzneimittel, insbesondere zur krebsbekaempfung, sowie verfahren zur gewinnung einer proteinmischung und arzneimittel zur krebsbekaempfung |
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| WO1992000318A1 (en) * | 1990-06-25 | 1992-01-09 | Oncogene Science, Inc. | Tissue-derived tumor growth inhibitors, methods for preparation and uses thereof |
| US5648340A (en) * | 1991-10-31 | 1997-07-15 | Barnea; Eytan R. | Gestational agents for controlling cell proliferation |
| GB9106678D0 (en) * | 1991-03-28 | 1991-05-15 | Ferguson Mark W J | Wound healing |
| US5916871A (en) * | 1992-04-27 | 1999-06-29 | Kansas State University Research Foundation | Inhibitory factor |
| AU678764B2 (en) * | 1992-06-03 | 1997-06-12 | Case Western Reserve University | Bandage for continuous application of biologicals |
| IL111021A0 (en) * | 1994-09-22 | 1994-11-28 | Mor Research Applic Ltd | Factor derived from muscle cells |
| WO1996013586A2 (en) * | 1994-10-26 | 1996-05-09 | Nobuko Satomi | Histiocyte-secreted factor (hsf) |
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| CN101058809B (zh) * | 2007-04-02 | 2010-09-08 | 苏州大学 | 人源化改造的鼠ing4基因及其腺病毒表达载体在制备治疗肺癌的药物中的应用 |
| JP7002364B2 (ja) | 2018-03-01 | 2022-01-20 | 三桜工業株式会社 | 曲げ成形型 |
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| US4261976A (en) * | 1978-10-03 | 1981-04-14 | The Massachusetts General Hospital | Method and glycoprotein composition for inhibition of growth of transformed cells and tumors |
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1984
- 1984-04-20 US US06/602,520 patent/US4708948A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-04-19 DE DE8585400784T patent/DE3580607D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-19 CA CA000479630A patent/CA1311704C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-19 JP JP60084353A patent/JP2550307B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-19 EP EP85400784A patent/EP0159276B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-12-13 JP JP7346642A patent/JP2702103B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP0821969A2 (en) | 1992-07-16 | 1998-02-04 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Medicinal Composition comprising TCF-II |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1311704C (en) | 1992-12-22 |
| EP0159276A2 (en) | 1985-10-23 |
| EP0159276B1 (en) | 1990-11-22 |
| JPH08231593A (ja) | 1996-09-10 |
| US4708948A (en) | 1987-11-24 |
| JP2702103B2 (ja) | 1998-01-21 |
| DE3580607D1 (de) | 1991-01-03 |
| EP0159276A3 (en) | 1986-07-30 |
| JP2550307B2 (ja) | 1996-11-06 |
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