CN101824091B

CN101824091B - G-csf融合蛋白突变体及其制备与应用

Info

Publication number: CN101824091B
Application number: CN2009101993379A
Authority: CN
Inventors: 温晓芳; 吴亦亮; 王叶飞; 杨志愉; 范敏; 王玉姣; 方晓春; 陆游
Original assignee: Jiangsu T-Mab Biopharma Co Ltd
Current assignee: Jiangsu T-mab BioPharma Co., Ltd.
Priority date: 2009-11-25
Filing date: 2009-11-25
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2029-11-25
Also published as: CN101824091A

Abstract

本发明涉及G-CSF融合蛋白突变体及其制备与应用。本发明的G-CSF融合蛋白突变体，为具有刺激中性粒细胞增殖活性的融合蛋白，其结构为G-CSF/载体蛋白或载体蛋白/G-CSF，其中，G-CSF部分含有多点突变，改变了活性与受体亲和力。本发明的G-CSF融合蛋白突变体与现有的同类产品比较，具有更长半衰期和更高的生物学活性。通过注射适合剂量的此药物制剂可治疗中性粒细胞减少症。

Description

G-CSF融合蛋白突变体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种新的具有加速粒细胞恢复功能的融合蛋白，制备这种融合蛋白的方法，含有这种融合蛋白的药物制剂以及在医药领域，尤其是治疗中性粒细胞减少症或白细胞减少症方面的应用。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，可诱导造血干细胞的增值和分化，促进血液中的中性粒细胞数增加；另外还能刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释放出并激活中性粒细胞的功能。G-CSF的空间主要结构为螺旋，174个残基中的103个形成了4个α螺旋(Hill CP等，Proc Natl Acad Sci USA，90：5167-5171，1993)，如图1所示。自1991年起，重组人粒细胞集落刺激因子(rG-CSF)已经广泛用于治疗癌症化疗导致的骨髓抑制，可以显著改善化疗所引起的中性粒细胞减少症的严重性和持续时间。目前，已经有多种商业化rG-CSF制剂在销售，如非格司亭(filgrastim)(商品名为

和)，雷诺司亭(lenograstim)(商品名为

和

)，那曲司亭(nartograstim)(商品名为

)。其中，filgrastim和nartograstim都是重组大肠杆菌细胞产生的非糖基化的rG-CSF，而lenograstim是CHO细胞表达的带糖基化的rG-CSF。

但是，天然或重组的G-CSF由于分子量较小，极易被肾小球过滤，在人体内的循环半衰期很短，只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天(Welte K等，Proc Nat Acad Sci USA，82：1526-1530，1985；Frampton JE等，Drugs，48：731-760，1994)。延长G-CSF制剂体内半衰期可以减少给药次数。增加G-CSF蛋白质的体内半衰期的一个途径是减少蛋白质的体内清除，包括通过肾脏的清除、蛋白酶降解和受体介导的清除。可以通过将G-CSF蛋白与能增加表观分子量的某些组分耦联，从而降低肾脏的清除速率。同时，将蛋白与这些组分连接可以有效地阻止蛋白酶与蛋白的接触，从而降低被蛋白酶的降解速率。血清中存在的一些长半衰期的蛋白，如白蛋白和IgG，存在一种FcRn介导的内吞保护作用。其基本原理是：IgG的Fc部分和白蛋白在正常生理状态下可以与细胞表面相应的FcRn受体结合，结合后被内吞，在吞噬小泡中因为pH下降，其结合复合物解离，IgG和白蛋白重新从细胞中被释放，正是因为存在FcRn介导的循环作用保护了IgG和白蛋白不被降解和代谢(Junghans RP，Immunol Res.，16：29-57，1997；Chaudhury C等，J ExpMed.，197：315-322，2003；Chaudhury C等，Biochemistry.，45：4983-4990，2006)。因此G-CSF与HSA或者IgG的Fc片段融合具有更长半衰期。通过聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rG-CSF，商品名)(Harris JM，Clin Pharmacokinet，40：539-551，2001)，可使G-CSF半衰期获得了延长。通过白蛋白融合技术，即通过基因工程方法将人白蛋白与G-CSF融合表达获得的rHSA/G-CSF，也能提高G-CSF在体内的半衰期(Wendy Halpern等，Pharm Res，19：1720-1729，2002)；同样的，通过与抗体Fc片段融合，也可以显著改善G-CSF在体内的半衰期(Cox George N等：Experimental Hematology，32：441-449，2004)。

但是，现有的长半衰期G-CSF在临床应用还是存在很多缺陷。

首先，虽然用PEG修饰或者白蛋白融合等技术可以提高G-CSF的分子量而改善其半衰期，但是，由于G-CSF受体介导(receptor mediated clear，RMC)的清除路径的存在，如下文更加详细的描述，这种改善也是有限的。

G-CSF在体内的清除不同于一般的蛋白质药物，除了肾脏的清除和蛋白酶降解等途径外，还存在G-CSF受体介导(receptor mediated clear，RMC)的清除途径。RMC途径是指G-CSF(包括其修饰物)与G-CSF受体结合形成G-CSF/G-CSFR复合物，然后G-CSF/G-CSFR复合物被细胞内吞，同溶酶体融合而被蛋白酶降解。影响RMC速度的核心因素是G-CSF与受体结合和解离的情况。该途径本身是机体调节内源性G-CSF作用的一个反馈机制。G-CSFR在中性粒细胞表面大量表达，当中性粒细胞数量上升时可以加速对G-CSF的清除。通过PEG修饰或白蛋白融合技术，虽然可以增大G-CSF的水合半径，减少肾脏滤过，也可以保护其在循环系统中不被蛋白酶降解，因而可以延长其体内半衰期。但是由于RMC途径是通过G-CSF受体来清除G-CSF的，而上述技术并没有明显影响G-CSF与受体的结合和解离速度，因此均无法显著减少RMC的清除速度。所以，对于修饰化的G-CSF制剂(PEG化的，白蛋白融合或其他载体蛋白融合方式)，RMC路径成为其体内代谢的主要途径。要想获得半衰期更长，疗效更好的修饰化的G-CSF制剂，需要抑制RMC途径。例如，由于RMC作用的存在，即使避免了肾脏清除途径，rHSA/G-CSF融合蛋白的半衰期仅为7.7-13.3个小时(Wendy Halpern等，Pharm Res，19：1720-1729，2002)，而白蛋白与其他细胞因子融合时的半衰期一般长达70-80小时(Müller D等，J Biol Chem，282：12650-12660，2007)。

通常，受体介导的清除(RMC)是和受体的活化关联的，多肽与其受体在非活化的情况下的结合不能导致RMC。清除是由于活化的受体与多肽结合后通过细胞内吞，随后被溶酶体降解所致。Bowen等人研究发现(Bowen等，Exp Hematol，27：425-432，1999)，PEG修饰的G-CSF蛋白上PEG基团的分子量与PEG/G-CSF的体外活性之间存在明显的反比关系；然而令人惊讶的是，体内实验的结果表明，PEG/G-CSF的体内活性随着PEG基团的分子量的增加而增加。他们推测PEG/G-CSF偶联物同G-CSFR的低亲和力有增加半衰期的作用，因为受体介导的内吞作用是一种调节造血生长因子水平的重要机制。还有人发现，在G-CSF的螺旋区，即氨基酸11-14，71-95，102-125，145-170的氨基酸残基中，如果出现氨基酸取代，将所得的多肽与PEG偶联后，可以导致受体介导的清除降低(Nissen等，美国专利US6831158)。

目前，人们通过对G-CSF分子上选择特定的位点进行突变的方式，获得了半衰期提高的突变体。Sarker等人基于对用氨基酸替代技术降低蛋白-受体在胞质内的亲合力，从而在随后的内囊体中的蛋白分选过程中能增加循环，其结果是延长蛋白质的半衰期的认识；将G-CSF的个别氨基酸残基用组氨酸残基取代，经过筛选获得两个半衰期延长的G-CSF突变体D110H和D113H(Sarker等，Nature Biotech，20：908-913，2002)。

虽然G-CSF与HSA或者IgG的Fc片段融合具有更长半衰期。但是，对于G-CSF融合蛋白，现有已知的通过G-CSF突变来延长半衰期的经验并不一定适用。主要原因是HSA或者Fc融合后会改变其与受体的结合能力。这个影响对融合蛋白中两个蛋白：G-CSF和融合载体，都是存在的。一方面会影响G-CSF与G-CSF受体间的结合；另一方面也会影响HSA(或Fc)FcRn之间的结合。而这两者的改变都与G-CSF的半衰期有关，因此要进一步延长G-CSF融合蛋白的半衰期是极其困难的。根据已有研究结果，将现有发现的一些可以延长G-CSF半衰期的突变位点引入rHSA/G-CSF融合蛋白中，所获得突变融合蛋白，却发现并不能比未突变的具有更长的半衰期(见表2)。

其次，化疗病人在化疗后即使给予G-CSF治疗，仍然会有一段持续时间较长的中性粒细胞匮乏时期，在这期间仍然有严重感染的风险，对这些病人而言，重要的是尽可能缩短中性粒细胞减少症的持续时间并减轻其程度，从而使严重感染的可能性降到最低。而目前使用的长效G-CSF制剂，仅仅能降低给药频率，并不能缩短中性粒细胞减少症的持续时间。因此，延长其半衰期的同时还能缩短中性粒细胞减少症的持续时间，对接受化疗或放疗的病人是极有意义的。

再次，现有的PEG或HSA修饰的G-CSF制剂虽然可以延长G-CSF体内半衰期，但是由于活性位点的封闭或空间位阻效应往往伴随着生物学活性的下降。如PEG化的G-CSF仅保留了原有活性的60％，HSA融合的G-CSF仅保留了原有活性的1/7(Fleer等，美国专利US5876969)，因此，临床应用需大剂量制剂以保证治疗效果。大剂量造成的一个副作用是G-CSF治疗总是伴随着剂量依赖性的骨痛。因此，使用时不产生骨痛的新型的G-CSF制剂，或者这种产品的体内生物学活性足够高，在该产品的有效使用剂量下不会引发骨痛，是患者所希望的。

大剂量带来的另外一个问题是产品制剂浓度的增加，如PEG/G-CSF制剂

浓度为10毫克/毫升，相比于原来的G-CSF制剂

(0.3毫克/毫升)增加了33倍。高浓度的蛋白制剂在运输和贮存期间容易造成蛋白质聚体增加。已有的研究表明，治疗用蛋白聚体增加，会增加免疫原性(De Groot AS和Scott DW，Trends Immunol.，28：482-490，2007)。重组蛋白多聚体会通过交联B细胞受体，激活B细胞增生从而启动B细胞和T细胞免疫(Rosenberg AS，AAPS J.，8：501-507，2006)。而且，重组蛋白多聚体也更容易被抗原递呈细胞(APC)所吞噬，从而加快驱使树突细胞(dendritic cell，DC)的成熟从而激发多种免疫反应(De Groot AS和Scott DW，Trends Immunol.，28：482-490，2007)。

第四，化疗病人在化疗后即使给予G-CSF治疗，仍然会有一段持续时间的中性粒细胞减少症，在这期间仍然有严重感染的可能性。而目前使用的长效G-CSF制剂，仅仅能降低给药频率，并不能缩短中性粒细胞减少症的持续时间。对这些病人而言，如果能缩短中性粒细胞减少症的持续时间并减轻其程度，就能够使严重感染的可能性降到最低。

综上所述，目前市场现有的G-CSF制剂仍然有相当大的改进空间。在现有技术的基础上，开发一种疗效更好，半衰期更长，安全性更高的G-CSF制剂是极其有意义的。本发明涉及这样的G-CSF制剂。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种G-CSF融合蛋白突变体及其制备与应用，与现有的同类产品比较，这类突变体具有更长半衰期；此外，在体内外的实验中发明者还很意外地发现，该类突变体具有更高的生物学活性，能使中性粒细胞更快恢复的特点。

本发明一方面公开了一种G-CSF融合蛋白突变体，为具有刺激中性粒细胞增殖活性的融合蛋白，其基本结构为G-CSF/载体蛋白或载体蛋白/G-CSF，其中，G-CSF部分含有K34H，L35I，K40H及L41I突变中的一种或多种的组合。例如，对于K34H突变，可以是G-CSF部分含有单独的K34H突变，也可以是G-CSF部分含有L35I，K40H及L41I突变中的一种或多种与K34H突变的组合。

较佳的，所述G-CSF部分还含有T1A，L3T，G4Y，P5R突变中的一种或多种的组合。

更佳的，所述G-CSF部分含有K34H，L35I，K40H，L41I，T1A，L3T，G4Y及P5R突变。优选的，G-CSF部分具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

如本发明实施例所列举，符合本发明目的的G-CSF融合蛋白突变体中，G-CSF可以为与SEQ ID NO：1相比，发生K34H，L35I，K40H或L41I突变中的任一，或者，也可以是发生K34H+L35I、K34H+K40H、K34H+L41I、L35I+K40H、L35I+L41I或K40H+L41I突变，最佳的，为发生了K34H，L35I，K40H，L41I，T1A，L3T，G4Y及P5R的突变。

G-CSF部分应至少有90％的序列与SEQ ID NO：1相同。较佳的，所述G-CSF部分至少有96％的序列(按174个氨基酸突变7个计算而得)与SEQ ID NO：1相同。

所述载体蛋白可以是本领域技术人员熟知且常用的载体蛋白。包括但不限于人血清白蛋白、人转铁蛋白、抗体Fc片段等。

最佳的，所述G-CSF融合蛋白突变体具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

进一步的，载体蛋白与G-CSF部分还可以通过连接肽相连，如一些富含Gly，Ser的短连接肽，如(GlyGlyGlyGlySer)_n，n介于1-10之间；连接肽可以采用其他目前已在广泛应用的连接肽，例如Daming Shan所提及的肽段(Shan D等，JImmunol.，162：6589-6595，1999)。

本发明第二方面，公开了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码前述融合蛋白突变体。

编码rG-CSF突变体的核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；也可以先合成具有SEQ ID NO：1所示G-CSF氨基酸序列的核苷酸序列，然后通过定点突变、定向诱变或以其它本领域熟知的技术来插入、替换、剔除序列以获得所需的核苷酸序列。

编码载体蛋白的核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。在本发明的一个具体实施例中，载体蛋白的核苷酸序列为编码人血清白蛋白的核苷酸序列或至少95％的序列与其一致。

编码rG-CSF突变体核苷酸序列和编码载体蛋白的核苷酸序列之间的融合技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。

本发明第三方面，公开了一种表达载体，为前述多核苷酸序列的表达载体。

含有表达rHSA/G-CSF融合蛋白的基因序列可以通过本领域技术人员熟知的表达系统表达，包括但不限于用重组噬菌体、质粒等载体转化的细菌，用酵母表达载体转化的酵母，用真菌载体转化的丝状真菌、用病毒载体感染的昆虫细胞、植物细胞等等。在本发明的一个具体实施例中，表达系统选用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌形式表达，巴斯德毕赤酵母具有高水平表达、成本低、以及具有真核表达系统的蛋白质加工、折叠、翻译后修饰的优点。在具体生产中，细胞可以在实验室中通过摇瓶培养，或者通过发酵罐发酵培养(包括连续、成批、补料分批和固体状态发酵)。

本发明第四方面，公开了一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有前述表达载体、或者染色体中整合有前述多核苷酸。

所述宿主细胞包含一个表达载体，该表达载体包含前述融合蛋白的编码核苷酸序列。通过在合适条件下培养该宿主细胞，使其表达相应的重组融合蛋白。

所述宿主细胞为真核宿主细胞，可以选自酿酒酵母细胞，汉克氏酵母，毕赤酵母，CHO细胞，COS细胞，BHK细胞，或HEK 293细胞。

本发明第五方面，公开了一种制备前述融合蛋白突变体的方法，该方法包括：合成含有能表达前述融合蛋白突变体的核苷酸序列，将此核苷酸序列构建至表达载体中，然后将含有融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，通过亲和层析、离子交换层析和疏水层析制备这种融合蛋白。

分泌到培养基的rHSA/G-CSF融合蛋白可以通过本领域技术人员熟知的方法纯化，包括担不限于超滤、硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、以及离子交换层析、疏水层析、反相层析、分子筛层析等。在本发明的一个具体实施例中，发明者采用联合亲和层析、疏水层析和离子交换层析的三步层析手段使融合蛋白纯化到均一。

本发明第六方面，公开了一种药物组合物，含有前述G-CSF融合蛋白突变体及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。

本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羚基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或生物有效性。

本发明的药物组合物可以用本领域技术人员所熟知的技术配制，包括液体或凝胶体，冻干的或其他形式，以产生储存稳定的适合对人或动物给药的药物。

本发明第七方面，公开了前述G-CSF融合蛋白突变体在制备治疗中性粒细胞减少症或白细胞减少症的药物中的应用。

用本发明的融合蛋白可以制备治疗疾病的药物，尤其适用于预防正在接受化疗、放疗和骨髓移植的癌症患者的感染，用于白细胞减少症和中性粒细胞减少症的患者的治疗，用于急性髓样白血病患者的治疗，用于AIDS或者其他免疫缺陷病的治疗。在本发明的一个实施例中，本发明的融合蛋白用于治疗白细胞减少症和中性粒细胞减少症。

本发明第八方面，公开了一种用于治疗哺乳动物中性粒细胞低下的方法，其中包括注射有效治疗剂量的前述融合蛋白突变体，从而加速其中性粒细胞恢复正常。

本发明的蛋白质可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。

有效治疗剂量，即足以对所治疗的疾病产生所预期的效果的剂量，施与患者。准确的剂量将根据所治疗的疾病，由本领域的技术人员根据临床结果确定，较优用量为1ug-1mg/kg，更优的用量：50ug-500ug/kg。在本发明的一个实施例中，所给予的融合蛋白的有效剂量，是指所给剂量足以使实验对象体内白细胞，尤其是嗜中性粒细胞的数量达到正常的剂量。

本发明的研究人员构建了多个rHSA/G-CSF的突变体(见表1，表2)，并在毕赤酵母中进行了表达，对这些获得的突变体进行了测定配基-受体亲合力的筛选试验，以及细胞水平的生物学活性试验。获得了与G-CSF受体低亲合力的rHSA/mG-CSF突变体融合蛋白。与现有的同类产品比较，该突变体融合蛋白具有更长半衰期。更令人惊讶的是突变后的融合蛋白在体内还具有更高的活性，能够比现有G-CSF融合蛋白具有更快地恢复中性粒细胞的效果，而且副作用更低。本发明在通过突变抑制RMC途径来提高G-CSF融合蛋白的半衰期的研究中意外获得了能够加速中性粒细胞的恢复的突变蛋白，这是出人意料的，现有的研究也无法圆满解释该现象的原因，有待于进一步的研究。但是这一意外结果对于对接受化疗或放疗的病人是极有意义的。

附图说明

图1：G-CSF的三维结构模型，包括4个a螺旋区域，

图2：rHSA/mG-CSF亲和层析色谱图，

图3：rHSA/mG-CSF疏水层析色谱图，

图4：rHSA/mG-CSF离子交换层析色谱图，

图5：rHSA/mG-CSF中间体及成品SDS-PAGE电泳图，

图6：rHSA/mG-CSF分子筛图谱，纯化的rHSA/mG-CSF纯度在95％以上，

图7：G-CSF、rHSA/G-CSF、rHSA/mG-CSF体外生物学活性分析，

图8：rHSA/G-CSF、rHSA/mG-CSF在正常成年SD大鼠体内的药代动力学研究结果，

图9：rHSA/G-CSF及rHSA/mG-CSF体内生物学活性分析

序列说明：

SEQ ID NO：1.G-CSF氨基酸序列，

SEQ ID NO：2.G-CSF突变体氨基酸序列，

SEQ ID NO：3.rHSA/G-CSF融合蛋白氨基酸序列，

SEQ ID NO：4.rHSA/mG-CSF融合蛋白氨基酸序列，

SEQ ID NO：5.rHSA/G-CSF融合蛋白的DNA编码序列，

SEQ ID NO：6.rHSA/mG-CSF融合蛋白的DNA编码序列。

具体实施方式

本发明使用以下缩写：

G-CSF人粒细胞集落刺激因子，mG-CSF人粒细胞集落刺激因子突变体，HSA人血清白蛋白，PEG聚乙二醇，rHSA/G-CSF重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子，rHSA/mG-CSF重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体。

用于定义氨基酸残基取代的缩写举例说明如下：K34指氨基酸序列中编号34的位置是赖氨酸残基；K34H指编号34的赖氨酸残基被组氨酸残基取代；K34H+K40H指编号34的赖氨酸残基被组氨酸残基取代并且编号40的赖氨酸残基被组氨酸残基取代。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1突变位点的筛选

将位于G-CSF受体结合界面及相关的多个氨基酸残基进行突变构建了多个rHSA/G-CSF的突变体，除序列差异外，突变体的构建方法同实施例2。并在毕赤酵母中进行了表达(表达纯化方法如实施例3-5记载)，对这些获得的突变体通过SPR(表面等离子共振)技术进行了测定配基-受体亲合力测定，以及细胞水平的生物学活性试验。通过SPR技术可以获得结合速度常数和解离速度常数并因此直接确定配体-受体平衡解离常数(Zhou等，Biochemistry，32：8193-8198，1993；Faegerstram和Osh annessy，In handbook ofAffinity Chromatography，Marcel Dekker INc，NY，1993)，平衡解离常数越大，表明配体与受体的亲合力越低。在本发明的实施例8中，详细描述了通过SPR技术测定rHSA/G-CSF与G-CSFR结合亲合力的方法。在本发明的实施例7中，详细描述了测定突变体体外生物学活性的方法。38个rHSA/mG-CSF的突变体的试验结果如表1所示。

表1

	平衡解离常数K_D(nmol/L)	体外活性％(按摩尔比计)		平衡解离常数K_D(nmol/L)	体外活性％(按摩尔比计)
						G-CSF	0.3	100	A37G	7.4	16
rHSA/G-CSF	1.3	15.6	T38S	6.7	15
						T1A	1.7	30	K40H	25.2	14
P2K	1.2	12	L41I	17.1	12
						L3T	1.8	40	H43R	4.3	3.8
G4Y	1.1	38	P44K	1.6	18
						P5R	1.5	44	E45D	0.8	15
A6G	8.9	11	E46D	8.5	16
						S7T	1.6	12	Q70K	5.9	17
P10K	0.9	11	Q90K	6.8	17
						Q11N	3.4	11	L108I	7.2	6.1
S12T	1.1	17	D109E	6.5	12
						L15I	4.8	15	D112E	3.1	1.3
K16H	7.3	17	T115S	2.5	12
						C17S	1.3	16	T116S	2.5	17
L19I	11.2	5.6	Q119N	1.8	13
						Q20N	97.5	1.2	Q120K	1.5	15
K34H	18.4	18	E123D	1.5	14
						L35I	12.5	11	L124I	1.4	16

*rHSA/G-CSF：实施例2-4的方法制备

由试验结果可以看到，与rHSA/G-CSF相比，K34H，L35I，K40H，L41I这几个位点的突变，平衡解离常数高，活性却没有明显提高，这说明这几个突变体与受体的亲和力较低。而T1A，L3T，G4Y，P5R等位点突变后活性较高，但是对亲和力影响不大。

根据以上实验结果，重新设计了一些突变位点组合：K34H+L35I，K34H+K40H，K34H+L41I，L35I+K40H，L35I+L41I，K40H+L41I，突变体的获得方法按上文所述，按上文的方法进行第二轮优化筛选试验，并按照实施例7的方法测定其体外活性，以及实施例9的方法测定其体内半衰期，结果如表2所示。同时，将文献报道能够延长G-CSF体内半衰期的D110H和D113H突变位点引入作为对照(Sarker等，Nature Biotech，20：908-913，2002)。本实施例中的G-CSF不含N端Met，D110H和D113H位点对应为D109H和D112H。

表2

样品	平衡解离常数K_D(nmol/L)	体外活性(％)	半衰期(小时)
				G-CSF	0.3	100	2.8
rHSA/G-CSF	1.3	16	8.5
				K34H+L35I	42.7	18	12.6
K34H+K40H	40.1	12	18.0
				K34H+L41I	28.5	17	13.2
L35I+K40H	25.5	17	21.9
				L35I+L41I	23.5	13	16.7
K40H+L41I	30.6	15	24.5
				D109H+D112H	5.3	13	8.8

由上述结果可见，这些突变体相比rHSA/G-CSF半衰期获得了延长，与受体的亲和力获得了降低，体内生物活性获得了提高。而能够延长G-CSF单体半衰期的突变(D109H，D112H)用于HSA融合蛋白，并未能显著延长半衰期。

实施例2rHSA/G-CSF以及突变体rHSA/mG-CSF酵母表达菌株的构建

在实施例1研究的基础上，对突变体进行了进一步的优化，最终筛选出一株与受体亲合力低、半衰期长，且活性高的优化菌株，该菌株发生了T1A，L3T，G4Y，P5R，K34H，L35I，K40H，L41I这些位点的突变。菌株的构建方法如下：

编码HSA/G-CSF(参见SEQ NO：5)和HSA/mG-CSF(参见SEQ NO：6)的DNA序列由上海Invitrogen公司合成，并插入到pMD18-T(TaKaRa)中，构建成质粒HSA/G-CSF/pMD18-T和HSA/mG-CSF/pMD18-T。HSA带有其天然的信号肽序列，并在信号肽序列前加入BamHI位点，G-SCF的3’端加入EcoRI位点。

HSA/G-CSF/pMD18-T质粒用BamHI/EcoRI酶切，分别回收HSA/G-CSF和HSA/mG-CSF片段，并分别连接到相同酶切的pPIC9质粒上，转化E.coli DH5a感受态细胞，最后涂布于含50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，直到长出单克隆菌斑。转化斑按常规方法提取质粒，用BamHI/EcoRI酶切鉴定，有目的大小片段切下的质粒，送往上海Invitrogen公司测序。

测序验证正确的质粒，经SalI酶切线性化后，用电转化转化至感受态GS115细胞中，涂布于RDB平板(1M山梨醇，2％葡萄糖，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.005％氨基酸(不含组氨酸)上，于30℃培养3天，至单菌落出现。

实施例3rHSA/G-CSF以及突变体rHSA/mG-CSF的表达筛选

将实施例2转化的重组酵母单菌落接种至10ml BMGY液体培养基(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，pH6.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)中，30℃，250rpm培养24小时后，静置过夜，弃上清，加入10ml含1％甲醇的BMMY液体培养基(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，pH6.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甲醇)，30℃，250rpm诱导，每24小时补加一次甲醇，共诱导72小时。从0小时起，每隔10小时取1ml诱导菌液至1.5ml离心管中，5000g离心5分钟。取40μl上清加入10μl 5×Loadingbuffer，沸水浴中煮5分钟，12％SDS-PAGE电泳，以GS115空菌诱导72小时样为对照，分析表达情况。

实施例4rHSA/G-CSF以及突变体rHSA/mG-CSF在酵母中的表达

挑取实施例3获得的含有rHSA/G-CSF以及突变体rHSA/mG-CSF重组体的单菌落接种于BMGY培养基中，30℃震荡培养过夜，A₆₀₀约为5.0。离心收集菌体，以BMMY培养基重悬菌体至A₆₀₀为2.0后诱导表达，每隔24h补加甲醇至甲醇终浓度为2％，72h后离心收集上清。

在毕赤酵母中生产的融合蛋白的表达水平用市售的G-CSF ELISA试剂(QuantikineHuman G-CSF Immunoassay，R&D system Cat No.DCS50)进行定量，表达水平约为200mg/L。

实施例5从酵母表达上清中纯化rHSA/mG-CSF

将实施例4的酵母表达上清离心，离心好的上清液上样于用平衡缓冲液(20mM PH 7.0)预先平衡好的Blue Sepharose CL6B亲和层析柱(GE Healthcare，XK26/20，50mL)，上样完成后用平衡缓冲液洗两个柱体积洗脱未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液(20mM PB，2M NaCl，10％甘油，pH7.0)洗脱目标蛋白(图2)。

在GE Healthcare公司的XK26/20柱中装入20mL的Phenyl High Sub疏水胶，流动相A为20mM PH 7.0加1mol/L(NH₄)₂SO₄，流动相B为20mM pH 7.0的PB缓冲液。将上一步亲和层析收集的目标峰补加硫酸铵至硫酸铵终浓度为1M，上样于预先用流动相A平衡好的上述层析柱，上完样后用流动相A平衡2个柱体积，再用50％的流动相B洗脱，收集目标峰(图3)。

在GE Healthcare公司的XK16/20柱中装入10mL的Sepharose Q FF胶，流动相A为20mMPH 7.0，流动相B为20mM 0.5M NaCl，pH 7.0。先将上一步的疏水层析洗脱峰用纯水稀释2倍，然后上样于用流动相A平衡好的上述层析柱，上完样后再用流动相A平衡2个柱体积，然后以10个柱体积，0-100％流动相B的线性梯度洗脱，收集目标峰(图4)。

实施例6鉴定和定量rHSA/mG-CSF

对象：实施例5纯化获得的rHSA/mG-CSF。

1.蛋白浓度测定采用Bradford方法。

2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

对纯化好的rHSA/mG-CSF进行12％SDS聚丙烯酰胺电泳，明显可见一条分子量为85KD的单一条带。(图5)

3.分子筛层析(SEC-HPLC)

SEC-HPLC采用TSK Gel G3000 Swxl柱，缓冲液为50mM PB，0.25M NaCl，pH7.0，表观分子量约为85KD。(图6)

4.反相层析-高效液相色谱(RP-HPLC)

RP-HPLC采用VYDAC protein C4 TP5415柱，流动相A为：含0.1％TFA的水溶液，流动相B采用含0.1％TFA的9∶1乙腈∶水溶液，结果显示，所纯化的rHSA/mG-CSF纯度为98％。

5.氨基酸序列分析

通过氨基酸序列分析能更准确地测定蛋白组成。对纯化的rHSA/mG-CSF进行N端及C端的氨基酸分析表明，经过实验确定的氨基酸序列与预期的一致。

实施例7测定rHSA/mG-CSF的体外生物学活性

对象：实施例5纯化获得的rHSA/mG-CSF。

rHSA/mG-CSF的体外活性测定选用G-CSF依赖细胞株NFS60，以MTT法测定生物学活性(中华人民共和国药典，2005版，三部)。

1.标准品溶液的制备

取重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定的国家标准品(中国药品生物制品检定所，批号98/01)，按说明书复溶，用基础培养液稀释至每毫升含50～100IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。

2.供试品溶液的制备

取供试品按标示量溶解后，用基础培养液稀释至每毫升含50～100IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl供试品稀释液，弃去孔中多余溶液。

3.测定

NFS 60细胞株用完全培养液于37℃、5％CO₂培养，控制细胞浓度为每毫升含1×10⁵～4×10⁵个细胞，传代24～36小时后用于测定。取足量NFS 60细胞培养物，离心收集细胞，用RPMI 1640培养液洗两次，然后重悬于基础培养液(RPMI 1640900ml+新生牛血清100ml)配成每毫升含2×10⁵个细胞的细胞悬液。在加有标准品和供试品的96孔板中每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5％CO₂培养40～48小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％CO₂培养5小时。每孔加入裂解液100μl，37℃过夜，用酶标仪于波长570nm处测定吸光度，以630nm为参比波长，其中一个典型的活性检测结果参见图7，活性为天然G-CSF的48％。实验数据采用ORIGIN 7.0软件(Microcal公司)或四参数回归计算法进行处理，并用以下公式计算：

式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数。

实施例8测定rHSA/mG-CSF与受体亲合力的配基-受体结合-解离常数

1.G-CSFR的偶联

用Biacore

控制软件Wizard中的氨基偶联方法将受体G-CSFR(R&D公司，，货号381GR/CF)偶联到CM5芯片的FC₄道上。HBS-P缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％(v/v)的surfactant P20，pH 7.4)作为工作缓冲液，1mg/mL的G-CSFR用pH 4.5，10mM NaAC稀释至终浓度为20μg/mL。芯片表面用0.2M EDC和50mM NHS 1∶1混合以10μL/min的流速进样7分钟，然后注射G-CSFR溶液，以pH 8.5，1M ethanolamine进样7分钟，封闭活化的芯片表面。

2.用SPR(表面等离子共振)方法测配体和受体的结合活性。

用HBS-P缓冲液将rHSA/mG-CSF和G-CSF标准品定量稀释，按Biacore

控制软件中的动力学分析Wizard进行动力学实验。所有样品进样时，流速为30μL/min，进样3min，解离5min，然后分别用50mM NaOH，1M NaCL和HBS-P缓冲液以100μL/min的流速进样15s、60s进行再生。得到的数据根据Biacore 3000分析软件中的1∶1 Langmuir结合模型进行拟合，得到确切的动力学常数：

结合速度常数k_a和解离速度常数k_d，然后计算出平衡解离常数K_D＝k_d/k_a。实施例5纯化获得的rHSA/mG-CSF最终检测其平衡解离常数为42.6nm/L。

实施例9rHSA/G-CSF及rHSA/mG-CSF的体内半衰期试验

采用雄性Sprague Dawley大鼠，在给药的当天，称量动物体重(每只280-310克)，将rHSA/G-CSF和rHSA/mG-CSF样品按每千克体重100μg经尾静脉注射给三只大鼠，注射后30分钟，1，2，4，8，24，48，72，96，120小时取血。室温储存血样1.5小时后，离心分离血清，-80℃储存样品。采用双抗体夹心ELISA法检测样品中rHSA/G-CSF、rHSA/mG-CSF的血药浓度，具体操作参见Human G-CSF DuoSet试剂盒Human G-CSF ELISA ConstructionKit(ANTIGENIX)的操作手册。得到标准品的数据用MicroCal Origin软件中的四参数逻辑曲线绘制标准曲线，并求回归方程及相关统计参数；用Microsoft Excel 2003软件将样品数据代入标准曲线的回归方程计算相关数值并作图。结果见图8，未突变的rHSA/G-CSF和突变的rHSA/mG-CSF(实施例5获得)的半衰期经测定分别为8.5小时和25.5小时；说明在G-CSF中引入新的氨基酸替换导致体内半衰期明显增加。

实施例10rHSA/G-CSF及rHSA/mG-CSF体内生物学活性分析

SPF Sprague Dawley大鼠(250-270克)按6只/组随机分组。给药前24小时，对每只大鼠腹腔注射50mg/kg的环磷酰胺(CPA)。在给药当天，将rHSA/G-CSF和rHSA/mG-CSF样品按每千克体重100μg分别静脉或者皮下注射6只随机分配的大鼠。在给药前，以及给药后6、12、24、36、48、72、96、120、144和168小时，从尾静脉采血300μl，加EDTA使其稳定。对血清样品进行白细胞计数。结果如图9所示，rHSA/G-CSF和rHSA/mG-CSF给药后3小时白细胞水平增加，之后白细胞水平由于化疗下降，约48小时达到最小值，rHSA/mG-CSF给药组白细胞下降水平明显低于对照rHSA/G-CSF组。给药约48小时后，rHSA/mG-CSF给药的大鼠白细胞数目恢复正常水平，而对照的rHSA/G-CSF给药的大鼠在72小时后中性粒细胞数目才开始接近正常水平。与对照组比较，rHSA/mG-CSF给药组的白细胞减少症的持续时间大大缩短。

序列表

<110>泰州贝今生物技术有限公司

<120>G-CSF融合蛋白突变体及其制备与应用

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>174

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val

35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys

50 55 60

Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser

65 70 75 80

Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser

85 90 95

Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp

100 105 110

Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro

115 120 125

Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe

130 135 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe

145 150 155 160

Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

165 170

<210>2

<211>174

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>mG-CSF序列，与G-CSF相比，发生了T1A，L3T，G4Y，P5R，K34H，L35I，

K40H，L41I位点的突变

<400>2

Ala Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

Glu His Ile Cys Ala Thr Tyr His Ile Cys His Pro Glu Glu Leu Val

35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys

50 55 60

Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser

65 70 75 80

Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser

85 90 95

Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp

100 105 110

Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro

115 120 125

Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe

130 135 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe

145 150 155 160

Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

165 170

<210>3

<211>783

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(24)

<223>人血清白蛋白信号肽

<400>3

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Leu Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

610 615 620

Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu

625 630 635 640

Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu

645 650 655

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser

660 665 670

Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His

675 680 685

Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile

690 695 700

Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala

705 710 715 720

Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala

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Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala

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Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

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<210>4

<211>783

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(24)

<223>人血清白蛋白信号肽

<400>4

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

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Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

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Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

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Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

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225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

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Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

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Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

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Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

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Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

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435 440 445

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Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

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Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

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<210>5

<211>2352

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(72)

<223>人血清白蛋白信号肽

<400>5

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

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gaaaatttca aagccttggt gctgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagggt cactaaatgc 1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagcttgt gaaacacaag 1680

cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttaaca ccattaggcc ctgccagctc cctgccccag 1860

agcttcctgc tcaagtgctt agagcaagtg aggaagatcc agggcgatgg cgcagcgctc 1920

caggagaagc tgtgtgccac ctacaagctg tgccaccccg aggagctggt gctgctcgga 1980

cactctctgg gcatcccctg ggctcccctg agcagctgcc ccagccaggc cctgcagctg 2040

gcaggctgct tgagccaact ccatagcggc cttttcctct accaggggct cctgcaggcc 2100

ctggaaggga tctcccccga gttgggtccc accttggaca cactgcagct ggacgtcgcc 2160

gactttgcca ccaccatctg gcagcagatg gaagaactgg gaatggcccc tgccctgcag 2220

cccacccagg gtgccatgcc ggccttcgcc tctgctttcc agcgccgggc aggaggggtc 2280

ctggttgcct cccatctgca gagcttcctg gaggtgtcgt accgcgttct acgccacctt 2340

gcccagccct ga 2352

<210>6

<211>2352

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(72)

<223>人血清白蛋白信号肽

<400>6

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120

gaaaatttca aagccttggt gctgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagggt cactaaatgc 1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagcttgt gaaacacaag 1680

cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttagca ccaacatacc gtgctagctc cctgccccag 1860

agcttcctgc tcaagtgctt agagcaagtg aggaagatcc agggcgatgg cgcagcgctc 1920

caggagcata tttgtgccac ctaccatatt tgccaccccg aggagctggt gctgctcgga 1980

cactctctgg gcatcccctg ggctcccctg agcagctgcc ccagccaggc cctgcagctg 2040

gcaggctgct tgagccaact ccatagcggc cttttcctct accaggggct cctgcaggcc 2100

ctggaaggga tctcccccga gttgggtccc accttggaca cactgcagct ggacgtcgcc 2160

gactttgcca ccaccatctg gcagcagatg gaagaactgg gaatggcccc tgccctgcag 2220

cccacccagg gtgccatgcc ggccttcgcc tctgctttcc agcgccgggc aggaggggtc 2280

ctggttgcct cccatctgca gagcttcctg gaggtgtcgt accgcgttct acgccacctt 2340

gcccagccct ga 2352

Claims

1.一种G-CSF融合蛋白突变体，为具有刺激中性粒细胞增殖活性的融合蛋白，其结构为G-CSF/载体蛋白或载体蛋白/G-CSF，其中，G-CSF部分与SEQ ID NO：1相比，突变为K34H,L35I,K40H及L41I突变中的任一种，或者为K34H与L35I突变组合、K34H与K40H突变组合、K34H与及L41I突变组合、L35I与K40H突变组合、L35I与L41I突变组合、K40H与L41I突变组合中的任一种，或者为K34H,L35I,K40H,L41I,T1A,L3T,G4Y及P5R突变组合，所述载体蛋白选自人血清白蛋白。

2.如权利要求1所述G-CSF融合蛋白突变体，其特征在于，所述G-CSF部分氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1所述G-CSF融合蛋白突变体，其特征在于，所述G-CSF融合蛋白突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码如权利要求1所述G-CSF融合蛋白突变体。

5.一种含有权利要求4所述的多核苷酸的序列的表达载体。

6.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体、或者染色体中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种制备权利要求1所述G-CSF融合蛋白突变体的方法，该方法包括：合成含有能表达权利要求1所述G-CSF融合蛋白突变体的核苷酸序列，将此核苷酸序列构建至表达载体中，然后将含有融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，通过亲和层析、离子交换层析和疏水层析制备这种融合蛋白。

8.一种药物组合物，含有权利要求1所述G-CSF融合蛋白突变体及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。

9.权利要求1-3中任一权利要求所述G-CSF融合蛋白突变体在制备治疗中性粒细胞减少症或白细胞减少症的药物中的应用。