CN101602801A - 聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG－rmhG－CSF)的制备和鉴定。通过点突变技术，将重组人粒细胞集落刺激因子(rhG－CSF)18位的半胱氨酸(cys)突变为丝氨酸(ser)，再通过噬菌体展示技术表达N端突变的重组人粒细胞集落刺激因子(其中18位的半胱氨酸已突变为丝氨酸)，然后利用重组人粒细胞集落刺激因子受体筛选出具有高稳定性和生物学活性的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG－CSF)。突变后的rmhG－CSF与带有氨基反应基团的聚乙二醇(PEG)反应，经分离纯化，获得了活性和稳定性更高的聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG－rmhG－CSF)。

Description

聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体

技术领域

本发明涉及蛋白质聚乙二醇化修饰领域，更具体地说，涉及了一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)的制备和鉴定。

发明背景

天然人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)成熟蛋白具有174个氨基酸，分子量为19Kda。重组表达的人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)由于增加了一个起始密码子(ATG，翻译后为甲硫氨酸)，因此为175个氨基酸(如序列表所示)。重组人粒细胞集落刺激因子可诱导造血干细胞的增值和分化，导致血液中的中性粒细胞数增加；另外还能刺激成熟中性粒细胞数从骨髓中释出，并激活中性粒细胞的功能。因此自1991年起rhG-CSF已经广泛用于治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症，可以显著改善中性粒细胞减少症的严重性和持续时间。

但是和许多分子量小于30kDa的蛋白质药物一样，rhG-CSF在其代谢过程中易由肾小球滤过，在通过肾小管时又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而半衰期短。rhG-CSF血清半衰期只有2-4小时，为维持一定的疗效需要每天注射，持续注射5-7天，不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应(Welte K等，Proc Nat Acad Sci，82：1526-1530(1985)；Frampton JE等，Drugs，48(5)：731-60(1994))，这不仅增加了病人的痛苦，也增加了医疗费用。

聚乙二醇(PEG)化学修饰是延长蛋白类药物半衰期的一个有效途径。聚乙二醇(简称PEG)是一种惰性、两亲、不带电荷的柔性长链高分子聚合物，化学式为HO(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂OOH，n为聚合单元的个数。PEG分子量随n的增加可由1kDa增至50kDa，有线性和分支两种构型，已经作为多种药物的安全载体用于临床应用。PEG通过共价键与蛋白质连接，可与蛋白质分子中的氨基(位于N末端的氨基或赖氨酸残基)或者巯基(位于半胱氨酸)反应对蛋白质分子进行修饰。该修饰可以有效地改变蛋白类药物在体内的分布和药物学特性，延长蛋白质药物的血药浓度，同时还可降低免疫原性。目前已经有多种聚乙二醇药物应用于临床，如聚乙二醇单修饰重组人干扰素α2a(PEG-IFNα2a)(Bailon P等，Bioconjugate Chem.，12：195-202(2001))、聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)(Harris JM等，Clin Pharmacokinet，40：539-551(2001))等。

聚乙二醇(PEG)分子必须通过一个活化基团活化，才能与蛋白质表面的反应基团反应，以共价键形式连接到蛋白质分子上。Kinstler Olaf B等(美国专利US5985265，1999年公开)研究重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的PEG修饰时就发现，当采用6KD的mPEG-SCM(N-hydroxy succinimidyl ester ofcarboxymethyl methoxy polyethylene glycol)修饰时，最终制备获得的单一修饰的PEG-rhG-CSF是由N端，Lys35，Lys41分别结合有一个PEG分子组成的混合物。进一步分析这三种不同的PEG-rhG-CSF分子，发现N端修饰的PEG-rhG-CSF活性最高，保留了原有活性的68％，Lys35和Lys41修饰产物活性分别为56％和21％，而且Lys35修饰产物是不稳定的，在体外很容易被降解。

从中我们可以发现，用现有方法对rhG-CSF进行PEG修饰以后，rhG-CSF的生物学活性都会下降，根据不同修饰位点和修饰数目，其体外活性可能下降几倍到几十倍。因此，如能制备出一种活性和稳定性更高的PEG化rhG-CSF产物，以降低rhG-CSF的临床用药频率和减少其毒副作用，具有很重要的临床和经济意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有更高生物学活性和稳定性的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)。

本发明的另一个目的是改进现有PEG修饰重组人粒细胞集落刺激因子技术，提供高活性的聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体。

本发明的另一个目的是提供一种聚二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种包含上述聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的药物制剂及其在制备治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症药物中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现最终目的：通过点突变技术，将重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)18位的半胱氨酸(cys)突变为丝氨酸(ser)，再通过噬菌体展示技术表达N端突变的重组人粒细胞集落刺激因子(其中18位的半胱氨酸已突变为丝氨酸)，然后利用重组人粒细胞集落刺激因子受体筛选出具有高生物学活性的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)。突变后的rmhG-CSF与带有氨基反应基团的聚乙二醇(PEG)反应，经分离纯化，获得了活性更高的聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)。

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一个由4个α-螺旋组成的结构(Hill等，PNAS.，5167-5171(1993))，共有两对半二硫键，其中37位和43位的半胱氨酸，65和75位的半胱氨酸分别组成二硫键，只剩下18位的半胱氨酸未成对；此外N端并不在G-CSF的结构区内，并且根据文献报道(Schrader等，PNAS.，2458-2462(1986))，造血细胞因子具有N端结构同源性。因此，通过定点突变技术先将18位的半胱氨酸突变成丝氨酸，可以增加蛋白复性收率和稳定性。然后通过基因突变技术获得N端突变的rmhG-CSF。为了得到高活性的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，需要利用噬菌体展示技术对突变后的rmhG-CSF进行筛选。噬菌体展示技术是目前一种广泛使用的高亲和力和高活性蛋白质筛选技术，该技术能够在丝状噬菌体表面上表达多种随机的蛋白质，再经过与特定配基结合、洗脱和重复筛选，最后得到与受体或者配体有高亲和力蛋白质。

本发明中，为了构建具有高生物活性和稳定性的rmhG-CSF，首先我们利用点突变技术将rhG-CSF 18位的半胱氨酸突变为丝氨酸，再用PCR法创建一编码N端序列被随机替代的rmhG-CSF cDNA文库(具体方法见实例1)，然后通过噬菌体展示技术，用重组人粒细胞集落刺激因子受体作为配体，通过多轮筛选后得到了21个活性基本保留的rmhG-CSF，其氨基酸序列见表1(其中克隆编号0为未突变的rhG-CSF)，其体外活性高于rhG-CSF(见表2)。生物学活性的测定可参照2005年版《中国药典》第三部附录58所示的方法。

表1 21个高活性rmhG-CSF的N端氨基酸序列

克隆编号N端                  17个氨基酸序列

0                            M T P L G P A S S L P Q S F L L K

7                            M A P K R G T S S P F A E L F L K

13                           M T L L A S P T G R A F S M L K L

19            M L P K R T S T P F T E Q L M R K

26            M F K P N D Q E I H P S T W V Y D

31            M Y S S K A R N D F S T W N I Q E

37            M V G A G S L H D N R S K R V A L

56            M A P T Y R A S S L P Q S F L L K

63            M R S K F Q S V I W L R A Q E V D

65            M S F T K M P S T R R A S S P T Y

70            M A K Y F N D Q I L K F S V R A S

101           M T P S Q W S F I H E Q F G A T S

112           M A F K Y S F G T Y R T K R S Y W

140           M L Q A L F A Y R D N Q K N E L N

151           M T D A K T S K E N A P S R K E S

169           M A Y T P R S T K S L N G L F D A

170           M F V A S K T V R N Q T D G T N P

172           M E A A S T Y W M D V E Q D N L Q

173           M P K S A Y R V W I L W Y I H A E

177           M K V Y S T A V S D T L P R D S K

189           M A M T A P S P Y F L R I P K G A

195           M E P K R R T T R T K D H Y H T T

表2 G-CSF和rmhG-CSF的体外生物学活性比较

                Specific bioactivity      Relative

克隆编号        (×10⁸IU/mg)              bioactivity(％)

0               0.82                      100

7               1.28                      156

13              1.17                      143

19              1.25                      152

26              1.16                      141

31        1.31                160

37        1.16                142

56        1.53                186

63        1.09                133

65        1.27                155

70        1.37                167

101       1.30                158

112       1.12                137

140       1.34                163

151       1.05                128

169       1.35                165

170       1.40                171

172       1.39                170

173       1.21                148

177       1.07                130

189       1.16                141

195       1.11                135

筛选到的rmhG-CSF蛋白可以通过原核生物或真核生物宿主基因重组技术表达外源性DNA序列而得到，合适的原核生物宿主包括各种细菌(如E coli.)；合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)。依据所用的宿主的不同，rmhG-CSF表达产物可能会被哺乳动物或其它真核细胞中的碳水化合物所糖基化修饰。对于本发明所用的人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，优选的采用原核表达系统或酵母表达系统的产物，例如E.coli或甲醇酵母表达系统。

通过原核生物或真核生物宿主基因重组技术表达外源性DNA序列而得到的rmhG-CSF，其中小部分为有活性的可溶表达的rmhG-CSF(可用于测活)，绝大部分为无活性的包涵体，需要通过合适的破菌、复性和分离纯化方法，才能得到合格的rmhG-CSF。如中国专利96106418.8所示，原核表达rmhG-CSF通过中空纤维超滤透析方式复性，再经过离子交换层析、疏水柱层析和分子筛层析顺序组合，最终获得的制品含有至少95％以上的rmhG-CSF。

通过控制合适的反应条件，带有氨基反应基团的聚乙二醇分子可与这些改构的高活性的rmhG-CSF蛋白序列中存在的α-氨基或ε-氨基发生定点修饰反应，例如可与N末端甲硫氨酸残基上的α-氨基或第35或第41位赖氨酸残基上的ε-氨基反应。聚乙二醇分子详细可参考Steven M(Modification of CD4 Immunoadhesinwith Monomethoxypoly(ethylene glycol)aldehyde via ReductiveAlkylation，Bioconjugate.Chem，1994，5：133-140)论文中第134页表1中列举的PEG种类以及姜忠义等(蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学，《有机化学》2003年第23卷12期：1340-1347)论文中所描述的那些PEG衍生物，包括但不局限于：PEG琥珀酰亚胺碳酸酯，PEG对硝基苯碳酸酯，PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯，PEG碳酰咪唑，PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)，PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯，甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate，mPEG-SC)，甲氧聚乙二醇醛如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)、甲氧聚乙二醇丁醛等，以及将两个线性的BTC-PEG或mPEG-SC链连到赖氨酸的α-氨基和ε-氨基形成的分支状的PEG衍生物等。聚乙二醇氨基反应试剂可以和rmhG-CSF的氨基基团特异性的结合，分离纯化获得聚乙二醇定点单修饰的产物。这些活性聚乙二醇可以是分子量大于5kDa的任意大小的PEG，其形状可以是单链或者分支状，其中优选分子量在5kDa到40kDa之间的线性或分枝PEGs，更优选分子量为20kDa的单链聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD₂₀₀₀₀)。

本发明还提供一种聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的制备方法，其包括如下步骤：

(1)在含水介质中，带有氨基反应基团的聚乙二醇分子与重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)中的氨基反应；

(2)任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的产物。

较合适的修饰反应条件是rmhG-CSF浓度为0.5-20毫克/毫升，优选3-6毫克/毫升。蛋白质∶PEG分子的比例在1∶1-1∶20之间，优选1∶3-1∶5之间。pH条件为酸性、中性或碱性，优选为酸性或碱性，更优选为pH4.5-6.0或pH7.5-9.5。带有氨基反应基团的聚乙二醇分子可选用上述的那些PEG衍生物，优选甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯(例如甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate，mPEG-SC)或甲氧聚乙二醇醛，例如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)或甲氧聚乙二醇丁醛等。在酸性条件下(优选pH4.5-6.0)，由于赖氨酸残基上ε-氨基和N-末端α-氨基的pKa差异，在反应溶液中未质子化的N-末端α-氨基的分子数相对要比赖氨酸残基上ε-氨基多，因而带有未共用电子对的N-末端α-氨基更容易对上述优选的聚乙二醇衍生物(例如聚二醇丙醛)的羰基发生亲核进攻，通过西佛碱的形成聚乙二醇丙醛可以偶联到α-氨基上，在还原剂如氰基硼酸钠的催化下形成稳定的胺键(其反应原理如下所示)：

因此，在足够酸性的条件下我们可以得到比较均一的rmhG-CSF的N-末端α-氨基被聚乙二醇单修饰的产物。如果提高反应的pH值(例如pH7.5-9.5)，则发生在非N端的(例如在lys35或lys41残基ε-氨基位点单修饰形成稳定的胺键)聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的比例会比较大，可以通过合适的分离纯化方法分离得到单修饰的产物。

经修饰反应后获得的为含有PEG-rmhG-CSF的混合物，其中含有PEG-rmhG-CSF、未反应的活性PEG分子和rmhG-CSF等。需要通过合适的分离纯化方法，例如通过离子交换层析和分子筛层析的组合来纯化上述混合物体系，最终获得的制品含有至少90％以上的PEG-rmhG-CSF和至多10％的未发生聚乙二醇化的rmhG-CSF，优选制品含有至少95％以上的PEG-rmhG-CSF和至多5％的未发生聚乙二醇化的rmhG-CSF，更优选制品含有至少99％以上的PEG-rmhG-CSF和至多1％的未发生聚乙二醇化的rmhG-CSF。

另外，在分离纯化聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体中，发现聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体中(N端修饰)的活性不如某些聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体中(非N端修饰)，具体例子见实例2。因此，我们可以适当提高反应的pH条件，例如碱性，优选pH7.5-9.5，以增加反应产物中发生在非N端的(例如在lys35或lys41残基ε-氨基位点单修饰)聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的比例，然后通过分离纯化得到这些聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体

本发明所制备的PEG-rmhG-CSF，与以前的方法相比，由于采用了点突变技术、N端随机突变技术和噬菌体展示技术，得到了高活性和高稳定性的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)，再通过和聚乙二醇氨基反应试剂相结合的技术方案，因而在提高经聚乙二醇单修饰的蛋白质活性和稳定性方面获得了显著的有益效果。对采用上述方法形成的蛋白分子进行检验，得到如下结果：

(1)提高了体外生物学活性，PEG-rmhG-CSF的活性与rhG-CSF活性相当，高于PEG-rhG-CSF的活性；而且其体外稳定性更高，在pH4.0和4℃条件下可存放3个月而不发生降解。

(2)体内活性实验明显长效，动物实验证实，其体内半衰期延长到了14.6小时，比未修饰的G-CSF(T_1/2＝2.2小时)提高了7倍，达到了长效、减少给药次数的目的。

本发明还提供了一种含有聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)的药用组合物，该药物制剂含有上述的有效量的生物制品和药用稀释剂、佐剂或载体等。该药剂可用于治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症，由于半衰期延长，因此可实现每周只给药1次。优选制剂为注射水针，每毫升含6mg mPEG-rmhG-CSF，0.35mg乙酸钠，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg的氯化钠，pH为4.0。

以下实例将进一步说明本发明。

附图说明

附图1 Seq ID No.1-Seq ID No.21为表1所示21种阳性克隆中重组人粒细胞集落刺激因子突变体的175个氨基酸序列。

附图2图2为rmhG-CSF的PEG修饰和纯化的SDS-PAGE电泳图.，其中1为marker，从上到下为97，67，41，33，21，14KDa；2为纯化的rmhG-CSF；3为rmhG-CSF PEG修饰反应混合物；4为Resource S洗脱峰1；5为Resource S洗脱峰2；6为Resource S洗脱峰3，

附图3为Reource S分离纯化PEG-rmhG-CSF的层析图，洗脱峰1为修饰位点在第41位赖氨酸残基的ε-氨基上的PEG-rmhG-CSF(lys41)，洗脱峰2为修饰位点在第35位赖氨酸残基的ε-氨基上的PEG-rmhG-CSF(lys35)，洗脱峰3为修饰位点在N-末端甲硫氨酸α-氨基上的PEG-rmhG-CSF(N端)

附图4为小鼠皮下给药后rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的血药浓度-时间图

附图5为小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和空白对照的白细胞总数变化情况

具体实施方式

实例1高活性重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的获得

(1)突变的重组人粒细胞集落刺激因子基因rmhG-CSF¹⁸的获得

为了获得第18位Cys突变为Ser的重组人粒细胞集落刺激因子基因rmhG-CSF¹⁸，首先我们要先获得重组人粒细胞集落刺激因子基因rhG-CSF。rhG-CSF基因的克隆方法可参考中国专利CN96106418.8实施例1。以获得的cDNA为模板，设计引物如下：

上游引物1：5‘-GAATTCATGACACCATTAGGC-3’

下游引物2：5’-AAAGGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3’，用常规PCR方法进行目的基因的扩增。PCR产物经回收、纯化，装到pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，将阳性克隆送测序检测。将测序正确的克隆基因用EcoRI和BamH I从pGEM-T上切割回收，即成功获得了rhG-CSF基因。

以上述成功获得的rhG-CSF基因为模板，设计引物如下：

上游引物3：5‘-GAATTCATGACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTCCTTAGAGCAAGTGAGG-3’

该引物与人G-CSF cDNA负链的第1～69个核苷酸互补，其中突变了编码第18个氨基酸的密码子。

下游引物2：5‘-AAAGGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3’

该引物与人G-CSF cDNA正链的第506～534个核苷酸互补(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，用常规PCR方法进行目的基因的扩增。PCR产物经回收、纯化，装到pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞，做蓝白斑筛选，将阳性克隆送测序检测。将测序正确的克隆基因用EcoRI和BamH I从pGEM-T上切割回收，即成功获得了第18位的Cys突变为Ser的重组人粒细胞集落刺激因子基因rmhG-CSF¹⁸。

(2)高活性重组人粒细胞集落刺激因子rmhG-CSF的获得

为了获得高活性的重组人粒细胞集落刺激因子，我们对目前市场上流通的重组人粒细胞集落刺激因子蛋白进行突变筛选。具体操作如下：

a.展示随机突变的重组人粒细胞集落刺激因子基因(rmhG-CSF)噬菌体文库构建据相关文献报道，重组人粒细胞集落刺激因子的生物活性的关键区域是在蛋白的N端，为了获得具有高生物活性的重组人粒细胞集落刺激因子(rmhG-CSF)，我们用随机突变的方法来对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端进行突变来获得rmhG-CSF的cDNA文库。

为了对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端进行随机突变，设计了一个随机的引物库，如下：

随机上游引物：5‘-GAATTCATG---------------------TGCTTAGAGCAA-3’；

其中“---------------------”代表的是48个碱基的随机组合，来编码随机的16个20种人体常见的氨基酸，“TGCTTAGAGCAA”是与编码重组人粒细胞集落刺激因子的第18-21个氨基酸的密码子互补的碱基序列。该引物序列在合成过程中形成一个随机的引物库。

下游引物2：5’-AAAGGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3’。

为了对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端进行随机突变，我们重新构建了一个PCR模板，即以实例一中获得的rmhG-CSF¹⁸基因为模板，以上游引物4和下游引物2为引物对进行常规的PCR基因扩增，PCR产物经回收、纯化，装到pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，将阳性克隆送测序检测。将测序正确的克隆基因用EcoR I和BamH I从pGEM-T上切割回收，即获得了对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端进行随机突变的前模板基因rmhG-CSF°。上游引物4：5’-GAATTCTCCTTAGAGCAAGTGAGGAAGATC-3’。

然后将获得的rmhG-CSF°和随机上游引物等摩尔混合，利用低温PCR条件进行退火连接，并以此连接产物作为最终的对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端进行随机突变的模板基因，在此连接体系中在补加随机上游引物和下游引物2，进行常规PCR进行基因扩增。最终的PCR产物回收后用限制性内切酶EcoRI和BamH I切割，将一部分回收的酶切产物用DNA连接酶和同样用EcoR I和BamHI切割的噬菌粒载体pUC118连接，将连接产物转化TG1感受态细胞，转化后的感受态细胞涂布含有Amp和IPTG及X-gal的2×YT平板(配方见分子克隆第2版附录，冷泉港出版社)，37℃培养过夜，挑取白色的单克隆扩增培养后少量提取质粒，进一步酶切鉴定证实已获得重组的噬菌粒pUC118-重组人粒细胞集落刺激因子(rmhG-CSF)(具体的操作参见分子克隆)。

含重组噬菌粒的大肠杆菌TG1培养液以10mL/L接种于含Amp的2×YT培养基中，37℃摇床培养至A600nm值为0.6，加入辅助噬菌体M13K07继续培养1h，4000g离心15min，收集的菌体加入到新鲜的含Amp，Kan的2×YT培养基中，30℃摇床培养14~18h。将上述培养物10800g，4℃离心10min，收集上清。加入1/6体积PEG/NaCl(200g/L PEG8000，2.5mol/L NaCl)，充分混匀后4℃静置1h，10800g，4℃离心30min，TBS溶解，加入1/6体积的PEG/NaCl，充分混匀后0℃放置20min，10800g，4℃离心30min，TBS溶解，10800g，4℃离心10min，吸取上清，即为表面呈现随即突变的重组人粒细胞集落刺激因子(rmhG-CSF)的重组噬菌体。

b.高活性的人粒细胞集落刺激因子(rmhG-CSF)文库筛选

取提前配制好含0.1g/L叠氮钠的封闭液14mL稀释PEG沉淀的16ml重组噬菌体，室温下孵育10~15min后，取20mL加入G-CSF受体(R&D公司)包被的锥形培养瓶中，37℃孵育2h。PBS，PBST洗培养瓶，然后将10mL培养至对数生长期的TG1细胞加入上述免疫吸附后的培养瓶内，37℃孵育1h，让吸附的重组噬菌体感染TG1细胞，完成第一轮筛选。将10mL感染了重组噬菌体的TG1细胞转移至50mL细菌培养管中，加氨苄青霉素至100mg/L、葡萄糖至终浓度20g/L，再加入辅助噬菌体M13K07，37℃，250r/min震荡培养1h，同前述方法一样进行又一轮筛选.用相同方法完成第3、第4轮筛选，再感染TG1细胞，得到富集的噬菌体克隆。

随机挑选经筛选后的单克隆500个，利用NFS-60细胞的生长对G-CSF的依赖性进行体外生物活性检测，以天然的G-CSF为对照，MTT色素还原法测定样品的生物学活性。结果显示在这些克隆中有21个克隆的生物活性和天然的G-CSF相似或者比天然的G-CSF活性高。选取这21个阳性克隆进行DNA序列分析，结果如下表3

表3 21个高活性rmhG-CSF的N端基因序列

克隆编号                           N端碱基序列

0          ATGACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAG

7          ATGGCACCAAAGCGCGGTACCAGCTCCCCATTCGCAGAACTGTTCCTCAAG

13         ATGACACTATTAGCCTCCCCGACGGGACGCGCCTTTAGCATGCTGAAGCTC

19         ATGCTACCAAAGCGCACATCGACCCCCTTCACAGAACAGTTGATGAGAAAG

26         ATGTTCAAGCCCAACGACCAAGAAATCCACCCAAGTACCTGGGTATATGAC

31         ATGTACAGCAGCAAAGCCAGTAACGACTTCAGTACGTGGAATATCCAAGAG

37         ATGGTCGGAGCCGGTAGTCTTCATGACAACCGCAGTAAACGCGTCGCTCTA

56         ATGGCACCAACATACCGTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAG

63         ATGAGATCCAAATTCCAATCCGTAATATGGCTAAGAGCTCAAGAAGTCGAC

65         ATGAGCTTCACAAAGATCCCCTCGACTAGAAGAGCATCTAGTCCAACATAC

70         ATGGCCAAATACTTCAACGATCAAATTCTGAAATTCTCGGTCAGAGCCAGT

10         ATGACACCATCGCAATGGAGTTTTATCCACGAACAGTTCGGCGCAACTTCC

112        ATGGCATTCAAGTATTCCTTCGGGACATACAGAACTAAACGGTCTTACTGG

140        ATGCTACAAGCGTTATTTGCCTATCGGGACAACCAGAAGAATGAGTTGAAC

151        ATGACCGACGCGAAAACTTCTAAAGAGAATGCGCCATCCAGAAAGGAGTCA

169        ATGGCATATACGCCGAGAAGTACCAAGTCTTTGAACGGACTGTTCGACGCA

170        ATGTTCGTCGCGAGTAAAACCGTTAGAAACCAAACTGACGGGACTAACCCC

172        ATGGAAGCCGCAAGTACCTATTGGATGGACGTTGAGCAAGATAACCTGCAA

173        ATGCCGAAAAGTGCCTACAGAGTCTGGATTCTGTGGAACATCCACGCCGAA

177        ATGAAGGTCTATTCCACAGCTGTATCCGATACGCTTCCCAGGGATAGCAAG

189        ATGGCCATGACAGCACCTTCCCCCTATTTTCTACGCATACCCAAGGGCGCC

195        ATGGAACCTAAGCGTCGTACAACAAGGACTAAAGACCATTATCACACAACC

其相应的氨基酸序列如下表所示：

表421个高活性rmhG-CSF的N端氨基酸序列

克隆编号           N端17个氨基酸序列

0                  M T P L G P A S S L P Q S F L L K

7                  M A P K R G T S S P F A E L F L K

13                 M T L L A S P T G R A F S M L K L

19                 M L P K R T S T P F T E Q L M R K

26                 M F K P N D Q E I H P S T W V Y D

31                 M Y S S K A R N D F S T W N I Q E

37                 M V G A G S L H D N R S K R V A L

56                 M A P T Y R A S S L P Q S F L L K

63                 M R S K F Q S V I W L R A Q E V D

65                 M S F T K M P S T R R A S S P T Y

70                 M A K Y F N D Q I L K F S V R A S

101                M T P S Q W S F I H E Q F G A T S

112                M A F K Y S F G T Y R T K R S Y W

140                M L Q A L F A Y R D N Q K N E L N

151                M T D A K T S K E N A P S R K E S

169                M A Y T P R S T K S L N G L F D A

170                M F V A S K T V R N Q T D G T N P

172                M E A A S T Y W M D V E Q D N L Q

173                M P K S A Y R V W I L W Y I H A E

177                M K V Y S T A V S D T L P R D S K

189                M A M T A P S P Y F L R I P K G A

195                M E P K R R T T R T K D H Y H T T

c.高活性的重组人粒细胞集落刺激因子(rmhG-CSF)在原核系统中的表达、纯化和性质鉴定

取上述21个包含高活性的突变的人粒细胞集落刺激因子(rmhG-CSF)基因的阳性克隆参照中国专利(96106418.8)进行克隆表达、纯化和性质鉴定，最后获得纯度、和活性等都符合要求的rmhG-CSF，其活性测定数据见表2(生物学活性的测定可参照2005年版《中国药典》第三部附录58所示的方法)。选取活性最高的56号克隆参照中国专利(96106418.8)进行克隆表达和纯化，以用于下一步的PEG修饰实验。

实例2PEG-rmhG-CSF的制备

a.rmhG-CSF的PEG修饰

rmhG-CSF的PEG修饰：准备50ml 2mg/ml的rmhG-CSF(阳性克隆56号)，100mM PBS(pH7.5)，然后加入300mg平均分子量为20KDa的MPEG-ALD(聚乙二醇-丙醛，直链)和20mM NaCNBH₄，在4℃下轻轻搅动6h后，SDS-PAGE分析结果表明4个小时后rmhG-CSF的修饰率已经达到85％以上(图2，泳道3)。

b.PEG-rmhG-CSF的制备

然后用注射用水把反应液稀释到1mg/ml，pH以稀盐酸调至4.0，过Resource30S离子交换柱(16×10)，在0-0.5M NaCl，20mM NaAc(pH4.0)中梯度洗脱，其中三种单修饰的PEG-rmhG-CSF在2％-40％梯度洗脱下，分别为洗脱峰1，2，3。收集和合并峰(图3)，SDS-PAGE电泳显示该峰为单条带(图2，泳道4，5，6)，纯度均在95％以上。

c.PEG-rmhG-CSF单修饰异构体的鉴定

根据Kinstler Olaf B等(美国专利US5985265，1999年公开)专利文献说明书15-16页关于PEG蛋白质鉴定的方法，鉴定得到洗脱峰1为PEG-rmhG-CSF(lys41)，洗脱峰2为PEG-rmhG-CSF(lys35)，洗脱峰3为PEG-rmhG-CSF(N端)

实例3PEG-rmhG-CSF等生物学活性的分析

体外生物活性的测定：采用MTT方法((Welte K等，Proc Nat Acad Sci，82：1526-1530(1985))。具体步骤为：在96孔细胞培养板中接种一定浓度的细胞悬液(50μL/孔)，将rhG-CSF标准品(中国药品生物制品检定所)和修饰rhG-CSF样品系列对倍稀释，各取50μL加入培养板相应孔中。设阳性对照、阴性对照(不含rhG-CSF)和空白对照(只含培养液)，37℃，5％ CO2培养36-48h，加MTT溶解液100μL/孔，次日测定各孔A₅₇₀/A₆₃₀值。

经生物学活性测定显示(表5)修饰前的rhG-CSF和rmhG-CSF分别为0.82×10⁸IU/mg和1.53×10⁸IU/mg，后者活性高出86％，说明我们筛选到高活性的rmhG-CSF；而修饰后的PEG-rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF(N端)、PEG-rmhG-CSF(lys35)PEG-rmhG-CSF(lys41)活性分别为0.58×10⁸IU/mg、0.71×10⁸IU/mg、0.80×10⁸IU/mg、0.83×10⁸IU/mg，PEG-rmhG-CSF的活性比PEG-rhG-CSF高，说明得到了高活性的PEG-rmhG-CSF。而且PEG-rmhG-CSF(非N端修饰)，包括PEG-rmhG-CSF(lys35)和PEG-rmhG-CSF(lys41)的活性比PEG-rmhG-CSF(N端修饰)的活性高，说明在该rmhG-CSF的PEG修饰过程中，N端修饰由于阻碍了受体和配体的结合，活性反而降低。而且，初步实验证明，在pH4.0和4℃条件下PEG-rmhG-CSF(N端)、PEG-rmhG-CSF(lys35)和PEG-rmhG-CSF(lys41)放置3个月，SEC-HPLC检测未发生降解，显示其在体外比较稳定。

表5各种G-CSF体外生物学活性比较

实例4PEG-rmhG-CSF体内药物代谢动力学和药效动力学的分析

药代动力学的测定：采用双抗体夹心ELISA法检测样品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF(PEG-rmhG-CSF(lys41)为例，在这个实验中也简称为PEG-rmhG-CSF)以的血药浓度。每组三只18~22g雄性SPF级ICR小鼠，参照表6进行注射和采集血样后，再将血样离心30min后分离血清，-20℃保存待测。用双抗体夹心ELISA法检测样品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的血药浓度，具体操作参见Human G-CSF DuoSet试剂盒(R&D Systems)的操作手册。得到标准品的数据用MicroCal Origin软件中的四参数逻辑曲线绘制标准曲线，并求回归方程及相关统计参数；用Microsoft Excel 2003软件将样品数据代入标准曲线的回归方程计算相关数值并作图；最后用3P87软件进行曲线拟合并计算主要药代动力学参数。

表6皮下给药和取样方法

·SC＝subcutaneous；D1＝first day

结果：rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF小鼠皮下给药(subcutaneous，SC)后的血药浓度-时间数据主要药动学参数见表7，PEG-rmhG-CSF与rhG-CSF在小鼠体内的血药浓度-时间曲线比较见图4。从表7中可看到：rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF血清中药物的半衰期(T_1/2)分别为2.2h和14.8h，后者是前者的7倍；PEG-rmhG-CSF的AUC值为14489ng·h·ml-1，是rhG-CSF的16倍；从图3的血药浓度-时间曲线图可直观看出，达峰时间PEG-rmhG-CSF明显大于rhG-CSF，并且在70h后在血液中可以检测到PEG-rmhG-CSF的血药浓度，血药浓度的波动显著减少。从上述药代参数对比来看，PEG修饰技术确实可以延长rhG-CSF的半衰期，从而达到长效的目的。

表7小鼠皮下给药后rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的药代参数

Abbreviations：SC＝subcutaneous；T_1/2＝terminal half-life；T(peak)＝time of maximum concentration；C(max)＝maximum concentration；AUC＝area under the curve；CL/f(s)＝clearance over bioavailability；V/f＝volume ofdistribution using the terminal phase.

药效动力学的分析：自中科院上海实验动物中心购入19~23gICR小鼠245只(125只雄性，120只为雌性)，除正常对照组注射等量的生理盐水外，其余小鼠注射环磷酰胺1mg/10g体重，连续3天，随机取正常和造模小鼠5只，经测试造模成功。将造模成功小鼠随机分成3组，分组和给药见下表8，给药剂型为水针，每毫升含6mg的mPEG-rmhG-CSF，0.35mg乙酸钠，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20，和0.02mg的氯化钠，pH为4.0。采集各组给药后D2、D4、D6、D8天各5只小鼠血样进行血细胞计数和白细胞分类计数和评价。

表8分组和给药

结果如下：表9、图5分别为小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和对照的白细胞总数表和图。从中可看出PEG-rmhG-CSF对环磷酰胺引起的小鼠白细胞减少症有升白作用，其5天一次注射的效果与每天注射的rhG-CSF效果相当。

表9小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和对照的的白细胞总数

组别	剂量	WBC(k/ul)(第2天)	WBC(k/ul)(第4天)	WBC(k/ul)(第6天)	WBC(k/ul)(第8天)
						rhG-CSF	0.1mg/kg*5	2.13±1.25	2.89±1.52	10.78±9.25	4.12±2.55
PEG-rmhG-CSF	0.5mg/kg	1.49±0.59	14.18±3.58	12.38±14.44	4.05±1.25
						NS组	0.1ml/10g	1.39±0.59	2.49±1.39	3.31±1.85	3.12±1.26

序列表

<110>杭州九源基因工程有限公司

<120>聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>175

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

1               5                   10                  15

Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu

            20                  25                  30

Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu

        35                  40                  45

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser

    50                  55                  60

Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His

65                  70              75                      80

Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile

                85              90                      95

Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala

            100             105                     110

Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala

        115             120                     125

Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala

    130                 135                 140

Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser

145                 150                 155                 160

Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

                165                 170                 175

Claims (10)

1、一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体，其特征在于：(1)所述的重组人粒细胞集落刺激因子突变体氨基酸序列与Seq ID No.1-SeqID No.21任一项所示的氨基酸序列相同；

(2)所述的聚乙二醇为带有氨基反应基团的聚乙二醇分子，其定点结合于重组人粒细胞集落刺激因子突变体蛋白序列中的α-氨基或ε-氨基。

2、根据权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体，其特征在于：所述的聚乙二醇分子为PEG琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG对硝基苯碳酸酯、PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯、PEG碳酰咪唑、PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)、PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate，mPEG-SC)、甲氧聚乙二醇醛或将两个线性的BTC-PEG或mPEG-SC链连到赖氨酸的α-氨基和ε-氨基形成的分支状的PEG衍生物等。

3、根据权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体，其特征在于：

(1)所述的重组人粒细胞集落刺激因子突变体氨基酸序列与Seq ID No.7所示的氨基酸序列相同；

(2)所述的聚乙二醇为甲氧聚乙二醇丙醛，其与重组人粒细胞集落刺激因子突变体蛋白序列中N末端甲硫氨酸残基上的α-氨基反应后形成胺键相连。

4、根据权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体，其特征在于：

(1)所述的重组人粒细胞集落刺激因子突变体氨基酸序列与Seq ID No.7所示的氨基酸序列相同；

(2)所述的聚乙二醇为甲氧聚乙二醇丙醛，其与重组人粒细胞集落刺激因子突变体蛋白序列中第35位赖氨酸残基上的ε-氨基反应后形成胺键相连。

5、根据权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体，其特征在于：

(1)所述的重组人粒细胞集落刺激因子突变体氨基酸序列与Seq ID No.7所示的氨基酸序列相同；

(2)所述的聚乙二醇为甲氧聚乙二醇丙醛，其与重组人粒细胞集落刺激因子突变体蛋白序列中第41位赖氨酸残基上的ε-氨基反应后形成胺键相连。

6、权利要求1-5中任一项所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体在制备治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症药物中的应用。

7、一种含有如权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的生物制品，其特征在于：所述制品含有至少90％以上的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体和至多10％的未发生聚乙二醇化的重组人粒细胞集落刺激因子突变体。

8、一种制备如权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的方法，其包括如下步骤：

(1)在含水介质中，带有氨基反应基团的聚乙二醇分子与重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)中的氨基反应；

(2)任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的产物。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：重组人粒细胞集落刺激因子突变体∶聚乙二醇分子的比例在1∶1-1∶20之间。

10、重组人粒细胞集落刺激因子突变体，其氨基酸序列与Seq ID No.1-Seq IDNo.21任一项所示的氨基酸序列相同。

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