JP2022553152A - 顆粒球コロニー刺激因子受容体（ｇ－ｃｓｆｒ）の改変された細胞外ドメイン及びそれに結合するサイトカイン - Google Patents

顆粒球コロニー刺激因子受容体（ｇ－ｃｓｆｒ）の改変された細胞外ドメイン及びそれに結合するサイトカイン Download PDF

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Abstract

本明細書には、バリアントサイトカイン受容体及びサイトカインのペアを用いて細胞を選択的に活性化させるための方法及び組成物であって、該サイトカイン受容体が顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ－ＣＳＦＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、方法及び組成物が記載されている。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、養子細胞移植療法のための細胞の排他的活性化に有用である。したがって、本明細書に含まれるのは、その天然型受容体には結合しないサイトカインによって選択的に活性化されるバリアント受容体を発現する細胞を作製する方法である。また、本明細書では、Ｇ－ＣＳＦＲの細胞外ドメインを含むバリアント受容体を発現する細胞を対象に投与することと、該バリアント受容体を活性化させるバリアントサイトカインを共投与することと、を含む、治療を必要とする対象を治療する方法も開示される。TIFF2022553152000035.tif127170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６２／９１２，３１８号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。２０２０年１０月７日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＩＫＥ－０６８ＷＯ＿ＵＳ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、８５，１０９バイトのサイズである。
発明の分野
本発明は、バリアントサイトカイン受容体及びサイトカインペアを用いた細胞の選択的活性化のための方法及び組成物であって、該サイトカイン受容体が、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ－ＣＳＦＲ）のバリアント細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、方法及び組成物について開示する。また、本明細書では、養子細胞移植によって対象を治療する方法であって、対象にバリアント受容体を発現する細胞を投与することと、バリアントサイトカインを投与して、バリアント受容体を発現する細胞にシグナルを送ることと、を含む、方法が開示される。本開示に含まれるのは、バリアントサイトカイン及び受容体を発現する細胞を作製するための核酸、発現ベクター、及びキットであり、該キットは、バリアント受容体に結合するためのサイトカインも提供する。
関連技術の説明
過去２０年間で、養子細胞療法（ＡＣＴ）によるがんの治療には大きな進歩がもたらされた。内在性腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）を用いたＡＣＴは、現在、進行性メラノーマにおいて５０％を超える客観的臨床奏効率が再現性よく得られる。Ｂ細胞系白血病を認識する（ＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体、ＣＤ１９ ＣＡＲを使用して）ように操作されたＴ細胞を用いたＡＣＴでは、最大９０％の完全奏効率が得られ、大半の患者は持続的な奏効を達成する。これらの顕著な結果に刺激され、いくつかの企業はＴＩＬ及びＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞アプローチを商品化している。
ＡＣＴのためのＴ細胞の生着、増殖、及び持続性は、臨床的な安全性及び有効性の重要な決定要因である。これは、ＡＣＴ移植後のＩＬ－２の全身投与と、移植前に体外でＴ細胞をＩＬ－２で増殖させることによって対処されることが多い。意図した免疫刺激効果に加えて、全身的なＩＬ－２治療は、血管漏出症候群などの重篤な毒性を引き起こす可能性があり、患者の安全のために厳重に制御する必要がある。これらのリスクを管理するために、患者は通常２～３週間入院し、予防措置としてＩＣＵを利用する必要がある。さらに、ＩＬ－２は、エフェクターＴ細胞と制御性（抑制性）Ｔ細胞（５）の両方の増殖を誘発するため、患者にＩＬ－２を投与することは、アクセルとブレーキペダルを同時に踏むようなものである。ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞の増殖と持続性が安全なレベルを超える可能性があるいう逆の問題をもたらす。さらに、それは正常なＢ細胞（ＣＤ１９を発現している）も例外なく根絶してしまうため、患者は一生、部分的に免疫不全のままとなる。理想的には、養子移入後の腫瘍反応性Ｔ細胞の数を正確に制御し、がんを根絶した後に移入細胞を除去できるようにする機能を含むことが望ましい。幹細胞治療などの他の細胞ベース療法も、注入された細胞の増殖、分化、及び持続性に対する制御を改善することで恩恵を得ることができるだろう。
ヒトＧ－ＣＳＦは、がん患者の好中球減少症を治療するために使用される承認済みの治療薬（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標），Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）である。Ｇ－ＣＳＦは、４－ヘリックスバンドルであり（Ｈｉｌｌ，ＣＰ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９３ Ｊｕｎ １；９０（１１）：５１６７－７１（非特許文献1））、Ｇ－ＣＳＦと、その受容体Ｇ－ＣＳＦＲと複合体を形成した構造は十分に特徴付けられている（Ｔａｍａｄａ，Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６ Ｆｅｂ ２８；１０３（９）：３１３５－４０（非特許文献2））。Ｇ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ複合体は、２：２ヘテロ二量体である。Ｇ－ＣＳＦは、Ｇ－ＣＳＦＲとの結合界面を２つ有する。１つの界面は、サイトＩＩと呼ばれるものであり、Ｇ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦＲのサイトカイン受容体相同（ＣＲＨ）ドメインとの間のより大きな界面である。もう１つの界面は、サイトＩＩＩと呼ばれるものであり、Ｇ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦＲのＮ末端Ｉｇ様ドメインとの間のより小さな界面である。
Ｈｉｌｌ，ＣＰ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９３ Ｊｕｎ １；９０（１１）：５１６７－７１ Ｔａｍａｄａ，Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６ Ｆｅｂ ２８；１０３（９）：３１３５－４０
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ－ＣＳＦＲ）のバリアント細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む受容体であって、Ｇ－ＣＳＦＲのバリアントＥＣＤが、サイトＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異、サイトＩＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異、またはそれらの組み合わせを含む、受容体である。特定の態様では、サイトＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異は、配列番号２のアミノ酸位置１４１、１６７、１６８、１７１、１７２、１７３、１７４、１９７、１９９、２００、２０２、及び２８８からなる群より選択されるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤのアミノ酸位置に位置する。特定の態様では、サイトＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異は、Ｒ１４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、Ｋ１６８Ｄ、Ｋ１６８Ｅ、Ｌ１７１Ｅ、Ｌ１７２Ｅ、Ｙ１７３Ｋ、Ｑ１７４Ｅ、Ｄ１９７Ｋ、Ｄ１９７Ｒ、Ｍ１９９Ｄ、Ｄ２００Ｋ、Ｄ２００Ｒ、Ｖ２０２Ｄ、Ｒ２８８Ｄ、及びＲ２８８ＥからなるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ変異群から選択される。特定の態様では、サイトＩＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異は、配列番号２のアミノ酸位置３０、４１、７３、７５、７９、８６、８７、８８、８９、９１、及び９３からなる群より選択されるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ変異群から選択される。特定の態様では、サイトＩＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異は、Ｓ３０Ｄ、Ｒ４１Ｅ、Ｑ７３Ｗ、Ｆ７５ＫＦ、Ｓ７９Ｄ、Ｌ８６Ｄ、Ｑ８７Ｄ、Ｉ８８Ｅ、Ｌ８９Ａ、Ｑ９１Ｄ、Ｑ９１Ｋ、及びＥ９３ＫからなるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ変異群から選択される。特定の態様では、Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤは、表６のデザイン番号の変異の組み合わせを含み、該変異は、配列番号２のアミノ酸位置に対応する。特定の態様では、Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤは、Ｒ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄである変異を含む。
特定の態様では、本明細書に開示される受容体はキメラ受容体である。特定の態様では、受容体は細胞上で発現する。特定の態様では、受容体は免疫細胞上で発現する。特定の態様では、免疫細胞は、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞は幹細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である。
特定の態様では、変異Ｇ－ＣＳＦによる受容体の活性化は、受容体を発現する細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答を引き起こす。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される受容体のいずれかをコードする核酸である。特定の態様では、本明細書に記載されるのは、核酸を含む発現ベクターである。特定の実施形態では、本明細書に記載されるのは、本明細書に開示される受容体を発現するように操作された細胞である。特定の態様では、細胞は免疫細胞である。特定の実施形態では、免疫細胞は、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞は幹細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である。特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、バリアント顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）であって、該バリアントＧ－ＣＳＦが、サイトＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異、サイトＩＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異、またはそれらの組み合わせを含む、バリアントＧ－ＣＳＦである。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦのサイトＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異は、配列番号１のアミノ酸位置１２、１６、１９、２０、１０４、１０８、１０９、１１２、１１５、１１６、１１８、１１９、１２２、及び１２３からなる群より選択されるアミノ酸位置に位置する。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦのサイトＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異は、Ｓ１２Ｅ、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｒ、Ｋ１６Ｄ、Ｌ１８Ｆ、Ｅ１９Ｋ、Ｑ２０Ｅ、Ｄ１０４Ｋ、Ｄ１０４Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、Ｌ１０８Ｒ、Ｄ１０９Ｒ、Ｄ１１２Ｒ、Ｄ１１２Ｋ、Ｔ１１５Ｅ、Ｔ１１５Ｋ、Ｔ１１６Ｄ、Ｑ１１９Ｅ、Ｑ１１９Ｒ、Ｅ１２２Ｋ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３Ｒからなる変異群より選択される。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦのサイトＩＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異は、配列番号１のアミノ酸位置３８、３９、４０、４１、４６、４７、４８、４９、及び１４７からなる群より選択される変異群から選択される。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦのサイトＩＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異は、Ｔ３８Ｒ、Ｙ３９Ｅ、Ｋ４０Ｄ、Ｋ４０Ｆ、Ｌ４１Ｄ、Ｌ４１Ｅ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ４７Ｄ、Ｖ４８Ｋ、Ｖ４８Ｒ、Ｌ４９Ｋ、及びＲ１４７Ｅからなる変異群より選択される。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦは、表６のデザイン番号の変異の組み合わせを含み、該変異は、配列番号１のアミノ酸位置に対応する。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦは、Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒである変異を含む。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦは、本明細書に開示される受容体に選択的に結合する。特定の態様では、受容体は細胞上で発現する。特定の態様では、細胞は免疫細胞である。特定の態様では、免疫細胞は、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞は幹細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦの、受容体への選択的結合により、免疫細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答が引き起こされる。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、バリアントＧ－ＣＳＦをコードする核酸である。特定の態様では、本明細書に開示されるのは、核酸を含む発現ベクターである。特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、バリアントＧ－ＣＳＦを発現するように操作された細胞である。特定の態様では、細胞は免疫細胞である。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、細胞表面上で発現する受容体を選択的に活性化させるシステムであって、該システムが受容体及びバリアントＧ－ＣＳＦを含み、該受容体がサイトＩＩ界面領域、サイトＩＩＩ界面領域、またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも１つの変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦが受容体のサイトＩＩ界面領域、受容体のサイトＩＩＩ界面領域、またはそれらの組み合わせを結合するＧ－ＣＳＦのアミノ酸配列において少なくとも１つの変異を含み；該バリアントＧ－ＣＳＦが野生型Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤよりも優先的に受容体に結合し、該受容体が野生型Ｇ－ＣＳＦよりも優先的にバリアントＧ－ＣＳＦに結合する、システムである。特定の態様では、受容体及びバリアントＧ－ＣＳＦは、表２のデザイン番号のサイトＩＩ界面の変異の組み合わせを含み、該受容体の変異が配列番号２のアミノ酸位置に対応し、該バリアントＧ－ＣＳＦの変異が配列番号１のアミノ酸位置に対応する。特定の態様では、受容体及びバリアントＧ－ＣＳＦは、表４のデザイン番号のサイトＩＩＩ界面の変異の組み合わせを含み、該受容体の変異が配列番号２のアミノ酸位置に対応し、該バリアントＧ－ＣＳＦの変異が配列番号１のアミノ酸位置に対応する。特定の態様では、受容体及びバリアントＧ－ＣＳＦは、表６のデザイン番号のサイトＩＩ界面及びサイトＩＩＩ界面の変異の組み合わせを含み、該受容体の変異が配列番号２のアミノ酸位置に対応し、該バリアントＧ－ＣＳＦの変異が配列番号１のアミノ酸位置に対応する。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号１０６の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ及びＤ１０４Ｋ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ及びＫ１６８Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号１１７の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ及びＲ１４１Ｅ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号１３０の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ及びＲ１６７Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号１３４の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、Ｄ１１２Ｒ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３Ｒ変異を含み、該受容体は配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号１３５の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｔ１１５Ｋ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、Ｌ１７１Ｅ、及びＱ１７４Ｅ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号１３７の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号３００の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＫ４０Ｄ、Ｌ４１Ｄ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＦ７５Ｋ、Ｑ９１Ｋ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせは、デザイン番号３０１の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＴ３８Ｒ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｑ７３Ｅ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号３０２の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｌ８６Ｄ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号３０３の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＬ１０８Ｋ、Ｄ１１２Ｒ、及びＲ１４７Ｅ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＥ９３Ｋ及びＲ１６７Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号３０４の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、Ｄ１１２Ｒ、及びＲ１４７Ｅ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｅ９３Ｋ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号３０５の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号３０７の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＳ１２Ｅ、Ｋ１６Ｄ、Ｅ１９Ｋ、及びＥ４６Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｄ１９７Ｋ、Ｄ２００Ｋ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号３０８の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｒ、Ｅ４６Ｒ、Ｄ１１２Ｋ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、Ｖ２０２Ｄ及びＲ２８８Ｅ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号４００の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｄ１０９Ｒ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、Ｍ１９９Ｄ、及びＲ２８８Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号４０１の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、及びＲ２８８Ｄ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号４０２の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｄ１１２Ｋ、及びＴ１１５Ｋ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｅ、Ｑ１７４Ｅ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む。特定の態様では、変異の組み合わせはデザイン番号４０３の変異を含み、該バリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｒ、Ｅ４６Ｒ、及びＤ１１２Ｋ変異を含み、該受容体は、配列番号２のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、細胞の表面上で発現する受容体を選択的に活性化させる方法であって、該受容体をバリアントＧ－ＣＳＦと接触させることを含む、方法である。特定の態様では、受容体は細胞上で発現する。特定の態様では、受容体は免疫細胞上で発現する。特定の態様では、受容体はＴ細胞またはＮＫ細胞上で発現する。特定の態様では、免疫細胞の選択的活性化により、免疫細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答が引き起こされる。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される受容体を発現する細胞を作製する方法であって、本明細書に開示される核酸または発現ベクターを細胞に導入することを含む、方法である。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に本明細書に開示される細胞（例えば、免疫細胞）を注入することを含む、方法である。特定の態様では、本方法は、対象にバリアントＧ－ＣＳＦを投与することをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、細胞表面上で発現する受容体を選択的に活性化させるシステムを作製するためのキットであって、該キットが、本明細書に開示される核酸または発現ベクターと、本明細書に開示されるバリアントＧ－ＣＳＦと、使用説明書と、を含む、キットである。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるのは、キメラ受容体であって、該キメラ受容体が、（ａ）第２のドメインに作動可能に連結したＧ－ＣＳＦＲ（顆粒球コロニー刺激因子受容体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み；該第２のドメインが、（ｂ）ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体）、ＩＬ－１２Ｒ（インターロイキン－１２受容体）、及びＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）からなる群より選択されるマルチサブユニットサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の少なくとも一部を含み、任意選択で、該ＩＬ－２ＲがＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγｃからなる群より選択され、任意選択で、該第２のドメインがＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－１２Ｒβ２、またはＩＬ－２１ＲのＣ末端領域の少なくとも一部を含み；該サイトカイン受容体のＩＣＤの少なくとも一部が、サイトカイン受容体の細胞内ドメインの少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含み、任意選択で、該少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位が、Ｇ－ＣＳＦＲのＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＨＰ－２結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＨＣ結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ１結合部位；ＩＬ－７ＲαのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－７Ｒαのホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ４結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ３結合部位；及びＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ１結合部位からなる群より選択され；任意選択で、該ＩＣＤが、Ｇ－ＣＳＦＲ及びｇｐ１３０からなる群より選択されるタンパク質のＢｏｘ１領域及びＢｏｘ２領域を含み；任意選択で、該キメラ受容体が、Ｇ－ＣＳＦＲ、ｇｐ１３０（糖タンパク質１３０）、及びＩＬ－２Ｒβからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む第３のドメインを含み、任意選択で、該膜貫通ドメインが、野生型膜貫通ドメインである、キメラ受容体である。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、第２のドメインに作動可能に連結したＧ－ＣＳＦＲのＥＣＤを含むキメラ受容体であって、該第２のドメインが、
（ｉ）
（ａ）ｇｐ１３０の膜貫通ドメインと、
（ｂ）ｇｐ１３０のＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－１２Ｒβ２のＣ末端領域、または、
（ｉｖ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２１ＲのＣ末端領域、または、
（ｖ）
（ａ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃの膜貫通ドメインと、
（ｂ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＣ末端領域、または、
（ｖｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－７ＲαのＣ末端領域
を含む、キメラ受容体である。
特定の実施形態では、活性化キメラ受容体はホモ二量体を形成し、任意選択で、該キメラ受容体の活性化により、キメラ受容体を発現する細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答が引き起こされ、任意選択で、該キメラ受容体はＧ－ＣＳＦとの接触により活性化され、任意選択で、該Ｇ－ＣＳＦは野生型Ｇ－ＣＳＦであり、任意選択で、該Ｇ－ＣＳＦＲの細胞外ドメインは野生型細胞外ドメインである。特定の実施形態では、活性化キメラ受容体はホモ二量体を形成し、任意選択で、該キメラ受容体の活性化により、キメラ受容体を発現する細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答が引き起こされ、任意選択で、該キメラ受容体はＧ－ＣＳＦとの接触により活性化され、任意選択で、該Ｇ－ＣＳＦは野生型Ｇ－ＣＳＦであり、任意選択で、該Ｇ－ＣＳＦＲの細胞外ドメインは野生型細胞外ドメインである。
特定の実施形態では、キメラ受容体は、細胞、任意選択で免疫細胞、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞において発現され、任意選択で、該細胞は幹細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である。
特定の実施形態では、ＩＣＤは、（ａ）配列番号１６、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、もしくは３９のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ＲβのＩＣＤの少なくとも一部；または（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部；または（ｃ）配列番号２５もしくは２７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２１ＲのＩＣＤの少なくとも一部；または（ｄ）配列番号２３、３２、もしくは２６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２Ｒβ２のＩＣＤの少なくとも一部；または（ｅ）配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、４０、もしくは４２のアミノ酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＩＣＤの少なくとも一部；または（ｆ）配列番号１８もしくは３８のアミノ酸配列を有するｇｐ１３０のＩＣＤの少なくとも一部；または（ｇ）配列番号４３のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲのＩＣＤの少なくとも一部；または（ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ＲＧのＩＣＤの少なくとも一部、を含む。
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、（ａ）配列番号８、または（ｂ）配列番号９、または（ｃ）配列番号１０、または（ｄ）配列番号１１に記載の配列を含む。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、キメラ受容体をコードする核酸を含む細胞であって、該キメラ受容体が、（ａ）第２のドメインに作動可能に連結したＧ－ＣＳＦＲ（顆粒球コロニー刺激因子受容体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み；該第２のドメインが、（ｂ）ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体）、ＩＬ－１２Ｒ（インターロイキン－１２受容体）、及びＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）からなる群より選択されるマルチサブユニットサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の少なくとも一部を含み、任意選択で、該ＩＬ－２ＲがＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγｃからなる群より選択され、任意選択で、該第２のドメインがＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－１２Ｒβ２、またはＩＬ－２１ＲのＣ末端領域の少なくとも一部を含み；該サイトカイン受容体のＩＣＤの少なくとも一部が、サイトカイン受容体の細胞内ドメインの少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含み、任意選択で、該ＩＣＤが、Ｇ－ＣＳＦＲのＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＨＰ－２結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＨＣ結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ１結合部位；ＩＬ－７ＲαのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－７Ｒαのホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ４結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ３結合部位；及びＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ１結合部位からなる群より選択される少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含み；任意選択で、該ＩＣＤが、Ｇ－ＣＳＦＲ及びｇｐ１３０からなる群より選択されるタンパク質のＢｏｘ１領域及びＢｏｘ２領域を含み；任意選択で、該キメラ受容体が、Ｇ－ＣＳＦＲ、ｇｐ１３０（糖タンパク質１３０）、及びＩＬ－２Ｒβからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む第３のドメインを含み、任意選択で、該膜貫通ドメインが、野生型膜貫通ドメインである。特定の実施形態では、Ｇ－ＣＳＦＲのＥＣＤは、配列番号５または６に記載の核酸配列によってコードされる。特定の実施形態では、核酸は、
（ａ）配列番号１６、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、もしくは３９のアミノ配列を有するＩＬ－２ＲβのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｃ）配列番号２５もしくは２７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２１ＲのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｄ）配列番号２３、３２、もしくは２６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２Ｒβ２のＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｅ）配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、４０、もしくは４２のアミノ酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｆ）配列番号１８もしくは３８のアミノ酸配列を有するｇｐ１３０のＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｇ）配列番号４３のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ＲγｃのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、を含む。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のキメラ受容体をコードする核酸を含む発現ベクターについて記載する。特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びプラスミドからなる群より選択される。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、キメラ受容体をコードする核酸であって、該キメラ受容体が、第２のドメインに作動可能に連結されたＧ－ＣＳＦＲのＥＣＤを含み、該第２のドメインが、
（ｉ）
（ａ）ｇｐ１３０の膜貫通ドメインと、
（ｂ）ｇｐ１３０のＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－１２Ｒβ２のＣ末端領域、または、
（ｉｖ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２１ＲのＣ末端領域、または、
（ｖ）
（ａ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃの膜貫通ドメインと、
（ｂ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＣ末端領域、または、
（ｖｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－７ＲαのＣ末端領域
を含む、キメラ受容体をコードする核酸である。特定の実施形態では、Ｇ－ＣＳＦＲのＥＣＤは、配列番号５または６に記載の核酸配列によってコードされる。特定の実施形態では、核酸は、
（ａ）配列番号１６、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、もしくは３９のアミノ配列を有するＩＬ－２ＲβのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｃ）配列番号２５もしくは２７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２１ＲのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｄ）配列番号２３、３２、もしくは２６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２Ｒβ２のＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｅ）配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、４０、もしくは４２のアミノ酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｆ）配列番号１８もしくは３８のアミノ酸配列を有するｇｐ１３０のＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｇ）配列番号４３のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ＲγｃのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、を含む。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びプラスミドからなる群より選択される。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、キメラ受容体をコードする核酸を含む細胞であって、該キメラ受容体が、（ａ）第２のドメインに作動可能に連結したＧ－ＣＳＦＲ（顆粒球コロニー刺激因子受容体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み；該第２のドメインが、（ｂ）ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体）、ＩＬ－１２Ｒ（インターロイキン－１２受容体）、及びＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）からなる群より選択されるマルチサブユニットサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の少なくとも一部を含み、任意選択で、該ＩＬ－２ＲがＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγｃからなる群より選択され、任意選択で、該第２のドメインがＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－１２Ｒβ２、またはＩＬ－２１ＲのＣ末端領域の少なくとも一部を含み；該サイトカイン受容体のＩＣＤの少なくとも一部が、サイトカイン受容体の細胞内ドメインの少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含み、任意選択で、該ＩＣＤが、Ｇ－ＣＳＦＲのＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＨＰ－２結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＨＣ結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ１結合部位；ＩＬ－７ＲαのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－７Ｒαのホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ４結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ３結合部位；及びＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ１結合部位からなる群より選択される少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含み；任意選択で、該ＩＣＤが、Ｇ－ＣＳＦＲ及びｇｐ１３０からなる群より選択されるタンパク質のＢｏｘ１領域及びＢｏｘ２領域を含み；任意選択で、該キメラ受容体が、Ｇ－ＣＳＦＲ、ｇｐ１３０（糖タンパク質１３０）、及びＩＬ－２Ｒβからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む第３のドメインを含み、任意選択で、該膜貫通ドメインが、野生型膜貫通ドメインであり；任意選択で、
該細胞が、免疫細胞、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞が幹細胞であり、任意選択で、該細胞が初代細胞であり、任意選択で、該細胞がヒト細胞である、キメラ受容体をコードする核酸を含む細胞である。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、キメラ受容体をコードする核酸を含む細胞であって、該キメラ受容体が、第２のドメインに作動可能に連結されたＧ－ＣＳＦＲのＥＣＤを含み、該第２のドメインが、
（ｉ）
（ａ）ｇｐ１３０の膜貫通ドメインと、
（ｂ）ｇｐ１３０のＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－１２Ｒβ２のＣ末端領域、または、
（ｉｖ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２１ＲのＣ末端領域、または、
（ｖ）
（ａ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃの膜貫通ドメインと、
（ｂ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＣ末端領域、または、
（ｖｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－７ＲαのＣ末端領域
を含み；任意選択で、該細胞が、免疫細胞、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞が幹細胞であり、任意選択で、該細胞が初代細胞であり、任意選択で、該細胞がヒト細胞である、キメラ受容体をコードする核酸を含む細胞である。
特定の実施形態では、Ｇ－ＣＳＦＲのＥＣＤは、配列番号５または６に記載の配列を有する細胞に含まれる核酸によってコードされる。特定の実施形態では、核酸は、
（ａ）配列番号１６、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、もしくは３９のアミノ配列を有するＩＬ－２ＲβのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｃ）配列番号２５もしくは２７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２１ＲのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｄ）配列番号２３、３２、もしくは２６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２Ｒβ２のＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｅ）配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、４０、もしくは４２のアミノ酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｆ）配列番号１８もしくは３８のアミノ酸配列を有するｇｐ１３０のＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｇ）配列番号４３のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、または
（ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ＲγｃのＩＣＤの少なくとも一部をコードする配列、を含む細胞によって構成される。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載の発現ベクターを含む細胞であり、任意選択で、該細胞は免疫細胞、任意選択で、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。特定の態様では、本明細書に記載されるのは、請求項１に記載のキメラ受容体を含む細胞であり、任意選択で、該細胞は免疫細胞、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞は幹細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載のキメラ受容体を含む細胞であり、任意選択で、該細胞は免疫細胞、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞は幹細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、細胞の表面上に発現したキメラ受容体を選択的に活性化させる方法であって、キメラ受容体を選択的に活性化させるＧ－ＣＳＦとキメラ受容体を接触させることを含み；該キメラ受容体が、（ａ）第２のドメインに作動可能に連結したＧ－ＣＳＦＲ（顆粒球コロニー刺激因子受容体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み；該第２のドメインが、（ｂ）ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体）、ＩＬ－１２Ｒ（インターロイキン－１２受容体）、及びＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）からなる群より選択されるマルチサブユニットサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の少なくとも一部を含み、任意選択で、該ＩＬ－２ＲがＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγｃからなる群より選択され、任意選択で、該第２のドメインがＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－１２Ｒβ２、またはＩＬ－２１ＲのＣ末端領域の少なくとも一部を含み；該サイトカイン受容体のＩＣＤの少なくとも一部が、サイトカイン受容体の細胞内ドメインの少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含み、任意選択で、該少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位が、Ｇ－ＣＳＦＲのＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＨＰ－２結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＨＣ結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ１結合部位；ＩＬ－７ＲαのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－７Ｒαのホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ４結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ３結合部位；及びＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ１結合部位からなる群より選択され；任意選択で、該ＩＣＤが、Ｇ－ＣＳＦＲ及びｇｐ１３０からなる群より選択されるタンパク質のＢｏｘ１領域及びＢｏｘ２領域を含み；任意選択で、該キメラ受容体が、Ｇ－ＣＳＦＲ、ｇｐ１３０（糖タンパク質１３０）、及びＩＬ－２Ｒβからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む第３のドメインを含み、任意選択で、該膜貫通ドメインが、野生型膜貫通ドメインである、キメラ受容体を選択的に活性化させる方法である。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、細胞の表面上に発現したキメラ受容体を選択的に活性化させる方法であって、キメラ受容体を該キメラ受容体を選択的に活性化させるＧ－ＣＳＦと接触させることを含み；該キメラ受容体が、第２のドメインに作動可能に連結されたＧ－ＣＳＦＲのＥＣＤを含み；該第２のドメインが、
（ｉ）
（ａ）ｇｐ１３０の膜貫通ドメインと、
（ｂ）ｇｐ１３０のＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－１２Ｒβ２のＣ末端領域、または、
（ｉｖ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２１ＲのＣ末端領域、または、
（ｖ）
（ａ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃの膜貫通ドメインと、
（ｂ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＣ末端領域、または、
（ｖｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－７ＲαのＣ末端領域
を含む、キメラ受容体を選択的に活性化させる方法である。
本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、活性化キメラ受容体はホモ二量体を形成し、任意選択で、該キメラ受容体の活性化により、該キメラ受容体を発現する細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答が引き起こされ；任意選択で、該キメラ受容体はＧ－ＣＳＦとの接触により活性化され、任意選択で、該Ｇ－ＣＳＦは野生型Ｇ－ＣＳＦであり、任意選択で、該Ｇ－ＣＳＦＲの細胞外ドメインは野生型細胞外ドメインであり；該キメラ受容体は、細胞、任意選択で免疫細胞、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞において発現され、任意選択で、該細胞は幹細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である。
本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、キメラ受容体は、
（ａ）配列番号１６、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、もしくは３９のアミノ配列を有するＩＬ－２ＲβのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｃ）配列番号２５もしくは２７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２１ＲのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｄ）配列番号２３、３２、もしくは２６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２Ｒβ２のＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｅ）配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、４０、もしくは４２のアミノ酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｆ）配列番号１８もしくは３８のアミノ酸配列を有するｇｐ１３０のＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｇ）配列番号４３のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ＲγｃのＩＣＤの少なくとも一部を含み；膜貫通ドメインは、（ａ）配列番号８、または（ｂ）配列番号９、または（ｃ）配列番号１０、または（ｄ）配列番号１１に記載の配列を含む。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、細胞においてキメラ受容体を産生する方法であって、請求項１３～１６もしくは１９～２２のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１７、１８、２３、もしくは２４のいずれか一項に記載の発現ベクターを細胞に導入することを含み；任意選択で、該方法が遺伝子編集を含み；任意選択で、該細胞が、免疫細胞、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である、細胞においてキメラ受容体を産生する方法である。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるのは、治療を必要とする対象を治療する方法であって、該対象にキメラ受容体を発現する細胞を注入することと、該キメラ受容体に結合するサイトカインを投与することと、を含み；該キメラ受容体が、（ａ）第２のドメインに作動可能に連結したＧ－ＣＳＦＲ（顆粒球コロニー刺激因子受容体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み；該第２のドメインが、（ｂ）ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体）、ＩＬ－１２Ｒ（インターロイキン－１２受容体）、及びＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）からなる群より選択されるマルチサブユニットサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の少なくとも一部を含み、任意選択で、該ＩＬ－２ＲがＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγｃからなる群より選択され、任意選択で、該第２のドメインがＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－１２Ｒβ２、またはＩＬ－２１ＲのＣ末端領域の少なくとも一部を含み；該サイトカイン受容体のＩＣＤの少なくとも一部が、サイトカイン受容体の細胞内ドメインの少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含み、任意選択で、該ＩＣＤが、Ｇ－ＣＳＦＲのＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＨＰ－２結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＨＣ結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ１結合部位；ＩＬ－７ＲαのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－７Ｒαのホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ４結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ３結合部位；及びＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ１結合部位からなる群より選択される少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含み；任意選択で、該ＩＣＤが、Ｇ－ＣＳＦＲ及びｇｐ１３０からなる群より選択されるタンパク質のＢｏｘ１領域及びＢｏｘ２領域を含み；任意選択で、該キメラ受容体が、Ｇ－ＣＳＦＲ、ｇｐ１３０（糖タンパク質１３０）、及びＩＬ－２Ｒβからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む第３のドメインを含み、任意選択で、該膜貫通ドメインが、野生型膜貫通ドメインである、治療を必要とする対象を治療する方法である。
特定の態様では、本明細書に記載されるのは、治療を必要とする対象を治療する方法であって、該対象にキメラ受容体を発現する細胞を注入することと、該キメラ受容体に結合するサイトカインを投与することと、を含み；該キメラ受容体が、第２のドメインに作動可能に連結されたＧ－ＣＳＦＲのＥＣＤを含み；該第２のドメインが、
（ｉ）
（ａ）ｇｐ１３０の膜貫通ドメインと、
（ｂ）ｇｐ１３０のＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２ＲβのＣ末端領域、または、
（ｉｉｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－１２Ｒβ２のＣ末端領域、または、
（ｉｖ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２１ＲのＣ末端領域、または、
（ｖ）
（ａ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃの膜貫通ドメインと、
（ｂ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－２Ｒβ＋γｃのＣ末端領域、または、
（ｖｉ）
（ａ）Ｇ－ＣＳＦＲの膜貫通ドメインと、
（ｂ）Ｇ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域と、
（ｃ）ＩＬ－７ＲαのＣ末端領域
を含む、治療を必要とする対象を治療する方法である。
本方法の特定の実施形態では、活性化キメラ受容体はホモ二量体を形成し、任意選択で、該キメラ受容体の活性化により、該キメラ受容体を発現する細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答が引き起こされ；任意選択で、該キメラ受容体はＧ－ＣＳＦとの接触により活性化され；任意選択で、該Ｇ－ＣＳＦは野生型Ｇ－ＣＳＦであり；任意選択で、該Ｇ－ＣＳＦＲの細胞外ドメインは野生型細胞外ドメインであり；該キメラ受容体は、細胞において発現され；任意選択で、該細胞は、免疫細胞、任意選択でＴ細胞、任意選択でＮＫ細胞、任意選択でＮＫＴ細胞、任意選択でＢ細胞、任意選択で形質細胞、任意選択でマクロファージ、任意選択で樹状細胞であり、任意選択で、該細胞は幹細胞であり、任意選択で、該細胞は初代細胞であり、任意選択で、該細胞はヒト細胞である。特定の実施形態では、キメラ受容体は、任意選択で、
（ａ）配列番号１６、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、もしくは３９のアミノ配列を有するＩＬ－２ＲβのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｃ）配列番号２５もしくは２７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２１ＲのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｄ）配列番号２３、３２、もしくは２６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２Ｒβ２のＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｅ）配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、４０、もしくは４２のアミノ酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｆ）配列番号１８もしくは３８のアミノ酸配列を有するｇｐ１３０のＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｇ）配列番号４３のアミノ酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部、または
（ｈ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ＲγｃのＩＣＤの少なくとも一部を含み；膜貫通ドメインは、（ａ）配列番号８、または（ｂ）配列番号９、または（ｃ）配列番号１０、または（ｄ）配列番号１１に記載の配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、がんを治療するために使用される。特定の実施形態では、本方法は、自己免疫疾患を治療するために使用される。特定の実施形態では、本方法は、炎症状態を治療するために使用される。特定の実施形態では、本方法は、移植片拒絶反応を予防及び治療するために使用される。特定の実施形態では、本方法は、感染症を治療するために使用される。特定の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの追加の活性剤を投与することをさらに含み、任意選択で、追加の活性剤は追加のサイトカインである。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ｉ）免疫細胞を含有する試料を単離することと、（ｉｉ）キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列を免疫細胞に形質導入またはトランスフェクトすることと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）の免疫細胞を対象に投与または注入することと、（ｉｖ）免疫細胞をキメラ受容体に結合するサイトカインと接触させることと、を含む。特定の実施形態では、対象は、細胞を対象に投与または注入する前に、免疫除去治療を受けている。特定の実施形態では、免疫細胞を含有する試料は、細胞を投与または注入される対象から単離される。特定の実施形態では、免疫細胞は、該細胞が対象に投与または注入される前に、インビトロでサイトカインと接触させられる。特定の実施形態では、免疫細胞は、キメラ受容体に結合するサイトカインと、該キメラ受容体からのシグナル伝達を活性化させるのに十分な時間、接触させられる、
本明細書に記載されているのは、治療を必要とする対象を治療するためのキットであって、本明細書に記載のキメラ受容体をコードし、任意選択で免疫細胞である、細胞と、使用説明書と、を含み、任意選択で、該キットが、該キメラ受容体に結合するサイトカインを含む、キットである。本明細書に記載されているのは、細胞上で発現するキメラ受容体を作製するためのキットであって、本明細書に記載のキメラ受容体をコードする発現ベクターと、使用説明書と、を含み、任意選択で、該キットが、該キメラ受容体に結合するサイトカインを含む、キットである。
本明細書に記載されているのは、細胞上で発現するキメラ受容体を作製するためのキットであって、本明細書に記載のキメラ受容体をコードする発現ベクターを含み、任意選択で細菌細胞である、細胞と、使用説明書と、を含み、任意選択で、該キットが、該キメラ受容体に結合するサイトカインを含む、キットである。
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明、及び添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。
２：２のＧ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲヘテロ二量体複合体のサイトＩＩ及びＩＩＩ界面の構造を示す図である。
Ｇ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ界面デザインに使用される戦略を概説する図である。
サイトＩＩ界面相互作用のエネルギー成分を示すグラフである。
サイトＩＩ界面の構造と、Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）のＡｒｇ１６７（左）及びＡｒｇ１４１（右）とサイトＩＩ界面のＧ－ＣＳＦ残基との相互作用を示す図である。
サイトＩＩにおける野生型Ｇ－ＣＳＦを示す図（左）及びサイトＩＩデザイン＃３５の三重のＺｙｍｅＣＡＤ（商標）平均場パックの同じ領域の重ね合わせ（右）である。
Ｇ－ＣＳＦデザイン＃：６、７、８、９、１５、１７、３０、３４、３５、及び３６（上パネル）と、共発現及び精製サイトＩＩデザイン複合体＃：６、７、８、９、１５、１７、３０、３４、３５、及び３６（下パネル）（第１レーンＷＴ Ｇ－ＣＳＦ対照、第２レーンＷＴ Ｇ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）対照）のＧ－ＣＳＦプルダウンアッセイの結果を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像である。
ＷＴ－Ｇ－ＣＳＦＲと共発現させたＧ－ＣＳＦデザイン＃：６、７、８、９、１５、１７、３０、３４、３５、及び３６のＧ－ＣＳＦプルダウンアッセイ（上パネル）と、Ｇ－ＣＳＦＲデザイン＃：６、７、８、９、１５、１７、３０、３４、３５、及び３６と共発現させたＷＴ Ｇ－ＣＳＦのＧ－ＣＳＦプルダウンアッセイ（下パネル、第１レーンＷＴ：ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲプルダウン対照）の結果を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像である。
サイトＩＩＩ界面相互作用のエネルギー成分を示すグラフである。
サイトＩＩＩ界面の構造と、Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）のＲ４１（左）及びＥ９３（右）とサイトＩＩＩ界面のＧ－ＣＳＦ残基との相互作用を示す図である。
デザイン＃４０１及び４０２のＧ－ＣＳＦプルダウンアッセイの結果（上パネル）と、共発現し精製したサイトＩＩ／ＩＩＩデザイン複合体＃４０１及び４０２（ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲと、デザイン＃４０１及び４０２ Ｇ－ＣＳＦＲと共発現させたＷＴ Ｇ－ＣＳＦのプルダウン）のＧ－ＣＳＦプルダウンアッセイの結果（下パネル）を示し、第１レーンがＷＴ Ｇ－ＣＳＦ対照、第２レーンがＷＴ Ｇ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）対照である、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像である。
ＴＥＶ切断後のＷＴ（ＳＸ７５）Ｇ－ＣＳＦと、デザイン１３０（ＳＸ７５）、３０３（ＳＸ２００）、及び４０１（ＳＸ２００）Ｇ－ＣＳＦＥ変異体のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示すグラフである。
ＴＥＶ切断後のＷＴ（ＳＸ７５）と、精製デザイン４０１（ＳＸ２００）及び４０２（ＳＸ２００）Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅ変異体のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示すグラフである。
ＷＴ、デザイン＃１３０、＃４０１、＃４０２ Ｇ－ＣＳＦの、それらの同族またはミスペアリングＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）への結合についての結合ＳＰＲセンサーグラムを示すグラフである。各Ｇ－ＣＳＦ対Ｇ－ＣＳＦＲペアは、各パネルの下に表記される。デザイン＃４０１及び＃４０２の同族ペアについてのＫＤを導出するために使用される代表的な定常状態での適合は、それぞれのセンサーグラムの下に示される。
左上パネル：ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ、デザイン＃１３０及び＃１３４ Ｇ－ＣＳＦＥのＤＳＣサーモグラム；右上パネル：ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）、デザイン＃１３０及び＃１３４ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）ＥのＤＳＣサーモグラム；左下パネル：デザイン＃４０１及び＃４０２ Ｇ－ＣＳＦＥのＤＳＣサーモグラム；右下パネル：デザイン＃３００、＃３０３、＃３０４及び＃３０７ Ｇ－ＣＳＦＥのＤＳＣサーモグラムを示すグラフである。
Ａ）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒｂ（ホモ二量体）またはＢ）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒｂ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｃ（ヘテロ二量体）を発現する増殖３２Ｄ－ＩＬ－２ＲβＩＬ２Ｒｂ細胞を示すブロモ－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイの結果を示すグラフである。細胞は、サイトカインなし、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、またはＧ－ＣＳＦＷＴ（Ａでは１００ｎｇ／ｍｌ、Ｂでは３０ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。
Ａ）Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒｂ（ホモ二量体）またはＢ）Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤＩＬ－２Ｒｂ＋Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｃ（ヘテロ二量体）を発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞の増殖を示すＢｒｄＵアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、サイトカインなし、ＩＬ－２（３００ＩＵＩＵＩＵ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇｎｇｎｇ／ｍｌ）、またはＧ－ＣＳＦＲ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。
Ａ）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒｂ（ホモ二量体）またはＢ）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒｂ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｃ（ヘテロ二量体）を発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞の増殖を示すＢｒｄＵアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、サイトカインなし、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）、またはＧ－ＣＳＦＲ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。
Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒｂ（ホモ二量体）、Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒｂ（ホモ二量体）、Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒｂ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｃ（ヘテロ二量体）、またはＧ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤＩＬ－２Ｒｂ＋Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｃ（ヘテロ二量体）を発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞のシグナル伝達を示すウエスタンブロットである。細胞は、サイトカインなし、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）、またはＧ－ＣＳＦＲ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。
サイトカインなし、ＩＬ－２、またはＷＴ、１３０、３０４、または３０７サイトカインでの刺激に応答して、示されたキメラ受容体を発現する初代マウスＴ細胞（または非形質導入細胞）の細胞周期の進行を評価するＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフである。Ａ及びＢは、反復実験を表す。
天然型ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγｃ、及びＧ－ＣＳＦＲサブユニットと、Ｇ２Ｒ－１受容体サブユニットデザインの概略図である。
示されたＧ－ＣＳＦＲキメラ受容体サブユニットを発現し、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、またはサイトカインなしで刺激された３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞（ヒトＩＬ－２Ｒβサブユニットを安定して発現する３２Ｄ細胞株）の増殖（細胞数の倍数変化）を示すグラフを表す。Ｇ／γｃは、そのＮ末端にＭｙｃエピトープをタグ付けされ（Ｍｙｃ／Ｇ／γｃ）、Ｇ／ＩＬ－２Ｒβは、そのＮ末端にＦｌａｇエピトープをタグ付けされ（Ｆｌａｇ／Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ）；これらのエピトープタグは、フローサイトメトリーによる検出を補助し、受容体の機能には影響を与えない。さらに、Ｂ～Ｄの下パネルは、各培養条件下でＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを発現する細胞の割合（％Ｇ－ＣＳＦＲ＋）を示す。四角は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。三角は、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。円は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。
Ｆｌａｇタグ付きＧ／ＩＬ－２Ｒβサブユニットのみ、Ｍｙｃタグ付きＧ／γｃサブユニットのみ、または全長Ｇ－ＣＳＦＲを発現するヒトＴ細胞の増殖（細胞数の倍数変化）を示すグラフを表す。Ａ～Ｄ）ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞；Ｅ～Ｈ）腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）。四角は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。三角は、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。円は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。
天然型受容体及びキメラ受容体の概略図であり、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、Ｓｈｃ、ＳＨＰ－２、及びＰＩ３Ｋ結合サイトを示す。影付きのスキームには、図１の受容体が含まれる。
キメラ受容体の概略図であり、Ｊａｋ、ＳＴＡＴ、Ｓｈｃ、ＳＨＰ－２、及びＰＩ３Ｋ結合サイトを示す。影付きのスキームには、図１及び４の受容体が含まれる。
Ｇ２Ｒ－２ ｃＤＮＡインサートを含有するレンチウイルスプラスミドの図である。
Ｇ２Ｒ－２で形質導入された細胞のフローサイトメトリーによって評価されたＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を示すグラフを表す。Ａ）３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞株；Ｂ）ＰＢＭＣ由来ヒトＴ細胞及びヒト腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）。
非形質導入細胞と比較したＧ２Ｒ－２を発現する細胞の増殖（細胞数の倍数変化）を示すグラフを表す。Ａ）ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞；Ｂ、Ｃ）２つの独立した実験からのヒト腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）。四角は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。三角は、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。円は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。
非形質導入細胞と比較したＧ２Ｒ－２を発現するＣＤ４またはＣＤ８選択ヒト腫瘍関連リンパ球の増殖（細胞数の倍数変化）を示すグラフを表す。Ａ）非形質導入ＣＤ４選択細胞；Ｂ）非形質導入ＣＤ８選択細胞；Ｃ）Ｇ２Ｒ－２で形質導入されたＣＤ４選択細胞；Ｄ）Ｇ２Ｒ－２で形質導入されたＣＤ８選択細胞。灰色の点線は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。黒の実線は、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。灰色の破線は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。
Ｇ２Ｒ－２を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋腫瘍関連リンパ球の増殖（細胞数の倍数変化）を示すグラフを表す。示されているように、細胞を最初にＧ－ＣＳＦまたはＩＬ－２において増殖した。次に、細胞を、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦ、または培地のみでプレーティングした。灰色の実線は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。灰色の実線は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。黒の実線は、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。薄い灰色の破線は、ＩＬ－２で増殖し、培地のみで刺激された細胞を表す。濃い灰色の破線は、Ｇ－ＣＳＦで増殖し、培地のみで刺激された細胞を表す。
Ｇ－ＣＳＦまたはＩＬ－２で増殖させた後の、Ｇ２Ｒ－２キメラ受容体構築物を発現するＣＤ４またはＣＤ８選択腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）と非形質導入細胞の免疫表現型（フローサイトメトリーによる）を示すグラフを表す。Ａ）ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞表面の表現型を示す生細胞の割合（％）。Ｂ）ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７発現に基づいた、示された細胞表面の表現型を示す生細胞の割合（％）。
Ｇ２Ｒ－２を発現する初代ヒトＴ細胞と非形質導入細胞の増殖を評価するためのＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフを表す。Ｔ細胞は、アッセイの前に、示されているように、ＩＬ－２またはＧ－ＣＳＦでの培養によって選択された。Ａ）腫瘍関連リンパ球；Ｂ）ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞。
Ｇ２Ｒ－２または一本鎖Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ（Ｇ２Ｒ－１の構成要素）を発現する初代マウスＴ細胞とモック形質導入細胞の増殖を評価するためのＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフを表す。Ａ）示されたサイトカインでの培養後、Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを発現する細胞の割合（％）（フローサイトメトリーによる）で反映される形質導入効率；Ｂ）示されたサイトカインに応答したすべての生細胞におけるＢｒｄＵ取り込みの割合（％）；Ｃ）Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを発現する細胞（Ｇ－ＣＳＦＲ＋細胞）によるＢｒｄＵ取り込みの割合（％）。すべての細胞を、アッセイ前にＩＬ－２で３日間増殖させた。四角は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。三角は、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。円は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。
Ｇ２Ｒ－２を発現するヒト初代Ｔ細胞と非形質導入細胞における、示されたサイトカインシグナル伝達イベントを検出するためのウエスタンブロットを表す。β－アクチン、総Ａｋｔ、及びヒストンＨ３は、タンパク質ローディング対照として機能する。Ａ、Ｂ）腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）；Ｃ）ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞。
Ｇ２Ｒ－２または一本鎖Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ（Ｇ２Ｒ－１由来）を発現する初代マウスＴ細胞とモック形質導入細胞における示されたサイトカインシグナル伝達イベントを検出するためのウエスタンブロットを表す。矢印は、特異的なｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ２バンドを示し、他のより大きなバンドは、初代抗ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ２抗体とｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ１の交差反応性の結果であると推定される。β－アクチン及びヒストンＨ３はタンパク質ローディング対照として機能する。
サイトカインなし、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）、またはＷＴ Ｇ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）、または１３０ Ｇ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）での刺激に応答して、示されたキメラ受容体を発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞（または非形質導入細胞）の細胞周期の進行を評価するＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフである。
サイトカインなし、ＩＬ－２、またはＷＴ、１３０、３０４、または３０７サイトカインでの刺激に応答して、示されたキメラ受容体を発現する初代マウスＴ細胞（または非形質導入細胞）の細胞周期の進行を評価するＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフである。Ａ及びＢは、反復実験を表す。
サイトカインなし、ＩＬ－２、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ、または１３０ Ｇ－ＣＳＦでの刺激に応答して、示されたキメラ受容体サブユニットを発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞（または非形質導入細胞）における示されたサイトカインシグナル伝達イベントを検出するためのウエスタンブロットを表す。β－アクチン及びヒストンＨ３は、タンパク質ローディング対照として機能する。
Ａ）サイトカインなし、ＩＬ－２、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ、１３０ Ｇ－ＣＳＦ、または３０４ Ｇ－ＣＳＦでの刺激に応答して、示されたキメラ受容体サブユニットを発現する初代マウスＴ細胞における示されたサイトカインシグナル伝達イベントを検出するためのウエスタンブロットを表す。β－アクチン及びヒストンＨ３は、タンパク質ローディング対照として機能する。Ｂ）ヒトＧ－ＣＳＦ受容体の細胞外ドメインに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価された、パネルＡで使用された細胞の形質導入効率を表す。
示されたキメラ受容体構築物で形質導入された初代ヒト腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）におけるフローサイトメトリーによるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を示すプロットを表す。生きているＣＤ３＋、ＣＤ５６－細胞を、ＣＤ８またはＣＤ４でゲートし、Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を各集団について示す。
Ｇ２Ｒ－３を発現する初代ヒト腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）と非形質導入細胞の拡大増殖、増殖、及びシグナル伝達を示すグラフ及び画像を表す。Ａ）細胞にＧ２Ｒ－３をコードするレンチウイルスを形質導入し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしで再プレーティングした、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示すグラフ。生細胞は３～４日ごとに計数した。四角は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。三角は、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。円は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。Ｂ）細胞内シグナル伝達イベントを評価するためのウエスタンブロット。細胞を増殖アッセイから回収し、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）または野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。矢印は、１２５ｋＤａでの特異的なｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ２バンドを示し；より大きなバンドは、初代抗ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ２抗体とｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ１の交差反応性の結果であると推定される。β－アクチン及びヒストンＨ３はタンパク質ローディング対照として機能する。Ｃ）Ｔ細胞増殖を評価するためのＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフ。細胞を増殖アッセイから回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしにおいて再プレーティングした。
ＷＴ ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－３を発現する初代ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と非形質導入細胞の増殖倍率とＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を示すグラフを表す。Ａ）細胞にＧ２Ｒ－３をコードするレンチウイルスを形質導入した、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示すグラフ。１日目に、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはサイトカインなし（培地のみ）を培養液に添加した。その後、２１日目まで、細胞に、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦを含有するか、またはサイトカインを含まない培地を補充した。増殖の２１日目に、細胞を洗浄し、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－７（２０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－１５（２０ｎｇ／ｍＬ）、またはサイトカインなしで再プレーティングした。生細胞は２～４日ごとに計数した。四角は、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。三角は、Ｇ－ＣＳＦで刺激され、２１日目にＩＬ－７及びＩＬ－１５で再プレーティングされた細胞を表す。円は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。ひし形は、Ｇ－ＣＳＦで刺激され、２１日目に培地のみで再プレーティングされた細胞を表す。Ｂ）増殖の２１日目または４２日目に、フローサイトメトリーによって測定されたＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤの発現を示すグラフ。
Ｇ２Ｒ－３を発現する初代ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と非形質導入細胞の細胞内シグナル伝達及び免疫表現型を示すグラフを表す。Ａ）細胞内シグナル伝達イベントを評価するためのウエスタンブロット。細胞を増殖アッセイから回収し、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）または野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。β－アクチンはタンパク質ローディング対照として機能する。Ｂ、Ｃ）増殖の４２日目に、Ｇ２Ｒ－３を発現する細胞と非形質導入細胞の、フローサイトメトリーによって評価された免疫表現型を示す代表的なフローサイトメトリープロット及びグラフ。
３０４または３０７ ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－３を発現する初代ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と非形質導入細胞の増殖倍率を示すグラフを表す。Ａ）細胞にＧ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤをコードするレンチウイルスを形質導入した、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示すグラフ。Ｂ）細胞にＧ２Ｒ－３ ３０７ ＥＣＤをコードするレンチウイルスを形質導入した、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示すグラフ。Ｃ）非形質導入細胞を用いたＴ細胞増殖アッセイの結果を示すグラフ。２日目に、示されたように、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）、３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０７ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、またはサイトカインなし（培地のみ）を培養液に添加し、その後２日ごとに補充した。生細胞は３～４日ごとに計数した。ひし形は、３０４ Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。四角は、３０７ Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。三角は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。逆三角形は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。
３０４または３０７ ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－３を発現する初代ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と非形質導入細胞の増殖を評価するためのＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフを表す。細胞に、Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤまたは３０７ ＥＣＤをコードするレンチウイルスを形質導入し、３０４または３０７ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）において増殖させた。非形質導入細胞は、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）において増殖させた。増殖の１２日目に、細胞を洗浄し、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、１３０ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０７ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしで再プレーティングした。
示されたキメラ受容体構築物で形質導入された初代マウスＴ細胞におけるフローサイトメトリーによるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を示すグラフを表す。
Ｇ２１Ｒ－１またはＧ２１Ｒ－２を発現する初代ＰＢＭＣ由来ヒトＴ細胞におけるＳＴＡＴ３のＧ－ＣＳＦ誘導性リン酸化（フローサイトメトリーにより検出）を示す。細胞は、Ｇ－ＣＳＦＲ陽性（上パネル）またはＧ－ＣＳＦＲ陰性（下パネル）の集団に細分化された（すなわち、ゲートされた）。
Ｇ２１Ｒ－１またはＧ１２Ｒ－１を発現する初代マウスＴ細胞におけるＧ－ＣＳＦ誘導性生化学的シグナル伝達イベントを示すグラフ及び画像を表す。Ａ）Ｇ２１Ｒ－１で形質導入され、サイトカインなし、ＩＬ－２１、またはＧ－ＣＳＦで刺激されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を示すグラフ（フローサイトメトリーにより検出）。Ｂ）サイトカインなし（黒丸）、ＩＬ－２１（四角）、またはＷＴ Ｇ－ＣＳＦ（灰色丸）で刺激した後、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３に対して陽性に染色された細胞の割合（％）を示すグラフ。生細胞は、ＣＤ８またはＣＤ４でゲートされ、各集団についてｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３陽性細胞の割合（％）が示されている。Ｃ）Ｇ２１Ｒ－１またはＧ１２Ｒ－１を発現し、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、またはＷＴ Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞における、示されたサイトカインシグナル伝達イベントを評価するためのウエスタンブロット。β－アクチン及びヒストンＨ３は、タンパク質ローディング対照として機能する。
Ｇ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１、及びＧ２７／２Ｒ－１を発現する初代マウスＴ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞の増殖を示すグラフを表す。Ａ、Ｂ）Ｔ細胞増殖を評価するためのＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフ。細胞を回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしにおいて再プレーティングした。パネルＡ及びＢは、反復実験を表す。 Ｇ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１、及びＧ２７／２Ｒ－１を発現する初代マウスＴ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞の増殖を示すグラフを表す。Ａ、Ｂ）Ｔ細胞増殖を評価するためのＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフ。細胞を回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしにおいて再プレーティングした。パネルＡ及びＢは、反復実験を表す。 Ｇ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１、及びＧ２７／２Ｒ－１を発現する初代マウスＴ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞におけるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を示すグラフを表す。Ｃ）示されたキメラ受容体構築物で形質導入された初代マウスＴ細胞におけるフローサイトメトリーによるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を示すグラフ。 Ｇ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１、及びＧ２７／２Ｒ－１を発現する初代マウスＴ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞におけるＷＴ Ｇ－ＣＳＦ誘導性細胞内シグナル伝達イベントを示す画像を表す。Ｄ）Ｇ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１及びＧ２７／２Ｒ－１を発現する細胞、またはモック形質導入Ｔ細胞における示されたサイトカインシグナル伝達イベントを評価するためのウエスタンブロット。細胞をＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２７（５０ｎｇ／ｍＬ）、またはＧ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。β－アクチン及びヒストンＨ３はタンパク質ローディング対照として機能する。
Ｇ２１／２Ｒ－１、Ｇ１２／２Ｒ－１、及び２１／１２／２Ｒ－１、またはモック形質導入Ｔ細胞を発現する初代マウスＴ細胞における増殖、Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現、及びＧ－ＣＳＦ誘導性生化学的シグナル伝達イベントを示すグラフ及び画像を表す。Ａ、Ｂ）Ｔ細胞増殖を評価するためのＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフ。細胞を回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしにおいて再プレーティングした。パネルＡ及びＢは、反復実験を表す。Ｃ）示されたキメラ受容体構築物で形質導入された初代マウスＴ細胞におけるフローサイトメトリーによるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を示すグラフ。Ｄ）Ｇ２１／２Ｒ－１、Ｇ１２／２Ｒ－１、及び２１／１２／２Ｒ－１を発現する細胞、またはモック形質導入Ｔ細胞における示されたサイトカインシグナル伝達イベントを評価するためのウエスタンブロット。細胞をＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、またはＧ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。β－アクチン及びヒストンＨ３はタンパク質ローディング対照として機能する。
１３４ ＥＣＤを有するＧ１２／２Ｒ－１を発現する初代ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と非形質導入細胞の増殖倍率とＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現を示すグラフを表す。Ａ）細胞にＧ１２／２Ｒ－１＿１３４－ＥＣＤをコードするレンチウイルスを形質導入し、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、１３０ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、または培地で増殖した、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示すグラフ。生細胞は４～５日ごとに計数した。四角は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。三角は、１３０ Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。ひし形は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。Ｂ）パネルＡのように細胞が形質導入されたＴ細胞増殖アッセイの結果を示すグラフ。増殖の１９日目に、細胞を洗浄し、ＩＬ－２、１３０ Ｇ－ＣＳＦ、または培地のみで再プレーティングした。生細胞は４～５日ごとに計数した。四角は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。薄い灰色のひし形は、１３０ Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。濃い灰色のひし形は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。薄い灰色の逆三角形は、最初にＩＬ－２で刺激され、その後１９日目に、培地のみで再プレーティングした細胞を表す。濃い灰色の三角形は、最初に１３０ Ｇ－ＣＳＦで刺激され、その後１９日目に、培地のみで再プレーティングした細胞を表す。Ｃ）増殖の４日目または１６日目に、フローサイトメトリーによって測定されたＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤの発現を示すグラフ。
１３４ ＥＣＤを有するＧ１２／２Ｒ－１を発現する初代ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と非形質導入細胞の増殖及び免疫表現型を示すグラフを表す。Ａ）Ｔ細胞増殖を評価するためのＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示すグラフ。細胞を回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ－２＋ＩＬ－１２（それぞれ、３００ＩＵ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍＬ）、１３０Ｇ－ＣＳＦ（３００ｎｇ／ｍｌ）、または培地のみで再プレーティングした。Ｂ、Ｃ）増殖の１６日目に、１３４ ＥＣＤを有するＧ１２／２Ｒ－１を発現する細胞と非形質導入細胞の、フローサイトメトリーによって評価された免疫表現型を示す代表的なフローサイトメトリープロット及びグラフ。
３０４ ＥＣＤを有するＧ１２／２Ｒ－１を発現する初代ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と非形質導入細胞の拡大増殖倍率及び増殖倍率を示すグラフを表す。Ａ）細胞にＧ１２／２Ｒ－１＿１３４－ＥＣＤをコードするレンチウイルスを形質導入し、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）、１３０ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、または培地のみで増殖した、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示すグラフ。非形質導入細胞は、ＩＬ－２、１３０ Ｇ－ＣＳＦ、３０４ Ｇ－ＣＳＦ、または培地のみで培養した。生細胞は３～４日ごとに計数した。逆三角形は、サイトカインで刺激されていない細胞を表す。三角は、ＩＬ－２で刺激された細胞を表す。丸は、１３０ Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。ひし形は、３０４ Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞を表す。Ｂ）１２日目に細胞を増殖アッセイから回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、１３０ Ｇ－ＣＳＦ（３００ｎｇ／ｍｌ）、３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０７ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、または培地のみで再プレーティングした。
３０４ ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－３、３０４ＥＣＤを有するＧ１２／２Ｒ－１、または非形質導入Ｔ細胞を発現する初代ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞において示されたサイトカインシグナル伝達イベントを検出するためのウエスタンブロットを表す。細胞を増殖アッセイから回収し、示されているように、３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２及びＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、または培地のみで刺激した。黒い矢印と右側の小さな出っ張ったパネルは、タンパク質ラダーの１１５ｋＤａ及び１４０ｋＤａでの分子量マーカーを示す。β－アクチン及びヒストンＨ３はタンパク質ローディング対照として機能する。
発明の詳細な説明
手短に言えば、以下でより詳細に説明するように、本明細書に記載されるのは、バリアントサイトカイン受容体及びサイトカインペアを用いた細胞の選択的活性化のための方法及び組成物であって、該サイトカイン受容体が、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ－ＣＳＦＲ）のバリアント細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、方法及び組成物である。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、養子細胞移植療法のための細胞の排他的活性化に有用である。したがって、本明細書に含まれるのは、その天然型受容体に結合しないサイトカインによって選択的に活性化されるバリアント受容体を発現する細胞を作製するための方法である。また、本明細書に開示されるのは、治療を必要とする対象を治療する方法であって、Ｇ－ＣＳＦＲのバリアントＥＣＤを含む受容体を発現する細胞を対象に投与することと、Ｇ－ＣＳＦＲのバリアントＥＣＤに結合するＧ－ＣＳＦのバリアントを共投与することと、を含む方法である。特定の態様では、本明細書に記載の組成物及び方法は、養子細胞移植法のための細胞の選択的活性化に対するアンメットニーズに対処し、養子細胞移植の前の対象の免疫除去の必要性またはＩＬ－２などの広範囲作用性刺激サイトカインを投与する必要性を減少または排除し得る。
定義
請求項及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載するように定義する。
「治療」という用語は、疾患状態、例えば、がんの疾患状態の治療における任意の治療的に有益な結果を意味し、その予防、重症度もしくは進行の軽減、寛解、または治癒を含む。
「インビボ」という用語は、生体内で発生するプロセスを指す。
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタを含むがこれらに限定されない。
「十分な量」という用語は、所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、細胞上で発現している受容体を選択的に活性化させるのに十分な量、を意味する。
「治療的有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療とみなすことができるため、治療的有効量は「予防的有効量」であることができる。
「作動可能に連結された」という用語は、それぞれ、別の核酸またはアミノ酸配列と機能的関係に置かれる核酸またはアミノ酸配列を指す。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結している核酸配列またはアミノ酸配列が連続的であること、及び分泌リーダーの場合、連続的であり、リーディング相にあることを意味する。
本明細書で使用される場合、「細胞外ドメイン」（ＥＣＤ）という用語は、細胞の表面上で発現するときの受容体（例えば、Ｇ－ＣＳＦＲ）の原形質膜の外部にあるドメインを指す。特定の実施形態では、Ｇ－ＣＳＦＲのＥＣＤは、配列番号２または配列番号７の少なくとも一部を含む。
本明細書で使用される場合、「細胞内ドメイン」（ＩＣＤ）という用語は、受容体が細胞表面上で発現するときの受容体の細胞内に位置するドメインを指す。
本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」（ＴＭＤまたはＴＭ）という用語は、受容体が細胞表面上で発現するときの細胞表面受容体の原形質膜内に位置するドメインまたは領域を指す。
「サイトカイン」という用語は、サイトカイン受容体に結合し、細胞上で発現するサイトカイン受容体に結合して活性化させると細胞シグナル伝達を誘発できる小タンパク質（約５～２０ｋＤａ）を指す。サイトカインの例には、インターロイキン、リンホカイン、コロニー刺激因子、及びケモカインが含まれるが、これらに限定されない。
「サイトカイン受容体」という用語は、１型及び２型サイトカイン受容体を含むサイトカインに結合する受容体を指す。サイトカイン受容体としては、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体）、ＩＬ－１２Ｒ（インターロイキン－１２受容体）、及びＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「キメラ受容体」という用語は、１つ以上の異なる膜貫通タンパク質または受容体の配列に由来する少なくとも１つのドメイン（例えば、ＥＣＤ、ＩＣＤ、ＴＭＤ、またはＣ末端領域）の少なくとも一部を有するように操作された膜貫通受容体を指す。
本明細書で使用される「サイトＩＩ界面」、「サイトＩＩ領域」、「サイトＩＩ界面領域」、または「サイトＩＩ」は、Ｇ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦＲとのＧ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ ２：２ヘテロ二量体結合界面のうち大きい方を意味し、Ｇ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦＲのサイトカイン受容体ホモログ（ＣＲＨ）ドメインと間の界面に位置する。
本明細書で使用される「サイトＩＩＩ界面」、「サイトＩＩＩ領域」、「サイトＩＩＩ界面領域」、または「サイトＩＩＩ」は、Ｇ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦＲとのＧ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ ２：２ヘテロ二量体結合界面のうち小さい方を意味し、Ｇ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦＲのＮ末端Ｉｇ様ドメインと間の界面に位置する。
本明細書で使用される「少なくとも一部」または「一部」という用語は、特定の態様では、本明細書に記載の配列番号の連続する核酸塩基またはアミノ酸の長さの７５％超、８０％超、９０％超、９５％超、９９％超を指す。特定の態様では、本明細書に記載されるドメインまたは結合部位（例えば、ＥＣＤ、ＩＣＤ、膜貫通、Ｃ末端領域、またはシグナル伝達分子結合部位）の少なくとも一部は、本明細書に記載の配列番号に対して７５％超、８０％超、９０％超、９５％超、９９％超、同一であり得る。
「野生型」という用語は、ポリペプチドの天然アミノ酸配列または本明細書に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の天然型核酸配列を指す。タンパク質または遺伝子の野生型配列は、そのタンパク質または遺伝子の種のポリペプチドまたは遺伝子の最も一般的な配列である。
「バリアントサイトカイン－受容体ペア」、「バリアントサイトカイン及び受容体ペア」、「バリアントサイトカイン及び受容体デザイン（複数可）」、「バリアントサイトカイン－受容体スイッチ」、または「直交サイトカイン－受容体ペア」という用語は、（ａ）天然型サイトカインまたは同族受容体に結合せず、（ｂ）対応する操作された（バリアント）リガンドまたは受容体に特異的に結合するようにアミノ酸を変化させることによって改変された遺伝子操作されたタンパク質のペアを指す。
本明細書で使用される「バリアント受容体」または「直交受容体」という用語は、バリアントサイトカイン－受容体ペアの遺伝子操作された受容体を指し、キメラ受容体を含む。
本明細書で使用される「バリアントＥＣＤ」という用語は、バリアントサイトカイン－受容体ペアの受容体（例えば、Ｇ－ＣＳＦＲ）の遺伝子操作された細胞外ドメインを指す。
本明細書で使用される「バリアントサイトカイン」、「バリアントＧ－ＣＳＦ」、または「直交サイトカイン」という用語は、バリアントサイトカイン－受容体ペアの遺伝子操作されたサイトカインを指す。
本明細書で使用される場合、「結合しない」または「結合できない」は、検出可能な結合がない、またはわずかな結合、すなわち、天然のリガンドのものよりもはるかに低い結合親和性を有することを指す。
本明細書で使用される「選択的に活性化させる」または「選択的活性化」という用語は、サイトカイン及びバリアント受容体について言及する場合、サイトカインがバリアント受容体に優先的に結合し、サイトカインがバリアント受容体に結合することにより該受容体が活性化することを指す。特定の態様では、サイトカインは、サイトカインに特異的に結合するように共進化したキメラ受容体を選択的に活性化させる。特定の態様では、サイトカインは、野生型サイトカインであり、細胞上で発現するキメラ受容体を選択的に活性化させるが、サイトカインに対する天然型野生型受容体は細胞内で発現しない。
本明細書で使用される「増強した活性」という用語は、バリアントサイトカインによる刺激時に細胞上で発現しているバリアント受容体の活性の増加を指し、該活性は、天然型サイトカインによる刺激時に天然型受容体について観察される活性である。
「免疫細胞」という用語は、生物の免疫系（自然免疫応答及び適応免疫応答を含む）をサポートする機能を有することが知られている任意の細胞を指し、リンパ球（例えば、Ｂ細胞、形質細胞、及びＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、単球、樹状細胞、好中球、及び顆粒球が含まれるが、これらに限定されるものではない。免疫細胞には、幹細胞、未成熟免疫細胞、及び分化細胞が含まれる。免疫細胞には、生体内で稀であろうと豊富であろうと、あらゆる細胞の亜集団も含まれる。特定の実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞タイプ及び亜集団の既知のマーカー（例えば、細胞表面マーカー）を保有することによって、そのように識別される。
「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３及び／またはＴ細胞抗原受容体の発現を特徴とし得る哺乳動物免疫エフェクター細胞を指し、これらの細胞は、直交サイトカイン受容体を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ２、ＴＨ９、ＴＨ１１、ＴＨ２２、ＴＦＨ；制御性Ｔ細胞、例えば、ＴＲ１、天然ＴＲｅｇ、誘導性ＴＲｅｇ；メモリーＴ細胞、例えば、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びγδＴ細胞から選択される。
「Ｇ－ＣＳＦＲ」という用語は、顆粒球コロニー刺激因子受容体を指す。Ｇ－ＣＳＦＲは、ＧＣＳＦＲ、Ｇ－ＣＳＦ受容体、コロニー刺激因子３受容体、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＤ１１４抗原、またはＳＣＮ７とも呼ばれ得る。ヒトＧ－ＣＳＦＲは、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１１９５３５を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＧ－ＣＳＦＲは、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１５６０３９．３に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。
「Ｇ－ＣＳＦ」という用語は、顆粒球コロニー刺激因子を指す。Ｇ－ＣＳＦは、コロニー刺激因子３及びＣＳＦ３とも呼ばれ得る。ヒトＧ－ＣＳＦは、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１０８３４２を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＧ－ＣＳＦは、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＫＰ２７１００８．１に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。
「ＪＡＫ」は、ヤヌスキナーゼとも呼ばれ得る。ＪＡＫは、Ｊａｋ－ＳＴＡＴ経路を介してサイトカイン媒介シグナルを伝達する細胞内非受容体型チロシンキナーゼのファミリーであり、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、及びＴＹＫ２が含まれる。ヒトＪＡＫ１は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１６２４３４を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＪＡＫ１は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２２２７に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＪＡＫ２は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ００００００９６９６８を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＪＡＫ２は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１３２２１９４に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＪＡＫ３は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１０５６３９を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＪＡＫ３は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００２１５に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトトＴＹＫ２は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１０５３９７を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＴＹＫ２は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１３８５１９７に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。
ＳＴＡＴは、シグナル伝達物質及び転写活性化因子とも呼ばれ得る。ＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、及びＳＴＡＴ６の７つのＳＴＡＴタンパク質のファミリーである。ヒトＳＴＡＴ１は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１１５４１５を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ１は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００７３１５に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ２は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１７０５８１を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ２は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５４１９に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ３は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１６８６１０を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ３は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿１３９２７６に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ４は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１３８３７８を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ４は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００３１５１に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ５Ａは、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１２６５６１を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ５Ａは、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００３１５２に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ５Ｂは、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１７３７５７を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ５Ｂは、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０１２４４８に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ６は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１６６８８８を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＴＡＴ６は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００３１５３に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。
ＳＨＣは、Ｓｒｃホモロジー２ドメイン含有形質転換タンパク質とも呼ばれ得る。Ｓｈｃは、３つのアイソフォームのファミリーであり、ｐ６６Ｓｈｃ、ｐ５２Ｓｈｃ、及びｐ４６Ｓｈｃ、ＳＨＣ１、ＳＨＣ２、及びＳＨＣ３を含む。ヒトＳＨＣ１は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１６０６９１を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＨＣ１は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿１８３００１に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＳＨＣ２は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１２９９４６を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＨＣ２は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０１２４３５に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。ヒトＳＨＣ３は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１４８０８２を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＨＣ３は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０１６８４８に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。
ＳＨＰ－２は、非受容体型プロテインチロシンホスファターゼ１１（ＰＴＰＮ１１）及びプロテインチロシンホスファターゼ１Ｄ（ＰＴＰ－１Ｄ）とも呼ばれ得る。ヒトＳＨＰ－２は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１７９２９５を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＳＨＰ－２は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１３３０４３７に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。
ＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスホスフェート３－キナーゼとも呼ばれ得る。ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットは、ＰＩＫ３ＣＡと呼ばれ得る。ヒトＰＩＫ３ＣＡは、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別番号：ＥＮＳＧ０００００１２１８７９を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＰＩＫ３ＣＡは、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００６２１８に対応するｃＤＮＡ配列によってコードされる。
本出願で使用する略語は以下のものが挙げられる：ＥＣＤ（細胞外ドメイン）、ＩＣＤ（細胞内ドメイン）、Ｇ－ＣＳＦＲ（顆粒球コロニー刺激因子受容体）、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン２受容体）、ＩＬ－１２Ｒ（インターロイキン１２受容体）、ＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン２１受容体）、及びＩＬ－７Ｒ（インターロイキン７受容体）。ＩＬ－２Ｒγは、本明細書では、ＩＬ－２ＲＧ、ＩＬ－２Ｒｇｃ、γｃ、またはＩＬ－２Ｒγｃとも呼ばれ得る。選択されたキメラサイトカイン受容体デザインの場合：「Ｇ－ＣＳＦＲｗｔ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒｂ」は、本明細書では「Ｇ／ＩＬ－２Ｒｂ」とも呼ばれる；「Ｇ－ＣＳＦＲｗｔ－ＩＣＤｇｃ」は、本明細書では「Ｇ／ｇｃ」とも呼ばれる；「Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒｂ」は、本明細書では「１３７ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－２」とも呼ばれる；「Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤＩＬ－２Ｒｂ＋ＧＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｃ」は、本明細書では「１３７ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－１」とも呼ばれる。ＩＬ－２Ｒγ（すなわち、ＩＬ－２ＲＧ、ＩＬ－２Ｒｇｃ、γｃ、またはＩＬ－２Ｒγｃ）。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値も具体的に開示されることを理解する。いずれかの記載値、または記載範囲内の介在値からいずれかの他の記載値またはその記載範囲内の介在値の間のそれぞれのより小さな範囲を本発明内に含む。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、この範囲内に独立して含まれてもよいし、含まれなくてもよく、またこれらのより小さい範囲内に、これら限界値のいずれか一方を含む、いかなる限界値も含まない、またはこれらの限界値の両方を含む各範囲は、この記載範囲内のいずれかの具体的に除外された制限に従い、本発明内に含まれる。記載範囲が一方または両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
バリアントサイトカイン及び受容体デザイン
本明細書に記載されるのは、バリアント受容体を選択的に活性化させるためのバリアントサイトカイン及び受容体ペアである。本開示のバリアント受容体は、Ｇ－ＣＳＦＲの細胞外ドメインを含み；バリアントサイトカインは、バリアント受容体に結合して活性化させるＧ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）を含む。特定の実施形態では、バリアント受容体は、Ｇ－ＣＳＦＲのＥＣＤと、Ｇ－ＣＳＦＲとは異なる受容体のＩＣＤの少なくとも一部と、を含むキメラ受容体である。
バリアントＧ－ＣＳＦ及びバリアントＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤペア
特定の態様では、本明細書に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ及び受容体デザインは、少なくとも１つのサイトＩＩ界面領域変異、少なくとも１つのサイトＩＩＩ界面領域変異、及びそれらの組み合わせを含む。特定の態様では、本明細書に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ及び受容体デザインは、表２、４、または６に記載の少なくとも１つのサイトＩＩまたはサイトＩＩＩ界面領域変異を含む。
特定の態様では、サイトＩＩ界面領域のバリアント受容体上の少なくとも１つの変異は、Ｇ－ＣＳＦＲ細胞外ドメイン（配列番号２）のアミノ酸位置１４１、１６７、１６８、１７１、１７２、１７３、１７４、１９７、１９９、２００、２０２、及び２８８からなる群より選択されるＧ－ＣＳＦＲ細胞外ドメインのアミノ酸位置に位置する。
特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦサイトＩＩ界面領域上の少なくとも１つの変異は、Ｇ－ＣＳＦ（配列番号１）のアミノ酸位置１２、１６、１９、２０、１０４、１０８、１０９、１１２、１１５、１１６、１１８、１１９、１２２、及び１２３からなる群より選択されるＧ－ＣＳＦのアミノ酸位置に位置する。
特定の態様では、バリアント受容体サイトＩＩ界面領域上の少なくとも１つの変異は、Ｒ１４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、Ｋ１６８Ｄ、Ｋ１６８Ｅ、Ｌ１７１Ｅ、Ｌ１７２Ｅ、Ｙ１７３Ｋ、Ｑ１７４Ｅ、Ｄ１９７Ｋ、Ｄ１９７Ｒ、Ｍ１９９Ｄ、Ｄ２００Ｋ、Ｄ２００Ｒ、Ｖ２０２Ｄ、Ｒ２８８Ｄ、及びＲ２８８ＥからなるＧ－ＣＳＦＲ細胞外ドメイン変異群から選択される。
特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦサイトＩＩ界面領域上の少なくとも１つの変異は、Ｋ１６Ｄ、Ｒ、Ｓ１２Ｅ、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｒ、Ｋ１６Ｄ、Ｌ１８Ｆ、Ｅ１９Ｋ、Ｅ１９Ｒ、Ｑ２０Ｅ、Ｄ１０４Ｋ、Ｄ１０４Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、Ｌ１０８Ｒ、Ｄ１０９Ｒ、Ｄ１１２Ｒ、Ｄ１１２Ｋ、Ｔ１１５Ｅ、Ｔ１１５Ｋ、Ｔ１１６Ｄ、Ｑ１１９Ｅ、Ｑ１１９Ｒ、Ｅ１２２Ｋ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３ＲからなるＧ－ＣＳＦ変異群から選択される。
特定の態様では、バリアントサイトＩＩＩ界面領域上の少なくとも１つの変異は、配列番号２のアミノ酸位置３０、４１、７３、７５、７９、８６、８７、８８、８９、９１、及び９３からなる群より選択されるＧ－ＣＳＦＲ細胞外ドメイン変異群から選択される。
特定の態様では、サイトＩＩＩ界面領域上の少なくとも１つの変異は、配列番号１のアミノ酸位置３８、３９、４０、４１、４６、４７、４８、４９、及び１４７からなる群より選択されるＧ－ＣＳＦ変異群から選択される。
特定の態様では、サイトＩＩＩ界面領域上の少なくとも１つの変異が、Ｓ３０Ｄ、Ｒ４１Ｅ、Ｑ７３Ｗ、Ｆ７５Ｋ、Ｓ７９Ｄ、Ｌ８６Ｄ、Ｑ８７Ｄ、Ｉ８８Ｅ、Ｌ８９Ａ、Ｑ９１Ｄ、Ｑ９１Ｋ、及びＥ９３ＫからなるＧ－ＣＳＦＲ細胞外ドメイン変異群から選択される。
特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦサイトＩＩＩ界面領域上の少なくとも１つの変異は、Ｔ３８Ｒ、Ｙ３９Ｅ、Ｋ４０Ｄ、Ｋ４０Ｆ、Ｌ４１Ｄ、Ｌ４１Ｅ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ４７Ｄ、Ｖ４８Ｋ、Ｖ４８Ｒ、Ｌ４９Ｋ、及びＲ１４７ＥからなるＧ－ＣＳＦ変異群から選択される。
本明細書に記載のバリアントサイトカイン及び受容体ペアは、サイトＩＩ領域のみ、サイトＩＩＩ領域のみ、またはサイトＩＩ及びサイトＩＩＩ領域の両方において変異を含み得る。
本明細書に記載のバリアントサイトカイン及び受容体ペアは、任意の数の本明細書に記載のサイトＩＩ及び／またはサイトＩＩＩ変異を有することができる。特定の態様では、バリアントＧ－ＣＳＦ及び受容体は、表６に記載の変異を有する。特定の態様では、バリアント受容体及び／またはバリアントＧ－ＣＳＦは、本明細書に記載の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を有し得る。
特定の態様では、本明細書に記載のバリアント受容体は、本明細書に記載の配列番号のＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有するＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤドメインを含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号２、３、６、または８のアミノ酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＥＣＤを含む。
特定の態様では、本明細書に記載のバリアントＧ－ＣＳＦは、配列番号１のＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列を含む。
特定の態様では、Ｇ－ＣＳＦＲのＥＣＤは、Ｒ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
バリアントサイトカイン及び／または受容体は、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えにより産生され得、この異種ポリペプチドは、例えば、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素であっても、ベクターに挿入されるコード配列の一部であってもよい。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞の発現においては、天然型シグナル配列を用いてもよいし、他の哺乳動物のシグナル配列、例えば、同一または近縁種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、及びウイルス分泌リーダーが好適となり得る。特定の実施形態では、シグナル配列は、Ｇ－ＣＳＦＲまたはＧＭ－ＣＳＦＲのシグナル配列である。特定の実施形態では、シグナル配列は、配列番号１１または配列番号１２である。
特定の態様では、バリアント受容体及び／またはバリアントＧ－ＣＳＦは、安定性を高めるために、天然または合成のいずれかで改変される（例えば、糖基、ＰＥＧ）。例えば、特定の実施形態では、バリアントサイトカインは、ＩｇＧ、アルブミン、または他の分子のＦｃドメインに融合され、例えば、当技術分野で知られているようにＰＥＧ化、グリコシル化などによって、半減期を延長させる。Ｆｃ融合はまた、インビボで代替的なＦｃ受容体媒介特性を促進することができる。「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧをパパインで消化することによって生成されるＩｇＧ Ｃ末端ドメインに相同な天然に存在するまたは合成ポリペプチドであり得る。ＩｇＧ Ｆｃは、約５０ｋＤａの分子量を有する。バリアントサイトカインは、Ｆｃ領域全体を含んでもよく、またはその一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持する、より小さい部分を含んでもよい。さらに、完全長または断片化されたＦｃ領域は、野生型分子のバリアントとすることができる。
バリアントサイトカインがバリアント受容体に結合すると、バリアント受容体は、天然型の細胞内構成要素を通じて伝達されるシグナル伝達を活性化して、その天然型の応答を模倣する生物学的活性を提供するが、それはバリアント受容体を発現するように操作された細胞に対して特異的である。特定の態様では、バリアント受容体及びＧ－ＣＳＦペアは、それらの天然型野生型Ｇ－ＣＳＦまたは天然型野生型Ｇ－ＣＳＦＲと結合しない。したがって、特定の実施形態では、バリアント受容体は、バリアントサイトカインの天然型対応物を含む、内因性対応サイトカインに結合しない一方で、該バリアントサイトカインは、バリアント受容体の天然型対応物を含むいかなる内因性受容体に結合しない。特定の実施形態では、バリアントサイトカインは、天然型サイトカインの、天然型サイトカイン受容体への結合と比較して、著しく低下した親和性で天然型受容体に結合する。特定の実施形態では、天然型受容体に対するバリアントサイトカインの親和性は、天然型サイトカイン受容体に対する天然型サイトカインの親和性の１０倍未満、１００倍未満、１，０００倍未満、または１０，０００倍未満である。特定の実施形態では、バリアントサイトカインは、１Ｘ１０－４Ｍより大きい、１Ｘ１０－５Ｍより大きい、１Ｘ１０－６Ｍより大きい；１Ｘ１０－７Ｍより大きい、１Ｘ１０－８Ｍより大きい、または１Ｘ１０－９Ｍより大きいＫＤで天然型受容体に結合する。特定の実施形態では、バリアントサイトカイン受容体は、天然型サイトカインに対する天然型サイトカイン受容体の結合と比較して著しく低下した親和性で天然型サイトカインに結合する。特定の実施形態では、バリアントサイトカイン受容体は、天然型サイトカインを、天然型サイトカイン受容体に対する天然型サイトカインの１０倍未満、１００倍未満、１，０００倍未満、または１０，０００倍未満で結合する。特定の実施形態では、バリアントサイトカイン受容体は、１Ｘ１０－４Ｍより大きい、１Ｘ１０－５Ｍより大きい、１Ｘ１０－６Ｍより大きい、または１Ｘ１０－７Ｍより大きい、１Ｘ１０－８Ｍより大きい、または１Ｘ１０－９Ｍより大きいＫＤで天然型サイトカインに結合する。いくつかの実施形態では、バリアント受容体に対するバリアントサイトカインの親和性は、天然型受容体に対する天然型サイトカインの親和性に匹敵し、例えば、天然型サイトカイン受容体ペアの親和性の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％である親和性を有し、それより高くてもよく、例えば、天然型受容体に対する天然型サイトカインの親和性の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上であり得る。親和性は、当業者によく知られている任意の数のアッセイによって決定することができる。例えば、親和性は、様々な濃度の非標識リガンドの存在下で、単一濃度の標識リガンドを用いて受容体の結合を測定する競合結合実験により決定することができる。典型的には、非標識リガンドの濃度は、少なくとも６桁にわたって変化する。競合結合実験により、ＩＣ５０を決定することができる。本明細書で使用される場合、「ＩＣ５０」は、受容体と標識リガンドとの間の会合の５０％阻害に必要とされる非標識リガンドの濃度を指す。ＩＣ５０は、リガンド－受容体結合親和性の指標である。低ＩＣ５０は高親和性を表す一方、高ＩＣ５０は低親和性を表す。
細胞の表面上で発現するバリアントサイトカイン受容体へのバリアントサイトカインの結合は、バリアントサイトカイン受容体の機能に（天然型サイトカイン受容体活性と比較して）影響してもしなくてもよく；天然型の活性は、すべての場合において必要でも望まれるものでもない。特定の実施形態では、バリアントサイトカインのバリアントサイトカイン受容体への結合は、天然型サイトカインシグナル伝達の１つ以上の特徴を誘発することになる。特定の実施形態では、細胞の表面上で発現するバリアントサイトカイン受容体へのバリアントサイトカインの結合は、増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答を引き起こす。
（表１）ヒトＷＴ Ｇ－ＣＳＦ及びヒトＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲＩｇ－ＣＲＨドメインの配列
Figure 2022553152000002
（表２）Ｇ－ＣＳＦＥ及びＧ－ＣＳＦＲＥの変異を有するサイトＩＩデザイン
Figure 2022553152000003
（表４）サイトＩＩＩデザイン
Figure 2022553152000004
（表６）サイトＩＩ及びＩＩＩデザインの組み合わせから得られるデザインの例
Figure 2022553152000005
Figure 2022553152000006
キメラ受容体
特定の態様では、本明細書に記載されるバリアント受容体は、キメラ受容体である。キメラ受容体は、本明細書に記載のバリアントＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤドメインのいずれかを含むことができる。特定の態様では、キメラ受容体は、異なるサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の少なくとも一部をさらに含む。異なるサイトカイン受容体の細胞内ドメインは、ｇｐ１３０（糖タンパク質１３０）、ＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒｂ（インターロイキン－２受容体β）、ＩＬ－２ＲγまたはγｃまたはＩＬ－２ＲＧ（インターロイキン－２受容体γ）、ＩＬ－７Ｒα（インターロイキン－７受容体α）、ＩＬ－１２Ｒβ２（インターロイキン－１２受容体β２）、及びＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）からなる群より選択することができる。特定の態様では、細胞内ドメインの少なくとも一部は、本明細書に記載のサイトカイン受容体ＩＣＤのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列を含む。特定の態様では、サイトカイン受容体ＩＣＤの少なくとも一部は、配列番号４、７、または９に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を共有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるのは、第２のドメインに作動可能に連結されるＧ－ＣＳＦＲ（顆粒球コロニー刺激因子受容体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むキメラサイトカイン受容体であり；該第２のドメインは、マルチサブユニットサイトカイン受容体、例えば、ＩＬ－２Ｒの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラサイトカイン受容体は、表１５Ａ及び表１５ＢのＩＣＤの一部を含む。特定の態様では、キメラサイトカイン受容体は、表１５Ａ及び表１５Ｂから選択される膜貫通ドメインを含む。特定の態様では、キメラサイトカイン受容体ＩＣＤは、表１５Ａ、表１５Ｂ、及び表１６のＢｏｘ１及びＢｏｘ２領域を含む。特定の態様では、キメラサイトカイン受容体は、表１５Ａ、表１５Ｂ、及び表１６の少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含む。
特定の態様では、本明細書に記載のキメラ受容体は、表１７～２０のそれぞれに開示される配列のＮ末端からＣ末端の順序のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のキメラ受容体は、表１７～２０のそれぞれに開示される配列の５’から３’の順序の核酸配列を含む。特定の態様では、キメラサイトカイン受容体は、表１７～２０のそれぞれに開示されるアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端の順序のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有する。特定の態様では、キメラサイトカイン受容体は、表１７～２０のそれぞれに開示される核酸配列の５’～３’順序の核酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の核酸同一性を共有する。
特定の態様では、本明細書に記載のキメラ受容体は、本明細書に記載のＩＣＤ配列番号に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸または核酸配列同一性を共有するサイトカイン受容体のＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号２６、２９、３１、３９、４１、４３、４５、４７、または４９のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ＲβのＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号５４、５７、５９、６７、６９、７１、７３、７５、または７７の核酸配列を有するＩＬ－２Ｒβ、すなわちＩＬ－２ＲｂのＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号５１のアミノ酸配列または配列番号７９の核酸配列を有するＩＬ－７ＲαのＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号５３のアミノ酸配列または配列番号８１の核酸配列を有するＩＬ－７ＲのＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号４５または５５のアミノ酸配列を有するＩＬ－２１ＲのＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号３５または３７の核酸配列を有するＩＬ－２１ＲのＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号３３、４２、または４６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１２Ｒβ２のＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号６１、７０、または７４の核酸配列を有するＩＬ－１２Ｒβ２のＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４４、５０、または５２のアミノ酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７２、７８、または８０の核酸配列を有するＧ－ＣＳＦＲのＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号２８または４８のアミノ酸配列を有するｇｐ１３０のＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号５６または７６の核酸配列を有するｇｐ１３０のＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒγ（すなわち、ＩＬ－２ＲＧ、ＩＬ－２Ｒｇｃ、γｃ、またはＩＬ－２Ｒγｃ）のＩＣＤの少なくとも一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号５５の核酸配列を有するＩＬ－２Ｒγ（すなわち、ＩＬ－２ＲＧ、ＩＬ－２Ｒｇｃ、γｃ、またはＩＬ－２Ｒγｃ）のＩＣＤの少なくとも一部を含む。
特定の態様では、本明細書に記載のＩＣＤの少なくとも一部は、少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位を含む。特定の態様では、少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位は、Ｇ－ＣＳＦＲのＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＴＡＴ３結合部位；ｇｐ１３０のＳＨＰ－２結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳｈｃ結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２ＲβのＳＴＡＴ１結合部位；ＩＬ－７ＲαのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－７Ｒαのホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ４結合部位；ＩＬ－１２Ｒβ２のＳＴＡＴ３結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ５結合部位；ＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ３結合部位；及びＩＬ－２１ＲのＳＴＡＴ１結合部位である。特定の態様では、少なくとも１つのシグナル伝達分子結合部位は、表１６に記載のアミノ酸をさらに含む配列を含む。
特定の態様では、本明細書に記載のＩＣＤの少なくとも一部は、ｇｐ１３０またはＧ－ＣＳＦＲのＢｏｘ１及びＢｏｘ領域を含む。特定の態様では、Ｂｏｘ１領域は、表２に記載のアミノ酸の配列を含む。特定の態様では、Ｂｏｘ１領域は、表１６に記載のＢｏｘ１配列に対して５０％を超える同一性のアミノ酸配列を含む。
特定の態様では、異なるサイトカイン受容体の細胞内ドメインは、野生型細胞内ドメインである。
特定の態様では、本明細書に記載のキメラバリアント受容体は、異なるサイトカイン受容体の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）の少なくとも一部をさらに含む。異なるサイトカイン受容体のＴＭＤは、ｇｐ１３０（糖タンパク質１３０）、ＩＬ－２Ｒβ（インターロイキン－２受容体β）、ＩＬ－２Ｒγまたはγｃ（ＩＬ－２受容体γ）、ＩＬ－７Ｒα（インターロイキン－７受容体α）、ＩＬ－１２Ｒβ２（インターロイキン－１２受容体β２）、及びＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）からなる群より選択することができる。特定の態様では、ＴＭＤの少なくとも一部は、本明細書に記載のサイトカイン受容体ＴＭＤのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列を含む。特定の態様では、サイトカイン受容体ＴＭＤの少なくとも一部は、配列番号４、５、７、または９に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を共有する。
特定の態様では、本明細書に記載のキメラ受容体は、図２０、２３、及び２４のキメラ受容体デザインに示すように、Ｎ末端からＣ末端の順で配置されたＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤドメイン、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、及びＩＣＤの少なくとも一部を含む。
特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号３のＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ、配列番号４のｇｐ１３０ ＴＭＤ及びＩＣＤの一部、ならびに配列番号５のＩＬ－２Ｒβ ＩＣＤの一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号６のＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ、及び配列番号７のＩＬ－２Ｒβ ＩＣＤの一部を含む。特定の態様では、キメラ受容体は、配列番号８のＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ、及び配列番号９のＩＬ－２Ｒγ ＩＣＤの一部を含む。
細胞の表面上で発現するキメラサイトカイン受容体へのバリアントまたは野生型サイトカインの結合は、バリアントサイトカイン受容体の機能に（天然型サイトカイン受容体活性と比較して）影響してもしなくてもよく；天然型の活性は、すべての場合において必要でも望まれるものでもない。特定の実施形態では、バリアントサイトカインのキメラサイトカイン受容体への結合は、天然型サイトカインシグナル伝達の１つ以上の特徴を誘発することになる。特定の実施形態では、細胞の表面上で発現するキメラサイトカイン受容体へのバリアントサイトカインの結合は、増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答を引き起こす。
バリアントサイトカイン及び受容体をコードする核酸
本開示に含まれるのは、本明細書に記載の受容体及びバリアントＧ－ＣＳＦのいずれか１つをコードする核酸である。
バリアント受容体またはバリアントＧ－ＣＳＦは、組み換えにより直接生成されるだけでなく、異種ポリペプチド、例えば、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生成されてもよい。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素であっても、ベクターに挿入されるコード配列の一部であってもよい。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞の発現では、天然シグナル配列が使用されても、他の哺乳動物のシグナル配列、例えば、同じ種または関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、及びウイルス分泌リーダーが適していてもよい。特定の態様では、シグナル配列は、配列番号２、３、６、または８のＮ末端領域にシグナル配列を含むアミノ酸配列であり得る。特定の態様では、シグナル配列は、ＭＡＲＬＧＮＣＳＬＴＷＡＡＬＩＩＬＬＬＰＧＳＬＥ（配列番号１１）のアミノ酸配列であり得る。
バリアントサイトカインまたは受容体をコードする発現ベクター
本明細書に記載のバリアント受容体またはバリアントＧ－ＣＳＦの１つ以上をコードする１つ以上の核酸配列（複数可）を含む、発現ベクター及び発現ベクターのキットもまた本明細書に記載される。
特定の実施形態では、バリアント受容体またはバリアントＧ－ＣＳＦをコードする核酸は、発現のため複製可能なベクターに挿入される。このようなベクターは、本明細書に記載のバリアント受容体またはサイトカインを発現するように、核酸配列（複数可）を宿主細胞に導入するために使用され得る。多くのそのようなベクターが利用可能である。ベクターの構成要素は、一般に、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、組み込みベクターなどを含む。ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。ベクターは、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または他の細胞）にトランスフェクトまたは形質導入することができ得る。
発現ベクターは、通常、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。選択可能なマーカー遺伝子は、選択的培養培地で増殖する形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、培養培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を補うか、または（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
特定の態様では、発現ベクターは、宿主生物により認識され、バリアントタンパク質コード配列に作動可能に連結されるプロモーターを含有する。プロモーターは、それらが作動可能に連結される特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列（一般に約１００～１０００ｂｐ以内）である。そのようなプロモーターは、典型的には、２つのクラス、誘導プロモーター及び構成プロモーターに分けられる。誘導プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化に応じてそれらの制御下で、ＤＮＡから、増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス幹細胞ウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、または免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御され得る。ただし、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合することを条件とする。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。
高等真核生物による転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーはＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常約１０～３００ｂｐであり、プロモーターに作用してその転写を促進する。エンハンサーは、相対的に配向及び位置に依存せず、転写ユニットの５’側及び３’側、イントロン内、ならびにコード配列それ自体内のうちに見出される。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の５’または３’位で発現ベクターにスプライシングされてもよいが、好ましくは、プロモーター由来の５’部位に位置する。
真核生物宿主細胞に使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの、５’側、場合により３’側の非翻訳領域から得ることができる。上記の構成要素の１つ以上を含有する好適なベクターの構築は、標準的な技術を用いる。
特定の態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるキメラ受容体をコードするレンチウイルスベクターである。特定の態様では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１ ５’ＬＴ及び３’ＬＴＲを含む。特定の態様では、レンチウイルスベクターは、ＥＦ１ａプロモーターを含む。特定の態様では、レンチウイルスベクターは、ＳＶ４０ポリターミネーター配列を含む。特定の態様では、ベクターは ｐｓＰＡＸ２、Ａｄｄｇｅｎｅ（登録商標）１２２６０、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ、またはＡｄｄｇｅｎｅ（登録商標）８４５４である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の配列に対して高い配列同一性、例えば、９５、９６、９７、９８、９９％以上の配列同一性を有する核酸及びポリペプチド配列も記載される。パーセント配列「同一性」という用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、以下に記載する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮまたは当業者が利用できる他のアルゴリズム）の１つを使用して、または目視検査により測定された、最大対応性について比較及びアラインメントされるときに、同一である特定の割合のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域上にわたり、例えば、機能ドメイン上にわたり、あるいは、比較される２つの配列の全長上にわたり存在することができる。
配列比較のため、典型的には、１つの配列が基準配列の役割を果たし、これと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムが用いられる場合、試験及び基準配列がコンピュータに入力され、必要であれば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは次いで、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を算出する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性探求方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、以下を参照）により実施され得る。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。
バリアント受容体及びバリアントサイトカインを発現する細胞
本明細書には、バリアント受容体を発現する細胞も記載されている。操作された免疫細胞を含む宿主細胞に、バリアントサイトカインまたは受容体発現のための上記の発現ベクターをトランスフェクトまたは形質導入することができる。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のバリアント受容体またはバリアントサイトカインのうちの１つ以上を含む細胞を提供する。細胞は、本明細書に記載のバリアント受容体またはバリアントサイトカインをコードする核酸またはベクターを含み得る。本開示はまた、バリアント受容体を発現する細胞を作製する方法を提供する。特定の態様では、細胞は、本明細書に記載の核酸または発現ベクターを細胞に導入することによって作製される。核酸または発現ベクターは、トランスフェクション、ウイルスベクターの形質導入、転移または遺伝子編集を含むがこれらに限定されない任意のプロセスによって細胞に導入することができる。当技術分野で知られている任意の遺伝子編集技術を使用することができ、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ、及びメガヌクレアーゼからなる技術を含むがこれに限定されない。
宿主細胞は、体内の任意の細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞であり、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ９、ＴＨ１１、ＴＨ２２、ＴＦＨ；制御性Ｔ細胞、例えば、ＴＲ１、天然ＴＲｅｇ、誘導性ＴＲｅｇ；メモリーＴ細胞、例えば、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、細胞はＢ細胞であり、ナイーブＢ細胞、胚中心Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、細胞傷害性Ｂ細胞、サイトカイン産生Ｂ細胞、制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）、中心芽細胞、中心細胞、抗体分泌細胞、形質細胞などを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、細胞は自然リンパ系細胞であり、ＮＫ細胞などを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、細胞は骨髄系細胞であり、マクロファージ、樹状細胞、骨髄由来抑制細胞などを含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、細胞は幹細胞であり、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞などを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、細胞は、対象に移植される前に、エクスビボ手順で遺伝的に改変される。細胞は、治療のために単位用量で提供され得、意図されたレシピエントに関して同種他家由来、自己由来などであることができる。
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。それらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）のような他のリンパ球と区別されることができる。以下にまとめるように、Ｔ細胞には様々な種類がある。
ヘルパーＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）は、形質細胞及びメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助している。Ｔｈ細胞は、その表面にＣＤ４を発現する。Ｔｈ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上にあるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されると、活性化状態になる。これらの細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、またはＴｆｈを含むいくつかのサブタイプ（これらは、異なるタイプの免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌する）のうちの１つへと分化し得る。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。ほとんどのＣＴＬは、その表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、ＭＨＣクラスＩ（すべての有核細胞の表面に存在する）に会合される抗原への結合により標的を認識する。
メモリーＴ細胞は抗原特異的Ｔ細胞のサブセットであり、感染が回復した後であっても長期的に存続する。メモリーＴ細胞は、その同種抗原へ再暴露されると、ただちに多数のエフェクターＴ細胞へと拡張し、免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリーＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）と２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）の、３つのサブタイプを含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。典型的に、メモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として知られており、免疫寛容の維持に不可欠である。それらの主な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を免疫応答の終わりに向けてシャットダウンし、胸腺における負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞には、内在性Ｔｒｅｇ細胞と適応性Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要分類が記載されている。
内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知である）は胸腺で生じ、ＴＳＬＰによって活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）及び形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互反応に関連している。Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞と区別することができる。
適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知である）は、正常な免疫応答中に発生し得る。細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの自然免疫シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
特定の態様では、本明細書に記載のバリアント受容体またはバリアントサイトカインを発現する細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）である。特定の態様では、ＴＩＬまたはＴＡＬは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びそれらの組み合わせを含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＴ細胞は、免疫療法で使用するための人工Ｔ細胞受容体を産生するように遺伝子操作されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）である。特定の態様では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者自身の血液中のＴ細胞に由来する（すなわち、自己由来）。特定の態様では、ＣＡＲ－Ｔは、別の健康なドナーのＴ細胞に由来する（すなわち、同種他家由来）。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞は、免疫療法で使用するための特定のＴ細胞受容体を産生するように遺伝子操作された操作されたＴ細胞受容体（ｅＴＣＲ－Ｔ細胞）である。特定の態様では、ｅＴＣＲ－Ｔ細胞は、患者自身の血液中のＴ細胞に由来する（すなわち、自己由来）。特定の態様では、ｅＴＣＲ－Ｔ細胞は、ドナーのＴ細胞に由来する（すなわち、同種他家由来）。
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を生成する共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、及び胸腺で分化及び成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
特定の態様では、本明細書に記載されるキメラサイトカイン受容体を発現する細胞は、Ｂ細胞である。Ｂ細胞には、ナイーブＢ細胞、胚中心Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、細胞傷害性Ｂ細胞、サイトカイン産生Ｂ細胞、制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）、中心芽細胞、中心細胞、抗体分泌細胞、形質細胞が含まれるが、これらに限定されない。
特定の態様では、本明細書に記載のキメラサイトカイン受容体を発現する細胞は、マクロファージ、樹状細胞、骨髄由来サプレッサー細胞などを含むがこれらに限定されない骨髄細胞である。
本明細書に記載のバリアント受容体またはバリアントサイトカインを発現する細胞は、任意の細胞型であり得る。特定の態様では、本明細書に記載されるバリアント受容体またはバリアントサイトカインを発現する細胞は、造血系の細胞である。本発明による免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、患者自身の末梢血（ファーストパーティー）からか、ドナー末梢血からの造血幹細胞移植の設定（セカンドパーティー）においてか、または非血縁者のドナー由来の末梢血（サードパーティー）から、エクスビボで作製され得る。あるいは、本明細書に記載の免疫細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の、免疫細胞へのエクスビボでの分化に由来し得る。あるいは、エフェクター機能を保持し、治療薬として作用することができる、不死化免疫細胞株を使用することができる（例えば、溶解機能を保持するＴ細胞またはＮＫ細胞株、抗体産生機能を保持する形質細胞株、または食作用及び抗原提示機能を保持する樹状細胞株もしくはマクロファージなど）。これらすべての実施形態では、バリアント受容体発現細胞は、ウイルスベクターによる形質導入またはＤＮＡもしくはＲＮＡによるトランスフェクションを含む、多くの手段のうちの１つによって、各バリアント受容体（複数可）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
本明細書に記載の細胞は、バリアント受容体及び／またはバリアントサイトカインを発現するようにエクスビボで操作された対象に由来する免疫細胞であり得る。免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料または腫瘍試料由来であり得る。免疫細胞は、本発明の第１の態様によるバリアント受容体またはバリアントサイトカインを提供する分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び／またはＩＬ－２での処理によって、活性化及び／または拡大増殖し得る。本発明の免疫細胞は、（ｉ）対象または上記の他の供給源から細胞を含む試料を単離することと、（ｉｉ）バリアント受容体またはバリアントサイトカインをコードする１つ以上の核酸配列（複数可）を用いて免疫細胞の形質導入またはトランスフェクションすることと、によって作製され得る。
細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために必要に応じて改変される従来の栄養培地において培養することができる。哺乳動物の宿主細胞は、さまざまな培地で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に好適である。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質、微量要素、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物もまた、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞にこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
次に、免疫細胞は、精製、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択することができる。特定の実施形態では、細胞は、選択可能なマーカー（例えば、タンパク質、蛍光マーカー、またはエピトープタグ）の発現によって、または細胞の選択、単離、及び／または精製のための当技術分野で知られている任意の方法によって選択される。
キット
本開示は、本明細書に記載のバリアント受容体またはバリアントＧ－ＣＳＦのいずれかの少なくとも１つを発現する細胞を作製するためのキットも記載する。特定の実施形態では、キットは、少なくとも１つのバリアント受容体をコードする少なくとも１つの発現ベクターと、使用説明書とを含む。特定の態様では、キットは、医薬製剤中の少なくとも１つのバリアントサイトカイン、または本明細書に記載のバリアント受容体の少なくとも１つと結合するバリアントＧ－ＣＳＦをコードする発現ベクターをさらに含む。特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるバリアント受容体をコードする発現ベクターを含む細胞を含む。
特定の実施形態では、キットは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）など、（ＣＡＲ）／操作されたＴ細胞受容体（ｅＴＣＲ）など（例えば、操作された非天然型ＴＣＲ受容体）をコードする発現ベクターを含む細胞を含む。特定の実施形態では、キットは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／操作されたＴ細胞受容体（ｅＴＣＲ）などをコードする発現ベクターを含む。特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載のバリアント受容体及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／操作されたＴ細胞受容体（ｅＴＣＲ）などをコードする発現ベクターを含む。
特定の態様では、本明細書に記載のキットは、バリアントサイトカインをさらに含む。特定の実施形態では、キットは、少なくとも１つの追加のバリアントサイトカインをさらに含む。特定の態様では、キットは、医薬製剤中の少なくとも１つのバリアントサイトカインをさらに含む。特定の実施形態では、成分は、任意の便利な包装で液体または固体の形態で、投与形態で提供される。
本明細書に記載されるように提供される細胞または作製される細胞の増殖、選択、及び調製のために、追加の試薬が提供され得る。例えば、キットは、細胞培養のための成分、成長因子、分化剤、トランスフェクションまたは形質導入のための試薬などを含むことができる。
特定の実施形態では、上記の成分に加えて、キットは使用説明書も含むことができる。説明書は、任意の便利な形態で提供することができる。例えば、説明書は、印刷された情報として、キットのパッケージ、パッケージの挿入物などに提供されてもよい。説明書は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体として提供することもできる。さらに、説明書は、情報にアクセスするために使用できるウェブサイトのアドレスで提供されてもよい。
バリアント受容体の選択的活性化の方法
本開示は、細胞の表面上で発現するバリアント受容体を選択的に活性化させるための方法であって、本明細書に記載のバリアント受容体を、キメラ受容体を選択的に活性化させるサイトカインと接触させることを含む、方法を提供する。特定の態様では、キメラ受容体を選択的に活性化させるサイトカインは、バリアントＧ－ＣＳＦである。Ｇ－ＣＳＦは、天然型（野生型）サイトカイン受容体と比較して、バリアント受容体へのＧ－ＣＳＦの優先的結合及び活性化をもたらす１つ以上の変異を含む、野生型Ｇ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦであることができる。
特定の態様では、バリアント受容体へのサイトカインの結合によるバリアント受容体の選択的活性化は、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、またはそれらの組み合わせをもたらす。
特定の態様では、バリアント受容体の活性化は、下流のシグナル伝達分子の活性化をもたらす。特定の態様では、バリアント受容体は、天然型の細胞内シグナル伝達分子を通じて伝達されるシグナル伝達分子または経路を活性化して、その天然型の応答を模倣する生物学的活性を提供するが、それはバリアント受容体を発現するように操作された細胞に対して特異的である。特定の態様では、下流のシグナル伝達分子の活性化は、細胞周期の進行、増殖、生存、及び／または増強された活性を刺激する細胞シグナル伝達経路の活性化を含む。特定の態様では、活性化されるシグナル伝達経路または分子は、これらに限定されないが、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、Ｓｈｃ、ＥＲＫ１／２、及びＡｋｔである。特定の態様では、バリアント受容体の活性化は、受容体に結合するサイトカインの投与後の細胞増殖の増加をもたらす。特定の態様では、増殖の程度は、細胞がＩＬ－２で刺激されたときに観察される増殖の０．１～１０倍である。
養子細胞移植の方法
本発明は、本明細書に記載のバリアント受容体及び／またはバリアントサイトカインを発現する細胞（例えば、以下に記載の医薬組成物）を対象に投与するステップを含む、疾患を治療及び／または予防するための方法を提供する。
疾患を治療するための方法は、本明細書に記載の細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはバリアント受容体を発現する他の任意の免疫細胞または非免疫細胞の治療的使用に関する。細胞は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減、低減、または改善するため、及び／または疾患の進行を減速、低減、または阻止するために、既存の疾患または状態を有する対象に投与することができる。疾患を予防するための方法は、本開示の細胞の予防的使用に関連する。そのような細胞は、疾患の原因を予防もしくは損なわせるため、または疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を低減もしくは予防するために、まだ疾患に罹患していない及び／または疾患の症状を示していない対象に投与され得る。対象は、疾患の素因を持っているか、または発症するリスクがあると考えられ得る。
いくつかの実施形態では、主題の組成物、方法、及びキットを使用して、免疫応答を増強する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、サイトカインの全身投与（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内など）による、標的細胞、例えば、がん細胞、感染細胞、自己免疫疾患に関わる免疫細胞などの枯渇または調節が望ましい状態に対して行われる。
本方法は、（ｉ）免疫細胞を含有する試料を単離するステップと、（ｉｉ）そのような細胞を、例えばバリアント受容体を発現する核酸配列またはベクターで形質転換またはトランスフェクトするステップと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞を対象に投与（すなわち、注入）するステップと、（ｉｖ）注入された細胞を刺激するバリアントサイトカインを投与するステップと、を含み得る。特定の態様では、対象は、細胞を対象に投与する前に、免疫除去治療を受けたことがある。特定の態様では、対象は、細胞を対象に投与する前に、免疫除去治療を受けたことがない。特定の態様では、対象は、細胞を対象に投与する前に、本明細書に記載のバリアント受容体を使用しなければ必要となるであろう重症度、用量、及び／または期間が低減された免疫枯渇治療を受けたことがある。
免疫細胞を含有する試料は、例えば上記のように、対象または他の供給源から単離することができる。免疫細胞は、対象自身の末梢血（ファーストパーティー）からか、ドナー末梢血からの造血幹細胞移植の設定（セカンドパーティー）においてか、または非血縁者のドナー由来の末梢血（サードパーティー）から、単離することができる。免疫細胞はまた、幹細胞または他の形態の前駆細胞から誘導分化させるなど、インビトロ方法で誘導することも可能である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、インビボでバリアントサイトカインと接触する、すなわち、免疫細胞をレシピエントに移し、有効量のバリアントサイトカインをレシピエントに投与して、その本来の場所、例えばリンパ節などで免疫細胞と接触させる。いくつかの実施形態では、接触はインビトロで行われる。細胞がインビトロでバリアントサイトカインと接触する場合、サイトカインは、受容体からのシグナル伝達を活性化させるのに十分な用量及び期間、細胞に添加され、これは、天然の細胞内機構の特徴、例えば、アクセサリータンパク質、共受容体などを利用することができる。活性化された細胞は、抗原特異性の決定、サイトカインプロファイリング、及びインビボでの送達に関連する実験目的を含むがこれらに限定されない、任意の目的に使用することができる。
特定の態様では、治療的有効な数の細胞が対象に投与される。特定の態様では、対象は、複数の別々の機会にバリアント受容体を発現する細胞を投与または注入される。特定の実施形態では、少なくとも１ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも１ｘ１０７細胞／ｋｇ、少なくとも１ｘ１０８細胞／ｋｇ、少なくとも１ｘ１０９細胞／ｋｇ、少なくとも１ｘ１０１０細胞／ｋｇ、またはそれ以上が投与され、これは、採取中に得られる細胞、例えば、トランスフェクトされたＴ細胞の数によって制限されることがある。トランスフェクトされた細胞は、任意の生理学的に許容される培地で、通常は血管内で対象に注入することができるが、細胞が増殖に適した部位を見つけ得る、他の任意の都合のよい部位に導入されてもよい。
特定の態様では、治療的有効量のバリアントサイトカインが対象に投与される。特定の態様では、対象は、複数の別々の機会にバリアントサイトカインを投与される。特定の態様では、投与されるバリアントサイトカインの量は、治療的に望ましい結果を達成する（例えば、対象の疾患の症状を軽減する）のに十分な量である。特定の態様では、投与されるバリアントサイトカインの量は、本明細書に記載のバリアントサイトカイン受容体を発現する細胞の細胞周期の進行、増殖、生存、及び／または機能的活性を刺激するのに十分な量である。特定の態様では、バリアントサイトカインは、治療的に望ましい結果を達成するのに必要とされる用量及び／または期間で投与される。特定の態様では、バリアントサイトカインは、本明細書に記載のバリアントサイトカイン受容体を発現する細胞の細胞周期の進行、増殖、生存、及び／または機能的活性を刺激するのに十分な用量及び／または期間で投与される。投与量及び頻度は、薬剤、投与方法、サイトカインの性質などによって異なる場合がある。そのようなガイドラインは個々の状況に合わせて調整されることが当業者によって理解されるであろう。投与量はまた、局所投与（例えば、鼻腔内投与、吸入など）について、全身投与（例えば、筋肉内、腹腔内、血管内など）について、変えることができる。
養子細胞移植の適応症
本開示は、疾患の治療及び／または予防に使用するための、本明細書に記載のバリアント受容体を発現する細胞を提供する。本発明はまた、疾患の治療及び／または予防のための薬剤の製造における、本明細書に記載のバリアント受容体を発現する細胞の使用に関する。
本発明の方法によって治療及び／または予防される疾患は、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、結腸癌、子宮内膜癌、血液悪性腫瘍、腎臓癌（腎細胞）、白血病、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、及び甲状腺癌などの癌性疾患であり得るが、これらに限定されない。
治療及び／または予防される疾患は、自己免疫疾患であってもよい。自己免疫疾患は、自己タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、及び／または他の自己分子を異常に標的とするＴ及びＢリンパ球により、体内の器官、組織、または細胞型（例えば、膵臓、脳、甲状腺、または消化管）の損傷及びまたは機能不全を引き起こして、疾患の臨床症状を引き起こすことが特徴である。自己免疫疾患には、特定の組織に影響を与える疾患と、複数の組織に影響を与えることができる疾患があり、これは、応答が特定の組織に限定された抗原に向けられるか、または体内に広く分布する抗原に向けられるかによって、部分的に左右され得る。自己免疫疾患には、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性甲状腺疾患、及びバセドウ病が含まれるが、これらに限定されるものではない。
治療及び／または予防すべき疾患は、心臓線維症などの炎症性疾患であってもよい。一般に、炎症性状態または障害は、典型的には、免疫系が身体の自身の細胞または組織を攻撃し、異常な炎症を引き起こす可能性があり、慢性的な痛み、発赤、腫脹、硬直、及び正常な組織の損傷をもたらす可能性がある。炎症性疾患は、炎症を特徴とする、または炎症によって引き起こされるものであり、セリアック病、血管炎、ループス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、過敏性腸疾患、動脈硬化、関節炎、筋炎、強皮症、痛風、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬が含まれるが、これらに限定されるものではない。
特定の実施形態では、本方法は、感染症を治療するために使用される。
特定の実施形態では、治療されるべき状態は、移植片拒絶反応を予防及び治療することである。特定の実施形態では、治療及び／または予防されるべき状態は、同種移植片拒絶である。特定の態様では、同種移植片拒絶は、急性同種移植片拒絶である。
治療及び／または予防されるべき疾患は、罹患した個体への細胞、組織、器官、または他の解剖学的構造の移植を含み得る。細胞、組織、臓器、または他の解剖学的構造は、同じ個体（自家または「自家」移植）または異なる個体（同種他家または「同種」移植）に由来する可能性がある。細胞、組織、臓器、または他の解剖学的構造は、細胞クローニング、細胞分化誘導、または合成生体材料による作製を含む、インビトロ方法を用いて作製することも可能である。
本発明は、本明細書に記載のバリアントサイトカイン及び／または細胞（例えば、上記の医薬組成物中の）を対象に投与する１つ以上のステップを含む、疾患を治療及び／または予防するための方法を提供する。
疾患を治療及び／または予防するための方法は、本開示の細胞の治療的使用に関する。本明細書では、細胞は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減、低減、または改善するため、及び／または疾患の進行を減速、低減、または阻止するために、既存の疾患または状態を有する対象に投与することができる。疾患を予防するための方法は、本開示の細胞の予防的使用に関連する。そのような細胞は、疾患の原因を予防もしくは損なわせるため、または疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を低減もしくは予防するために、まだ疾患に罹患していない及び／または疾患の症状を示していない対象に投与され得る。対象は、疾患の素因を持っているか、または発症するリスクがあると考えられ得る。本方法は、（ｉ）免疫細胞を含有する試料を単離するステップと、（ｉｉ）そのような細胞を、本発明によって提供される核酸配列またはベクターで形質転換またはトランスフェクトするステップと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞を対象に投与するステップと、（ｉｖ）注入された細胞を刺激するバリアントサイトカインを投与するステップと、を含み得る。免疫細胞を含有する試料は、例えば上記のように、対象または他の供給源から単離することができる。免疫細胞は、対象自身の末梢血（ファーストパーティー）からか、ドナー末梢血からの造血幹細胞移植の設定（セカンドパーティー）においてか、または非血縁者のドナー由来の末梢血（サードパーティー）から、単離することができる。
治療は、他の活性剤、例えば、抗生物質、抗がん剤、抗ウイルス剤、及び他の免疫調節剤（例えば、プログラム細胞死タンパク質－１［ＰＤ－１］経路に対する抗体またはＣＴＬＡ－４に対する抗体）と組み合わせてもよいが、これらに限定されるものではない。また、追加のサイトカインが含まれてもよい（例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１２など）。
バリアントサイトカイン受容体を発現する幹細胞を使用する方法
本発明は、本明細書に記載のバリアント受容体及び／またはバリアントサイトカインを発現する幹細胞を投与するステップを含む、状態または疾患を治療及び／または予防するための方法を提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載のバリアントサイトカイン受容体及び／またはバリアントサイトカインを発現する幹細胞は、再生医療、細胞／組織／臓器移植、組織再建、または組織修復に使用される。
本発明の医薬組成物
本開示はまた、本明細書に記載のバリアント受容体及び／または本明細書に記載のサイトカインを発現する複数の細胞を含有する医薬組成物に関する。本開示はまた、本明細書に記載のバリアントサイトカインを含有する医薬組成物に関する。本発明の細胞は、医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、本明細書に記載のバリアント受容体を発現する１つ以上の細胞に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は無毒性でなければならず、活性成分の有効性を妨げてはならない。医薬組成物は、任意選択で、１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／または化合物を含んでもよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。
個体に投与されるべき本開示による、本明細書に記載のバリアント受容体及びバリアントサイトカインを発現する細胞の場合、投与は、個体に利益を示すのに十分な「治療的有効量」であることが好ましい。個体に利益を示すのに十分な場合、「予防的に有効な量」もまた投与することができる。投与されるサイトカインの実際の量または細胞数、ならびに投与の速度及び時間経過は、治療される疾患の性質及び重篤度に依存する。治療法、例えば投与量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に知られている他の要因を考慮する。上記の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出すことができる。
医薬組成物は、治療すべき状態に応じて、単独で、または他の治療と組み合わせて、同時投与または逐次投与することができる。
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、例示を目的として提供されているにすぎず、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に対する正確さを確保する努力がなされているが、当然いくつかの実験によるエラー及び偏差が許容されるはずである。
本発明の実施は、別途指示のない限り、当業者の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ手法、細胞培養、養子細胞移植、及び薬理学の従来の方法を用いるであろう。そのような手法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。
実施例１：Ｇ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）の排他的サイトＩＩ界面の合理的デザイン
野生型（ＷＴ）Ｇ－ＣＳＦＷＴ：Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ複合体は、２：２ヘテロ二量体である。Ｇ－ＣＳＦは、Ｇ－ＣＳＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との２つの結合界面を有する。Ｇ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦＲの細胞外サイトカイン受容体相同（ＣＲＨ）ドメインとの間のより大きな界面は、サイトＩＩと呼ばれる。Ｇ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦＲのＮ末端Ｉｇ様（Ｉｇ）細胞外ドメインとの間のより小さな界面は、サイトＩＩＩと呼ばれる（図１を参照）。
共進化した、操作された（Ｅ）Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲＥサイトカイン：受容体ペアを設計するために、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦと、Ｇ－ＣＳＦＲのＩｇ－ＣＲＨ細胞外ドメインとの２：２複合体（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ Ｂａｎｋ ＩＤ ２Ｄ９Ｑ，Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００６）を、サイトＩＩ及びサイトＩＩＩ界面を包含する、それぞれＧ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）及びＧ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）からなる、２つの異なる部分複合体に分離した（図１を参照）。配列については表１を参照のこと。
方法
共進化した排他的なＧ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲＥ変異ペア（デザイン）を作成するために、コンピュテーショナルデザインワークフローを採用した（図２を参照）。まず、サイトＩＩでの排他的デザインを作成した。
Ｇ－ＣＳＦＷＴ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）ＷＴのサイトＩＩ界面相互作用のインシリコ構造解析は、サイトＩＩでの引力ＡＭＢＥＲエネルギー合計１０９．６４ｋｃａｌ／ｍｏｌを占める、ほとんどの分子相互作用が荷電残基によって行われることを示した（図３を参照）。詳細な検査により、ほとんどが静電相互作用と水素結合相互作用、例えば、Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）のＲ１６７とＧ－ＣＳＦのＤ１１２／Ｄ１０９間であることが明らかとなり、これはサイトＩＩでの引力ＡＭＢＥＲエネルギー合計の２８％を占める。別の重要な静電相互作用は、Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）のＲ１４１とＧ－ＣＳＦのＥ１２２／Ｅ１２３間に存在し（図４を参照）、これはサイトＩＩの引力ＡＭＢＥＲエネルギー合計の２１．４％を占める（図３を参照）。同様に、サイトカインのＥ１９と受容体ＣＲＨドメインのＲ２８８の間の塩橋は１７．３％を占め、アルギニンは、受容体ＣＲＨドメインのＤ２００への静電及び水素結合相互作用によってさらに安定化される。
サイトＩＩでの各デザインは、Ｇ－ＣＳＦＥとＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅの変異ペアからなる。まず、サイトＩＩでのポジティブデザインを、例えば、結合パートナー側の塩基性残基を酸性残基に、またはその逆に変異させることによる電荷の反転を通じて作成しながら、必要に応じて追加の変異によりパッキング及び疎水性相互作用を維持した。変異ペアＧ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅは、ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）の平均場パッキングワークフローでパッキングした。パッキングしたサイトＩＩのデザインのインシリコモデルを、構造の完全性について目視で検査し、ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）メトリックにより評価した。具体的には、Ｇ－ＣＳＦＥ変異体が、対応するＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅ変異体に対して、ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）のインシリコでのｄＡＭＢＥＲ結合親和性を１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満有するように設計することを目指した（ペアの相互作用）。このメトリックは、Ｌｅｎｎａｒｄ Ｊｏｎｅｓ親和性及び静電親和性の合計であるＡＭＢＥＲ親和性を、ＷＴ：ＷＴのサイトカイン－受容体ペアのＡＭＢＥＲ親和性と比較したものである。ｄＡＭＢＥＲ＿ｆｏｌｄｉｎｇが８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ超のデザインは除外された。ｄＡＭＢＥＲ＿ｆｏｌｄｉｎｇメトリックは、変異時の、Ｌｅｎｎａｒｄ Ｊｏｎｅｓ結合フォールディングと静電フォールディングの合計の変化をスコアリングする。また、ｄＤＤＲＷアポスタビリティ（ａｐｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）において４００ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも高いスコアを得たデザインも除外した。このメトリックは、タンパク質がそのアポ型から変異した際の、知識ベースの潜在的安定性における変化を表す。
次に、各デザインのＧ－ＣＳＦＥ変異体を、ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）により、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲとの複合体（及びその逆のＧ－ＣＳＦＲＥとＧ－ＣＳＦＷＴ）にパッキングし、以下の２つの複合体Ｇ－ＣＳＦＷＴ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）ＥとＧ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）ＷＴを形成する際のミスペアリング条件下で、各ポジティブデザインのメトリックを評価した。ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）を用いて、ミスペアリングした配向について、インシリコでのｄｄＡＭＢＥＲメトリックを計算した（ｄｄＡＭＢＥＲ＿ａｆｆｉｎｉｔｙ＿Ａｗｔ＿Ｂｍｕｔは、ペアリングした操作された複合体のＡＭＢＥＲ親和性から、ミスペアリングした複合体Ｇ－ＣＳＦＷＴ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）ＥのＡＭＢＥＲ親和性を差し引いたものであり、ｄｄＡＭＢＥＲ＿ａｆｆｉｎｉｔｙ＿Ａｍｕｔ＿Ｂｗｔは、ペアリングした操作された複合体のＡＭＢＥＲ親和性から、ミスペアリングした複合体Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）ＷＴのＡＭＢＥＲ親和性を差し引いたものである。ミスペアリングしたｄｄＡＭＢＥＲ親和性メトリックを最小化するデザインは、野生型サイトカインまたは受容体結合への結合よりも、そのペアリングした結合パートナーに対して選択的であると考えられた。
すべてのサイトＩＩデザインをクラスター化し、Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅ、Ｇ－ＣＳＦＷＴ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅ、Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）ＷＴのパッキングメトリックを検討して、ペアリングの強度（ポジティブデザイン）ならびにＷＴ Ｇ－ＣＳＦ及びＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）とのミスペアリングに対する選択性（ネガティブデザイン）を評価し、デザインのランク付けをした。
結果
表２に記載のデザインは、インシリコでＧ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅのペアリングに有利であるＺｙｍｅＣＡＤ（商標）におけるパッキングメトリックを有し（表３を参照）、塩橋、水素結合の存在と、激しい衝突の不在など、目視検査上、インシリコにおいて満足のいく相互作用を示した（図５を参照）。また、これらのデザインは、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）とのミスペアリングに対して高い選択性を示した（表３を参照）。
したがって、表２に示す同じバリアントＧ－ＣＳＦ及び受容体デザインのサイトＩＩ変異は、それぞれ野生型Ｇ－ＣＳＦＲ及びＧ－ＣＳＦよりも優先的な結合を示すと予測される。
（表３）ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）を用いたトリプリケートインシリコ平均場パッキングからのｋｃａｌ／ｍｏｌで示したＡＭＢＥＲメトリックを有するサイトＩＩデザイン
Figure 2022553152000007
実施例２：サイトＩＩデザインのインビトロスクリーニング
選択されたサイトＩＩデザインは、バキュロウイルスベースの昆虫細胞システムにおいて共発現させたときにサイトＩＩ複合体を形成する能力について、Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅの形式でプルダウン実験でスクリーニングした。また、Ｇ－ＣＳＦＥ変異体の各デザインとＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）ＷＴを共発現させることにより、その逆でＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅ変異体の各デザインをＧＣＳＦＷＴと共発現させることにより、デザインがＷＴ受容体またはサイトカインとミスペアリング複合体を形成できるかどうかを評価した。Ｇ－ＣＳＦＥのみの発現は、サイトカイン変異体の単一感染によって確認した。
方法
簡単に言えば、サイトＩＩ Ｇ－ＣＳＦデザインと対応するペアのＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）変異体は、昆虫細胞トランスフェクションベクターに別々にクローニングした。Ｇ－ＣＳＦ ＷＴ（残基１－１７３、表１）及び変異体を、Ｎ末端分泌シグナル及び配列
Figure 2022553152000008
を有するＣ末端ＴＥＶ切断可能Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐタグがインフレームに存在する改変ｐＡｃＧＰ６７ｂトランスファーベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にクローニングした。受容体細胞外ドメインの中では、サイトＩＩデザイン変異体を有するＣＲＨドメイン（残基９８－３０８、表１）のみが、Ｎ末端分泌シグナル及び配列
Figure 2022553152000009
のＴＥＶ切断可能ヘキサヒスチジン（配列番号８９）タグがインフレームに存在する改変ｐＡｃＧＰ６７ｂトランスファーベクターにクローニングされた。すべてのコンストラクトを合成し、昆虫細胞の発現のためにコドンを最適化した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。トランスファーベクターＤＮＡは、Ｍｉｄｉ－ｐｒｅｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．Ｋ０４８１）により調製し、エンドトキシンを含まず、Ａ２６０／２８０吸光度比が１．８～２．０であった。組換えウイルス生成は、製造元（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の説明に従って付着法を用いて、組換え、線状化バキュロウイルスＤＮＡとベクターＤＮＡを、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ９（Ｓｆ９）細胞に、共トランスフェクションすることにより達成された。トランスフェクションの約１時間前に、０．４６×１０６細胞ｍｌ－１で、健康な対数期Ｓｆ９細胞２ｍＬを６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，ｃａｔ．６５７－１６０）のウェルごとに播種した。トランスフェクション混合物は以下のように調製した：１００μｌのトランスフェクション培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ｃａｔ．９５－０２０－１００）を２本の滅菌１．５ｍｌＭｉｃｒｏｆｕｇｅチューブＡ及びＢのそれぞれに入れた。チューブＡには、０．４μｇの組換えＢｅｓｔＢａｃ ２．０Δ ｖ－ｃａｔｈ／ｃｈｉＡ線状化ＤＮＡ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ｃａｔ．９１－００２）及び２μｇのベクターＤＮＡを加えた。チューブＢには、１．２μｌの５ＸのＥｘｐｒｅｓｓ２ＴＲトランスフェクション試薬（Ｅｘｐｒｅｓ２ＩＯＮ，ｃａｔ．Ｓ２－５５Ａ－００１）を添加した。溶液Ａ及び溶液Ｂを約２４℃で５分間インキュベートした後、それらを合わせて、３０分間インキュベートした。インキュベーション後、８００μｌのトランスフェクション培地を各トランスフェクション反応物に加え、容量を１ｍｌまで増加させた。古いＥＳＦ９２１培地をウェルから取り除き、細胞の単層を乱さないように滴下して１ｍＬのトランスフェクション混合液で置換した。プレート（複数可）を前後左右に穏やかに揺り動かして、トランスフェクション混合物を均一に分散させ、２７℃で４時間インキュベートした。４時間後、トランスフェクション混合物を共トランスフェクションプレート（複数可）から取り出し、ゲンタマイシンを１０μｇ／ｍｌ（ｃａｔ．１５７５０－０６０）で含有する２ｍＬの新鮮なＥＳＦ９２１昆虫細胞培養培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｃａｔ．９６－００１－０１）を滴下して加えた。蒸発を防ぐため、プレートをサランラップで包み、滅菌プラスチックボックスに入れ、２７℃で４～５日間インキュベートした。トランスフェクション後４日目または５日目に、Ｐ１上清を収集し、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して清澄化し、新しい滅菌チューブに移し、光から保護して４℃で保存した。
上記のようにして生成した組換えＰ１ストックをさらに増幅して、タンパク質発現研究のための高力価、低継代のＰ２ストックを得た。次のワークフローでは、共トランスフェクションから採取したウイルスのＰ１シードストックを接種原として使用して、５０～１００ｍＬのウイルスを生成した。１．５ｘ１０６細胞ｍｌ－１での対数期Ｓｆ９細胞５０ｍＬを、２５０ｍＬの振盪フラスコ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．ＰＢＶ ２５０）に播種し、０．５ｍＬのＰ１ウイルスストックを加えた。細胞を２７℃で、１３５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートし、感染について観察した。感染後５～７日目にＰ２ウイルス上清を回収し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより清澄化した。力価の低下を最小限に抑えるため、１０％の熱不活化ＦＢＳ（ＶＷＲ，ｃａｔ．９７０６８－０８５）を加え、Ｐ２ウイルスを４℃で暗所に保管した。
Ｐ２ウイルスストックを、小規模でのタンパク質発現について試験した。Ｐ２ウイルスを使用して、Ｇ－ＣＳＦＥ変異体と対応するＧ－ＣＳＦＲＥ変異体を１２ウェルプレート中のＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｔｎｉ）細胞に共感染させた。Ｇ－ＣＳＦＷＴ及びＧＣＳＦＲ（ＣＲＨ）ＷＴのＰ２ストックを用いて、各デザインの変異体、そしてＧ－ＣＳＦＥ変異体のみについて別々の共感染を実施した。各反応について、２ｘ１０６細胞ｍｌ－１での健康な対数期Ｔｎｉ２ｍＬに、２０μｌのＰ２ウイルスを接種した。プレートは２７℃で約７０時間、１３５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。上清を５０００ｒｐｍで３分間遠心分離により清澄化し、分泌タンパク質を、Ｇ－ＣＳＦＥ変異体及びＧ－ＣＳＦＷＴ上のＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ（ＴＳＴ）を介して、ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ－ＸＴスーパーフロー（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ．２－４０１０－０１０）によりバッチモードでプルダウンした。簡単に言えば、各１．８ｍＬの反応上清に、０．２ｍＬの１０ＸのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を１Ｘの２０μｌのベッドボリューム（ｂ．ｖ）の精製ビーズを加え、反応物を２４℃で転倒式に混合しながら３０分間インキュベーションした。さらに２０μｌのｂ．ｖ．の精製ビーズを加え、続いて、再度３０分間インキュベートした。ビーズを２２００ｒｐｍで３分間遠心分離してペレット化し、上清を除去して１ＸのＨＢＳ緩衝液で洗浄した。タンパク質を３０μｌのＢＸＴ溶出緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＣＬ ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのビオチン（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ．２－１０４２－０２５））で溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液で煮沸して、１２％のＢｏｌｔ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐｌｕｓ、１２ウェルゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．ＮＷ００１２２ＢＯＸ）上で、２００Ｖで３０分間、還元条件下で解析した。
結果
サイトＩＩデザイン＃６、７、８、９、１５、１７、３０、３４、３５、３６は、Ｇ－ＣＳＦＥ単独での発現を示し、Ｇ－ＣＳＦＥ上のＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐタグを介してプルダウンされた十分に安定なペアリングしたＧ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲＥ複合体を形成した（図６を参照）。例えば、操作された複合体のプルダウン後のサイトＩＩデザイン＃６は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで、そのＧ－ＣＳＦＥ変異体の約２２ｋＤａのバンドと、対応する共発現したＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）Ｅ変異体の約３３ｋＤａのバンドを示した（図６を参照）。
サイトＩＩデザイン＃８、９、１５、及び３４は、共発現アッセイにおいて、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ及びＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲとのミスペアリングに対して選択的であり（図７を参照）、その理由は、それらがＷＴ Ｇ－ＣＳＦによってプルダウンされなかったことと（図７の下パネル参照）、ＷＴ受容体がＧ－ＣＳＦＥ変異体によってプルダウンされなかった（図７の上パネル参照）ためである。サイトＩＩ Ｇ－ＣＳＦＲＥデザイン３０及び３５は、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦによってプルダウンされなかったので、共発現アッセイにおいてＷＴ Ｇ－ＣＳＦとのミスペアリングに対して選択的であったが（図７の下パネル参照）、相互Ｇ－ＣＳＦＥデザインは、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲがプルダウンされたため（図７の上パネル参照）、共発現アッセイにおいてＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲとのミスペアリングに対して選択的ではなかった。サイトＩＩデザイン６、７、１７、及び３６は、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲをプルダウンし、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦによってプルダウンされたため、共発現アッセイにおいてＷＴ Ｇ－ＣＳＦまたはＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲとのミスペアリングに対して選択的ではなかった（図７を参照）。
残基Ｒ２８８に変異を有するサイトＩＩ受容体変異体は、Ｉｇドメインを有さないＧ－ＣＳＦＲ（ＣＲＨ）受容体鎖の形式では発現しなかった。Ｒ２８８を含むデザインを、Ｉｇドメイン上のサイトＩＩＩデザインと組み合わせて、ＳＰＲによってペアリングした複合体形成について評価した（実施例６を参照）。したがって、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ及びＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲとのミスペアリングに対しても選択的である、十分に安定な、ペアリングしたＧ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲＥ複合体を形成した、いくつかのサイトＩＩデザインが同定された。
したがって、表２に示す同じバリアントＧ－ＣＳＦ及び受容体デザインのさまざまなサイトＩＩ変異は、それぞれ野生型Ｇ－ＣＳＦＲ及びＧ－ＣＳＦに対する優先的な結合を示す。
実施例３：Ｇ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）の排他的サイトＩＩＩ界面の合理的デザイン
Ｇ－ＣＳＦに結合するサイトＩＩＩ受容体Ｉｇドメインの結合活性効果は、２：２ヘテロ二量体化学量論のＧ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）複合体の形成に寄与する（図１を参照）。ＷＴサイトＩＩＩ界面を有するサイトＩＩにのみ存在する選択的デザインは、完全に排他的な２：２ Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅ複合体を作成するには不十分であるように思われる。ＷＴサイトカインまたは受容体へのミスペアリング結合よりも選択的であるペアリングした共進化デザインの結合を優先するために、実施例１で述べたインシリコデザインワークフローをサイトＩＩＩ界面に適用し、選択的サイトＩＩＩデザインを作成した（図２を参照）。
方法
まず、サイトＩＩＩ界面相互作用の構造解析を実施した。サイトＩＩＩ界面は、５５．６４ｋｃａｌ／ｍｏｌのＡＭＢＥＲエネルギーをＧ－ＣＳＦ：Ｇ－ＣＳＦＲ複合体にもたらし、６９２．６Å２の界面領域のサイトＩＩと比較して、５７１．５Å２の全体的に小さい界面領域を有する。サイトＩＩＩ界面の詳細な検査により、サイトＩＩ界面と比較して、静電相互作用及び水素結合相互作用が少ないことが明らかである（図８を参照）。サイトＩＩＩでの重要な相互作用は、例えば、Ｇ－ＣＳＦのＥ４６と受容体ＩｇドメインのＲ４１間、さらにＧ－ＣＳＦのＲ１４７と受容体ＩｇドメインのＥ９３間の塩橋である（図９を参照）。両方の相互作用は、サイトＩＩＩの引力ＡＭＢＥＲエネルギー合計に対して、それぞれ１５．９％と１５．４％を占める。さらなる相互作用は、例えば、受容体ＩｇドメインのＱ８７を介して作られ、Ｇ－ＣＳＦサイトＩＩＩのバックボーンへの側鎖アミドとの水素結合相互作用を形成し、Ｅ４６及びＬ４９など、サイトカインの周囲の側鎖とのＬｅｎｎａｒｄ Ｊｏｎｅｓ相互作用を有する。この相互作用は、サイトＩＩＩの引力ＡＭＢＥＲエネルギー合計の１２．３％を占める。
次に、Ｇ－ＣＳＦＥ変異体が、その共進化したＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）Ｅ変異体（ペアの相互作用）に対して、インシリコで好ましいＡＭＢＥＲ結合親和性を有するサイトＩＩＩでのポジティブデザインを作成した。これは、例えば、Ｌｅｎｎａｒｄ Ｊｏｎｅｓ及び水素結合相互作用を維持しながら、電荷の反転または形状相補性の変更により実施した。変異体ペアＧ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）Ｅは、ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）の平均場パッキングワークフローでパッキングした。パッキングしたサイトＩＩＩのデザインのインシリコモデルを、構造の完全性について目視で検査し、実施例１に記載のＺｙｍｅＣＡＤ（商標）メトリックにより評価した。次に、各デザインのＧ－ＣＳＦＥ変異体を、ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）により、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）（及びその逆のＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）ＥとＧ－ＣＳＦＷＴ）とパッキングし、ＷＴサイトカイン及び受容体とのミスペアリングの条件下で、メトリックを評価した。サイトＩＩについて実施例１で前述したように、ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）を使用したサイトＩＩＩデザインについて、ｄｄＡＭＢＥＲ親和性メトリック（Ｇ－ＣＳＦＷＴ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）Ｅ、Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）ＷＴ）を計算した（表５を参照）。
サイトＩＩＩデザインをクラスター化し、３つすべてのインシリコ複合体Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）Ｅ、Ｇ－ＣＳＦＷＴ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）Ｅ、Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）ＷＴのパッキングメトリックを目視検査と合わせて検討し、デザインのランク付けのためにペアリングの強度及びＷＴとのミスペアリングに対する選択性を評価した。
結果
表４に記載のデザインは、Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）Ｅのペアリングに有利であるＺｙｍｅＣＡＤ（商標）におけるインシリコパッキングメトリックを有し、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ）とのミスペアリングに対して高い選択性を持っている。したがって、表４に示す同じバリアントＧ－ＣＳＦ及び受容体デザインのさまざまなサイトＩＩＩ変異は、それぞれ野生型Ｇ－ＣＳＦＲ及びＧ－ＣＳＦよりも優先的な結合を示すと予測される。
（表５）ＺｙｍｅＣＡＤ（商標）におけるトリプリケートインシリコ平均場パッキングからのｋｃａｌ／ｍｏｌで示したＡＭＢＥＲメトリックでのサイトＩＩＩデザイン
Figure 2022553152000010
実施例４：バリアント、共進化したサイトカイン受容体スイッチを作成するためのサイトＩＩ及びＩＩＩの組み合わせ
２：２のヘテロ二量体の操作した複合体を介した結合及びシグナル伝達を可能にし、野生型サイトカインまたは受容体との交差反応性が低いか、または完全に消失した完全選択性デザインペアＧ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅを開発するために、実施例１及び３の選択したサイトＩＩ及びＩＩＩデザインを組み合わせ（表６を参照）、インビトロで試験した。
表６のデザインを組み合わせたのと同様に、実施例１のサイトＩＩデザイン（表２）と実施例３のサイトＩＩＩデザイン（表４）の任意の他の組み合わせにより、バリアントシグナル伝達を可能にする完全選択的Ｇ－ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅデザインの組み合わせを得ることができた。組み合わせデザイン４０１及び４０２を、実施例２に記載の共発現アッセイにおいて、操作したＧ：ＣＳＦＥ：Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅ複合体を形成する能力、及びＷＴサイトカインまたは受容体を結合する能力について試験した。
方法
サイトカインＴＳＴタグを介したプルダウンを伴う共発現アッセイは、上記の実施例２で説明したように実施したが、受容体コンストラクトがＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）と呼ばれるＩｇ及びＣＲＨドメイン（残基２－３０８、表１）を含むという点で異なる。
結果
組合せデザイン４０１及び４０２は、本デザインサイトカインが、それらの共進化した、操作された受容体をプルダウンするがＷＴ受容体はプルダウンせず、その逆にＷＴ Ｇ－ＣＳＦが、操作された受容体をプルダウンしなかったという点で、共発現アッセイにおいて完全に選択的であった（図１０を参照）。
これらの結果は、バリアントＧ－ＣＳＦ、ならびに選択したサイトＩＩ及びサイトＩＩＩ変異体を組み合わせたバリアントＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤデザインを含む受容体が、それぞれ操作されたサイトカイン受容体ペアに特異的に結合することができ、野生型受容体またはサイトカインに結合しないことを示す。
実施例５：Ｇ－ＣＳＦ及びＧ－ＣＳＦＲ野生型及び変異体の作製
野生型及び操作されたサイトカイン及び受容体バリアントを作製し、それらの生物物理学的特性を比較するために、組換えタンパク質を発現させ、昆虫細胞から精製した。
方法
Ｇ－ＣＳＦＥ及びＧ－ＣＳＦＷＴを、上記のようにクローン化した。組換えタンパク質の分取スケール生成は、２～４Ｌの健常な対数期Ｔｎｉ細胞において以下のように行った。２×１０６細胞ｍｌ－１での８００ｍＬのＴｎｉに、２ｍｌ細胞当たり２０μｌのサイトカインバリアントＰ２ウイルスを接種し、１３５ｒｐｍで振盪しながら２７℃で７０時間インキュベートした。インキュベーション後、５５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、上清を２回、まず１μｍのＡ／Ｅ型ガラス繊維フィルター（ＰＡＬＬ，ｃａｔ．６１６３１）、続いて０．４５μｍのＰＶＤＦメンブレンフィルター（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ．ＨＶＬＰ０４７００）を通じてろ過した。プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ．５３９１３４）を加え、上清緩衝液をＨＢＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に交換し、タンジェンシャルフローで３００ｍＬに濃縮した。タンパク質を、３ｘ３ｍＬのｂ．ｖ Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ－ＸＴ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗによりバッチモードで精製し、４℃で２ｘ１時間、１ｘ一晩、撹拌しながらインキュベートした。溶出前に樹脂を１０ＣＶのＨＢＳ緩衝液で洗浄した。タンパク質を４ｘ５ｍＬのＢＸＴ溶出緩衝液で溶出した。溶出液をｎａｎｏｄｒｏｐ Ａ２８０及び還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、約２ｍＬに濃縮し、ＴＥＶ：タンパク質比１：８０で１８℃で一晩、ＴＥＶと転倒式に混合してインキュベートすることによりＴＳＴ精製タグを切断した。切断されたタンパク質は、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＳＸ７５ １６／６００またはＳＸ２００ １６／６００サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ．２８－９８９３－３３または２８－９８９３－３５）にロードする前に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した（図１１を参照）。タンパク質含有フラクションを還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、プールして、ｎａｎｏｄｒｏｐ Ａ２８０測定により濃度を測定した。
受容体バリアントのタンパク質精製のために、野生型及びＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅ変異体を上記のようにクローニングし、精製のための受容体コンストラクトはＣＲＨドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ９９０６２の残基３－３０８、表１）に加えてＩｇドメインを含んだ。ウイルスストックを調製し、上記のように２～４Ｌのスケールで感染に使用した。清澄化した上清を、Ｎｉ－ＮＴＡ結合緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール）に緩衝液交換し、上記のように３００ｍＭに濃縮した。タンパク質を、３ｘ３ｍＬのｂ．ｖ Ｎｉ－ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗによりバッチ結合モードで精製し、４℃で２ｘ１時間、１ｘ一晩、撹拌しながらインキュベートした。溶出前に樹脂を１０ＣＶの結合緩衝液で洗浄した。タンパク質を４ｘ５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ溶出緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１ＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール）で溶出した。溶出液を分析し、２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌに緩衝液交換し、濃縮し、上記のように一晩切断した。切断されたタンパク質は、続いて、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＳＸ７５ １６／６００またはＳＸ２００ １６／６００サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした（図１２を参照）。タンパク質含有フラクションを還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、プールして、ｎａｎｏｄｒｏｐ Ａ２８０測定により濃度を測定した。
結果
野生型、Ｇ－ＣＳＦＥ、及びＧ－ＣＳＦＲＥ変異体は、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより判断すると、ＳＥＣ後の純度は９０％を超えていた（図１１及び１２を参照）。デザイン４０１及び４０２のＧ－ＣＳＦＥの１Ｌの培養物当たりのＳＥＣ後の収量は、それぞれ２．７ｍｇ及び１．６ｍｇであった。デザイン４０１及び４０２のＧ－ＣＳＦＲＥの１Ｌの生産当たりのＳＥＣ後の収量は、それぞれ１．７ｍｇ及び１．５ｍｇであった。ＷＴ Ｇ－ＣＳＦは、１Ｌの培養物当たり２．１ｍｇのＳＥＣ後の収量で精製され、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲは、１Ｌの培養物当たり３．１ｍｇのＳＥＣ後の収量で精製された。
これらの結果により、バリアントＧ－ＣＳＦ及び受容体を精製するために使用される方法が、インビトロでの生物物理学的特性の分析に使用される精製タンパク質を得るのに効率的であったことが確認される。
実施例６：ＳＰＲによるペアリングされた及びミスペアリングされた結合パートナーに対するデザインの親和性の決定
共進化した受容体変異体に対するデザインサイトカインの親和性を決定するために、Ｇ－ＣＳＦＲＷＴに対するＧ－ＣＳＦＥの親和性を測定した。また、Ｇ－ＣＳＦＥとＧ－ＣＳＦＲＷＴの親和性、及びＧ－ＣＳＦＷＴとＧ－ＣＳＦＲＥの親和性を、ＳＰＲによりデザインのサブセット（ミスペアリングした）について測定した。
方法
ＳＰＲ結合アッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）で、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０）ランニング緩衝液を用いて、２５℃の温度で実施された。ＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓセンサチップ、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキット（ＮＨＳ，ＥＤＣ，及び１Ｍのエタノールアミン）、及び１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液は、すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した．０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳランニング緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ）はＴｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。デザインは、３つの異なる固定化配向において評価した。
Ｇ－ＣＳＦＥのＧ－ＣＳＦＲＥへの結合親和性を決定するために、Ｇ－ＣＳＦＲＥ変異体を、製造元（ＧＥ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）が説明するように標準的なアミンカップリングにより捕捉した。簡単に説明すると、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化直後に、１０ｍＭのＮａＯＡｃ，ｐＨ５．０中のＧ－ＣＳＦＲＥの５μｇ／ｍＬ溶液を、約７００～９００ＲＵの受容体密度に達するまで５μＬ／分の流速で注入した。残りの活性基は、１Ｍのエタノールアミン塩酸塩－ＮａＯＨ ｐＨ８．５を１０μＬ／分で４２０秒間注入してクエンチした。シングルサイクルキネティクスを用い、６つの濃度の２００ｎＭから始まる対応するＧ－ＣＳＦＥ変異体の２倍希釈系列とブランクの緩衝液対照を、２５μＬ／分で３００秒間、順次注入し、１８００秒の解離相を伴い、緩衝液ブランク基準で一連のセンサーグラムを得た。同じ試料滴定は、バリアントが捕捉されていない基準セルでも実行した。１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．０の１パルス（３０μＬ／分で３０秒間）によって、次の注入サイクルに備えるためにチップを再生した。
Ｇ－ＣＳＦＷＴのＧ－ＣＳＦＲＥへの結合親和性を評価するために、Ｇ－ＣＳＦＥを、上記のように約７００～９００ＲＵの密度でチップ上に捕捉した。シングルサイクルキネティクスを用い、６つの濃度の２００ｎＭから始まる各Ｇ－ＣＳＦＲＷＴの２倍希釈系列とブランクの緩衝液対照を、２５μＬ／分で３００秒間、順次注入し、１８００秒の総解離時間を伴い、緩衝液ブランク基準で一連のセンサーグラムを得た。同じ試料滴定は、上述のようにバリアントが捕捉されず、チップが再生された基準セルでも実行した。
Ｇ－ＣＳＦＥのＧ－ＣＳＦＲＷＴへの結合親和性を評価するために、実施例５に記載されるように精製された組換えＧ－ＣＳＦＲＷＴを、この実施例に記載されるように捕捉した。シングルサイクルキネティクスを用い、６つの濃度の２００ｎＭから始まる各Ｇ－ＣＳＦＥの２倍希釈系列とブランクの緩衝液対照を上述のように順次注入した。同じ試料滴定は、バリアントが捕捉されていない基準セルでも実行した。Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ表面は、上述のように再生した。
対照として、ＷＴＧ－ＣＳＦのＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）への結合を各実験で評価し、各独立した測定内のＫＤ変化倍率を算出するために使用した。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標） Ｔ２００評価ソフトウェアｖ３．０を使用して、２回または３回の繰り返し注入からのダブルリファレンスしたセンサーグラムを分析し、１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。
結果
曲線の会合及び解離相を適合させることによって速度論的導出親和性定数（ＫＤ）を得た。ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）に対するＷＴ Ｇ－ＣＳＦのＫＤは、１．８～２．５Ｅ－９の範囲であった。速度論的パラメータを適合させることができなかった場合、定常状態の親和性定数を導出することを試みた。これらの場合、ＫＤ変化倍率は、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ：ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）ペアの定常状態から導出されたＫＤから算出され、表７に示される。
デザイン９、１３０、１３４、１３７、３０７、４０１、及び４０２は、ＷＴ：ＷＴ ＫＤと２倍以内の違いで、共進化した結合パートナーに対する親和性を示した（表７及び図１３を参照）。
デザイン９、３０、及び３４のＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅ変異体は、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）と比較してＷＴ Ｇ－ＣＳＦに対して７００倍を超える弱い親和性を示した。デザイン＃３５のＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅは、ＷＴサイトカインとのミスペアリングに対して選択性が低く、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦに対する親和性はＷＴ：ＷＴ親和性と比較して約１９分の１に減少した。デザイン１３０、１３４、４０１、４０２、３００、３００３、３０４、及び３０７のＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅ変異体は、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦとのミスペアリングに対して最も選択的であり、滴定された濃度でＷＴ Ｇ－ＣＳＦに対して顕著な結合を示さなかった（表８、図１３を参照）。
デザイン１２４、１３０、４０１、４０２、３００、３０３、３０４、及び３０７のＧ－ＣＳＦＥ変異体は、滴定された濃度でＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）に対して顕著な結合を示さなかった。デザイン９、３０、及び３４のＧ－ＣＳＦＥ変異体は、ＷＴ：ＷＴ ＫＤと比較して、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）に対して少なくとも約２０倍弱いＫＤを示した。デザイン＃１３４のＧ－ＣＳＦＥは、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）に対して約５００倍弱い親和性を示した（表９、図１３を参照）。デザイン３５及び１１７のＧ－ＣＳＦＥ変異体は、ＷＴ：ＷＴ ＫＤと同様にＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）に対する結合を示す。
これらの結果は、選択されたバリアントＧ－ＣＳＦデザインが野生型Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤに結合しないか、または野生型Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤに対して親和性が大幅に低下して結合する（少なくとも約２０倍弱いＫＤ）ことを示す。
（表７）ＳＰＲによって測定されたＷＴ：ＷＴ結合親和性と比較した対応するＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅ変異体に対するＧ－ＣＳＦＥ変異体の結合親和性（ＫＤ）の変化
Figure 2022553152000011
ssは、定常状態から導出された親和性定数を示す。
（表８）ＳＰＲによって測定されたＷＴ：ＷＴ結合親和異性と比較したデザインＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅに対するＷＴ Ｇ－ＣＳＦの結合親和性の変化
Figure 2022553152000012
ssは、定常状態から導出された親和性定数を示す。
（表９）ＳＰＲによって測定されたＷＴ：ＷＴ結合親和異性と比較した野生型Ｇ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）に対するＧ－ＣＳＦＥの結合親和性の変化
Figure 2022553152000013
実施例７：デザインＧ－ＣＳＦ Ｅ 変異体の熱安定性の測定
ＷＴサイトカイン及び受容体と比較したＧ－ＣＳＦＥ及びＧ－ＣＳＦＲＥ変異体の熱安定性を測定するために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施した。
方法
バリアントの熱安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により以下のように評価した：濃度１～２ｍｇ／ｍＬの精製試料９５０ｍＬを、Ｎａｎｏ ＤＳＣ（ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）を用いたＤＳＣ分析に使用した。各分析の開始時に、ベースラインの安定化のために緩衝液ブランクの注入を行った。各試料を、６０ｐｓｉの窒素圧力下、６０℃／時の速度で２５～９５℃で走査した。得られたサーモグラムを参照し、ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅソフトウェアを用いて解析し、熱安定性の指標となる融解温度（Ｔｍ）を測定した。
結果
操作されたバリアントの熱安定性は、同じ条件及び実験設定下で測定された、操作された分子と同等の野生型分子との間の最も顕著な遷移（最高のエンタルピー）の差として報告される。測定されたＷＴ ＧＣＳＦのＴｍは、独立した実験間で５２．２～５５．４℃の間で変動し、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦＲのＴｍは５０．５℃を示した。デザイン＃１５及び３４を除いて試験したＧ－ＣＳＦＥ変異体は、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦのＴｍとは５℃未満異なるＴｍを示した（表１０及び図１４を参照）。試験したすべての受容体変異体は、ＷＴ受容体と同じ熱安定性を示した（表１０及び図１４を参照）。
これらの結果は、バリアントＧ－ＣＳＦ、及びバリアントＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤデザインを有する受容体が、野生型Ｇ－ＣＳＦ及びＧ－ＣＳＦＲと同様の熱安定性を有することと、サイトＩＩ及び／またはサイトＩＩＩ変異が、Ｇ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤのいずれの熱安定性も損なわないことを示したものである。
（表１０）ＤＳＣによって測定された野生型と比較したデザインサイトカイン及び受容体変異体の融解温度（Ｔｍ）の変化
Figure 2022553152000014
Figure 2022553152000015
＊１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５で測定
実施例８：ＵＰＬＣ－ＳＥＣによるＧ－ＣＳＦ Ｅ 変異体の単分散性の測定
ＷＴ Ｇ－ＣＳＦと比較したＧ－ＣＳＦＥ変異体の単分散性を測定するために、ＵＰＬＣ－ＳＥＣによって変異体を分析した。
方法
ＳＥＣ精製したタンパク質試料に対して、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ１２５ ＳＥＣカラム（４．６ｘ１５０ｍｍ，ステンレススチール，１．７μｍ粒子）（Ｗａｔｅｒｓ ＬＴＤ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を３０℃に設定し、ＰＤＡ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩシステムに取り付けてＵＰＬＣ－ＳＥＣを実施した。分析時間は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０または１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５のランニング緩衝液を用いて、流速０．４ｍＬ／分で７分間のランタイムで構成された。溶出は、２１０～５００ｎｍの範囲でＵＶ吸光度によりモニターし、クロマトグラムは２８０ｎｍで抽出した。ピーク積分は、ＯｐｅｎＬＡＢ（商標）ＣＤＳ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェアを使用して実施した。
結果
ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ及びデザイン３４、３５、及び１３０のＧ－ＣＳＦＥ変異体は、１００％単分散性であった（表１１を参照）。変異体８、９、１５、１１７、１３５は、６５．３～７９．５％のより低い単分散性を示した。デザイン＃１３４サイトカインは、ｐＨ８．０で５７．３％の単分散性を示したが、ｐＨ６．５では８６．６％の単分散性に改善した。移動相のより低いｐＨでの単分散性の改善は、ｐＩのシフト（例えば、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦでの算出されたｐＩ５．４１からデザイン＃１３４のＧ－ＣＳＦＥでの算出されたｐＩ８．３５へ）に起因する可能性がある。
これらの結果から、バリアントＧ－ＣＳＦデザインのいくつかは野生型Ｇ－ＣＳＦと同じ１００％単分散性を持つことが示され、サイトＩＩ及び／またはサイトＩＩＩ変異体のサブセットがＧ－ＣＳＦの単分散性を損なわないことが示唆される一方で、他のバリアントＧ－ＣＳＦデザインでは単分散性が低くなり、低いｐＨで増加したことが示された。
（表１１）ＵＰＬＣ－ＳＥＣによって測定されたＧ－ＣＳＦＥデザインの変異体の単分散性
Figure 2022553152000016
＊１５０ｍＭのＮａＣｌ、ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５における
実施例９：細胞内ＩＬ－２受容体シグナル伝達ドメインを有するキメラＧ－ＣＳＦ受容体の構築
デザインＧ－ＣＳＦＥサイトカイン変異体がデザインＧ－ＣＳＦＲ（Ｉｇ－ＣＲＨ）Ｅ受容体変異体を介してシグナル伝達し、免疫細胞増殖を引き起こすことができるかどうかを調べるために、ｇｐ１３０膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＣＤ）、ならびにＩＬ－２Ｒβ細胞内シグナル伝達ドメインに融合したＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを使用して、一本鎖キメラＧ－ＣＳＦ受容体（Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβ）を構築した。また、ヘテロ二量体受容体として共発現するように設計された２つのサブユニットからなるキメラＧ－ＣＳＦＲを利用した：１）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２ＲβサブユニットはＩＬ－２ＲβＴＭ及びＩＣＤに融合したＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤからなり、２）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγｃサブユニットは共通γ鎖（γｃ，ＩＬ－２Ｒγ２Ｒγ）ＴＭ及びＩＣＤに融合したＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤからなる。
方法
一本鎖キメラ受容体構築物は、Ｇ－ＣＳＦＲシグナルペプチド及びＥＣＤ、次いでｇｐ１３０ ＴＭ及び部分ＩＣＤ、ならびにＩＬ－２Ｒβ部分ＩＣＤを含むように設計した（表１２）。ヘテロ二量体キメラ受容体構築物は、以下を含むように設計した：１）Ｇ－ＣＳＦＲシグナルペプチド及びＥＣＤ、次いでＩＬ－２ＲβＴＭ及びＩＣＤ（表１３）；ならびに２）Ｇ－ＣＳＦＲシグナルペプチド及びＥＣＤ、次いでγｃ ＴＭ及びＩＣＤ（表１４）。キメラ受容体構築物をレンチウイルストランスファープラスミドにクローニングし、構築物配列をサンガーシークエンシングにより確認した。トランスファープラスミド及びレンチウイルスパッケージングプラスミド（ｐｓＰＡＸ２、ｐＶＳＶＧ）を、以下のようにレンチウイルスパッケージング細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ）に共トランスフェクションさせた：細胞を、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で一晩プレーティングし、トランスフェクションの２～４時間前に培地交換した。プラスミドＤＮＡ及び水をポリプロピレンチューブ内で混合し、ＣａＣｌ２（０．２５Ｍ）を滴下して加えた。２～５分間インキュベートした後、２ｘのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（０．２８ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．１ＭのＨＥＰＥＳ）と１：１で混合することにより、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡ混合物を細胞上に添加し、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７培地を交換し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。翌朝、プレートから細胞上清を回収し、軽く遠心分離して破片を除去し、０．４５μｍフィルターで濾過した。上清をＢｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－ＸＰ超遠心機のＳＷ－３２Ｔｉローターを用いて２５，０００ｒｐｍで９０分間回転させた。上清を除去し、ペレットを適当量のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に再懸濁させた。ウイルスの連続希釈液をＢＡＦ３細胞（１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び１００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を含有する増殖用ＲＰＭＩ）に添加することにより、ウイルス力価を測定した。形質導入の４８～７２時間後、細胞を抗ヒトＧ－ＣＳＦＲ ＡＰＣコンジュゲート抗体（１：５０希釈）及びｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（１：１０００希釈）とともに４℃で１５分間インキュベートして洗浄し、Ｃｙｔｅｋ ＡｕｒｏｒａまたはＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。この方法により測定した推定力価を用いて、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞株（１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び３００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を含有するＲＰＭＩにおいて増殖）に、ＭＯＩ０．５でキメラ受容体構築物をコードするレンチウイルス上清を形質導入した。形質導入は、適切な量のウイルス上清を細胞に添加し、２４時間インキュベートし、細胞培地を交換することにより行った。形質導入から３～４日後、上記のようにフローサイトメトリーによりヒトＧ－ＣＳＦＲの発現を確認した。ＢｒｄＵアッセイを行う前に、細胞をＧ－ＣＳＦＷＴ中で約１４～２８日間増殖させた。
上記のようにＧ－ＣＳＦＷＴ中で増殖した３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、関連するアッセイサイトカイン（サイトカインなし、ｈＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）またはＧ－ＣＳＦＥ（３０ｎｇ／ｍｌ）を含有する新鮮な培地で４８時間再プレーティングした。ＢｒｄＵアッセイ手順は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）ＡＰＣ ＢｒｄＵフローキット（５５７８９２）の取扱説明書に従って行い、さらに以下を追加した：細胞をＢｒｄＵ及びｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（１：５０００）と３０分間共インキュベートした。Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ機器を使用して、分析フローサイトメトリーを実行した。
結果
ＢｒｄＵアッセイでは、一本鎖キメラ受容体構築物Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβまたはヘテロ二量体受容体構築物Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγｃでトランスフェクトした細胞は、Ｇ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）に反応してｈＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）と比較して同等または優れた増殖が示された。細胞は、サイトカインの非存在下では増殖しなかった（図１５を参照）。
これらの結果は、Ｇ－ＣＳＦによる刺激により、一本鎖及びヘテロ二量体キメラ受容体構築物が、細胞増殖を誘発するように活性化され得ることを示す。
実施例１０：ＢｒｄＵにより調査したデザイン１３７のＧ－ＣＳＦＲ Ｅ －ＩＣＤ ＩＬ－２ で形質導入され、野生型またはデザインＧ－ＣＳＦ １３７ で処理された３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞の増殖
ＳＰＲまたは共発現アッセイによって判断されるように十分に選択的であったサイトＩＩ／ＩＩＩの組み合わせデザインを、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞の増殖を誘発する能力についてインビトロで試験した。
方法
デザイン１３７の点変異を、表１２～１４に記載の構築物に導入した。Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβ（ホモ二量体）またはＧ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤγｃ（ヘテロ二量体）構築物のクローニング及び発現は、上記と同じ手順に従った。ＢｒｄＵアッセイを行う前に、細胞をＧ－ＣＳＦ１３７中で約１４～２８日間増殖させた。
Ｇ－ＣＳＦ１３７中で増殖した３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞を、上記のＢｒｄＵアッセイ手順を用いて、Ｇ－ＣＳＦ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、またはサイトカインなしでの増殖に関してアッセイした。
結果
ＢｒｄＵアッセイでは、一本鎖キメラ受容体構築物Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβまたはヘテロ二量体受容体構築物Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤγｃで形質導入された細胞は、Ｇ－ＣＳＦ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）においてｈＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）と比較して同等または優れた増殖が示された。細胞はサイトカインの非存在下では増殖せず、Ｇ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）において劣った増殖を示した（図１６を参照）。
これらの結果は、バリアントＧ－ＣＳＦが操作された受容体を特異的に活性化させることを示し；逆に、操作された受容体はバリアントＧ－ＣＳＦによって活性化されるが、野生型Ｇ－ＣＳＦよりも顕著に活性化されないことを示している。したがって、バリアントＧ－ＣＳＦは、バリアントＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤによってキメラ受容体を特異的に活性化して、キメラ受容体を発現する細胞の増殖を特異的に誘発することができる。
実施例１１：ＢｒｄＵにより調査した、野生型Ｇ－ＣＳＦＲ－ＩＣＤ ＩＬ－２ で形質導入され、野生型またはデザインＧ－ＣＳＦ Ｅ で処理された３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞の増殖
続いて、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒ２Ｒβ細胞においてペアリングしたシグナル伝達を回復することができたサイトＩＩ／ＩＩＩの組み合わせデザインを、一本鎖キメラ受容体構築物Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβまたはヘテロ二量体受容体構築物Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγｃで形質導入された３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒ２Ｒβ細胞の増殖を誘発する能力について試験した。
方法
Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβ（ホモ二量体）またはＧ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγｃ（ヘテロ二量体）構築物のクローニング及び発現は、上記と同じ手順に従った。ＢｒｄＵアッセイを行う前に、細胞をＧ－ＣＳＦＷＴ中で約１４～２８日間増殖させた。
Ｇ－ＣＳＦＷＴ中で増殖した３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞を、上記のＢｒｄＵアッセイ手順を用いて、Ｇ－ＣＳＦ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、またはサイトカインなしでの増殖に関してアッセイした。
結果
ＢｒｄＵアッセイでは、一本鎖キメラ受容体構築物Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβまたはヘテロ二量体受容体構築物Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ及びＧ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγｃで形質導入された細胞は、Ｇ－ＣＳＦ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）においてＧ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）と比較して劣った増殖が示された。細胞は、サイトカインの非存在下では増殖しなかった（図１７を参照）。
これらの結果は、バリアントＧ－ＣＳＦが野生型Ｇ－ＣＳＦＲに効率的に結合せず、バリアントＧ－ＣＳＦが操作された受容体を特異的に活性化させるが、野生型Ｇ－ＣＳＦＲは活性化せず、細胞増殖を誘発することを示している。
実施例１２：ウエスタンブロットにより分析したＷＴまたはデザイン１３７のＧ－ＣＳＦＲ Ｅ －ＩＣＤ ＩＬ－２ で形質導入され、野生型またはデザインＧ－ＣＳＦ １３７ で処理された３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞のシグナル伝達
３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞の操作されたサイトカイン受容体複合体を介して増殖シグナル伝達を回復することができ、Ｇ－ＣＳＦＷＴまたはＷＴ－ＧＣＳＦＲ－ＩＣＤ－ＩＬ２の結合を介して有意にシグナル伝達しなかったサイトＩＩ／ＩＩＩの組み合わせデザインを、Ｇ－ＣＳＦＷＴまたはＧ－ＣＳＦ１３７に応答して下流のシグナル伝達分子を活性化させる能力についてウエスタンブロットによって評価した。
方法
Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβ（ホモ二量体）またはＧ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγｃ（ヘテロ二量体）構築物のクローニング及び発現は、上記と同じ手順に従った。ウエスタンブロットアッセイを実施する前に、細胞をＧ－ＣＳＦ１３７またはＧ－ＣＳＦＷＴで約１４～２８日間増殖させた。非形質導入細胞はＩＬ－２において維持した。
ウエスタンブロットを行うために、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、サイトカインを含まない培地で１６～２０時間静置した。細胞を、サイトカインなし、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）、またはＧ－ＣＳＦＷＴ（３０ｎｇ／ｍｌ）で、３７℃で２０分間刺激した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７７７．９、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、１ｘのＰｉｅｒｃｅプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤ミニタブレット（Ａ３２９６１）を含有する洗浄緩衝液で細胞を１回洗浄した。０．２％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ６３０（Ｓｉｇｍａ）を加えた上記洗浄緩衝液中、氷上で、１０分間細胞を溶解し、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離後、上清（細胞質画分）を回収した。ペレットを、０．４２ＭのＮａＣｌ及び２０％のグリセロールを加えた上記洗浄緩衝液中で溶解及び再懸濁させた。細胞を氷上で３０分間、頻繁にボルテックスしながら溶解し、１３，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した後、核画分（上清）を回収した。細胞質画分と核画分を１０分間還元し（７０℃）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルで泳動した。ゲルをニトロセルロース膜に転写し（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）ＳＤセミドライ転写セルにて２０Ｖで６０分）、乾燥し、ＴＢＳ中のＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液（９２７－５００００）で１時間ブロッキングした。ブロットを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ中のＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液中、４℃で一次抗体（１：１，０００）を用いて一晩インキュベートした。使用した一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した：Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｈｃ（Ｔｙｒ２３９／２４０）抗体＃２４３４、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ＃４０６０、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）抗体＃２２１１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体＃９１０１、β－アクチン（１３Ｅ５）ウサギｍＡｂ＃４９７０、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｄ３Ａ７）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ＃９１４５、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ５（Ｔｙｒ６９４）（Ｃ１１Ｃ５）ウサギｍＡｂ＃９３５９、及びヒストンＨ３（９６Ｃ１０）マウスｍＡｂ＃３６３８。ブロットを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで３回洗浄し、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ緩衝液中で二次抗体（１：１０，０００）とともに室温で３０～６０分間インキュベートした。二次抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した：抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） （ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ４ＸのＰＥＧコンジュゲート）＃５２５７及び抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ４Ｘ ＰＥＧコンジュゲート）＃５１５１。ブロットを洗浄し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージャーで露光した。
結果
非形質転換３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞において、ＩＬ－２のみでの刺激に応答した活性化ＩＬ－２Ｒ関連シグナル伝達分子を検出した。Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２ＲβまたはＧ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγｃのいずれかを発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞において、ＩＬ－２またはＧ－ＣＳＦＷＴに応答した活性化シグナル伝達分子の同様のパターンが観察された。Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβを発現するまたはＧ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγｃを発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞のＧ－ＣＳＦ１３７刺激に応答したＩＬ－２Ｒ関連シグナル伝達分子の活性化は観察されなかった。Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２ＲβまたはＧ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤγｃを発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞において、ＩＬ－２またはＧ－ＣＳＦ１３７に応答した活性化シグナル伝達分子の同様のパターンが観察された。Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβを発現するまたはＧ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβ＋Ｇ－ＣＳＦＲ１３７－ＩＣＤγｃを発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞のＧ－ＣＳＦＷＴ刺激に応答したＩＬ－２Ｒ２Ｒ２Ｒ関連シグナル伝達分子の活性化は観察されなかった。
これらの結果は、バリアントＧ－ＣＳＦが、バリアントＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを発現するキメラ受容体を活性化して、キメラ受容体を発現する細胞における天然型サイトカインシグナル伝達の特徴を誘発することができることを実証している。
実施例１３～３０の方法
初代細胞及び細胞株：レンチウイルスパッケージング細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ）は、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。ＢＡＦ３－ＩＬ－２Ｒβ細胞を、ＢＡＦ３細胞株へのヒトＩＬ－２Ｒβサブユニットの安定的トランスフェクションによって事前に生成し、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び１００ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃａｎａｄａ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０において増殖させた。３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞株を、３２Ｄ細胞株へのヒトＩＬ－２Ｒβサブユニットの安定的トランスフェクションによって事前に生成し、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び３００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２、または示された他のサイトカインを含有するＲＰＭＩ－１６４０において増殖させた。ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を、３％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｈ４５２２）、及び３００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２、または示された他のサイトカインを含有するＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地（Ｍｉｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９７－１９６）において増殖させた。ヒト腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）を、Ｔ細胞培地（以下の５０：５０混合物）において、初代腹水試料を１４日間培養することにより生成した：１）１０％ウシ胎児血清、５０ｕＭβ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ－１６４０；及び２）最終濃度３０００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を含有するＡＩＭ Ｖ（商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１２０５５０８３）。この高用量のＩＬ－２増殖の後、ＴＡＬを３００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２または示された他のサイトカインを含有するＴ細胞培地において培養した。レトロウイルスパッケージング細胞株Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＲＶ－１０１）を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、プロマイシン（１ｍｃｇ／ｍｌ）、及びブラストサイジン（１０ｍｃｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭにおいて培養した。
レンチウイルスの生成及び３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞の形質導入：キメラ受容体構築物をレンチウイルストランスファープラスミドにクローニングし、得られた配列をサンガーシークエンシングにより確認した。トランスファープラスミド及びレンチウイルスパッケージングプラスミドは、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、以下のようにＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞に共トランスフェクトした：細胞は一晩プレーティングし、トランスフェクションの２～４時間前に培地交換した。プラスミドＤＮＡ及び水をポリプロピレンチューブ内で混合し、ＣａＣｌ２（０．２５Ｍ）を滴下して加えた。２～５分間インキュベートした後、２ｘのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（０．２８ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．１ＭのＨＥＰＥＳ）と１：１で混合することにより、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡ混合物を細胞上に添加し、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７培地を交換し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。翌朝、プレートから細胞上清を回収し、軽く遠心分離して破片を除去し、上清を０．４５ミクロンフィルターで濾過した。上清をＢｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－ＸＰ超遠心機のＳＷ－３２Ｔｉローターを用いて２５，０００ｒｐｍで９０分間回転させた。上清を除去し、ペレットを適当量のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に再懸濁させた。ウイルスの連続希釈液をＢＡＦ３－ＩＬ－２Ｒβ細胞に添加することにより、ウイルス力価を決定した。形質導入の４８～７２時間後に、細胞を抗ヒトＧ－ＣＳＦＲ ＡＰＣコンジュゲート抗体（１：５０；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９７－３０８）及びＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（１：１０００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、６５－０８６３－１４）とともに４℃で１５分間インキュベートして洗浄し、Ｃｙｔｅｋ ＡｕｒｏｒａまたはＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。この方法により測定した推定力価を用いて、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞株に、感染多重度（ＭＯＩ）０．５でキメラ受容体構築物をコードするレンチウイルス上清を形質導入した。形質導入は、適切な量のウイルス上清を細胞に加え、２４時間インキュベートした後、培地を交換することによって行った。形質導入の３～４日後に、ヒトＧ－ＣＳＦＲの発現を、上記のようにフローサイトメトリーにより測定した。
ヒト初代Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入：ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞及びＴＡＬの形質導入のために、細胞を解凍し、Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－１１１－１６０）の存在下で、製造元のガイドラインに従って、プレーティングした。活性化の２４時間後、レンチウイルス上清をＭＯＩ０．１２５～０．５で添加した。活性化の４８時間後、細胞を新鮮な培地に分割し、残留ウイルス及び活性化試薬を除去した。形質導入の２～４日後に、上記のようにフローサイトメトリーにより形質導入効率を測定した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋画分の形質導入効率を別々に測定した実験では、ヒトＧ－ＣＳＦＲに対する抗体、ＣＤ４（１：５０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３００５２６）、ＣＤ８（１：５０，ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３０１０３０）、ＣＤ３（１：５０，Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（商標）コンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３００４４８）及びＣＤ５６（１：５０，Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１（商標）コンジュゲート，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３１８３３６）を、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（１：１０００）とともに、利用した。
ヒトＴ細胞及び３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ増殖アッセイ：上記で生成した、示されたキメラ受容体構築物を発現するヒト初代Ｔ細胞または３２－ＩＬ－２Ｒβ細胞を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、新鮮な培地で再プレーティングするか、示されたように、その培地を徐々に交換した。完全培地を交換し、野生型ヒトＧ－ＣＳＦ（自家生成またはＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標），Ａｍｇｅｎ Ｃａｎａｄａ）、変異体Ｇ－ＣＳＦ（自家生成）、ｈＩＬ－２、またはサイトカインなしのいずれかを含有するようにした。３～５日ごとに、トリパンブルー排除により細胞生存率及び密度を測定し、開始時細胞数に対する増殖倍率を算出した。Ｇ－ＣＳＦＲの発現は、上記のようにフローサイトメトリーにより評価した。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ヒトＴＡＬ増殖アッセイ：： ＴＡＬのＣＤ４＋及びＣＤ８＋画分の増殖を調べるために、エクスビボ腹水試料を解凍し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋画分を、それぞれ、Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９６－５３３）及びＨｕｍａｎ ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９６－４９５）を用いて富化させた。サイトカイン含有培地での増殖後、細胞の免疫表現型を、ヒトＧ－ＣＳＦＲに対する抗体、ＣＤ４（１：５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００コンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３００５２６）、ＣＤ８（１：５０、ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３０１０３０、ＣＤ３（１：５０，Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（商標）コンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３００４４８）、及びＣＤ５６（１：５０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１（商標）コンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３１８３３６）を利用して、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（１：１０００）とともに、フローサイトメトリーにより評価した。
初代ヒトＴ細胞免疫表現型解析アッセイ：サイトカイン含有培地での増殖後、Ｔ細胞の免疫表現型を、ヒトＧ－ＣＳＦＲに対する抗体、ＣＤ４（１：１００，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００コンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３００５２６またはＰＥコンジュゲート、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、１２－００４８－４２、またはＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５７０（商標）コンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１７４４５）、ＣＤ８（１：１００、ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３０１０３０）、ＣＤ３（１：１００、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（商標）またはＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７５０（商標）コンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３００４４８または３４４８４５）、ＣＤ５６（１：１００、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１（商標）コンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３１８３３６）、ＣＣＲ７（１：５０、ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ（商標）７５０コンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５３２４６）、ＣＤ６２Ｌ（１：３３、ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ（商標）５９４コンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０４８４２）、ＣＤ４５ＲＡ（１：３３、ＦＩＴＣコンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０４１４８）、ＣＤ４５ＲＯ（１：２５、ＰｅｒＣＰ－ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７１０コンジュゲート、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、４６－０４５７－４２）、ＣＤ９５（１：３３、ＰＥ－シアニン７コンジュゲート、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、２５－０９５９－４２）を利用して、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０または５１０６（１：１０００）とともに、フローサイトメトリーにより評価した。
レトロウイルス形質導入： ｐＭＩＧトランスファープラスミド（プラスミド＃９０４４、Ａｄｄｇｅｎｅ）は、制限エンドヌクレアーゼクローニングにより変更され、ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（ＢｇｌＩＩからＰａｃＩサイト）を除去し、カスタムマルチクローニングサイトをコードするアニーリングプライマーを導入した。キメラ受容体構築物をカスタマイズしたトランスファープラスミドにクローニングし、得られた配列をサンガーシークエンシングにより確認した。トランスファープラスミドを、上記のように、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてＰｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、培地を５ｍｌの新鮮な完全培地に交換した。トランスフェクションの４８時間後、細胞上清をプレートから回収し、０．４５ミクロンフィルターで濾過した。臭化ヘキサジメトリン（１．６ｍｃｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びマウスＩＬ－２（２ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を上清に添加した。この精製されたレトロウイルス上清を使用して、以下に記載するようにマウスリンパ球に形質導入した。
レトロウイルス上清を回収する４８時間前に、２４ウェル付着プレートを、ＰＢＳ中で希釈した非コンジュゲート抗マウスＣＤ３（５ｍｃｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５３０５８）及び抗マウスＣＤ２８（１ｍｃｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５３２９４）抗体でコートし、４℃で保存した。レトロウイルス上清を回収する２４時間前に、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（自家生成）を、ビクトリア大学動物実験委員会が管理する承認済みの動物実験計画書の下で安楽死させた。脾臓を採取し、マウスＴ細胞を以下のように単離した：脾臓を手作業で取り除き、１００ミクロンフィルターで濾過した。赤血球は、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１０４９２０１）中で室温で５分間インキュベートすることにより溶解し、その後、血清含有培地で１回洗浄した。ＣＤ８ａ陽性細胞またはＰａｎ－Ｔ細胞を、特異的ビーズベース分離キット（それぞれＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－１０４－０７５または１３０－０９５－１３０）を使用して単離した。細胞を、マウスＴ細胞増殖培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５ｍＭβ－メルカプトエタノール、及び２ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２１２－１２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０）中の抗ＣＤ３－抗体及び抗ＣＤ２８－抗体または３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）でコートしたプレートに加えて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。形質導入当日、培地の約半分を上記で生成したレトロウイルス上清と交換した。このレトロウイルス上清を用いて、３０℃で９０分間、１０００ｇで細胞をスピンフェクトした。プレートをインキュベーターに０～４時間戻し、その後、培地の約半分を新鮮なＴ細胞増殖培地と交換した。上記のように、レトロウイルス形質導入を２４時間後に繰り返し、合計２回の形質導入を行った。最後の形質導入から２４時間後に、Ｔ細胞を６ウェルプレートに分割し、抗体刺激から除去した。
形質導入の４８～７２時間後、上記のように、ヒトＧ－ＣＳＦＲ、ＣＤ４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２コンジュゲート、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、５８－００４２－８２）、ＣＤ８ａ（ＰｅｒＣＰ－ｅＦｌｕｏｒ ７１０コンジュゲート、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、４６－００８１－８２）、及びＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（１：１０００希釈）を検出するフローサイトメトリーにより形質導入効率を評価した。
ＢｒｄＵ取り込みアッセイ：上記のように生成したヒト初代Ｔ細胞、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞、またはマウス初代Ｔ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、関連するアッセイサイトカイン：サイトカインなし、ｈＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型または操作されたＧ－ＣＳＦ（個々の実験で示された濃度）を含有する新鮮な培地で４８時間再プレーティングした。ＢｒｄＵアッセイ手順は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）ＡＰＣ ＢｒｄＵフローキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５７８９２）の取扱説明書に従って行い、さらに以下を追加した：細胞をＢｒｄＵ及びＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（１：５０００）と３０分間～４時間、３７℃で共インキュベートした。Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ機器を使用して、フローサイトメトリーを実行した。キメラ受容体を発現するマウスＴ細胞の増殖を特異的に評価するために、ヒトＧ－ＣＳＦＲ（１：２０希釈）、ＣＤ４（１：５０希釈）、及びＣＤ８（１：５０希釈）の追加染色を、固定化前に、氷上で１５分間実施した。
ウエスタンブロット：上記のように生成したヒト初代Ｔ細胞、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞、またはマウス初代Ｔ細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、サイトカインを含まない培地で１６～２０時間静置した。細胞を、サイトカインなし、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（個々の実験で示された濃度）、またはＧ－ＣＳＦ１３７（３０ｎｇ／ｍｌ）によって、３７℃で２０分間刺激した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、及び１ｘのＰｉｅｒｃｅプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤ミニタブレット（Ａ３２９６１）を含有する緩衝液で細胞を１回洗浄した。細胞を上記の洗浄緩衝液に溶解し、０．２％のＮＰ－４０（Ｓｉｇｍａ）を氷上で１０分間加えた。溶解物を４℃で１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（細胞質画分）を収集した。ペレット（核タンパク質を含む）を、０．４２ＭのＮａＣｌ及び２０％のグリセロールを加えた上記洗浄緩衝液中で再懸濁させた。核を氷上で頻繁にボルテックスしながら３０分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した後、上清（核画分）を回収した。細胞質画分と核画分を１０分間還元し（７０℃）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルで泳動した。ゲルをニトロセルロース膜に転写し（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）ＳＤセミドライ転写セルにて２０Ｖで６０分）、乾燥し、ＴＢＳ中のＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液（９２７－５００００）で１時間ブロッキングした。ブロットを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ中のＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液中、４℃で一次抗体（１：１，０００）を用いて一晩インキュベートした。使用した一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した：Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ１（Ｔｙｒ１０３４／１０３５）（Ｄ７Ｎ４Ｚ）ウサギｍＡｂ＃７４１２９、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ２（Ｔｙｒ１００７／１００８）＃３７７１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｊａｋ３（Ｔｙｒ９８０／９８１）（Ｄ４４Ｅ３）ウサギｍＡｂ＃５０３１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ７０ Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ４２１／Ｓｅｒ４２４）抗体＃９２０４、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｈｃ（Ｔｙｒ２３９／２４０）抗体＃２４３４、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ＃４０６０、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）抗体＃２２１１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体＃９１０１、β－アクチン（１３Ｅ５）ウサギｍＡｂ＃４９７０、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ１（Ｔｙｒ７０１）（５８Ｄ６）ウサギｍＡｂ＃９１６７、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｄ３Ａ７）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ＃９１４５、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ４（Ｔｙｒ６９３）抗体＃５２６７、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）（Ｃ１１Ｃ５）ウサギｍＡｂ＃９３５９、及びヒストンＨ３（９６Ｃ１０）マウスｍＡｂ＃３６３８。ブロットを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで３回洗浄し、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ緩衝液中で二次抗体（１：１０，０００）とともに室温で３０～６０分間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した二次抗体は、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） （ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ４ＸのＰＥＧコンジュゲート）＃５２５７及び抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ４Ｘ ＰＥＧコンジュゲート）＃５１５１であった。ブロットを洗浄し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージャーで露光した。
リン酸化タンパク質を検出するフローサイトメトリー：上記のように生成したヒト初代Ｔ細胞、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞、またはマウス初代Ｔ細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、サイトカインを含まない培地で１６～２０時間静置した。細胞を、示されたようにＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０（１：１０００）、及び抗Ｇ－ＣＳＦＲ（１：２０）、抗ＣＤ４（１：５０）、及び抗ＣＤ８ａ（１：５０）の存在下、３７℃で２０分間、サイトカインなし、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、または野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。細胞をペレット化し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）固定緩衝液Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５７８７０）を用いて室温で１５分間固定化した。細胞を洗浄後、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５８０５０）を用いて氷上で１５分間透過処理した。細胞を２回洗浄し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）ＰＥマウス抗Ｓｔａｔ３（ｐＹ７０５）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６１２５６９）またはＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソトープコントロール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５８５９５）２０μｌを含有する緩衝液に再懸濁した。細胞を洗浄し、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ機器を使用して、フローサイトメトリーを実行した。
実施例１３：Ｇ２Ｒ－１、Ｇ－ＣＳＦＲ／ＩＬ－２ＲΒサブユニットのみ、ＭＹＣタグ付きＧ－ＣＳＦＲ／γ－Ｃサブユニットのみ、または全長Ｇ－ＣＳＦＲを発現するヒトＴ細胞の増殖。
ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞または腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）に、図１に示すキメラ受容体構築物をコードするレンチウイルスで形質導入し、細胞を洗浄した後、示されたサイトカインで再プレーティングした。細胞を３～４日ごとに計数した。Ｇ／γｃは、そのＮ末端にＭｙｃエピトープをタグ付けされ（Ｍｙｃ／Ｇ／γｃ）、Ｇ／ＩＬ－２Ｒβは、そのＮ末端にＦｌａｇエピトープをタグ付けされ（Ｆｌａｇ／Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ）；これらのエピトープタグは、フローサイトメトリーによる検出を補助し、受容体の機能には影響を与えない。予想通り、すべてのＴ細胞培養物は陽性対照サイトカインであるＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）に反応して増殖を示した。Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した後、ＰＭＢＣ由来のＴ細胞及びＧ２Ｒ－１キメラサイトカイン受容体を発現するＴＡＬについてのみ、増殖が観察された（図２２）。レンチウイルスの形質導入効率は、Ｔ細胞の１００％未満が、示されたキメラサイトカイン受容体を発現するように１００％未満であったことに留意されたい。これは、ＩＬ－２と比較してＧ２Ｒ－１によって媒介される増殖率が低いことの原因であると考えられる。同様に、増殖の増加は、Ｇ－ＣＳＦＲキメラ受容体サブユニットＧ２Ｒ－１及びＧ２Ｒ－２を発現し、Ｇ－ＣＳＦで刺激された３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞（ヒトＩＬ－２Ｒβサブユニットを安定して発現する）において観察された（図２１）。Ｔ細胞とは対照的に、Ｇ／ＩＬ－２Ｒβキメラ受容体サブユニットのみを発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞は、Ｇ－ＣＳＦに反応して増殖した（図２）；Ｇ－ＣＳＦ誘導性増殖は、Ｇ／γｃキメラ受容体サブユニットのみを発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞では見られなかった（図２）。
これらの結果から、Ｇ－ＣＳＦはＧ２Ｒ－１キメラ受容体を発現するＰＭＢＣ由来のＴ細胞及びＴＡＬ、ならびにＧ／ＩＬ－２Ｒβ、Ｇ２Ｒ－１、及びＧ２Ｒ－２キメラ受容体を発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞の増殖及び生存を刺激することができることが示された。
実施例１４：Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤは、Ｇ／ＩＬ－２ＲΒ、Ｇ２Ｒ－１、及びＧ２Ｒ－２で形質導入された細胞の表面に発現する。
Ｇ２Ｒ－２キメラサイトカイン受容体をコードするレンチウイルスベクター（図２３及び２５に概略的に示す）を形質導入した後の３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞株、ＰＢＭＣ由来のヒトＴ細胞及びヒト腫瘍関連リンパ球に対してフローサイトメトリーを行い、細胞が細胞表面にＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを発現するかどうかを測定した。Ｇ－ＣＳＦＲ陽性細胞は、すべての形質導入された細胞タイプにおいて検出された（図２６）。別の実験では、Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ、Ｇ２Ｒ－１、及びＧ２Ｒ－２キメラ受容体を発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞は、フローサイトメトリーによりＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤに対して陽性であった（図２１Ｂ～Ｄの下段）。
これらの結果は、Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ、Ｇ２Ｒ－１、及びＧ２Ｒ－２キメラ受容体が細胞表面上に発現していることを示すものである。
実施例１５：非形質導入細胞と比較したＧ２Ｒ－２を発現する細胞の増殖
ヒトＰＢＭＣ由来のＴ細胞及びヒト腫瘍関連リンパ球に、Ｇ２Ｒ－２受容体構築物（図４及び図６）をレンチウイルスを形質導入し、洗浄し、示されたサイトカインで再プレーティングした。いくつかの実験では、Ｔ細胞もＴｒａｎｓＡｃｔで刺激することにより定期的に再活性化させた。生細胞は３～４日ごとに計数した。ＰＭＢＣ由来のＴ細胞（図２７Ａ）及び腫瘍関連リンパ球（図２７Ｂ、Ｃの２つの独立した実験）の増殖は、Ｇ２Ｒ－２キメラ受容体を発現する細胞においてＧ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した後に観察されたが、非形質導入細胞では観察されなかった。
これらの結果は、Ｇ－ＣＳＦ誘導性のＧ２Ｒ－２キメラ受容体の活性化が、免疫細胞の増殖及び生存を誘発するのに十分であることを示す。
実施例１６：非形質導入細胞と比較した、Ｇ２Ｒ－２を発現するＣＤ４またはＣＤ８選択ヒト腫瘍関連リンパ球の増殖及び免疫表現型
ＣＤ４選択及びＣＤ８選択ヒトＴ細胞に、Ｇ２Ｒ－２をコードするレンチウイルスベクター（図２５）を形質導入するか、または示された場所では形質導入しないままにした。細胞を洗浄し、示されたサイトカインで再プレーティングして３～４日ごとに計数した。Ｇ２Ｒ－２を発現するＣＤ４またはＣＤ８選択ＴＡＬの増殖は、Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）での刺激後に観察されたが、添加したサイトカインがない場合（培地のみ）では観察されなかった（図２８及び図２９）。図２８では、各線は５つの患者試料のうちの１つからの結果を表す。
フローサイトメトリーによる免疫表現型解析は、Ｇ－ＣＳＦまたはＩＬ－２で培養したＴ細胞が、これらの培養条件下で、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋の特徴を保持し（図３０Ａ）、ＮＫ細胞表現型（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を欠き（図３０Ａ）、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）表現型を示した（図３０Ｂ）ことを示した。
Ｇ－ＣＳＦで刺激するとＧ２Ｒ－２を発現するＴ細胞の細胞周期の進行が促進することを確認するために、ＢｒｄＵアッセイを行った（図３１）。Ｔ細胞は、アッセイの前に、示されているように、ＩＬ－２またはＧ－ＣＳＦでの培養によって選択された。腫瘍関連リンパ球（図３１Ａ）及びＰＢＭＣ由来Ｔ細胞（図３１Ｂ）の両方を評価した。
これらの結果は、Ｇ－ＣＳＦがキメラサイトカイン受容体Ｇ２Ｒ－２の活性化により、初代ヒトＴＡＬの細胞周期の進行と長期的増殖を選択的に活性化できることを示す。また、これらの結果は、ホモ二量体形成によるＧ２Ｒ－２キメラ受容体の活性化が、ＴＡＬにおけるサイトカイン様シグナル伝達及び増殖を活性化させるのに十分であることを示す。さらに、Ｇ２Ｒ－２を発現するＴＡＬは、Ｇ－ＣＳＦの離脱により、ＩＬ－２の離脱に対する反応と同様に細胞死を起こすというサイトカイン依存性を維持している。Ｇ－ＣＳＦで培養したＴＡＬは、ＩＬ－２で培養したＴＡＬと同様の免疫表現型を維持する。
実施例１７：Ｇ－ＣＳＦに応答したＧ２Ｒ－２を発現する初代マウスＴ細胞の増殖。
Ｇ－ＣＳＦによる刺激時の、Ｇ２Ｒ－２または一本鎖Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ（Ｇ２Ｒ－１の構成要素）を発現する初代マウスＴ細胞とモック形質導入細胞の増殖を評価するために、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを実施した。すべての細胞を、アッセイ前にＩＬ－２で３日間増殖させた。Ｇ２Ｒ－２またはＧ／ＩＬ－２Ｒβの細胞表面発現は、フローサイトメトリーにより確認した（図３２Ａ）。示されたように、次に細胞をＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしでプレーティングした。Ｇ－ＣＳＦによる刺激後の細胞周期進行の促進は、非形質導入細胞または一本鎖Ｇ／ＩＬ－２Ｒβを発現する細胞よりもＧ２Ｒ－２を発現する細胞において観察された（図３２Ｂ、Ｃ）。パネルＢ及びＣは、それぞれ、すべての生細胞またはＧ－ＣＳＦＲ＋細胞についての結果を示す。
これらの結果は、Ｇ－ＣＳＦ誘導性ホモ二量化に応答して、Ｇ２Ｒ－２キメラ受容体が一本鎖Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ受容体よりも効率的であり、マウスＴ細胞においてサイトカイン様シグナル伝達及び増殖を活性化させることを示す。
実施例１８：Ｇ－ＣＳＦまたはＩＬ－２に応答したＧ２Ｒ－２を発現するヒト初代Ｔ細胞におけるサイトカイン関連細胞内シグナル伝達イベントの活性化
キメラサイトカイン受容体が、実際にＩＬ－２と同様のサイトカインシグナル伝達を活性化させることができることを確認するために、サイトカイン受容体がさまざまなシグナル伝達分子を活性化させる能力を評価した。Ｇ２Ｒ－２を発現する腫瘍関連リンパ球及びＰＢＭＣ由来Ｔ細胞は、あらかじめＧ－ＣＳＦにおいて、非形質導入細胞は、あらかじめＩＬ－２において増殖させた。細胞を洗浄し、次にＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしで刺激し、示されたシグナル伝達分子に対する抗体を用いて細胞溶解物にウエスタンブロットを行った（図３３）。パネルＡ及びＢはＴＡＬの結果を示し、パネルＣはＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の結果を示す。Ｇ２Ｒ－２を発現するＴ細胞は、Ｇ－ＣＳＦにより刺激すると、非形質導入細胞または形質導入細胞のＩＬ－２刺激後に見られるのと同程度に（Ｇ－ＣＳＦがＪａｋ２リン酸化を誘発したのに対し、ＩＬ－２はＪａｋ３リン酸化を誘発したという予想される例外を除いて）、ＩＬ－２関連シグナル伝達分子を活性化した。
これらの結果は、Ｇ２Ｒ－２キメラ受容体が、Ｇ－ＣＳＦにより刺激すると、ＩＬ－２受容体様サイトカイン受容体シグナル伝達を活性化させることができることを確認するものである。
実施例１９： Ｇ２Ｒ－２を発現するマウス初代Ｔ細胞において、Ｇ－ＣＳＦに応答してサイトカインシグナル伝達が活性化される。
キメラサイトカイン受容体Ｇ２Ｒ－２または一本鎖Ｇ／ＩＬ－２Ｒβ（Ｇ２Ｒ－１由来）が、サイトカインシグナル伝達を活性化させることができるかどうかを評価するために、これらのサイトカイン受容体のさまざまなシグナル伝達分子を活性化させる能力を、Ｇ２Ｒ－２またはＧ／ＩＬ－２Ｒβを発現するマウス初代Ｔ細胞とモック形質導入細胞の細胞溶解物のウエスタンブロットによって評価した。すべての細胞を、アッセイ前にＩＬ－２で３日間増殖させた。その後、細胞を洗浄し、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしで刺激した。Ｇ２Ｒ－２を発現するＴ細胞は、Ｇ－ＣＳＦにより刺激すると、非形質導入細胞または形質導入細胞のＩＬ－２刺激後に見られるのと同程度に（Ｇ－ＣＳＦがＪａｋ２リン酸化を誘発したのに対し、ＩＬ－２はＪａｋ３リン酸化を誘発したという予想される例外を除いて）、ＩＬ－２関連シグナル伝達分子を活性化した（図３４）。対照的に、Ｇ／ＩＬ－２Ｒβは、Ｇ－ＣＳＦへの曝露時にサイトカインシグナル伝達を活性化しなかった。
これらの結果により、Ｇ２Ｒ－２キメラ受容体がＧ－ＣＳＦ刺激によるホモ二量体化によってＩＬ－２受容体様サイトカイン受容体シグナル伝達を活性化させることができるのに対し、一本鎖Ｇ／ＩＬ－２ＲβのみはＧ－ＣＳＦに応答したホモ二量体化によってサイトカインシグナル伝達を活性化させることができないことが、初代マウスＴ細胞において確認された。
実施例２０：キメラ受容体の発現は、直交Ｇ－ＣＳＦによる刺激後、３２Ｄ－ＩＬ－２ＲΒ細胞及び初代マウスＴ細胞の増殖をもたらす。
キメラサイトカイン受容体を発現する細胞が直交Ｇ－ＣＳＦに応答して選択的に活性化され得るかどうかを判定するために、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞または初代マウスＴ細胞に、野生型Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを含むキメラ受容体Ｇ２Ｒ－１及びＧ２Ｒ－２（Ｇ２Ｒ－１ ＷＴ ＥＣＤ、Ｇ２Ｒ－２ ＷＴ ＥＣＤ）と、アミノ酸置換Ｒ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄを有するＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを含むキメラ受容体Ｇ２Ｒ－１及びＧ２Ｒ－２（Ｇ２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤ、Ｇ２Ｒ－２ １３４ ＥＣＤ）を形質導入した。細胞を、ＩＬ－２、野生型Ｇ－ＣＳＦ、またはＧ２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤ、及びＧ２Ｒ－２ １３４ ＥＣＤに結合できるが野生型Ｇ－ＣＳＦＲへの結合が著しく低下した直交Ｇ－ＣＳＦ（１３０ Ｇ－ＣＳＦ）のいずれかで刺激した。ＢｒｄＵ取り込みアッセイを行い、サイトカイン刺激による細胞周期の進行の促進能力を評価した（図３）。Ｇ２Ｒ－２ １３４ ＥＣＤを発現する３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞は、１３０ Ｇ－ＣＳＦ（アミノ酸置換Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒを保有；３０ｎｇ／ｍｌ）で刺激すると細胞周期の進行を示したが、野生型Ｇ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で刺激すると細胞周期の進行は起こらなかった。操作されたサイトカイン：受容体ＥＣＤペアの直交性は、「クリスクロス」増殖アッセイで初代マウスＴ細胞を刺激することによってさらに示され、このアッセイでは、ＷＴ、１３０、１３４、３０４、または３０７ ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－３（図２３）を発現する細胞がＷＴ、１３０、３０４または３０７サイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激された（図３６）。１３０ ＥＣＤは、アミノ酸置換：Ｒ４１Ｅ及びＲ１６７Ｄを有する。３０４ ＥＣＤは、アミノ酸置換：Ｒ４１Ｅ、Ｅ９３Ｋ、及びＲ１６７Ｄを有し、３０４サイトカインは、アミノ酸置換：Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、Ｄ１１２Ｒ、及びＲ１４７Ｅを有する。３０７ ＥＣＤは、アミノ酸置換：Ｒ４１Ｅ、Ｄ１９７Ｋ、Ｄ２００Ｋ、及びＲ２８８Ｅを有し、３０７サイトカインは、アミノ酸置換：Ｓ１２Ｅ、Ｋ１６Ｄ、Ｅ１９Ｋ、及びＥ４６Ｒを有する。図３６のパネルＡ及びＢは、反復実験を表す。
これらの結果は、直交キメラサイトカイン受容体を発現する細胞が、直交Ｇ－ＣＳＦ ＣＳＦで刺激すると選択的な活性化及び細胞周期の進行が可能であることを示す。
実施例２１：細胞内シグナル伝達は、３２Ｄ－ＩＬ２ＲΒ細胞、及び直交キメラサイトカイン受容体を発現する初代ヒトＴ細胞で活性化され、直交Ｇ－ＣＳＦにより刺激される。
キメラサイトカイン受容体を発現する細胞が直交Ｇ－ＣＳＦに応答して細胞内サイトカインシグナル伝達イベントを選択的に活性化し得るかどうかを判定するために、３２Ｄ－ＩＬ－２Ｒβ細胞に、野生型Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを含むキメラ受容体Ｇ２Ｒ－１及びＧ２Ｒ－２（Ｇ２Ｒ－１ ＷＴ ＥＣＤ及びＧ２Ｒ－２ ＷＴ ＥＣＤ）と、アミノ酸置換Ｒ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄを有するＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤを含むキメラ受容体Ｇ２Ｒ－１及びＧ２Ｒ－２（Ｇ２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤ、Ｇ２Ｒ－２ １３４ ＥＣＤ）を形質導入した。細胞を、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、またはＧ２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤ、Ｇ２Ｒ－２ １３４ ＥＣＤに結合できるが野生型Ｇ－ＣＳＦＲへの結合が著しく低下した直交Ｇ－ＣＳＦ（１３０ Ｇ－ＣＳＦ－Ｅ４６Ｒ＿Ｌ１０８Ｋ＿Ｄ１１２Ｒ；３０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激した。サイトカインへの曝露時にサイトカインシグナル伝達を活性化させる細胞の能力を評価するために、細胞溶解物に対してウエスタンブロットを実施した（図３７）。Ｇ２Ｒ－２ １３４ ＥＣＤを発現する細胞は、野生型Ｇ－ＣＳＦではなく１３０Ｇ－ＣＳＦで刺激時のサイトカインシグナル伝達の証拠を示した。さらに、Ｇ２Ｒ－２ ＷＴ ＥＣＤを発現する細胞は、１３０Ｇ－ＣＳＦで刺激するとサイトカインシグナル伝達を活性化させることができなかった。
操作されたサイトカイン：受容体ペアの直交性は、初代マウスＴ細胞をウエスタンブロット分析にかけることによってさらに示され、この分析では、ＷＴ、１３４、または３０４ ＥＣＤ（Ｒ４１Ｅ＿Ｅ９３Ｋ＿Ｒ１６７Ｄ）を有するＧ２Ｒ－３を発現する細胞がＷＴ、１３０、または３０４ Ｇ－ＣＳＦ（Ｅ４６Ｒ＿Ｌ１０８Ｋ＿Ｄ１１２Ｒ＿Ｒ１４７Ｅ；１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激され、示されたシグナル伝達イベントを測定した（図３８Ａ）。ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）及びＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍｌ）は、対照サイトカインとして機能した。Ｇ２Ｒ－３ ＷＴ ＥＣＤを発現する細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、またはＷＴ Ｇ－ＣＳＦによる刺激時のサイトカインシグナル伝達の証拠を示した。Ｇ２Ｒ－３ １３４ ＥＣＤを発現する細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、または１３０ Ｇ－ＣＳＦによる刺激時のサイトカインシグナル伝達の証拠を示した。Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤを発現する細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、または３０４ Ｇ－ＣＳＦによる刺激時のサイトカインシグナル伝達の証拠を示した。
Ｇ２Ｒ－３の３つのＥＣＤバリアントの細胞表面発現は、フローサイトメトリーによって確認した（図３８Ｂ）。
これらの結果は、直交キメラサイトカイン受容体を発現する細胞が、直交Ｇ－ＣＳＦで刺激すると細胞内サイトカインシグナル伝達イベントを選択的に活性化できることを示す。
実施例２２：Ｇ２Ｒ－３の発現は、初代ヒトＴ細胞において、増殖、細胞周期の進行、ならびにサイトカイン関連細胞内シグナル伝達及び免疫表現型をもたらす
Ｇ２Ｒ－３キメラ受容体が初代ヒトＴ細胞においてＧ－ＣＳＦで刺激するとサイトカインシグナル伝達関連イベントを促進できるかどうかを判定するために、ＴＡＬにＧ２Ｒ－３をコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。Ｔ細胞増殖アッセイを実施して、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしでの刺激時における細胞の増殖を試験した。生細胞は３～４日ごとに計数した。非形質導入対応物とは対照的に、Ｇ２Ｒ－３を発現する初代ＴＡＬは、Ｇ－ＣＳＦに応答して培養液中で増殖させた（図４０Ａ）。Ｇ－ＣＳＦによる刺激時にサイトカインシグナル伝達イベントが活性化されたかどうかを判定するために、細胞溶解物にウエスタンブロットを行い、細胞内シグナル伝達を評価した。細胞を増殖アッセイから回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）または野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。Ｇ２Ｒ－３を発現する初代ＴＡＬは、Ｇ－ＣＳＦがＪａｋ２リン酸化を誘発したのに対し、ＩＬ－２がＪａｋ３リン酸化を誘発したという予想される例外を除いて、Ｇ－ＣＳＦに応答してＩＬ－２関連シグナル伝達イベントを実証した（図４０Ｂ）。
Ｇ－ＣＳＦによる刺激時の細胞周期の進行を評価するために、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを実施した。細胞を増殖アッセイから回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしにおいて再プレーティングした。Ｇ２Ｒ－３を発現する初代ＴＡＬは、Ｇ－ＣＳＦに応答して細胞周期の進行を示した（図４０Ｃ）。
Ｇ２Ｒ－３を発現する細胞のＧ－ＣＳＦ誘導性増殖は、初代ＰＢＭＣ由来のヒトＴ細胞を使用しても実証された（図４１）。Ｇ２Ｒ－３ ＷＴ ＥＣＤを発現する細胞は、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦに応答して増殖したが、培地のみでは増殖しなかった（図４１Ａ）。細胞が外因性サイトカインに継続的に依存していることを実証するために、培養の２１日目に、Ｇ－ＣＳＦ増殖条件の細胞を洗浄し、ＷＴ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－７（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ－１５（２０ｎｇ／ｍＬ）、または培地のみで再プレーティングした。Ｇ－ＣＳＦまたはＩＬ－７＋ＩＬ－１５の存在下で再プレーティングされた細胞のみが、時間経過とともに生存力を維持した。
フローサイトメトリーによって評価されるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤの発現は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において、増殖の２１～４２日目の間、安定したままであった（図４１Ｂ）。
ウエスタンブロットにより、Ｇ２Ｒ－３を発現する初代ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞は、Ｇ－ＣＳＦに応答してＩＬ－２関連シグナル伝達イベントを示した（図４２Ａ）。ＷＴ Ｇ－ＣＳＦまたはＩＬ－７＋ＩＬ－１５において４２日間増殖した初代ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞に対して、フローサイトメトリーに基づく免疫表現型解析を実施した。Ｇ２Ｒ－３ ＷＴ ＥＣＤを発現し、Ｇ－ＣＳＦ中で培養した細胞は、ＩＬ－７＋ＩＬ－１５中で培養した非形質導入細胞と同様の表現型を保持し、幹細胞様メモリーＴ細胞表現型（ＴＳＣＭ）を示すＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋表現型を主に示した（図４２Ｂ、Ｃ）。同様に、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、エフェクターモリー（ＴＥＭ）、及び終末分化（ＴＴＥ）Ｔ細胞の画分も類似していた。
これらの結果は、Ｇ２Ｒ－３キメラサイトカイン受容体が、サイトカインシグナル伝達イベントを活性化し、初代細胞における細胞周期の進行及び増殖を促進することができることを確認している。Ｇ２Ｒ－３を発現し、Ｇ－ＣＳＦ中で長期的に増殖したＴ細胞の免疫表現型は、ＩＬ－７＋ＩＬ－１５中で増殖した非形質導入細胞と類似している。
実施例２３：直交Ｇ－ＣＳＦは、直交ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－３を発現する初代ヒトＴ細胞における増殖及び拡大増殖を誘発する
３０４（Ｒ４１Ｅ＿Ｅ９３Ｋ＿Ｒ１６７Ｄ）または３０７（Ｒ４１Ｅ＿Ｄ１９７Ｋ＿Ｄ２００Ｋ＿Ｒ２８８Ｅ） ＥＣＤを有するキメラサイトカイン受容体Ｇ２Ｒ－３が直交リガンド１３０、３０４、または３０７ Ｇ－ＣＳＦによる刺激に応答して増殖及び拡大増殖を誘発できるかどうかを評価した。初代ＰＢＭＣ由来ヒトＴ細胞にＧＲ－３ ３０４ ＥＣＤまたはＧ２Ｒ－３ ３０７（Ｒ４１Ｅ＿Ｄ１９７Ｋ＿Ｄ２００Ｋ＿Ｒ２８８Ｅ）ＥＣＤをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０７ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしで培養したときの細胞の増殖倍率を評価するためにＴ細胞増殖アッセイを実施した。生細胞は３～４日ごとに計数した。Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤを発現するＴ細胞を、ＩＬ－２または３０４ Ｇ－ＣＳＦに応答して培養液中で増殖させた（図４３Ａ）。Ｇ２Ｒ－３ ３０７ ＥＣＤを発現するＴ細胞を、ＩＬ－２または３０７ Ｇ－ＣＳＦに応答して培養液中で増殖させた（図４３Ｂ）。非形質導入Ｔ細胞のみを、ＩＬ－２に応答して増殖させた（図４３Ｃ）。
ＢｒｄＵ取り込みアッセイを、１３０、３０４、及び３０７ Ｇ－ＣＳＦによる刺激時の細胞周期の進行を評価するために、クリスクロスデザインで実施した。細胞を増殖アッセイから回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、１３０Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０４Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０７Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしで再プレーティングした。Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤを発現する初代ヒトＴ細胞は、１３０または３０４ Ｇ－ＣＳＦに応答した細胞周期の進行を示したが、３０７ Ｇ－ＣＳＦには応答しなかった（図４４）。Ｇ２Ｒ－３ ３０７ ＥＣＤを発現するＴ細胞は、３０７ Ｇ－ＣＳＦに応答した細胞周期の進行を示したが、１３０または３０４ Ｇ－ＣＳＦには応答しなかった。すべてのＴ細胞は、ＩＬ－２に応答して細胞周期の進行を示した。
この結果は、キメラ受容体Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤ及びＧ２Ｒ－３ ３０７ ＥＣＤが、それぞれ直交３０４または３０７ Ｇ－ＣＳＦで刺激すると、初代ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的な細胞周期の進行及び増殖を誘発することができることを示す。さらに、１３０ Ｇ－ＣＳＦは、Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤを発現する細胞の増殖を刺激することができるが、Ｇ２Ｒ－３ ３０７ ＥＣＤを発現する細胞の増殖は刺激しない。
実施例２４：Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤは、Ｇ２１Ｒ－１、Ｇ２１Ｒ－２、Ｇ１２Ｒ－１及びＧ２Ｒ－３キメラ受容体構築物で形質導入された初代ヒト腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）の表面に発現される。
キメラサイトカイン受容体構築物が初代ヒト腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）の表面上で発現できるかどうかを評価するために、ＴＡＬにＧ２１Ｒ－１、Ｇ２１Ｒ－２、Ｇ１２Ｒ－１、及びＧ２Ｒ－３キメラ受容体をコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入し、細胞をフローサイトメトリーによって細胞表面上のＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ発現について試験した（図３９）。４つのキメラサイトカイン受容体デザインすべてについて、Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ陽性細胞が検出された。
これらの結果は、Ｇ２１Ｒ－１、Ｇ２１Ｒ－２、Ｇ１２Ｒ－１、及びＧ２Ｒ－３キメラ受容体が初代細胞の表面上で発現できることを示す。これらの結果は、Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤキメラ受容体のデザインが初代細胞の表面上で発現していることも示す。
実施例２５：Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤは、Ｇ１２Ｒ－１及びＧ２１Ｒ－１キメラ受容体構築物で形質導入された初代マウスＴ細胞の表面に発現される
Ｇ１２Ｒ－１及びＧ２１Ｒ－１キメラ受容体が初代Ｔ細胞の表面上で発現することができるかどうかを判定するために、初代マウスＴ細胞にＧ１２Ｒ－１及びＧ２１Ｒ－１キメラ受容体をコードするレトロウイルスベクターを用いて形質導入し、フローサイトメトリーにより分析した（図４５）。
この結果は、Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤが、Ｇ１２Ｒ－１及びＧ２１Ｒ－１をコードするレトロウイルスベクターで形質導入された初代マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に発現していることを示す。
実施例２６：Ｇ－ＣＳＦは、Ｇ２１Ｒ－１またはＧ２１Ｒ－２を発現する初代ＰＢＭＣ由来ヒトＴ細胞においてサイトカインシグナル伝達イベントを誘発する
Ｇ２１Ｒ－１及びＧ２１Ｒ－２構築物が初代細胞においてサイトカインシグナル伝達イベントを誘発することができるかどうかを判定するために、初代ＰＢＭＣ由来ヒトＴ細胞に、Ｇ２１Ｒ－１またはＧ２１Ｒ－２キメラサイトカイン受容体をコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。細胞をｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３（ｐ－ＳＴＡＴ３）特異的抗体で細胞内染色し、フローサイトメトリーにより評価し、ＳＴＡＴ３活性化の尺度であるＳＴＡＴ３リン酸化の程度を測定した（図４６）。Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激すると、Ｇ２１Ｒ－１またはＧ２１Ｒ－２のいずれかで形質導入したＧ－ＣＳＦＲ陽性細胞のサブセットにおいて、リン酸化ＳＴＡＴ３を発現する細胞数が増加した。対照的に、Ｇ－ＣＳＦＲ陰性（すなわち非発現）細胞は、Ｇ－ＣＳＦで刺激してもリン酸化ＳＴＡＴ３の増加を示さなかったが、ＩＬ－２１で刺激すると増加した。
これらの結果は、Ｇ２１Ｒ－１及びＧ２１Ｒ－２キメラ受容体が、初代ヒトＴ細胞においてＧ－ＣＳＦを刺激すると、ＩＬ－２１関連サイトカインシグナル伝達イベントを活性化できることを示す。
実施例２７：Ｇ－ＣＳＦは、Ｇ２１Ｒ－１またはＧ－１２Ｒ－１を発現する初代マウスＴ細胞において細胞内シグナル伝達イベントを誘発する
キメラサイトカイン受容体Ｇ２１Ｒ－１がサイトカインシグナル伝達イベントを活性化できるかどうかを判定するために、初代マウスＴ細胞にＧ２１Ｒ－１をコードするレトロウイルスベクターを用いて形質導入し、フローサイトメトリーにより評価して、Ｇ－ＣＳＦによる刺激時にリン酸化ＳＴＡＴ３を検出した。生細胞をＣＤ８またはＣＤ４でゲーティングし、サイトカインなし、ＩＬ－２１（１ｎｇ／ｍｌ）、またはＧ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）での刺激後、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３陽性染色細胞の割合をＣＤ８及びＣＤ４細胞集団について測定した。Ｇ－ＣＳＦで刺激すると、Ｇ２１Ｒ－１を発現する細胞（非形質導入細胞ではない）は、リン酸化ＳＴＡＴ３の量の増加を示した（図４７Ａ及び４７Ｂ）。Ｇ－ＣＳＦで刺激するとＧ２１Ｒ－１またはＧ１２Ｒ－１を発現する細胞の細胞内サイトカインシグナル伝達を評価するためにウエスタンブロットを実施した。予想通り、Ｇ２１Ｒ－１を発現し、Ｇ－ＣＳＦで刺激された細胞は、ＳＴＡＴ３のリン酸化の増加を示し、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ４及びｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ５においてわずかに増加した（図４７Ｃ）。また予想通り、Ｇ１２Ｒ－１を発現する細胞では、Ｇ－ＣＳＦに応答して、ＳＴＡＴ４の強いリン酸化が見られた。Ｇ－ＣＳＦは、モック形質導入細胞においてシグナル伝達イベントを誘発しなかった。（Ｇ１２Ｒ－１群では、陽性対照（ｈＩＬ－１２ １０ｎｇ／ｍｌ）がシグナル伝達イベントを誘発しなかったと思われることに留意されたい；これは、マウスＩＬ－１２ＲへのヒトＩＬ－１２の結合が不十分なためである可能性がある。）
結果は、Ｇ２１Ｒ－１及びＧ１２Ｒ－１が、Ｇ－ＣＳＦでの刺激時に初代マウスＴ細胞においてサイトカインシグナル伝達イベントを誘発できることを示す。
実施例２８：Ｇ－ＣＳＦは、Ｇ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１、Ｇ２７／２Ｒ－１、Ｇ２１／２Ｒ－１、Ｇ１２／２Ｒ－１、またはＧ２１／１２／２Ｒ－１を発現する初代マウスＴ細胞において増殖及び細胞内シグナル伝達イベントを誘発する
キメラサイトカイン受容体によって媒介されるサイトカインシグナル伝達イベント及び細胞増殖を評価するために、初代マウスＴ細胞にＧ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１、Ｇ２７／２Ｒ－１、Ｇ２１／２Ｒ－１、Ｇ１２／２Ｒ－１、またはＧ２１／１２／２Ｒ－１をコードするレトロウイルスベクターを用いて形質導入した。Ｇ－ＣＳＦによる刺激時の細胞周期の進行を評価するために、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを実施した。細胞を回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、野生型Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしにおいて再プレーティングした。Ｇ－ＣＳＦ誘導性細胞周期の進行は、Ｇ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１、もしくはＧ２７／２Ｒ－１（図４８Ａ、４８Ｂ）、またはＧ２１／２Ｒ－１、Ｇ１２／２Ｒ－１、もしくはＧ２１／１２／２Ｒ－１を発現する初代マウスＴ細胞において見られた（図４９Ａ、４９Ｂ）。Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤの発現は、フローサイトメトリーによっても検出可能であった（図４８Ｃ、４９Ｃ）。
ウエスタンブロットにより、示されたキメラサイトカイン受容体を発現する細胞において、Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）に応答して複数のサイトカインシグナル伝達イベントが観察されたが、モック形質導入細胞においては観察されなかった（図４８Ｄ、４９Ｄ）。一般に、観察されたサイトカインシグナル伝達イベントは、さまざまなＩＣＤデザインに組み込まれたシグナル伝達ドメインに基づいて予想通りであった（図２３及び図２４）。一例として、Ｇ７Ｒ－１キメラ受容体は、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発し（図４８Ｄ）、これは、ＩＬ－７Ｒα（図２３）からＳＴＡＴ５結合部位が組み込まれたことに起因すると予想される。第２の例として、Ｇ２１／２Ｒ－１キメラ受容体は、ＳＴＡＴ３のリン酸化を誘発し（図４９Ｄ）、これは、Ｇ－ＣＳＦＲ（図２４）からＳＴＡＴ３結合部位が組み込まれたことに起因すると予想される。第３の例として、Ｇ１２／２Ｒ－１キメラ受容体は、ＳＴＡＴ４のリン酸化を誘発し、これはＩＬ－１２Ｒβ２（図２４）からＳＴＡＴ４結合部位が組み込まれたことに起因すると予想される。他のキメラサイトカイン受容体は、細胞内シグナル伝達イベントの他の明確に異なるパターンを示した。
結果は、Ｇ２Ｒ－２、Ｇ２Ｒ－３、Ｇ７Ｒ－１、Ｇ２１／７Ｒ－１、Ｇ２７／２Ｒ－１、Ｇ２１／２Ｒ－１、Ｇ１２／２Ｒ－１、及びＧ２１／１２／２Ｒ－１が、Ｇ－ＣＳＦで刺激すると、初代マウスＴ細胞におけるサイトカインシグナル伝達イベント及び増殖を誘発することができることを示す。さらに、キメラ受容体のＩＣＤに異なるシグナル伝達ドメインを組み込むことにより、細胞内シグナル伝達イベントの異なるパターンを生成することができる。
実施例２９：直交Ｇ－ＣＳＦは、直交ＥＣＤを有するＧ１２／２Ｒ－１を発現する初代ヒトＴ細胞において、拡大増殖、増殖、サイトカイン関連細胞内シグナル伝達、及び免疫表現型を誘発する
１３４ ＥＣＤを有するキメラサイトカイン受容体Ｇ１２／２Ｒ－１が、直交リガンド１３０ Ｇ－ＣＳＦでの刺激に応答して増殖及び拡大増殖を誘発できるかどうかを判定するために、初代ＰＢＭＣ由来ヒトＴ細胞にＧ１２／２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、１３０ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカインなしで培養したときの細胞の増殖倍率を評価するためにＴ細胞増殖アッセイを実施した。生細胞は４～５日ごとに計数した。Ｇ１２／２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤを発現する初代ヒトＴ細胞は、ＩＬ－２または１３０ Ｇ－ＣＳＦに応答して培養液中で増殖したが（図５０Ａ）、培地のみでは限定的な一過性の増殖を示した。
この実験の１９日目に、１３０ Ｇ－ＣＳＦまたはＩＬ－２で増殖させたＴ細胞を３回洗浄し、ＩＬ－２、１３０ Ｇ－ＣＳＦ、または培地のみで再プレーティングした。培地のみでは、Ｔ細胞は生存能力の低下及び数の減少を示した（図５０Ｂ）。対照的に、ＩＬ－２またはＧ－ＣＳＦ １３０で再プレーティングされたＴ細胞は、継続的な生存能力及び安定した数を示した。
Ｇ－ＣＳＦ受容体に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって検出されたＧ１２／２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤの発現は、１３０ Ｇ－ＣＳＦによる刺激によって増殖したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において４日目から１６日目まで増加した（図５０Ｃ）。１３０ Ｇ－ＣＳＦによる刺激時の細胞周期の進行を評価するために、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを実施した。
ＢｒｄＵアッセイによって細胞周期の進行を評価するために、細胞を増殖アッセイから回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ－２、及びＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍｌ）、１３０Ｇ－ＣＳＦ（３００ｎｇ／ｍｌ）またはサイトカインなしで再プレーティングした。Ｇ１２／２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤを発現する初代ヒトＴ細胞は、１３０ Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、またはＩＬ－２＋ＩＬ－１２に応答して細胞周期の進行を示したが、非形質導入細胞は、ＩＬ－２またはＩＬ－２＋ＩＬ－１２に対してのみ応答した（図５１Ａ）。
１６日間の培養期間の後、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯに対する抗体を用いてフローサイトメトリーにより免疫表現型解析を行い、１３０ Ｇ－ＣＳＦにおいて増殖したＧ１２／２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤを発現するＴ細胞とＩＬ－２において増殖した非形質導入細胞とを比較した。２つのＴ細胞集団は、幹細胞様メモリー（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ）、及び終末分化（ＴＴＥ）表現型の類似した割合を示した（図５１Ｂ、Ｃ）。
同様の実験を、３０４ ＥＣＤ（１３４ ＥＣＤではなく）を有するキメラサイトカイン受容体Ｇ１２／２Ｒ－１を用いて行った。初代ＰＢＭＣ由来ヒトＴ細胞に、Ｇ１２／２Ｒ－１ ３０４ ＥＣＤをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、１３０ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、または培地のみで培養したときの細胞の増殖倍率を評価するためにＴ細胞増殖アッセイを実施した。生細胞は４～５日ごとに計数した。３０４ ＥＣＤを有するＧ１２／２Ｒ－１を発現するＴ細胞は、ＩＬ－２、１３０ Ｇ－ＣＳＦ、または３０４ Ｇ－ＣＳＦの存在下で増殖し得るが、培地のみでは増殖せず、非形質導入細胞はＩＬ－２のみに応答して増殖することができた（図５２Ａ）。
ＢｒｄＵアッセイにより細胞周期の進行を評価するために、１３０ Ｇ－ＣＳＦまたは３０４ Ｇ－ＣＳＦのいずれかで事前に増殖させたＧ１２／２Ｒ－１ ３０４ ＥＣＤを発現するＴ細胞を、増殖アッセイから回収し、洗浄した後、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）、１３０Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３０７ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、または培地のみで再プレーティングした。Ｇ１２／２Ｒ－１ ３０４ ＥＣＤを発現するＴ細胞は、１３０または３０４ Ｇ－ＣＳＦに応答して細胞周期の進行を示したが、３０７ Ｇ－ＣＳＦまたは培地のみでは応答しなかった（図５２Ｂ）。
この結果は、Ｇ１２／２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤが、直交１３０ Ｇ－ＣＳＦで刺激すると、初代ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞周期の進行及び増殖を誘発できることを示す。Ｇ１２／２Ｒ－１ １３４ ＥＣＤを発現し、１３０ Ｇ－ＣＳＦで増殖させた細胞のＴ細胞メモリー表現型は、ＩＬ－２で増殖させた非形質導入細胞と同様である。さらに、Ｇ１２／２Ｒ－１ ３０４ ＥＣＤは、１３０または３０４ Ｇ－ＣＳＦで刺激するとＴ細胞の選択的な細胞周期の進行及びを誘発できるが、３０７ Ｇ－ＣＳＦに応答して誘発されることはない。
実施例３０：直交Ｇ－ＣＳＦは、直交ＥＣＤを有するＧ２Ｒ－３またはＧ１２／２Ｒ－１を発現する初代ヒトＴ細胞において、明確に異なる細胞内シグナル伝達イベントを誘発する
細胞内シグナル伝達イベントを評価するために、初代ＰＢＭＣ由来ヒトＴ細胞に、Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤまたはＧ１２／２Ｒ－１ ３０４ ＥＣＤをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。３０４ Ｇ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２、及びＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）、または培地のみで刺激時の、Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤもしくはＧ１２／２Ｒ－１ ３０４ ＥＣＤを発現する細胞、または非導入細胞における細胞内サイトカインシグナル伝達を評価するためにウエスタンブロットを実施した。形質導入されたＴ細胞と非形質導入Ｔ細胞の両方において、ＳＴＡＴ５の強いリン酸化が、ＩＬ－２＋ＩＬ－１２、またはＩＬ－２のみでの刺激のいずれかに応答して検出された（図５３）。ＳＴＡＴ４の強いリン酸化は、ＩＬ－２＋ＩＬ－１２の両方による刺激に応答して検出されたが、ＳＴＡＴ４の弱いリン酸化のみが、ＩＬ－２のみでの刺激に応答して検出された。Ｇ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤを発現する細胞では、ＳＴＡＴ４の弱いリン酸化及びＳＴＡＴ５の強いリン酸化が３０４ Ｇ－ＣＳＦでの刺激に応答して検出され、ＩＬ－２のみに応答して見られるパターンに類似していた。Ｇ１２／２Ｒ－１ ３０４ ＥＣＤを発現する細胞では、ＳＴＡＴ４及びＳＴＡＴ５の強いリン酸化が３０４ Ｇ－ＣＳＦの刺激に応答して検出され、ＩＬ－２＋ＩＬ－１２に対する応答に見られるパターンに類似していた。非形質導入Ｔ細胞は、３０４ Ｇ－ＣＳＦに対する応答を示さなかった。
この結果は、３０４ ＥＣＤを有するＧ１２／２Ｒ－１が、３０４ Ｇ－ＣＳＦでの刺激に応答して、ＳＴＡＴ４及びＳＴＡＴ５の強いリン酸化を含む、サイトカインシグナル伝達イベントを誘発することができることを示す。シグナル伝達イベントの異なるパターンは、３０４ Ｇ－ＣＳＦによる刺激後のＧ２Ｒ－３ ３０４ ＥＣＤを発現する細胞において見られ、ＳＴＡＴ５の強いリン酸化を含むがＳＴＡＴ４の強いリン酸化は含まない。
本発明は、好ましい実施形態及びさまざまな代替実施形態を参照して特に示され、説明されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細におけるさまざまな変更が本明細書になされ得ることは、関連する技術分野の当業者には理解されよう。
本明細書の本文中で引用したすべての参考文献、発行済特許、及び特許出願は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
（表１２）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤｇｐ１３０－ＩＬ－２Ｒβの配列
Figure 2022553152000017
（表１３）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤＩＬ－２Ｒβの配列
Figure 2022553152000018
（表１４）Ｇ－ＣＳＦＲＷＴ－ＩＣＤγCの配列
Figure 2022553152000019
（表１５Ａ）キメラサイトカイン受容体
Figure 2022553152000020
（表１５Ｂ）キメラサイトカイン受容体
Figure 2022553152000021
（表１６）
Figure 2022553152000022
（表１７）シグナルペプチド。シグナルペプチドは次のいずれか１つで構成される：
Figure 2022553152000023
（表１８）野生型Ｇ－ＣＳＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）：Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤは、次のいずれか１つで構成される：
Figure 2022553152000024
Figure 2022553152000025
Figure 2022553152000026
（表１９）膜貫通ドメイン（ＴＭ）。ＴＭは、次のいずれか１つで構成される：
Figure 2022553152000027
（表２０）細胞内ドメイン（ＩＣＤ）。ＩＣＤは、次のいずれか１つで構成される：
Figure 2022553152000028
Figure 2022553152000029
Figure 2022553152000030
Figure 2022553152000031
Figure 2022553152000032
Figure 2022553152000033
Figure 2022553152000034

Claims (72)

  1. 顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ－ＣＳＦＲ）のバリアント細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む受容体であって、
    前記Ｇ－ＣＳＦＲのバリアントＥＣＤが、サイトＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異、サイトＩＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異、またはそれらの組み合わせを含む、前記受容体。
  2. 前記サイトＩＩ界面領域における前記少なくとも１つの変異が、配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置１４１、１６７、１６８、１７１、１７２、１７３、１７４、１９７、１９９、２００、２０２、及び２８８からなる群より選択されるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤのアミノ酸位置に位置する、請求項１に記載の受容体。
  3. 前記サイトＩＩ界面領域における前記少なくとも１つの変異が、Ｒ１４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、Ｋ１６８Ｄ、Ｋ１６８Ｅ、Ｌ１７１Ｅ、Ｌ１７２Ｅ、Ｙ１７３Ｋ、Ｑ１７４Ｅ、Ｄ１９７Ｋ、Ｄ１９７Ｒ、Ｍ１９９Ｄ、Ｄ２００Ｋ、Ｄ２００Ｒ、Ｖ２０２Ｄ、Ｒ２８８Ｄ、及びＲ２８８ＥからなるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ変異群から選択される、請求項２に記載の受容体。
  4. 前記サイトＩＩＩ界面領域における前記少なくとも１つの変異が、配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置３０、４１、７３、７５、７９、８６、８７、８８、８９、９１、及び９３からなる群より選択されるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ変異群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の受容体。
  5. 前記サイトＩＩＩ界面領域における前記少なくとも１つの変異が、Ｓ３０Ｄ、Ｒ４１Ｅ、Ｑ７３Ｗ、Ｆ７５ＫＦ、Ｓ７９Ｄ、Ｌ８６Ｄ、Ｑ８７Ｄ、Ｉ８８Ｅ、Ｌ８９Ａ、Ｑ９１Ｄ、Ｑ９１Ｋ、及びＥ９３ＫからなるＧ－ＣＳＦＲ ＥＣＤ変異群から選択される、請求項４に記載の受容体。
  6. 前記Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤが表６のデザイン番号の変異の組み合わせを含み、前記変異が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応する、前記請求項のいずれか一項に記載の受容体。
  7. 前記Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤが、変異Ｒ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の受容体。
  8. キメラ受容体である、前記請求項のいずれか一項に記載の受容体。
  9. 細胞上で発現する、前記請求項のいずれか一項に記載の受容体。
  10. 前記細胞が、免疫細胞であり、
    任意選択でＴ細胞であり、
    任意選択でＮＫ細胞であり、
    任意選択でＮＫＴ細胞であり、
    任意選択でＢ細胞であり、
    任意選択で形質細胞であり、
    任意選択でマクロファージであり、
    任意選択で樹状細胞であり、
    任意選択で前記細胞が幹細胞であり、
    任意選択で前記細胞が初代細胞であり、
    任意選択で前記細胞がヒト細胞である、
    請求項９に記載の受容体。
  11. バリアントＧ－ＣＳＦによる前記受容体の活性化が、前記受容体を発現する細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答を引き起こす、前記請求項のいずれか一項に記載の受容体。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の受容体をコードする、核酸。
  13. 請求項１２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  14. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の受容体を発現するように操作された、細胞。
  15. Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１４に記載の細胞。
  16. サイトＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異、サイトＩＩＩ界面領域における少なくとも１つの変異、またはそれらの組み合わせを含む、バリアント顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）。
  17. 前記サイトＩＩ界面領域における前記少なくとも１つの変異が、配列番号１のアミノ酸位置１２、１６、１９、２０、１０４、１０８、１０９、１１２、１１５、１１６、１１８、１１９、１２２、及び１２３からなる群より選択されるアミノ酸位置に位置する、請求項１６に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  18. 前記サイトＩＩ界面領域における前記少なくとも１つの変異が、Ｓ１２Ｅ、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｒ、Ｋ１６Ｄ、Ｌ１８Ｆ、Ｅ１９Ｋ、Ｑ２０Ｅ、Ｄ１０４Ｋ、Ｄ１０４Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、Ｌ１０８Ｒ、Ｄ１０９Ｒ、Ｄ１１２Ｒ、Ｄ１１２Ｋ、Ｔ１１５Ｅ、Ｔ１１５Ｋ、Ｔ１１６Ｄ、Ｑ１１９Ｅ、Ｑ１１９Ｒ、Ｅ１２２Ｋ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３Ｒからなる変異群より選択される、請求項１７に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  19. 前記サイトＩＩＩ界面領域における前記少なくとも１つの変異が、配列番号１のアミノ酸位置３８、３９、４０、４１、４６、４７、４８、４９、及び１４７からなる群より選択される変異群から選択される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  20. 前記サイトＩＩＩ界面領域における前記少なくとも１つの変異が、Ｔ３８Ｒ、Ｙ３９Ｅ、Ｋ４０Ｄ、Ｋ４０Ｆ、Ｌ４１Ｄ、Ｌ４１Ｅ、Ｌ４１Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ４７Ｄ、Ｖ４８Ｋ、Ｖ４８Ｒ、Ｌ４９Ｋ、及びＲ１４７Ｅからなる変異群より選択される、請求項１９に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  21. 前記バリアントＧ－ＣＳＦが表６のデザイン番号の変異の組み合わせを含み、前記変異が配列番号１のアミノ酸位置に対応する、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  22. 変異Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒを含む、請求項２１に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  23. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の受容体に選択的に結合する、請求項１６～２２のいずれか一項に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  24. 前記受容体が細胞上で発現する、請求項２３に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  25. 前記細胞が免疫細胞である、請求項２４に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  26. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞であり、
    任意選択でＮＫ細胞であり、
    任意選択でＮＫＴ細胞であり、
    任意選択でＢ細胞であり、
    任意選択で形質細胞であり、
    任意選択でマクロファージであり、
    任意選択で樹状細胞であり、
    任意選択で前記細胞が幹細胞であり、
    任意選択で前記細胞が初代細胞であり、
    任意選択で前記細胞がヒト細胞である、
    請求項２５に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  27. 前記バリアントＧ－ＣＳＦの前記受容体への前記選択的結合が、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答を引き起こす、請求項２６に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ。
  28. 請求項１６～２７のいずれか一項に記載のバリアントＧ－ＣＳＦをコードする、核酸。
  29. 請求項２８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  30. 請求項１６～２７のいずれか一項に記載のバリアントＧ－ＣＳＦを発現するように操作された、細胞。
  31. 免疫細胞である、請求項３０に記載の細胞。
  32. （ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の受容体と、
    （ｂ）請求項１６～２７のいずれか一項に記載のバリアントＧ－ＣＳＦと
    を含む、細胞表面上で発現する受容体を選択的に活性化させるためのシステムであって、
    前記受容体が、サイトＩＩ界面領域、サイトＩＩＩ界面領域、またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも１つの変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが、前記受容体の前記サイトＩＩ界面領域、前記受容体の前記サイトＩＩＩ界面領域、またはそれらの組み合わせに結合するＧ－ＣＳＦのアミノ酸配列において少なくとも１つの変異を含み、
    前記バリアントＧ－ＣＳＦが、野生型Ｇ－ＣＳＦＲ ＥＣＤよりも優先的に前記受容体に結合し、前記受容体が、野生型Ｇ－ＣＳＦよりも優先的に前記バリアントＧ－ＣＳＦに結合する、前記システム。
  33. 前記受容体及び前記バリアントＧ－ＣＳＦが、表２のデザイン番号のサイトＩＩ界面の変異の組み合わせを含み、前記受容体の変異が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応し、前記バリアントＧ－ＣＳＦの変異が配列番号１のアミノ酸位置に対応する、請求項３２に記載のシステム。
  34. 前記受容体及び前記バリアントＧ－ＣＳＦが、表４のデザイン番号のサイトＩＩＩ界面の変異の組み合わせを含み、前記受容体の変異が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応し、前記バリアントＧ－ＣＳＦの変異が配列番号１のアミノ酸位置に対応する、請求項３２に記載のシステム。
  35. 前記受容体及び前記バリアントＧ－ＣＳＦが、表６のデザイン番号のサイトＩＩ界面及びサイトＩＩＩ界面の変異の組み合わせを含み、前記受容体の変異が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応し、前記バリアントＧ－ＣＳＦの変異が配列番号１のアミノ酸位置に対応する、請求項３２に記載のシステム。
  36. 前記変異の組み合わせがデザイン番号１０６の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ及びＤ１０４Ｋ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ及びＫ１６８Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  37. 前記変異の組み合わせがデザイン番号１１７の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ及びＲ１４１Ｅ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  38. 前記変異の組み合わせがデザイン番号１３０の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ及びＲ１６７Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  39. 前記変異の組み合わせがデザイン番号１３４の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、Ｄ１１２Ｒ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  40. 前記変異の組み合わせがデザイン番号１３５の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｔ１１５Ｋ、Ｅ１２２Ｒ、及びＥ１２３Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、Ｌ１７１Ｅ、及びＱ１７４Ｅ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  41. 前記変異の組み合わせがデザイン番号１３７の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１４１Ｅ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  42. 前記変異の組み合わせがデザイン番号３００の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＫ４０Ｄ、Ｌ４１Ｄ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＦ７５Ｋ、Ｑ９１Ｋ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  43. 前記変異の組み合わせがデザイン番号３０１の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＴ３８Ｒ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｑ７３Ｅ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  44. 前記変異の組み合わせがデザイン番号３０２の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｌ８６Ｄ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  45. 前記変異の組み合わせがデザイン番号３０３の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＬ１０８Ｋ、Ｄ１１２Ｒ、及びＲ１４７Ｅ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＥ９３Ｋ及びＲ１６７Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  46. 前記変異の組み合わせがデザイン番号３０４の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、Ｄ１１２Ｒ、及びＲ１４７Ｅ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｅ９３Ｋ、及びＲ１６７Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  47. 前記変異の組み合わせがデザイン番号３０５の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  48. 前記変異の組み合わせがデザイン番号３０７の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＳ１２Ｅ、Ｋ１６Ｄ、Ｅ１９Ｋ、及びＥ４６Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｄ１９７Ｋ、Ｄ２００Ｋ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  49. 前記変異の組み合わせがデザイン番号３０８の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｒ、Ｅ４６Ｒ、Ｄ１１２Ｋ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、Ｖ２０２Ｄ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  50. 前記変異の組み合わせがデザイン番号４００の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｄ１０９Ｒ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、Ｍ１９９Ｄ、及びＲ２８８Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  51. 前記変異の組み合わせがデザイン番号４０１の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｌ１０８Ｋ、及びＤ１１２Ｒ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、及びＲ２８８Ｄ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  52. 前記変異の組み合わせがデザイン番号４０２の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｋ、Ｅ４６Ｒ、Ｄ１１２Ｋ、及びＴ１１５Ｋ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｅ、Ｑ１７４Ｅ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  53. 前記変異の組み合わせがデザイン番号４０３の変異を含み、前記バリアントＧ－ＣＳＦが配列番号１のアミノ酸位置に対応するＥ１９Ｒ、Ｅ４６Ｒ、及びＤ１１２Ｋ変異を含み、前記受容体が配列番号２のアミノ酸２～３０８のアミノ酸位置に対応するＲ４１Ｅ、Ｒ１６７Ｄ、及びＲ２８８Ｅ変異を含む、請求項３５に記載のシステム。
  54. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の受容体を、請求項１６～２７に記載のバリアントＧ－ＣＳＦと接触させることを含む、細胞の表面上で発現する受容体を選択的に活性化させる方法。
  55. 前記受容体が、免疫細胞上、
    任意選択でＴ細胞上、
    任意選択でＮＫ細胞上、
    任意選択でＮＫＴ細胞上、
    任意選択でＢ細胞上、
    任意選択で形質細胞上、
    任意選択でマクロファージ上、
    任意選択で樹状細胞上
    で発現し、
    任意選択で前記細胞が幹細胞であり、
    任意選択で前記細胞が初代細胞であり、
    任意選択で前記細胞がヒト細胞である、
    請求項５４に記載の方法。
  56. 前記免疫細胞の前記選択的活性化が、前記免疫細胞の増殖、生存、及び増強した活性からなる群より選択される細胞応答を引き起こす、請求項５４に記載の方法。
  57. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の受容体を発現する免疫細胞を作製する方法であって、前記細胞に請求項１２に記載の核酸または請求項１３に記載の発現ベクターを導入することを含む、前記方法。
  58. 治療を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１４に記載の細胞を前記対象に注入することを含む、前記方法。
  59. 請求項１６～２７のいずれか一項に記載のバリアントＧ－ＣＳＦを前記対象に投与することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
  60. がんを治療するために使用される、請求項５８または５９に記載の方法。
  61. 炎症状態を治療するために使用される、請求項５８または５９に記載の方法。
  62. 移植片拒絶反応を治療するために使用される、請求項５８または５９に記載の方法。
  63. 感染症を治療するために使用される、請求項５８または５９に記載の方法。
  64. 前記方法が、少なくとも１つの追加の活性剤を投与することをさらに含み、任意選択で、前記追加の活性剤が追加のサイトカインである、請求項５８または５９に記載の方法。
  65. 治療を必要とする対象を治療する方法であって、
    （ｉ）免疫細胞を含有する試料を単離することと、
    （ｉｉ）請求項１～１１に記載のバリアントサイトカイン受容体をコードする核酸配列を前記免疫細胞に形質導入またはトランスフェクトすることと、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の前記免疫細胞を前記対象に投与または注入することと、
    （ｉｖ）前記免疫細胞を、前記バリアント受容体に結合する請求項１６～２７に記載のバリアントＧ－ＣＳＦと接触させることと
    を含む、前記方法。
  66. 前記細胞を前記対象に投与または注入する前に、前記対象が免疫除去治療を受けている、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記免疫細胞を含有する試料が、前記細胞を投与または注入される前記対象から単離される、請求項６５に記載の方法。
  68. 前記細胞を前記対象に投与または注入する前に、前記免疫細胞をインビトロで前記サイトカインと接触させる、請求項６５に記載の方法。
  69. 前記免疫細胞を、キメラ受容体からのシグナル伝達を活性化させるのに十分な時間、前記キメラ受容体に結合する前記サイトカインと接触させる、請求項６５に記載の方法。
  70. 治療を必要とする対象を治療するためのキットであって、請求項１～１１のいずれか一項に記載のバリアント受容体をコードする細胞と、使用説明書と、を含み、任意選択で、前記キットが、前記バリアント受容体に結合する請求項１６～２７に記載のバリアントＧ－ＣＳＦを含み、任意選択で、前記細胞が免疫細胞である、前記キット。
  71. 細胞表面上で発現する受容体を選択的に活性化させるためのシステムを作製するためのキットであって、
    （ａ）請求項１２に記載の核酸または請求項１３に記載の発現ベクターと、
    （ｂ）請求項１６～２７のいずれか一項に記載のバリアントＧ－ＣＳＦ、請求項２８に記載の核酸、または請求項２９に記載の発現ベクターと、
    （ｃ）使用説明書と
    を含む、前記キット。
  72. 細胞上で発現するキメラ受容体を作製するためのキットであって、請求項１～１１のいずれか一項に記載のバリアント受容体をコードする発現ベクターを含む細胞と、使用説明書と、を含み、任意選択で、前記細胞が細菌細胞であり、任意選択で、前記キットが前記バリアント受容体に結合するバリアントＧ－ＣＳＦを含む、前記キット。
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