CN1765926A - 化学修饰的白细胞介素偶联物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种化学修饰的白细胞介素偶联物，用以改善蛋白自身的物理化学性质。特别是聚乙二醇丙酸修饰的白细胞介素2。与已有技术中偶联物相比，本发明偶联物具有更为专一的结合位点，更低的免疫原性，产物稳定性好，更少的活性损失和产品收率高等优点。

Description

化学修饰的白细胞介素偶联物及其制备方法

技术领域

本发明提供了化学修饰的白细胞介素偶联物，用以改善蛋白自身的物理化学性质。特别是，本发明提供了一种聚乙二醇丙酸活性酯修饰白细胞介素2生成的偶联物。

背景技术

Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，称为T细胞生长因子(T cell growth factor)，1979年统一命名为白细胞介素2(interleukin2，IL-2)。IL-2主要由T细胞或T细胞系产生，目前应用基因工程技术所制备和纯化的IL-2已用于临床治疗某些肿瘤和其它疾病。

IL-2的分子结构和基因人IL-2含有133氨基酸残基，分子量为15.5kDa。天然IL-2在N端含有糖基，但糖基对IL-2的生物学活性无明显影响，等电点在6.6～8.2。IL-2分子含有3个半胱氨酸，分别位于第58、105和125位氨基酸，其中58位与105位半胱氨酸之间所形成的链内二硫键对于保持IL-2生物学活性起重要作用。在IL-2基因产物的提纯和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。现已有应用点突变，将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基，使只能形成一种二硫键，保证了在IL-2复性过程的活性。还有报道用蛋白工程技术生产新型rIL-2，将IL-2分子第125位半胱氨酸改为丙氨酸，改构后IL-2比活性比天然IL-2明显增加。人IL-2基因定位于第4号染色体，长约5kb，由4个外显子和3个内含子组成。人和小鼠IL-2基因DNA序列有63％同源性。

多数天然的或重组的蛋白质药物，在拥有良好临床应用前景的同时，也存在诸如免疫反应、水不溶性、体内半衰期短等缺点，使药物在机体内很难达到有效的治疗浓度。然而，这些缺陷是可以在一定程度上得到解决的。其方法是，将蛋白分子表面共价结合上一定数量的水溶性多聚物。例如，使用聚乙二醇共价修饰蛋白质分子，可以达到以上多种目的。Davis.等人在美国专利US：4179337中提到用聚乙二醇与胰岛素结合，其偶联物表现出较低的免疫原性和较高的体内活性；同时，还提到了一种制备该偶联物的方法。Kater等人在美国专利US：4766106中公开了多种高聚物修饰的水溶性蛋白分子，特别是白细胞介素2、干扰素β和免疫毒素而聚乙二醇通过戊二酰基与蛋白连接。其偶合物与原蛋白分子相比，减少了免疫原性，提高了血浆药物浓度。Nishimura的欧洲专利申请EP：154316，Tomasi的PCT/US85/02572，Nitecki的US：4902502使用聚乙二醇碳酸酯修饰蛋白和Katre的US：5206344使用聚乙二醇对甲基苯磺酸酯修饰蛋白，公开了类似的蛋白偶合物。

聚合物与蛋白的偶联方法，在该技术中起重要作用。不同的偶联方法会在特异性、方便可行性和产物稳定性等方面具有各自的特点。本发明提供的偶联物及其制备方法与上述公开文献不同，同时具有以上三方面的优势。与未偶联的白细胞介素2(IL-2)相比，偶联物增加了水溶性，因此更加容易做成制剂，而且延长了体内半衰期，增加了药物体内活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种聚乙二醇与白细胞介素2(IL-2)的偶联物。

本发明提供一种化学修饰的IL-2偶联物，其结构如I式所示：

其中，R表示C_1～4烷烃端基，

m表示1～10之间的任一整数，

IL-2表示天然IL-2、基因重组IL-2或同样具有天然IL-2功能的基因突变产物。

其中所述R表示C_1～4烷烃端基为甲基、乙基、丙基或丁基，优选甲基。聚乙二醇分子量在1kDa～100kDa之间，可选5kDa～40kDa之间的分子量，优选10kDa～20kDa之间的分子量，最优值为10kDa或20kDa。M优选1～3之间，最佳为1或2，最优选1。

本领域普通技术人员可知，本发明所述聚乙二醇(PEG)分子结构中n表示20～2270范围内的整数值，可选113～900之间的整数值，优选226～450之间的整数值，最佳范围值为226或450。

本发明所用的连接到蛋白分子上的高聚物分子，是由线性分子通过丙酸分子与保护基N-琥珀酰亚胺酯基相连，即mPEG-SPA，具有较高的化学反应活性。该项技术已有专利报道(US：5672662)，也可参考J.M.Harris，Jms-Rev.Macromol.Chem.Phys.，C25(3)，325-373(1985)。

IL-2可以是天然的、重组蛋白或同样具有天然IL-2功能的基因突变产物。当然，也包括通过组织培养、蛋白质合成、细胞培养(天然、重组细胞或突变体)方法得到的产品。天然、重组IL-2或突变体的提取和分离方法是本领域技术人员所熟知的，详细介绍可以参考US：4778879；US：473892；US：4518584；US：4752585；US：Taniguchi，T.，et al.，Nature，302：305～310(1983)；Devos，R.，Nucleic Acids Research，11：4307～4323(1983)。

结构式I所示的偶联物是由IL-2与聚乙二醇丙酸活性酯共价结合而成。该合成方法是本领域所熟知的，生成酰胺键连接，产物主要由修饰上1～10个mPEG的偶联物组成。该反应条件为，pH值在5～10之间；温度在4℃～25℃之间；反应时间为30分钟～8小时之间。反应物摩尔比例，IL-2：mPEG在1∶1至1∶100之间。一般情况下，选择低温、低pH值、短时间条件，反应趋向于生成连接单一偶联物；常温、碱性条件(例如，pH＝9.2)、长时间反应，反应趋向于生成连接1和2个mPEG的偶联物。

不同修饰度偶联物可以用常用的分子排阻色谱法或阳离子交换色谱法逐一纯化。例如，使用Sephacryl S-200，S-300或S-400HR分子排阻色谱介质，混合物上柱后，pH值可以在4～9之间，最佳为pH5.5～7.5；使用Sulfopropyl(SP)离子交换介质的Fraetogel EMD SO3-650S(EM Separations，Gibbstown，N.J.)预装柱，pH3～10/10～30mM的醋酸钠平衡，反应副产物和无吸收组分在穿透部分，修饰产物可用含0.1～0.5M氯化钠的平衡液洗脱得到，监测UV280nm吸收值，收集到的组分，可以使用质谱、SDS-PAGE等方法，通过检测分子量来确认。

另外，本发明提供的化学修饰的IL-2偶联物的生物活性，可以使用本领域所熟知的使用HT-2细胞增殖的MTT法检测(Gillis，et al.，J.Immunol.，120：2027～2032，1978)。

本发明涉及一种聚乙二醇丙酸修饰的白细胞介素2。其作用与IL-2具有相同的用途，但本发明偶联物具有更好的水溶性，更长的体内半衰期。与已有技术中偶联物相比，本发明偶联物具有更为专一的结合位点，更低的免疫原性，产物稳定性好，更少的活性损失和产品收率高等优点。

附图说明

图1为凝胶色谱图

色谱条件：ZORAX GF250(9.4*250)

流动相：50Mm PB，150Mm NaCL，pH7.0，1ml/min

UV检测：280nm

组分1为双取代IL-2产物；组分2为单取代IL-2产物；组分3为未反应IL-2。

图2为SDS-PAGE检测结果

电泳条件：15％SDS-PAGE，恒压200V，45min，银染检测。

组分1、组分2和组分3含义均与图1表示含义相同。

图3为离子交换色谱结果，组分1、组分2和组分3含义均与图1表示含义相同。

具体实施方式

实施例1、mPEG-SPA修饰IL-2的制备与鉴定

表1

序列号	分子量	R
			Ia	5kDa	甲基
Ib	10kDa	甲基
			Ic	20kDa	甲基
Id	40kDa	甲基
			IIa	5kDa	乙基
IIb	20kDa	乙基
			IIIa	1kDa	甲基
IIIb	60kDa	甲基
			IIIc	100kDa	甲基

各种PEG-SPA试剂分子量及结构如表1所示，由北京凯正生物工程发展有限责任公司提供，合成方法参考美国专利US：5672662。

mPEG-SPA修饰反应：

影响修饰反应的因素有，1)pH值，2)温度，3)反应时间，4)IL-2与mPEG-SPA的摩尔比，5)蛋白浓度。通过控制其中单个或若干个因素的变化，可以使反应向不同的方向进行，产生不同的主产物，例如：单取代、双取代、三取代或四取代。反应过程以Ic(分子量为20kDa)化合物举例说明，1)pH值9.2，2)室温条件下，主产物为单取代和双取代产物，3)反应时间为30分钟，4)IL-2与mPEG-SPA的摩尔比为1∶4。凝胶色谱结果见图1所示，SDS-PAGE结果如图2所示。反应产物的其它mPEG-SPA试剂的反应数据列于表2。反应后，用冰醋酸调节终止，并保存与-20℃条件下。

           表2

	分子量	pH	温度	反应时间	摩尔比
						IaIb	5kDa10kDa	5.07.3	25℃25℃	0.5小时0.5小时	1∶31∶30

IcIdIIaIIbIIIaIIIbIIIc

20KDa40kDa5kDa20kDa1kDa60kDa100kDa

9.27.3107.37.38.010

25℃4℃25℃25℃4℃25℃25℃

0.5小时4小时1小时8小时4小时0.5小时1小时

1∶41∶301∶301∶31∶1001∶301∶1

分离反应混合物：

Sephacryl S-200分子排阻色谱柱(φ9.4mm*25cm)用pH5.5/50mM乙酸钠预平衡；将反应混合液，用冰醋酸调节pH至5.5，该混合溶液上柱，以2ml/分钟流速，pH5.5/50mM醋酸钠洗脱，色谱结果如图3所示。收得的rhIL-2偶联物溶液用0.2μm无菌滤器过滤，-20℃条件下保存。

IL-2偶联物的鉴定

蛋白检测：

紫外检测纯化后的偶联物的A280值。

SDS-PAGE检测：

使用12％和15％的聚酰胺凝胶或者8～16％的聚酰胺分离胶，还原条件参考laemmli.nature 227：680-685，1970。

分子量检测：

MALDI-TOF检测。

内毒素检测：

LAL法检测，检测用试剂购自厦门鲎试剂厂。

生物活性检测：

HT-2细胞增殖的MTT法，检测方法如前所述(Gillis，et al.，J.Immunol.，120：2027～2032，1978)。

实施例2、rhIL-2的制备与鉴定

反应过程以Ib(分子量为10kDa)化合物举例说明，蛋白浓度为5mg/ml，1)pH值7.3，2)在室温下反应，产物以单取代为主，3)反应时间为30分钟时，主产物为单取代产物，4)rhIL-2与mPEG-SPA的摩尔比为1∶30。反应后，反应液用冰醋酸终止，并保存与-20℃条件下。

层析介质为强阳离子交换树脂Sulfopropyl(SP)

首先，将5mg蛋白偶合物溶于10倍的蒸馏水中，用冰醋酸调节pH至4.5。该稀溶液加载至2ml柱体积的Fractogel EMI)SO3-650S(EM Separations，Gibbstown，N.J.).

预装柱应事先用pH4.5/20mM的醋酸钠平衡。反应副产物和无吸收组分在穿透部分，修饰产物可用含0.15M氯化钠的平衡液洗脱得到，未反应的IL-2可用含0.5M氯化钠的平衡液步级洗脱得到。收得的IL-2偶联物溶液用0.2μm无菌滤器过滤，-20℃条件下保存。

反应产物的鉴定：

同实施例1鉴定方法。

Claims (9)

1.本发明提供一种化学修饰的IL-2偶联物，其结构如I式所示：

其中，R表示C1～4烷烃端基，

n表示22～2270之间的任一整数，

m表示1～10之间的任一整数，

IL-2表示天然IL-2、基因重组IL-2或同样具有天然IL-2功能的基因突变产物。

2.权利要求1所述的偶合物，其特征是，R为甲基、乙基、丙基或丁基。

3.权利要求2所述的偶合物，其特征是，R为甲基。

4.权利要求1所述的偶合物，其特征是，n为113～910之间的整数。

5.权利要求4所述的偶合物，其特征是，n为226～450之间的整数。

6.权利要求1所述的偶合物，其特征是，m为1、2或3。

7.权利要求6所述的偶合物，其特征是，m为1或2。

8.权利要求7所述的偶合物，其特征是，m为1。

9.权利要求1所述的偶合物的制备方法为，将mPEG-SPA与IL-2混合，生成酰胺键产物，产物主要由修饰上1～3个mPEG的偶联物组成，该反应条件为，pH值在5～10之间；温度在4C～25℃之间；反应时间为30分钟～8小时之间；反应物摩尔比例，IL-2∶mPEG-SPA在1∶1至1∶100之间。

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