CN1316436A - 水溶性缓释重组蛋白质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水溶性缓释重组蛋白质的制备和纯化方法。提供了三种能使蛋白质在生理条件下稳定的水溶性多聚物。通过本发明中的制备方法，我们从混合物中获得了一种单一的新的具有生物学活性的蛋白质。这一单一产品较以前的基因工程蛋白质有明显的优点。它的体内半衰期延长，体内生物活性增强，稳定性增加，免疫原性降低。提供了用相关方法修饰的人生长激素(hGH)、粒细胞集落刺激因子(G－CSF)、白细胞介素－11(IL－11)、和干扰素(IFN)。

Description

水溶性缓释重组蛋白质的制备方法

本发明涉及蛋白质修饰领域，具体的说就是蛋白质的氨基酸残基与水溶性多聚物共价修饰的领域。本发明涉及这一具有生物活性的多肽的衍生物。这一化合物在体内生理环境下，能在较长的一段时间内持续的释放出活性多肽。

随着重组DNA技术的飞速发展，具有生物学活性的重组活性蛋白质也应运而生。通过基因工程方法可获得蛋白质。为了得到有活性的蛋白质，除了需复性外，还需要进行必要的修饰，如氨基端的酰氨化、豆蔻酰化等。但是，这些蛋白质进入体内后，仍然可能被胃酸、蛋白酶等所降解而失活。

在近二十年的临床应用过程中，逐渐暴露出目前上市的基因工程药物的一些共同缺点。如生物半衰期短，需频繁用药；有抗原性，长期使用产生抗体；保存条件苛刻，较不稳定等。

如何保护蛋白质，阻止其降解，延长其在体内的半衰期，并降低其抗原性，已经成为药物学研究的首要任务。这就需要对蛋白质进行修饰(FrancisFocus on Growth Factors,3:4-10；1992年5月，由Mediscript,Morntview Court,Friern Barnet Land,London N20,OLD,UK出版)

将蛋白质聚氧乙烯大分子化，则能够有效的解决这些问题。目前还没有很好的方法制备并分离出单一的聚氧乙烯大分子化的蛋白质。而且有关此类蛋白质的活性和稳定性也缺乏深入的研究。本发明正是基于这一需要，对以上这些方面作出了具体的阐述。

通过本发明中的制备方法，我们从混合物中获得了一种单一的新的具有生物学活性的蛋白质。这一单一产品较以前的基因工程蛋白质有明显的优点。它的体内半衰期延长，体内生物活性增强，稳定性增加，免疫原性降低。

本发明涉及活性的水溶性缓释重组蛋白质的单一制品及其制备和分离纯化的方法。通过将重组蛋白质与聚氧乙烯进行反应，如G-CSF和聚氧乙烯20,000反应，经过离子交换和分子筛层析分离纯化，得到单一的聚氧乙烯大分子化的G-CSF。令人高兴的是，把所得的各个单一样品进行生物活性测定，其中一种聚氧乙烯大分子化的G-CSF具有明显的诱导嗜中性粒细胞的快速增殖作用。而且，更具优势的是这种聚氧乙烯大分子化的G-CSF的体内生物活性比对照的G-CSF更加高，稳定性更好，其在体内的代谢清除率更低。这可能是由于POE与G-CSF连接使分子变大，或者蛋白质代谢与排泄所要求的细胞受体的相互作用受到空间位阻。同时，聚氧乙烯本身具有良好的生物相容性。

因此，本发明的内容对获得水溶性的稳定的重组蛋白质具有积极的意义。

本发明涉及活性的水溶性缓释重组蛋白质的单一制品及其制备和分离纯化的方法。以下对此进行详细描述：

首先，本发明涉及水溶性缓释重组蛋白质的制备和分离纯化的方法。

本方法可以将聚氧乙烯大分子化蛋白质。通过选择合适的缓冲液和pH值，使活化的聚氧乙烯反应到蛋白质的氨基酸残基上。反应效率达到70％。在用离子交换和分子筛层析柱，分离产物中的各组份，得到了单一的制品。并通过肽图谱得以证实。

其次，本发明涉及获得的活性水溶性缓释重组蛋白质。

将分离纯化的单一样品进行生物活性的测定和稳定性实验。比较后，确定了一种既具有生物学活性，又水溶液稳定的单一制品。

实例一

1、重组人G-CSF的制备

人G-CSF的氨基酸序列如下：

Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro

Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly

Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu

Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala

Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu

Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg

Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val

Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

我们将含有该序列的质粒，转化大肠杆菌进行表达，对获得的菌体蛋白进行复性，以及离子交换，分子筛柱纯化，获得G-CSF半成品即可作为聚氧乙烯化的原料。2、聚氧乙烯大分子化的G-CSF的制备

将1中制备的1.5mg/ml G-CSF溶液，用100mM(pH8.0)的磷酸钠缓冲液透析过夜，加入溶解于此缓冲液的平均分子量为20000的甲氧基环氧丙基聚氧乙烯(EPO-MPOE)(摩尔比为聚氧乙烯∶G-CSF=20∶1)，4℃缓慢搅拌16小时。3、产物混合物的分离纯化

将2中制备的产物用20mM乙酸钠(pH4.0)透析过夜。然后上样于Pharmacia CM SepharoseFF柱(1ml树脂结合1mg蛋白质)，以缓冲液A(20mM醋酸钠，pH4.0)平衡柱。将蛋白质上样，再以缓冲液B(1M的氯化钠)，其浓度梯度为0-30％进行浓度梯度洗脱。流速为3ml/min，洗脱液在280nm处监测，部分收集蛋白含量大于0.5mg/ml的部分。合并不同峰的馏分进行分析(结果见图1)。如图所示，产物POE-GCSF通过离子交换层析柱的得率为70％左右。

将离子交换层析柱获得的蛋白质进行分子筛层析。柱为PharmaciaSephcryl S-200HR,300ml。以20mm醋酸钠(pH4.0)缓冲液平衡。上样蛋白以6ml/min流速洗脱200min，在280nm处监测蛋白的流出情况，合并目的蛋白峰(结果见图2)。如图所示，产物POE-GCSF通过分子筛层析柱的得率为95％以上。4、产物生物活性测定(1)体外活性测定

利用对G-CSF依赖的细胞株NFS-60，在含有10％经热灭活的胎牛血清和G-CSF的IMDM培养基中，于37℃,5％CO₂培养72小时后。用无G-CSF的培养基清洗细胞2次，以每孔10000个细胞/50μl加入96孔板，并加入用IMDM-FBS配成的20、40、80、160、320pg/ml的美国Amgen公司G-CSF标准品和自制POE-GCSF样品。37℃,5％CO₂培养48小时后，按CellTiter 96 Aqueous细胞生长的非同位素检测试剂盒中的说明，加入新鲜配制的以20∶1混合的MTS/PMS溶液20μl/孔，继续培养4小时，用BioTek酶标仪读取490nm的值。酶标仪上自带的软件可显示出标准曲线及计算出待测样品的生物活性(结果见图3)。如图所示，采用本发明独特的方法制备得到的POE-GCSF样品具有明显的体外诱导嗜中性粒细胞的快速增殖作用。(2)体内活性测定

选择ICR小鼠，以10μg蛋白质/kg剂量静脉注射自制POE-GCSF样品，并以美国Amgen公司G-CSF标准品作为阳性对照。注射后，间隔一定时间，取外周血，对嗜中性粒细胞进行计数(结果见图4)。如图所示，采用本发明的方法制备得到的POE-GCSF样品在体内仍然具有生物学活性。5、产物等电点测定

分别取样品POE-GCSF原液和美国Amgen公司G-CSF标准品作为对照液及等电点标准液各2μl分别加入IEF胶的加样孔中，进行聚焦。100V 15分钟，200V 15分钟，450V 60分钟，停止聚焦(此时电流趋于零)。然后，胶进行固定和脱色(结果见图5)。结果显示，样品POE-GCSF与G-CSF标准品具有相同的等电点。6、产物分子量及胰肽酶切分离图谱分析(1)SDS-PAGE电泳

利用10％的变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色(结果见图6)。(2)分子排阻HPLC

采用TSK gel SW3000凝胶柱，以10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)为流动相，进行分子排阻HPLC，流速为1.0ml/min，洗脱液在280nm处监测(结果见图7)。图中结果通过计算机对峰面积进行积分处理后显示，样品经分子筛层析柱纯化，纯度达到98％以上。(3)胰肽酶切分离图谱

500μg POE-GCSF及对照品G-CSF样品真空干燥，将其溶解在含有6M的盐酸胍及1mM EDTA的0.3M Tris-HCl中(pH8.4)。配成1mg/950μl浓度。样品中加碘乙酸进行S-羧甲基化，并在37℃反应20分钟。然后样品用Sephadex G-25快速离心蛋白分离柱(Quick SpinProtein Columns)脱盐处理。加入上述缓冲液至蛋白终浓度为0.5mg/ml。

将以上蛋白质样品及对照品用蛋白质内切酶SV8(酶与底物比为1∶25)消化，以不加样品的胰酶溶液作空白。25℃消化26小时。取出，装Vydac C4柱，以溶液B(95％乙腈，5％水，0.1％三氟乙酸)3％-76％梯度洗脱，通过HPLC作肽图。从而说明POE-GCSF为单个POE化学修饰的产物。7、产物稳定性研究

将POE-GCSF的注射液置于37℃放置48天，分别于0天，第6天，第12天，第24天，第36天，第48天取样，进行还原型SDS-PAGE电泳(结果见图8)，及分子排阻HPLC。结果显示，POE-GCSF经过37℃放置48天后，仍然没有降解，性质非常稳定。

实例二

将HPLC纯的重组人生长激素(hGH)1.5mg/ml溶液，其中人生长激素的氨基酸序列如下：

Met Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr

Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro

Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu

Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe

Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn

Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly

Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr

Ser Lys phe Asp Thr Asn Ser his Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr

Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe

Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe用100mM(pH8.3)碳酸铵缓冲液透析过夜，加入溶解于此缓冲液的平均分子量为20000的甲氧基环氧丙基聚氧乙烯(EPO-MPOE)(摩尔比为聚氧乙烯∶hGH=20∶1)，4℃缓慢搅拌16小时。然后，在4℃环境下，以10mM NaCl/20mM Tris(pH7.5)溶液对反应混合物进行超滤(截流分子量20kD)。将去除了未反应人生长激素蛋白质的原液上样于Pharmacia Q Sepharose FF柱(1ml树脂结合1.2mg蛋白质)，以缓冲液A(50mM NaCl/20mM Tris(pH7.5))平衡柱。将蛋白质上样，再以缓冲液B(1M的氯化钠)，其浓度梯度为0-20％进行浓度梯度洗脱。流速为3ml/min，洗脱液在280nm处监测，部分收集蛋白含量大于0.5mg/ml的部分。合并不同峰的馏分进行分析。将离子交换层析柱获得的蛋白质进行分子筛层析。柱为Pharmacia Sephcryl S-200HR,300ml。以20mm醋酸钠(pH4.0)缓冲液平衡。上样蛋白以6ml/min流速洗脱200min，在280nm处监测蛋白的流出情况，合并目的蛋白峰。通过分离纯化得到单一的POE-hGH，进行胰肽酶切分离图谱分析。活性测定结果显示其仍然具有促进骨生长、增加骨骼长度的作用。

相关专利美国专利              4,002,531美国专利              4,179,337美国专利              4,414,147美国专利              4,810,643美国专利              4,894,226美国专利              4,897,471美国专利              4,904,584美国专利              5,252,714美国专利              5,349,052美国专利              5,773,581欧洲专利              0098110欧洲专利              0154316欧洲专利              0236987欧洲专利              0243153欧洲专利              0335423欧洲专利              0338916欧洲专利              0401384欧洲专利              0442724欧洲专利              0459630欧洲专利              0473268欧洲专利              0539167英国专利              9016138英国专利              9018414英国专利              9018418世界专利              8604145世界专利              8906546世界专利              8910932世界专利              9004606世界专利              9105798世界专利              9417185

                    相关文献Woodland et al.,Journal of Medicinal Chemistry,1973,16,897-901；Wise et al.,Journal of Pharmacy and Pharmacology,1978,30,686-689Proceed Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.16,(1989)No.268 pp.509-510；Biotechnology 8,(1990)pp.755-758Mumtaz S,Bachhawat BK,Indian J Biochem Biophys 1991 Oct-Dec；28(5-6):346-51

Claims (8)

1．水溶性缓释重组蛋白质的制备方法包括：

(1)在合适的pH条件下，将水溶性多聚物与重组蛋白质进行反应。

(2)获得水溶性多聚物加成至重组蛋白质的氨基酸残基上的混合物。

(3)通过分子筛和离子交换层析分离未反应物及其它副产物，得到单一的水溶性缓释重组蛋白质。

2．权利要求1的制品中所说的水溶性多聚物是指葡聚糖、多聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇(polypropylene glycol)均聚体、聚氧化丙烯/氧化乙烯(polypropylene oxide/ethylene oxide)共聚体、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyols)及聚乙烯醇的化学物质进行化学修饰。

3．权利要求1中所说的重组蛋白质是指白细胞介素-11(IL-11)、人生长激素(hGH)、人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)、和干扰素(IFN)。

4．权利要求1中所说的水溶性缓释重组蛋白质为单一制品。该制品可制成不同的制剂，这些制剂包括药用上可接受的稀释剂、载体或佐剂。

5．权利要求1中的方法，其中所说的水溶性多聚物是指聚氧乙烯(POE)。包括环氧丙基甲基聚氧乙烯(EPO-MPOE)，氯丙基甲基聚氧乙烯(CM-POE)及琥珀酰亚胺丙酸酯基甲基聚氧乙烯(SPA-MPOE)。

6．权利要求1中的方法，其中所说的水溶性缓释重组蛋白质是指水溶性缓释白细胞介素-11(POE-IL-11)、水溶性缓释人生长激素(POE-hGH)、水溶性缓释集落细胞刺激因子(POE-G-CSF)、和水溶性缓释干扰素(POE-IFN)。

7．权利要求5中的聚氧乙烯(POE)具有从4KDa-80KDa的分子量。

8．权利要求5中所说的水溶性多聚物是符合GMP生产要求的，是药用上可以接受的。

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