CN1778821A - 化学修饰的粒细胞集落刺激因子偶联物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学修饰GCSF偶联物及其制备方法。本发明涉及一种接枝结构的聚乙二醇修饰的GCSF，其偶联物结构是已有技术中所没有的。与已有技术中偶联物相比，本发明偶联物具有更为专一的结合位点，更低的免疫原性，更少的活性损失和产品收率高的特点。

Description

化学修饰的粒细胞集落刺激因子偶联物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种使用分枝型水溶性聚合物化学修饰的粒细胞集落刺激因子偶联物及其制备方法。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(GCSF)是一种造血生长因子，它作用于骨髓中性粒细胞系造血前体细胞，促进其增殖、分化，并促进中性粒细胞的成熟和释放，增强成熟中性粒细胞的功能。CSF最早的适应症是促进癌症化疗以及骨髓移植后的中性粒细胞恢复，以后逐步扩大到各种病因引起的中性粒细胞减少症(Metcalf，Blood 67：257(1986)；Yan，et al.，Blood84(3)：795-799(1994)；Bensinger，et al.，Blood 81(11)：3158-3163(1993)；Neben，etal.，Blood 81(7)：1960-1967(1993))。

GCSF在机体内，具有半衰期短，易受蛋白酶降解的特点。这些特点极大的限制了其在临床治疗中的应用。在针对其它治疗用蛋白药物的研究中，人们发现了解决蛋白类药物在机体内半衰期短，易降解问题的方法。其中方法之一，是将蛋白质分子与水溶性聚合物共价结合成偶联物。其中所使用的水溶性聚合物包括聚乳糖，聚乙二醇(PEG)，聚合氨基酸。其中聚乙二醇的使用比较普遍。

PEG-蛋白偶联物中的聚乙二醇具有优秀的临床适用性。例如，良好的热稳定性、抗酶解、增加水溶性、延长半衰期、降低清除率、减少免疫原性和毒性(Inada，et al.，J.Bioact.And Compatible Polymers，5：343(1990)；Delgado，et al.，Critical Reviews InTherapeutic Drug Carrier Systems，9：249(1992)；Katre，Advanced Drug DeliverySystems，10：91(1993))。这些特点同样适用于PEG-GCSF偶联物。

已有的技术中，各种PEG-GCSF偶联物的区别在聚乙二醇与GCSF之间的连接方法的不同。更具体的说，就是连接臂不同，从而导致连接位点、偶合物稳定性、生物活性的不同。已报道的连接方法包括：PEG活性丙酸酯(PEG-SPA)修饰GCSF(CN：00809241，US：20030130193)；PEG-丙醛的N-末端修饰GCSF(CN：95191454，US：08/321510)。另外，EP：0335423，EP：0401384，r.w.niven，et al.，j.controlled release 32：177-189(1994)中也报道了其他GCSF的修饰方法。其中，CN：95191454提到N-末端修饰GCSF偶合物的体内活性优于35位偶合物的体内活性，但是我们在实验中发现本发明所涉及的偶合物中35位偶合物的体内活性优于N-末端修饰GCSF偶合物的体内活性。本发明的偶联物结构与这些偶联物的结构不同，蛋白质分子上偶联聚乙二醇分子可以显著改变蛋白质的治疗效果，并且修饰位点不同，体内活性存在很大差异。分枝型聚乙二醇修饰剂与直链聚乙二醇相比，修饰选择性更高，更加稳定，免疫原性很低，改变不同PH值，可以特异性修饰蛋白质位点。CN：1404401提到分枝型聚乙二醇修饰GCSF，采用的聚乙二醇结构不同于本专利化合物结构，并未给出具体实验方案、实验结果、鉴定数据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种分枝型聚乙二醇与粒细胞集落刺激因子的偶联物。

一方面，本发明涉及一种化学修饰的GCSF偶联物，其结构如I式所示：

其中，R表示具有C_1～4烷烃端基的水溶性聚合物，包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸，聚合氨基酸等

L表示O、NH或S，

X表示NH或S，

a表示0、1、2、3或4，

b表示0、1、2、3或4，并且a、b不同时为0，

m表示1～5之间的任一整数，

M选自-CH₂CH₂-、

之一，

Y选自

之一，

GCSF表示天然GCSF、基因重组GCSF或同样具有天然GCSF功能的基因突变产物，但不包括糖基化的天然GCSF、基因重组GCSF或同样具有天然GCSF功能的基因突变产物。

Y与GCSF连接位点包括该分子结构中的游离氨基、游离巯基、游离羟基、游离咪唑基。优选氮端、35位、41位氨基。

其中所述R表示具有C_1～4烷烃端基的水溶性聚合物，所述水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸，聚合氨基酸等高分子聚合物，优选聚乙二醇；其分子量在1kDa～100kDa之间，优选5kDa～20kDa之间的分子量，最优值为5kDa或10kDa。其中C_1～4烷烃端基为甲基、乙基、丙基、丁基或叔丁基，优选甲基。L优选O或NH；X优选NH。a优选2、3或4；b优选0、1或2；最佳选择为a等于4，同时b等于0。m优选1、2、3或4，最佳为1或2。

上述M优选 或

Y优选

或

最佳选

本发明最佳偶联物结构为

m优选1或2。

本领域普通技术人员可知，本发明所述聚乙二醇(PEG)分子结构可以表示如下：

n表示20～2270范围内的整数值，优选113～1361，最佳范围在113～490之间。其对应的聚乙二醇分子量范围在1kDa～100kDa之间的分子量，优选范围在5kDa～60kDa之间，最佳范围在10kDa～20kDa之间的分子量。考虑到高分子化合物分子量的分散性，上述具体数值不确指，只表示一种平均范围。

本发明所用的连接到蛋白分子上的高聚物分子，是由两条线性分子通过连接臂分子连接在一起，同时引入新官能团。该新官能团经过化学处理后，可以具有很高的化学反应活性。该项技术已有专利报道(US：5932462，US：5643575)，其产品为接枝PEG，又称U-PEG，本发明所涉及的各种U-PEG可以参考该项技术进行化学处理。其产品结构II所示，其中NS表示N-琥珀酰亚胺基氧基结构。

除US：5932462公开的专利技术外，上述U-PEG也可以采用其它常用方法处理。例如咪唑法、2-羟基吡啶法、3-甲基-2羟基吡啶法、磺酸酯法等。上述方法可参考J.M.Harris，Jms-Rev.Macromol.Chem.PHys.，C25(3)，325-373(1985)。

GCSF可以是天然的、重组蛋白或同样具有天然GCSF功能的基因突变产物，最好是人源的产品，但不包括糖基化的天然GCSF、基因重组GCSF或同样具有天然GCSF功能的基因突变产物。当然，也包括通过组织培养、蛋白质合成、细胞培养(天然、重组细胞或突变体)方法得到的产品。天然、重组GCSF或突变体的提取和分离方法是本领域技术人员所熟知的，详细介绍可以参考美国专利US：4810643，US：5532341。

另一方面，本发明涉及一种分枝型聚乙二醇与粒细胞集落刺激因子的偶联物的制备方法。

结构式I所示的偶联物是由GCSF与结构式II所示化合物共价结合而成。该合成方法是本领域所熟知的，生成酰胺键连接，产物主要由修饰上1～5个U-PEG的偶联物组成。该反应条件为，pH值在5～10之间；温度在4℃～25℃之间；反应时间为30分钟～24小时之间；反应物摩尔比例，U-PEG∶GCSF在1∶1至100∶1之间。优选条件为，pH值在8.5～9.5之间；温度在4℃～25℃之间；反应时间为1小时～4小时之间；反应物摩尔比例，U-PEG∶GCSF在1∶1至10∶1之间。一般情况下，选择低温、低pH值(例如，pH＝5)、短时间条件，反应趋向于生成连接1个U-PEG的偶联物；高温、高pH值条件(例如，pH＝7.5)、长时间反应，反应趋向于生成连接多个U-PEG的偶联物。

不同修饰度偶联物可以用常用的阳离子交换色谱法逐一纯化。例如，混合物上柱后，用pH4/20mmol的醋酸钠淋洗；再用0～0.5M氯化钠梯度洗脱，pH值可以在3～5.5之间，最佳为pH4.0(图4)。收集到的组分，可以使用质谱、SDS-PAGE等方法，通过检测分子量来确认。

影响PEG化反应的因素主要有1)pH，2)温度，3)反应时间，4)蛋白与PEG试剂的摩尔比，5)蛋白浓度。通过控制一个或多个反应因素，我们可以得到所期望的单、双、多PEG修饰样品。例如，SHEARWATER公司SPA-PEG5000推荐的反应条件为1)PH 7.3，2)温度4℃可得到单、双修饰样品，温度室温可得到三修饰样品，3)反应时间30分钟，可得到单修饰样品，反应时间4小时可得到双、三修饰样品，4)蛋白与反应试剂摩尔比1∶30。对于表1中其它反应试剂，得到所需修饰产物所进行的反应条件的优化是各不相同的。通过酸化终止反应，并冻存于-20℃。

反应条件

聚合物的分子量  可以是任意大小，结构为分枝型。对聚乙二醇来说，所选的分子量是1KD到大约100KD(术语大约意指聚乙二醇制品中，一些分子大于所述分子量，另一些分子小于所述分子量)。下面实施例2所涉及U-PEG-20K，其选择便于纯化及提供一个合适的模型系统。U-PEG分子量的选取，取决于所需的治疗方案(例如所需的缓释持续时间、活性、处理的方便性、抗原性大小或缺乏以及其它一些PEG对治疗性蛋白质及其类似物的已知效应)。一般来说，聚合物的分子量越大，结合到蛋白质上的聚合物分子数越少。聚合物分子量越高(分枝越多)，聚合物对蛋白质的比例应越高。

反应投料比  聚乙二醇分子对蛋白质分子的比例与它们在反应混合物中的浓度一样，可以改变，一般来说，聚乙二醇对蛋白质分子的最佳比例(指反应效率而言，即反应混合物中没有多余未反应的蛋白质及聚合物分子)将根据所选聚乙二醇分子量进行测定。不同投料比将分别得到单、双、多U-PEG修饰样品。1∶1～3∶1通常可得到单U-PEG修饰样品，5∶1～8∶1将得到单、双U-PEG修饰样品混合物，10∶1以上将得到单、双、多U-PEG修饰样品的混合物。反应体系PH增加的同时，聚合物的水解也相应增加，因此不同条件下，要选用不同的投料比。

PH会影响到所用的聚合物分子与蛋白质分子的比例，一般来说，如果反应液PH低于PK，聚合物分子比例应大大超过蛋白质分子为好；如果PH高于PK，则聚合物对蛋白质分子的比例不必要太大。反应体系PH值的不同将导致聚合物与蛋白质的结合位点有明显差别，对于单U-PEG修饰样品，其反应位点有很大差别。反应PH增加，将提高反应速度，同时也会增加聚合物的水解。

反应时间  反应程度随时间的延长而增加，与反应温度相关。通常温度越高，反应时间越短。一般选择半小时至24小时不等。

反应温度  通常聚合物与蛋白质反应温度为4度或者25度室温，反应在低温状态下，进行很慢，但有利于蛋白结构保持稳定，得到相同的修饰产物需要较长的时间；而高温则有利于反应的进行，相应可缩短反应时间。也可以选用4度～25度室温之间的某一温度条件。

GCSF与U-PEG骨架的偶联可通过传统的方法进行。本专利可选用的PEG为任一分子量的PEG。例如，反应可以在PH5-10的溶液进行，反应温度从4℃到室温，反应时间从30分钟到24小时，选用的反应物与GCSF的摩尔比为1∶1至100∶1。反应条件的选择可以由所需要得到的偶联物的主要修饰度直接来确定，通常低温、低PH(如5)，短反应时间将导致U-PEG与GCSF偶联的数量较少。高温，中性或高PH(如大于等于7)，长反应时间可使U-PEG与GCSF偶联的分子数量增加。例如在用分子量为10KD的反应物，在PH8.0溶液中，反应物与蛋白摩尔比选用10∶1，反应温度控制在4℃，反应时间为30分钟可得到主产物为单U-PEG偶联物的混合物；而在4℃，将反应时间延长到2小时，可得到主产物为双U-PEG偶联物的混合物；当反应温度控制在室温，反应时间仍为2小时，可得到主产物为三U-PEG偶联物的混合物；此反应可通过酸化反应物而终止或在-20℃进行冻存。通常优选的PH为8.0-9.0，反应物与蛋白摩尔比为3∶1至10∶1。

阳离子层析技术根据电荷差别可作为有效的分离方法来分离该混合物，其可有效分离各种分子量的反应产物。例如，阳离子柱装好后，用20mM醋酸钠(PH4.0)冲洗，然后用含OM～0.5M NaCl的缓冲液进行线性洗脱，缓冲液的PH可以在3～5.5之间，优选PH为4.0。由阳离子层析得到的层析组分可用传统方法鉴别其分子量，如，质谱，SDS-PAGE电泳，或其它已知鉴定化合物分子量的方法。其中的一个组分被鉴定含有的分子式I的化合物，其含有所需要的U-PEG修饰个数，证明其已经与为修饰的GCSF和其它修饰度的U-PEG-GCSF偶联物分开。

另一方面，本发明涉及提供含有若干不同分子量偶合物的组合物。优选的组成为m＝1和2的混合物。在实施例1的IIIa修饰混合物中，m＝1的样品占70-80％，m＝2的样品为20-30％。该混合物可通过U-PEG与GCSF的摩尔比为1∶1至100∶1(反应物过量)反应得到的。反应在PH9.0左右，反应温度从4-25℃，反应时间为30分钟到24小时。反应结束时，加入乙酸终止。偶联物经过纯化，去除残余未反应的蛋白、过量的U-PEG试剂、其它杂质以及反应过程所使用的缓冲液。在U-PEG修饰蛋白过程中，其它杂质是指N-羟基琥珀酰亚胺和U-PEG试剂的水解产物。

本发明的另一方面涉及提供含有？式结构GCSF偶合物的可用于临床治疗的药用组合物。该药用组合物可用于注射，或者是口服，作用于肺、鼻腔以及其它形式的施用。一般说来，包含于本发明中的药用组合物包含有效量的本发明的单聚体/蛋白质连接物产物以及药用上可接受的稀释剂，保存剂，增溶剂，乳化剂，佐剂及/或载体。

这类组合物中包括各种缓冲液组份(如Tris-HCl，醋酸盐，磷酸盐)PH及离子强度的稀释剂；添加剂诸如去污剂及增溶剂(如Tween80，多聚山梨醇脂80)抗氧化剂(如抗坏血酸，偏亚硫酸氢钠)，保存剂(如：水杨乙汞，苯甲醇)以及填充物质(如：乳糖，甘露醇)；将这些物质掺入聚合物分子如聚乳酸(polylactic acid)，聚乙二醇酸等做成的颗粒状制品中或掺入脂质体中。这些组合物可能会影响本发明的分枝型聚乙二醇修饰的蛋白偶合物的物理状态稳定性，在体内的释放速度及体内清除速度。例如参见Remington’s《药物学》第18版。(1990，Mack出版公司Easton，PA18042)pp.1435-1712。本文引用以供参考。

另外，本发明提供的化学修饰的GCSF偶联物的生物活性，可以使用本领域所熟知的多种检测方法检测(参见：Asano，et al.，Jpn.PHarmacol.Ther.19：2767-2773(1991)；Yamasaki et al.，J.Biochem.115：814-819；Neben，et al.，Blood 81：1960(1993))。

本发明涉及一种分枝结构的PEG修饰的GCSF，其偶联物结构是已有技术中所没有的。本发明偶联物可以显著增加GCSF的半衰期，增加GCSF的治疗效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细地描述。

图1为20kDa IIIb修饰的GCSF偶联物凝胶色谱图

图2为10kDa IIIa修饰的GCSF偶联物SDS-PAGE谱图

图3为10kDa IIIa修饰的GCSF偶联物凝胶色谱图

图4为10kDa IIIa修饰的GCSF偶联物离子交换色谱图

图5为20kDa IIIb修饰的rhG-CSF偶联物离子交换色谱图

图6为20kDa IIIb不同反应位点的单U-PEG化rhG-CSF离子交换色谱图

图7为20kDa IIIb修饰的GCSF偶联物SDS-PAGE谱图

图8为20kDa单IIIb修饰的rhG-CSF凝胶色谱图

图9为rhG-CSFV8酶肽图谱

图10为20kDa IIIb修饰的rhG-CSF-41位偶联物V8酶肽图谱

图11为20kDa IIIb修饰的rhG-CSF-35位偶联物V8酶肽图谱

图12为20kDa IIIb修饰的rhG-CSF-氮端偶联物V8酶肽图谱

图13为20kDa IIIb在不同pH条件下制备的多U-PEG化rhG-CSF组合物的体内活性检测比较

具体实施方式

实施例1、U-PEG修饰GCSF的制备与鉴定

U-PEG试剂：

表1

	III			IV			V			VI
													代号	IIIa	IIIb	IIIc	IVa	IVb	IVc	Va	Vb	Vc	VIa	VIb	VIc
分子量	10k	20k	40k	10k	20k	40k	10k	20k	40k	10k	20k	40k

*分子量单位为道尔顿Da

各种U-PEG试剂分子量见表1所示，由北京凯正生物工程发展有限责任公司提供，合成方法参考美国专利US：5932462，US：5643575。

GCSF由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供。

U-PEG修饰反应：

影响修饰反应的因素有，1)pH值，2)温度，3)反应时间，4)GCSF与U-PEG的摩尔比，5)蛋白浓度。通过控制其中单个或若干个因素的变化，可以使反应向不同的方向进行，产生不同的主产物，例如：单取代、双取代、三取代、四取代或五取代产物。反应过程以结构式IIIa(分子量为10kDa)化合物举例说明，1)pH值7.3，2)温度室温条件下，主产物为单取代和双取代产物，3)反应时间为30分钟时，4)GCSF与U-PEG的摩尔比为1∶3。SDS-PAGE结果如图2所示，凝胶色谱结果见图3所示。其它U-PEG试剂的反应数据列于表2。反应后，用冰醋酸调节终止，并保存与-20℃条件下。

表2

	分子量	pH	温度	反应时间	摩尔比
						IVaIVbIVcVa	10kDa20kDa40kDa10kDa	7.08107.3	25℃25℃25℃4℃	0.5小时2小时1小时4小时	1∶31∶301∶1001∶30

VbVcVIaVIbVIcIIIaIIIbIIIc

20kDa40kDa10kDa20kDa40kDa10kDa20kDa40kDa

107.37.38107.398

25℃25℃25℃25℃25℃25℃25℃25℃

1小时4小时24小时17小时1小时0.5小时2小时0.5小时

1∶301∶31∶301∶301∶301∶31∶51∶1

分离反应混合物：

层析介质为强阳离子交换树脂Sulfopropyl(SP)

首先，将5mg蛋白修饰物溶于10倍的蒸馏水中，用冰醋酸调节pH至4.5。该稀溶液加载至2ml柱体积的Fractogel EMD S03-650S(EM Separations，Gibbstown，N.J.)预装柱，预装柱应事先用pH4.5/10mM的醋酸铵平衡。反应副产物和无吸收组分在穿透部分，修饰产物可用含0.15M氯化钠的平衡液步级洗脱得到，未反应的GCSF可用含0.5M氯化钠的平衡液步级洗脱得到。离子交换色谱结果如图4所示。收得的U-PEG-GCSF偶联物溶液用0.2μm无菌滤器过滤，-20℃条件下保存。

U-PEG-GCSF偶联物的鉴定

蛋白检测：

紫外检测纯化后的偶联物的A280值。每1mg/ml蛋白溶液的A280＝0.86。

SDS-PAGE检测：

使用12％和15％的聚酰胺凝胶或者8～16％的聚酰胺分离胶，还原条件参考laemmli.nature 227：680-685，1970。

分子量检测：

MALDI-TOF检测。

内毒素检测：

LAL法检测，检测用试剂购自厦门鲎试剂厂。

生物活性检测：

体外检测使用M-NFS-60细胞；体内活性检测用雄性SD大鼠。检测方法如前所述(Asano，et al.，Jpn.PHarmacol.Ther.19：2767～2773(1991))。体外活性检测结果如表3。

表3

	GCSF	IVa	IVb	IVc	Va	Vb	Vc	VIa	VIb	VIc	IIIa	IIIb	IIIc
														活性％	100	52.4	34.3	31.2	/	13.3	15.5	8.6	35.7	39.4	4.7	41.6	38.1

实施例2、IIIb(分子量为20kDa)修饰rhG-CSF偶合物的制备与鉴定

a、多U-PEG化rhG-CSF组合物的制备

重组人类粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)样品由杭州九源基因工程有限公司提供

1ml(1.53mg/ml)rhG-CSF溶液装入透析袋(3500Da)，用20mM硼酸缓冲液(pH＝9.0)透析过夜。取出后加入到8.09mgIIIb(MW20KDa)固体中，IIIb比rhG-CSF多4摩尔，室温振荡两小时后，混合物中加入25％乙酸终止，调节PH为4.0。此时反应混合物中主要为单个U-PEG化rhG-CSF，部分为双U-PEG化rhG-CSF，及未修饰的rhG-CSF和反应副产物(NHS)组成。如图1所示。

b、单U-PEG化rhG-CSF的纯化

上述混合物上样于PHarmacia Biotech SP SepHarose Fast Flow柱(PHarmaciaBiotch XK 16/20)，柱体积为5ml。以缓冲液A(20mM醋酸钠，PH＝4.0)加以平衡，约5倍柱体积。上样，以3倍柱体积的缓冲液A冲洗；以3倍柱体积10％缓冲液B(20mM醋酸钠+1M氯化钠PH＝4.0)洗脱多U-PEG化rhG-CSF，收集峰1；以3倍柱体积20％缓冲液B洗脱单U-PEG化rhG-CSF，收集峰2；以3倍柱体积50％缓冲液B洗脱未修饰rhG-CSF，收集峰3。之后用100％缓冲液B清洗5倍柱体积，缓冲液A重新平衡柱。整个过程流速维持在0.8ml/min，检测波长为280nm，用试管收集各组分峰。如图5所示。

c、不同反应位点的单U-PEG化rhG-CSF纯化

上述单U-PEG(IIIb)化rhG-CSF样品使用强阳离子柱TOSOH CO.TSK-GEL，SP-5PW，7.5*75mm，以20mM NaAc，pH5.0的溶液加以平衡，约5倍柱体积。上样，以3倍柱体积的20mMNaAc，pH5.0的溶液冲洗。蛋白质用3倍柱体积的缓冲液(20mM NaAc，0.5M NaCl，pH5.0)，其浓度从0-30％进行线性梯度洗脱。整个过程流速维持在0.5ml/min，洗脱液在紫外280nm检测，用试管收集各组分峰。如图6所示。

d、特征描述

为鉴定rhG-CSF的不同位点的单U-PEG化产物的特征，从四个方面加以分析：

SDS-Page(图7)

分子筛层析HPLC(即SEC-HPLC)(图8)

肽(酶切)分离图谱分析(图9～12)

体外生物活性检测(表5)

检测方法

SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE电泳使用的是自制还原性9％的分离胶，浓缩胶用5％，200V恒压40min，硝酸银染色。泳道1为层析穿透峰(NHS\PEG)；泳道2为LMW蛋白质标准品；泳道3为rhG-CSF蛋白质，上样量为0.6ug；泳道4为U-PEG-rhG-CSF混合物，上样量为0.8ug；泳道5为多修饰U-PEG-rhG-CSF蛋白质，上样量为0.1ug；泳道6为单修饰U-PEG-rhG-CSF蛋白质上样量为0.4ug；泳道7为rhG-CSF蛋白质，上样量为0.4ug；如图7所示。6道中含有单修饰U-PEG-rhG-CSF，基本呈单条带，略含多修饰U-PEG-rhG-CSF及部分拖尾。由于离子交换色谱分离以获得具有电荷特征的单个PEG化物质，也可能存在含有相同的表观电荷的其它多个PEG化物质。拖尾可能为PEG原料所引起。

分子筛层析HPLC(即SEC-HPLC)

使用的是GF-250柱，在水相HPLC系统中进行的，并使用50mM磷酸盐和150mM氯化钠缓冲液，在PH7.0条件下，以1ml/min流速洗脱16min。监测280nm处的信号。结果如图8所示。单修饰U-PEG-rhG-CSF纯度为85％，与SDS-PAGE结果相对应。

肽(酶切)分离图谱分析

取一定量蛋白，按其体积溶入一定量固体盐酸胍，使盐酸胍浓度达6M，充分溶解后用1MNaOH调pH值至8。按每1mg蛋白需40μl 20g/L DTT的比例加入还原剂，放置于37℃水浴中还原30min。最后在N₂保护下，按每1mg蛋白需40μl 48g/L碘乙酸的比例加入，37℃水浴中避光烷基化20min。最后加入1μl β-巯基乙醇终止反应，样品烷基化完成。

酶切前样品先用酶切缓冲液透析过夜，以1∶25(w/w)加入V8内切酶，25℃酶切16h，放入-20℃冰箱备用，进样前离心去除不溶物。RP-HPLC检测，检测条件：流速为0.8ml/min，检测波长214nm，进样量20μg，反相柱(vydac c4柱)以5％乙腈(含0.1％的三氟乙酸)平衡好以后，35min内线性梯度洗脱至75％，保持5min。

rhG-CSFV8酶肽图谱分析

rhG-CSF样品经RP-HPLC检测共得到10个肽段组分(T1～T10)，如图9所示。

偶合物V8酶肽图谱分析

单一IIIb分子修饰rhG-CSF偶合物，经离子交换色谱分离得到5个组分，逐一编号为1#～5#，如图6所示。其中，2#样品未判定出具体位点；4#样品用羟胺处理后基本消失，可以认为修饰到了组氨酸上，由于该组分浓度低，收集到的量少，其V8酶肽图谱不具有普遍性，在此未列出。1#样品经凝胶色谱分析为混合组分，其余为单一U-PEG修饰组分。按照rhG-CSF的V8酶肽图谱方法操作，得到了它们各自的V8酶肽图谱(图10～图12)。

与rhG-CSF的V8酶肽图谱对比，可以得到其主要缺失或减少的肽段，收集这些肽段，用MALDI-TOF测定分子量，通过检索可以确定这些肽段的氨基酸序列，最终结果见表4。

表4

U-PEG-GCSF V8酶肽图谱		与GCSF V8酶肽图谱比较			U-PEG修饰位点判定
						序号	PEG肽段出峰时间	缺失肽段	分子量	对应序列
1#	22.008min	T4	1650.72Da	35～47	Lys41
						2#	/	/	/	/	/
3#	21.453min	T4	1650.72Da	35～47	Lys35
						4#	/	/	/	/	His
5#	23.196min	T7	2189.96Da	1～20	N-端

由肽分离图谱分析，可判定单修饰U-PEG-rhG-CSF混合物中含有5个组份，可确定的修饰位点为41-LYS，35-LYS，N-端。

体外活性

取足量的NFS-60细胞培养物，离心收集NFS-60细胞，用基础培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成2.0*105个细胞/ml的细胞悬液，置37度备用。取参考品用基础培养液稀释至100IU/ml；将待检样品按标示量溶解后，用基础培养液稀释成100IU/ml；在96孔细胞培养板中，作倍比稀释。参考品和检测样品同做7个稀释度，每个梯度做2个复孔。每孔加入50ul细胞悬液，37度，5％CO2培养40～48小时；每孔加入20ulMTT溶液，37度，5％CO2培养5小时；每孔加入200ul裂解液，混匀后在酶标仪上比色，测定波长为570nm，参比波长为630nm，记录测定结果。如表5所示。

表5

	rhG-CSF	1#	2#	3#	4#	5#
							活性％	100	71.6	91.2	31.9	83.1	85.8

不同反应位点的单修饰U-PEG-rhG-CSF体外活性存在明显差别，经PEG修饰后，除修饰位点为35-LYS的样品活性保留为31.93％外，其它样品活性均保留为70％以上。

实施例3、不同pH条件下制备的多U-PEG化rhG-CSF组合物的体内活性检测

多U-PEG化rhG-CSF组合物的制备

rhG-CSF样品由杭州九源基因工程有限公司

1ml(1.53mg/ml)rhG-CSF溶液装入透析袋(3500Da)，以pH6.2的20mM硼酸缓冲液透析过夜，取出后加入到8.09mg IIIb(MW 20KDa)固体中，IIIb比rhG-CSF多4摩尔，室温振荡两小时后，混合物中加入25％乙酸终止，调节PH为4.0。此时反应混合物中主要为单个U-PEG化rhG-CSF，部分为双U-PEG化rhG-CSF，及未修饰rhG-CSF和反应副产物(NHS)组成。

不同pH反应条件的多U-PEG化rhG-CSF组合物的制备

以pH7.0的20mM硼酸缓冲液透析过夜，其它反应条件与pH6.2的修饰产物制备条件相同，制备pH7.0的修饰产物。

以pH8.0的20mM硼酸缓冲液透析过夜，其它反应条件与pH6.2的修饰产物制备条件相同，制备pH8.0的修饰产物。

以pH9.0的20mM硼酸缓冲液透析过夜，其它反应条件与pH6.2的修饰产物制备条件相同，制备pH9.0的修饰产物。

雄性SD大鼠250-270g，皮下单次注射，剂量为0.1mg/kg，每个样品六只动物为一组。取基础值：尾部取血(收取的血样当天进行全血白细胞计数，并计算出白细胞平均数)；按剂量注射样品，按6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h分别尾部取血(收取的血样当天进行全血白细胞计数，并计算出白细胞平均数)。结果处理：绘制白细胞变化对时间(h)曲线。结果如图13所示。

不同修饰位点的单修饰U-PEG-rhG-CSF活性均明显高于天然GCSF，这与PEG修饰可显著延长蛋白质半衰期，增加体内生物活性相符。修饰位点为35-LYS的单修饰U-PEG-rhG-CSF体内活性明显高于其它修饰位点的单修饰U-PEG-rhG-CSF产物。由于35位修饰产物的体内受体清除速率比较低，在体内半衰期更长，所以与体外活性相比，体内活性会更高。

Claims (16)

1.一种化学修饰的GCSF偶联物，其结构如I式所示：

其中，R表示具有C14烷烃端基的水溶性聚合物，包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸，聚合氨基酸等，

L表示O、NH或S，

X表示NH或S，

a或b均取自0～4的整数值，并且a、b不同时为0，

m表示1～5之间的任一整数，

M选自-CH₂CH₂-、

之一，

Y选自

之一，

GCSF表示天然GCSF或者基因重组GCSF以及具有GCSF功能的基因突变产物，但不包括糖基化的具有GCSF功能的基因突变产物。

2.权利要求1所述偶联物，其中所述水溶性聚合物为聚乙二醇，具有在5kDa～100kDa之间的分子量。

3.权利要求2所述偶联物，其中所述聚乙二醇具有在10kDa～20kDa之间的分子量。

4.权利要求1～3所述任一偶联物，其中所述水溶性聚合物的端基为甲基。

5.权利要求4所述偶联物，其中所述L为O或NH。

6.权利要求5所述偶联物，其中所述X为NH。

7.权利要求1～3所述任一偶联物，Y与GCSF连接位点包括该分子结构中的游离氨基、游离巯基、游离羟基、游离咪唑基。

8.权利要求1～3所述任一偶联物，其中所述a为2、3或4；b为0、1或2。

9.权利要求8所述偶联物，其中所述a为4，b为0。

10.权利要求1所述偶联物，其中所述M为

或

11.权利要求1所述偶联物，其中所述Y为

或

12.权利要求11所述偶联物，其中所述Y为

13.权利要求11所述偶联物，其中所述L为O；X为NH；a为4，b为0；M为

Y为 m为1。

14.权利要求9～13所述任一偶联物，其修饰位点为GCSF的35位氨基。

15.一种制备偶联物方法，控制反应溶液pH，选择性修饰G-CSF不同位点。

16.一种可用于临床治疗的药用组合物，含有有效量的选自权利要求1～14中任一偶联物，和药用稀释剂、佐剂或载体。

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