CN1897812B - 糖聚乙二醇化的粒细胞集落刺激因子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了粒细胞刺激集落因子和PEG部分之间的缀合物。通过插入肽和修饰基团之间并共价连接这两者的完整糖基连接基团来连接该缀合物。通过糖基转移酶的作用从糖基化和非糖基化的肽形成缀合物。糖基转移酶将修饰糖部分连接至肽上的氨基酸或糖基上。还提供了包括缀合物的药物制剂。制备缀合物的方法也在本发明的范围之内。

Description

糖聚乙二醇化的粒细胞集落刺激因子

            相关申请的交叉参考 

本申请享有2003年12月3日申请的U.S.临时专利申请No.60/526,796；2004年3月23日申请的U.S.临时专利申请No.60/555,813；2004年5月11日申请的U.S.临时专利申请No.60/570,282；2004年1月26日申请的U.S.临时专利申请No.60/539,387；2004年7月29日申请的U.S.临时专利申请No.60/592,744；2004年9月29日申请的U.S.临时专利申请No.60/614,518；和2004年10月29日申请的U.S.临时专利申请No.60/623,387的优先权，其中每个在此以其整体引入作为参考，用于所有目的。 

发明背景

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激嗜中性粒细胞祖细胞和成熟嗜中性粒细胞存活、增殖、分化和功能的糖蛋白。临床用途中两种形式的重组人G-CSF是嗜中性粒细胞生成的有效的刺激剂并已经证明在一些嗜中性白细胞减少症中的防止感染并发症的有效性。它们可以用于促进骨髓抑制治疗的嗜中性白细胞恢复。

G-CSF通过降低发热性嗜中性白细胞减少症的发生降低了癌症化疗的发病率，降低了通过骨髓移植支持的高剂量化疗的发病率，和降低了严重慢性嗜中性白细胞减少症患者感染的发生和持续。此外，最近已经表明当心肌梗死发作后给药时，G-CSF具有治疗效果。

日本和美国小组在1986年克隆了人形式的G-CSF(参见，例如，Nagata等，Nature 319：415-418，1986)。天然人糖蛋白存在两种形式，一种为175个氨基酸，另一种为178个氨基酸。更丰富和更有活性的175个氨基酸形式已经通过重组DNA技术用于药品开发中。

在大肠杆菌(E.coli)表达系统中合成的重组人G-CSF称为非尔司啶(filgrastim)。非尔司啶的结构略不同于天然糖蛋白。另一种形式的重组人G-CSF称为利诺司啶(lenograstim)并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中合成。

hG-CSF是单体蛋白，通过2个G-CSF分子和2个受体的2∶2复合物的形成使G-CSF受体二聚(Horan等，Biochemistry，35(15)：4886-96(1996))。通过X-射线晶体图象研究已经鉴定以下的hG-CSF残基作为受体结合界面的一部分：G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，L15，K16，E19，Q20，L108，D109，D112，T115，T116，Q119，E122，E123和L124(参见，例如，Aritomi等，(1999)Nature 401：713)。

可购得形式的rhG-CSF具有短期药物效果且对于白细胞减少症的持续必须一天多于一次的经常给药。具有较长循环半衰期的分子将减少缓解白细胞减少症并防止随后感染的必要给药次数。目前可获得rG-CSF产品的另一个问题是剂量依赖性骨痛的发生。由于骨痛是作为rG-CSF治疗的显著副作用而患者所经历的，理想的是提供没有导致骨痛的rG-CSF产品，通过本质上不具有该作用的产品或足够小剂量的该产品是有效的而没有引起骨痛。因此，明确地需要改进的重组G-CSF分子。

已经报道了hG-CSF的蛋白工程化变体(U.S.专利No.5,581,476，U.S.5,214,132，U.S.5,362,853，U.S.4,904,584和Riedhaar-Olson等，Biochemistry 35：9034-9041，1996)。还报道了hG-CSF和其他多肽的修饰，使得与天然多肽相比较引入了至少一个另外的碳水化合物链(U.S.专利No.5,218,092)。此外，已经报道和研究了天然hG-CSF的聚合物修饰，包括连接PEG基团(参见，例如，Satake-Ishikawa等，(1992)Cell Structure and Function 17：157；Bowen等(1999)Experimental Hematology 27：425；U.S.专利No.5,824,778，U.S.5,824,784，WO96/11953，WO95/21629和WO94/20069)。

在提高糖蛋白治疗剂药物动力学性能的尝试中将合成聚合物连接 肽主链是本领域已知的。已经与肽缀合的示范性聚合物是聚(乙二醇)(“PEG”)。已经证明使用PEG来衍生肽治疗剂能降低肽的免疫原性。例如，U.S.专利No.4,179,337(Davis等)公开了结合聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的非免疫原性多肽如酶和肽激素。除了降低的免疫原性，由于所述多肽的PEG缀合增加的大小，延长了循环中的清除时间。

PEG及其衍生物连接肽的主要模式是通过肽氨基酸残基的非特异性结合(参见，例如，U.S.专利No.4,088,538，U.S.专利No.4,496,689，U.S.专利No.4,414,147，U.S.专利No.4,055,635和PCT WO87/00056)。连接PEG和肽的另一种模式是通过糖肽上糖基的非特异性氧化(参见，例如，WO94/05332)。

这些非特异性方法中，以随机、非特异性的方式将聚(乙二醇)添加至肽主链上的反应性残基。当然，PEG分子的随机加入具有其缺陷，包括缺乏成品的均一性，和降低肽的生物或酶活性的可能性。因此，对于治疗肽的生产，形成特异性标记的、容易表征的、实质上均一产品的衍生策略是优选的。已经产生了这样的方法。

通过酶的作用可以在体外生产特异性标记的、均一的肽治疗剂。与连接合成聚合物或其他标记和肽的典型非特异性方法不同，基于酶的合成具有区域选择性和立体选择性的优势。标记肽合成中所用的两个主要类别的酶是糖基转移酶(例如，唾液酸转换酶、寡糖转移酶、N-乙酰基氨基葡糖基转移酶)和糖苷酶。这些酶可以用于糖的特定连接，随后可以修饰这些糖来包括治疗剂部分。或者，糖基转移酶和修饰的糖苷酶可以用于将修饰的糖直接转移至肽主链(参见，例如，U.S.专利6,399,336和U.S.专利申请公开20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，其中每个在此引入作为参考)。结合化学和酶合成要素的方法也是已知的(参见，例如，Yamamoto等，Carbohydr.Res.305：415-422(1998)和U.S.专利申请公开20040137557，其在此引入作为参考)。

响应改进治疗G-CSF的需要，本发明提供了糖聚乙二醇化 (glycopegylated)的G-CSF，是治疗上活性的且相对于相同的或接近的类似物、非糖聚乙二醇化的G-CSF肽具有提高的药物动力学参数和性能。此外，本发明提供了成本有效和工业规模生产本发明改进G-CSF肽的方法。

发明概述

现在已经发现用一个或多个聚(乙二醇)部分受控修饰粒细胞集落刺激因子(G-CSF)获得了新的G-CSF衍生物，该衍生物与相应的天然(未-聚乙二醇化)的G-CSF相比较具有提高的药物动力学特征(图3)。此外，糖聚乙二醇化的G-CSF的药物活性与可购得的单-聚乙二醇化非尔司啶的大约相同(图4)。

示范性实施方案中，通过酶介导的在糖基化或非糖基化G-CSF肽和酶可转移糖基部分之间形成缀合物来生产本发明的“糖聚乙二醇化”的G-CSF分子，该酶可转移的糖基部分在其结构内部包括聚(乙二醇)部分。将该PEG部分直接连接糖部分(即，通过两个反应基的反应所形成的单个基团)或通过衔接物部分，例如，取代或未取代的烷基，取代或未取代的杂烷基等。示范性的可转移PEG-糖基结构列于图5中。

因此，一方面中，本发明提供了PEG部分例如PEG和肽之间的缀合物，该肽具有与本领域已知G-CSF相似的体内活性或是本领域已知G-CSF的其他类似物。本发明的缀合物中，PEG部分通过完整糖基连接基团共价连接肽。示范性的完整糖基连接基团包括用PEG衍生的唾液酸部分。

一示范性方面中，本发明提供了包括以下部分的G-CSF肽：

上述通式中，D是-OH或R¹-L-NH-。符号G表示R¹-L-或-C(O)(C₁-C₆)烷基。R¹是包括直链或支链聚(乙二醇)残基的部分；且L是衔接物， 其选自键，取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基。通常，当D是OH时，G是R¹-L-，且当G是-C(O)(C₁-C₆)烷基时，D是R¹-L-NH-。在此所示修饰的唾液酸结构中，COOH还表示COO^-和/或其盐。

另一方面中，本发明提供了制造包括上述部分的PEG-化G-CSF的方法。本发明的方法包括(a)在适于转移的条件下，将底物G-CSF肽与PEG-唾液酸供体和将PEG-唾液酸转移至G-CSF的氨基酸或糖基上的酶接触。示范性PEG-唾液酸供体部分具有通式：

一实施方案中，宿主是哺乳动物细胞。另一实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞、植物细胞、细菌或真菌。

通过改变肽的结构、糖基化位点的数量和位置容易地改变了本发明化合物的药物动力学特征。因此，加入一个或多个突变是在本发明应用范围内的，该突变是将野生型中不存在的O-或N-连接的糖基化位点插入G-CSF肽中。这些突变体的抗体及其糖基化的最终产物和中间产物也在本发明的范围之内。

另一方面中，本发明提供了G-CSF缀合物，该缀合物具有通过完整糖基连接基团与其共价结合的PEG部分例如PEG的群。本发明的缀合物中，实质上群的每个成员通过糖基连接基团结合肽的糖基，且每个糖基具有相同的结构。

示范性实施方案中，本发明提供了G-CSF缀合物，该缀合物具有通过完整糖基连接基团与其共价结合的PEG部分例如PEG的群。本发明的缀合物中，实质上群的每个成员结合肽的氨基酸残基，且结合聚合物的每个氨基酸残基具有相同的结构。例如，如果一个肽包括连接Thr的糖基，群体中至少约70％、80％、90％、95％、97％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或更优选99.8％的肽具有与相同Thr残基共价结合的相同糖基。对于O-糖基化和N-糖基化位点，上述讨论同等相关。

还提供了药物组合物。组合物包括药物学上可接受的载体和非天然产生的PEG部分与糖基化或非糖基化G-CSF肽之间的共价缀合物。

从以下的详细描述中，本发明的其他目的和优势对本领域技术人员将变得清楚。

附图描述

图1是G-CSF的结构，显示了在Thr 133(Thr 134，如果甲硫氨酸存在)的潜在糖基化的存在和位置。

图2是流程图，显示了本发明的示范性实施方案，其中在加入PEG衍生的糖部分之前，通过酶将GalNAc部分添加至Thr 133的糖基残基((Thr 134，如果甲硫氨酸存在)来改变了G-CSF肽上的碳水化合物残基。

图3是曲线，比较了未糖基化的G-CSF、Neulasta^TM和酶促糖聚乙二醇化的G-CSF的体内停留时间。

图4是曲线，比较了图3中所示物质的活性。

图5是合成流程图，用于生产制备本发明缀合物中的所用的示范性PEG-糖基连接基团前体(修饰的糖)。

图6显示了示范性的G-CSF氨基酸序列。SEQ ID NO：1是175个氨基酸的变体，其中第一个氨基酸是甲硫氨酸，且在Thr 134是苏氨酸残基。SEQ ID NO：2是174个氨基酸的变体，其具有和175个氨基酸变体相同的序列，除了没有前导甲硫氨酸，因此序列开始于T且在位置133是苏氨酸残基。

图7证明了在生长于各种培养基中并用IPTG诱导的细菌中生产重组GCSF。

图8提供了在SP-琼脂糖色谱后再折叠GCSF的Western印迹分析。

图9说明了一些示范性的本发明实践中有用的修饰糖核苷酸。

图10说明了更多本发明实践中有用的示范性修饰糖核苷酸。

图11是唾液酸转移酶的表，这些转移酶用于将在此所示的修饰唾液酸物质和未修饰的唾液酸转移至受体。

发明详述和优选实施方案

缩写

PEG，聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；Ara，阿拉伯羰基；Fru，果糖基；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰基半乳糖胺基；Glc，葡糖基；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺基；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖胺基醋酸盐；Xyl，木糖基；和NeuAc，唾液酸(N-乙酰神经氨糖基)；M6P，甘露糖-6-磷酸盐；Sia，唾液酸，N-乙酰神经氨糖基及其衍生物和类似物。

定义

除非另外指出，在此所用的所有技术和科学术语通常具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同意思。通常，在此所用的术语和细胞培养、分子遗传、有机化学和核酸化学和杂交的实验室程序是本领域公知的且常用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。通常根据本领域的常规方法和各种通用的参考文献来进行工艺和程序(总地参见，Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，在此将其引入作为参考)，贯穿该文件提供了这些。在此所用的术语和以下所述的分析化学和有机合成中的实验室程序是本领域公知的且常用的那些。标准技术或其改进用于化学合成和化学分析。

在此所述的所有寡糖如下描述：用非还原性糖(即，Gal)的名称或缩写，后面为糖苷键的构象(α或β)、环键(1或2)、涉及键(2、3、4、6或8)的还原糖的环位置，然后是还原糖的名字或缩写(即，GlcNAc)。每个糖优选是吡喃糖。对于标准糖生物学命名的综述，参见Essentials of Glycobiology Varki等编辑，CSHL Press(1999)。

认为寡糖具有还原末端和非还原末端，不管糖是否在还原末端实际上是还原糖。根据公认的命名，在此所述的寡糖在左边具有非还原末端，还原末端在右边。

术语“唾液酸”指的是九-碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰-神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-galactononulopyranos-1-onic acid(通常缩写为Neu5Ac，NeuAc，或NANA)。家族的第二个成员是N-乙醇酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基团是羟基化的。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-nonulosonic acid(KDN)(Nadano等，(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557；Kanamori等，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包括的是9-取代的唾液酸，如9-O-C₁-C₆ 酰基-Neu5Ac，如9-O-乳酰-Neu5Ac或9-O-乙酰-Neu5Ac，9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮-9-脱氧-Neu5Ac。对于唾液酸家族的综述，参见例如，Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and function，R.Schauer，编辑(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化程序中的合成和使用公开于国际申请WO92/16640中，1992年10月1日公开。

术语“粒细胞集落刺激因子”或“粒细胞集落刺激因子肽”，或“G-CSF”或“G-CSF肽”指的是任何野生型或突变的肽，重组的，或天然的，或任何具有天然GCSF活性或模拟天然G-CSF活性的GCSF片段。术语通常还包括非肽G-CSF模拟物。示范性实施方案中，G-CSF肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。另一示范性实施方案中，G-CSF肽具有选自SEQ ID NO：3-11的序列。

术语“粒细胞集落刺激因子活性”指的是任何活性，包括但不限于，受体结合和激活，受体结合的抑制，或通过野生型粒细胞集落刺激因子的作用正常影响的任何生化或生理反应。粒细胞集落刺激因子活性可以由如上所定义的任何粒细胞集落刺激因子肽的作用而引起。

“肽”指的是聚合物，其中单体是氨基酸并通过酰胺键连接在一起，或者称为多肽。因此，还包括非天然氨基酸，例如，β-丙氨酸、 苯基甘氨酸和高精氨酸。本发明中还可以使用非基因编码的氨基酸。此外，本发明中还可以使用已经修饰的来包括反应基、糖基化位点、聚合物、治疗剂部分、生物分子等的氨基酸。本发明所用的所有氨基酸可以是D-或L-异构体。通常优选L-异构体。此外，其他肽模拟物在本发明中也是有用的。如在此所用的，“肽”指的是糖基化的和非糖基化的肽。还包括通过表达肽的系统不完全糖基化的肽。对于一般综述，参见Spatola，A.F.，CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINOACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein编辑，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。

术语“肽缀合物”指的是本发明的物质，其中肽与在此所示的修饰糖缀合。

术语“氨基酸”指的是天然产生的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和作用方式与天然产生氨基酸相似的氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及之后得到修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然产生氨基酸相同基础化学结构的化合物，即，结合氢的α碳、羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保持与天然产生氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物指的是具有不同于氨基酸一般化学结构的结构的化合物，但是作用方式与天然产生的氨基酸相似。如在此所用的，“氨基酸”，不管是在衔接物中或是肽序列的部分，指的是氨基酸的D-和L-异构体以及这两种异构体的混合物。

如在此所用的，术语“修饰的糖”，指的是天然或非天然产生的碳水化合物，在本发明的方法中通过酶添加至肽的氨基酸或糖基上。修饰的糖选自各种酶底物，包括但不限于，糖核苷酸(单-、双-和三-磷酸盐)，活性糖(例如，糖基卤化物、糖基甲磺酸盐)和既不是活性也不是核苷酸的糖。“修饰的糖”用“修饰基团”来共价功能化。有用的修饰基团包括但不限于，FEG部分、治疗剂部分、诊断剂部分、 生物分子等。修饰基团不优选天然产生的，或未修饰的碳水化合物。选择修饰基团功能化的位置使得其不能阻止“修饰糖”通过酶添加至肽。

术语“水溶性的”指的是在水中具有一定可检测程度溶解度的部分。检测和/或定量水溶解度的方法是本领域公知的。示范性PEG部分包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可以具有由单个氨基酸构成的混合序列，例如，聚(赖氨酸)。相似地，糖可以是混合的序列或由单个糖亚基构成，例如，葡聚糖、直链淀粉、壳聚糖和聚(唾液酸)。示范性聚(醚)是聚(乙二醇)。聚(乙烯亚胺)(Poly(ethyleneimine))是示范性的聚胺，聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。

如在此所用的术语“糖基连接基团”，指的是其上共价连接物质(例如，PEG部分、治疗剂部分、生物分子)的糖基。本发明的方法中，“糖基连接基团”变成共价连接糖基化的或未糖基化的肽，因此将所述物质连接肽上的氨基酸和/或糖基。“糖基连接基团”通常源自“修饰的糖”，通过酶将“修饰的糖”连接至肽的氨基酸和/或糖基。“完整糖基连接基团”指的是源自糖基部分的连接基团，其中连接缀合物的单个糖单体没有被降解，例如，氧化，例如，通过偏高碘酸钠。本发明的“完整糖基连接基团”可以源自天然产生的寡糖，通过加入糖基单位或从母体糖结构除去一个或多个糖基单位。

如在此所用的术语“靶向部分”指的是将选择性地定位于身体特定组织或部位的物质。通过分子决定因子的特定识别、靶向剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水相互作用等来介导定位。将药剂靶向至特定组织或部位的其他机理是本领域技术人员已知的。示范性的靶向部分包括抗体、抗体片段、转铁蛋白、HS-糖蛋白、抗血友病因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。

如在此所用的，“药物学上可接受的载体”包括任何物质，当该物质结合缀合物时，保留缀合物的活性且与受试者的免疫系统是非反应性的。实例包括但不限于，任一种标准药物载体如磷酸盐缓冲的盐溶液、水、乳液如油/水乳液，和各种类型的润湿剂。其他载体还可以 包括无菌溶液、包括包衣片剂的片剂和胶囊。通常这样的载体含有赋形剂，如淀粉、乳汁、糖、特定类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石、植物脂肪或油、树胶、多元醇，或其他已知的赋形剂。这样的载体还可以包括香味和颜色添加剂或其他组分。通过公知的常规方法配制含有这样载体的组合物。

如在此所用的，“给药”，意思是口服给药、作为栓剂给药、局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、损伤内、鼻内或皮下给药，或给受试者植入缓慢释放的装置，例如，小渗透泵。通过任何途径给药，包括非肠道的和经粘膜的(例如，口、鼻、阴道、直肠或经皮的)。非肠道给药包括，例如，静脉内、肌内、小动脉内、皮肤内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。此外，当注射来治疗肿瘤时，例如，诱导凋亡，可以直接给药至肿瘤和/或进入围绕肿瘤的组织。其他的传送方式包括但不限于，使用脂质体制剂，静脉内灌输、经皮贴片等。术语“改善”(ameliorating或ameliorate)指的是在病理或病症治疗中成功的任何标记，包括任何客观或主观参数，如症状的减轻、缓解或减少或患者身体或精神良好状态的改善。症状的改善可以基于客观或主观参数；包括身体检查和/或精神评价的结果。

术语“治疗”指的是疾病或病症的“治疗”(treating或treatment)，包括预防倾向于疾病但是还没有经历或呈现疾病症状的动物中疾病或病症的发生(预防性治疗)、抑制疾病(减缓或停止其发展)、提供减轻症状或疾病的副作用(包括如息疗法)和解除疾病(导致疾病的退化)。

术语“有效量”或“量有效的”或“治疗上的有效量”或任何语法上等价术语意思是当给药于动物治疗疾病时，足以有效治疗该疾病的量。

术语“分离的”指的是基本上或实质上没有以下成分的物质，该成分用于生产该物质。对于本发明的肽缀合物，术语“分离的”指的是基本上或实质上没有以下成分的物质，该成分通常伴随用于制备肽混合物中的物质。“分离的”和“纯的”可以交替使用。通常，本发 明分离的肽缀合物具有优选表达为范围的纯度。肽缀合物纯度的下限是约60％、约70％或约80％，纯度范围的上限是约70％、约80％、约90％或高于约90％。

当肽缀合物高于约90％纯时，它们的纯度也优选表达为范围。纯度范围的下限是约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上限是约92％、约94％、约96％、约98％或约100％纯度。

通过本领域已知的任何分析方法来测定纯度(例如，银染凝胶上的条带强度、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC或相似的方法)。

如在此所用的“实质上群的每个成员”描述了本发明肽缀合物群的特征，其中选定百分比的加至肽的修饰糖添加至肽上的多个、相同的受体位点。“实质上群的每个成员”是对缀合修饰糖的肽上的位点“均一性”而言的并指的是本发明的缀合物，至少是约80％，优选至少约90％和更优选至少约95％的均一性。

“均一性”指的是缀合修饰糖的受体部分群结构一致性。因此，本发明的肽缀合物中，其中每个修饰糖部分与具有相同结构的受体位点缀合，该相同结构作为每个其他修饰糖的受体位点，据说肽缀合物约100％均一。均一性通常表达为范围。肽缀合物均一性范围的下限是约60％、约70％或约80％，纯度范围的上限是约70％、约80％、约90％或高于约90％。

当肽缀合物高于或等于约90％均一时，它们的均一性也优选表示为范围。均一性范围的下限是约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。均一性范围的上限是约92％、约94％、约96％、约98％或约100％均一性。通常通过本领域技术人员已知的一种或多种方法来测定肽缀合物的纯度，例如，液相色谱-质谱(LC-MC)、基质辅助的激光吸收质量时间飞行质谱(MALDITOF)、毛细管电泳等。

“基本上均一的糖形式”或“基本上均一的糖基化模式”，当指的是糖肽物质时，指的是通过目标糖基转移酶(例如，岩藻糖基转移酶)糖基化的受体部分的百分比。例如，在α1，2岩藻糖基转移酶的情况中，如果基本上所有(如下所定义的)的Galβ1，4-GlcNAc-R及 其唾液酸化的类似物在本发明的肽缀合物中是岩藻糖基化的则存在基本上均一的岩藻糖基化模式。本领域技术人员将理解，起始原料可以含有糖基化的受体部分(岩藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，计算的糖基化百分比将包括通过本发明方法糖基化的受体部分，以及在起始原料中已经糖基化的那些受体部分。

上述定义“基本上均一”中的术语“基本上”，对于特定糖基转移酶，通常意思是至少约40％，至少约70％，至少约80％，或更优选至少约90％，再更优选至少约95％的受体部分是糖基化的。

其中通过从左至右书写的常规化学式来限定取代基，它们同样包括由右至左书写形成的化学上相同的取代基，例如，确定-CH₂O-也用来表述-OCH₂-。

术语“烷基”单独或作为另一取代基的一部分，除非另外指出，意思是直链或支链或环状烃基，或其组合，其可以是全部饱和的，单-或多不饱和的，并可以包括二价和多价基团，具有指定的碳原子数(即，C₁-C₁₀意思是一至十个碳原子)。饱和烃基的实例包括但不限于，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲-丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，其同系物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。不饱和烷基具有一个或多个双键或三键。不饱和烷基的实例包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，和高级同系物和异构体。术语“烷基”，除非另外指出，还意味着包括以下那些更详细定义的烷基衍生物，如“杂烷基”。限于烃基的烷基也称为“同型烷基”。

术语“亚烷基”单独或作为另一取代基的一部分，意思是源自链烷的二价基团，例如，但不限于，-CH₂CH₂CH₂CH₂-，并进一步包括以下描述为“杂亚烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)具有1至24个碳原子，本发明中优选具有10个或更少碳原子的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，通常具有八个或更少碳原子。

术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以它们的常规意思来使用，并指的是各自通过氧原子、氨基或硫原子连接分子其它部分的那些烷基。

术语“杂烷基”单独或结合另一术语，除非另外指出，意思是稳定的直链或支链，或环状的烃基，或其组合，由所述数量的碳原子和至少一个杂原子构成，杂源自选自O、N、Si和S，且其中氮和硫原子可以任意地是氧化的，氮杂原子可以任意地是季铵化的。杂原子O、N和S以及Si可以位于杂烷基的任何内部位置或位于烷基连接分子其它部分的位置。实例包括，但不限于，-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂、-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-OCH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃，和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。可以达两个杂原子是相邻的，如，-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。相似地，术语“杂亚烷基”单独的或作为另一取代基的一部分，意思是源自杂烷基的二价基团，例如，但不限于，-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于杂亚烷基，杂原子还可以占据任一个或两个链端(例如，烯化氧，烯化二氧、烯化氨基、烯化二氨基等)。再进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，通过其中书写的连接基团的方向没有隐含连接基团的方向。例如，通式-C(O)₂R′-表示-C(O)₂R′-和-R′C(O)₂-两者。

术语“环烷基”和“杂环烷基”，单独或结合其他术语，除非另外指出，各自表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环连接分子其它部分的位置。环烷基的实例包括，但不限于，环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于，1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-某基、四氢呋喃-3-基、四氢噻嗯-2-基、四氢噻嗯-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。

术语“卤”或“卤素”单独或作为另一取代基的一部分，除非另外指出，意思是氟、氯、溴或碘原子。此外，术语如“卤烷基”意思 是包括单卤烷基和多卤烷基。例如，术语“卤(C₁-C₄)烷基”意思是包括，但不限于，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

术语“芳基”，除非另外指出，意思是多不饱和的、芳香族的取代基，可以单环或多个融合在一起或共价连接的环(优选1至3个环)。术语“杂芳基”指的是含有一至四个选自N、O和S杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子可以任意地是氧化的，且氮原子任意地是季胺化的。杂芳基可以通过杂原子连接分子的其它部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-二苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2- 唑基、4-

唑基、2-苯基-4-

唑基、5-

唑基、3-异

唑基、4-异

 唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻嗯基、3-噻嗯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、purinyl、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻嗯基、2，3-二氢苯并[1，4]二氧芑-6-基、苯并[1，3]二氧戊环-5-基和6-喹啉基。对于上述每个芳基和杂芳基环系统的取代基从以下所述的可接受的取代基中选择。

为了简洁，当术语“芳基”结合其他术语使用时(例如，芳氧基、芳基硫氧、芳基烷基)，包括如上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意思是包括其中芳基连接烷基的那些基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶甲基等)，其中烷基(例如，亚甲基)包括碳原子已经由例如氧原子取代的那些烷基(例如，苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。

上述术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)中的每个意思包括所示基团的取代和未取代形式。以下提供了每种类型基团的优选取代基。

对于烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团) 的取代基通常称为“烷基取代基”，且它们可以是一个或多个基团，选自但不限于：OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO₂R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)₂R′、-NR-C(NR′R″R

)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR

、-S(O)R′、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-NRSO₂R′、-CN和-NO₂，数量为零至(2m′+1)，其中m′是这样基团中的碳原子总数。R′、R″、R

和R″″各自优选独立地指的是氢，取代的或未取代的杂烷基，取代或未取代的芳基，例如，1-3个卤素取代的芳基，取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些的基团时，每个R基团各自独立地选择为R′、R″、R和R″″基团。当R′和R″连接相同的氮原子时，它们可以结合氮原子来形成5-、6-，或7-元环。例如，-NR′R″意思是包括，但不限于，1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基的上述讨论中，本领域技术人员将理解术语“烷基”意思是包括这样的基团：该基团含有结合氢基团以外基团的碳原子，如卤素烷基(例如，-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(例如，-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

与对于烷基所述取代基相似，芳基和杂芳基的取代基通常称为“芳基取代基”。取代基选自，例如：卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO₂R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R

、-NR″C(O)₂R′、-NR-C(NR′R″R)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR

、-S(O)R′、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-NRSO₂R′、-CN和-NO₂、-R′、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基，和氟(C₁-C₄)烷基，数量为零至芳香族环系统打开价的总数；且其中R′、R ″、R

和R″″优选独立地指的是氢，取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基，取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些的基团时，每个R基团各自独立地选择为R′、R″、R

 和R″″基团。以下的流程图中，符号X表示如上所述的“R”。

芳基或杂芳基环相邻原子上的两个取代基可以任意地由通式 -T-C(O)-(CRR′)_q-U-取代，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR′-或单键，且q是0至3的整数。或者，芳基或杂芳基环相邻原子上的两个取代基可以任意地由通式-A-(CH₂)_r-B-的取代基取代，其中A和B独立地为-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR′-或单键，且r是1至4的整数。因此形成的新环的单键之-可以任意地由双键替代。或者，芳基或杂芳基环相邻原子上的两个取代基任意地由通式-(CRR′)_s-X-(CR″R

)_d的取代基取代，其中s和d独立地是0至3的整数，且X是-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR′-。取代基R、R′、R″和R

优选独立地选自氢或取代的或未取代的(C₁-C₆)烷基。

如在此所用的，术语“杂原子”意思是包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

引言

本发明包括修饰G-CSF上的多糖结构的方法。G-CSF作为通过激活的T-细胞、巨噬细胞、内皮细胞和基质成纤维细胞产生的细胞因子是本领域公知的。G-CSF主要作用于骨髓来增加炎症白细胞的产生，并进一步起内分泌激素的作用来启动炎症作用过程中消耗的嗜中性粒细胞的补充。G-CSF还在化疗后的骨髓替代中具有临床应用。

本发明提供了粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的缀合物。本发明提供了具有粒细胞集落刺激活性的糖基化和非糖基化肽的缀合物。可以通过进一步与不同物质如治疗剂部分、诊断剂部分、靶向部分等缀合来另外修饰缀合物。

本发明进一步包括重塑(remodelling)和/或修饰G-CSF的方法。G-CSF是治疗多种疾病中有价值的工具，但如上所述的，由于其相对差的药物动力学妨碍了它的临床效果。

示范性实施方案中，本发明的G-CSF肽可以给药于患者，目的是预防正经受特定类型的放疗、化疗和骨髓移植的癌症患者的感染，来动员祖细胞，用于在外周血祖细胞移植中收集，用于治疗严重的慢性 或相关的白细胞减少症，与诱因无关，并支持急性骨髓白血病患者的治疗。另外，本发明的多肽缀合物或组合物可以用于治疗AIDS或其他免疫缺陷疾病以及细菌感染。

已经将G-CSF克隆并测序。示范性实施方案中，G-CSF具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列。本领域技术人员将容易地认识到本发明不受限于在此所示的序列，如G-CSF的变体，如上文中所讨论的。

因此，本发明进一步包括G-CSF变体，如本领域公知的。例如，但不是限制本发明，U.S.专利No.6,166,183中已经描述了G-CSF变体，其中描述了包括赖氨酸残基的天然互补物并进一步连接一个或两个聚乙二醇分子的G-CSF。另外，U.S.专利No.6,004,548、5,580,755、5,582,823和5,676,941描述了G-CSF变体，其中位置17、36、42、64和74的一个或多个半胱氨酸残基由丙氨酸或者丝氨酸替代。U.S.专利No.5,416,195描述了G-CSF分子，其中位置17的半胱氨酸、位置27的天冬氨酸、位置65和66的丝氨酸各自由丝氨酸、丝氨酸、脯氨酸和脯氨酸取代。其他变体是本领域公知的，并描述于，例如，U.S.专利No.5,399,345中。再进一步的变体具有选自SEQ ID NO：3-11的氨基酸。

可以使用本领域公知的方法来测定本发明修饰的G-CSF分子的表达和活性，如U.S.专利No.4,810,643中所述的方法。例如，使用放射性标记的胸苷吸收测试来测量活性。简而言之，将来自健康捐献者的人骨髓用Ficoll-Hypaque(1.077g/ml，Pharmacia，Piscataway，NJ)进行密度分级并将低密度细胞悬浮于含有10％胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的Iscove′s培养基中(GIBCO，La Jolla，CA)。在96-孔平底平板中用对照培养基或本发明的G-CSF孵育约2×10⁴个人骨髓细胞，在约37℃、5％CO₂的空气中孵育约2天。然后用0.5μCi/孔³H-胸苷(New Englang Nuclear，Boston，Mass)将培养物脉冲约4小时并如Ventua等(1983，Blood 61：781)中所述的测量吸收。与对照化合物处理的骨髓细胞相比较，人骨髓细胞中³H-胸苷吸收的增加是活性的和可行的G-CSF化合物的表示。

如上所讨论的，通过酶将修饰的糖连接至糖基化或非糖基化的G-CSF肽来形成本发明的缀合物。当插入G-CSF肽和糖上的修饰基团之间时，修饰的糖变成在此所指的，例如“完整的糖基连接基团”。使用酶如糖基转移酶灵敏的选择性，本发明方法提供了在一个或多个特定位置带有所需基团的肽。因此，根据本发明，修饰的糖直接连接G-CSF肽链上选定的位置，或，修饰的糖添加至糖肽的碳水化合物部分上。其中修饰糖同时结合糖肽碳水化合物和直接结合G-CSF肽主链氨基酸残基的肽也在本发明范围之内。

与已知的化学和酶促肽加工策略相反，本发明的方法可以装配肽和具有基本上均一衍生模式的糖肽；本发明中所用的酶通常对于G-CSF肽特定的氨基酸残基或氨基酸残基的组合是选择性的。该方法对于大规模生产修饰的肽和糖肽也是有用的。因此，本发明的方法提供了大规模制备具有预选均一衍生模式的糖肽的有用方式。该方法特别适于治疗肽的修饰，包括但不限于，在细胞培养细胞(例如，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，真菌细胞，酵母细胞或原核细胞)或转基因植物或动物的生产过程中非完全糖基化的糖肽。

本发明还提供了糖基化和非糖基化G-CSF肽的缀合物，由于例如降低的清除率，或免疫系统或网状内皮组织系统(RES)降低的吸收率，该缀合物具有提高的治疗半衰期。此外，本发明的方法提供了遮掩肽上抗原决定簇的方法，因此降低或消除对抗肽的宿主免疫应答。靶向剂的选择性连接还可以用于将肽靶向特定靶向剂特异性的特定组织或细胞表面受体。

缀合物

第一个方面中，本发明提供了选定修饰基团和G-CSF肽之间的缀合物。

G-CSF肽和选定部分之间的连接包括插入肽和选定部分之间的完整糖基连接基团。如在此所讨论的，选定部分实质上是可以连接糖单位来形成通过合适转移酶识别的“修饰糖”的任何物质，转移酶将修 饰糖添加至G-CSF肽上。当插入G-CSF肽和选定部分之间时，修饰糖的糖部分成为“完整的糖基连接基团”。从选定部分修饰后的任何单-或寡糖形成的糖基连接基团是合适转移酶的底物。

本发明的缀合物通常对应于以下总的结构：

其中符号a、b、c、d和s表示正的、非零整数；且t是0或正的整数。“试剂”通常是水溶性部分，例如PEG部分。连接物可以是以下多种连接基团中的任一种。或者，连接物可以是单键或“零级连接物”。

示范性实施方案中，所选的修饰基团是水溶性聚合物，例如，m-PEG。水溶性聚合物通过糖基连接基团共价连接G-CSF肽，糖基连接基团共价连接G-CSF肽的氨基酸残基或糖基。本发明还提供了缀合物，其中用糖基连接基团修饰氨基酸残基和糖基。

示范性水溶性聚合物是聚(乙二醇)，例如，甲氧基-聚(乙二醇)。本发明中所用的聚(乙二醇)不受限于任何特别形式或分子量范围。对于非支链的聚(乙二醇)分子，分子量优选为500至100,000。优选使用2,000-60,000的分子量，更优选约5,000至约30,000。

另一实施方案中，聚(乙二醇)是具有多于一个连接的PEG部分的支链PEG。支链PEG的实例描述于U.S.专利No.5,932,462；U.S.专利No.5,342,940；U.S.专利No.5,643,575；U.S.专利No.5,919,455；U.S.专利No.6,113,906；U.S.专利No.5,183,660；WO 02/09766；KoderaY.，Bioconjugate Chemistry 5：283-288(1994)；和Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，52：2125-2127，1998。在此公开了其他有用的支链PEG结构。

示范性实施方案中，支链PEG的每个聚(乙二醇)的分子量等于或大于约2,000、5,000、10,000、15,000、20,000、40,000或60,000道尔顿。

本发明的肽包括至少在N-或O-连接的糖基化位点。除了提供通过酶添加糖基连接基团形成的缀合物，本发明提供了取代模式高度均一的缀合物。使用本发明的方法，可以形成肽缀合物，其中实质上本发明缀合物群的所有修饰糖部分连接结构上相同的氨基酸或糖基的多个拷贝。因此，第二个方面中，本发明提供了具有水溶性聚合物部分群的肽缀合物，该聚合物部分通过完整糖基连接基团共价结合G-CSF肽。本发明的优选缀合物中，实质上群的每个成员通过糖基连接基团结合G-CSF肽的糖基，且连接糖基连接基团的G-CSF肽的每个糖基具有相同的结构。

还提供了具有通过糖基连接基团共价结合的水溶性聚合物部分群的肽缀合物。优选实施方案中，实质上水溶性聚合物群的每个成员通过糖基连接基团结合G-CSF肽的氨基酸残基，且具有连接的糖基连接基团的每个氨基酸残基具有相同的结构。

本发明还提供了上述那些类似的缀合物，其中G-CSF肽通过完整糖基连接基团与治疗剂部分、诊断剂部分、靶向部分、毒性部分等缀合。上述部分中的每个可以是小分子、天然聚合物(例如，多肽)或合成聚合物。

实质上任何粒细胞集落刺激因子肽或物质(具有任何序列)可以用作本发明缀合物的肽部分。已经将粒细胞集落刺激因子克隆并测序。示范性实施方案中，G-CSF肽具有SEQ ID NO：1中所示的序列：

MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL

CATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLA

GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD

VADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAF

QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ

ID NO：1).

另一示范性实施方案中，G-CSF肽具有SEQ ID NO：2中所示的序列：

TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCA

TYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGC

LSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVA

DFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQR

RAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ ID

NO：2).

另一示范性实施方案中，G-CSF肽具有以下SEQ ID NO：3-11中所示的序列：

MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL

VSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQAL

QLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTL

QLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFA

SAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP

(SEQ ID NO：3)

MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGP

ASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKL

CHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQL

HSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFAT

TIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGG

VLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ ID NO：4)

MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGP

ASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECAT

YKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCL

SQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVAD

FATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRR

AGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ ID

NO：5)

MVTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEK

LCATYKLCHPEELVLLGHTLGIPWAPLSSCPSQALQL

AGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQL

DVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASA

FQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ

ID NO：6)；

MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL

CATYKLCHPEELVLLGHTLGIPWAPLSSCPSQALQLA

GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD

VADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAF

QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ ID

NO：7)；

MVTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEK

LCATYKLCHPEELVLLGSSLGIPWAPLSSCPSQALQL

AGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQL

DVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASA

FQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ

ID NO：8)；

MQTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEK

LCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQL

AGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQL

DVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASA

FQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ

ID NO：9)；

MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL

CATYKLCHPEELVLLGHSLGHPWAPLSSCPSQALQLA

GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD

VADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAF

QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQPTQGAM

P；(SEQ ID NO：10)和

MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKL

CATYKLCHPEELVLLGSSLGIPWAPLSSCPSQALQLA

GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD

VADFATTIWQQMEELGMAPTTTPTQTAMPAFASAF

QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ ID

NO：11)

本发明不受限于在此所列的序列。

示范性实施方案中，本发明的G-CSF肽包括至少一个O-连接的糖基化位点，其是用包括PEG部分的糖基来糖基化的。PEG通过完整糖 基连接基团与G-CSF肽共价连接。糖基连接基团共价连接G-CSF肽的氨基酸残基或糖基。或者，糖基连接基团连接糖肽的一个或多个糖基单位。本发明还提供了缀合物，其中糖基连接基团同时连接氨基酸残基和糖基。

PEG部分直接或通过非糖基连接物连接完整糖基连接物，例如，非糖基连接物为取代或未取代的烷基，取代的或未取代的杂烷基。

优选实施方案中，G-CSF肽包括具有通式I通式的部分。

通式I

其中D选自-OH和R¹-L-NH-；G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烷基；R¹是包括选自含有直链或支链聚(乙二醇)残基部分的部分；且L是连接物，其选自键、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基，使得当D是OH时，G是R¹-L-，且当G是-C(O)(C₁-C₆)烷基时，D是R¹-L-NH-。在此所示的修饰唾液酸结构中，COOH还表示COO^-和/或其盐。

一实施方案中，R¹-L具有通式：

其中a是0至20的整数。

示范性实施方案中，R¹具有选自以下的结构：

其中e和f是独立地选自1至2500的整数；且q是1至20的整数。另一实施方案中，R¹具有选自以下的结构：

其中e、f和f′是独立地选自1至2500的整数；且q和q′是独立地选自1至20的整数。

再一实施方案中，本发明提供了Facto IX肽缀合物，其中R¹具有选自以下的结构：

其中e、f和f′是独立地选自1至2500的整数；且q、q′和q″是独立地选自1至20的整数。

另一实施方案中，R¹具有选自以下的结构：

其中e和f是独立地选自1至2500的整数。

另一示范性实施方案中，本发明提供了包括具有以下通式的部分的肽：

Gal可以连接氨基酸或糖基，糖基直接或间接(例如，通过糖基)连接氨基酸。

另一实施方案中，所述部分具有通式：

GalNAc可以连接氨基酸或糖基，糖基直接或间接(例如，通过糖基)连接氨基酸。

再一示范性实施方案中，肽包括根据以下通式的部分：

其中AA是所述肽的氨基酸残基，且在每个上述结构中，D和G如在此所述的。

可以缀合一个或多个上述物质的G-CSF肽的示范性氨基酸残基包括丝氨酸和苏氨酸，例如SEQ ID NO：1的苏氨酸133。

另一示范性实施方案中，本发明提供了G-CSF缀合物，该缀合物包括具有以下通式的糖基：

其中a、b、c、d、i、r、s、t和u是独立地选自0和1的整数，指数q是1。指数e、f、g和h是独立地选自0至6的整数。指数j、k、l和m是独立地选自0和100的整数。指数v、w、x和y是独立地选自0和1的整数，且v、w、x和y中至少一个是1。符号AA表示G-CSF肽的氨基酸残基。

符号Sia-(R)表示具有以下通式的基团：

其中D选自-OH和R¹-L-NH-。符号G表示R¹-L-或-C(O)(C₁-C₆)烷基；R¹表示包括直链或支链聚(乙二醇)残基的部分；且L是连接物， 其选自键、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基。通常，当D是OH时，G是R¹-L-，且当G是-C(O)(C₁-C₆)烷基时，D是R¹-L-NH-。

另一示范性实施方案中，本发明缀合物中PEG-修饰的唾液酸部分具有通式：

其中指数“s”表示0至20的整数，且n是1至2500的整数。优选实施方案中，s等于1；且m-PEG部分具有约20kD的分子量。

再一示范性实施方案中，PEG-修饰的唾液酸具有通式：

其中L是连接唾液酸部分和PEG部分的取代或未取代的烷基或取代或未取代的杂烷基连接物部分。

优选实施方案中，至少两个，更优选三个，更优选四个上述的天冬酰胺残基用上述所示的N-连接的糖链来功能化。

本发明的缀合物包括单价或多价的(例如，触角结构)完整糖基连接基团。因此，本发明的缀合物包括两种物质，其中选定部分通过单价糖基连接基团和多价连接基团连接肽。本发明中还包括的是其中多于一个选定部分通过多价连接基团连接肽的缀合物。

修饰的糖

本发明提供了修饰的糖、修饰的糖核苷酸和修饰糖的缀合物。本 发明的修饰糖化合物中，糖部分优选是糖、脱氧糖、氨基糖或N-芳基糖。术语“糖(saccharide)”及其等价物，“糖基(saccharyl)”、“糖(sugar)”和“糖基(glycosyl)”指的是单体、二聚体、寡聚物和多聚物。还用修饰基团将糖部分功能化。将修饰基团与糖部分缀合，通常，通过用胺、硫氢或羟基例如伯羟基结合糖上的部分。示范性实施方案中，通过胺连接修饰基团与糖上的部分，例如通过胺与修饰基团的反应性衍生物的反应形成的酰胺、尿烷或脲。

任何糖可以用作本发明缀合物的糖核心。用于形成本发明组合物的示范性糖核心包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖和唾液酸。其他有用的糖包括氨基糖如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺类似物等。糖核心可以是天然发现的结构或可以被修饰来提供缀合修饰基团的位点。例如，一实施方案中，本发明提供了包括其中9-羟基部分由胺替代的唾液酸衍生物的肽缀合物。用选定修饰基团的激活类似物是容易衍生胺的。

以下的讨论中，通过参考唾液酸的选定衍生物来说明本发明。本领域技术人员将认识到讨论的焦点是为了说明的清晰度，所示的结构和组合物通常可适用于贯穿糖基团、修饰的糖基团、激活的修饰糖基团和修饰糖基团缀合物的种类。

示范性实施方案中，本发明提供了肽缀合物，该缀合物包括具有以下通式的修饰糖胺：

其中G是糖基部分，L是键或连接物，且R¹是修饰基团。示范性键是糖基部分上的NH₂和修饰基团上互补反应性基团之间形成的那些。因此，示范性键包括但不限于NHR¹、OR¹、SR¹等。例如，当R¹包括羧酸部分时，可以用糖基上的NH₂部分来激活和连接该部分以获得具有结构NHC(O)R¹的键。相似地，OH和SH基团各自可以转化成相应的醚或硫醚衍生物。

示范性连接物包括烷基和杂烷基部分。连接物包括连接基团，例如，基于酰基的连接基团，例如，-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。连接基团是本发明物质的组分之间形成的键，例如，在糖基部分和连接物(L)之间，或在连接物和修饰基团(R¹)之间。其他的连接基团是醚、硫醚和胺。例如，一实施方案中，连接物是氨基酸残基，如甘氨酸残基。通过与糖基上的胺反应，将甘氨酸的羧酸部分转化成相应的酰胺，通过与修饰基团的活性羧酸或碳酸反应，将甘氨酸的胺转化成相应的酰胺或尿烷。

另一示范性连接物是PEG部分或用氨基酸残基功能化的PEG部分。PEG通过氨基酸残基在一个PEG末端连接糖基并通过另一个PEG末端结合R¹。或者，氨基酸残基结合R¹，没有结合氨基酸的PEG末端结合糖基。

对于NH-L-R¹，示范性物质具有通式：

-NH{C(O)(CH₂)_aNH}_s{C(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH}_tR¹，其中指数s和t独立地是0或1。指数a、b和d独立地是0至20的整数，且c是1至2500的整数。其他相似的连接物基于其中-NH部分由例如-S、-O和-CH₂替代的物质。

更特别地，本发明提供了肽缀合物，该缀合物包括其中NH-L-R¹是以下物质的化合物：

NHC(O)(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹，

NHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹，

NHC(O)O(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹，

NH(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹，NHC(O)(CH₂)_aNHR¹，

NH(CH₂)_aNHR¹和NHR¹。这些通式中，指数a、b和d独立地选自0至20的整数，优选1至5。指数c是1至2500的整数。

说明性的实施方案中，G是唾液酸并选择具有以下通式的本发明的化合物：

本领域技术人员将认识到，上述示范性化合物中的唾液酸部分可以用任何其他氨基-糖替代，包括但不限于，葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺，及其N-乙酰衍生物等。

另一说明性实施方案中，糖的伯羟基部分用修饰基团功能化。例如，唾液酸的9-羟基可以转化成相应的胺并功能化来提供根据本发明的化合物。根据该实施方案的通式包括：

进一步的示范性实施方案中，本发明提供了肽缀合物，该缀合物包括其中6-羟基位置转化成相应胺部分的修饰糖，其带有连接物-修饰基团盒，如以上所示的那些。可以用作这些修饰糖核心的示范性糖基包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。根据该实施方案，代表性的修饰糖具有通式：

其中R³-R⁵和R⁷独立地选自H、OH、C(O)CH₃、NH和NHC(O)CH₃。R⁶ 是OR¹、NHR¹或NH-L-R¹，其如上所述。

本发明所选的缀合物基于甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或基于具有甘露糖、半乳糖或葡萄糖立体化学的物质。这些缀合物的通式是：

另一示范性实施方案中，本发明提供了作为相应核苷酸糖激活的以上所示的化合物。以其修饰形式用于本发明中的示范性糖核苷酸包括核苷酸单-、二-或三磷酸盐或其类似物。优选实施方案中，修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷，CMP-糖苷，或GDP-糖苷。更优选，修饰糖核苷酸的糖核苷酸部分选自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-岩藻糖，CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。示范性实施方案中，核苷酸磷酸盐连接C-1。

因此，说明性实施方案中，其中糖基部分是唾液酸，本发明提供了使用具有以下通式的化合物形成的肽缀合物：

其中L-R¹如上所述，且L¹-R¹表示结合修饰基团的连接物。和L一样，根据L¹的示范性连接物物质包括键、烷基或杂烷基部分。根据这些实施方案的示范性修饰糖核苷酸化合物列于图1和图2中。

另一示范性实施方案中，本发明提供了本发明修饰糖和例如肽、脂质、糖苷配基等物质之间形成的缀合物，更特别的，是修饰糖和糖肽或糖脂的糖基之间形成的缀合物。该实施方案中，修饰糖的糖部分变成糖基连接基团，插入底物和修饰基团之间。示范性糖基连接基团是完整的糖基连接基团，其中形成连接基团的糖基部分没有被化学(例如，偏高碘酸钠)或酶方法(例如，氧化酶)降解。本发明所选的缀合物包括连接例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等氨基糖的 胺部分的修饰基团。根据该基序的示范性修饰基团-完整糖基连接基团盒基于唾液酸结构，如具有通式：

上述通式中，R¹、L¹和L²如上所述。

再一示范性实施方案中，在底物和糖部分1-位置之间形成缀合物，其中通过糖基部分6-碳位置的连接物连接修饰基团。因此，根据该实施方案的说明性缀合物具有通式：

其中基团如上所讨论的。本领域技术人员将认识到以上所示的修饰糖基部分也可以在2、3、4或5碳原子缀合底物。

根据该实施方案的说明性化合物包括具有以下通式的化合物：

其中R基团和指数如上所述。

本发明还提供了在6-碳位置用L-R¹修饰的糖核苷酸。根据该实施方案的示范性物质包括：

其中R基团和L，表示如上所讨论的部分。指数“y”是0、1或2。

本发明更多示范性的核苷酸糖，基于具有GDP甘露糖立体化学的物质。根据该实施方案的示范性物质具有结构：

再一示范性实施方案中，本发明提供了缀合物，基于UDP半乳糖的立体化学。根据该实施方案的示范性化合物具有结构：

另一示范性实施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立体化学。根据该实施方案的示范性物质具有通式：

修饰基团，R¹，是多种物质中的任一种，包括但不限于，水溶性聚合物、水不溶性聚合物、治疗剂、诊断剂等。以下将更详细地讨论示范性修饰基团的性质。

修饰基团

水溶性聚合物

许多水溶性聚合物是本领域技术人员已知的并在实施本发明中是有用的。术语水溶性聚合物包括以下物质：如糖(例如，葡聚糖、直链淀粉、透明质酸、聚(唾液酸)、类肝素、肝素等)；聚(氨基酸)，例如，聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(例如，聚(丙烯酸)、聚(醚)，例如，聚(乙二醇)；肽、蛋白质等。可以用任何水溶性聚合物来实施本发明，唯一的限制是聚合物必须包括缀合物的其它部分可以连接的点。

还可以在WO94/17039，U.S.专利No.5,324,844，WO94/18247，WO94/04193，U.S.专利No.5,219,564，U.S.专利No.5,122,614，WO90/13540，U.S.专利No.5,281,698，以及WO93/15189中找到激活聚合物的方法，以及对于激活聚合物和肽之间的缀合，例如，抗血友病因子VIII(WO94/15625)，血红蛋白(WO94/09027)，携氧分子(U.S. 专利No.4,412,989)，核糖核酸酶和超氧物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。

优选的水溶性聚合物是聚合物样品中聚合物分子实质性比例的分子量大约相同的那些；这样的聚合物是“均相分散”。

通过参考聚(乙二醇)缀合物来进一步说明本发明。可以获得几篇关于PEG的功能化和缀合的综述和专论。参见，例如，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology135：30-65(1987)；Wong等，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)；和Bhadra等，Pharmazie，57：5-29(2002)。制备反应性PEG分子并使用反应性分子形成缀合物的途径是本领域已知的。例如，U.S.专利No.5,672,662公开了聚合物酸的活性酯的水溶性和可分离的缀合物，聚合物酸选自直链和支链聚(亚烷基氧化物)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)和聚(丙烯吗啉)。

U.S.专利No.6,376,604列出了制备水溶性和非肽聚合物的水溶性1-苯并三唑碳酸酯的方法，通过将聚合物的末端羟基与二(1-苯并三唑)碳酸酯在有机溶剂中反应。活性酯用来与生物活性剂如蛋白质和肽形成缀合物。

WO99/45964描述了包括生物活性剂和活性水溶性聚合物的缀合物，该聚合物包括聚合物主链，该主链具有至少一个通过稳定键连接聚合物主链的末端，其中至少一个末端包括分枝部分，该分枝部分具有连接分枝部分的近端反应基，其中生物活性剂连接至少一个近端反应基。其他支链聚(乙二醇)描述于WO96/21469中，U.S.专利No.5,932,462描述了用支链PEG分子形成的缀合物，该PEG分子包括具有反应性官能团的分枝末端。利用游离的反应基来与生物活性物质如蛋白质或肽反应，形成聚(乙二醇)和生物活性物质之间的缀合物。U.S.专利No.5,446,090描述了双功能PEG连接物及其在形成每个PEG连接物末端具有肽的缀合物中的用途。

WO99/34833；和WO99/14259，以及U.S.专利No.6,348,558中描述了包括可降解PEG连接物的缀合物，这样可降解的连接物可应用于本发明中。

上述本领域已知的聚合物激活方法可用于本发明形成在此所述支链聚合物的内容中，也可用于这些支链聚合物与其他物质如糖、糖核苷酸等的缀合。

可用于本发明中的示范性聚(乙二醇)分子包括，但不限于，具有以下通式的那些：

其中R⁸是H、OH、NH₂、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的杂烷基，例如，缩醛、OHC-、H₂N-(CH₂)_q-、HS-(CH₂)_q或-(CH₂)_qC(Y)Z¹。指数“e”表示1至2500的整数。指数b、d和q独立地表示0至20的整数。符号Z和Z¹独立地表示OH、NH₂、离去基团，例如，咪唑、p-硝基苯基、HOBT、四唑、卤化物、S-R⁹、活性酯的醇部分；-(CH₂)_pC(Y¹)V或-(CH₂)_pU(CH₂)_sC(Y¹)_v。符号Y表示H(2)、＝O、＝S、＝N-R¹⁰。符号X、Y、Y¹、A¹和U分别表示部分O、S、N-R¹¹。符号V表示OH、NH₂、卤素、S-R¹²、活性酯的醇部分、活性酰胺的胺部分、糖核苷酸和蛋白质。指数p、q、s和v独立地选自0至20整数。符号R⁹、R¹⁰、R¹¹和R¹²独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环烷基和取代或未取代的杂芳基。

另一示范性的实施方案中，聚(乙二醇)分子选自以下：

用于形成本发明缀合物的聚(乙二醇)是直链或支链的。适用于本发明中的支链聚(乙二醇)分子，包括但不限于，通过以下通式所述的那些：

其中，R⁸和R^8′独立地选自以上对于R⁸定义的基团。A¹和A²独立地选自以上对于A¹定义的基团。指数e、f、o和q如上所述。Z和Y如上所述。X¹和X^1′独立地选自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH。

另一示范性实施方案中，支链PEG是基于半胱氨酸、丝氨酸或二-赖氨酸核心。因此，更多的示范性支链PEG包括：

再一实施方案中，分枝PEG部分是基于三-赖氨酸肽。三-赖氨酸可以是单-、二-、三-或四-PEG化的。根据该实施方案的示范性物质具有通式：

其中，e、f和f′独立地选自1至2500的整数；和q、q′和q″独立地选自1至20的整数。

本发明的示范性实施方案中，PEG是m-PEG(5kD、10kD或20kD)。示范性支链PEG物质是丝氨酸-或半胱氨酸-(m-PEG)₂，其中m-PEG是20kD的m-PEG。

如本领域技术人员已知的，本发明中所用的支链聚合物包括上述主题的变体。例如，以上所示的二-赖氨酸-PEG缀合物可以包括三个聚合亚基，结合α-胺的第三个显示为上述结构中未修饰的。相似地，使用三个或四个聚合亚基功能化的三-赖氨酸在本发明范围之内。

根据本发明的特定实施方案包括：

和这些物质的碳酸酯和活性酯，如：

适用于激活用于制备在此所述化合物的直链PEG的其他活性基团或离去基团，包括但不限于以下物质：

用这些和其他物质激活的PEG分子和制备激活PEG的方法列于WO04/083259中。

本领域技术人员将认识到支链聚合物的一个或多个m-PEG臂可以由具有不同末端的PEG部分来替代，例如，OH、COOH、NH₂、C₂-C₁₀-烷基等。此外，通过在α-碳原子和侧链官能团之间插入烷基连接物或除去碳原子来容易地修饰以上结构。因此，“同型”衍生物和高级同系物以及低级同系物在本发明中所用支链PEG的核心范围之内。

通过如以下流程图中所示的方法来容易地制得在此所示的支链PEG物质：

其中，X^a是O或S，且r是1至5的整数。指数e和f独立地选自1至2500的整数。

因此，根据该流程图，将天然或非天然氨基酸与激活的m-PEG衍生物接触，在这种情况中是甲苯磺酸盐，通过将侧链杂原子X^a烷基化来形成1。用反应性m-PEG衍生物将单-功能化的m-PEG氨基酸呈现于N-乙酰化条件，因此装配支链的m-PEG2。如本领域技术人员已知的， 可以用任何合适的离去基团替代甲苯磺酸盐离去基团，例如，卤素、甲磺酸盐、triflate等。相似地，用来将胺酰基化的反应性碳酸酯可以用活性酯来替代，例如，N-羟基琥珀酰亚胺等，或使用脱水剂如二环己基碳化二亚胺、羰二咪唑等来原位激活酸。

示范性实施方案中，修饰基团是PEG部分，然而，任何修饰基团，例如，水溶性聚合物，水不溶性聚合物，治疗剂部分等，可以通过合适的连接引入糖基部分中。通过酶促手段、化学手段或其组合来形成修饰的糖，因此产生修饰的糖。示范性实施方案中，用活性胺在任何位置取代糖，使得可以连接修饰基团，再使得糖可以起酶底物的作用，该酶能够连接修饰糖至G-CSF肽。示范性实施方案中，当半乳糖胺是修饰糖时，胺部分在6-位置连接碳原子。

水溶性聚合物修饰的物质

其中糖部分是用水溶性聚合物修饰的水溶性聚合物修饰的核苷酸糖物质是本发明可用的。示范性修饰糖核苷酸带有通过糖上的胺部分修饰的糖基团。修饰的糖核苷酸，例如，糖核苷酸的糖-胺衍生物，也可用于本发明的方法中。例如，糖胺(无修饰基团)可以通过酶缀合肽(或其他物质)，游离的糖胺部分随后缀合所需的修饰基团。或者，修饰糖核苷酸可以起酶底物的作用，该酶将修饰糖转移至底物上的糖受体，底物例如为肽、糖肽、脂质、糖苷配基、糖脂等。

一实施方案中，其中糖核心是半乳糖或葡萄糖，R⁵是NHC(O)Y。

示范性实施方案中，修饰的糖是基于6-氨基-N-乙酰-糖基部分。如以下所示的，对于N-乙酰半乳糖胺，通过标准方法容易制得6-氨基-糖部分。

以上的流程图中，指数n表示1至2500的整数，优选10至1500，更优选10至1200。符号“A”表示活性基团，例如，卤素、活性酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)的部分、碳酸酯(例如，p-硝基苯基碳酸酯)的部分等。本领域技术人员将认识到通过这个和类似的方法容易制得其他PEG-酰胺核苷酸糖。

另一示范性的实施方案中，酰胺部分由如尿烷或脲的基团替代。

再一实施方案中，R¹是支链的PEG，例如，上述那些物质中的一种。根据该实施方案的说明性化合物包括：

其中，X⁴是键或O。

此外，如上所述，本发明提供了使用直链或支链水溶性聚合物修饰的核苷酸糖形成的肽缀合物。例如，具有以下所示通式的化合物在本发明范围之内：

其中X⁴是O或键。

相似地，本发明提供了使用那些其中6-位置的碳是修饰的修饰糖物质的核苷酸糖形成的肽缀合物：

其中X⁴是O或键。

还提供了包括本发明组合物的肽和糖肽，脂质和糖脂的缀合物。例如，本发明提供了具有以下通式的缀合物：

水不溶性聚合物

另一实施方案中，与上述的那些类似，修饰的糖包括水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。本发明的缀合物还可以包括一个或多个水不溶性聚合物。通过缀合物用作以受控方式传送治疗肽的载体的用 途来说明本发明的这个实施方案。聚合药物传送系统是本领域已知的。参见，例如，Dunn等编辑，POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本领域技术人员将认识到基本上任何已知的药物传送系统适用于本发明的缀合物。

代表性的水不溶性聚合物包括，但不限于，聚膦嗪(polyphosphazine)、聚(乙烯醇)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、polyalkyleneterephthalate、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚尿烷、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯))、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸二乙酯)、聚(乙烯醋酸酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、pluronic和聚乙烯酚及其共聚物。

用于本发明缀合物中的合成的修饰天然聚合物包括，但不限于，烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝基纤维素。特别优选的合成修饰天然聚合物大类中的成员包括，但不限于，甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素醋酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素醋酸丁酸酯、纤维素醋酸邻苯二甲酸酯、羧甲基纤维素、纤维素三醋酸酯、纤维素硫酸钠盐，以及丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物和藻酸。

在此讨论的这些和其他聚合物可以容易地从商业来源获得，如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)，Polysciences(Warrenton，PA.)，Aldrich(Milwaukee，WI)，Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)，或从这些供应商获得的单体使用标准技术来合成。

用于本发明缀合物中的代表性生物可降解聚合物包括，但不限于，聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物、聚(乙烯对苯二酸酯)、聚(丁酸)、 聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-caprolactone)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐类、聚(原酸酯)，及其混合物和共聚物。特别使用的是形成凝胶的组合物，如包括胶原、pluronic等的那些。

用于本发明的聚合物包括“杂合”聚合物，包括在其至少部分结构内具有生物再吸收分子的水不溶性物质。这样聚合物的实例是包括水不溶性共聚物的聚合物，其具有生物再吸收部分，亲水部分和每个聚合物链的多个可交联的官能团。

为了本发明的目的，“水不溶性物质”包括基本上不溶于在水中或含水环境中的物质。因此，尽管共聚合物的特定部分或片段可以是亲水的或甚至是水溶性的，聚合物分子作为整体在水中没有任何实质上可测量的溶解。

为了本发明的目的，术语“生物再吸收分子”包括能够通过身体正常分泌途径代谢或降解和再吸收和/或排除的部分。这样的代谢物或降解产物优选对身体基本上没有毒性。

生物再吸收部分可以是疏水的或亲水的，只要共聚物组合物作为整体没有呈现水溶性。因此，基于聚合物作为整体保持水不溶性的优先性来选择生物再吸收部分。因此，选择生物再吸收部分和亲水部分的相对性质，即，所含官能团的种类和相对比例，来确保有用的生物再吸收组合物保持水不溶性。

示范性的再吸收聚合物包括，例如，合成产生的聚(α-羟基-羧酸)/聚(氧化烯)的再吸收嵌段共聚物(参见，Cohn等，U.S.专利No.4,826,945)。这些共聚物不是交联的且是水溶性的，使得身体可以分泌降解的嵌段共聚物组合物。参见，Younes等，JBiomed.Mater.Res.21：1301-1316(1987)；和Cohn等，J Biomed.Mater.Res.22：993-1009(1988)。

本发明优选的生物再吸收聚合物包括一个或多个组分，选自聚(酯)、聚(羟酸)、聚(内酯)、聚(酰胺)、聚(酯-酰胺)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(膦嗪)、聚(磷酯)、聚(硫酯)、多糖及其混合物。更优选，生物再吸收聚合物包括聚(羟基)酸部分。 聚(羟基)酸中，优选聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。

除了形成体内可吸收的(“生物吸收的”)片段，优选用于本发明方法中的聚合涂层(coating)也可以形成可分泌的和/或可代谢的片段。

高阶共聚物也可以用于本发明中。例如，Casey等，U.S.专利No.4,438,253，1984年3月20日公开，公开了从聚(乙醇酸)和羟基封端的聚(亚烷基二醇)的酯交换作用产生的三-嵌段共聚物。公开了这样的组合物可以用作再吸收的单丝缝合(monofilament suture)。通过将芳香族原碳酸酯如四-p-甲苯基原碳酸酯引入共聚物结构中来控制这样组合物的柔性。

也可以使用基于乳酸和/或乙醇酸的其他聚合物。例如，Spinu，U.S.专利No.5,202,413，1993年4月13日公开，公开了生物可降解多嵌段共聚物，具有聚丙交酯和/或聚乙交酯按次序的嵌段，通过寡聚二醇或二胺残基上的丙交酯和/或乙交酯的开环聚合作用，接着用二-功能化合物如二异氰酸酯、二酰基氯化物或二氯硅烷来延伸链。

可以将本发明中所用涂层的生物再吸收部分设计成水解和/或酶可分解的。为了本发明的目的，“水解可分解的”指的是共聚物尤其是生物再吸收区对水中或含水环境中水解的敏感度。相似地，在此所用的“酶可分解的”指的是共聚物尤其是生物再吸收部分对内源或外源酶分解的敏感度。

当放置于体内时，亲水部分可以加工成可分泌的和/或可代谢的片段。因此，亲水部分可以包括，例如，聚醚、聚烯化氧、多元醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(烷基唑啉)、多糖、碳水化合物、肽、蛋白质及其共聚物和混合物。此外，亲水部分还可以是，例如，聚(亚烷基)氧化物。这样的聚(亚烷基)氧化物可以包括，例如，聚(乙烯)氧、聚(丙烯)氧及其混合物和共聚物。

水凝胶组分的聚合物也可用于本发明中。水凝胶是能够吸收相对大量水的聚合物质。形成水凝胶的化合物实例包括，但不限于，聚丙 烯酸、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、卡拉胶(carrageenan)和其他多糖、羟基亚乙基异丁烯酸(HEMA)，及其衍生物等。产生的水凝胶可以是稳定的、生物可降解的和生物再吸收的。此外，水凝胶组合物可以包括呈现一个或多个这些特性的亚基。

可以通过交联控制其完整性的生物相容水凝胶组合物是已知的且是必定优选用于本发明的方法中。例如，Hubbell等，U.S.专利No.5,410,016，1995年4月25日颁发，和5,529,914，1996年6月25日颁发，公开了水溶性系统，其是交联的嵌段共聚物，具有夹在两个水解不稳定延伸部分之间的水溶性中心嵌段片段。用光可聚合的丙烯酸制剂将这样的共聚物进一步封端。当交联时，这些系统变成水凝胶。这样共聚物的水溶性中心嵌段可以包括聚(乙二醇)；而，水解不稳定延伸部分可以是聚(α-羟酸)，如聚乙醇酸或聚乳酸。参见，Sawhney等，Macromolecules 26：581-587(1993)。

另一优选实施方案中，凝胶是热可逆凝胶。目前优选的是包括成分如、pluronic、胶原、明胶、透明质酸、多糖、聚尿烷水凝胶、聚尿烷-脲水凝胶，及其组合的热可逆凝胶。

另一示范性实施方案中，本发明的缀合物包括脂质体的成分。根据本领域技术人员已知的方法制备脂质体，例如，这样的方法描述于Eppstein等，U.S.专利No.4,522,811，1985年6月11日颁发。例如，可以如下制备脂质体制剂：将合适的脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶解于然后蒸发的无机溶剂中，在容器的表面留下干脂质的薄膜。然后将活性化合物或其药物学上可接受盐的水溶液引入容器中。然后用手将容器涡旋使脂质物质离开容器的侧面并分散脂质聚合体，因此形成脂质体悬浮液。

通过实例提供了上述微粒和制备微粒的方法，且不是用来限定本发明中所用微粒的范围。本领域技术人员将清楚通过不同方法制得的微粒系统可用于本发明中。

以上水溶性聚合物内容中所讨论的结构形式，对于水不溶性聚合物，直链和支链通常都是可用的。因此，例如，半胱氨酸、丝氨酸、 二赖氨酸和三赖氨酸分枝核心可以用两个水不溶性聚合物部分来功能化。用于生产这些物质的方法通常与那些用于生产水溶性聚合物的非常类似。

还可以用PEG部分如聚(乙二醇)(PEG)来提高治疗糖肽的体内半衰期。例如，用PEG化学修饰蛋白质(PEG化)增加它们的分子大小并降低它们的表面和官能团的可接近性，其中每个取决于连接蛋白的PEG的大小。这使得血浆半衰期和蛋白水解稳定性的提高，和免疫原性和肝吸收的降低(Chaffee等，J.Clin.Invest.89：1643-1651(1992)；Pyatak等，Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29：113-127(1980))。已经报道了白细胞间介素-2的PEG化提高了体内抗肿瘤效能(Katre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：1487-1491(1987))和源自单克隆抗体A7的F(ab′)2的PEG化具有提高的肿瘤定位(Kitamura等，Biochem.Biophys.Res.Commun.28：1387-1394(1990))。因此，另一优选实施方案中，通过本发明方法用PEG部分衍生的肽的体内半衰期相对于非衍生肽的体内半衰期提高了。

肽体内半衰期的提高最好表达为该数量中百分比增加的范围。百分比增加范围的下限是约40％、约60％、约80％、约100％、约150％或约200％。范围的上限是约60％、约80％、约100％、约150％，或高于约250％。

示范性实施方案中，本发明提供了PEG化的FSH(图1、图2和图5)。

方法

除了以上讨论的缀合物，本发明提供了制备这些和其他缀合物的方法。因此，再一方面中，本发明提供了在选定部分和G-CSF肽之间形成共价缀合物的方法。此外，本发明提供了将本发明的缀合物靶向身体特定组织或部位的方法。

示范性实施方案中，在PEG部分(或包括PEG部分的酶可转移的糖基部分)和糖基化或非糖基化肽之间形成缀合物。将PEG通过完整糖基连接基团与G-CSF肽缀合，完整糖基连接基团插入G-CSF肽和PEG 部分之间并共价连接两者，或连接PEG非糖基连接物(例如，取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基)构建体。该方法包括将G-CSF肽与含有修饰糖和修饰糖为底物的糖基转移酶的混合物接触。在修饰糖和G-CSF肽之间足以形成共价键的条件下进行反应。修饰糖的糖部分优选选自核苷酸糖、活性糖和既不是核苷酸也不是活性的糖。

通常从头合成受体肽(糖基化的或非糖基化的)，或在原核细胞(例如，细菌细胞，如大肠杆菌)或真核细胞如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞中重组表达。G-CSF肽可以是全长蛋白和片段。此外，G-CSF肽可以是野生型的或突变的肽。示范性实施方案中，G-CSF肽包括将一个或多个N-或O-连接的糖基化位点加入肽序列的突变。

示范性实施方案中，因子XI是O-糖基化的并以下方式用水溶性聚合物功能化。产生具有可获得的氨基酸糖基化位点的肽，或如果是糖基化的，将糖基化部分裁掉来暴露氨基酸。例如，丝氨酸或苏氨酸是α-1N-乙酰氨基半乳糖基化的(GalNAc)，并用唾液酸修饰基团盒将NAc-半乳糖基化的肽唾液酸化，使用ST6GalNAcT1。或者，用核心-1-GalT-1将NAc-半乳糖基化的肽半乳糖基化，且用唾液酸修饰基团盒将产物唾液酸化，使用ST3GalT1。根据该方法的示范性缀合物具有以下的连接：Thr-α-1-GalNAc-β-1，3-Gal-α2，3-Sia^*，其中Sia^* 是唾液酸修饰基团盒。

本发明的方法中，如上所示的，使用多个酶和糖基供体，可以分开进行单个糖基化步骤，或合并成“单罐(single pot)”反应。例如，以上所示的三个酶反应中，GalNAc转移酶、GalT和SiaT及其供体可以合并于单个容器中。或者，可以单独进行GalNAc反应，将GalT和SiaT两者和合适的糖基供体作为单个步骤加入。进行反应的另一种方式包括加入每种酶，顺次加入合适的供体，并在“单罐”形式中进行反应。以上所示每种方法的组合可用于本发明化合物的制备中。

本发明的缀合物中，尤其是糖聚乙二醇化N-连接的聚糖，可以将Sia-修饰基团盒连接α-2，6或α-2，3连接的Gal。

本发明的方法还提供了重组产生的不完全糖基化肽的修饰。本发 明方法中使用修饰糖，可以同时将G-CSF肽进一步糖基化并用例如PEG部分、治疗剂等来衍生。修饰糖的糖部分可以是缀合完全糖基化肽中的合适受体的残基，或具有所需特性的另一个糖部分。

通过本发明方法修饰的G-CSF肽可以是合成的或野生型肽，或它们可以是突变的肽，通过本领域已知的方法生产的，如定点诱变。肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。示范性的N-连接是修饰糖和天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是任何氨基酸除了脯氨酸，是碳水化合物部分和天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一种的存在形成了可能的糖基化位点。O-连接的糖基化指的是一个糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)和羟氨基酸的羟基侧链的连接，羟氨基酸优选丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

例如，一实施方案中，在哺乳动物系统中表达G-CSF并通过唾液酸酶处理的修饰来修(trim)末端唾液酸残基，接着使用ST3Gal3和PEG-唾液酸供体来PEG化。

另一示范性实施方案中，首先用唾液酸酶处理在哺乳动物中表达的G-CSF来修整末端唾液酸残基，然后使用ST3Gal3和PEG-唾液酸供体来PEG化，然后使用ST3Gal3和唾液酸供体来唾液酸化。

还可以用唾液酸酶和半乳糖苷酶处理哺乳动物系统中表达的G-CSF来修整唾液酸和半乳糖残基，然后用半乳糖供体和半乳糖基转移酶来半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供体来PEG化。

再一示范性的实施方案中，首先没有用唾液酸酶来处理G-CSF，而是使用修饰基团-唾液酸盒的唾液酸转移反应和酶如ST3Gal3来糖聚乙二醇化。

再一示范性的实施方案中，G-CSF在昆虫细胞中表达，并在以下的程序中得到修饰：首先使用合适的N-乙酰葡糖胺供体和一个或多个GnT-I、II、IV和V将N-乙酰葡糖胺添加至G-CSF；然后使用PEG-半乳糖的供体和半乳糖基转移酶将G-CSF PEG化。

酵母中产生的G-CSF也可以糖聚乙二醇化。例如，首先用内聚糖酶处理G-CSF来修整糖基，使用半乳糖供体和半乳糖基转移酶来半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供体来PEG化。

将糖基化位点加入肽或其他结构通常通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个糖基化位点来完成。还可以通过在G-CSF肽的序列中引入一个或多个具有-OH基团的物质优选丝氨酸或苏氨酸残基来进行添加(对于O-连接的糖基化位点)。通过突变或通过全部化学合成G-CSF肽来进行添加。优选通过DNA水平的改变来改变G-CSF肽的氨基酸序列，尤其是在预选的碱基突变编码肽的DNA，使得产生的密码子翻译成所需的氨基酸。优选使用本领域已知的方法来进行DNA突变。

示范性实施方案中，通过改组多核苷酸来添加糖基化位点。可以用DNA改组实验方案来调控编码侯选肽的多核苷酸。DNA改组是循环重组和突变的方法，通过相关基因集合的随机片段化来进行，接着通过聚合酶链式反应等方法将片段重新装配。参见，例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature370：389-391(1994)；和U.S.专利No.5,605,793，5,837,458，5,830,721和5,811,238。

本发明还提供了对添加(除去)肽一个或多个选定糖基的方法，此后将修饰糖与肽的至少一个选定糖基缀合。例如，当希望将修饰糖与肽上不存在或不存在所需量的选定糖基缀合时，本实施方案是有用的。因此，将修饰糖结合肽之前，将选定的糖基通过酶或化学连接与G-CSF肽缀合。另一实施方案中，改变糖肽的糖基化模式，在缀合修饰糖之前从糖肽除去碳水化合物残基。参见，例如WO98/31826。

通过化学或酶来完成糖肽上存在的任何碳水化合物部分的添加或除去。优选将多肽变体暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等价化合物来进行化学脱糖基化。该处理使得大多数或全部糖裂解，除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)，同时留下完整的肽。化学脱糖基化描述于Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.118：131(1981)。可以使用各种内-和外- 糖苷酶来完成多肽变体上碳水化合物部分的酶裂解，如Thotakura等，Meth.Enzymol.138：350(1987)中所述的。

通过本领域已知的任何方法来进行糖基部分的化学添加。优选使用在此所示方法的改变来完成糖基部分的酶添加，即用天然糖基单位替代本发明中所用的修饰糖。添加糖部分的其他方法公开于U.S.专利No.5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577中。

选定糖基的示范性连接点包括，但不限于：(a)用于N-和O-糖基化的共有位点；(b)作为糖基转移酶受体的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)游离羧基；(e)游离巯基如半胱氨酸的那些；(f)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些；(g)芳香族残基如苯丙酰胺、酪氨酸或色氨酸的那些；或(h)谷氨酰胺的酰胺基。本发明中所用的示范性方法描述于WO87/05330，1987年9月11日公开，和Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)。

方法

除了以上讨论的缀合物，本发明提供了制备这些和其他缀合物的方法。此外，本发明提供了预防、治疗和改善病状的方法，通过将本发明的缀合物给药于处于产生疾病风险的受试者和患有疾病的受试。

因此，本发明提供了在选定部分之间和G-CSF肽之间形成共价缀合物的方法。

示范性实施方案中，在水溶性聚合物、治疗剂部分、靶向部分或生物分子和糖基化或非糖基化G-CSF肽之间形成缀合物。聚合物、治疗剂部分或生物分子通过糖基连接基团与G-CSF肽缀合，糖基连接基团插入肽和修饰基团(例如，水溶性聚合物)之间并与这两者共价连接。该方法包括将G-CSF肽与含有修饰糖和将修饰糖与底物(例如，肽、糖苷配基、糖脂)缀合的酶例如糖基转移酶的混合物接触。在适于修饰糖和G-CSF肽之间形成共价键的条件下进行反应。

受体G-CSF肽通常从头合成，或在原核细胞(例如，细菌细胞， 如大肠杆菌)或真核细胞如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞中重组表达。G-CSF肽可以是全长蛋白或片段。此外，G-CSF肽可以是野生型或突变的肽。示范性实施方案中，G-CSF肽包括将一个或多个N-或O-连接的糖基化位点加入肽序列的突变。

本发明的方法还提供了重组产生的不完全糖基化G-CSF肽的修饰。许多重组产生的糖蛋白是不完全糖基化的，将具有不理想特性例如免疫原性的碳水化合物残基暴露，通过RES识别。本发明的方法中使用修饰糖，可以将肽同时进一步糖基化并用例如水溶性聚合物、治疗剂等来衍生。修饰糖的糖部分可以是与全部糖基化肽中的受体适当缀合的残基，或另一个具有所需特性的糖部分。

本发明中所用的修饰肽的示范性方法列于WO04/099231、WO03/031464以及其中所列的参考文献中。

示范性实施方案中，本发明提供了制备PEG化G-CSF的方法，该G-CSF包括以下的部分：

其中D是-OH或R¹-L-HN-。符号G表示R¹-L-或-C(O)(C₁-C₆)烷基。R¹是含有直链或支链聚(乙二醇)残基的部分。符号L表示连接物，选自键、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基。通常，当D是OH时，G是R¹-L-，且当G是-C(O)(C₁-C₆)烷基时，D是R¹-L-NH-。本发明的方法包括，(a)将底物G-CSF肽与PEG-唾液酸供体和能够将PEG-唾液酸部分从供体转移至底物G-CSF肽的酶接触。

示范性PEG-唾液酸供体是核苷酸糖，如具有以下通式：

和在适于转移的条件下，将PEG-唾液酸转移至G-CSF肽的氨基酸或糖基上的酶。

一实施方案中，在形成本发明缀合物之前，在宿主细胞中表达底物G-CSF肽。示范性宿主细胞是哺乳动物细胞。另一实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞、植物细胞、细菌或真菌。

在此所示的方法适用于以上部分中所示的每个G-CSF缀合物。

通过本发明的方法修饰的G-CSF肽可以是合成的或野生型肽，或它们可以是突变的肽，通过本领域已知的方法产生的，如定点诱变。肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。示范性N-连接是修饰糖和天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是任何氨基酸除了脯氨酸，是碳水化合物部分和天冬酰胺侧链酶连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中一种的存在形成了可能的糖基化位点。O-连接的糖基化指的是一个糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)和羟氨基酸的羟基侧链的连接，羟氨基酸优选丝氨酸和苏氨酸，尽管也可以使用不常见的或非天然的氨基酸，例如，5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

通常通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个糖基化位点来完成肽或其他结构的糖基化位点添加。还可以在肽序列中引入一个或多个具有-OH基团的物质来进行添加，这种物质优选丝氨酸和苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)。通过突变或通过肽的全部化学合成来进行添加。优选通过DNA水平的改变来改变肽的氨基酸序列，尤其是在预选的碱基突变编码肽的DNA使得产生的密码子翻译成所需的氨基酸。优选使用本领域已知的方法来形成DNA突变。

示范性实施方案中，通过改组多核苷酸来添加糖基化位点。用DNA改组实验方案来调控编码候选肽的多核苷酸。DNA改组是循环重组和突变的方法，通过相关基因集合的随机片段化来进行，接着通过聚合酶链式反应等方法将片段重新装配。参见，例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad Sci.USA 91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；和U.S.专利No.5,605,793，5,837,458，5,830,721和5,811,238。

添加或除去糖基化位点，和添加或除去糖基结构或亚结构的示范性方法详细描述于WO04/099231、WO03/031464和相关的U.S.和PCT申请中。

本发明还使用了对G-CSF肽添加(或除去)一个或多个选定糖基的方法，此后将修饰糖与肽的至少一个选定糖基缀合。例如，当希望将修饰糖和G-CFS肽上不存在或不存在所需量的选定糖基缀合时，这样的技术是有用的。因此，在修饰糖和肽结合之前，通过酶或化学缀合将选定的糖基与G-CSF肽缀合。另一实施方案中，改变糖肽的糖基化模式，在修饰糖缀合之前，从糖肽除去碳水化合物残基。参见，例如WO98/31826。

用于选定糖基的示例连接点包括，但不限于：(a)用于N-连接糖基化的共有位点，和用于O-连接糖基化的位点；(b)作为糖基转移酶受体的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)游离羧基；(e)游离巯基如半胱氨酸的那些；(f)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些；(g)芳香族残基如苯丙酰胺、酪氨酸或色氨酸的那些；或(h)谷氨酰胺的酰胺基。本发明中所用的示范性方法描述于WO87/05330，1987年9月11日公开，和Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)。

将PEG修饰的糖与糖基化的或非糖基化的肽缀合，使用合适的酶来介导缀合。优选，选择修饰供体糖、酶和受体肽的浓度使得糖基化继续进行直至获得所需程度的受体修饰。以下所讨论的考虑事项，同时列于唾液酸转移酶的内容中，通常适用于其他糖基转移酶反应。

使用糖基转移酶来合成所需寡糖结构的多种方法是已知的并通常适用于本发明。示范性方法描述于，例如，WO96/32491，Ito等，PureAppl.Chem.65：753(1993)，U.S.专利No.5,352,670，5,374,541，5,545,553，和共有的U.S.专利No.6,399,336和6,440,703中，在此引入作为参考。

使用单个糖基转移酶或糖基转移酶的组合物来实施本发明。例如，可以使用唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合物。使用多于一种酶的那些实施方案中，优选将酶和底物合并于初始反应混合物中，或第一个酶反应一旦完成或接近完成时将用于第二个酶反应的酶和反应试剂加入反应介质中。通过在单个容器中按次序进行两个酶反应，相对于其中将中间产物分离的方法提高了总产量。此外，减少了过量溶剂和副产品的清除和处理。

优选实施方案中，第一种和第二种酶是糖基转移酶。另一优选实施方案中，一种酶是内糖苷酶。另外的优选实施方案中，使用多于两种酶来装配本发明的修饰糖蛋白。在修饰糖加入肽之前或之后的任何点，使用酶来改变G-CSF肽上的糖结构。

另一实施方案中，本方法使用一种或多种外-或内糖苷酶。糖苷酶通常是突变的，将其改造来形成糖键而不是分裂它们。突变的聚糖酶通常包括氨基酸残基替代活性位点的酸性氨基酸残基。例如，当内聚糖酶是内-H，取代的活性位点残基通常是位置130的Asp、位置132的Glu或其组合。通常用丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺来替代该氨基酸。

突变的酶催化反应，通常通过类似于内聚糖酶水解步骤逆反应的合成步骤。这些实施方案中，糖基供体分子(例如，所需的寡-或单-糖结构)含有离去基团，反应持续进行将供体分子连接蛋白上的GlcNAc残基。例如，离去基团可以是卤素，如氟化物。另一实施方案中，离去基团是Asn或Asn-肽部分。再一实施方案中，糖基供体分子上的GlcNAc残基是修饰的。例如，GlcNAc残基可以包括1，2

唑啉部分。

优选实施方案中，用于产生本发明缀合物的每种酶以催化量存在。特定酶的催化量将根据酶底物的浓度以及反应条件如温度、时间和pH值而改变。在预选的底物浓度和反应条件下测定给定酶的催化量的方法是本领域技术人员已知的。

进行上述过程的温度可以只高于稳定于最敏感酶变性温度的温 度。优选的温度范围是约0℃至约55℃，更优选约20℃至约37℃。另一示例实施方案中，在升高的温度使用耐热酶进行本发明方法的一个或多个部分。

将反应混合物维持足以使受体糖基化的时间，因此形成所需的缀合物。通常在几个小时后检测一些缀合物，通常在24小时或更少时间内获得可收集的量。本领域技术人员将理解反应速率依赖于多个可变因素(例如，酶浓度、供体浓度、受体浓度、温度、溶剂体积)，其对于选定系统是最佳的。

本发明还提供了修饰肽的工业规模生产。如在此所用的，工业规模通常生产至少一克最终的纯化缀合物。

以下的讨论中，通过修饰唾液酸部分和糖基化肽的缀合来举例说明本发明。用PEG标记示例的修饰唾液酸。以下讨论的焦点在于使用PEG-修饰的唾液酸和糖基化的肽是为了说明的清楚性，并不意味着本发明受限于这两个配偶体的缀合。本领域技术人员将理解除了唾液酸讨论通常适用于修饰糖基部分的添加。此外，讨论同样适用于用试剂修饰糖基单体，这些试剂除了PEG包括其他PEG部分、治疗剂部分和生物分子。

酶方法可以用于将PEG化或PPG化的碳水化合物选择性地引至肽或糖肽上。该方法利用含有PEG、PPG或遮掩的反应性官能团的修饰糖，并与合适的糖基转移酶或糖基合酶组合。通过选择形成所需碳水化合物连接的糖基转移酶和使用修饰糖作为供体底物，可以将PEG或PPG直接引至G-CSF肽主链上、糖肽现有的糖基上或已经加入肽的糖基上。

唾液酸转移酶的受体存在于通过本发明方法待修饰的G-CSF肽上，以天然产生的结构或重组、酶或化学放置的结构。合适的受体包括，例如，半乳糖基受体如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GlcNAc、乳糖-N-tetraose、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)，以及本领域技术人员已知的其他受体(参见，例如，Paulson等，J.Biol.Chem.253：5617-5624(1978))。

一实施方案中，唾液酸转移酶的受体存在于体内合成糖肽时待修饰的糖肽上。可以使用所述的方法将这样的糖肽唾液酸化，而不需要糖肽糖基化模式之前的改变。或者，本发明的方法可以用于将不包括合适受体的肽唾液酸化；首先通过本领域技术人员已知的方法将G-CSF肽修饰来包括受体。示范性实施方案中，通过GalNAc转移酶的作用来添加GalNAc残基。

示范性实施方案中，通过将半乳糖残基连接至连接G-CSF肽的合适受体上来装配半乳糖基受体，例如GlcNAc。该方法包括用含有合适量的半乳糖基转移酶(例如，glcβ1，3或galβ1，4)和合适的半乳糖基供体(例如，UDP-半乳糖)的反应混合物来孵育待修饰的G-CSF肽。使反应充分持续进行至完成，或当加入预定量的半乳糖基时终止反应。装配选定糖受体的其他方法是本领域技术人员清楚的。

再一实施方案中，首先将连接糖肽的寡糖“修整(trim)”，全部或部分，来暴露唾液酸酶的受体或可以添加一个或多个合适残基而获得合适受体的部分。酶如糖基转移酶和内糖苷酶(参见，例如，U.S.专利No.5,716,812)可以用于连接和修整反应。

以下的讨论中，通过使用具有连接的PEG部分的修饰糖来举例说明本发明的方法。讨论的焦点是为了说明的清楚性。本领域技术人员将认识到讨论同样与那些其中修饰糖带有治疗剂部分、生物分子等的实施方案相关。

本发明的示范性实施方案中，其中在加入修饰糖之前将碳水化合物残基“修整”，将高甘露糖调整成第一代双触角结构。将带有PEG部分的修饰糖与通过“调整”暴露的一个或多个糖残基缀合。一实施例中，通过与PEG部分缀合的GlcNAc来加入PEG部分。将修饰的GlcNAc连接双触角结构的一个或两个末端甘露糖残基。或者，将未修饰的GlcNAc添加至分枝物质的的一个或两个末端。

另一示范性实施方案中，通过具有半乳糖残基的修饰糖将PEG部分添加至双触角结构的一个或两个末端甘露糖残基上，半乳糖残基与添加至末端甘露糖残基上的GlcNAc残基缀合。或者，可以将未修饰的 Gal添加至一个或两个末端GlcNAc残基上。

再一实施例中，使用修饰的唾液酸将PEG部分添加至Gal残基上。

另一示范性实施方案中，将高甘露糖结构“修整”成从其分枝成双触角结构的甘露糖。一实施例中，通过用聚合物修饰的GlGNAG来添加PEG部分。或者，将未修饰的GlcNAc添加至甘露糖，接着用连接PEG部分的Gal。再一实施方案中，将未修饰的GlcNAc和Gal残基顺次添加至甘露糖，接着是用PEG部分修饰的唾液酸部分。

再一示范性实施方案中，将高甘露糖“修整”成连接第一个甘露糖的GlcNAc。将GlcNAc与带有PEG部分的Gal残基缀合。或者，将未修饰的Gal残基添加至GlcNAc，接着加入用水溶性修饰的唾液酸。再一实施例中，将末端GlcNAc与Gal缀合，并随后用带有PEG部分的修饰岩藻糖将GlcNAc岩藻糖化。

还可以将高甘露糖修整成连接肽Asn的第一个GlcNAc。一实施例中，GlcNAc-(Fuc)_a残基的GlcNAc与带有水溶性聚合物的GlcNAc缀合。另一实施例中，用带有水溶性聚合物的Gal修饰GlcNAc-(Fuc)_a残基的GlcNAc。再一实施方案中，用Gal修饰GlcNAc，接着与带有PEG部分的修饰唾液酸的Gal缀合。

其他示范性实施方案列于共有的U.S.专利申请公开：20040132640；20040063911；20040137557；U.S.专利申请No.10/369,979；10/410,913；10/360,770；10/410,945和PCT/US02/32263中，其中每个在此引入作为参考。

以上所示的实施例提供了在此所述方法效力的说明。使用在此所述的方法，可以“修整”并建立实质上任何所需结构的碳水化合物结构。如上所示可以将修饰糖添加至碳水化合物部分的末端，或可以是肽核心和碳水化合物末端之间的中间产物。

示范性实施方案中，使用唾液酸酶从G-CSF糖肽除去现有的唾液酸，因此暴露全部或大部分的潜在半乳糖基。或者，用半乳糖残基或终止于半乳糖单位的寡糖残基来标记肽或糖肽。半乳糖残基暴露或添加后，使用合适的唾液酸转移酶来添加修饰的唾液酸。该方法总结于 流程图1中。

流程图1

总结于流程图2中的再一方法中，唾液酸上存在遮掩的反应性官能度。遮掩的反应基优选不受用于连接修饰唾液酸和G-CSF条件的影响。修饰唾液酸和G-CSF肽共价连接后，除去遮掩并将G-CSF肽与试剂如PEG来缀合。以特定的方式将试剂与肽缀合，通过与修饰糖基上的未遮掩反应基的反应。

在此所示的任何修饰糖可以与其合适的糖基转移酶一起使用，根据糖肽的寡糖侧链的末端糖(表1)。如上所讨论的，引入PEG化结构需要的糖肽的末端糖可以在表达过程中天然引入或可以使用合适的糖苷酶、糖基转移酶或糖苷酶和糖基转移酶的混合物在表达后来生产。

表1

X＝O，NH，S，CH2，N-(R1-5)2.  Y＝X；Z＝X；A＝X；B＝X.  Q＝H2，O，S，NH，N-R.  R，R1-4＝H，接头-M，M.  M＝PEG，e.g.，m-PEG

再一示范性实施方案中，将UDP-半乳糖-PEG与牛奶β1，4-半乳糖基转移酶反应，因此将修饰的半乳糖转移至合适的末端N-乙酰葡糖胺结构。可以在表达过程中来产生糖肽上的末端GlcNAc残基，如可以在这样的表达系统如哺乳动物、昆虫、植物或真菌中产生，而且根据需要，还可以用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基转移酶处理糖肽来产生。

另一示范性实施方案中，GlcNAc转移酶，如GNT1-5，用来将PEG化-GlcN转移至糖肽上的末端甘露糖残基。再一示范性实施方案中，通过酶从糖肽除去N-和/或O-连接的聚糖结构来暴露随后与修饰糖缀 合的氨基酸或末端糖基。例如，使用内聚糖酶来除去糖肽的N-连接的结构来暴露末端GlcNAc，作为糖肽上的GlcNAc-连接的-Asn。使用UDP-Gal-PEG和合适的半乳糖基转移酶将PEG-半乳糖官能度引至暴露的GlcNAc上。

可替换的实施方案中，将修饰糖直接添加至G-CSF肽主链上，使用已知的将糖基转移至肽主链的糖基转移酶。该示范性实施方案列于流程图3中。实施本发明有用的示范性糖基转移酶包括，但不限于，GalNAc转移酶(GalNAc T1-14)、GlcNAc转移酶、岩藻糖基转移酶、葡糖基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶等。使用该方法使得修饰糖可以直接添加至缺少任何碳水化合物的肽上，或者，添加至现有糖肽上。两种情况中，在肽主链上的特定位置产生修饰糖的添加，如通过糖基转移酶的底物特异性限定的，且不是以随机方式发生的，如使用化学方法的蛋白质肽主链的修饰过程中发生的。可以将试剂的阵列引入缺少糖基转移酶底物肽序列的蛋白质或糖肽中，通过将合适的氨基酸序列工程化引入多肽链中。

流程图3

以上所示的每个示范性实施方案中，在修饰糖和肽缀合后，可以使用一个或多个另外的化学或酶修饰步骤。示范性实施方案中，使用酶(例如，岩藻糖基转移酶)将糖基单位(例如，岩藻糖)添加至连接G-CSF肽的末端修饰糖上。另一实施例中，使用酶反应将修饰糖不能缀合的位点“加帽”。或者，使用化学反应来改变缀合的修饰糖的结构。例如，将缀合的修饰糖与试剂反应，该试剂使修饰糖连接的肽部分的连接稳定或脱稳定。另一实施例中，在缀合肽后，将修饰糖部分脱保护。本领域技术人员将认识到在修饰糖缀合G-CSF肽后的阶段 存在一组可用于本发明方法中的酶和化学方法。修饰糖-肽缀合物的更多详细描述在本发明范围之内。

酶

除了以上形成酰基连接的缀合物内容中所讨论的酶，可以通过使用其他酶的方法来精心设计、修整或另外修饰缀合物的糖基化模式和起始底物(例如，肽、脂质)。使用将糖供体转移至受体的酶来重塑肽和脂质的方法，在DeFrees，WO03/031464 A2中有更详细地讨论，2003年4月17日公开。以下列出了用于本发明中所选酶的概述。

糖基转移酶

糖基转移酶以逐步的方式催化活性糖(供体NDP-或NMP-糖)添加至蛋白质、糖肽、脂质或糖脂或添加至增长中寡糖的非还原性末端。通过转移酶合成N-连接的糖肽，脂质连接的寡糖供体Dol-PP-NAG₂Glc₃Man₉整体转移，接着修整核心。这种情况中，“核心”糖的性质与随后的连接稍微有些不同。大量的糖基转移酶是本领域已知的。

本发明中所用的糖基转移酶可以是任意的，只要其可以利用修饰糖作为糖供体。这样酶的实例包括Leloir途径的糖基转移酶，如半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖基转移酶、木糖基转移酶、葡糖醛酸基转移酶等。

对于涉及糖基转移酶反应的酶促糖合成，可以克隆糖基转移酶，或从任何来源分离。许多克隆的糖基转移酶是已知的，以及它们的多核苷酸序列也是已知的。参见，例如“The WWW Guide To ClonedGlycosyltransferases，”(http：//www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm)。糖基转移酶的氨基酸序列和可以推断出氨基酸序列的编码糖基转移酶的核苷酸序列也可以在各种公众可获得的数据库中找到，包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL和其他的。

本发明方法中可以使用的糖基转移酶包括，但不限于，半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、葡糖基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖基转移酶、葡糖醛酸转移酶、半乳糖醛酸转移酶和寡糖基转移酶。合适的糖基转移酶包括从真核细胞以及原核细胞获得的那些。

可以通过化学合成，通过从合适的细胞或细胞系培养物筛选mRNA的逆转录物，通过从合适的细胞筛选基因组文库，或通过这些方法的组合来获得编码糖基转移酶的DNA。可以使用从糖基转移酶基因序列产生的寡核苷酸探针来进行mRNA或基因组DNA的筛选。用可检测的基团如荧光基团、放射性原子或化学发光基团根据已知方法来标记探针并用于常规的杂交测试中。可替换的方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)方法来获得糖基转移酶基因序列，使用从糖基转移酶基因序列产生的PCR寡核苷酸引物。参见，Mullis等的U.S.专利No.4,683,195和Mullis的U.S.专利No.4,683,202。

可以在用含有编码糖基转移酶的DNA的载体转化的宿主细胞中合成糖基转移酶。将载体用于扩增编码糖基转移酶的DNA和/或表达编码糖基转移酶的DNA。表达载体是可复制的DNA构建体，其中编码糖基转移酶的DNA序列可操作地连接合适的能够影响糖基转移酶在合适宿主中表达的控制序列。这样控制序列的需要将根据所选的宿主和所选的转化方法而改变。通常，控制序列包括转录启动子，控制转录的任意操纵子序列，编码合适mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达控制结构域。所有需要的是在宿主中复制的能力，通常通过复制起点来给予，和有助于转化子识别的选择基因。

示范性实施方案中，本发明使用原核生物的酶。这样的糖基转移酶包括涉及脂寡糖(LOS)合成的酶，脂寡糖通过许多革兰氏阴性细菌产生(Preston等，Critical Reviews in Microbiology 23(3)：139-180(1996))。这样的酶包括，但不限于，如E.coli和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)种属的rfa操纵子的蛋白，其包括β1，6 半乳糖基转移酶和β1，3半乳糖基转移酶(参见，例如，EMBL登录号No.M80599和M86935(E.coli)；EBML登录号No.S56361(S.typhimurium))，葡糖基转移酶(Swiss-Prot登录号No.P25740(E.coli)，β1，2葡糖基转移酶(rfaJ)Swiss-Prot登录号No.P27129(E.coli)和Swiss-Prot登录号No.P19817(S.typhimurium))，β1，2-N-酰葡糖基转移酶(rfaK)(EMBL登录号No.U00039(E.coli))。氨基酸序列已知的其他糖基转移酶包括由操纵子如rfaB编码的那些，操纵子，其已经在生物体中得到表征如肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、E.coli、鼠伤寒沙门氏菌、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、Mycobacterium leprosum，和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操纵子。

还适用于本发明的是涉及产生含有乳糖-N-neotetraose，D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰-D-葡糖氨基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，和P^k血型三糖序列，D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖结构的糖基转移酶，其已经在粘膜病原体淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS中得到鉴定(Scholten等，J.Med.Microbiol.41：236-243(1994))。来自脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的编码涉及这些结构生物合成的糖基转移酶的基因已经从脑膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等，Mol.Microbiol.18：729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突变体F62(Gotshlich，J.Exp.Med.180：2181-2190(1994))中得到鉴定。在脑膜炎奈瑟氏球菌中，由三个基因lgtA、lgtB和lgE构成的基因座，编码在乳糖-N-neotetraose链中添加最后三个糖需要的糖基转移酶(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271：19166-73(1996))。最近证明了lgtB和lgtA基因产物的酶活性，对他们提出的糖基转移酶功能提供了第一个直接证据(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271(45)：28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中，存在两个另外的基因，lgtD，将β-D-GalNAc添加至乳糖 -N-neotetraose结构的末端半乳糖的3位置，和lgtG，将末端α-D-Gal添加至截短的LOS的乳糖元件上，因此形成P^k血型抗原结构(Gotshlich(1994)，上文)。脑膜炎奈瑟氏球菌中，分离的免疫型L1也表达P^k血型抗原并已经显示出携带lgtC基因(Jennings等，(1995)，上文)。奈瑟氏球菌糖基转移酶和相关基因还描述于USPN5,545,553(Gotschlich)中。来自幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的α1，2-岩藻糖基转移酶和α1，3-岩藻糖基转移酶的基因也已经得到表征(Martin等，J.Biol.Chem.272：21349-21356(1997))。还可用于本发明中的是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的糖基转移酶(参见，例如，http：//afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf一42.html)。

岩藻糖基转移酶

一些实施方案中，本发明方法中所用的糖基转移酶是岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶是本领域技术人员已知的。示范性岩藻糖基转移酶包括将GDP-岩藻糖的L-岩藻糖转移至受体糖羟基位置的酶。将非核苷酸糖转移至受体的岩藻糖基转移酶也可用于本发明中。

一些实施方案中，受体糖是，例如，寡糖糖苷中Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基团的GlcNAc。用于该反应的合适岩藻糖基转移酶包括Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)，其首先是从人乳中得到表征的(参见，Palcic等，Carbohydrate Res.190：1-11(1989)；Prieels等，J.Biol.Chem.256：10456-10463(1981)；和Nunez等，Can.J.Chem.59：2086-2095(1981))和人血清中发现的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α岩藻糖基转移酶(FTIV、FTV、FTVI)。FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，唾液酸α(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβ岩藻糖基转移酶，也已经得到了表征。重组形式的Galβ(1→3，4)GlcNAc β-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶也已经得到了表征(参见，Dumas等，Bioorg.Med.Letters1：425-428(1991) 和Kukowska-Latallo等，Genes and Development 4：1288-1303(1990))。其他示例岩藻糖基转移酶包括，例如，α1，2岩藻糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.69)。可以通过Mollicone等，Eur.J.Biochem.191：169-176(1990)或U.S.专利No.5,374,655中所述的方法进行酶促岩藻糖基化。用于产生岩藻糖基转移酶的细胞还包括用于合成GDP-岩藻糖的酶系统。

半乳糖基转移酶

另一组实施方案中，糖基转移酶是半乳糖基转移酶。示范性半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，参见，例如Dabkowski等，Transplant Proc.25：2921(1993)和Yamamoto等，Nature 345：229-233(1990)，牛(GenBank j04989，Joziasse等，J.Biol.Chem.264：14290-14297(1989)，鼠(GenBank m26925；Larsen等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 86：8227-8231(1989))，猪(GenBank L36152；Strahan等，Immunogenetics 41：101-105(1995))。另一种合适的α1，3半乳糖基转移酶是涉及血型B抗原合成的(EC2.4.1.37，Yamamoto等，J.Biol.Chem.265：1146-1151(1990)(人))。再一示范性半乳糖基转移酶是核心Gal-T1。

还适用于本发明方法中的是β(1，4)半乳糖基转移酶，包括，例如，E.C.2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183：211-217(1989))，人(Masri等，Biochem.Biophys.Res.Commun.157：657-663(1988))，鼠(Nakazawa等，J.Biochem.104：165-168(1988)，以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC2.4.1.45，Stahl等，J.Neurosci.Res.38：234-242(1994))。其他合适的半乳糖基转移酶包括，例如，α1，2半乳糖基转移酶(来自，例如，Schizosaccharomyces pombe，Chapell等，Mol.Biol.Cell 5：519-528(1994))。

唾液酸转移酶

唾液酸转移酶是另一种可用于本发明重组细胞和反应混合物中的糖基转移酶。产生重组唾液酸转移酶的细胞还将产生CMP-唾液酸，其是唾液酸转移酶的唾液酸供体。适用于本发明中的唾液酸转移酶实例包括ST3Gal III(例如，大鼠或人ST3Gal III)，ST3Gal IV，ST3GalI，ST3Gal II，ST6Gal I，ST3Gal V，ST6Gal II，ST6GalNAc I，ST6Gal NAcII和ST6Gal NAc III(在此所用的唾液酸转移酶命名描述于Tsuji等，Glycobiology 6：v-xiv(1996))中。示范性α(2，3)唾液酸转移酶称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)，将唾液酸转移至Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原性末端Gal。参见，Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.256：3159(1981)；Weinstein等，J.Biol.Chem.257：13845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.267：21011(1992)。另一示范性α2，3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.4)将唾液酸转移至二糖或糖苷的非还原性末端Gal。参见，Rearick等，J.Biol.Chem.254：4444(1979)和Gillespie等，J.Biol.Chem.267：21004(1992)。更多的示范性酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾液酸转移酶(参见，Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。

优选，对于糖肽的碳水化合物的糖基化，唾液酸转移酶将能够将唾液酸转移至序列Galβ1，4GlcNAc-，全部唾液酸化碳水化合物结构上末端唾液酸之下的最常见的倒数第二的序列(参见，表2)。

表2：使用Galβ1，4GlcNAc序列作为受体物质的唾液酸转移酶 

唾液酸转移酶	来源	形成的序列	参考文献
				ST6Gal I	哺乳动物	NeuAcα2，6Galβ1，4GlCNAc-	1
ST3Gal III	哺乳动物	NeuAcα2，3Galβ1，4GlCNAc-  NeuAcα2，3Galβ1，3GlCNAc-	1
				ST3Gal IV	哺乳动物	NeuAcα2，3Galβ1，4GlCNAc-  NeuAcα2，3Galβ1，3GlCNAc-	1
ST6Gal II	哺乳动物	NeuAcα2，6Galβ1，4GlCNA
				ST6Gal II	光合细菌	NeuAcα2，6Galβ1，4GlCNAc-	2
ST3Gal V	脑膜炎奈瑟氏球菌  淋病奈瑟氏球菌	NeuAcα2，3Galβ1，4GlCNAc-	3

1)Goochee等，Bio/Technology 9：1347-1355(1991)

2)Yamamoto等，J.Biochem.120：104-110(1996)

3)Gilbert等，J.Biol.Chem.271：28271-28276(1996)

用于所述方法中的唾液酸转移酶的实例是ST3GalIII，其也称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)。该酶催化唾液酸转移至Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal(参见，例如，Wen等，J.Biol.Chem.267：21011(1992)；Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.256：3159(1991)并担负糖肽中连接天冬酰胺的寡糖的唾液酸化。唾液酸通过两个糖之间α-连接的形成连接Gal。糖之间的键(连接)是在NeuAc的2-位置和Gal的3位置之间。可以从大鼠肝脏(Weinstein等，J. Biol.Chem.257：13845(1982)；人cDNA(Sasaki等，(1993)J.Biol.Chem.268：22782-22787；Kitagawa & Paulson(1994)J.Biol.Chem.269：1394-1401)和基因组(Kitagawa等(1996)J.Biol.Chem.271：931-938)中分离该特定的酶。DNA序列是已知的，有助于通过重组表达来产生该酶。优选的实施方案中，所述的唾液酸化方法使用大鼠ST3Gal III。

本发明中所用的其他示范性唾液酸转移酶包括从空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)中分离的那些，包括CST-I和CST-II和形成α(2，3)连接的那些。参见，例如，WO99/49051。

列于表2中的其他那些唾液酸转移酶，也可用于经济和有效的大规模方法中来用于商业上重要糖肽的唾液酸化。作为发现这些其他酶用途的简单测试，将每种酶的各种含量(1-100mU/mg蛋白质)与asialo-α₁AGP(1-10mg/ml)反应来比较目标唾液酸转移酶将糖肽唾液酸化的能力，相对于牛ST6Gal I、ST3Gal III或两种唾液酸转移酶。或者，从肽主链酶释放的其他糖肽或N-连接的寡糖可以用来替代asialo-α₁AGP来用于该评价。具有比ST6Gal I更有效的将糖肽的N-连接的寡糖唾液酸化能力的唾液酸转移酶可用于肽唾液酸化的大规模方法中。

这些和另外的唾液酸转移酶列于图11中，是用于将在此所示的修 饰唾液酸物质和未修饰的唾液酸转移至受体的唾液酸转移酶的表。

GalNAc转移酶

N-乙酰半乳糖胺基转移酶可用于实施本发明，尤其是用于结合GalNAc部分和肽的O-连接糖基化位点的氨基酸。合适的N-乙酰半乳糖胺基转移酶包括，但不限于，α(1，3)N-乙酰半乳糖胺基转移酶、β(1，4)N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.267：12082-12089(1992)和Smith等，J.Biol.Chem.269：15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Homa等，J.Biol.Chem.268：12609(1993))。

通过基因工程从克隆的基因生产蛋白质如酶GalNAc TI-XX是公知的。参见，例如，U.S.专利No.4,761,371。一种方法包括收集足够的样品，然后通过N-端测序来测定酶的氨基酸序列。然后将该信息用于分离编码全长(膜结合)转移酶的cDNA克隆，该转移酶在昆虫细胞系Sf9中表达时使得全部活性的酶合成。然后测定酶的受体特异性，使用16个不同蛋白质中围绕已知糖基化位点的氨基酸的半定量分析，接着合成肽的体外糖基化研究。该工作已经证明特定氨基酸残基在糖基化肽片段中过量存在，且围绕糖基化丝氨酸和苏氨酸残基的特定位置中的残基比其他的氨基酸部分对受体效率具有更显著的影响。

结合细胞的糖基转移酶

另一实施方案中，本发明方法中所用的酶是结合细胞的糖基转移酶。尽管许多可溶性糖基转移酶是已知的(参见，例如，U.S.专利No.5,032,519)，当结合细胞时糖基转移酶通常是膜结合的形式。迄今研究的许多膜结合酶被认为是内在蛋白质；即，通过超声它们不从膜释放出来并需要去污剂来用于溶解。已经在脊椎动物和无脊椎动物细胞的表面上鉴定了表面糖基转移酶，也已经认识到这些表面转移酶在生理条件下保持催化活性。然而，更多已知的细胞表面糖基转移酶的功能是关于胞内识别的(Roth，MOLECULAR APPROACHES to SUPPACELLULAR PHENOMENA，1990)。

已经形成了方法来改变细胞表达的糖基转移酶。例如，Larsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8227-8231(1989)，报道了基因方法来分离克隆的cDNA序列，该序列决定细胞表面寡糖结构和它们的同源糖基转移酶的表达。将从已知表达UDP-半乳糖：β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖基转移酶的鼠细胞系分离的mRNA产生的cDNA文库转化进COS-1细胞中。然后培养转化的细胞并测试α1-3半乳糖基转移酶活性。

Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2713-2717(1992)公开了将β-乳糖酶锚定大肠杆菌外表面的方法。产生由(i)外膜蛋白的信号序列，(ii)外膜蛋白的跨膜部分，和(iii)完全成熟的β-乳糖酶序列组成的三部分融合来形成结合活性表面的β-乳糖酶分子。然而，Francisco方法只限于原核细胞系统并如作者所认识的，对于恰当的功能化需要完整的三部分融合。

磺基转移酶

本发明还提供了包括硫酸化分子的肽的生产方法，包括，例如硫酸化的多糖如肝素、硫酸乙酰肝素、卡拉胶(carragenen)和相关的化合物。合适的磺基转移酶包括，例如，软骨素-6-磺基转移酶(Fukuta等，J.Biol.Chem.270：18575-18580(1995)描述的鸡cDNA；GenBank登录号No.D49915)，葡糖胺聚糖-N-乙酰葡糖胺N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶1(Dixon等，Genomics 26：239-241(1995)；UL18918)，和葡糖胺聚糖N-乙酰葡糖胺N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶2(Orellana等，J.Biol.Chem.269：2270-2276(1994)和Eriksson等，J.Biol.Chem.269：10438-10443(1994)描述的鼠cDNA；GenBank登录号No.U2304描述的人cDNA)。

糖苷酶

本发明还包括使用野生型和突变的糖苷酶。已经证明突变的β- 半乳糖苷酶通过α-糖基氟化物和半乳糖基受体分子的连接来催化二糖的形成。(Withers，U.S.专利No.6,284,494；2001年9月4日颁发)。本发明中所用的其他糖苷酶包括，例如，β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-乙酰氨基葡糖苷酶、β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、β-木糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纤维素酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖-氨基糖苷酶、α-木糖苷酶、α-岩藻糖苷酶和神经氨酸酶/唾液酸酶。

固定化酶

本发明还提供了使用固定于固体和/或可溶支持物的酶。示范性实施方案中，提供了根据本发明的方法通过完整糖基连接物缀合PEG的糖基转移酶。将PEG-连接物-酶缀合物任意地连接固体支持物。在本发明方法中使用固体支持的酶简化了反应混合物的工作和反应产物的纯化，而且使得酶容易回收。在本发明方法中使用糖基转移酶缀合物。酶和支持物的其他组合是本领域技术人员清楚的。

融合蛋白

另一示范性实施方案中，本发明的方法使用具有多于一种涉及所需糖肽缀合物合成的酶活性的融合蛋白。融合多肽可以包括例如，结合辅酶催化活性结构域的糖基转移酶的催化活性结构域。辅酶催化结构域可以，例如，催化作为糖基转移酶供体的核苷酸糖形成中的步骤，或催化涉及糖基转移酶循环的反应。例如，将编码糖基转移酶的多核苷酸符合读框地连接编码涉及核苷酸糖合成的酶的多核苷酸。然后所得到的融合蛋白不仅能催化核苷酸糖的合成，而且能将糖部分转移至受体分子。融合蛋白可以是两种或多种循环酶连接成一个可表达的核苷酸序列。另一实施方案中，融合蛋白包括两种或多种糖基转移酶的催化活性结构域。参见，例如，5,641,668。使用各种合适的融合蛋白 可以容易地设计并制造本发明的修饰糖肽(参见，例如，PCT专利申请PCT/CA98/01180，其于1999年6月24日以WO99/31224公开)。

修饰糖的制备

通常，通过使用反应基将糖部分或糖部分-连接物盒和PEG或PEG-连接物盒基团连接在一起，反应基通常通过连接过程转化成新的有机官能团或非反应性物质。将糖反应性官能团定位于糖部分的任何位置。本发明实施中所用的反应基和反应类别通常是生物缀合物化学领域中公知的那些。通常优选的具有反应性糖部分的可获得反应类型是在相对温和的条件下进行的那些。这些包括，但不限于亲核取代(例如，胺和具有酰基卤、活性酯的醇反应)，亲电取代(例如，烯胺反应)和碳-碳和碳-杂原子重键的添加(例如，Michael反应，Diels-Alder加成)。这些和其他有用的反应描述于，例如，March，ADVANCED ORGANICCHEMISTRY，第3版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等，MODIFICATION OF PROTEINS；Advancesin Chemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。

附着于糖核或修饰基团的有用反应性官能团包括，但不限于：

(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酸性卤化物、酰基咪唑、硫酯、p-硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和脂肪族酯。

(b)羟基，其可以转化成例如，酯、醚、醛等。

(c)卤素烷基，其中卤化物之后可以用亲核基团替代，如胺、羧酸盐阴离子、硫醇阴离子、负碳离子，和醇盐离子，因此在卤素原子的官能团形成新基团的共价连接；

(d)亲二烯体基团，其能够参与Diels-Alder反应，如马来酰亚胺基；

(e)醛或酮基，使得随后可以通过羰基衍生物如亚胺、腙、缩氨 基脲或肟的形成来衍生，或通过这样的机理如Grignard添加或烷基锂添加；

(f)磺酰卤化物基团，用于随后与胺反应，例如形成磺胺；

(g)硫醇基，其可以，例如，转化成二硫化物或与酰基卤反应；

(h)胺或巯基，其可以，例如，酰基化、烷基化或氧化；

(i)烯烃，其可以接受，例如，环加、酰基化、Michael加成等；和

(j)环氧化物，其可以与，例如，胺和羟基化合物反应。

选择反应性官能团使得它们没有参与或干扰装配反应性糖核或修饰基团必需的反应。或者，通过保护基的存在防止反应性官能团参与反应。本领域技术人员理解怎样去保护特定的官能团使得其不会干扰所选择的一套反应条件。例如，有用的保护基，参见，例如，Greene等，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley & Sons，New York，1991。

以下的讨论中，列出了本发明实施中所用的多种修饰糖的特定实例。示范性实施方案中，将唾液酸衍生物用作连接修饰基团的糖核。关于唾液酸衍生物讨论的焦点只是为了说明的清楚性，并不构成本发明范围的限制。本领域技术人员将认识到以使用唾液酸作为实例所示的类似方式可以激活和衍生多种其他糖部分。例如，可获得多种方法来用于修饰半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖来命名一些通过本领域已知方法容易修饰的糖物质。参见，例如，Elhalabi等，Curr.Med.Chem.6：93(1999)；和Schafer等，J.Org.Chem.65：24(2000))。

示范性实施方案中，通过本发明方法修饰的G-CSF肽是在哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)或在转基因动物中产生的糖肽，并因此含有N-和/或O-连接的不完全唾液酸化寡糖链。缺乏唾液酸并含有末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可以PEG化、PPG化或用修饰的唾液酸另外修饰。

流程图4中，氨基糖苷1，用受保护氨基酸(例如，甘氨酸)衍生物的活性酯处理，将糖胺残基转化成相应的受保护氨基酸酰胺加合物。用醛缩酶处理加合物来形成α-羟基羧酸酯2。通过CMP-SA合成酶的作用将化合物2转化成相应的CMP衍生物，接着CMP衍生物的催化氢化产生化合物3。通过甘氨酸加合物形成引入的胺用作PEG连接的位置，通过化合物3与活性PEG或PPG衍生物(例如，PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-p-硝基苯基)的反应，各自产生物质如4或5。

流程图4

表3列出了用PEG部分衍生的糖单磷酸酯的代表性实例。通过流程图4的方法制备表3的特定化合物。通过本领域已知的方法制备其他衍生物。参见，例如，Keppler等，Glycobiology 11：11R(2001)；和Charter等，Glycobiology 10：1049(2000))。其他胺反应性PEG和PPG类似物是可购得的，或通过本领域技术人员容易获得的方法来制备。

表3

实施本发明中所用的修饰糖磷酸酯可以在其他位置以及以上所示的那些位置被取代。目前优选的唾液酸取代列于以下的通式中： 

其中X是连接基团，其优选选自-O-、-N(H)-、-S、-CH₂-，和N(R)₂， 其中每个R独立地选自R¹-R⁵。符号Y、Z、A和B各自表示选自以上对于X相同的基团。X、Y、Z、A和B各自独立地选择，因此，它们可以是相同的或不同的。符号R¹、R²、R³、R⁴和R⁵表示H、PEG部分、治疗剂部分、生物分子或其他部分。或者，这些符号表示结合PEG部分、治疗剂部分、生物分子或其他部分的连接物。

连接在此所公开缀合物的示范性部分包括，但不限于，PEG衍生物(例如，酰基-PEG、酰基-烷基-PEG、烷基-酰基-PEG-氨甲酰基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(例如，酰基-PPG、酰基-烷基-PPG、烷基-酰基-PPG氨甲酰基-PPG、芳基-PPG)、治疗剂部分、诊断剂部分、甘露糖-6-磷酸酯、肝素、类肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸酯、唾液酸Lewis X、FGF、VFGF、蛋白质、软骨素、角质素、皮肤素、清蛋白、整联蛋白、触角寡糖、肽等。将各种修饰基团缀合糖部分的方法是本领域技术人员容易获得的(POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY：BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS，J.MiltonHarris编辑，Plenum Pub.Corp.，1992；POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS，J.Milton Harris编辑，ACS Symposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等编辑，POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEM，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。

连接基团(交联基团)

本发明方法中所用的修饰糖的制备包括PEG部分和糖残基的连接，优选，形成稳定的加合物，其是糖基转移酶的底物。因此，通常优选使用连接物，例如通过PEG和糖部分反应形成的，用交联剂来缀合PEG和糖。可以用于连接修饰基团和碳水化合物部分的示范性双功能化合物包括，但不限于，双功能聚(乙二醇)、聚酰胺、聚醚、聚酯等。用于连接碳水化合物和其他分子的一般方法在文献中是已知的。 参见，例如，Lee等，Biochemistry 28：1856(1989)；Bhatia等，Anal.Biochem.178：408(1989)；Janda等，J.Am.Chem.Soc.112：8886(1990)和Bednarski等，WO92/18135。以下的讨论中，以对新生修饰糖的糖部分良性的来处理反应基。讨论的焦点是为了说明的清楚性。本领域技术人员将认识到讨论也与修饰基团上的反应基相关。

使用各种试剂来修饰具有分子内化学交联的修饰糖组分(对于交联剂和交联方法的评述参见：Wold，F.，Meth.Enzymol.25：623-651，1972；Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，ENZYMES AS DRUGS.(Holcenberg和Roberts编辑)pp.395-442，Wiley，New York，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91：580-609，1983；Mattson等，Mol.Biol.Rep.17：167-183，1993，所有在此引入作为参考)。优选的交联剂源自各种零长、同型-双功能和异-双功能的交联剂。零-长交联剂包括不用外来物质的引入而直接连接两个内在化学基团。催化二硫键形成的试剂属于这类。另一实例是诱导羧基和伯氨基缩合形成酰胺键的试剂，如碳二亚胺、氯甲酸乙酯、Woodward′s试剂K(2-乙基-5-苯基异

唑

-3′-磺酸盐)和羰二咪唑。除了这些化学试剂，酶谷氨酰胺转移酶(谷氨酰-肽γ-谷氨酰转移酶；EC2.3.2.13)可以用作零-长交联剂。该酶催化在蛋白质结合的谷氨酰残基的氨甲酰基团的酰基转移反应，通常使用伯氨基作为底物。优选的同型-和异-双功能试剂各自含有两个相同或两个不同的位点，其对于氨基、巯基、胍基、吲哚或非特异性基团是反应性的。

G-CSF缀合物的纯化

重折叠不溶G-CSF

在细菌中表达的许多重组蛋白质表达为细菌内含体中的不溶聚合体。内含体是发现于细菌的细胞质和周质空间的蛋白质沉积物。(参见，例如，Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207(2001))。重组G-CSF蛋白质在细菌内含体中表达，并在此提供了重折叠这些蛋白质来产生活性G-CSF蛋白质的方法。

A.重折叠活性G-CSF的条件

为了从细菌细胞产生活性G-CSF蛋白质，在细菌内含体中表达G-CSF蛋白质，将细菌收集、裂解，并分离和洗涤内含体。一实施方案中，进行三次洗涤，第一次洗涤在pH6.0至9.0的缓冲液中；单价盐，例如，氯化钠；非离子去污剂，例如，Triton X-100；离子去污剂，例如，脱氧胆酸钠；和EDTA；第二次洗涤在无去污剂的缓冲液中，第三次洗涤在H₂O中。然后溶解内含体中的蛋白质。使用变性剂(胍基氯化物(guanidiniunl chloride)和脲)；极端的pH；或去污剂或这些的任意组合来进行溶解。一实施方案中，使用5-6M的胍基HCl或脲来溶解GCSF。另一实施方案中，加入DTT。

溶解后，从GCSF蛋白混合物中除去变性剂。可以通过各种方法来进行变性剂的除去，包括稀释成重折叠缓冲液-或缓冲液交换方法。缓冲液交换方法包括透析、渗滤、凝胶过滤和将蛋白质固定于固体支持物上。(参见，例如，Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-107(2001))。可以结合上述任意的方法来除去变性剂。

通过加入含有氧化还原偶(redox couple)的重折叠缓冲液来促进GCSF蛋白质中二硫键的形成。氧化还原偶包括还原的和氧化的谷胱甘肽((-JSF-I/GSSG)、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺、DTT/GSSG和DTE/GSSG。(参见，例如，Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207(2001))。一实施方案中，氧化还原偶是比例为10∶1的GSH/GSSG。

可以在例如pH6.0至10.0的缓冲液中进行重折叠。重折叠缓冲液可以包括其他的添加剂来提高重折叠，例如，L-精氨酸(0.4-1M)；PEG；低浓度的变性剂，如脲(1-2M)和胍基氯化物(0.5-1.5M)；和去污剂(例如，Chaps、SDS、CTAB、月桂基麦芽苷、Tween80和TritonX-100)。

重折叠后，将GCSF蛋白质透析来除去氧化还原偶或其他不需要的缓冲液成分。一实施方案中，使用包括醋酸钠、甘油和非离子去污剂如Tween-80的缓冲液来进行透析。透析后，可以将GCSF蛋白质进一步纯化，和/或通过离子交换层析浓缩。一实施方案中，使用了SP-琼 脂糖阳离子交换树脂。

本领域技术人员将认识到当重折叠蛋白质具有可检测生物活性时，蛋白质已经得到了正确的重折叠。对于GCSF蛋白质，可以使用各种方法来测量生物活性。例如，生物活性GCSF蛋白质是O-连接糖基化的底物，描述于U.S.专利申请60/535284，2004年1月8日申请；60/544411，2004年2月12日申请；和代理摘要编号019957-018820US，2004年2月20日申请，其中每个在此引入作为参考，用于所有目的。还可以使用大鼠中的细胞增殖测试或白细胞(WBC)测试来测量GCSF蛋白质活性。(也描述于U.S.专利申请60/535284，2004年1月8日申请；60/544411，2004年2月12日申请；和代理摘要编号019957-018820US，2004年2月20日申请；其中每个在此引入作为参考，用于所有目的)。可以在重折叠GCSF蛋白质的O-连接糖基化之前或之后进行增殖测试和WBC测试。

分离本发明缀合物的其他方法

或者，可以使用上述方法产生的产物而不需要纯化。然而，通常优选回收产物。可以使用用于回收糖基化糖的标准、公知技术如薄或厚层色谱、柱层析、离子交换层析或膜过滤。优选使用膜过滤，更优选使用反相渗透膜，或一个或多个用于回收的柱层析技术，如下文中和在此所引用的文献中所讨论的。例如，可以使用其中膜具有分子量截留约3000至10000的膜过滤来除去蛋白质如糖基转移酶。然后可以使用纳滤(nanofiltration)或反相渗透来除去盐和/或纯化产物糖(参见，例如，WO98/15581)。纳滤膜是一种使单价盐通过但留住多价盐和大于约100至约2,000道尔顿的不带电荷溶质的反相渗透膜，取决于所用的膜。因此，通常的应用中，通过本发明方法制得的糖将留在膜中而杂质盐将通过。

如果修饰的糖蛋白是胞内产生的，在第一步，除去颗粒碎片，宿主细胞或裂解的片段，例如通过离心或超滤；任意地，用可购得的蛋白质浓缩滤器将蛋白质浓缩，接着通过一个或多个步骤从其他杂质中 分离多肽变体，这些步骤选自亲和免疫层析、离子交换柱分离(例如，在二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或硫代丙基的基质上)、Blue-琼脂糖上的层析、CM Blue-琼脂糖、MONO-Q、MONO-S、扁豆凝集素-琼脂糖、WGA-琼脂糖、Con A-琼脂糖、醚Toyopearl、丁基Toyopearl、苯基Toyopearl或蛋白质A琼脂糖、SDS-PAGE层析、二氧化硅层析、层析焦聚、反相HPLC(例如，具有附加脂族基的硅胶)、使用例如Sephadex分子筛的凝胶过滤或大小排阻层析、选择性结合多肽柱上的层析和乙醇或硫酸铵沉淀。

通常将培养物中产生的修饰糖肽分离，通过从细胞、酶等的初始提取，接着一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或大小排阻层析步骤。此外，通过亲和层析纯化修饰糖蛋白。最后，使用HPLC用于最后的纯化步骤。

蛋白酶抑制剂，例如，甲基磺酰氟化物(PMSF)可以包括于之前任何步骤中来抑制蛋白水解和可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。

另一实施方案中，首先浓缩产生本发明修饰糖肽系统的上清液，使用可购得的蛋白浓缩滤器，例如，Amicon或Milllipore Pellicon超滤装置。浓缩步骤后，将浓缩物施加至合适的纯化基质。例如，合适的亲和基质可以包括肽的配体、凝集素或结合合适支持物的抗体分子。或者，可以使用阴离子树脂，例如，具有附着DEAE基团的基质或底物。合适的基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白质纯化中常用的其他类型。或者，可以使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括含有磺代丙基或羧甲基的各种不溶性基质。特别优选磺代丙基。

最后，使用一个或多个RP-HPLC步骤来进一步纯化多肽变体组合物，这些步骤使用疏水RP-HPLC介质，例如，具有附着甲基或其他脂族基的硅胶。可以以各种组合来使用之前纯化步骤的一些或全部来提供均一的修饰糖蛋白。

由大规模发酵得到的本发明的修饰糖肽可以通过类似于Urdal 等，J.Chromatog.296：171(1984)中所公开的那些方法来纯化。该参考文献描述了两个顺次的RP-HPLC步骤用于在制备性HPLC柱上纯化重组人IL-2。或者，可以使用如亲和层析的技术来纯化修饰的糖蛋白。

药物组合物

另一方面中，本发明提供了药物组合物。该药物组合物包括药物学上可接受的稀释剂和非天然产生的PEG部分、治疗剂部分或生物分子与糖基化或非糖基化肽之间的共价缀合物。通过插入G-CFS肽和聚合物、治疗剂部分或生物分子之间并共价连接两者的完整糖基连接基团将聚合物、治疗剂部分或生物分子与G-CSF肽缀合。

本发明的药物组合物适用于各种药物传送系统中。本发明中所用的合适制剂可在Remington′s Pharmaceutical Science，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)中找到。对于药物传送方法的简述，参见，Langer，Science 249：1527-1533(1990)。

可以配制药物组合物用于任何合适的给药方式，给药方式包括，例如，局部、口服、鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内给药。对于非肠道给药，如皮下注射，载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服给药，可以使用上述载体中的任一种或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。还可以使用生物可降解微球体(例如，聚乳酸酯聚甘醇酸酯)作为本发明药物组合物的载体。合适的生物可降解的微球体公开于，例如，U.S.专利No.4,897,268和5,075,109中。

通常，将药物组合物非肠道给药，例如，静脉内。因此，本发明提供了用于非肠道给药的组合物，其包括溶解或悬浮于可接受载体中的化合物，载体优选为含水载体，例如，水、缓冲的水、盐水、PBS等。组合物可以包含接近生理条件需要的药物学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去污剂等。

可以通过常规灭菌技术将这些组合物灭菌，或可以无菌过滤。可 以将所得到的水溶液包装，按原状使用或冻干，在给药前与无菌含水载体组合冻干的制剂。制剂的pH通常为3至11，更优选5至9，最优选7至8。

一些实施方案中，本发明的糖肽可以掺入标准囊形成脂质形成的脂质体中。可获得各种方法来制备脂质体，如描述于，例如，Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，U.S.专利No.4,235,871，4,501,728和4,837,028。使用各种靶向剂(例如，本发明的唾液酸半乳糖苷)来靶向脂质体是本领域公知的(参见，例如，U.S.专利No.4,957,773和4,603,044)。

可以使用结合靶向剂和脂质体的标准方法。这些方法通常包括将脂质成分，如磷脂酰乙醇胺(其可以激活用于连接靶向剂)，或衍生的亲脂性化合物(如本发明的脂质衍生的糖肽)掺入脂质体中。

靶向机理通常需要将靶向剂放置于脂质体的表面上，以这样的方式使得靶向部分是可获得的以用于与靶例如细胞表面受体相互作用。在脂质体形成之前使用本领域技术人员已知的方法将本发明的碳水化合物连接脂质分子(例如，各自具有长链烷基卤化物或具有脂肪酸的碳水化合物上存在的羟基的烷基化或酰基化)。或者，可以以这样的方式将脂质体定型使得在膜形成时连接部分首先掺入膜中。连接部分必须具有亲脂性部分，其牢固地包埋和锚定在膜中。还必须具有反应部分，其在脂质体的含水表面上是化学可获得的。选择反应部分使其与之后加入的靶向剂或碳水化合物在化学上适于形成稳定的化学键。一些情况中，可以连接靶向剂和连接分子，但是大多数情况中，更适于使用第三个分子来作为化学桥，因此连接膜中的连接分子与三维地伸出囊表面的靶向剂或碳水化合物。

还发现通过本发明方法制得的化合物可以用作诊断剂。例如，标记的化合物可用于定位怀疑患有炎症的患者中炎症或肿瘤转移的部位。为了这种用途，可以用¹²⁵I、¹⁴C或氚标记化合物。

本发明药物组合物中所用的活性组分是糖聚乙二醇化的G-CSP及其具有提高例如排卵的促卵泡激素释放激素生物特性的衍生物。优选， 将本发明的G-CSF组合物非肠道给药(例如，IV、IM、SC或IP)。期望有效剂量根据待治疗的病症和给药途径而显著地改变，但期望为约0.1(～7U)至100(～7000U)μg/kg体重的活性物质。用于治疗贫血症的优选剂量为约50至约300单位/kg，一周三次。因为本发明提供了具有提高的体内清除时间的G-CSF，当给药本发明的组合物时可以将所述的剂量任意地降低。

提供以下实施例来说明本发明的缀合物和方法，但不是限制所述的本发明。

实施例

实施例1

CHO细胞中产生的G-CSF的糖PEG化

a.脱唾液酸(Asialo)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的制备

将CHO细胞中产生的G-CSF以2.5mg/mL溶解于50mM Tris 50mMTris-HCl pH7.4，0.15M NaCl，5mM CaCl₂中，并在Centricon Plus 20离心滤器中浓缩至500μL。将溶液用300mU/mL神经氨酸酶II(霍乱弧菌(Vibrio cholerae))在32℃温育16小时。为了监控反应，用合适的缓冲液将反应的少量试样稀释并进行IEF凝胶。然后将反应混合物加入预洗的N-(p-氨基苯基)草氨酸-琼脂糖缀合物(800μL/mL反应体积)并将洗涤的珠子在4℃温和地旋转24小时。将混合物在10,000rpm离心，并收集上清液。将珠子洗涤3次，用Tris-EDTA缓冲液，一次用0.4mL Tris-EDTA缓冲液，一次用0.2mL Tris-EDTA缓冲液，并合并所有的上清液。将上清液在4℃对50mM Tris-HCl pH7.4，1M NaCl，0.05％NaN₃，然后再两次对50mM Tris-HCl pH7.4，1M NaCl，0.05％ NaN₃透析。然后使用Centricon Plus 20离心滤器将透析的溶液浓缩并储存于-20℃。根据Invitrogen提供的程序和试剂来进行IEF凝胶的条件。将天然和脱唾液酸化G-CSF的样品对水进行透析并通过MALDI-TOF MS分析。

b.G-CSF-(α2，3)-唾液酸-PEG的制备

将脱唾液酸化的G-CSF以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl，0.15MNaCl，0.05％NaN₃，pH7.2中。用1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL ST3Gal1将溶液在32℃温育2天。为了监控唾液酸-PEG的引入，加入具有CMP-SA-PEG-荧光配体的少量反应试样；通过Toso Haas G3000SW分析柱上的凝胶过滤从游离标记分离出引入肽的标记，使用PBS缓冲液(pH7.1)。使用在线荧光检测仪定量引入肽的荧光标记。2天后，使用Toso Haas G3000SW制备性柱纯化反应混合物，使用PBS缓冲液(pH7.1)，并基于UV吸收收集级分。根据Invitrogen提供的程序和试剂使用SDS-PAGE和IEF分析来分析反应产物。将天然和PEG化G-CSF的样品对水透析并通过MALDI-TOF MS分析。

c.G-CSF-(α2，8)-唾液酸-PEG的制备

将CHO细胞中产生的含有α2，3-唾液酸化O-连接聚糖的G-CSF以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，0.05％NaN₃，pH7.2中。用1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL的CST-II将溶液在32℃温育2天。为了监控唾液酸-PEG的引入，加入具有CMP-SA-PEG-荧光配体的小量反应试样；在Toso Haas G3000SW分析柱上通过凝胶过滤从游离标记分离出引入肽的标记，使用PBS缓冲液(pH7.1)。使用在线荧光检测仪定量引入肽的荧光标记。2天后，使用Toso Haas G3000SW制备性柱纯化反应混合物，使用PBS缓冲液(pH7.1)，并基于UV吸收收集级分。根据Invitrogen提供的程序和试剂使用SDS-PAGE和IEF分析来分析反应产物。将天然和PEG化G-CSF的样品对水透析并通过MALDI-TOF MS分析。

d.G-CSF-(α2，6)-唾液酸-PEG的制备

将只含有O-连接GalNAc的G-CSF以2.5mg/mL溶解于50mMTris-HCl，0.15M NaCl，0.05％NaN₃，pH7.2中。用1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL的ST6GalNAcI或II将溶液在32℃温育2天。为了监控唾液酸-PEG的引入，加入具有CMP-SA-PEG-荧光配体的小量反应试样；通过Toso Haas G3000SW分析柱上的凝胶过滤从游离标记分离出引入肽的标记，使用PBS缓冲液(pH7.1)。使用在线荧光检测仪定量引入肽的荧光标记。2天后，使用Toso Haas G3000SW制备性柱纯化反应混合物，使用PBS缓冲液(pH7.1)，并基于UV吸收收集级分。根据Invitrogen提供的程序和试剂使用SDS-PAGE和IEF分析来分析反应产物。将天然和PEG化G-CSF的样品对水透析并通过MALDI-TOF MS分析。

用节杆菌属(Arthrobacter)唾液酸酶处理CHO细胞中产生的G-CSF，然后通过Superdex75上的大小排阻进行纯化，并用ST3Ga11或ST3Ga12处理，然后用CMP-SA-PEG 20Kda处理。通过离子交换和凝胶过滤纯化所得到的分子，且通过SDS PAGE的分析证明了PEG化是完全的。这是O-连接聚糖的糖PEG化的第一个证明。

实施例2

重组GCSF-表达、重折叠和纯化

●通过离心收集细胞，丢弃上清液。各种培养基上的生长结果显示于图7中。

●将细胞沉淀重悬浮于10mM Tris pH7.4，75mM NaCl，5mM EDTA中，使用10ml/g(裂解缓冲液)。

●Microlluidize细胞(以及French压力加工)。

●4℃，5,000RPM离心30分钟，-丢弃上清液。

●将沉淀重悬浮于裂解缓冲液中并如上离心。

●在25mM Tris pH8，100mM NaCl，1％TX-100，1％NaDOC，5mM EDTA中洗涤IB′s。通过移吸和涡旋将沉淀重悬浮。4℃，5,000RPM离心15分钟。再次重复该步骤(总共两次洗涤)。

●将沉淀在25mM Tris pH8，100mM NaCl，5mM EDTA中洗涤两次来除去去污剂，如上离心。

●将沉淀重悬浮于dH₂O中成等分试样，并如上离心。将沉淀冷冻于-20℃。

●使用移液器将IB′s 以20mg/ml重悬浮于6M盐酸胍，5mM EDTA，100mM NaCl，100mM Tris pH8，10mM DTT中，接着在室温旋转2-4h。

●将溶解的IB′s在室温，14,000RPM离心1分钟。收集上清液。

●用重折叠缓冲液50mM MES pH6，240mM NaCl，10mM KCl，0.3mM月桂基麦芽苷，0.055％PEG3350，1mM GSH，0.1M GSSG，0.5M精氨酸1∶20稀释上清液，并在4℃旋转器上重折叠过夜。

●将重折叠转移Pierce蛇皮7kDa MWCO用于透析。透析缓冲液20mM NaOAc pH4，50mM NaCl，0.005％吐温-80，0.1mM EDTA。透析在4℃对至少200倍过量下总共3次。

●透析后将物质通过0.45μM滤器。

●用透析缓冲液平衡SP-琼脂糖柱并施加样品。用透析缓冲液洗涤柱子并用含有达1M NaCl盐梯度的透析缓冲液来洗脱。通常在300-400mMNaCl洗脱蛋白质。

●在SDS-PAGE上检测物质(参见，例如，图8)。

实施例3

两个罐(pot)中的两种酶方法

以下的实施例说明了在两个连续步骤中制备G-CSF-GalNAc-SA-PEG，其中将每个中间产物在用于下一个步骤之前纯化。

a.从G-CSF和UDP-GalNAc使用GalNAc-T2制备G-CSF-GalNAc(pH6.2)

将3.2mL包装缓冲液中的G-CSF(960mcg)使用UF滤器(MWCO 5K)通过超滤浓缩，然后用1mL的25mM MES缓冲液(pH6.2，0.005％NaN₃)重建。然后加入UDP-GalNAc(6mg，9.24mM)，GalNAc-T2(40μL，0.04U)和100mM MnCl₂(40μL，4mM)并将所得到的溶液在室温温育。

24小时后，MALDI表明反应是完全的。直接将反应混合物进行HPLC纯化，使用SEC(Superdex 75和Superdex 200)和含有PBS(磷酸 盐缓冲盐水，pH4.9和0.005％吐温80)的洗脱缓冲液。使用Centricon5KDa MWCO滤器将收集的G-CSF-GalNAc峰浓缩至约150μL，并使用PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH4.9和0.005％吐温80)将体积调节至1ml。终蛋白浓度1mg/mL(A₂₈₀)，产量100％。将样品保存于4℃。

b.使用纯化的G-CSF-GalNAc，CMP-SA-PEG(20KDa)和小鼠ST6GalNAc-T1(pH6.2)制备G-CSF-GalNAc-SA-PEG

将含有1mg蛋白质的G-CSF-GalNAc溶液缓冲交换成25mM MES缓冲液(pH6.2，0.005％NaN₃)，并加入CMP-SA-PEG(20KDa)(5mg，0.25umol)。溶解后，加入MnCl₂(100mcL，100mM溶液)和ST6GalNAc-I(100mcL，小鼠酶)，将反应混合物在32℃缓慢摇动三天。通过超滤(MWCO 5K)将反应混合物浓缩并用25mM NaOAc(pH4.9)缓冲交换一次，然后浓缩至1mL的总体积。然后将产品纯化，使用SP-琼脂糖(A：25mM NaOAc+0.005％吐温-80 pH4.5；B：25mM NaOAc+0.005％吐温-80 pH4.5+2M NaCl)，保持时间13-18分钟，和SEC(Superdex 75；PBS-pH7.2，0.005％吐温80)，保持时间8.6分钟(Superdex 75，流速1ml/min)。收集所需的级分，浓缩至0.5mL并保存于4℃。

实施例4

使用同时加入酶来制备G-CSF-GalNAc-SA-PEG的一罐方法

以下实施例说明了使用同时加入酶在一罐中制备G-CSF-GalNAc-SA-PEG。

1.使用小鼠ST6GalNAc-I的一罐法(pH6.0)

通过超滤(MWCO 5K)将G-CSF(溶解于3.2mL产物制剂缓冲液中的960μg蛋白质)浓缩至0.5ml并用25mM MES缓冲液(pH6.0，0.005％NaN₃)重建至约1mL的总体积或1mg/ml的蛋白浓度。然后加入UDP-GalNAc(6mg，9.21μmol)，GalNAc-T2(80μL，80mU)，CMP-SA-PEG(20KDa)(6mg，0.3μmol)和小鼠酶ST6GalNAc-I(120μL)和100mMMnCl₂(50μL)。将溶液在32℃摇动48小时，并使用标准层析条件在 SP-琼脂糖上纯化。获得总共0.5mg的蛋白质(A₂₈₀)或约50％的总产率。通过MALDI和SDS-PAGE的分析证实产物的结构。

2.使用鸡ST6GalNAc-I的一罐方法(pH6.0)

将14.4mg的G-CSF浓缩至3mL的终体积，用25mM MES缓冲液(pH6.0，0.05％NaN₃，0.004％吐温80)缓冲交换并将体积调节至13mL。然后加入UDP-GalNAc(90mg，150μmol)，GalNAc-T2(0.59U)，CMP-SA-PEG 20KDa(90mg)，鸡ST6GalNAc-I(0.44U)和100mM MnCl₂(600mcL)。将所得到的混合物在室温放置60小时。然后使用UF(MWCO5K)将反应混合物浓缩并离心。将残余物(约2mL)溶解于25mM NaOAc缓冲液中(pH4.5)并再次浓缩至5mL的终体积。将该样品纯化，使用SP-琼脂糖约10-23分钟，SEC(Superdex 75，17分钟，流速0.5ml/min)和另外的SEC(Superdex 200，23分钟，流速0.5ml/min)，产生3.6mg(25％的总产率)的G-CSP-GalNAc-SA-PEG-20KDa(A₂₈₀和BCA方法)。

实施例5

使用顺次加入酶来制备G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG的一罐方法

以下实施例说明了使用顺次加入酶来制备G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG的一罐方法。

1.从GalNAc-G-CSF开始

a.从G-CSF和UDP-GalNAc使用GalNAc-T2制备G-CSF-GalNAc(pH6.2)

使用UF滤器(MWCO 5K)通过超滤浓缩3.2mL包装缓冲液中的G-CSF(960mcg)，然后用1mL的25mM MES缓冲液(pH6.2，0.005％NaN₃)重建。然后加入UDP-GalNAc(6mg，9.24mM)，GalNAc-T2(40μL，0.04U)和100mM MnCl₂(40μL，4mM)并将所得到的溶液在室温温育。

b.从G-CSF-GalNAc；UDP-半乳糖，SA-PEG-20K道尔顿和合适的酶来制备G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG

将UDP-半乳糖(4mg，6.5μmole)，核心-1-Gal-T(320μL，160mU)，CMP-SA-PEG-20KDa(8mg，0.4μmole)，ST3Gal2(80μL，0.07mU)和100mM MnCl₂(80μL)直接加入1.5ml 25mM MES缓冲液(pH6.0)中的以上步骤a的G-CSF-GalNAc(1.5mg)的粗制反应混合物中。将反应混合物在32℃温育60小时。将反应混合物离心并使用超滤(MWCO 5K)将溶液浓缩至0.2mL，然后用25mM NaOAc(pH4.5)再次溶解至1mL的终体积。使用SP-琼脂糖将产物纯化(保持时间10-15分钟)，使用旋转滤器(MWCO 5K)将峰级分浓缩并进一步使用SEC(Superdex 75，保持时间10.2分钟)纯化残余物。使用旋转滤器浓缩(MWCO 5K)后，使用含有PBS，2.5％甘露醇，0.005％聚山梨醇酯，pH6.5的配制缓冲液将蛋白质稀释至1mL，并配制成每mL 850mcg蛋白的蛋白浓度(A₂₈₀)。总产率为55％。

实施例6

使用同时加入酶来制备G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG的一罐方法

a.从G-CSF开始

通过超滤(MWCO 5K)将G-CSF(960mcg，3.2ml)浓缩并用25mM Mes缓冲液(pH6.0，0.005％NaN₃)重建。G-CSF溶液的总体积为约1mg/ml。加入UDP-GalNAc(6mg)，GalNAc-T2(80μL，～80μU)，UDP-Gal(6mg)，核心1GalT(160μL，80μU)，CMP-SA-PEG(20K)(6mg)和2，3-(O)-唾液酸转移酶(160μL，120μU)，100mM MnCl₂(40μL)。将所得到混合物在32℃温育48小时。如以下所述的使用IEX和SEC进行纯化。使用超滤(MWCO 5K)将所得到的含有产物的级分浓缩并用缓冲液将体积调节至约1mL。通过A280测定蛋白浓度为0.392mg/ml，从G-CSF获得40％的总产率。

理解在此所述的实施例和实施方案只用于说明的目的，本领域技术人员根据其提出各种改进或改变并包括于该申请的精神和范围之内和所附权利要求的范围之内。在此所引用的所有出版物、专利和专利申请在此以其整体引入作为参考用于所有目的。

Claims (32)

1.用以下部分修饰的粒细胞集落刺激因子肽：

其中

D选自-OH和R¹-L-HN-；

G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烷基；

R¹是选自含有直链或支链聚(乙二醇)残基部分的成员；和

L是连接物，其具有以下通式，

{C(O)(CH₂)_aNH}_s{C(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH}_t

其中指数s和t独立地是0或1，并且指数a、b和d独立地是0至20的整数，且c是1至2500的整数；

使得D是OH时，G是R¹-L-，且当G是-C(O)(C₁-C₆)烷基时，D是R¹-L-NH-。

2.根据权利要求1的肽，其中R¹具有选自以下的结构：

其中

e和f是独立地选自1至2500的整数；和

q是0至20的整数。

3.根据权利要求1的肽，其中R¹具有选自以下的结构：

其中

e、f和f′是独立地选自1至2500的整数；和

q和q′是独立地选自1至20的整数。

4.根据权利要求1的肽，其中R¹具有选自以下的结构：

其中

e、f和f′是独立地选自1至2500的整数；和

q、q′和q″是独立地选自1至20的整数。

5.根据权利要求1的肽，其中R¹具有选自以下的结构：

其中

e和f是独立地选自1至2500的整数。

6.根据权利要求1的G-CSF肽，其中所述部分具有通式：

7.根据权利要求1的肽，其中所述部分具有通式：

8.根据权利要求1的肽，其中所述部分具有通式：

其中

AA是所述肽的氨基酸残基。

9.根据权利要求8的肽，其中所述氨基酸残基选自丝氨酸或苏氨酸。

10.根据权利要求1的肽，其中所述肽具有选自SEQ.ID.NO：1和SEQ.ID.NO：2的氨基酸序列。

11.根据权利要求1的肽，其中所述肽具有SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列。

12.根据权利要求11的肽，其中所述氨基酸残基是SEQ.ID.NO：1位置134或SEQ.I D.NO：2位置133的苏氨酸。

13.根据权利要求1的肽，其中所述部分具有通式：

其中

a、b、c、d、i、r、s、t和u是独立地选自0和1的整数；

q是1；

e、f、g和h是独立地选自0至6的整数；

j、k、l和m是独立地选自0和100的整数；

v、w、x和y独立地选自0和1，且v、w、x和y中至少一个是1；

AA是所述G-CSF肽的氨基酸残基；

Sia-(R)具有通式：

其中

D选自-OH和R¹-L-HN-；

G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烷基；

R¹是包含含有选自直链或支链聚(乙二醇)残基部分的成员的部分；和

L是连接物，其选自键、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基，

使得D是OH时，G是R¹-L-，且当G是-C(O)(C₁-C₆)烷基时，D是R¹-L-NH-。

14.根据权利要求13的肽，其中所述氨基酸残基是天冬酰胺残基。

15.制备包括以下部分的G-CSF肽缀合物的方法：

其中

D选自-OH和R¹-L-HN-；

G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烷基；

R¹是包含选自直链或支链聚(乙二醇)残基部分的成员的部分；

和

L是连接物，其选自键、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基，

使得D是OH时，G是R¹-L-，且当G是-C(O)(C₁-C₆)烷基时，D是R¹-L-NH-，

所述方法包括：

(a)将底物G-CSF肽接触具有以下通式的PEG-唾液酸供体部分：

以及将所述PEG-唾液酸转移至所述G-CSF肽的氨基酸或糖基上的酶，在适于转移的条件下。

16.根据权利要求15的方法，其中L-R¹具有通式：

其中

a是0至20的整数。

17.根据权利要求15的方法，其中R¹具有选自以下的结构：

其中

e和f是独立地选自1至2500的整数；和

q是0至20的整数。

18.根据权利要求15的方法，其中R¹具有选自以下的结构：

其中

e、f和f′是独立地选自1至2500的整数；和

q和q′是独立地选自1至20的整数。

19.权利要求15的方法，其中R¹具有选自以下的结构：

其中

e、f和f′是独立地选自1至2500的整数；和

q、q′和q″是独立地选自1至20的整数。

20.根据权利要求15的方法，其中R¹具有选自以下的结构：

其中

e和f是独立地选自1至2500的整数。

21.根据权利要求15的方法，在步骤(a)之前进一步包括：

(b)在合适的宿主细胞中表达所述底物粒细胞集落刺激因子肽。

22.根据权利要求21的方法，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞和哺乳动物细胞。

23.根据权利要求1的肽在制备用于刺激炎症白细胞产生的药物中的用途。

24.根据权利要求1的肽在制备用于治疗感染的药物中的用途。

25.药物制剂，包括根据权利要求1的粒细胞集落刺激因子肽和药物学上可接受的载体。

26.重折叠不溶性的、重组的、根据权利要求1的粒细胞集落刺激因子肽的方法，该方法包括步骤：

(a)溶解所述肽；和

(b)将可溶性所述肽接触含有氧化还原偶的缓冲剂来重折叠所述肽，其中重折叠的所述肽是生物活性的。

27.根据权利要求1的肽，其中L具有以下通式：

C(O)(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH

其中a、b和d独立地选自0至20，并且c是1至2500的整数。

28.根据权利要求1的肽，其中L具有以下通式：

C(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH，

其中b和d独立地选自0至20，并且c是1至2500的整数。

29.根据权利要求1的肽，其中L具有以下通式：

C(O)O(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH

其中b和d独立地选自0至20，并且c是1至2500的整数。

30.根据权利要求1的肽，其中L具有以下通式：

(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH

其中a、b和d独立地选自0至20，并且c是1至2500的整数。

31.根据权利要求1的肽，其中L具有以下通式：

C(O)(CH₂)_aNH

其中a是选自0至20的整数。

32.根据权利要求1的肽，其中L具有以下通式：

(CH₂)_aNH

其中a是选自0至20的整数。

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