MX2011003014A - Uso de una variante del factor estimulador de colonias de granulocitos multi-pegilado en el tratamiento de neutropenia inducida por radiacion. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para tratar o prevenir neutropenia inducida por radiación en un paciente expuesto a radiación, administrando al paciente una variante del factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) multi-PEGilado.

Description

USO DE UNA VARIANTE DEL FACTOR ESTIMULADOR DE COLONIAS DE GRANULOCITOS MULTI-PEGILADO EN EL TRATAMIENTO DE NEUTROPENIA INDUCIDA POR RADIACIÓN REFERENCIA RECÍPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Conforme a 35 U.S.C. §119(e), esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. de serie 61/098,569, presentada en septiembre 19 de 2008, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia para todos los propósitos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir neutropenia inducida por radiación, administrando una variante del factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) multi-PEGilado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El proceso por el cual los glóbulos blancos crecen, se dividen y se diferencian en la médula ósea, se denomina hematopoyesis (Dexter y Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol., 3: 423, 1987). Cada uno de los tipos de células sanguíneas surge de células madre pluripotenciales. Existen generalmente tres clases de células sanguíneas producidas in vivo: glóbulos rojos (eritrocitos), plaquetas y glóbulos blancos (leucocitos), la mayoría de los últimos estando implicados en la defensa inmune del hospedero. La proliferación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas son reguladas por una familia de citocinas, que incluyen factores estimuladores de colonias (CSFs), tales como el G-CSF y las interleucinas (Arai et al., Ann. Rev. Biochem., 59: 783-836, 1990). El efecto biológico principal del G-CSF in vivo, es estimular el crecimiento y el desarrollo de ciertos glóbulos blancos conocidos como granulocitos neutrofílicos o neutrófilos (Welte er a/., PNAS 82: 1526-1530, 1985; Souza et al., Science, 232: 61-65, 1986). Cuando son liberados en el torrente sanguíneo, los granulocitos neutrofílicos funcionan para combatir las infecciones bacterianas y de otro tipo.

La secuencia de aminoácidos del G-CSF humano (hG-CSF) fue reportada por Nagata et al. (Nature 319: 415-418, 1986). El hG-CSF es una proteína monomérica que dimeriza al receptor del G-CSF por la formación de un complejo 2:2 de 2 moléculas del G-CSF y 2 receptores (Horan et al., Biochemistry 35(15): 4886-96, 1996). En una publicación más reciente (PNAS 103: 3135-3140, 2006), Tamada et al. describieron una estructura cristalina del complejo de señalización entre el G-CSF humano y una región de unión al ligando del receptor del GCSF.

La leucopenia (un nivel reducido de glóbulos blancos) y la neutropenia (un nivel reducido de neutrófilos), son trastornos que resultan en una susceptibilidad incrementada a varios tipos de infecciones. Para pacientes con neutropenia severa (denominada también neutropenia febril), exhibida por un conteo absoluto de neutrófilos (ANC) abajo de aproximadamente 500 células/mm3, incluso infecciones relativamente menores pueden ser serias, e incluso ponen en riesgo la vida. Se usa con frecuencia G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) para tratar y prevenir varias formas de leucopenia y neutropenia. Preparaciones del rhG-CSF están disponibles comercialmente, por ejemplo, Neupogen® (Filgrastim), que es no glucosilado y producido en células de E. coli recombinantes, y Neulasta® (Pegfilgrastim), que tiene la misma secuencia de aminoácidos que Neupogen®, pero contiene un grupo polietilenglicol (PEG) individual de 20 kDa N-term¡nalmente enlazado. Se ha mostrado que esta molécula del rhG-CSF mono-PEGilado tiene una vida media incrementada en comparación con el G-CSF no PEGilado, y de esta manera puede administrarse con menos frecuencia que los productos del G-CSF no PEGilados, y reduce la duración de la neutropenia hasta aproximadamente el mismo número de días como por la administración del G-CSF no PEGilado.

El síndrome agudo por radiación (ARS), conocido también como enfermedad por radiación o mal por radiación, abarca una serie de procesos fisiopatológicos complejos precipitados por la exposición a altas dosis de radiación que afectan a los sistemas hematológico, gastrointestinal y cardiovascular. El ARS ocurre generalmente después de irradiación del cuerpo entero o irradiación parcial significativa del cuerpo de aproximadamente 0.7 a 1 gray (Gy) o más, suministrada durante un período relativamente corto (Waselenko J. K. et al., Annals of Internal Medicine 140(12): 1037-1051 , 2004; Jarrett D. G. et al., Radiation Measurements 42: 1063-1074, 2007). La latencia, severidad y duración de las varias manifestaciones del ARS son una función de la dosis de radiación, el grado de la dosis y el tipo de radiación, así como la heterogeneidad u homogeneidad de la exposición precipitante.

El ARS sigue un curso un poco predecible, y se caracteriza por síntomas que son manifestaciones de la reacción específica de varias células, tejidos y sistemas de órganos a la radiación (véase, por ejemplo, Waselenko et al., citado anteriormente, en particular la figura 1 , los cuadros 1 a 3 y el cuadro 5 de esta cita). Los síntomas asociados con el ARS incluyen náusea, vómito, diarrea, neutropenia, quemaduras y úlceras de la piel, fatiga, deshidratación, inflamación, pérdida del cabello, ulceración de la mucosa oral y el sistema Gl, xerostomia y hemorragia (por ejemplo, de la nariz, boca y recto). Las células que se replican a alta velocidad, tales como las células progenitoras hematopoyéticas, los espermatocitos y las células de las criptas intestinales, son más inmediatamente vulnerables a la exposición aguda a la radiación. La probabilidad de efectos clínicos mensurables se incrementa conforme se incrementa la dosis total o el grado de la dosis. Sin embargo, una dosis de radiación total que produce un efecto observable después de una exposición rápida individual puede ser tolerada con poco efecto mensurable, si se da durante un período más prolongado.

Las células hematopoyéticas circulantes y las células progenitoras hematopoyéticas (médula ósea), están entre las células más altamente radiosensibles. Una causa subyacente común para los síntomas asociados con la enfermedad por radiación, es el efecto de la radiación sobre dichas células. El síndrome hematopoyético (H-ARS) se observa en humanos expuestos a niveles significativos de radiación del cuerpo entero o niveles de radiación parcial del cuerpo, que exceden en general aproximadamente 0.7-1 Gy (Jarrett et al., citado anteriormente; Waselenko et ai, citado anteriormente), y es rara vez clínicamente significativo abajo de este nivel. Las células progenitoras hematopoyéticas mitóticamente activas tienen una capacidad limitada para dividirse después de una dosis de radiación del cuerpo entero de 2 a 3 Gy. El síndrome hematopoyético del ARS se caracteriza por reducciones en el número de células sanguíneas - glóbulos blancos (WBC; neutrófilos y linfocitos), plaquetas (denominadas también trombocitos) y glóbulos rojos (RBC) -, con resultados potencialmente clínicamente significativos. La exposición a la radiación ionizante puede llevar a decrementos en el conteo de WBC, que se manifiestan como neutropenia (reducción en neutrófilos/granulocitos) y linfopenia (reducción en linfocitos). Los decrementos de RBC pueden resultar en anemia, mientras que la reducción de plaquetas puede llevar a trombocitopenia. La cinética de la neutropenia, trombocitopenia y anemia inducida por radiación depende de la dosis recibida, el grado de la dosis y el grado al cual el cuerpo es irradiado (Waselenko et al., citado anteriormente). El daño inducido por la radiación sobre la producción celular en la médula ósea, comienza al momento de la exposición. Mientras que la mayoría de las células progenitoras de la médula ósea son susceptibles a la muerte de las células después de dosis de radiación suficientemente altas, se ha encontrado que las sub-poblaciones de células madre o células accesorias son más radiorresistentes, debido probablemente a su estado no cíclico (Go), lo cual puede desempeñar una función importante en la recuperación de la hematopoyesis después de la exposición a dosis potencialmente letales (Waselenko et al., citado anteriormente).

Los efectos de la radiación dependen también de la cantidad de área de superficie del cuerpo expuesta. Se cree que el cuerpo humano puede absorber una dosis individual de hasta aproximadamente 2 Gy sobre el área del cuerpo entero sin riesgo de muerte inmediato. Una dosis arriba de aproximadamente 2 Gy, si no se trata, lleva a muerte probable o peligro de muerte debido a la falla de la médula ósea. Una dosis del cuerpo entero de aproximadamente 8 Gy o más dada durante un período corto, es casi ciertamente fatal. En contraste, decenas de Gy pueden tolerarse cuando se suministran durante un período más largo, y/o a un volumen pequeño de tejido (como en, por ejemplo, para la terapia del cáncer).

La neutropenia inducida por radiación incrementa la susceptibilidad a la infección que pone en riesgo la vida por organismos saprofitos y patógenos, y disminuye la resistencia inmune a la expansión bacteriana en tejidos subcutáneos y a partir de rupturas en la integridad de la pared intestinal. Esta susceptibilidad a la infección y sepsis, es la causa primaria de mortalidad en sujetos con exposiciones a la radiación ionizante en la escala de 2 a 8 Gy. Concurrentes con la neutropenia, pueden observarse también grados variables de trombocitopenia. La trombocitopenia severa puede incrementar la susceptibilidad a la hemorragia que pone en riesgo la vida si se deja sin tratar.

La neutropenia inducida por radiación asociada con el ARS lleva a mortalidad y morbilidad significativas en pacientes expuestos a altos niveles de radiación por medio de, por ejemplo, un incidente nuclear o exposición accidental a la radiación. Existe la necesidad de productos del G-CSF de acción duradera, en particular G-CSF multi-PEGilado, que puedan administrarse con seguridad para reducir la neutropenia inducida por radiación asociada con el ARS, y de métodos para el tratamiento y prevención de neutropenia inducida por radiación usando dichos productos del G-CSF.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención, es proveer un método para tratar o prevenir neutropenia en pacientes expuestos a radiación, por ejemplo, como una consecuencia de una explosión nuclear o exposición accidental a la radiación, para aumentar la supervivencia disminuyendo la duración y/o severidad de la neutropenia inducida por radiación, y disminuyendo de esta manera el riesgo de infección que pone en riesgo la vida en dichos pacientes.

Un aspecto de la invención se refiere de esta manera a un método para tratar o prevenir neutropenia en un paciente sujeto a exposición a la radiación, que comprende administrar a dicho paciente una variante del G-CSF multi-PEGilado en una cantidad efectiva para reducir la neutropenia inducida por radiación, tal como neutropenia inducida por radiación asociada con el síndrome agudo de radiación (ARS), por ejemplo, el síndrome hematopoyético de ARS (H-ARS).

Otro aspecto de la invención se refiere a una variante del G-CSF multi-PEGilado para tratar o prevenir neutropenia por medio del método descrito en la presente. Este aspecto de la invención se refiere de esta manera a una variante del G-CSF multi-PEGilado para el tratamiento de neutropenia inducida por radiación. Este aspecto de la invención se refiere también a una variante del G-CSF multi-PEGilado para tratar o prevenir neutropenia en un paciente expuesto a radiación, administrando la variante del G-CSF multi-PEGilado al paciente.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una variante del G-CSF multi-PEGilado, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir neutropenia inducida por radiación por medio del método descrito en la presente. Este aspecto de la invención se refiere de esta manera al uso de una variante del G-CSF multi-PEGilado, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir neutropenia inducida por radiación en un paciente expuesto a radiación, en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado se administra al paciente en una cantidad efectiva para reducir neutropenia inducida por radiación. Este aspecto de la invención se refiere también al uso de una variante del G-CSF multi-PEGilado, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de neutropenia inducida por radiación. Este aspecto de la invención se refiere también al uso de una variante del G-CSF multi-PEGilado, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir neutropenia inducida por radiación en un paciente expuesto a radiación, administrando la variante del G-CSF multi-PEGilado al paciente.

En algunas modalidades, la variante del G-CSF multi-PEGilado se administra al paciente en una cantidad efectiva para reducir la duración de la neutropenia severa en un grupo tratado con la variante del G-CSF multi-PEGilado, respecto a un grupo no tratado con la variante del G-CSF multi-PEGilado, en un sistema de modelo animal (tal como un sistema de modelo de primate no humano) de neutropenia inducida por radiación. En otras modalidades, la variante del G-CSF multi-PEGilado se administra al paciente en una cantidad efectiva para incrementar el número de supervivientes 30 días o 60 días post-exposición a la radiación en un grupo tratado con la variante del G-CSF multi-PEGilado, respecto a un grupo no tratado con la variante del G-CSF multi-PEGilado, en un sistema de modelo animal (tal como un sistema de modelo de primate no humano) de neutropenia inducida por radiación.

Estos y otros aspectos y características de la invención llegarán a ser más enteramente evidentes, cuando se lea la siguiente descripción detallada en conjunto con los dibujos acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una relación de respuesta a la dosis de letalidad en el síndrome hematopoyético de 60 días en monos rhesus, presentada como por ciento de letalidad probit contra dosis de TBI en grays (Gy) sobre una escala logarítmica. El valor de LD50/60 resultante para macacos rhesus expuestos a fotones LINAC de 2 MV y que reciben cuidado de soporte, se índica como LD50UNAC (con el intervalo de confianza de 95% en corchetes [ ]). Esta figura muestra también dos series de datos históricos que muestran la respuesta a la dosis de TBI y los valores de LD50/30 calculados (con intervalo de confianza de 95% en corchetes [ ]), de macacos rhesus expuestos a radiación de Co-60 gamma y radiación X de 2 MV (denotada como LD50co6o y LD50rayos x, respectivamente). Los animales en los estudios históricos no recibieron cuidado de soporte.

La figura 2 muestra el curso de tiempo del cambio en el conteo absoluto medio de neutrófilos (ANC) en monos rhesus, después de exposición a irradiación total del cuerpo a dosis que se aproximan a la LD30/60 (720 centigrays (cGy)), LD50/60 (755 cGy) y LD70/60 (805 cGy), y a los que se les dio cuidado de soporte.

La figura 3 demuestra que un ejemplo de variante del G-CSF multí-PEGilado de la invención (identificado en la presente como "Maxy-G21 ") mejora la recuperación de neutrófilos en primates no humanos después de exposición a la radiación, respecto al rhG-CSF mono-PEGilado. El conteo absoluto de neutrófilos (ANC) en monos rhesus se determinó después de irradiación con 600 cGy (6.00 Gy) y administración de Maxy-G21 , Neulasta® o control (sueros), un día post-irradiación. Se indica neutropenia severa (ANC < 500/µ?_) mediante la linea horizontal.

La figura 4 muestra el perfil farmacocinético (PK) de monos rhesus irradiados con 600 cGy dosificados un día post-irradiación con 300 g/kg de Maxy-G21 o 300 pg/kg de Neulasta®.

La figura 5 muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones expuestos a radiación de 776 cGy y tratados subsiguientemente con un ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado de la invención ("G34", identificado también en la presente como "Maxy-G34")) o con diluyente ("vehículo"). Se irradió a ratones C57BL/6, y entonces se inyectó subcutáneamente a los mismos con G34 (1.0 mg/kg = 20 pg/20 g de ratón) a 24 horas y 7 días post-exposición (rombos claros), o 24 horas, 7 días y 14 días post-exposición (cuadros claros). Se inyectó a ratones control a 24 horas, 7 días y 14 días post-exposición (triángulos claros) con diluyente. No se trató a los ratones con antibióticos.

La figura 6 muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones expuestos a radiación de 796 cGy y tratados subsiguientemente con un ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado de la invención ("G34", identificado también en la presente como "Maxy-G34")) o con diluyente ("vehículo"). Se irradió a ratones C57BL/6, y entonces se inyectó subcutáneamente a los mismos con G34 (1.0 mg/kg = 20 pg/20 g de ratón) a 24 horas y 7 días post-exposición (rombos claros), o 24 horas, 7 días y 14 días post-exposición (cuadros claros). Se inyectó a ratones control a 24 horas, 7 días y 14 días post-exposición (triángulos oscuros) con vehículo. No se trató a los ratones con antibióticos.

Definiciones En la descripción y las reivindicaciones más adelante, se aplican las siguientes definiciones.

Los términos "polipéptido" o "proteína" pueden usarse reciprocamente en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos, sin que sean limitados a una secuencia de aminoácidos de alguna longitud particular. Se pretende que estos términos incluyan no sólo proteínas de longitud completa sino también, por ejemplo, fragmentos o versiones truncadas, variantes, dominios, etc., de alguna proteína o polipéptido dado.

Un "polipéptido del G-CSF", es un polipéptido que tiene la secuencia del factor estimulador de colonias de granulocitos humano (hG-CSF) como se muestra en SEQ ID NO: 1 , o una variante del hG-CSF que exhiba actividad del G-CSF. La "actividad del G-CSF" puede ser la capacidad para unirse a un receptor del G-CSF (Fukunaga et al., J. Bio. Chem, 265: 14008, 1990, cita que se incorpora en la presente como referencia), pero es de preferencia actividad de proliferación de células del G-CSF la cual puede determinarse, por ejemplo, en una prueba de actividad in vitro usando la linea de células de murino NFS-60 (número de la ATCC: CRL-1838). Una prueba in vitro adecuada para la actividad del G-CSF usando la linea de células NFS-60, es descrita por Hammerling et al. en J. Pharm. Biomed. Anal. 13(1): 9-20, 1995, cita que se incorpora en la presente como referencia. Se considera que un polipéptido que "exhibe actividad del G-CSF" tiene dicha actividad cuando exhibe una función mensurable, por ejemplo, una actividad de proliferación de células mensurable en una prueba in vitro.

Una "variante" (por ejemplo, una "variante del G-CSF"), es un polipéptido que difiere en uno o más residuos de aminoácido de un polipéptido precursor, en donde el polipéptido precursor es generalmente uno con una secuencia nativa de aminoácidos de tipo silvestre, típicamente un polipéptido nativo de mamífero, y más típicamente un polipéptido nativo de humano. La variante contiene de esta manera una o más sustituciones, inserciones o deleciones en comparación con el polipéptido nativo. Éstas pueden incluir, por ejemplo, truncamiento del extremo N-terminal y/o C-terminal, por uno o más residuos de aminoácido, o adición de uno o más residuos de aminoácido en el extremo N-terminal y/o C-terminal, por ejemplo, adición de un residuo de metionina en el extremo N-terminal La variante diferirá con más frecuencia en hasta 15 residuos de aminoácido del polipéptido precursor, tal como en hasta 12, 10, 8 6 6 residuos de aminoácido. Algunas variantes del G-CSF, en particular, tienen sustituciones de aminoácido en la secuencia del G-CSF con o sin la adición de un residuo de metionina en el extremo N-terminal.

El término G-CSF "modificado" se refiere a una molécula del G-CSF con la secuencia del G-CSF de humano o una variante del G-CSF de humano, la cual es modificada, por ejemplo, por la alteración de la estructura del glucano. Por ejemplo, la estructura del glucano del G-CSF puede ser modificada con el propósito de proveer moléculas del G-CSF gluco-PEGiladas, en las cuales las porciones de polietilenglicol están unidas a un grupo de enlace de glucosilo tal como una porción de ácido siálico como se describe en el documento WO 2005/055946, el cual se incorpora en la presente como referencia. Otro ejemplo de una molécula del G-CSF modificada, es uno que contiene por lo menos un sitio de glucosilación O-enlazado que no existe en el polipéptido de tipo silvestre. Moléculas del G-CSF que tienen dichos sitios de glucosilación O-enlazados de ocurrencia no natural, así como PEGilación de azúcares modificados del G-CSF, se describen en el documento WO 2005/070138, el cual se incorpora en la presente como referencia.

A menos que se indique de otra manera, se pretende que el término "G-CSF", como se usa en la presente, abarque moléculas del G-CSF con la secuencia nativa de humano (SEQ ID NO: 1), así como variantes de la secuencia del G-CSF de humano. En cualquier caso, se pretende también que el término "G-CSF" incluya G-CSF modificado, tales como variantes de glucosilación del G-CSF.

Un G-CSF PEGilado que "comprende porciones de polietilenglicol múltiples" (referido también en la presente como un "G-CSF multi-PEGilado"), se refiere a un polipéptido del G-CSF que tiene dos o más porciones de PEG que están unidas covalentemente ya sea directamente o indirectamente a un residuo de aminoácido del polipéptido, en contraste con un "G-CSF mono-PEGilado", el cual tiene sólo una porción de PEG unida covalentemente al polipéptido. Sitios de unión adecuados incluyen, por ejemplo, el grupo épsilon-amino de un residuo de lisina o el grupo amino N-terminal, un grupo ácido carboxilico libre (por ejemplo, el del residuo de aminoácido C-terminal o de un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico), el grupo tiol de un residuo de cisteina, grupos carbonilo convenientemente activados, porciones de carbohidrato oxidadas y grupos mercapto. Más información sobre los sitios de unión del PEG y métodos para la unión de porciones de PEG a proteínas puede encontrarse, por ejemplo, en los documentos WO 01/51510 y WO 03/006501 , y el catálogo de PEGilación avanzada 2005-2006 de Nektar (Nektar Therapeutics), los cuales se incorporan en la presente como referencia. Otra posibilidad para la PEGilación, es unir porciones de PEG a las estructuras de glucano del G-CSF, por ejemplo, por medio de modificación del glucano (véase anteriormente).

Una "variante del G-CSF multi-PEGilado", se refiere a una variante del G-CSF que tiene dos o más porciones de PEG que están unidas covalentemente ya sea directamente o indirectamente, a un residuo de aminoácido de la variante.

En la presente solicitud, nombres de aminoácidos y nombres de átomos (por ejemplo, CA, CB, NZ, N, O, C, etc.) se usan como es definido por el Banco de Datos de Proteínas (Protein Data Bank, PDB), el cual se basa en la nomenclatura de la IUPAC (nomenclatura y simbolismo de la IUPAC para aminoácidos y péptidos (nombres de residuos, nombres de átomos, etc.)), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984), junto con sus correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). Se pretende que el término "residuo de aminoácido" indique cualquier residuo de aminoácido de ocurrencia natural o no natural, en particular un residuo de aminoácido contenido en el grupo que consiste de los 20 aminoácidos de ocurrencia natural, es decir, residuos de alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (lie o I), lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o ), asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano (Trp o W) y tirosina (Tyr o Y).

La terminología usada para identificar posiciones/sustituciones de aminoácido en la presente, se ilustra como sigue: F13 indica el número de posición 13 ocupado por un residuo de fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de referencia. F13K indica que el residuo de fenilalanina en la posición 13 ha sido sustituido con un residuo de lisina. A menos que se indique de otra manera, la numeración de residuos de aminoácido hecha en la presente se hace respecto a la secuencia de aminoácidos del hG-CSF mostrada en SEQ ID NO: 1. Sustituciones alternativas se indican con una "/", por ejemplo, K16R/Q significa una secuencia de aminoácidos en la cual la lisina en la posición 16 es sustituida con arginina o glutamina. Sustituciones múltiples se indican con un "+", por ejemplo, K40R+T105K significa una secuencia de aminoácidos la cual comprende una sustitución del residuo de lisina en la posición 40 con un residuo de arginina, y una sustitución del residuo de treonina en la posición 105 con un residuo de lisina.

El término "vida media in vivo funcional" se usa en su significado normal, es decir, el tiempo al cual 50% de la actividad biológica de la molécula de prueba (por ejemplo, conjugado PEGilado) está aún presente en el órgano objetivo/cuerpo, o el tiempo al cual la actividad del polipéptido o conjugado es 50% del valor inicial. La "vida media en suero" se define como el tiempo en el cual 50% de las moléculas del conjugado circulan en el plasma o torrente sanguíneo antes de que sean depuradas. Términos alternativos para la vida media en suero incluyen "vida media en plasma", "vida media en la circulación", "depuración en suero", "depuración en plasma" y "vida media de depuración". La molécula de prueba (por ejemplo, conjugado PEGilado) es depurada por la acción de uno o más del sistema reticuloendotelial (RES), riñon, bazo o hígado, por degradación mediada por el receptor, o por proteólisis específica o no específica, en particular por la acción de depuración mediada por el receptor y depuración renal. Normalmente, la depuración depende del tamaño (respecto a la limitación para la filtración glomerular), carga, cadenas de carbohidratos unidas, y la presencia de receptores celulares para la proteína. La funcionalidad que va a ser retenida se selecciona normalmente de actividad proliferativa o actividad de unión al receptor. La vida media in vivo funcional y la vida media en suero pueden determinarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica.

El término "incrementada" como se usa con relación a la vida media ¡n vivo o la vida media en suero, se usa para indicar que la vida media de la molécula de prueba, es decir, la variante del G-CSF multi-PEGilado, es estadísticamente significativamente incrementada respecto a la de una molécula de referencia, tal como un hG-CSF no conjugado (es decir, no PEGilado) (por ejemplo, Neupogen®) o, de preferencia, respecto al G-CSF mono-PEGilado Neulasta®, según se determina bajo condiciones comparables (típicamente determinadas en un animal experimental, tal como rata, conejo, cerdo o mono). Por ejemplo, la vida media en suero (t½) de la molécula de prueba puede ser incrementada por cuando menos aproximadamente 1.2 x respecto a la de la molécula de referencia (es decir, (t½ de la molécula de prueba)/(t½ de la molécula de referencia) = 1.2 ), por ejemplo, por cuando menos aproximadamente 1.4 x, tal como por cuando menos aproximadamente 1.5 x, por ejemplo, por cuando menos aproximadamente 1.6 x, tal como por cuando menos aproximadamente 1.8 x, por ejemplo, por cuando menos aproximadamente 2.0 x, 2.5 x, 3 x, 5 x o 10 x respecto a la de la molécula de referencia.

El término "AUC" o "área bajo la curva" se usa en su significado normal, es decir, como el área bajo la curva de concentración en suero contra tiempo, en donde la molécula de prueba ha sido administrada a un sujeto. Una vez que se han determinado los puntos de concentración experimental-tiempo, el AUC puede calcularse convenientemente mediante un programa de cómputo tal como GraphPad Prism® (GraphPad Software, Inc.).

El término "incrementado", como se usa con relación al AUC, se usa para indicar que el AUC de la molécula de prueba, es decir, la variante del G-CSF multi-PEGilado, es estadísticamente significativamente incrementado respecto al de una molécula de referencia, tal como un hG-CSF no conjugado (por ejemplo, Neupogen®) o, de preferencia, respecto al hG-CSF mono-PEGilado Neulasta®, según se determina bajo condiciones comparables (típicamente determinadas en un animal experimental, tal como rata, conejo, cerdo o mono). Por ejemplo, el AUC de la molécula de prueba puede ser incrementado por cuando menos aproximadamente 1.2 x del de la molécula de referencia (es decir, (AUC de la molécula de prueba)/(AUC de la molécula de referencia) = 1.2 ), por ejemplo, por cuando menos aproximadamente 1.4 x, tal como por cuando menos aproximadamente 1.5 x, por ejemplo, por cuando menos aproximadamente 1.6 x, tal como por cuando menos aproximadamente 1.8 x, por ejemplo, por cuando menos aproximadamente 2.0 x, 2.5 x, 3 x, 5 x o 10 x del de la molécula de referencia.

El término "sujeto" se refiere a un animal, tal como un mamífero, incluyendo un no primate (por ejemplo, una vaca, cerdo, caballo, gato o perro) o un primate (por ejemplo, un mono, chimpancé o humano) tal como un primate no humano (por ejemplo, un mono o chimpancé), o un humano. En algunos casos, el sujeto es un mamífero, tal como un humano, que ha sido expuesto a radiación. El término "sujeto" se usa reciprocamente con el término "paciente" en la presente.

El término "exposición aguda a la radiación", se refiere a la exposición a la radiación que ocurre durante un corto periodo, es decir, bajo 24 horas (tal como menos de 20 horas, menos de 16 horas, menos de 12 horas, menos de 10 horas, menos de 8 horas, menos de 6 horas, menos de 2 horas, menos de 1 hora, menos de 30 minutos, menos de 20 minutos, menos de 10 minutos, menos de 5 minutos o menos de un minuto). La exposición aguda a la radiación puede resultar de un evento nuclear (tal como una explosión nuclear); un accidente de laboratorio o de fabricación; exposición durante el manejo de fuentes altamente radiactivas durante minutos u horas; o dosis medicinales altas accidentales o intencionales.

El término "dosis de radiación" se refiere a la cantidad total de radiación absorbida por materiales o tejidos, expresada generalmente en centrigrays (cGy) o grays (Gy).

El término "por ciento de dosis de radiación" se refiere a la dosis (dosificación) de radiación absorbida por unidad de tiempo.

El término "LDx/y" se refiere a la dosis de radiación promedio que resulta en la muerte de x % de sujetos por y días. Por ejemplo, los términos LD50/30 y LD50/60 se refieren a la dosis de radiación promedio que resulta en la muerte de 50% de los sujetos alrededor de 30 ó 60 días, respectivamente.

Varios términos adicionales se definen o se caracterizan de otra manera en la presente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para tratar o prevenir neutropenia en un paciente expuesto a radiación, en donde el método comprende administrar a dicho paciente una variante del G-CSF multi-PEGilado en una cantidad efectiva para reducir la neutropenia inducida por radiación.

Los presentes inventores han encontrado que la administración de una variante del G-CSF multi-PEGilado es más efectiva para reducir la duración de la neutropenia inducida por radiación, cuando se compara con la administración de un hG-CSF mono-PEGilado (Neulasta®) en un modelo de primate no humano irradiado. La reducción del tiempo para la recuperación absoluta de neutrófilos (ANC) fue también significativamente mejorada en comparación con el hG-CSF control y mono-PEGilado (Neulasta®). Como se usa en la presente, el término "tiempo para la recuperación del ANC" se define como el número de días que parte del día uno de quimioterapia hasta los dos primeros días consecutivos en donde el sujeto tiene conteos arriba de 0.5 x 109 células en el ANC/L, es decir, arriba del límite que define la neutropenia severa. El tiempo para la recuperación del ANC, la duración/dias de leucopenia y la duración/días de neutropenia severa, son todos indicativos del período durante el cual un paciente expuesto a radiación está en un estado inmunosuprimido (los términos "días de neutropenia" y "días de neutropenia severa", se usan recíprocamente en la presente). Durante este periodo, el paciente es vulnerable a infecciones que pueden exacerbar otros síntomas de síndrome agudo de radiación, y las cuales pueden llevar a mortalidad. En vista de los resultados descritos en los ejemplos en la presente, se contempla que la administración de la variante del G-CSF multi-PEGilado es más efectiva que la administración de un hG-CSF mono-PEGilado (Neulasta®), para reducir la magnitud y duración de la neutropenia inducida por radiación en un sujeto.

El método de la invención es efectivo para reducir el tiempo para la recuperación del ANC, los días de leucopenia y los días de neutropenia. A dosis equivalentes, el método es más efectivo para reducir el tiempo para la recuperación del ANC, los días de leucopenia y los días de neutropenia, cuando se compara con el hG-CSF mono-PEGilado (Neulasta®).

De conformidad con el método de la presente invención, la variante del G-CSF multi-PEGilado se administra de preferencia dentro de siete días después de la exposición a la radiación. Por ejemplo, la variante del G-CSF multi-PEGilado puede administrarse dentro de aproximadamente 4 días después de la exposición a la radiación, tal como dentro de 3 días después de la exposición a la radiación, por ejemplo, dentro de 2 días después de la exposición a la radiación, tal como dentro de 1 día (24 horas) después de la exposición a la radiación. Dependiendo del pronóstico del paciente, la variante del G-CSF multi-PEGilado puede administrarse dos o más veces durante el curso de un régimen de tratamiento. Por ejemplo, la variante del G-CSF multi-PEGilado puede administrarse semanalmente, por ejemplo, por dos semanas, tres semanas o cuatro semanas. Debido a la biodísponibilidad superior de la variante del G-CSF multi-PEGilado en comparación con el hG-CSF no PEGilado (por ejemplo, Neupogen®) y el hG-CSF mono-PEGilado (por ejemplo, Neulasta®), la variante del G-CSF multi-PEGilado de preferencia puede administrarse durante períodos más largos tales como, por ejemplo, cada 10 días, cada dos semanas, cada 18 días o cada tres semanas, dependiendo del pronóstico del paciente.

Variante del G-CSF multi-PEGilado Pueden prepararse proteínas multi-PEGiladas de muchas maneras que son bien conocidas en la técnica. La unión covalente (es decir, conjugación) de porciones de polietilenglicol (PEG) a proteínas o polipéptídos ("PEGilación"), es una técnica bien conocida para mejorar las propiedades de dichas proteínas o polipéptídos, en particular proteínas farmacéuticas, por ejemplo, para mejorar la vida medía en la circulación y/o para proteger a epitopes potenciales y reducir de esta manera el potencial para una respuesta inmunógena no deseada. Numerosas tecnologías basadas en PEG activado están disponibles para proveer la unión de la porción de PEG a uno o más grupos en la proteína. Por ejemplo, se considera generalmente que el mPEG-propionato de succinimidilo (mPEG-SPA, disponible de Nektar Therapeutics) es selectivo para la unión de los grupos N-terminal y épsilon-amino de los residuos de lisina por medio de un enlace de amida. Como se indicó anteriormente, el producto G-CSF PEGilado disponible comercialmente Neulasta® contiene una porción de PEG de 20 kDa individual unida al extremo N-terminal de la molécula del G-CSF.

En algunas modalidades, las variantes del G-CSF multi-PEGilado descritas en la presente exhiben parámetros farmacocinéticos mejorados, tales como una vida media en suero incrementada y/o un área bajo la curva (AUC) incrementado, respecto al G-CSF mono-PEGilado Neulasta® (pegfilgrastim), cuando se pone a prueba en animales experimentales tales como ratas. De conformidad con la presente invención, se ha encontrado que una variante del G-CSF multi-PEGilado es ventajosa sobre el G-CSF mono-PEGilado Neulasta®, en un modelo animal de neutropenia inducida por radiación, proveyendo un tiempo de recuperación más corto y un periodo de neutropenia/leucopenia más corto a dosis equivalentes.

En una modalidad, la variante del G-CSF multi-PEGilado administrada de conformidad con la invención, puede ser PEGilada con un PEG activado específico de amina que se une de preferencia al grupo amino N-terminal y/o a los grupos épsilon-amino de los residuos de lisina, por medio de un enlace de amida. Ejemplos de derivados de PEG activados específicos de amina incluyen mPEG-propionato de succinimidilo (mPEG-SPA), mPEG-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) y mPEG-a-metilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB) (disponibles de Nektar Therapeutics; véase el catálogo de PEGilación avanzado 2005-2006 de Nektar, "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation"); PEG-SS (succinato de succinimidilo), PEG-SG (glutarato de succinimidilo), PEG-NPC (carbonato de p-nitrofenilo) e isocianato de PEG, disponibles de SunBio Corporation; y PEG-SCM, disponible de NOF Corporation. El polietilenglicol puede ser lineal o ramificado.

Métodos para obtener proteínas PEGiladas son bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, el catálogo de PEGilación avanzado 2005-2006 de Nektar, el cual se incorpora en la presente como referencia. Variantes del G-CSF PEGilado, y métodos para su preparación se describen, por ejemplo, en los documentos WO 01/51510, WO 03/006501 , US 6,646,110, US 6,555,660 y US 6,831 ,158, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia.

En una modalidad preferida, la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende una porción de PEG unida al grupo N-terminal y por lo menos una porción de PEG unida a un residuo de lisina.

En una modalidad, la variante del G-CSF multi-PEGilado administrada comprende por lo menos una sustitución en la secuencia del hG-CSF de SEQ ID NO: 1 , que introduce un residuo de lisina en una posición en donde se desea PEGilación. En particular, el residuo de lisina puede ser introducido por medio de una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de T1 K, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, P10K, Q11 K, S12K, F13K, L14K, L15K, E19K, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, A29K, A30K, E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43K, P44K, E45K, E46K, V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61 K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71 K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, L99K, G100K, P101 K, T102K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K, A111K, D112K, F113K, T1 15K, T1 16K, W118K, Q119K, Q120K, M121 K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131 K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141 K, S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161 K, E162K, V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K y P174K (en donde la posición del residuo es respecto a SEQ ID NO: 1)· Ejemplos de sustituciones de aminoácido preferidas incluyen de esta manera una o más de Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K, S159K y H170K/Q/R, tales como dos, tres, cuatro o cinco de estas sustituciones, por ejemplo: Q70K+Q90K, Q70K+T105K, Q70K+Q120K, Q70K+T133K, Q70K+S159K, Q70K+H170K, Q90K+T105K, Q90K+Q120K, Q90K+T133K, Q90K+S159K, Q90K+H170K, T105K+Q120K, T105K+T133K, T105K+S159K, T105K+H170K, Q120K+T133K, Q120K+S159K, Q120K+H170K, T133K+S159K, T133K+H170K, S159K+H170K, Q70K+Q90K+T 05K, Q70K+Q90K+Q120K, Q70K+Q90K+T133K, Q70K+Q90K+S159K, Q70K+Q90K+H170K, Q70K+T105K+Q120K, Q70K+T105K+T133K, Q70K+T105K+S159K, Q70K+T105K+H170K, Q70K+Q120K+T133K, Q70K+Q120K+S159K, Q70K+Q120K+H170K, Q70K+T133K+S159K, Q70K+T133K+H170K, Q70K+S159K+H170K, Q90K+T105K+Q120K, Q90K+T105K+T133K, Q90K+T105K+S159K, Q90K+T105K+H170K, Q90K+Q120K+T133K, Q90K+Q120K+S159K, Q90K+Q120K+H170K, Q90K+T133K+S159K, Q90K+T133K+H170K, Q90+S159K+H170K, T105K+Q120K+T133K, T105K+Q120K+S159K, T105K+Q120K+H170K, T105K+T133K+S159K, T105?+?133?+?170?, ?105K+S159?+? 170?, Q120K+T133K+S159K, Q120K+T133K+H170K, Q120K+S159K+H170K, T133K+S159K+H170K, Q70K+Q90K+T105K+Q120K, Q70K+Q90K+T105?+?133?, Q70K+Q90K+T105K+S159K, Q70K+Q90K+T105K+H170K, Q70K+Q90K+Q 120?+?133?, Q70K+Q90K+Q120K+S159K, Q70K+Q90K+Q120K+H170K, Q70K+Q90K+T133K+S159K, Q70K+Q90K+T133K+H170K, Q70K+Q90K+S159K+H170K, Q70K+T105K+Q120?+?133?, Q70K+T105K+Q120K+S159K, Q70K+T105K+Q 120?+? 170?, Q70K+T105?+?133K+S159?, Q70K+T105K+T133K+H170K, Q70K+T105K+S159K+H170K, Q70K+Q120K+T133K+S159K, Q70K+Q120K+T133K+H170K. Q70K+T133K+S159?+? 170?, Q90K+T105K+Q120?+?133?, Q90K+T105K+Q120K+S159K, Q90K+T105K+Q120K+H170K, Q90K+T105+?133K+S159?, Q90K+T105+T133K+H170K, Q90K+T105+S159K+H170K, Q90K+Q120K+T133K+S159K, Q90K+Q120K+T133K+H170K, Q90K+Q120K+S159K+H170K, Q90K+T133K+S159K+H170K, T105K+Q120K+T133K+S159K, T105K+Q120K+T133K+H170K, T105K+Q120K+S159K+H170K, T105K+T133K+S159K+H170K o Q120K+T133K+S159K+H170K. En cualquiera de las variantes enlistadas anteriormente, la sustitución H170K puede ser más bien H170Q o H170R. Sustituciones particularmente preferidas que introducen una lisina incluyen una de T105K y S159K, o ambas.

En otra modalidad, el polipéptido del G-CSF puede ser alterado para producir una variante del G-CSF en la cual uno o más de los residuos de lisina nativos en las posiciones 16, 23, 34 y 40 son removidos para evitar la PEGilación en estas posiciones. Por ejemplo, uno o más de estos residuos de lisina pueden ser removidos por medio de sustitución, de preferencia con un residuo de arginina o glutamina, más preferiblemente con un residuo de arginina. De preferencia, uno o más de los residuos de lisina en las posiciones 16, 34 y 40 son removidos por medio de sustitución, más preferiblemente dos o tres de estos residuos de lisina son removidos, y muy preferiblemente tres de las lisinas en esta posición son removidas por sustitución. De esta manera, en una modalidad preferida, la variante del G-CSF comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 , con por lo menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de K16R, K16Q, K34R, K34Q, K40R y K40Q; es decir, por lo menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de K16R/Q, K34R/Q y K40R/Q. En una modalidad particularmente preferida, la variante comprende las sustituciones K16R/Q + K34R/Q + K40R/Q tales como, por ejemplo, K16R+K34R+K40R o K16Q+K34R+K40R o K16R+K34Q+K40R o K16R+K34R+K40Q o K16Q+K34Q+K40R o K16R+K34Q+K40Q o K16Q+K34Q+K40Q.

En otra modalidad, la variante del G-CSF comprende por lo menos una sustitución que introduce un residuo de lisina junto con por lo menos una sustitución que remueve un residuo de arginina, como se explicó anteriormente.

En otra modalidad, la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende una sustitución de uno o más de los residuos de lisina en las posiciones 16, 34 y 40, tal como con un residuo de arginina o un residuo de glutamina, por ejemplo, un residuo de arginina, y una o más sustituciones seleccionadas de Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K y S159K, y es conjugada con 2 a 6, tal como 2 a 4, porciones de polietilenglicol, cada una con un peso molecular de aproximadamente 1000 a 10,000 Da.

En otra modalidad, la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende una o más sustituciones seleccionadas de K16 , K34R y K40R, y una o más sustituciones seleccionadas de Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K y S159K, y es conjugada con 2 a 6, tal como 2 a 4, porciones de polietilenglicol, cada una con un peso molecular de aproximadamente 1000 a 10,000 Da.

En otra modalidad, la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende una sustitución de uno o más de los residuos de lisina en las posiciones 16, 34 y 40, tal como con un residuo de arginina o un residuo de glutamina, por ejemplo, un residuo de arginina, y por lo menos una sustitución seleccionada de T105K y S159K, y es conjugada con 2 a 6, tal como 2 a 4, porciones de polietilenglicol, cada una con un peso molecular de aproximadamente 1000 a 10,000 Da.

En otra modalidad, la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende una o más sustituciones seleccionadas de K16R, K34R y K40R, y por lo menos una sustitución seleccionada de T105K y S159K, y es conjugada con 2 a 6, tal como 2 a 4, porciones de polietilenglicol, cada una con un peso molecular de aproximadamente 1000 a 10,000 Da.

En una modalidad particular, la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende las sustituciones K16R, K34R, K40R, T105K y S159K, y es conjugada con 2 a 6, tal como 2 a 4, porciones de polietilenglicol, con un peso molecular de aproximadamente 1000 a 10,000 Da.

En una modalidad particular, la variante del G-CSF multi- PEGilado puede tener 2 a 6, típicamente 2 a 5, tal como 2 a 4, porciones de polietilenglicol con un peso molecular de aproximadamente 5000 a 6000 Da unidas, por ejemplo, mPEG con un peso molecular de aproximadamente 5 kDa. De preferencia, la variante del G-CSF multi-PEGilado tiene 2 a 4 porciones de polietilenglicol con un peso molecular de aproximadamente 5000 a 6000 Da unidas, por ejemplo, mPEG de 5 kDa. Una variante del G-CSF multi-PEGilado particularmente preferida que es adecuada para su uso en el método de la invención, comprende las sustituciones K16R, K34R, K40R, T105K y S159K y contiene 2 a 4 porciones de PEG, cada una con un peso molecular de aproximadamente 5 kDa, tales como 3 de dichas porciones de PEG.

En otra modalidad, la variante del G-CSF multi-PEGilado puede producirse en tanto tenga sólo un número individual de porciones de PEG unidas, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5 porciones de PEG por conjugado, o que tenga una mezcla deseada de conjugados con diferentes números de porciones de PEG unidas, por ejemplo, una mezcla de conjugados que tengan 2 a 5, 2 a 4, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 6, 4 a 5 o 5 a 6 porciones de PEG unidas. Como se indicó anteriormente, un ejemplo de una mezcla de conjugados preferida, es una que tenga 2 a 4 porciones de PEG de aproximadamente 5 kDa, por ejemplo, un conjugado que tenga principalmente 3 porciones de PEG unidas por conjugado, pero en donde una pequeña proporción de los conjugados tenga 2 ó 4 porciones de PEG unidas.

Se entenderá que un conjugado que tiene un número específico de porciones de PEG unidas, o una mezcla de conjugados que tenga una escala definida de números de porciones de PEG unidas, puede obtenerse eligiendo condiciones de PEGilación adecuadas y opcionalmente usando purificación subsiguiente para separar los conjugados que tengan el número deseado de porciones de PEG. Ejemplos de métodos para la separación de los conjugados del G-CSF con diferentes números de porciones de PEG unidas, así como métodos para determinar el número de porciones de PEG unidas se describen, por ejemplo, en los documentos WO 01/51510 y WO 03/006501 , los cuales se incorporan en la presente como referencia. Para los propósitos de la presente invención, puede considerarse que un conjugado tiene un número dado de porciones de PEG unidas, si la separación en un gel de SDS-PAGE muestra ninguna banda o sólo bandas insignificantes diferentes de las bandas que corresponden a los números dados de porciones de PEG. Por ejemplo, se considera que una muestra de un conjugado tiene 3 grupos PEG unidos, si un gel de SDS-PAGE sobre el cual la muestra se ha hecho correr muestra una banda principal que corresponde a tres grupos PEG, respectivamente, y sólo bandas insignificantes o, de preferencia, ninguna banda, que corresponden a 2 a 4 grupos PEG.

En algunos casos, derivados de PEG activados específicos de amina tales como mPEG-SPA, pueden no unirse exclusivamente a los grupos N-terminal y épsilon-amino de los residuos de lisina por medio de un enlace de amida, pero pueden unirse también al grupo hidroxi de un residuo de serina, tirosina o treonina por medio de un enlace de éster. Como resultado, las proteínas PEGiladas pueden no tener un grado de uniformidad suficiente, y pueden contener muchos diferentes isómeros de PEG diferentes de los que se pretendía tener. Dichas porciones de PEG unidas por medio de un enlace de éster serán típicamente lábiles, y pueden ser removidas por el método descrito en la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/686,726, incorporada en la presente como referencia, el cual implica someter el polipéptido PEGilado a un pH elevado por un período suficiente para remover las porciones de PEG lábiles unidas a un grupo hidroxi. Este método se describe también en los documentos USSN 11/420,546 (patente de E.U.A. No. 7,381 ,805) y WO 2006/128460, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia.

En una modalidad preferida, la variante del G-CSF multi-PEGilado es una mezcla de especies de isómeros de PEG posicionales.

Como se usa en la presente, el término "isómero de PEG posicional" de una proteína, se refiere a diferentes formas PEGiladas de la proteína, en donde grupos PEG se localizan en diferentes posiciones de aminoácido de la proteína. Una variante del G-CSF multi-PEGilado preferida usada en la práctica de la presente invención, es una mezcla de isómeros de lisina/PEG N-terminal. El término "isómero de lisina/PEG N-terminal" de una proteína, significa que los grupos PEG están unidos al grupo amino-terminal de la proteina y/o a los grupos épsilon-amino de los residuos de lisina en la proteína. Por ejemplo, la frase "isómeros de lisina/PEG posicional N-terminal que tiene 3 porciones de PEG unidas", como se aplica al G-CSF, significa una mezcla de isómeros de PEG posicionales del G-CSF en la cual tres grupos PEG están unidos a los grupos épsilon-amino de los residuos de lisina y/o al grupo N-terminal de la proteína. Típicamente, un "isómero de lisina/PEG posicional N-terminal que tiene 3 porciones de PEG unidas", tendrá dos porciones de PEG unidas a los residuos de lisina y una porción de PEG unida al grupo N-terminal. El análisis de los isómeros de PEG posicionales puede realizarse usando CLAR de intercambio catiónico como se describe en el documento WO 2006/128460, el cual se incorpora en la presente como referencia.

Típicamente, la mezcla de especies de isómeros de PEG posicionales, es una mezcla sustancialmente purificada de isómeros de lisina/PEG posicionales N-terminales. Una "mezcla sustancialmente purificada de isómeros de lisina/PEG posicionales N-terminales" de un polipéptido, se refiere a una mezcla de isómeros de lisina/PEG posicionales N-terminales que ha sido sometida a un procedimiento cromatográfico u otro procedimiento de purificación, para remover impurezas tales como isómeros no de lisina/PEG posicionales N-terminales. La "mezcla sustancialmente purificada de isómeros de lisina/PEG posicionales N-terminales" estará libre, por ejemplo, de la mayoría de las porciones de PEG lábiles unidas a un grupo hidroxilo que de otra manera estarían presentes en ausencia de un paso de des-PEGilación parcial y purificación subsiguiente como se describe en la presente, y típicamente contendrá menos de aproximadamente 20% de polipéptidos que contienen una porción de PEG lábil unida a un grupo hidroxilo, más típicamente menos de aproximadamente 15%. De preferencia, habrá menos de aproximadamente 10% de polipéptidos que contengan una porción de PEG lábil unida a un grupo hidroxilo, por ejemplo, menos de aproximadamente 5%.

De preferencia, la mezcla de especies de isómeros de PEG posicionales, es una mezcla homogénea de isómeros de PEG posicionales de una variante del G-CSF. El término "mezcla homogénea de isómeros de PEG posicionales de una variante del polipéptido (G-CSF)", significa que la porción de polipéptido de los diferentes isómeros de PEG posicionales, es la misma. Esto significa que todos los diferentes isómeros de PEG posicionales de la mezcla se basan en una secuencia variante individual del polipéptido. Por ejemplo, una mezcla homogénea de isómeros de PEG posicionales de una variante de polipéptido del G-CSF PEGilado, significa que diferentes isómeros de PEG posicionales de la mezcla se basan en una variante de polipéptido del G-CSF individual.

Típicamente, la mezcla homogénea de isómeros de PEG posicionales de una variante del G-CSF, exhibe uniformidad sustancial. Como se usa en la presente, el término "uniformidad" se refiere a la homogeneidad de un polipéptido PEGilado en términos del número de diferentes isómeros posicionales, es decir, diferentes isómeros de polipéptido que contienen diferentes números de porciones de PEG unidas en diferentes posiciones, asi como la distribución relativa de estos isómeros posicionales. Para polipéptidos farmacéuticos destinados para uso terapéutico en humanos o animales, es generalmente deseable que el número de diferentes isómeros de PEG posicionales y diferentes especies PEGiladas, sea reducido al mínimo.

En una modalidad (referida como "Maxy-G21" en los ejemplos más adelante), la variante del G-CSF multi-PEGilado es una mezcla de isómeros de PEG posicionales, en donde la variante del G-CSF componente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , con las sustituciones K16R, K34R, K40R, T105K y S159K (respecto a SEQ ID NO: 1), comprendiendo isómeros posicionales que tienen cada uno 4 ó 5 porciones de PEG unidas, incluyendo porciones de PEG lábiles en una de Ser66 o Tyr165, o ambas, así como porciones de PEG estables en el grupo N-terminal y en una o dos de las posiciones K23, K105 y K159. La variante del G-CSF multi-PEGilado referida como Maxy-G21 comprende en la presente porciones de PEG que son mPEG-SPA (Nektar), teniendo cada una un peso molecular promedio de 5000 Da.

El término "des-PEGilación parcial", se refiere en la presente a la remoción de porciones de PEG lábiles unidas a un grupo hidroxilo, mientras que las porciones de PEG que están unidas más establemente al grupo N-terminal o al grupo amino de un residuo de lisina, permanecen intactas. El método para llevar a cabo este procedimiento se describe en los documentos USSN 60/686,726, USSN 11/420,546 (patente de E.U.A. No. 7,381 ,805) y WO 2006/128460, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia.

En otra modalidad (referida como "Maxy-G34" en los ejemplos más adelante), la variante del G-CSF multi-PEGilado es una mezcla de isómeros de PEG posicionales, en donde la variante del G-CSF componente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con las sustituciones K16R, K34R, K40R, T105K y S159K (respecto a SEQ ID NO: 1), y en donde por lo menos 80% de la mezcla contiene 2 especies de isómeros de PEG posicionales, teniendo cada una 3 porciones de PEG unidas, en donde uno de los isómeros tiene grupos PEG unidos en el grupo N-terminal, Lys 23 y Lys 159, y el otro isómero tiene grupos PEG unidos en el grupo N-terminal, Lys 105 y Lys 159. La variante del G-CSF multi-PEGilado referido como Maxy-G34 comprende en la presente porciones de PEG que son mPEG-SPA (Nektar), teniendo cada una un peso molecular promedio de 5000 Da.

Para todas las modalidades descritas anteriormente, la variante del G-CSF y la variante del G-CSF multi-PEGilado pueden incluir opcionalmente un residuo de metionina añadido al grupo N-terminal.

En otras modalidades, la variante del G-CSF multi-PEGilado que se administrará de conformidad con la invención puede prepararse como se describe en cualquiera de los siguientes documentos, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia: · WO 89/05824 (variantes del G-CSF agotadas en lisina) • US 5,824,778 (G-CSF que tiene por lo menos una molécula de PEG unida covalentemente a por lo menos un aminoácido del polipéptido a través de un grupo carboxilo de dicho aminoácido) • WO 99/03887 (variantes de cisteina PEGiladas del G-CSF) · WO 2005/055946 (conjugados del G-CSF "gluco-PEGilado", con porciones de PEG enlazadas por medio de un grupo de enlace de glucosilo intacto) • WO 2005/070138 (polipéptidos del G-CSF que comprenden una secuencia de péptidos mutante que codifica para un sitio de glucosilación O-enlazado que no existe en el polipéptido de tipo silvestre correspondiente) • US 2005/01 4037 A1 (G-CSF con por lo menos una porción polimérica unida en por lo menos una de muchas posiciones de aminoácido especificadas diferente).

En otra modalidad, la variante del G-CSF multi-PEGilado que se administrará de conformidad con la invención exhibe una propiedad farmacocinética mejorada, tal como una vida media en suero incrementada y/o un AUC incrementado, en comparación con el hG-CSF mono-PEGilado, Neulasta®. De preferencia, la variante del G-CSF multi-PEGilado exhibe una vida media en suero o un AUC incrementado por cuando menos aproximadamente 1.2x de la vida media en suero o AUC de Neulasta®, por ejemplo, incrementado por cuando menos aproximadamente 1.4x, tal como por cuando menos aproximadamente 1.5x, por ejemplo, por cuando menos aproximadamente 1.6 x, tal como por cuando menos aproximadamente 1.8x, por ejemplo, por cuando menos aproximadamente 2.0x, 2.5x, 3x, 5x o 10x del hG-CSF mono-PEGilado, Neulasta®.

Exposición a la radiación y tratamiento A. Efectos de la exposición a la radiación sobre el sistema hematopoyético Los escenarios de accidentes de radiación han provisto varias características definitorias útiles en el diseño de modelos de preparación de emergencia y estrategias de tratamiento para individuos severamente irradiados. La posición del cuerpo, la protección fortuita y la distancia respecto a la fuente resultarán en exposiciones unilaterales, no uniformes y heterogéneas para cualquier grupo de individuos. Además, el intervalo de tiempo entre la exposición y el inicio del tratamiento puede ser menos que óptimo. Estos aspectos de la exposición subrayan la dificultad para determinar una dosis absorbida precisa; la base para establecer la selección y el tratamiento y además, el efecto del tratamiento sobre la biodosimetría, se desconoce. Respecto a la exposición a la radiación, es razonable asumir que las características anteriores pronostican una distribución de la dosis altamente variable, con posible escatimación de células progenitoras y células madre hematopoyéticas derivadas de la médula ósea ('HSC y HPC derivadas de la BM") y tejido tímico, aumentando de esta manera el potencial para la regeneración hematopoyética y linfoide en respuesta a la administración oportuna de los factores de crecimiento hematopoyéticos ("HGF").

El sistema hematopoyético es el sistema más radiosensible y el sistema de órganos limitativo de la dosis, después de irradiación total aguda del cuerpo (TBI). HSC y HPC son destruidas en una manera exponencial dependiente de la dosis con capacidad de reparación mínima, dictando que incrementos modestos en la dosis de exposición resulten en muerte desproporcionadamente incrementada de HSC y HPC. Las células maduras más diferenciadas son más radiorresistentes que las células madre y células progenitoras altamente proliferativas. Se ha propuesto que un subgrupo de HSC es relativamente radiorresistente La naturaleza exponencial dependiente de la dosis de muerte de las células para HSC y HPC de acuerdo con la realidad de la exposición no uniforme a la radiación y la distribución variable de la dosis consecuente a través de la médula ósea activa, sugiere que una fracción pequeña o modesta de HSC y HPC, así como células de los nichos de BM (osteoblastos), vascular y tímico (células epiteliales) respectivos, sobrevivirán a dosis de radiación potencialmente letales en el síndrome hematopoyético, y estará sujeta a los procedimientos terapéuticos como se esboza en la presente.

La exposición aguda que resulta de una explosión o accidente nuclear probablemente será unilateral, no uniforme y con cierto grado de protección parcial del cuerpo. En consecuencia, una fracción de HSC y HPC localizada dentro de los nichos vascular y de la médula puede no estar expuesta, o expuesta sólo a una dosis de radiación significativamente menor. Existe una base de datos consistente en modelos animales que demuestra el efecto de escatimación de la radiación no uniforme o parcial del cuerpo. La exposición unilateral puede resultar en un incremento aproximado de 20% en los valores de LD50/30 (la dosis promedio de radiación que resulta en la muerte de 50% de los sujetos dentro de 30 días) para exposición unilateral contra exposición bilateral. La orientación respecto a la fuente de radiación debe evaluarse también en términos biológicos. La exposición dorsal aumenta al máximo el daño a la médula ósea, debido al gran por ciento de médula ósea activa en los aspectos dorsal y espinal de las costillas y la pelvis de los adultos jóvenes. A la inversa, la exposición ventral reduce al mínimo el daño a la médula ósea debido a la protección ventral del volumen de la médula ósea activa. No debe verse que la exposición no uniforme es tan efectiva como la protección parcial de la médula ósea del cuerpo. Esto es significativo debido a que la relación exponencial entre la dosis de radiación y la supervivencia de HSC/HPC, por ejemplo, reduciendo por la mitad la dosis total del cuerpo, no incrementa la supervivencia de HSC hasta 50%, sino sólo hasta 10%.

B. Dosis de radiación La base de datos para el síndrome hematopoyético agudo inducido por radiación en primates no humanos ("NHP"), se derivó de experimentos que implican irradiación total del cuerpo (TBI) con radiación X de 250 kilovoltios pico (kVp) o radiación X de Co-60 gamma y 2 megavoltios (MV). La base de datos para la letalidad inducida por radiación de Co-60 gamma, es un experimento no publicado individual (n = 90 NHP) realizado en 1967. Dalrymple et al. (Radiation Res. 25: 377-400, 1965) usaron radiación X de 2 MV para establecer la relación de la respuesta a la dosis para la letalidad del síndrome hematopoyético y TBI. Estos dos estudios sirven como base para establecer la relación de la respuesta a la dosis para la letalidad del síndrome hematopoyético inducido por radiación en NHPs expuestos a radiación gamma o rayos X de alta energía (2 MV) que no han recibido cuidado de soporte. Esta base de datos ha servido como el grupo control del cual pudo elegirse una dosis de radiación individual y letalidad asociada con un grado de certeza. Los valores de LD50/30 para NHPs obtenidos de estos primeros estudios fueron de 6.40 Gy [6.06, 7.75] y 6.65 Gy [6.00, 10.17] (intervalo de confianza (Cl) de 95% en corchetes [ ]), respectivamente. Para comparación, el valor de LD50/30 respectivo para NHP expuestos a TBI con rayos X de 250 kVp es de aproximadamente 4.80 Gy, demostrando el efecto biológico relativo de la irradiación X con rayos X de menor energía, que los rayos X de 2 MV usados en el experimento de Dalrymple.

Los datos respecto a los efectos de la irradiación parcial del cuerpo significativa o del cuerpo entero en humanos, se han recabado necesariamente de incidentes nucleares del pasado, tales como la explosión de Hiroshima y el accidente de Chernobyl. Dichos datos se mantienen en un registro en el Radiation Emergency Assistance Centerfi"raining Site (REAC/TS) en Oak Ridge, Tennessee. Con basen estos datos, puesto que el conteo absoluto de linfocitos (ALC) disminuye poco después de la exposición a la radiación penetrante, se ha desarrollado un método para estimar la dosis de radiación en un individuo determinando la velocidad de disminución en el conteo de linfocitos durante un período de 48 horas (Goans R. E., et al. Health Phys. 81 : 446-449, 2001 ). Dichas estimaciones requieren dos o más determinaciones del ALC espaciadas a intervalos de 4 a 6 horas. En casos en donde dichas mediciones son teóricas, tal como en situaciones de desastre en masa, otra estimación de la dosis de radiación se basa en la duración de tiempo después de la exposición a la radiación antes de que el sujeto vomite. Berger, M. E. et al. (Occupational Medicine 56: 162-172, 2006) proveen una tabla que muestra que la mayoría de los individuos (70-90%) expuestos a la irradiación aguda del cuerpo entero de por lo menos 2 Gy vomitarán dentro de 1 a 2 horas después de la exposición, mientras que esencialmente 100% de los individuos expuestos a por lo menos 4 Gy de radiación vomitarán dentro de una hora, y los expuestos a por lo menos 6 Gy de radiación vomitarán dentro de 30 minutos. La severidad y el tiempo al inicio de otros síntomas físicos asociados con la exposición aguda a la radiación del cuerpo entero (tales como temperatura del cuerpo, cefalea, diarrea), se tabulan también en Berger ef al. (citado anteriormente).

C. Cuidado de soporte El uso de antibióticos, fluidos, productos sanguíneos, analgésicos y nutrición, es el "estándar de cuidado" para los pacientes expuestos a dosis de radiación letal y mielosupresora. El cuidado de soporte solo, tal como antibióticos, sangre entera o transfusiones de plaquetas, fluidos y nutrición, puede aumentar significativamente la supervivencia de los sujetos irradiados. La relación entre el cuidado de soporte y la supervivencia al síndrome hematopoyético en animales expuestos a dosis letales de radiación se ha demostrado en caninos, pero no en primates no humanos (NHPs). Un estudio individual por Byron ef al demostró que la capacidad de un régimen con antibióticos solo incrementa significativamente la supervivencia hasta 72% en macacos rhesus expuestos a una dosis letal de 100%. Además, los laboratorios MacVittie/Farese en el Armed Forces Radiobiology Research Institute (AFRRI) y la Universidad de Maryland en Baltimore (UMB), establecieron el efecto del cuidado de soporte a una dosis letal individual de TBI (LD70/30) estimada a partir de la base de datos indicada más adelante. Estos datos muestran que la irradiación de NHP con TBI a partir de radiación de Co-60 gamma a una dosis equivalente a una LD70/30 (es decir, una dosis que resulta en la muerte de 70% de los sujetos en 30 días en ausencia del cuidado de soporte), disminuye el número de muertes hasta aproximadamente 14% de los sujetos durante 30 días (es decir, LD14/30) cuando se administra el cuidado de soporte. Se realizaron estudios similares (laboratorios MacVittie/Farese-UMB) con macacos rhesus expuestos a TBI con rayos X de 250 kVp. La letalidad estimada de 70% asociada con la TBI de 6.00 Gy fue reducida hasta 9% con la adición de cuidado de soporte solo.

Los resultados obtenidos en los estudios de respuesta a la dosis de letalidad del síndrome hematopoyético inducido por radiación en NHPs que no han recibido cuidado de soporte, como se describió anteriormente, se usaron para diseñar un estudio aleatorizado oculto reciente de dosis de radiación, que determina la relación de la respuesta a la dosis letal en NHPs que reciben cuidado de soporte (ejemplo 1). El valor resultante para la LD50/60 fue de 7.52 Gy respecto a una LD50/60 aproximada de 6.50 Gy para los grupos control históricos a los que no se les brindó el cuidado de soporte. Esto sirvió para confirmar el efecto de mejora de la supervivencia del cuidado de soporte, asi como para proveer la relación de la dosis para determinar las dosis de LD30/60, LD50/60 y LD70/60 respectivas para NHP expuestos a dosis letales de radiación a los que se les administró el cuidado de soporte, de otra manera conocido como manejo médico dentro del síndrome hematopoyético.

Este efecto de mejora de la supervivencia depende de dos condiciones. Primero, las HSC y HPC sobrevivientes deben ser capaces -de mostrar regeneración espontánea y segundo, la recuperación hematopoyética debe resultar en la producción de neutrófilos y/o plaquetas funcionales dentro de un período crítico clínicamente manejable.

D. Función de los factores de crecimiento hematopoyéticos en el tratamiento del ARS Existe una base de datos sustancial y consistente en modelos animales pequeños y grandes de exposición a la radiación letal y/o mielosupresora, que demuestra que los factores de crecimiento hematopoyéticos (HGFs), cuando se administran en su plan óptimo y en combinación con el cuidado de soporte, aumentan significativamente la supervivencia y recuperación de neutrófilos y plaquetas más allá de las observadas para el cuidado de soporte solo. El laboratorio MacVittie estableció previamente la utilidad del cuidado de soporte solo, asi como en conjunto con la administración del G-CSF en perros expuestos a TBI de Co-60 a niveles que inducen el síndrome hematopoyético completo. La LD50/30 sin cuidado de soporte fue de 2.60 Gy, que se incrementó hasta 3.38 Gy con el cuidado de soporte, y se incrementó adicionalmente hasta 4.88 Gy con la adición del G-CSF bajo su plan de administración óptimo. Este estudio usó modelos de irradiación estándar de laboratorio que implican TBI uniforme a grados de dosis moderados.

El plan convencional para la administración de HGFs es iniciar el tratamiento tempranamente, dentro de 24 horas después de la irradiación, y continuar diariamente la administración para garantizar la regeneración de las células progenitoras hematopoyéticas y la producción de neutrófilos y/o plaquetas. Sin embargo, un plan más real con respecto al tratamiento después de una explosión o accidente nuclear, es la administración retardada por 48 a 72 horas post irradiación. Se han realizado muchos estudios preclinicos que evalúan el efecto de la administración retardada de HGFs. La mayoría de estos estudios muestran que la magnitud de la respuesta hematopoyética fue significativamente disminuida por un intervalo de tiempo incrementado entre la administración de los HGFs y la irradiación. Junto con el G-CSF y el G-CSF PEGilado, otros HGFs usados a veces en el tratamiento del ARS incluyen: factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF), factor de células madre (SCF), ligando de FLT3 (FL), interleucina-3 (IL-3), factor de desarrollo y crecimiento de megacariocitos (MGDF), trombopoyetina (TPO), agonista del receptor de TPO y eritropoyetina (EPO) (Drouet, M. et al., Haematologica 93(3): 465-466, 2008; Herodin F. et al., Experimental Hematology 35: 1172-1181 , 2007). De estos, como agentes individuales, sólo el G-CSF y GM-CSF están disponibles actualmente para tratar a personal potencialmente letalmente irradiado, si se usan "sin ver la indicación". Estos HGFs probablemente serían los primeros propuestos para la FDA para aprobación bajo la "Norma para Animales" (AR) de la FDA. La consideración de "cocteles" de HGFs debe incluir el análisis de las toxicidades respectivas y el tiempo de administración post-exposición.

E. Variantes del G-CSF multi-PEGilado en el tratamiento de neutropenia inducida por radiación en sistemas de modelo animal La citopenia inducida por radiación en el mono rhesus, ha demostrado ser un sistema de modelo efectivo para estudiar la eficacia de las formulaciones farmacéuticas en el tratamiento de trombocitopenia y neutropenia. En el estudio descrito en el ejemplo 2, una sola inyección de un ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado de conformidad con la invención (identificado en la presente como "Maxy-G21") indujo un incremento significativo en células nucleadas totales de sangre periférica, neutrófilos y células mononucleares, y una movilización significativa de células formadoras de colonias en la sangre periférica. En comparación con animales control expuestos a TBI de 6.0 Gy, que exhibieron un período de neutropenia de 14.8 a 15.2 días, los animales a los que se les administró Maxy-G21 a una dosis de 300 pg/kg a 24 horas después de TBI, exhibieron un periodo significativamente reducido de neutropenia de 7.3 ± 1.1 días. La duración de la neutropenia se determinó como el número de días que el animal tuvo un ANC observado o un ANC atribuido menor de 500/pL. El nadir del ANC, definido como el primer ANC observado o atribuido más bajo que ocurrió por lo menos 2 días después de la primera dosis del compuesto de prueba, fue también notablemente mejorado de 140 ± 45/pL hasta 49 ± 22/pL en los animales control. El tiempo a la recuperación determinado como el número de días del día de estudio 1 hasta los 2 primeros días consecutivos con ANC observado o atribuido de 500/µ?_ o mayor, fue asimismo mejorado de un valor control de 21.2 ± 0.4 días a 15.5 ± 0.3 días en el grupo tratado con Maxy-G21.

En comparación con un grupo de Neulasta® combinado, que comprende el grupo de Neulasta® intra-estudio y un grupo histórico (n = 9), Maxy-G21 redujo significativamente la duración de la neutropenia (p = 0.02), así como el tiempo a la recuperación. El requerimiento de antibióticos fue también significativamente diferente del grupo de Neulasta®, ya que el grupo tratado con Maxy-G21 requirió sólo antibióticos por 9.8 días, mientras que el grupo combinado tratado con Neulasta® requirió 14.7 días de soporte con antibióticos.

El estudio descrito en el ejemplo 2 demostró que un ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado de conformidad con la invención (identificado en la presente como Maxy-G21) administrado s.c. a monos rhesus, redujo significativamente el período de neutropenia en NHP irradiados. Se encontró además que el efecto excede el de Neulasta® cuando se compara con un grupo que comprende el grupo de Neulasta® intra-estudio y un grupo de Neulasta® histórico (N = 9). Los datos farmacocinéticos proveen evidencia de que la variante del G-CSF multi-PEGilado exhibe una vida media en plasma notablemente extendida en comparación con Neulasta® en macacos irradiados (figura 4). Los datos farmacocinéticos apoyan de esta manera la hipótesis de trabajo de que una variante del G-CSF multi-PEGilado tiene una mayor biodisponibilidad que el hG-CSF mono-PEGilado, Neulasta®, tanto en NHP que sufren un estado de mielosupresión severa inducida por radiación, asi como en NHP sanos (no irradiados).

En general, se encontró que la variante del G-CSF multi- PEGilado reduce notablemente el período de neutropenia inducida por radiación en primates no humanos. Se encontró además que la reducción del período de neutropenia excede el de Neulasta®, cuando se compara con un grupo de Neulasta® histórico. El grado y la duración de la neutropenia inducida por radiación fueron significativamente disminuidos por la administración de una variante del G-CSF multi-PEGilado de conformidad con los métodos de la presente invención.

En el estudio descrito en el ejemplo 3, se expuso a ratones a dosis de radiación suficientes para causar la muerte de 20% de los animales control no tratados (7.76 Gy; LD20730) o 45% de los animales control no tratados (7.96 Gy; LD45/30). En el día uno después de TBI, se les administró a los animales un ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado de conformidad con la invención (identificado en la presente como "Maxy-G34") a una dosificación de 20 pg/20 g en el ratón, o diluyente. La dosificación se repitió en el día 7 y, en algunos animales, en el día 14. Los ratones a los que se les administró la variante del G-CSF multi-PEGilado después de irradiación al nivel de LD20/30 y el nivel de LD45/30, exhibieron un porcentaje de supervivencia significativamente mayor después de 30 días, en comparación con los animales no tratados (figuras 5 y 6, respectivamente).

Los estudios presentados en los ejemplos 2 y 3 demuestran que las variantes del G-CSF multi-PEGilado de conformidad con la invención, son efectivas para reducir el grado y la duración de la neutropenia inducida por radiación, y para extender la supervivencia en dos sistemas de modelo animal. Las variantes del G-CSF multi-PEGilado pueden ser efectivas de esta manera en el tratamiento de neutropenia asociada con la exposición a la radiación que pone en riesgo la vida, como en el ARS en caso de una emergencia nuclear.

Administración de la variante del G-CSF multi-PEGilado A. Dosificaciones La dosificación de la variante del G-CSF multi-PEGilado administrada de conformidad con la invención, será generalmente un orden de magnitud similar que la dosificación aprobada actual para el hG-CSF mono-PEGilado (Neulasta®) en aplicaciones quimioterapéuticas, que es de 6 mg por paciente humano adulto (por ejemplo, 100 pg/kg para un paciente de 60 kg). Se contempla por lo tanto que una dosis apropiada de la variante del G-CSF multi-PEGilado está en la escala de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, tal como de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 20 mg, por ejemplo, de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 15 mg. Una dosis adecuada puede ser de esta manera, por ejemplo, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 12 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 20 mg o aproximadamente 30 mg. En forma alternativa, la dosificación puede basarse en el peso del paciente, de modo que se contempla que una dosis apropiada de la variante del G-CSF multi-PEGilado está en la escala de aproximadamente 20 pg/kg a aproximadamente 500 pg/kg, tal como aproximadamente 30 µg/kg a aproximadamente 400 µg kg, tal como aproximadamente 40 µg/kg a aproximadamente 300 pg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 50 pg/kg a aproximadamente 200 pg/kg. Una dosis adecuada puede ser de esta manera, por ejemplo, aproximadamente 20 pg/kg, aproximadamente 30 pg/kg, aproximadamente 40 pg/kg, aproximadamente 50 µg/kg, aproximadamente 60 g/kg, aproximadamente 75 pg/kg, aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 125 pg/kg, aproximadamente 150 g/kg, aproximadamente 175 pg/kg, aproximadamente 200 pg/kg, aproximadamente 250 pg/kg, aproximadamente 300 pg/kg, aproximadamente 400 pg/kg o aproximadamente 500 pg/kg. La variante del G-CSF multi-PEGilado se administra de preferencia tan pronto como sea posible después de la exposición a la radiación, por ejemplo, dentro de siete dias, dentro de cuatro dias, dentro de tres dias, dentro de dos dias (es decir, dentro de 48 horas) o más, de preferencia dentro de un día (es decir, dentro de 24 horas) después de la exposición a la radiación. Dependiendo de la naturaleza de la enfermedad y el pronóstico y la respuesta del paciente, una segunda y posiblemente tercera administración de la variante del G-CSF multi-PEGilado puede darse entre una a cuatro semanas (por ejemplo, aproximadamente 7 dias, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 dias, aproximadamente 18 dias, aproximadamente 21 días, aproximadamente 24 días, aproximadamente 28 días) después de la administración previa.

La dosificación precisa y la frecuencia de administración de la variante del G-CSF multi-PEGilado dependerán de muchos factores, tales como la actividad especifica y las propiedades farmacocinéticas de la variante del G-CSF multi-PEGilado, así como la naturaleza y la severidad de la condición que está siendo tratada (tal como el nivel y/o la duración de la exposición a la radiación, el área y la cantidad del cuerpo expuesto, el tipo de radiación, la severidad de los síntomas asociados con el ARS), entre otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Normalmente, la dosis debe ser capaz de prevenir o disminuir el grado y/o la duración de la neutropenia en el sujeto. Dicha dosis puede denominarse una cantidad "efectiva" o "terapéuticamente efectiva". Será evidente para los expertos en la técnica que una cantidad efectiva de la variante del G-CSF multi-PEGilado de la invención depende, entre otras cosas, de la severidad de la condición que está siendo tratada, la dosis, el plan de administración, si la variante del G-CSF multi-PEGilado se administra sola o en combinación con otros agentes terapéuticos, la vida media en suero y otras propiedades farmacocinéticas de la variante del G-CSF multi-PEGilado, así como la estatura, edad y salud general del paciente. La dosificación y frecuencia de administración puede ser indagada por el experto en la técnica, usando técnicas conocidas.

B. Composiciones farmacéuticas La variante del G-CSF multi-PEGilado administrada de conformidad con la presente invención, puede administrarse en una composición que incluya uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. La variante del G-CSF multi-PEGilado puede formularse en composiciones farmacéuticas en una manera conocida per se en la técnica, que resulta en una formulación farmacéutica que es suficientemente estable en almacenamiento y es adecuada para administración a humanos o animales. La composición farmacéutica puede formularse en una variedad de formas, tales como un líquido o gel, o puede liofilizarse, o puede estar en cualquier otra forma adecuada. La forma preferida dependerá de la indicación particular que está siendo tratada, y será evidente para los expertos en la técnica.

El término "farmacéuticamente aceptable" significa un vehículo o excipiente que a las dosificaciones y concentraciones usadas, no causa algún efecto adverso en los pacientes a quienes se administra. Dichos vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoctava edición, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, eds., Taylor y Francis (2000); y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a. edición, A. Kibbe, ed., Pharmaceutical Press (2000)).

C. Composiciones parenterales Un ejemplo de una composición farmacéutica es una solución diseñada para administración parenteral, por ejemplo, por la vía subcutánea. Aunque en muchos casos las formulaciones de solución farmacéutica se proveen en forma líquida, adecuada para uso inmediato, dichas formulaciones parenterales pueden proveerse también en forma congelada o en forma liofilizada. En el primer caso, la composición debe ser descongelada antes de su uso. La última forma se usa con frecuencia para aumentar la estabilidad del compuesto activo contenido en la composición bajo una variedad más amplia de condiciones de almacenamiento, ya que es reconocido por los expertos en la técnica que las preparaciones liofilizadas son generalmente más estables que sus contrapartes liquidas. Dichas preparaciones liofilizadas son reconstituidas antes de su uso por la adición de uno o más diluyentes adecuados farmacéuticamente aceptables, tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.

En caso de formulaciones parenterales, se preparan para almacenamiento como formulaciones o soluciones acuosas liofilizadas mezclando, según sea adecuado, el polipéptido que tenga el grado de pureza deseado con uno o más vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables usados típicamente en la técnica (todos los cuales se denominan "excipientes"), por ejemplo, agentes reguladores de pH, agentes estabilizadores, conservadores, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y/u otros aditivos diversos.

Los agentes reguladores de pH ayudan a mantener el pH en la escala que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Están presentes típicamente a una concentración que varía de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Agentes reguladores de pH adecuados para su uso con la presente invención, incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sales de los mismos, tales como reguladores de pH de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), reguladores de pH de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succinico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), reguladores de pH de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), reguladores de pH de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fu má rico-fuma rato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), reguladores de pH de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), reguladores de pH de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), reguladores de pH de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y reguladores de pH de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Posibilidades adicionales son reguladores de pH de fosfato, reguladores de pH de histidiha, y sales de trimetilamina tales como Tris.

Se añaden conservadores para retardar el crecimiento microbiano, y se añaden típicamente en cantidades de aproximadamente 0.2%-1% (en p/v). Conservadores adecuados para su uso con la presente invención, incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, halogenuros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro de benzalconio), cloruro de hexametonio, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.

Se añaden isotonificadores para garantizar la isotonicidad de las composiciones liquidas, e incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, de preferencia alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihídricos pueden estar presentes en una cantidad entre 0.1 % y 25% en peso, típicamente 1 % a 5%, tomando en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes.

Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función de un agente de abultamiento a un aditivo que solubiliza al agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o adherencia a la pared del contenedor. Estabilizadores típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol, y similares, que incluyen ciclitoles tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir <10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero de bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos tales como xilosa, mañosa, fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa, y polisacáridos tales como dextrán. Los estabilizadores están presentes típicamente en la escala de 0.1 a 10,000 partes en peso, con base en el peso de la proteína activa.

Agentes tensoactivos no iónicos o detergentes (conocidos también como "agentes mojantes") pueden estar presentes para ayudar a solubilizar al agente terapéutico, así como para proteger al polipéptido terapéutico contra la agregación inducida por la agitación, lo cual permite también que la formulación sea expuesta a tensión de superficie de esfuerzo cortante sin que cause la desnaturalización del polipéptido. Agentes tensoactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), poloxámeros (184, 188 etc.), polioles Pluronic®, monoéteres de polioxietileno sorbitán (Tween®-20, Tween®-80, etc.).

Excipientes diversos adicionales incluyen agentes de abultamiento o llenadores (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y co-solventes.

El ingrediente activo puede ser atrapado también en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa, gelatina o microcápsulas de metacrilato de polimetilo, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en microemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente.

Las formulaciones parenterales que se usarán para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. La invención se describe además mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Respuesta a la dosis de radiación letal y el efecto del cuidado de soporte en un modelo de primate no humano de neutropenia inducida por radiación Lo siguiente describe un estudio piloto diseñado para definir la respuesta a la dosis en macacos rhesus expuestos a dosis crecientes de radiación ionizante total del cuerpo (TBI) y que reciben cuidado de soporte (denominado también "manejo médico"). Este estudio se diseñó para evaluar: 1. Las curvas de supervivencia a la dosis de radiación de soporte y la LD50/30 para macacos rhesus expuestos a dosis letales de TBI con fotones de 6 MV derivados de LINAC (energía promedio, 2 MV) más manejo médico, y 2. El efecto del manejo médico sobre la relación de respuesta a la dosis y la LD50/30 respectiva para TBI sola comparada con series de datos históricos Materiales y métodos Cuarenta y ocho (48) monos rhesus machos fueron expuestos a irradiación total del cuerpo (TBI) uniforme y bilateral, usando una fuente de fotones LINAC de 6 megavoltios (MV) (Varían, modelo #EX-21) (fotones de 2 MV en promedio) a un grado de dosis de 80 ± 2.5 cGy/min. Los animales en grupos de 2 a 8 por dosis de radiación fueron irradiados a seis dosis aleatorizadas de TBI: 7.20 Gy, 7.55 Gy, 7.85 Gy, 8.05 Gy, 8.40 Gy y 8.90 Gy. Se proveyó manejo médico que consistía de antibióticos, fluidos, transfusiones sanguíneas, soporte nutricional, antidiarreicos, antiulcerosos, antipiréticos y manejo del dolor. Se observó a los animales irradiados por 60 días post-TBI.

El parámetro primario clínicamente relevante, fue la mortalidad a los 60 días. Los puntos de extremo secundarios fueron parámetros clave relacionados con neutrófilos y plaquetas (PLT), que incluyeron: nadires respectivos de neutrófilos y plaquetas, duración de la neutropenia (ANC < 500/µ?) y trombocitopenia (PLT < 20,000/µ?), y tiempo a la recuperación a un ANC > 1 ,000/µ? y PLT > 20,000/µ?. Se registró también el día de y la duración del ANC <100/µ?. Otros parámetros incluyeron el número de días con fiebre (temperatura= 39.44°C), la incidencia de infección documentada, neutropenia febril y tiempo de supervivencia medio (MST) de los finados.

Se colectaron datos por 60 días en 48 macacos rhesus machos expuestos a TBI en 6 grupos de dosis de 8 animales cada uno, a 7.20, 7.55, 7.85, 8.05, 8.40 y 8.90 Gy. Se calcularon los índices de mortalidad para cada grupo de dosis.

Se realizaron el análisis descriptivo y la regresión logística usando SAS versión 9, y se realizó la estimación de LD usando SPLUS versión 6.2. Se realizó el análisis de regresión logística como bilateral con nivel alfa de 0.05 para efectos principales, y 0. 0 para efectos marginales. Se presentan la frecuencia y el por ciento para datos del conteo; se presentan la media, desviación estándar, mediana, mínimo y máximo, para los datos continuos. El análisis de regresión logística con la mortalidad a los 60 días como resultado, puso a prueba el efecto de la dosis, con cálculos realizados usando el logaritmo natural de la dosis.

Resultados A. Dosis de radiación y letalidad de la misma Cuarenta y ocho (48) macacos rhesus machos fueron irradiados en siete grupos (grupo 1 , n = 2; grupo 2, n = 6; grupos 3 a 7, n = 8) sobre la escala de dosis de 7.20 Gy a 8.90 Gy, y se les administró manejo médico. Treinta y dos (32) del total de 48 animales (66.6%) sucumbieron al síndrome hematopoyético. La relación de respuesta a la dosis se muestra en la figura 1 y en el cuadro 1. La dosis de radiación fue un mecanismo de predicción significativo de mortalidad (P = 0.01), con índices de mortalidad incrementados a las dosis mayores.

CUADRO 1 Por ciento de supervivencia y tiempo medio de supervivencia después de la exposición a la radiación en macacos rhesus Los valores de LD30/60, LD50/60 y LD70/60 estimados (con intervalo de confianza de 95% en corchetes) para monos rhesus expuestos a TBI en este estudio, fueron de 7.09 Gy [6.50, 7.73], 7.52 Gy [7.12, 7.93] y 7.97 Gy [7.60, 8.36], respectivamente. Además, la estimación de la LD5/60 (6.24 Gy) [3.56, 6.91] y LD10/60 (6.51 Gy) [4.09, 7.09] respecto a la LD95/60 (9.05 Gy) [8.45, 12.93] y LD90/60 (8.68 Gy) [8.22, 11.27], determinó las relaciones respectivas entre las dosis letales para "pocos" y para "muchos" animales. La LD5:LD95 es de 1.45 [1.24, 3.57], y la LD10.LD90 es de 1.33 [1.18, 2.70]. La diferencia respectiva en Gy entre los "pocos" y "muchos" eventos letales, es aproximadamente 2.81 a 2.17.

B. Efecto del manejo médico sobre la LD50 Como se muestra en la figura 1 , se estimó que la LD50/30 de dos estudios históricos disponibles para macacos rhesus expuestos a TBI de calidad similar es de 6.40 Gy (radiación gamma de Co-60, LD50C06o) y 6.65 Gy (radiación X de 2 MV, LD50rayos x) en ausencia de cuidado de soporte (manejo médico). El valor para la LD50/60 estimada del estudio actual que usa TBI con fotones LINAC promedio de 2 MV más manejo médico, es de 7.52 Gy. Esta comparación retrospectiva indica que el manejo médico aumentará el valor de la LD50 y la supervivencia a través de la escala de dosificación de radiación letal en el síndrome hematopoyético (figura 1 y cuadro 2).

El tiempo medio de supervivencia (MST) de los finados en cada dosis de radiación varia de 16.2 días a 22.2 días (cuadro 1). El MST promedio general a través de todas las dosis para el estudio, fue de 19.4 días. Puesto que no se realizó un estudio de respuesta a la dosis de letalidad para los animales que no recibieron manejo médico, se calculó el MST para todos los estudios de respuesta a la dosis publicados usando macacos rhesus. Este análisis dio un MST promedio de 14.0 días a través de todos los estudios conocidos (cuadro 2).

CUADRO 2 Irradiación total del cuerpo y mortalidad a los 60 días: LD30/60, LD50/60 y LD70/60 estimadas y MST de los finados, para todos los animales a los que se les administró manejo médico Dosis letales para síndrome hemátopoyético Tiempo medio de supervivencia (días)** TBI, LINAC más manejo médico = 19.4 días TBI, Co-60, rayos X, sin manejo médico = 14 0 días * Un estudio de respuesta a la dosis completo (rayos X de 2 MV), está disponible en la literatura (Dalrymple, et al. 1965); el otro (Co-60) fue provisto como una comunicación personal al Dr. MacVittie. Ningún manejo médico se proveyó en estos estudios.

** El MST promedio de 14.0 días se calculó a partir de toda la literatura disponible, que determina la respuesta a la dosis de letalidad para macacos rhesus para el síndrome hemátopoyético sin manejo médico.

Los finados que recibieron manejo médico mostraron un incremento promedio en MST de aproximadamente 5.4 días, en comparación con los que no recibieron manejo médico alguno. Esta observación es significativa cuando se considera en el contexto de administrar un mitigador potencial, tal como una variante del G-CSF multi-PEGilado de la invención (tal como, por ejemplo, Maxy-G34), para animales letalmente irradiados que están recibiendo manejo médico efectivo. En este caso, el mitigador candidato tendría el beneficio de otros 5 días para mejorar la regeneración de la médula y la producción de células maduras tales como neutrófilos.

C. Duración de la neutropenia inducida por radiación Los neutrófilos proveen la primera línea de defensa contra la infección oportunista. Las dosis letales de TBI administradas en este estudio redujeron el conteo absoluto de neutrófilos (ANC) circulantes hasta 500/pL dentro de aproximadamente 5 días después de la TBI, sin tener en cuenta la dosis de radiación (cuadro 3).

CUADRO 3 Duración de la citopenia: parámetros relacionados con los neutrófilos * La duración (d) no incluye datos de los animales finados, a menos que ocurriera recuperación a ese nivel, por ejemplo, ANC= 100/pL o= 500/pL antes de la muerte.

Se administraron antibióticos cuando el ANC era < 500/pL, debido a que se anticipó que el ANC podría continuar disminuyendo hasta valores < 100/pL. A neutropenia severa de grado 4 (ANC < 100/pL), el animal está en mayor riesgo de infección y sepsis. Además, estos valores determinan la validez de administrar profilaxis primaria con antibióticos. El ANC en todos los animales letalmente irradiados disminuyó hasta < 100/pL dentro de los siguientes 1.5 a 3.0 días, y continuó disminuyendo en todos los grupos de dosis salvo uno (7.85 Gy), hasta la neutropenia absoluta (ANC ~ O/pL). El nadir promedio para el grupo de 7.85 Gy fue de 5/pL (cuadro 3). La duración de la neutropenia de grado 4 (ANC < 100/pL) para los sobrevivientes, sobre todo los grupos de dosis, varió de 9.8 a 15.0 días cuando la escala sobre todos los grupos de dosis para la duración del ANC < 500/pL, fue de 1 1.5 a 24.0 días. Los parámetros adicionales relacionados con los neutrófilos se muestran en el cuadro 3. Mostradas en la figura 2, son las curvas de recuperación de neutrófilos para todos los animales expuestos a las dosis de TBI que se aproximan a los niveles de LD30/60, LD50 60 y LD70/60.

En conclusión, este estudio demuestra que la dosis de TBI uniforme con fotones LINAC promedio de 2 MV, fue un mecanismo de predicción significativo de letalidad. Las dosis de TBI usadas en la presente, permitieron la estimación de los niveles de LD30/60, LD50/60 y LD70/60 para el diseño de pruebas de eficacia para agentes que mitigan la letalidad asociada con el síndrome hematopoyético del ARS. En este estudio, los niveles de LD30/60, LD50/60 y LD70/60 fueron de 7.09, 7.52 y 7.97 Gy, respectivamente. En comparación con los valores de la literatura determinados en estudios diseñados para evaluar la respuesta a la dosis de radiación letal de macacos rhesus sin el beneficio del manejo médico, el manejo médico (como se administró en el estudio presentado en la presente) incrementó la LD50/60 asociada con el síndrome hematopoyético del ARS, e incrementó el MST de los finados.

EJEMPLO 2 Farmacodinámica y farmacocinética de una variante del G-CSF multi- PEGilado en un modelo de primate no humano de neutropenia inducida por radiación Protocolo de estudio Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con los principios enunciados en la Guide for the Care and Use of Laboratory Animáis (The Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, 1996). Monos rhesus machos {Macaca mulatta) con un peso promedio de 4.6 +/- 0.7 kg, fueron expuestos a irradiación X de 250 kVp a 0.13 Gy/min unilateralmente en la posición posterior-anterior, y se hizo rotar a los mismos 108° a la dosis media (3.00 Gy) hacia la posición anterior-posterior para concluir la exposición total de 6.00 Gy. Los animales recibieron soporte clínico, que consistía de antibióticos, sangre entera irradiada fresca y fluidos, según fuese necesario. Se administró gentamicina (Elkin Sinn, Cherry Hill NJ) intramuscularmente (i.m.) cada día (q.d.) a 10 mg/dia, por los primeros siete días de tratamiento. Se administró Baytril® (Bayer Corp., Shawnee Mission, KS) a la dosis de 10 mg/día i.m. q.d. por el período entero de tratamiento antimicrobiano. Se administraron antibióticos hasta que el animal mantuviera un WBC > 1 ,000/µ? por 3 días consecutivos y hubiesen alcanzado un ANC > 500/µ?. Los animales recibieron sangre entera fresca irradiada (irradiada con Co-60 de 15.00 Gy), aproximadamente 30 ml/transfusión, de un grupo de monos donadores al azar cuando el conteo de plaquetas (PLT) era < 20,000/µ? y el hematócrito (HCT) era < 18%.

Nueve monos rhesus machos irradiados y dos no irradiados, fueron tratados con un ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado de conformidad con la invención (identificado en la presente como "Maxy-G21 "), y cuatro macacos rhesus irradiados fueron tratados con Neulasta®. Cuatro animales tratados sólo con diluyente ("vehículo"), sirvieron como controles. En el grupo de Neulasta®, se muestrearon dos animales para análisis farmacocinético, mientras que todos los animales tratados con Maxy-G21 se incluyeron en la evaluación farmacocinética. A cada animal se le administró una sola dosis subcutánea del compuesto de prueba o vehículo 24 horas después de la irradiación total del cuerpo. Se usaron dos diferentes dosificaciones de Maxy-G21 : 100 y 300 pg por kg, usando 4 y 5 monos, respectivamente. Al grupo de Neulasta® se le administraron 300 pg/kg. Dos animales no irradiados a los que se les administraron 300 pg/kg de Maxy-G21 se usaron para estudiar la movilización de células positivas para CD34 y células formadoras de colonias (CFC) in vitro. Se colectaron muestras de sangre de la vena safena. Un resumen del diseño de estudio se provee en el cuadro 4.

CUADRO 4 Resumen del protocolo de estudio *Estos animales se usaron para estudiar la movilización de células positivas para CD34 y células formadoras de colonias (CFC) in vitro.

Resultados En comparación con animales control expuestos a TBI de 6.00 Gy dosificados con suero autólogo (AS), que exhibieron un período de neutropenia de 14.8 a 15.7 días, los animales irradiados dosificados con 300 pg/kg de Maxy-G21 exhibieron un periodo reducido de neutropenia de 7.3 ± 1.1 días. El nadir del ANC fue también notablemente mejorado hasta 140 ± 45/pL de tan bajo como 49 ± 22/pL en animales control. El tiempo a la recuperación fue asimismo mejorado de un valor control de 21.2 ± 0.4 y 23.0 ± 0.0 días (en tres grupos control separados), a 15.5 ± 0.3 días en el grupo tratado con Maxy-G21. En comparación con el grupo de Neulasta® intra- estudio (N = 4) que usa una dosis equivalente de Neulasta® (300 pg/kg), se encontró que Maxy-G21 reduce la duración de la neutropenia en 2 días (de 9.3 a 7.3 días), el tiempo a la recuperación en 3 días (de 18.5 a 15.5 días), y el requerimiento de antibióticos en 3 días (de 11 .5 a 9.8 días; cuadro 5).

CUADRO 5 Efecto de la administración de Maxy-G21 sobre parámetros relacionados con neutrófilos en macacos rhesus irradiados con rayos X de 6.00 Gy contra el tratamiento con Neulasta® o suero control autólogo (AS): duración neutropénica, nadir, tiempo a la recuperación y soporte clínico Grupos control separados * Grupo de Neulasta® combinado que comprende este estudio y un grupo publicado laboratorio MacVittie.

Cuando los datos de un grupo de Neulasta® histórico (n = 5) se combinaron con el grupo de Neulasta® intra-estudio actual (n = 4), la duración de la neutropenia fue de 12.1 ± 1.3 días. La duración de la neutropenia fue significativamente más corta en el grupo de Maxy-G21 , en comparación con el grupo de Neulasta® combinado (P = 0.02) (figura 3, cuadro 5). El grupo control y el grupo tratado con Maxy-G21 requirieron sólo antibióticos por 9.8 días, mientras que el grupo tratado con Neulasta® combinado requirió 14.7 días de soporte con antibióticos. Maxy-G21 administrado a 100 pg/kg (datos no mostrados) no fue tan efectivo para estimular la recuperación de los neutrófilos bajo las condiciones de este estudio, según se évaluó por todos los parámetros relacionados con los neutrófilos.

Después de la administración subcutánea de Maxy-G21 , el fármaco alcanzó la concentración pico en plasma dentro de 24 a 96 horas en macacos rhesus irradiados y no irradiados. En los dos grupos de dosificación de 300 pg/kg, las concentraciones pico en plasma fueron aproximadamente tres veces mayores que en el grupo de 100 pg/kg. Un patrón de eliminación de Maxy-G21 bifásico se observa en los animales normales e irradiados tratados con 300 pg/kg de fármaco (figura 4).

Los animales irradiados tratados con 300 pg/kg de Maxy-G21 exhibieron una fase de eliminación lenta temprana, con una vida media en suero media de 59 horas. La duración de la fase lenta temprana fue de 12 a 13 días (figura 4). Los perfiles tempranos se caracterizan por uniformidad entre los 5 macacos. En el día 15 después de la inyección de la sustancia de fármaco, la fase lenta es retrasada por una fase más rápida, la cual mostró una vida media en plasma media de 16 horas. La fase de eliminación tardía, basada en el análisis de datos de 3 animales, se caracterizó por más variación inter-animal en las vidas medias en plasma. En los animales irradiados tratados con 100 pg/kg de Maxy-G21 , el fármaco fue eliminado en una fase individual con una vida media en suero media de 49 horas.

Los animales no irradiados ("normales") eliminaron Maxy-G21 (300 pg/kg) en un perfil de cinética de fase tardia-más lenta y temprana rápida. La vida media en plasma media de la fase tardía fue de 62 horas, en comparación con menos de 35 horas para Neulasta® en animales no irradiados en un estudio publicado (datos no mostrados). Una comparación de animales irradiados y no irradiados muestra una diferencia de 3 veces en el AUC a la misma dosis de 300 pg/kg de Maxy-G21 (cuadro 6).

Se encontró que Neulasta® es eliminado en una sola fase con una vida media en plasma media de 23 horas, la cual es notablemente más rápida que la observada para Maxy-G21 (figura 4). Se encontró que la concentración pico de Neulasta® en plasma es 5 a 6 veces menor, en comparación con Maxy-G21 (cuadro 6). Después de 11 a 15 días, Neulasta® fue indetectable en el plasma. El AUC para Neulasta® fue aproximadamente 9 a 10 veces menor, en comparación con Maxy-G21.

CUADRO 6 Farmacocinética de monos rhesus irradiados tratados con Maxy-G21 y Neulasta®, y monos rhesus no irradiados tratados con Maxy-G21. Los valores representan la media t desviación estándar 300 pg/kg Parámetros 300 pg/kg de 100 pg/kg de 300 pg/kg de de fármaco- Maxy-G21 Maxy-G21 Maxy-G21 Neulasta® cinéticos Irradiados Irradiados No irradiados Irradiados Cmílx (ng/mL) 7219 ± 1476 1961 ± 172 5953 ± 490 1239 1 658 Tmáx (hrs) 53 ± 31 50 ± 4 31 ± 0 15 l 13 928609 ± 165798 1 3590401 1986841 AUC (hrs/mL) 88114 45705 18837 124275 Conclusiones El presente estudio provee evidencia de que un ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado de conformidad con la invención (identificado en la presente como Maxy-G21) administrado s.c. a macacos rhesus, es capaz de reducir significativamente el período de neutropenia en NHP neutropénicos inducidos por radiación. Se encontró además que el efecto supera el de Neulasta® cuando se compara con un grupo que comprende el grupo de Neulasta® intra-estudio y un grupo de Neulasta® histórico (N = 9).

En general, el ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado Maxy-G21 exhibió una vida media en plasma notablemente extendida en comparación con el hG-CSF mono-PEGilado Neulasta® en NHP que sufren un estado de mielosupresión severa inducida por radiación, así como en primates no humanos sanos (no irradiados). Los datos farmacocinéticos apoyan la hipótesis de trabajo de que las variantes del G-CSF multi-PEGilado tales como Maxy-G21 , tienen mayor biodisponibilidad y una duración de acción sostenida respecto a Neulasta® mono-PEGilado durante un estado de mielosupresión severa inducida por radiación, asi como en NHP normales (no irradiados).

EJEMPLO 3 Actividad de radiomitiqación de una variante del G-CSF multi-PEGilado administrada subcutáneamente después de exposición a radiación letal, en ratones C57BL 6 La eficacia de un ejemplo de variante del G-CSF multi-PEGilado (identificado en la presente como Maxy-G34) se puso a prueba a una dosificación de 1 mg/kg y a dos diferentes dosis letales de radiación. Los ratones en cada nivel de dosis de radiación fueron repartidos en grupos de tratamiento de 20 ratones cada uno (10 hembras y 10 machos), recibiendo Maxy-G34 en los días 1 , 7 y 14 o los días 1 y 7 después de irradiación a 7.76 Gy o a 7.96 Gy. Los ratones tratados con vehículo recibieron diluyente (una solución liquida estéril de acetato de sodio 10 mM, 45 mg/ml de manitol, 0.05 mg/ml de polisorbato 20, pH 4.0) en los días 1 , 7 y 14. De esta manera, los tres grupos de ratones recibieron uno de los siguientes tratamientos: 1. Maxy-G34; 24 ± 4hr y 7d ± 4hr después de irradiación de 7.76 Gy (Maxy-G34 d1 , d7) 2. Maxy-G34; 24 + 4hr, 7d ± 4 hr y 14d + 4hr después de irradiación de 7.76 Gy (Maxy-G34 d1 , d7, d14) 3. Vehículo; 24 + 4hr, 7d ± 4hr y 14d ± 4hr después de irradiación de 7.76 Gy (vehículo d1 , d7, d14) 4. Maxy-G34; 24 + 4hr y 7d ± 4hr después de irradiación de 7.96 Gy (Maxy-G3 d1 , d7) 5. Maxy-G34; 24 ± 4hr, 7d ± 4hr y 14d ± 4hr después de irradiación de 7.96 Gy (Maxy-G3 d1 , d7, d14) 6. Vehículo; 24 ± 4hr, 7d ± 4hr y 14d ± 4hr después de irradiación de 7.96 Gy (Vehículo d1 , d7, d14).

Los ratones fueron irradiados en grupos de 14 a 16 animales, a las siguientes dosis: 7.76 Gy: 66.104 cGy/min (tiempo de exposición de 1 1 minutos 44 segundos) 7.96 Gy: 66.104 cGy/min (tiempo de exposición de 12 minutos 02 segundos).

A los ratones no se les administraron antibióticos. El punto de extremo primario fue la supervivencia general a los 30 días, y el punto de extremo secundario fue el tiempo medio de supervivencia (MST).

Resultados La supervivencia durante 30 días y los tiempos medios de supervivencia (MST) se muestran en el cuadro 7, cuadro 8, figura 5 y figura 6.

CUADRO 7 Supervivencia a los treinta días y MST CUADRO 8 Análisis estadístico de la supervivencia y tiempo medio de supervivencia (datos agrupados de 7.76 Gy y 7.96 Gy) La irradiación de ratones a la dosis de radiación de 7.76 Gy seguida de tratamiento con vehículo a d1 , d7 y d14 post-exposición, resultó en 80% de supervivencia después de 30 días (es decir, LD20/30). El tratamiento de los ratones irradiados con 7.76 Gy (LD20/30) con 1 mg/kg de Maxy-G34 a d1, d7 y d14 post-exposición, o a d1 y d7 post-exposición, incrementó la supervivencia después de 30 días a 95% (cuadro 7).

A la dosis de radiación de 7.96 Gy, la supervivencia en el grupo de vehículo d1 , d7, d14 fue de 55% 30 días post-exposición (es decir, LD45/30). Los ratones irradiados con 7.96 Gy (LD45/30) tratados con 1 mg/kg de Maxy-G34 a d1 y d7 mostraron 75% de supervivencia 30 días postexposición, y el grupo de Maxy-G34 d1, d7, d14 mostró 85% de supervivencia 30 días post-exposición. A este nivel de dosis de radiación, el régimen de dosis de 3 semanas (d1 , d7, d14) pareció ser más efectivo que el régimen de dosis de 2 semanas (d1 , d7).

Los datos obtenidos de los dos niveles de radiación se combinaron (cuadro 8). Bajo las condiciones de este estudio, el grupo de dosis de Maxy-G34 de 3 semanas y el grupo de dosis de Maxy-G34 de 2 semanas, mostraron incrementos estadísticamente significativos en supervivencia 30 días post-irradiación sobre los de los grupos control de vehículo. A las dosificaciones de radiación usadas en este estudio, las diferencias en MST entre los grupos de tratamiento y los grupos control de vehículo, no fueron estadísticamente significativas.

Mientras que la invención anterior se ha descrito en cierto detalle para propósitos de claridad y entendimiento, será claro para los expertos en la técnica después de que lean esta descripción, que pueden hacerse varios cambios en forma y detalle sin que se aparten del alcance real de la invención. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son sólo para propósitos ilustrativos, y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridos para los expertos en la técnica, y se incluirán dentro del espíritu y competencia de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y/u otros documentos citados en esta solicitud, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia para todos los propósitos, al mismo grado como si se indicara individualmente que cada publicación, patente, solicitud de patente y/u otro documento individual, se incorpora en su totalidad en la presente como referencia para todos los propósitos.

Claims (28)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de una variante del G-CSF multi-PEGilado, en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende: un polipéptido que exhibe actividad del G-CSF, el polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos que difiere en hasta 15 residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , y dos o más porciones de polietilenglicol (PEG), cada porción de PEG unida covalentemente ya sea directamente o indirectamente, a un residuo de aminoácido del polipéptido, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir neutropenia en un paciente sujeto a exposición a radiación.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , y por lo menos una sustitución respecto a SEQ ID NO: 1 seleccionada del grupo que consiste de T1 K, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, P10K, Q11 K, S12K, F13K, L14K, L15K, E19K, Q20K, V21 K, Q25K, G26K, D27K, A29K, A30K, E33K, A37K, T38K, Y39K, L41 K, H43K, P44K, E45K, E46K, V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61 K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71 K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, L99K, G100K, P101K, T102K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K, A1 11 K, D112K, F113K, T115K, T116K, W1 18K, Q119K, Q120K, M121K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131 K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141 K, S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161 K, E162K, V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171 K, A172K, Q173K y P174K.

3. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende por lo menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de Q70K, Q90K, T105K Q120K, T133K, S159K y H170K.

4. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende además por lo menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de K16R/Q, K34R/Q y K40R/Q.

5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende las sustituciones K16R, K34R, K40R, T105K y S159K.

6.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante del G-CSF multi-PEGilado consiste de las sustituciones K16R, K34R, K40R, T105K y S159K, y opcionalmente un residuo de metionina en el grupo N-terminal.

7 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende 2 a 6 porciones de PEG, cada una con un peso molecular de aproximadamente 1 a 10 kDa.

8 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende una porción de PEG unida al grupo N-terminal, y una porción de PEG unida a un residuo de lisina.

9.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde el G-CSF multi-PEGilado comprende 2 a 4 porciones de PEG, cada una con un peso molecular de aproximadamente 4 a 6 kDa.

10. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la secuencia de aminoácidos de la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende una o más sustituciones seleccionadas de K16R/Q, K34R/Q y K40R/Q, y una o más sustituciones seleccionadas de Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K y S159K, y comprende 2 a 6 porciones de PEG unidas, cada una con un peso molecular de aproximadamente 1 a 10 kDa.

1 1. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende una o más sustituciones seleccionadas de K16R/Q, K34R/Q y K40R/Q, y por lo menos una sustitución seleccionada de T105K y S159K, y comprende 2 a 4 porciones de PEG unidas, cada una con un peso molecular de aproximadamente 1 a 10 kDa.

12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la secuencia de aminoácidos de la variante del G-CSF multi-PEGilado comprende las sustituciones K16R, K34R, K40R, T105K y S159K, y comprende 2 a 4 porciones de PEG unidas, cada una con un peso molecular de aproximadamente 4 a 6 kDa.

13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado es una mezcla de especies de isómeros de PEG posicionales.

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, en donde la mezcla de especies de isómeros de PEG posicionales comprende por lo menos 2 especies de isómeros de PEG posicionales, cada una teniendo 3 porciones de PEG unidas, en donde uno de los isómeros tiene porciones de PEG unidas en el grupo N-terminal, Lys23 y Lys159, y el otro isómero tiene porciones de PEG unidas en el grupo N-terminal, Lys105 y Lys159.

15. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde las porciones de PEG tienen cada una un peso molecular de aproximadamente 1 a 10 kDa.

16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde las porciones de PEG tienen cada una un peso molecular de aproximadamente 5 kDa.

17. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado exhibe una propiedad farmacocinética mejorada en comparación con Neulasta (pegfilgrastim), cuando se pone a prueba bajo condiciones comparables en un modelo animal.

18. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado exhibe una vida media en suero incrementada en comparación con Neulasta en un modelo animal.

19. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde la variante del G-CSF multi-PEGilado exhibe un AUC incrementado en comparación con Neulasta en un modelo animal.

20. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento reduce la duración de la neutropenia severa en un grupo tratado con el medicamento, respecto a un grupo no tratado con el medicamento en un sistema de modelo animal de neutropenia inducida por radiación.

21. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento incrementa el número de supervivientes 30 días postexposición a la radiación en un grupo tratado con el medicamento, respecto a un grupo no tratado con el medicamento en un sistema de modelo animal de neutropenia inducida por radiación.

22. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable al paciente a una dosis de aproximadamente 20 g/kg de peso del paciente a aproximadamente 300 pg/kg de peso del paciente.

23. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el paciente es un humano adulto, y el medicamento está adaptado para ser administrable al paciente a una dosis de aproximadamente 1 a 30 mg por paciente.

24. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable con uno o más factores de crecimiento hematopoyéticos adicionales.

25 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde el factor de crecimiento hematopoyético adicional se selecciona de factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF), factor de células madre (SCF), ligando de FLT3 (FL), interleucina-3 (IL-3), factor de desarrollo y crecimiento de megacariocitos (MGDF), trombopoyetina (TPO), un agonista del receptor de TPO y eritropoyetina (EPO).

26.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable al sujeto dentro de aproximadamente 3 días después de la exposición a la radiación.

27 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la exposición a la radiación es igual a o mayor que aproximadamente 1 Gy.

28.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20 ó 21 , en donde el sistema de modelo animal es un sistema de modelo de primate no humano.