CN101627056B - Y型聚乙二醇修饰的g-csf及其制备方法和应用 - Google Patents

Y型聚乙二醇修饰的g-csf及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用Y型分支的聚乙二醇在特定的赖氨酸位点(K17)进行单位点修饰所得的聚乙二醇化G-CSF及其制备方法，以及获得的聚乙二醇化G-CSF在制药领域中的应用。

Description

Y型聚乙二醇修饰的G-CSF及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及Y型聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子(YPEG-G-CSF)及其制备方法，以及包含YPEG-G-CSF的药物组合物及应用。
背景技术
粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)是刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子之一，它能够特异性地刺激和调节粒细胞系统的增殖、分化、存活和活化，对于各种原因引起的粒细胞减少症具有潜在的、巨大的应用价值。
人G-CSF基因位于17号染色体q21-22区域，其全长为2.5kb，由5个外显子和4个内含子构成，成熟蛋白含有174个氨基酸。大肠杆菌表达的G-CSF在分子的N末端还有一个Met，共有175个氨基酸，如图1(SEQ IDNO：1)所示。该分子共有5个Cys，其中Cys37-Cys43和Cys75-Cys85形成两对二硫键，分子中有4个Lys残基，分别位于17、24、35和41位上。
化疗引起的中性粒细胞减少症，特别是中性粒细胞减少性发热症(febrile neutropenia，FN)是癌症患者接受化疗后产生的最普遍，通常也是最严重的副作用，尤其是在第一个化疗周期。FN带来的结果往往是患者必须接受住院观察、接受抗生素治疗，不仅增加额外的经济负担，而且有相当高的死亡率；另一严重的后果是由于中性粒细胞的减少，许多癌症患者的治疗计划不得不更改，例如降低化疗药物的剂量、推迟下一化疗周期等，而这些又直接与最终的化疗效果相关。自从1991年FDA批准rHuG-CSF药物上市以来，已有数百万的接受化疗的癌症患者从中受益。目前其年销售额已进入世界生物技术药物的前十位，具有非常好的应用前景。
但是重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有在体内循环半衰期短(t1/2仅为1.3-4.2h)、作用时间短暂、易被酶水解和肾脏清除、需要多次注射等问题，这不仅给患者带来了很大的不便，而且重复注射也会引起一些不良反应，限制其疗效。
近年来发展的聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)修饰技术为克服上述问题提供了一种可能的选择。
聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一类无毒的水溶性中性多聚体，具有良好的生物相容性和血液相容性，已被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准用于人体局部、胃肠道和静脉给药。蛋白质的PEG修饰技术是指PEG两端的一个或二个端基被活化后具有一定的官能团，该官能团对要结合的蛋白质中的至少一个官能团具有活性，通过共价键合使PEG结合到蛋白质的端头(N端或C端)或特定氨基酸上；PEG作用位点具有普遍性。
PEG是乙二醇和环氧乙烷聚合物，别名碳蜡，结构式为：
CH2〔OH〕-〔CH2CH2O〕n-CH2OH
常规PEG随分子量增大，其外观由无色粘稠液体(190-630Dalton)、白色膏状体(950-1050Dalton)至白色蜡状或片状固体(＞1200Dalton)而变化。用于蛋白质及其它药物修饰的PEG通常分子量巨大(表1)，如美国罗氏公司已上市产品Pegasys(聚乙二醇干扰素α2a注射液，派罗欣)采用的U型分支双链PEG分子量为40KD，美国先灵葆雅公司已上市产品Peg-Intron(聚乙二醇干扰素α2b注射液，佩乐能)采用的直链线性PEG分子量为12KD，美国Amgen公司已上市产品
Figure GPCT136953604150141000D000031
(聚乙二醇粒细胞集落刺激因子)采用的直链线性PEG分子量为20KD。药物中的PEG部分(或PEG)在体内的代谢过程已相当清楚，经证实其是一种良好的、安全的、无副作用的药物改性剂。
表1.目前已上市PEG化蛋白质药物的一些基本理化性质参数[18]
蛋白质药物经PEG化后，其性状有显著改善，具体包括药代半衰期延长(表1)、免疫原性降低、安全性提高、疗效增强、给药频度降低、药物可溶性和水溶性提高、蛋白酶酶解抗性增强、方便药物的控释等。例如，美国专利第4179337号披露，PEG与酶和胰岛素结合后，蛋白质的免疫原性降低了，同时仍保留了原蛋白质一定比例的活性。PEG化带来的另一独特效应是，蛋白质的体外活性降低了，但体内活性增强。例如美国专利第4179337号披露，PEG与酶和胰岛素结合后，蛋白质的免疫原性降低，与此同时蛋白质的活性明显下降，但仍保留了原蛋白质一定比例的活性。
用于药物修饰的PEG分为线型结构和分枝链状结构两种。例如，美国罗氏公司已上市产品
Figure GPCT136953604150141000D000041
(聚乙二醇干扰素α2a注射液，派罗欣)采用的是一种U型分支的双链PEG衍生物，PEG的平均分子量介于26KD-66KD，(US Pat.5382657-Filed Aug 26，1992-Hoffmann-La RocheInc.)，分子式如下：
式中，R和R’为独立无关的低分子量烷基；n和n’介于600-1500之间。
2002年美国FDA批准的Amgen公司上市产品(聚乙二醇粒细胞集落刺激因子)采用的是直链线性PEG分子，分子量为20kD(US Pat.5824784-Filed Oct 12，1994-Amgen Inc.)，修饰反应式如下：
Figure GPCT136953604150141000D000044
Amgen公司的
Figure GPCT136953604150141000D000045
产品是利用末端带醛基的PEG修饰剂，修饰发生在蛋白质的N末端氨基酸上，并获得了单位点修饰的PEG-G-CSF。其特点是PEG与G-CSF以C-N键相连。
采用不同构型的PEG来修饰蛋白质，其产物性状有明显区别。已有文献(Monfardini C，Schiavon O，Caliceti P，et al.Bioconjugate Chem，1995，6(1)：62-69)报道，支链PEG修饰蛋白质的pH抗性、热稳定性和抗蛋白酶酶解能力均明显强于直链PEG。
中国专利ZL 03801105.0报道了一种新型的Y型分支双链PEG衍生物，其基本分子结构式如下：
其中：
Pa和Pb是相同或不同的亲水性聚合物，可以是聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉或者它们的共聚物，其中特别优选是聚乙二醇及其共聚物；
j为1-12的整数；
Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基；
X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数；
F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或蛋白上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
当Pa和Pb优选聚乙二醇及其共聚物时，其基本分子结构式如下：
Figure GPCT136953604150141000D000061
该Y型的PEG专利与蛋白的修饰发生在蛋白的游离氨基上，属不固定位点的蛋白修饰。
现有技术中，可采用N-羟基琥珀酰亚胺活化法合成Y型分支NHS-PEG用于进行修饰。NHS-PEG的特点是能与rhG-CS F的赖氨酸上的游离氨基或末端游离氨基形成酰氨键，酰氨键能在体内缓慢水解，使rhG-CSF恢复其活性。但是，目前采用的Y型分支的NHS-PEG的普遍具有活性高，选择性差的问题，不能定向选择修饰位点，很难获得单一固定位点修饰的修饰产物。
发明内容
本发明基于新的单位点修饰的Y型聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子(YPEG-G-CSF)。具体地，本发明涉及YPEG化的G-CSF及其制备方法，以及包含YPEG-G-CSF的药物组合物及应用。其中，本发明的YPEG-G-CSF为在第17位赖氨酸(K17)单位点修饰的形式。利用所述K17单位点修饰的YPEG-G-CSF取得了较好的动物体内治疗效果。此外，所述K17单位点修饰的YPEG-G-CSF在血清药代半衰期等方面有明显改进。
一方面，本发明涉及Y型PEG衍生物(也记作YPEG)修饰的G-CSF(也记作YPEG-G-CSF或PEG-G-CSF)，其分子组成如下：
Figure GPCT136953604150141000D000071
其中：
Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；
j为1-12的整数；
Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、经取代的芳基、芳烷基或杂烷基；
X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数；
F是选自以下基团组成的组的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，其可以与G-CSF上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
在一个实施方案中，本发明的Y型聚乙二醇化G-CSF具有如下结构式：
Figure GPCT136953604150141000D000072
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选甲基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数，优选m＝m’并优选m+m’为600到1500。该结构中，该Y型分支PEG通过酰胺键以单位点结合到G-CSF分子上。
在一个优选的实施方案中，所述Y型聚乙二醇化G-CSF中，G-CSF通过相应于SEQ ID NO：1第17位的赖氨酸上的侧链ε氨基与Y型PEG上的端基羧基形成酰胺键相连。
任选地，本发明的G-CSF可以为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的G-CSF。优选地，所述G-CSF为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的具有SEQ ID NO：1所示序列的人G-CSF(hG-CSF)。更优选地，所述人G-CSF是重组人G-CSF(rhG-CSF)。rhG-CSF可以是人工合成的，也可以是原核系统如大肠杆菌(E.Coli)表达的，也可以是真核酵母系统如毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的，也可以是其它昆虫细胞系统或哺乳细胞系统如CHO表达的。制备天然或重组G-CSF的方法以及G-CSF和其YPEG修饰产物的活性检测方法为本领域技术人员使用的常规方法。
另一方面，本发明涉及制备YPEG修饰的G-CSF的方法。一个实施方案中，可以利用式III所示的YPEG经活化的衍生物如聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(YPEG-NHS)，通过亲核取代反应，将PEG部分共价结合在G-CSF中第17位赖氨酸残基上的ε-氨基：
Figure GPCT136953604150141000D000081
其中，YPEG-NHS可如EP1496076所述进行制备。
G-CSF与YPEG反应生成YPEG-G-CSF的反应方程式如下：
Figure GPCT136953604150141000D000091
反应条件温和，pH范围6.0-10，优选8.0，温度0-20℃，需搅拌或保持其它方式的混匀。可以通过对所得的YPEG-G-CSF进行分子量分析，结合分子量指纹作图和胰蛋白酶的酶切图谱及蛋白质的N末端序列等技术测定确定PEG化的修饰位点。本发明人发现，本发明的PEG对G-CSF的修饰发生在G-CSF的17位赖氨酸，将该修饰的产物记录为YPEG-G-CSF(17)。
对所述YPEG-G-CSF(17)的分离和纯化可通过例如离子交换等方法进行。本发明的一个实施方案中，使制备的YPEG-G-CSF通过阳离子交换柱，收集第四个活性峰，并用Sephacryl S-400HR柱进一步纯化，获得经提纯的YPEG-G-CSF(17)。
本发明还提供了本发明的Y型聚乙二醇化G-CSF或包含本发明的Y型聚乙二醇化G-CSF的组合物在治疗需要用G-CSF治疗的疾病中的应用。本发明所述的聚乙二醇化G-CSF或包含聚乙二醇化G-CSF的组合物与G-CSF的临床用途相同，均适用于与粒细胞减少相关的疾病例如由于严重的感染，白血病的治疗，干细胞移植，以及恶性实体瘤放化疗导致的粒细胞减少症(童英等，“G-CSF、GM-CSF的临床应用现状”，基础医学与临床2000 Vol.20 No.2 P.101-104)。动物体内试验结果表明，相对G-CSF，利用本发明的YPEG-G-CSF取得了意外的动物体内试验疗效，即在用药总用量减少的情况下，取得了相同或提高的疗效，具体可参见实施例部分。此外，本发明的YPEG-G-CSF在血清药代半衰期等方面有明显改进。本发明的YPEG-G-CSF可以以组合物的形式给予患者，所述组合物中包含药物学有效剂量的YPEG-G-CSF和药物学可接受的载体或赋形剂。优选地，所述组合物包含甘露醇、氨基酸、醋酸和醋酸钠，其中氨基酸优选天冬氨酸、天冬酰胺和甘氨酸。所述组合物可以制备成适宜的剂型，由有经验的医师以任何可接受的适宜方式给药。本发明还提供了治疗粒细胞减少症的方法，包括给药本发明包含YPEG-G-CSF的组合物。
附图说明
图1显示G-CSF的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其MW为18801.79，PI为5.62，加下划线的氨基酸代表YPEG对所述氨基酸序列在理论上的修饰位点，即包括N末端氨基和Lys上的游离氨基在内共5个理论上的可能修饰位点。
图2显示用阳离子交换柱对YPEG-G-CSF进行分离所得的活性峰，其中图示的第四个(4#)峰即为目的峰YPEG-G-CSF(17)。
图3显示用Sephacryl S-400HR柱对YPEG-GCSF进行纯化所得的峰。
图4显示用MALDI-TOF测定PEG-G-CSF的分子量的结果。
图5显示利用Maldi-Tof对G-CSF的肽段进行分子量肽指纹作图的结果。
图6显示利用Maldi-Tof对PEG-G-CSF的肽段进行分子量肽指纹作图的结果。
图7显示利用HPLC反相C18柱，对用胰蛋白酶切割后的G-CSF进行分离的结果。
图8显示利用HPLC反相C18柱，对用胰蛋白酶切割后的PEG-G-CSF进行分离的结果。
图9显示N末端氨基酸序列的测序图。
图10显示YPEG-G-CSF生物学比活性的测定结果。
图11是显示YPEG-rHuG-CSF对60Co猴中性粒细胞对数变化的影响的趋势图。
图12显示PEG-GCSF与G-CSF的药代动力学曲线比较。
具体实施方式
本发明通过下述非限制性实施例进一步阐明。通过实施例可见，与现有技术相比，本发明的优势在于：
1、本发明的YPEG-G-CSF是通过反应使YPEG修饰到G-CSF上，得到的反应混合物通过有效的纯化手段获得了在K17位点上进行单位点定点修饰的产物，从而解决了现有技术中由于NHS-PEG的活性高，选择性差，不能定向选择修饰位点，很难获得高纯度单一固定位点修饰的修饰产物等问题，更易于大规模制备时进行质量控制和保证批次稳定性。
2、本发明的YPEG-G-CSF在动物体内的循环半衰期与未修饰的G-CSF相比，显著延长。
3、本发明的YPEG-G-CSF在药效学方面与非PEG化的G-CSF相比有明显改善，具体表现为与现有技术中的G-CSF相比，运用相同总量或更低总量的YPEG-G-CSF，可取得相同甚或更加明显的治疗效果。
本领域技术人员应理解，任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限定。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。
实施例1YPEG化的G-CSF(YPEG-CSF)的制备
将400mg 9.58mg/ml G-CSF原液缓冲体系替换为50mM硼酸钠缓冲液(pH8.0)，用2mM HCl溶解40KD的NHS-YPEG(购自北京键凯科技有限公司)3.2g，按照蛋白∶PEG＝1∶6(质量比)的比例将两者混合。4℃反应3小时，反应物用10mM NaAc pH4.0稀释15倍，上到用10mMNaAc/HAc pH4.0平衡的阳离子交换柱(购自GE公司)，10mM NaAc/HAc+NaCl 160mM pH4.0缓冲液梯度洗脱，收集第四个活性峰(图2)。用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡的Sephacryl S-400HR柱(购自GE公司)，去除大分子高聚物，收集活性峰(图3)，超滤替换为含10mM NaAc pH4.0缓冲体系，经扫描共得样品73mg。
实施例2PEG化的G-CSF的分子量分析
用MALDI-TOF测定实施例1中制备的PEG-G-CSF的分子量，采用德国BRUKER公司autoflex TOF/TOF质谱仪，TOF/TOFMS法测定YPEG-rHuG-CSF和rHuG-CSF的分子量。基质采用芥子酸(Sinapinic acid，SA，C11H12O5，MW 224.22)，分析软件为flexAnalysisVer.3.0.54.0.。
检测结果：YPEG-rHuG-CSFMS分子量约为59kD，与理论分子量58801.8Dalton基本一致。检测图谱见图4。
YPEG-rHuG-CSF是rHuG-CSF的YPEG修饰产物。修饰剂(YPEG)是由一系列分子量呈正态分布的YPEG组成的混合物，平均分子量为40kD±10％。基于YPEG分子量的正态分布特点，导致该YPEG修饰产物的分子量也呈正态分布(±10％)，即YPEG-rHuG-CSF分子量应为58802.0Dalton±10％。
实施例3确定PEG化的修饰位点
分析从实施例1得到的PEG-G-CSF中发生PEG化的修饰位点。
将G-CSF和PEG-G-CSF缓冲液替换为：50mM(NH4)HCO3，pH8.0，按照1∶20比例加入内切蛋白酶(Endoproteinase)Glu-C分别对G-CSF和YPEG-G-CSF进行酶切，用Maldi-Tof法对所得肽段进行分子量肽指纹作图，结果分别显示于图5和图6。
从上述结果可以看出，G-CSF/Glu-c中可以切出1-20个氨基酸的肽段，其中包含的YPEG反应位点M1和K17(MTPLGPASSLPQSFLLKCLE，分子量2132.6D)，21-34个氨基酸的肽段，其中包含YPEG反应位点K24(QVRKIQGDGAALQE，分子量1512.7D)，35-47个氨基酸的肽段，其中包含YPEG反应位点K35和K41(KLCATYKLCHPEE，分子量1534.7D)而YPEG-G-CSF/Glu-c中不能切出1-20个氨基酸的肽段，可以切出21-34的肽段(QVRKIQGDGAALQE)和35-47(KLCATYKLCHPEE)说明修饰反应没有发生在K24，K35和K41位点上，而是发生在N末端氨基酸或第17位赖氨酸上，导致该肽段的分子量相对于未修饰的肽段因为多了40kD的YPEG分子而使分子量发生了改变。
为证实上述结论，对所得PEG-G-CSF的酶切肽图谱与未经修饰的G-CSF的酶切肽图谱进行比较。将测序级胰蛋白酶(Promega，猪，seq.grademodified，＞5000U/mg)用缓冲液溶解至浓度1μg/ul。对G-CSF-PEG进行超滤，将缓冲液替换为50mM NH4HCO3 pH8.0，并使得PEG-G-CSF的浓度为1mg/ml，得到YPEG-G-CSF样品溶液。取1μl胰蛋白酶，加50μl YPEG-G-CSF样品，在37℃酶切24小时。对未经修饰的G-CSF样品做同样处理作为对照。
用HPLC反相C18柱对酶切后的G-CSF和PEG-G-CSF样品分别进行分离，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱规格为Φ4.6mm×150mm，粒径5μm，孔径
Figure GPCT136953604150141000D000141
。流动相A为0.1％TFA/H2O(V/V)，流动相B为0.1％TFA/90％ACN(V/V)；流速1.0ml/min条件下进行梯度洗脱，洗脱梯度如下表2，所得分离图谱如图7和图8所示。
表2YPEG-rHuG-CSF HPLC-RPC C18胰酶肽图检测洗脱梯度
 时间(min)   A％   B％
  1  0   100   0
  2  1   100   0
  3  71   30   70
  4  81   0   100
  5  91   100   0
  6  100   100   0
从肽图上可以看出，PEG修饰后的PEG-G-CSF肽图在52.479min比未修饰的G-CSF多出了一个峰，而39.172min的峰消失了，对这两个肽段分别收集，对收集肽段N末端5个氨基酸进行Edman降解法测序，发现都具有相同的N末端MTPLG，该肽段因为带上了YPEG分子而使保留时间发生了变化，证明YPEG化的修饰位点确实发生蛋白的N末端的肽段上。
对制备的PEG-G-CSF进行N末端测序，发现能够测出N末端15个氨基酸序列MTPLGPASSLPQSFL。对其峰型进行分析，第一个氨基酸分析得到的结果是Met，并且与第二个氨基酸Thr相比，其峰面积没有显著降低(图9)，说明N末端存在游离氨基，而没有被修饰，即PEG修饰没有发生在N末端M1上，而是发生在K17上。这说明通过实施例1制备出的YPEG-G-CSF为K17单位点修饰。
实施例4PEG-G-CSF生物学活性测定
1试剂的配制与细胞培养
1.1 1640培养液：RPMI1640液体培养基，于4℃保存；或者按培养基说明书的配制方法进行配制。临用前每升培养基各加青霉素和链霉素补至105IU/L。
1.2.基本培养液：1640液添加2.5％的胎牛血清(FBS，v/v)及12.5％的马血清(ES，v/v)，4℃保存。
1.3完全培养液：基本培养液添加rhG-CSF至终浓度20ng(2000U)/ml。4℃保存。
1.4NFS-60细胞株：用完全培养液37℃，5％CO2条件下培养，间隔48～72小时传代，控制细胞浓度在2.0×105～10.0×105/ml之间，上次传代后24～36小时用于rhG-CSF效价测定。
1.5磷酸盐缓冲液(Hyclone)：取8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾用超纯水配成1000ml的溶液，经121℃，15分钟高压灭菌。
1.6噻唑蓝MTT溶液：MTT粉剂(Sigma)用磷酸盐缓冲液配成5.0mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
1.7裂解液
裂解液1：含1％浓HCL，5％TritonX-100的异丙醇溶液，室温避光保存。
或裂解液2：含2.8％浓HCL，10％TritonX-100的异丙醇溶液，室温避光保存。
2.PEG-G-CSF生物学活性的测定
2.1制备细胞悬液
取足量NFS-60细胞培养物，离心收集NFS-60细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后重悬于基本培养液中，调整细胞浓度约为2.0×105/ml，置37℃备用。
2.2G-CSF标准品(工作标准品或由中检所提供的rhG-CSF国家标准品，国际标准品可作为参照品进行复核)和待检样品按蛋白含量用基本培养液稀释至2ng/ml，每步稀释应不超过10倍。
2.3在96孔细胞培养板中预先加入基本培养液50μl/孔，对2.2项溶液继续以2倍稀释度做梯度稀释，参考品和待检样品做8个稀释度为1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml……，每孔为50μl，另外做阴性对照(不含rhG-CSF)及阳性对照(含rhG-CSF 2ng/ml)各至少3孔。
2.4每孔加入细胞悬液50μl，置于37℃，5％CO2培养40-48小时，观察到阴性细胞基本破碎(＞95％)后每孔加入MTT溶液20μl，置于37℃，5％CO2培养4-6小时。
2.5每孔加入裂解液1各180μl或裂解液2各100μl，混匀后在酶标仪上比色，实验波长570nm，参比波长630nm。
3.结果
以OD570nm-630nm值为Y轴，以板上稀释梯度对数为X轴作标准品和待检样品的量效关系图。试验数据采用四参数曲线回归计算法进行处理。以标准品的最高梯度的OD570nm-630nm值和最低梯度的OD570nm-630nm值的平均值作为半效OD570nm-630nm值。读取各样品曲线在半效OD570nm-630nm值处的稀释梯度对数为该样品C值。按下式计算结果：
待检样品效价(IU/支)＝标准品效价×C1/C2×D1/D2×V
其中：C1为待检样品相当于标准品半效量的稀释倍数；
C2为标准品半效稀释倍数；
D1为待检样品预稀释倍数；
D2为标准品预稀释倍数；
V为标示装量，ml；
经测定，实施例制备的YPEG-G-CSF生物学比活性为2.96×107IU/mg(图10)。
实施例5Y型聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子(YPEG-G-CSF)的药效学测定
(一)聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子(YPEG-G-CSF)对5-氟尿嘧啶所致小鼠粒细胞减少症的治疗作用
1.材料与方法
供试品：YPEG-G-CSF规格：1mg/支，西林瓶装液体针剂，2-8℃保存。厦门伯赛基因转录技术有限公司提供。
阳性对照品：惠尔血(G-CSF)，300μg/支，麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司制剂。保存：避光，2～8℃。
实验动物：小白鼠，昆明种，SPF级，140只，雄性，北京舒泰神药业有限公司生产，实验动物生产许可证号SCXK-(京)-2006-0004。随机分为7组，分别为正常对照组、模型对照组、低剂量组1、低剂量组2、中剂量组、高剂量组和阳性对照组。
造模方法：除正常对照组外，模型对照组和各给药组分别接受剂量为150mg/kg的5-FU，次日开始接受供试品或对照品的治疗。
剂量及给药频次：
YPEG-rHuG-CSF的给药剂量为15、50、150、500μg/kg，4天给药1次，共给药3次，阳性对照品给药剂量为50μg/kg，1-11天给药。剂量设计如下表3。
表3YPEG-rHuG-CSF给药剂量设计
Figure GPCT136953604150141000D000181
Figure GPCT136953604150141000D000191
给药方法：
除正常对照组、模型对照组外，其他各组于造模给药24小时后给予供试品及阳性对照品，给药频次如表所示。皮下注射给药。
2.结果
由于5-FU作用后，小鼠中性粒细胞数降低，3天后和9天内多数动物全血中性粒细胞极低，仪器无法检测，所以本试验测定了试验前、3天和9天后的中性粒细胞百分比，并计算了中性粒细胞的绝对数(ANC)。结果如表4所示。结果显示，5-FU作用后，模型对照组和15μg/kg组动物在给药3天时ANC显著降低，与同期正常对照组比较，具有显著差异(p＜0.05和p＜0.01)，而50-500μg/kg组和阳性对照组ANC未见降低，与正常动物WBC数值与正常对照组比较，未见差异。说明供试品在50-500μg/kg剂量下可减缓ANC降低的进程。至第9天检测时，模型对照组对照组仍低于正常对照组，而150和500μg/kg组超过正常对照组，阳性对照组也达到正常对照组水平。模型对照组在第11天达到正常对照组水平。说明给予供试品或阳性对照品可使动物中性粒细胞尽早升高至正常水平。
表4YPEG-rHuG-CSF对5-FU小鼠ANC(×109/L)的影响
Figure GPCT136953604150141000D000201
表中数值x±SD。n为测定的动物数，但实际可测出中性粒细胞的动物数比该数少。
与模型对照组比较，＊＊：P＜0.01；＊：P＜0.05；与正常对照组比，▲▲：P＜0.01；▲：P＜0.05。
续表4YPEG-rHuG-CSF对5-FU小鼠ANC(×109/L)的影响
Figure GPCT136953604150141000D000202
表中数值x±SD。n为测定的动物数，但实际可测出中性粒细胞的动物数比该数少。
与模型对照组比较，＊＊：P＜0.01；＊：P＜0.05；与正常对照组比，▲▲：P＜0.01；▲：P＜0.05。
3.结论
本发明人发现，除了明显的长效作用以外，YPEG-G-CSF对5-氟尿嘧啶所致的小鼠中性粒细胞减少症所表现的外周血中性粒细胞减少有明显增强的保护促进作用。YPEG-G-CSF可明显缩短小鼠中性粒细胞减少症模型中性粒细胞低下的持续时间，使外周血中性粒细胞的数目加速恢复。而且惠尔血每天给药一次、给药11次(惠尔血50μg/kg×11)与YPEG-G-CSF每4天给药一次、给药3次(低剂量YPEG-G-CSF 50μg/kg×3，中剂量YPEG-G-CSF 150μg/kg×3的情况下相比，显而易见在本发明的YPEG-G-CSF的总用药量明显减小的情况下，对中性粒细胞增加的刺激作用相当或更好。
二)Y型PEG化重组人粒细胞刺激因子(YPEG-rHuG-CSF)对60Co 3.0Gy照射所致的猴粒细胞减少症的的治疗作用
1、材料与方法
供试品：YPEG-G-CSF，规格：1mg/支，西林瓶装液体针剂，2-8℃保存。厦门伯赛基因转录技术有限公司提供。
阳性对照品：惠尔血(G-CSF)，300μg/支，麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司制剂。保存：避光，2～8℃。
试验动物：食蟹猴，普通级，雌雄均用，3-4岁，体重2.5-4.5kg，苏州西山中科实验动物有限公司，实动物生产许可证号：SCXK(苏)2002-0032。模型对照组5只动物，其他各组各4只动物。
造模及给药方法：动物经过约30天的检疫和适应性喂养期并分组后，用60Co对实验动物一次全身照射3.0Gy，照射剂量率为1.8Gy/min。于动物照射当天开始(5小时内)给药，后肢内侧皮肤皮下注射给药。见下表5。
表5给药方案设计
Figure GPCT136953604150141000D000211
2.实验结果及分析
在试验过程中，每天测定动物的血液学指标，并计数中性粒细胞数。结果显示，YPEG-rHuG-CSF低、中、高剂量组及阳性对照组ANC的均值高于同期模型对照组，并且在多个时间点进行的给药组与模型对照组比较均显示统计学差异(p＜0.05或p＜0.01)。试验结果见表6、图11。
表6YPEG-rHuG-CSF对60Co猴ANC(×109/L)的影响
Figure GPCT136953604150141000D000221
表中数值x±SD。模型对照组5只，其余4只动物。
与模型对照组比较，＊＊：P＜0.01；＊：P＜0.05.
续表6-1YPEG-rHuG-CSF对60Co猴ANC(×109/L)的影响
Figure GPCT136953604150141000D000222
表中数值x±SD。模型对照组5只，其余4只动物。
与模型对照组比较，＊＊：P＜0.01；＊：P＜0.05.
续表6-2YPEG-rHuG-CSF对60Co猴ANC(×109/L)的影响
Figure GPCT136953604150141000D000223
表中数值x±SD。模型对照组5只，其余4只动物。
与模型对照组比较，＊＊：P＜0.01；＊：P＜0.05.
表续6-3YPEG-rHuG-CSF对60Co猴ANC(×109/L)的影响
Figure GPCT136953604150141000D000224
Figure GPCT136953604150141000D000231
表中数值x±SD。模型对照组5只，其余4只动物。
与模型对照组比较，＊＊：P＜0.01；＊：P＜0.05.
3.结论
Y型PEG化重组人粒细胞刺激因子(YPEG-rHuG-CSF)对食蟹猴照射所致的中性粒细胞细胞减少症有治疗作用。
YPEG-rHuG-CSF具有长效作用，从以上体内试验结果可以看出，每6天注射本发明制备的YPEG-G-CSF 25μg/kg*5次与每天注射惠尔血10μg/kg*25次相比，前者在总用药量减少的情况下，对中性粒细胞增加的刺激作用与后者相当。
实施例6.YPEG-G-CSF动物体内药代动力学实验
1、试验方法和步骤
1.1药品和试剂
供试品：YPEG-G-CSF，规格：1mg/支，西林瓶装液体针剂，2-8℃保存。厦门伯赛基因转录技术有限公司提供。
阳性对照品：惠尔血(G-CSF)，300μg/支，麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司制剂。保存：避光，2～8℃。
1.2实验动物
食蟹猴6只，雌3雄3。广西营林开发中心猴饲养基地产(合格证编号：SCXK(桂)2005-0005)，体重3.11～5.62kg。分笼喂养，饲以标准猴饲料，自由饮水，每日给新鲜水果两次。
1.3实验设计
实验分为2组，分别为YPEG-G-CSF皮下注射300μg/kg组，普通G-CSF(惠尔血300μg/kg)组。
2实验方法
2.1血样采集
YPEG-rHuG-CSF单次皮下注射组于药前、药后0.25、0.5、1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h、168h、240h、312h、384h及480h，取注药对侧后肢静脉血1mL；惠尔血(G-CSF)给药组于药前、药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h抽取静脉血1mL，血样于4℃放置30min后，3000转低温离心10min，立即分离血清于-20℃保存待分析。
2.2血清药物浓度测定
采用免疫定量试剂盒(ELISA法)测定食蟹猴血清中G-CSF或YPEG-rHuG-CSF药物浓度。用Ray Biotech公司的Human G-CSF ELISA试剂盒建立了测定血清中G-CSF和YPEG-rHuG-CSF浓度的ELISA方法。
2.2.1测试原理概要
此药盒分析应用定量夹心技术。将一个对重组人G-CSF特异的单抗预先包被在微孔板上。标准和样品吸入至孔内，其中的G-CSF或YPEG-G-CSF将与固化抗体结合。洗掉所有未结合的物质后，将连接辣根过氧化物酶(HRP)的抗人G-CSF的IgG加至孔内，在洗掉所有未结合的抗体-酶试剂后，每孔内加入HRP的底物溶液而产生的颜色与最初一步结合的G-CSF或YPEG-G-CSF量成比例。终止反应测定颜色强度。吸光度O.D.值越高，样品中G-CSF或YPEG-G-CSF浓度越高。
2.2.2测定步骤
测定操作完全遵照药盒说明书。每孔加入100μL标准品或血清样品，并以平板混匀器轻轻混匀，根据未知样品预期浓度，用稀释液稀释至标准校正曲线的浓度范围。各板都设置重组G-CSF或YPEG-G-CSF标准校正曲线，用以计算该板未知样品浓度。室温孵育1h。以洗板液洗涤3次。每孔加入100μL二抗，继续室温反应1h。洗涤3次。每孔加入100μLHRP结合物，室温反应1h，每孔加入100TMB底物，室温避光放置15min。每孔加100终止液，轻轻混匀，终止反应。在5min内用酶标仪于450nm波长读光吸收OD值。
2.2.3结果计算
用Origin软件将浓度对数与光吸收OD值对数绘制标准曲线。利用针对用于测定被测未知样品的96孔板设置的标准曲线，通过线性回归计算样品中重组G-CSF或YPEG-G-CSF浓度，经稀释倍数校正后求得血药浓度。
2.3实验统计方法和药代动力学参数的估算
用非房室模型统计矩方法计算各种药代动力学参数，计算所用软件为3P97版本。猕猴自身数据比较用Student’s配对t-检验法进行统计判断，而不同猕猴用组间t-检验进行统计学判断，均采用Microsoft OfficeExecl(版本XP)提供的统计软件进行计算。实验结果线性回归用Origin软件求回归方程及相关统计参数，药代动力学曲线比较见图12。
食蟹猴单次皮下注射300μg·kg-1YPEG-rHuG-CSF后，血清中YPEG-rHuG-CSF浓度在皮下注射后8～24h达到峰值，Cmax为4.53±0.86μg·mL-1。末端半衰期分别是77.55±0.34h，MRT为95.03±14.51h。AUC(0-480h)是534.75±155.28μg·h·mL-1；AUC(0-∞)为539.27±158.32μg·h·mL-1。平均清除率为0.60±0.20mL·kg-1·h-1，基本上表现为线性药代动力学特征。
单次皮下注射300μg·kg-1G-CSF后，Cmax为2.49±0.20μg·mL-1，AUC(0-24h)为23.07±2.93μg·h·mL-1，清除率为12.95±1.95mL·kg-1·h-1，末端半衰期为4.00±1.44h，MRT为6.48±1.35h，VSS为72.53±18.86mL·kg-1。与YPEG-rHuG-CSF在食蟹猴体内的药代动力学特点差别非常明显，G-CSF经Y型PEG化后，消除速率常数、清除率和表观分布容积均明显减小，MRT和末端半衰期显著延长(77.55±0.34h vs 4.00±1.44h)。

Claims (9)

1.Y型聚乙二醇化G-CSF，其结构如下式II所示：
Figure FSB00000972033000011
R和R’均为甲基；
m和m’表征聚合度，为任何整数且m＝m’，m+m’为600到1500；
j为1-12的整数；
其中所述Y型聚乙二醇与G-CSF中相应于SEQ ID NO：1第17位的赖氨酸的侧链ε氨基相连。
2.权利要求1的Y型聚乙二醇化G-CSF，其中所述Y型聚乙二醇的总平均分子量为10000-60000道尔顿。
3.权利要求2的Y型聚乙二醇化G-CSF，其中所述Y型聚乙二醇的总平均分子量为40000±4000道尔顿。
4.权利要求1-3任一项所述的Y型聚乙二醇化G-CSF，其中所述G-CSF为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的G-CSF。
5.权利要求4的Y型聚乙二醇化G-CSF，其中所述G-CSF具有SEQ IDNO：1所示的序列。
6.权利要求1-5任一项的Y型聚乙二醇化G-CSF在制备用于治疗需要用G-CSF治疗的疾病的药物中的应用。
7.权利要求6的应用，其中所述需要用G-CSF治疗的疾病是由严重的感染、白血病、干细胞移植以及恶性实体瘤放化疗导致的粒细胞减少症。
8.一种制备和纯化权利要求1的Y型聚乙二醇化G-CSF的方法，其包括如下步骤：
(a)将具有式III的Y形分支结构的聚乙二醇与G-CSF按照质量比蛋白∶PEG＝1∶6的比例将两者混合，4℃反应得到Y型聚乙二醇化G-CSF；
Figure FSB00000972033000021
其中R和R’为甲基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数；
(b)反应物用10mM NaAc/HAc pH4.0稀释，上到用10mM NaAc/HAcpH4.0平衡的阳离子交换柱，10mM NaAc/HAc+NaCl 160mM pH4.0缓冲液梯度洗脱，收集第四个活性峰，用10mM、pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡的Sephacryl S-400HR柱，去除大分子高聚物，收集活性峰得到K17位修饰的Y型聚乙二醇化G-CSF。
9.权利要求8的方法，其中m＝m’且m+m’为600到1500。
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