CN102083469A - 含有肝素结合蛋白和肝素-羟烷基淀粉缀合物的复合物 - Google Patents

含有肝素结合蛋白和肝素-羟烷基淀粉缀合物的复合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102083469A
CN102083469A CN2009801263251A CN200980126325A CN102083469A CN 102083469 A CN102083469 A CN 102083469A CN 2009801263251 A CN2009801263251 A CN 2009801263251A CN 200980126325 A CN200980126325 A CN 200980126325A CN 102083469 A CN102083469 A CN 102083469A
Authority
CN
China
Prior art keywords
heparin
conjugate
complex
molecule
target protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801263251A
Other languages
English (en)
Inventor
乌多·哈伯尔
汉斯-格奥尔格·弗兰克
安迪·波特根斯
马克·埃姆跟布洛赫
安德烈亚斯·里巴卡
卡罗拉·施罗德
克里斯托夫·卡尼克特
奥拉夫·沃尔特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Octapharma AG
Original Assignee
Octapharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Octapharma AG filed Critical Octapharma AG
Publication of CN102083469A publication Critical patent/CN102083469A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

包含至少一个靶蛋白和至少一个结合分子的复合物，所述结合分子对所述靶蛋白具有结合亲和性，其中，所述具有结合亲和性的分子共价或非共价地结合于至少一个水溶性聚合物。

Description

含有肝素结合蛋白和肝素-羟烷基淀粉缀合物的复合物
技术领域
本发明涉及靶蛋白、结合分子与聚合物的复合物(complex)。本发明进一步公开了制备所述复合物的方法及所述复合物的应用。
背景技术
用于治疗的多肽(如蛋白)的用途近年来得到扩展，主要归因于引起许多疾病的分子生物学原理知识的进步，以及改进的人类多肽的重组表达和递药系统的可用性。多肽疗法主要用于患者体内某种天然多肽有缺陷或缺失的疾病中，尤其用于由于遗传基因的缺陷引起的疾病中。
例如，血友病是由于缺乏某种血浆蛋白而引起的疾病。血友病患者遭受由凝血级联系统的蛋白组分的功能紊乱引起的出血性疾病。根据受影响的凝血因子能区分两类血友病。二者具有共同之处，即可溶性血纤蛋白原向不溶性血纤蛋白凝块的转化受到抑制。它们是伴X染色体的隐性遗传疾病，主要影响男性人群。
每10,000位男性中，血友病A影响1-2位个体。它是由因子VIII的缺乏或缺失引起的，该因子是非常大的糖蛋白(Mw大约330kDa(Furie B.，Furie B.C.，Cell(1988)53，505-518))，代表凝血级联系统的重要要素。所述多肽序列能被细分成三个区：由所谓的A1域和A2域组成的N-末端区；中心B域区；及由A3域、C1域和C2域组成的C-末端区。在血液中，凝血因子VIII作为非活性的前体存在。它非共价地紧密结合于冯·维勒布兰德因子(von Willebrand Factor，vWF)，作为起稳定作用的载体蛋白发挥作用。凝血酶在三个特定位置(740、372、1689)对因子VIII的蛋白水解酶切作用导致其与vWF解离，释放出级联系统中的促凝功能。在其活性形式下，因子VIII作为因子IXa的辅因子发挥功能，从而使因子X的蛋白水解的活化加快几个数量级。
每25,000位男性中，约有一位男性患血友病B。它的特征在于丝氨酸蛋白酶因子IX(克里斯马斯因子(Christmas factor))的缺乏。该415个氨基酸的多肽在肝脏中合成为56kDa的糖蛋白。为了获得其合适的功能，需要翻译后羧化步骤(posttranslational carboxylation step)，该步骤仅在维生素K存在时才发生。
两类出血疾病的治疗从传统意义上包含输注因子VIII或因子IX的、源自人血浆的蛋白浓缩物。尽管这种方法代表了对血友病患者的有效治疗方法，但是它具有传播各种传染物(如引起肝炎或AIDS的病毒)或血栓栓塞因子的风险。或者，生产凝血因子的几种重组DNA技术已有记载。为此，已分离出与野生型因子VIII和因子IX相应的cDNA，并已将其克隆至合适的表达载体中(EP-A-160457；WO-A-86/01961、美国专利4,770,999、5,521,070和5,521,070)。
就因子VIII而言，现有技术(如，来自EP-A-150735、EP-A-232112、EP-A-0500734、WO-91/07490、WO-95/13300、美国专利5,045,455和5,789,203)中已知用于生产显示凝血剂活性的复合物的亚基的重组表达。此外，部分或整体缺失编码高度糖基化的B域的序列的截短cDNA版本的表达已有记载(如在WO-86/06101、WO-87/04187、WO-87/07144、WO-88/00381、WO-94/29471、EP-A-251843、EP-A-253455、EP-A-254076、美国专利4,868,112和4,980,456、EP-A-294910、EP-A-265778、EP-A-303540及WO-91/09122中)。最近已引入许多经选择的点突变，通过活化的蛋白C对因子VIII的蛋白水解的失活进行抑制，或降低免疫原性，从而使得被治疗的患者形成抑制性抗体(参见例如，美国专利5,859,204、5,422,260和5,451,521、WO-97/49725、WO-99/29848和M.L.Liu等，British J.Haematol.103：1051-1060(1998))。
然而，诸如因子VIII的多肽疗法存在许多弊端，包括短的循环半衰期、免疫原性和蛋白水解降解。例如，蛋白因子VIII的半衰期在人体内是约12小时，而在严重的冯·维勒布兰德疾病(vWD)患者体内是约2小时。现如今在发达国家，预防性治疗代表了血友病患者治疗的技术现状。预防性治疗的结果通常是每周2-4次的输注。
有许多其他用于治疗目的的蛋白，例如红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素和单克隆抗体等。
在许多情况下，延长所述治疗蛋白的半衰期有利于提高效率或减少施用于患者的治疗蛋白的用量。这也能降低治疗的费用。
在现有技术中，已通过将聚合物共价连接到所述多肽，解决了多肽疗法的短的循环半衰期。例如，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖或羟乙基淀粉(HES)的连接已显示出某些多肽的半衰期有所延长。
然而，已观察到聚合物连接的一些问题。例如，聚合物的连接能导致药物活性降低。另外，用于将聚合物偶联到蛋白的某些试剂反应性不够，因此需要长的反应时间，在此期间可发生蛋白的变性和/或失活。并且，不完全或不均匀的连接导致形成具有不同性质的化合物的混合群(mixed population)。
本发明的一个目标是克服现有技术的缺点，尤其是提供使人或动物循环系统中蛋白的半衰期延长的改进方法，从而降低输注的次数，提高患者的生活质量。
发明内容
在一个实施方式中，本发明针对使人或动物循环系统中靶蛋白的半衰期延长的方法。
在一个实施方式中，本发明公开了一种包含至少一个靶蛋白和至少一个结合分子的复合物，所述结合分子对所述靶蛋白具有结合亲和性，其中，所述具有结合亲和性的分子共价或非共价地结合于至少一个水溶性聚合物。
意外地发现，通过能紧密缔合到所述蛋白的结合分子，将聚合物非共价地偶联至靶蛋白，使得半衰期显著延长，显示出对患者的巨大益处。
由于结合分子与蛋白的特定结合位点的缔合，与所述结合分子偶联的聚合物定位于所述蛋白附近，从而影响所述蛋白的生理性质。确信由于聚合物的尺寸和物理性质，所述蛋白通过肾从循环中的清除作用和/或所述蛋白的降解作用(例如通过吸收进入某些细胞)受到削弱。
在某些情况下，所形成的复合物的总尺寸可超过能从循环系统中清除的分子的最大尺寸。具体而言，与聚合物结合的蛋白不能通过肾中的膜，因此滞留在血流中而不能通过尿排泄。
结合分子与聚合物一起形成缀合物(conjugate)，然后靶蛋白非共价地偶联至所述缀合物。优选地，在所述缀合物中，所述结合分子共价地偶联至所述聚合物。
所述缀合物还可干扰细胞吸收所述蛋白和/或干扰通过降解酶对所述蛋白的识别和结合。具体而言，当结合到所述蛋白时，所述缀合物可屏蔽某些蛋白区域，这些蛋白区域与蛋白的降解和/或清除有关，或与改变所述蛋白的整体电荷有关。例如，所述缀合物屏蔽所述蛋白的结合区域，所述区域被以下物质识别：(i)促进蛋白被吸收进入细胞的受体或因子；和/或(ii)与降解途径有关的蛋白，如蛋白酶、泛素缀合酶、蛋白酶体等。
此外，本发明的复合物以及方法提供了下述优点：用于治疗的蛋白不必为了延长它们在循环系统中的半衰期而进行化学修饰。相反，可将如本发明所述的缀合物并入例如预先存在的药物组合物中以发挥它们的功用。对于依赖临床批准的药物应用，这是相对于传统的偶联策略的优势所在，因为治疗的实体(therapeutic entity)没有改变。本发明的所述复合物优选以间接体内的方式(ex vivo)形成。
因此，第一方面，本发明提供包含至少一个靶蛋白和至少一个结合分子的复合物，所述的结合分子对所述靶蛋白具有结合亲和性，其中，所述具有结合亲和性的结合分子优选与至少一个聚合物共价结合。所述结合分子与所述聚合物一起形成结合到所述靶蛋白结合位点的缀合物。
第二方面，本发明涉及第一方面的复合物中存在的缀合物，以及所述缀合物形成复合物的用途。
第三方面，本发明提供一种制备第一方面所述的复合物的方法，该方法包括将所述靶蛋白与所述缀合物接触的步骤。
第四方面，本发明提供使人或动物的循环系统中靶蛋白的半衰期延长的方法，该方法包括将所述靶蛋白与缀合物接触的步骤，所述缀合物包含聚合物和对所述靶蛋白具有结合能力的结合分子。
第五方面，本发明分别涉及第一方面所述的复合物在医学中的应用、以及在药物组合物制备中的应用。另外，这一方面还涉及包含第一方面所述的复合物的药物组合物。
第六方面，本发明提供一种制备第三方面所述的缀合物的方法，该方法包括将所述聚合物偶联至所述结合分子的步骤。
在后文及本发明所附权利要求书中，描述了本发明这些方面的具体实施方式。
附图说明
图1显示出凝血因子VIII的三维结构，其中，突出显示了与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)相互作用的位点。
图2显示出因子VIII与1∶1的类肝素(heparinoid)-HES缀合物的复合物的结构。
图3显示出具有适配体(aptamer)-HES共价缀合物的靶蛋白的示意图(A＝适配体)。
图4显示出翻译后修饰的靶蛋白与模拟分子-HES缀合物结合的示意图。
图5显示出采用表面等离子体共振对HES-肝素缀合物的结合研究。
图6显示出体外试验中，与因子VIII相比，因子VIII-HES缀合物的半衰期的延长。
图7显示出体内试验中，与因子VIII相比，因子VIII-HES缀合物的血浆半衰期的延长。
图8显示出人的因子VIII和因子IX对岩藻聚糖(fucoidan)的结合研究，该研究基于表面等离子体共振进行。
图9显示出从活化的HES(C1马来酰亚胺HES，点线)、巯基修饰的LMWH(实线)和纯化的LMWH-HES缀合物(短划线)进行SEC-dRI/UV/MALS测量得出的折光率色谱图。柱：Superdex200 10/300GL；流动相：含有150mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)。(峰＞40min：盐)。
具体实施方式
定义
一般而言，本文使用的下列表述将优选具有如下阐述的含义，但它们所被使用的上下文另有所指时除外。
本文使用的表述“包括/包含”还包括且明确指的是“基本上由……组成”和“由……组成”的表述。
本文使用的术语“复合物”特指在两个或多个化合物间的非共价的物理缔合。所述复合物的化合物(本文中至少为所述靶蛋白与所述缀合物)通过一种或多种(非共价的)分子间力缔合，例如离子相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键、范德华相互作用和/或疏水作用。
术语“缀合物”特指连接在一起的两个或多个化合物，从而将来自于每个化合物的至少部分性质保留在所述缀合物中。可通过共价键或非共价键实现连接。优选地，所述缀合物的化合物通过共价键连接。缀合物的不同化合物可通过化合物的原子间的一个或多个共价键彼此直接结合。或者，所述化合物可通过接头分子(linker molecule)彼此结合，其中，所述的接头分子与所述化合物的原子共价相连。如果所述缀合物由两个以上的化合物组成，那么这些化合物可以例如以链式构象连接(即一个化合物连接到下一个化合物)，或数个化合物各自连接于一个中心化合物。
如本文使用的术语“蛋白”指氨基酸分子链或一条以上氨基酸链的复合物。蛋白可包含任何天然形成的氨基酸及人造氨基酸，且可源自生物或源自合成。蛋白可以被天然地修饰(翻译后修饰)或合成地修饰(如糖基化、酰胺化、羧化和/或磷酸化)。蛋白包含至少两个氨基酸，但不必是任何特定的长度；这个术语不包括任何尺寸的限制。在本申请中，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可交换使用。优选地，蛋白包含至少10个氨基酸，优选包含至少50个氨基酸、至少100个氨基酸，且最优选包含至少100个氨基酸。
术语“核酸”包括单链和双链的核酸和核糖核酸以及脱氧核糖核酸。
术语“结合位点”特指由蛋白的形状、疏水性和/或(部分)电荷而产生的蛋白区域。有利地，所述结合位点天然地能与靶分子(如肝素)非共价地缔合。
结合位点的特定实例是能结合到肝素和/或密切相关的化合物(如硫酸乙酰肝素、类肝素和/或它们的衍生物)的肝素结合位点。另一类实例是金属离子结合位点，该结合位点能结合至选自于由一价金属离子、二价金属离子、三价金属离子和四价金属离子组成的组的金属离子。示例性的金属离子是锌离子、铜离子、钴离子、镉离子和汞离子。另一类实例是能连接到RGD肽(即含有精氨酸(R)、甘氨酸(G)、天门冬氨酸(D)氨基酸序列的肽、或具有密切相关序列的肽和/或它们的衍生物)的RGD结合位点。另一类实例是能结合到脂质(包括甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、鞘脂、糖脂(saccharolipids)、聚酮(polyketides)、固醇脂质、异戊烯醇脂质(prenol lipids)和脂肪酸)的脂质结合位点。
本文使用的术语“结合分子”指能非共价结合到蛋白的结合位点的化合物。优选地，与结合位点的结合是特异性的，即，与结合位点的结合比与蛋白的天然环境(如人类或动物的循环系统)中存在的大部分其他分子的相互作用要强。在优选的实施方式中，将结合部分(bindingmoiety)结合到具有亲和性的结合位点，该结合在生理条件下具有1mM以下的解离常数，更优选300μM以下、100μM以下、30μM以下、10μM以下、3μM以下、1μM以下、300nM以下、100nM以下、30nM以下的解离常数，最优选10nM或1nM以下的解离常数。所述结合部分的结构及组成并不以任何方式受到限制，只要它能结合到所述结合位点即可。优选地，所述结合部分是无毒的和生理可接受的。例如，所述结合部分可能是肽部分、糖部分、核酸部分、脂质部分或它们的模拟化合物，或是前述结合部分的组合。结合分子的特定实例是肝素、硫酸乙酰肝素、类似肝素的分子(heparin-like molecules)(例如特别是肝素模拟肽)、RGD肽、金属离子模拟物和脂质、它们的衍生物及它们的模拟物。
术语“聚合物”特指由两种以上分子种类(“单体”)组成的化合物，形成共价键合的更大分子。聚合物可以是天然的或合成的，并且可以是直链的、支链的或枝状的。所述聚合物可以用合适的取代基(如反应性基团)进一步衍生。
术语“水溶性聚合物”指在水中可溶的聚合物。它与用来生产例如微滴定板及试管等的固态聚合物相反。在浓度为1mg/ml时，所述水溶性聚合物与水形成溶液而不发生相分离。
术语“羟烷基淀粉”或“HAS”指被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。所述淀粉优选是天然存在的淀粉，如马铃薯淀粉或玉米淀粉。所述羟烷基优选与葡萄糖单元的C2、C3和/或C6碳原子上的氧结合，并且主要发生在C2和C6上。引入的羟烷基的量可以用摩尔取代度MS表示，它被定义为每个葡萄糖分子中羟烷基的平均数(最大MS＝3.0；通常在0.4-0.7之间)。所连接的羟烷基可具有任何合适的化学结构，但优选具有例如1-10个碳原子的、直链或支链的低级烷基。优选地，所述羟烷基具有2-8个、更优选2-4个碳原子。例如，所述羟烷基可以是羟乙基、羟丙基或羟丁基，对于羟乙基，特别优选2-羟乙基。其中的羟烷基是羟乙基、优选2-羟乙基的羟烷基淀粉被称为“羟乙基淀粉”或“HES”。
化合物的“衍生物”特指被一个或多个化学部分取代的、和/或其中一个或多个化学部分被除去的化合物。衍生物包括通过天然存在的方法(如蛋白的磷酸化、核酸的甲基化等)得到的衍生物及通过化学合成得到的衍生物。衍生物的示例性的取代基是：官能团，如羟基、羧基、酮基、醛基、氨基、亚硫酸根、硫酸根和磷酸根；或其他基团，如烷基、芳基、烷氧基等。
本文所使用的靶化合物的“模拟物”特指具有一种或多种性质的化合物，所述性质与靶化合物的性质相似。具体而言，如果靶化合物能结合到蛋白的特异性结合位点，那么靶化合物(如肝素)的模拟物也能结合到所述结合位点，优选具有相仿的亲和性。更优选地，模拟物的解离常数(定义对结合位点的亲和性)是靶化合物的解离常数的至多1000倍，更优选是靶化合物的解离常数的至多500倍、至多100倍、至多50倍、至多20倍、至多10倍、至多5倍、至多2倍、至多1.5倍、至多1.2倍，最优选与靶化合物的解离常数相等或小于靶化合物的解离常数。
在优选的实施方式中，模拟物的三维结构和/或电荷的空间分布与所述靶化合物的三维结构和/或电荷的空间分布至少在与结合位点的结合有关的部分或其局部相似。
“接头”是将两个以上的靶化合物彼此连接的化学部分。为此，在偶联到靶化合物之前，所述接头分子显示出能与靶化合物形成共价键的官能团。两个靶化合物间的连接可以采用一个接头分子形成，或在将第二个(或两个)靶分子进行偶联之前，一系列接头分子可以彼此连接。
如本文使用的术语“循环系统”，特指人或动物的心血管系统和/或淋巴系统，优选心血管系统，包括心脏、血液和血管。
化合物的“半衰期”特指化合物的量衰减到其初始值的一半所需要的时间。例如，循环系统中化合物的半衰期是指循环系统中该化合物的浓度降低到其初始浓度(如化合物被添加到循环系统中时的浓度)的一半所需要的时间。循环系统中化合物的半衰期受到各种因素的影响，如化合物的肾清除速率、化合物的(酶)降解速率、细胞吸收化合物的速率等。
术语“药物组合物”特指适合对人或动物进行给药的组合物，即包含药学上可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或该活性化合物的盐或前药，以及载体、稀释剂或药用辅料(例如缓冲剂、防腐剂及张力调节剂(tonicity modifier)等)。
术语化合物的“分子量”特指1摩尔所述化合物的重量。如果所述化合物是多分散的，所述分子量指多分散的混合物的重均分子量，因此，所述多分散的混合物可包括具有比标明的重均分子量更高或更低分子量的单一化合物。
本文提到的所有专利、专利申请、科学论文或其他文件并入本文作参考。
本发明以下述发现为基础：通过采用偶联至聚合物的结合分子，将聚合物与靶蛋白非共价地结合，可将人或动物循环系统中靶蛋白的半衰期延长。
在这一方面，本发明涉及一种复合物，所述复合物包含靶蛋白和缀合物，所述缀合物包括聚合物部分(polymeric moiety)及具有结合到所述靶蛋白的能力的结合部分，其中，所述靶蛋白与所述缀合物非共价地偶联。
所述靶蛋白(其循环半衰期将被延长)可以是任何蛋白，只要它显示能与结合部分缔合的结合位点即可。优选地，所述蛋白溶于水。在某些实施方式中，所述蛋白在人和/或动物内具有药理活性，并优选可用于疾病(例如下面讨论的疾病)的治疗。优选地，所述靶蛋白在治疗中直接给药到循环系统中，如通过静脉内注射或动脉内注射。
在优选的实施方式中，所述的靶蛋白具有治疗活性。合适的靶蛋白包括选自下述位点组成的组的结合位点：肝素结合位点、RGD肽结合位点、RGD基序(motif)、金属离子结合位点、脂质结合位点和核酸结合位点。
合适的靶蛋白选自：凝血蛋白，如因子IX、因子VIII(野生型和去除B域的)、因子VII/VIIa、凝血酶、抗凝血酶、组织纤溶酶原激活物和冯·维勒布兰德因子(vWF)；生长因子，如红细胞生成素；集落刺激因子(CSF)，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞CSF(M-CSF)及粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)；细胞因子，如白介素；蛋白酶抑制剂，如α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)；整联蛋白；解联蛋白；胞外基质蛋白，如纤连蛋白和玻连蛋白(vitroncectin)；金属蛋白酶，如基质金属蛋白酶和ADAM/ADAMTS蛋白；金属蛋白酶；载脂蛋白；转运蛋白；激素；抑制性或调解性作用蛋白；以及上述蛋白的衍生物和突变体。
在某些实施方式中，所述靶蛋白具有10kDa以上、优选30kDa以上、最优选50kDa以上的分子量。此外，所述蛋白可以具有1000kDa以下、优选500kDa以下、最优选200kDa以下的分子量。
包含肝素结合位点的合适的靶蛋白例如：抗凝血酶、凝血酶、冯·维勒布兰德因子、组织纤溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、玻连蛋白、蛋白C抑制剂、组织因子通路抑制剂、血小板因子4、富含组氨酸的糖蛋白、血小板反应蛋白、尿激酶、纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、脂肪酶、载脂蛋白B、载脂蛋白E。
适于本发明的结合位点的例子是肝素结合位点、RGD肽结合位点、RGD基序、Src同源2(SH2)域、Src同源3(SH3)域、金属离子结合位点、脂质结合位点、核酸结合位点。在优选的实施方式中，所述蛋白包含例如图1所示的、凝血因子VIII的肝素结合位点。
包含RGD结合位点的靶蛋白包括例如整联蛋白。包含RGD基序的靶蛋白的实例是解联蛋白及胞外基质蛋白，如纤连蛋白和玻连蛋白。
包含金属离子结合位点的靶蛋白包括例如：金属蛋白酶，如基质金属蛋白酶和ADAM/ADAMTS蛋白；及金属硫蛋白(metallotheoneins)。
包含脂质结合位点的靶蛋白包括例如载脂蛋白。
在优选的实施方式中，所述的靶蛋白包含针对结合部分的结合位点，所述结合部分至少部分参与所述靶蛋白的降解和/或清除。
根据所述靶蛋白(其在循环系统中的半衰期将被延长)，必须选择所述缀合物的结合部分。优选地，所述结合部分选择性地结合到所述靶蛋白。通常，在不存在其他能结合到所述结合部分的蛋白时，所述靶蛋白与所述缀合物的复合物在体外(in vitro)形成。
为确保所述复合物在一定时间段内保持不变，优选所述结合部分对靶蛋白具有强的亲和性和特异性，即一经给药立即缔合。为实现半衰期的延长，这一点是重要的。通常，两个化合物相互作用的结合强度通过其解离常数Kd表示。解离常数Kd是平衡常数，它描述未结合的化合物与结合的化合物的比值，例如游离的靶蛋白和游离的缀合物与蛋白-缀合物复合物的浓度比。生物体系中的典型范围是在微摩尔和皮摩尔间。例如，在生理的盐浓度下，肝素结合到蛋白(即肝素结合蛋白)的Kd值在低至高的纳摩尔范围内。例如Olson等(1981 J.Biol.Chem.，256，11073-11079)测定肝素结合到抗凝血酶III的解离平衡常数为7.2(±1.9)×10-8M，这表明了蛋白-类肝素相互作用的高亲和性。
因此，靶蛋白-结合部分的相互作用及类似的靶蛋白-缀合物的相互作用的解离常数Kd优选在微摩尔范围以下。优选地，所述解离常数为100μM以下，更优选100nM以下。
所述结合分子可以是任何化学类型，包括肽部分、糖部分、核酸部分、脂质部分及其他有机化合物。
在一个实施方式中，所述结合分子包含靶蛋白的天然配体，或包含能结合到靶蛋白的配体的一部分。然而，所述结合分子并不必包含所述靶蛋白的天然配体。在一个实施方式中，所述结合分子包含所述靶蛋白的天然配体的模拟物。这些模拟物可为任何化学类型，优选是包含天然氨基酸和/或人造氨基酸的肽模拟物；包含天然单糖和/或人造单糖的糖模拟物；包含天然核苷酸和/或人造核苷酸的核酸模拟物；或通过正常的磷酸二酯键或人造的键偶联的肽核酸；或有机化合物模拟物。
因此，在所述靶蛋白包含肝素结合位点的情况下，所述结合分子可以是肝素部分；硫酸乙酰肝素部分；或类似肝素的部分，如岩藻聚糖、硫酸化岩藻聚糖(sulphated fucans)或类肝素(即高酸性的，如高度硫酸化的多糖)；或上述结合分子的模拟物。所述肝素可以是重均分子量小于约8000Da的低分子量肝素(LMWH)，如依诺肝素(克赛(Clexan)；Mw＝4.2kDa)或完全合成的戊聚糖方达帕鲁(pentasaccharide Fondaparinux)(Arixtra；1726.77g/mol)。优选地，所述肝素、硫酸乙酰肝素或类肝素平均由3-20个单糖单元组成，更优选由5-15个单糖单元组成(如戊聚糖)。
优选地，所述类似肝素的分子是结合到靶蛋白的肝素结合位点的肽(如肝素模拟肽)。因此，肝素或硫酸乙酰肝素的模拟物可以是优选包含如下氨基酸的肽：带负电的氨基酸，如Glu或Asp；用带负电的基团修饰的氨基酸，如硫酸化的氨基酸(特别是硫酸化酪氨酸)和磷酸化的氨基酸(特别是磷酸化的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸)；和/或在侧链中带有酸部分的非天然氨基酸。优选地，所述的肝素模拟肽包含一个或多个硫酸化的氨基酸，如硫酸化酪氨酸。在一个实施方式中，所述的模拟肽包含氨基酸基序X1-Y(SO3)-X2-Y(SO3)，其中，Y(SO3)是硫酸化酪氨酸，X1是带负电的氨基酸、丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，X2是天门冬氨酸、丙氨酸或不存在。示例性的模拟肽包含以下氨基酸基序：
-SY(SO3)DY(SO3)，
-SY(SO3)DY(SO3)SY(SO3)DY(SO3)，或
-Y(SO3)Y(SO3)GGY(SO3)DY(SO3)。
此外，肝素或硫酸乙酰肝素的模拟物可为：化学化合物，如苏拉明或其衍生物；有机聚合物，如磺化的聚合物、带有氨基酸侧链的聚合物和带有单糖或二糖侧链的聚合物；或硫酸化的糖，特别是硫酸化的戊聚糖。
例如，在H.H.A.M.Hassan，Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 7：1206-1235(2007)、S.H.Kim和K.L.Kiick，Peptides 28：2125-2136(2007)及H.D.Maynard和J.A.Hubbell，Acta Biomateriala l：451-459(2005)中记载了合适的肝素模拟物，上述文献并入本文作参考。
如果靶蛋白包含RGD结合位点，所述结合部分可以是包含RGD基序的天然肽或合成肽。可在整联蛋白结合蛋白(如解联蛋白)及胞外基质蛋白(如纤连蛋白和玻连蛋白)中找到合适的序列。
如果靶蛋白包含RGD基序，所述结合部分可以是RGD结合肽，例如RGD结合蛋白域(在例如几种整联蛋白中发现的)或特异性地结合到RGD基序的合成化合物(例如，在WO 90/03983或WO 97/08203中记载的环肽)。
如果靶蛋白包含SH2域，所述结合部分可以是优选包含酪氨酸残基的SH2结合肽，更优选包括磷酸化的酪氨酸残基的SH2结合肽，或是SH2结合肽的模拟物。
如果靶蛋白包含SH3域，所述结合部分可以是优选包含脯氨酸残基的SH3结合肽，或是SH3结合肽的模拟物。优选地，所述SH3结合肽包含氨基酸基序P-X-X-P，其中，P是脯氨酸，X是任何氨基酸、优选脂肪族氨基酸；或包含氨基酸基序R-X-X-K，其中，R是精氨酸，K是赖氨酸，X是任何氨基酸。
如果所述靶蛋白包含金属离子结合位点，所述结合分子可以是金属复合物的配体如胺、羧化物或硫醇。
如果所述靶蛋白包含脂质结合位点，所述结合部分可以是脂质，如磷脂或脂肪酸。
如果靶蛋白包含核酸结合位点，所述结合部分可以是天然存在的核酸或合成的核酸(如单链或双链的核糖核酸或单链或双链的脱氧核糖核酸)，或是上述核酸的模拟物(如肽核酸)。如果所述核酸结合位点是序列特异性的，所述结合部分优选是具有所需的序列或密切相关的序列的核酸，如与结合基序的整个序列具有约80％、85％、90％、95％或98％同一性的序列。
根据一个实施方式，所述结合分子不是包含可变区或其结合部的抗体或抗体的一部分。根据另一个实施方式，所述靶蛋白不是包含可变区或其结合部的抗体或抗体的一部分。此外，根据一个实施方式，所述的结合分子和靶蛋白都不是包含可变区或其结合部的抗体或抗体的一部分。
在一个优选的实施方式中，所述靶蛋白是包含肝素结合位点的蛋白(如因子VIII或因子IX)，且所述结合部分是肝素、硫酸乙酰肝素、类肝素或上述物质的模拟物。
为了使结合分子对靶蛋白功能的影响最小化，所述结合部分优选应尽可能小。因此，所述结合部分具有优选50kDa以下、更优选10kDa以下、进一步更优选5kDa以下的分子量。此外，所述结合分子可具有100Da以上、例如500Da以上的分子量。
靶蛋白半衰期的延长主要是由于缀合物的连接。因此，当所述缀合物结合到靶蛋白时，优选延长人或动物体的循环系统中靶蛋白的半衰期。例如，当所述缀合物结合到靶蛋白时，可能会干扰靶蛋白从循环系统中清除，或干扰靶蛋白的降解，和/或屏蔽与细胞吸收靶蛋白和/或降解酶识别并结合靶蛋白相关的一个或多个靶蛋白区域。
所述聚合物包括至少一种直链的、支链的或枝状的天然聚合物或合成聚合物，优选溶于水和体液，更优选是亲水性的。在优选的实施方式中，所述聚合物部分是生物学惰性和/或药学上可接受的。
所述聚合物可以是适合所需目的的任何尺寸。鉴于这一点，所述聚合物优选具有5kDa以上、更优选10kDa以上的分子量。作为上限，所述聚合物优选具有1000kDa以下、更优选300kDa以下、最优选200kDa以下的分子量。
在某些实施方式中，所述的聚合物包括选自下述物质组成的组的聚合物：多糖、多肽、核酸、聚醚、聚酯和聚烯烃。优选地，所述聚合物部分包括选自下述物质组成的组的聚合物：聚亚烷基二醇(polyalkyleneglycol)及其衍生物，包括聚乙二醇(PEG)、PEG均聚物、mPEG、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物，其中，所述的均聚物和共聚物未被取代或一端用例如酰基进行取代；聚甘油或聚唾液酸；甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)及其共聚物；聚谷氨酸盐/酯、碳水化合物、纤维素和纤维素衍生物包括甲基纤维素和羧甲基纤维素；淀粉，如羟烷基淀粉(HAS)，尤其是羟乙基淀粉(HES)和糊精，及它们的衍生物；葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括硫酸葡聚糖(dextransulfat)、羧甲基葡聚糖、交联糊精和羧甲基糊精；壳聚糖；聚乙烯醇和聚乙烯基乙醚；聚乙烯基吡咯烷酮；α，β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺；及聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylated polyols)。
在某实施方式中，所述聚合物包括羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，所述羟烷基淀粉具有至少为5kDa的平均分子量(Mw)，优选最大为1000kDa，更优选为8-500kDa，进一步更优选10-300kDa及100-300kDa。它可具有每葡萄糖单元约0.4-约1.3、优选0.4-0.9或0.4-0.7的羟烷基(羟乙基)摩尔取代度。
所述聚合物可直接地偶联到结合部分。如果所述聚合物部分和/或所述结合部分没有合适的偶联基团，可以用一个或多个接头来适当地修饰所述聚合物和/或结合分子，以使它们能与另一个分子上的至少一个反应性基团发生反应，从而生成缀合物。为此，可使用现有技术中已知的任何合适的偶联策略。WO 2007/101698和Orlando，Michele的论文，Modification of proteins and low molecular weight substances withhydroxyethyl starch(HES)(Justus-Liebig-
Figure BPA00001290378500151
Giessen，德国，2003)还详细地记载了合适的接头、聚合物部分及缀合方法，将上述文献并入本文作参考。优选地，所述偶联是特异性的，使得所述结合分子和/或聚合物仅有一个或有限数量的反应性基团用于偶联。对于所述聚合物、所述结合分子与任选的一个或多个接头的彼此偶联，可使用任何合适的反应性基团。
因此，如果所述的结合分子或聚合物包含肽，所述偶联反应可特异性地针对α-链氨基或α-链羧基，或针对优选仅在肽中出现一次的、氨基酸的侧链反应性基团。合适的侧链反应性基团的实例是：半胱氨酸的巯基；赖氨酸、精氨酸或组氨酸的氨基；天门冬氨酸盐/酯或谷氨酸盐/酯的羧基；天门冬酰胺或谷氨酰胺的酰胺基；及丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基。然而，通过人造氨基酸引入的反应性基团也可用于偶联。
如果所述结合分子或聚合物包含肽，下面存在于其它部分上或引入至其它部分的反应性基团可用于偶联：
-与肽的氨基反应的酰化基团，例如酸酐基团、N-酰基咪唑基团、叠氮基团、N-羧酸酐基团、双烯酮基团、焦碳酸二烷基酯基团、亚氨酸酯基团和碳化二亚胺活化的羧基。已知上述所有的基团与例如蛋白上的氨基反应以形成共价键，包括酰基或类似的连接键(linkage)；
-与肽的硫氢基(巯基)、甲硫基、咪唑基或氨基反应的烷基化基团，如卤代羧基、马来酰亚胺基、活化的乙烯基、乙烯亚胺基、卤代芳基、2-羟基-5-硝基-苄基溴基团；及与还原剂一起的脂肪族醛基和酮基，该醛基和酮基与肽的氨基反应；
-与肽的羧基反应的成酯基团和成酰胺基团，如重氮羧酸盐/酯基团，以及共同使用的碳化二亚胺与胺基团；
-与肽的硫氢基反应的形成二硫化物的基团，如5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸盐/酯)基团、正吡啶基二硫化物和烷基硫醇基团，烷基硫醇基团在存在氧化剂(如碘)时与硫氢基反应；
-与肽的胍部分反应的二羰基(如环己二酮基团)及其它的1，2-二酮基团；
-与肽的酚基反应的重氮基；
-来自于溴化氰与多糖反应的反应性基团，该反应性基团与肽的氨基反应。
在包含肽的结合部分/聚合物部分中，如果用来进行偶联反应的合适的氨基酸缺失，可将各自的氨基酸引入到该肽中，优选引入到其氨基末端或羧基末端。
如果结合部分和/或聚合物部分包含糖，所述的偶联反应可以分别特异性针对糖的还原端上的醛/半缩醛基团或酮/半缩酮基团。例如，WO2004/024776A1中记载了合适的偶联策略。
例如，可使还原端的醛/半缩醛基团与存在于其他部分上或引入到其它部分的伯胺基发生还原胺化。所述反应优选在存在还原剂(如硼氢化物(如氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化钠)或有机硼复合物时进行。或者，可用氧化剂(如碘、溴或合适的金属离子)使所述醛/半缩醛基团发生选择性氧化，或发生电化学氧化，形成羧基或活化的羧基(如酯、内酯或酰胺)。例如，所述(活化的)羧基可例如在存在活化剂时再与氨基反应，所述活化剂例如：N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、苯硫酚、对硝基苯酚、邻，对-二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚、1-羟基-1H-苯并三唑(HOBt)、3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBt)、4-羟基-3-硝基苯磺酸(HNSA)、2-羟基吡啶、3-羟基吡啶、3，4-二氢-3-羟基-4-氧代苯并三嗪、4-羟基-2，5-二苯基-3(2H)-噻吩酮-1，1-二氧化物、3-苯基-1-(对硝基苯基)-2-吡唑啉-5-酮)、[1-苯并三唑基-N-氧基-三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐](BOP)、[1-苯并三唑基氧基三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-双(五亚甲基)脲六氟磷酸盐、[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-双(四亚甲基)脲六氟磷酸盐、羰基二咪唑(CDI)、或碳二亚胺(如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)或二异丙基碳二亚胺(DIPC))。
如果结合部分和/或聚合物部分包含核酸，所述偶联可通过2′-羟基、3′-羟基或5′-羟基进行。如果结合部分包含脂肪酸，可使用其羧基。如果聚合物部分包含有机聚合物(如聚酯、聚醚或聚烯烃)，可将所述聚合物末端的反应性基团(如果存在)、聚合物单体单元的反应性基团或引入的反应性基团用于偶联。
因此，根据本发明的缀合物可任选地通过以下步骤制成：首先对所述聚合物部分和/或结合部分进行化学修饰，以生成其上具有至少一个化学基团的聚合物部分和/或结合部分，该化学基团能与在另一个部分上可用的化学基团或引入的化学基团发生反应；然后使聚合物部分与结合部分共同反应，以生成以共价键连接的、它们的缀合物。或者，任选经修饰的聚合物部分或任选经修饰的结合部分可首先偶联到(另外的)接头，然后所述接头再偶联到任选经修饰的其他部分。
在所述偶联反应的具体实施方式中，第一接头与所述聚合物部分偶联，其中，所述的第一接头具有不存在于聚合物部分且不与聚合物部分反应的反应性基团。第二接头与所述结合部分偶联，其中，所述的第二接头具有不存在于结合部分且不与结合部分反应的反应性基团。然后，第三接头相继或同时偶联到第一接头和第二接头。用于将第三接头偶联到第一接头和第二接头的反应性基团可以是适于该目的的任何反应性基团。此外，在第一接头与第二接头分别与聚合物部分和结合部分偶联时，所述接头的反应性基团可通过保护基进行保护。
示例性的反应性基团(它可用于聚合物部分、结合部分和任选一个或多个接头的彼此偶联)是C-C双键或C-C三键或芳香C-C键、酰卤、卤代、羟基、醛基、酰胺基、氨基、氨氧基、羟氨基、羰基、羧基、活化的酯、氰基、硫氰基、亚氨基、硝基、亚硝基、腈、过氧根、二氧磷基(phospho)、磺酰基、亚磺酰基、巯基、肼基和酰肼基。可用于接头彼此偶联的反应性基团对例如：氨基与琥珀酰亚胺酯基、巯基与马来酰亚胺基。
可在偶联反应中用作保护基的实例是：
-用来保护醇：乙酰(Ac)、β-甲氧乙氧甲基醚(MEM)、甲氧甲基醚(MOM)、对甲氧苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、特戊酰(Piv)、四氢吡喃(THP)、甲硅烷基醚(如三甲基甲硅烷基(TMS)醚、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)醚及三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲基醚、乙氧基乙基醚(EE)；
-用来保护胺：苄氧羰基(Cbz)、对甲氧苄基羰基(Moz或MeOZ)、叔丁氧羰基(BOC)、9-芴甲氧羰基(FMOC)、苄基(Bn)、对甲氧苄基(PMB)、3，4-二甲氧苄基(DMPM)、对甲氧苯基(PMP)、甲苯磺酰基(Ts)和氨磺酰基(Nosyl和Nps)；
-用来保护羰基：缩醛、缩酮、丙烯醛(acrylal)和二噻烷；及
-用来保护羧酸：甲酯、苄酯、叔丁酯和甲硅烷酯。
只要合适，可自由地选择缀合物中结合分子的数目和聚合物的数目。因此，所述缀合物可包含一个或多个结合分子，如仅一个、两个以上，三个以上及四个以上。同样地，所述缀合物可包含一个或多个聚合物，如仅一个、两个以上、三个以上及四个以上。在一个实施方式中，所述缀合物包含一个结合分子和一个聚合物。
如果接头用来将结合分子偶联到聚合物，一个接头可将两个分子彼此偶联，例如一个结合部分偶联到一个聚合物部分；或一个接头可将多于两个的分子彼此偶联，如一个结合部分偶联到两个以上的聚合物，两个以上的结合分子偶联到一个聚合物，或两个以上的结合分子偶联到两个以上的聚合物。
所述接头可具有任何合适的长度，但优选尽可能短。然而，所述接头优选足够长，以使得所述聚合物部分不干扰结合部分与靶蛋白的相互作用。用于将分子偶联的合适的接头在现有技术中是众所周知的，同时可以商购得到。
在缀合物中用来形成接头的合适的分子包含两个以上的官能团(如上所述)，用来将接头偶联到结合分子、聚合物和/或另一个接头分子。这些官能团优选通过药学上可接受的桥连基团(bridging group)(如源于脂肪族或芳香族的碳水化合物的桥连基团)连接。所述的接头可以是双同官能团(homo-bifunctional)的或双异官能团(hetero-bifunctional)的。
整个缀合物可以是适于所需应用的任何尺寸。然而，所述缀合物优选具有5-1000kDa的分子量，优选具有20-300kDa的分子量。
本发明的复合物可由一个或多个(如一个、二个、三个、四个或多个)靶蛋白与一个或多个(如一个、二个、三个、四个或多个)缀合物形成。在一个实施方式中，所述复合物包含仅一个靶蛋白和仅一个缀合物。
与以其游离形式(例如，仅结合到小离子而不结合到本发明的缀合物)给药时的半衰期相比，以本发明的所述复合物的形式对人或动物的循环系统给药时，靶蛋白的半衰期优选增加到至少1.1倍，更优选至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍，最优选至少10倍。
本发明的所述复合物可用在医药中。优选地，所述复合物的靶蛋白具有在治疗或预防某些疾病方面有用的药学活性。更优选地，所述靶蛋白在人或动物患者的循环系统中发挥其药学活性。优选地，所述待治疗或预防的疾病是由人体或动物体内的天然蛋白的缺陷或量的减少或缺失而引起的。具体地，所述疾病可由特定蛋白的基因中遗传的缺陷或后天的缺陷引起。这类疾病的特定实例是血友病A和血友病B。例如，靶蛋白可以是因子VIII，所述复合物可用于血友病A的治疗；或者，靶蛋白可以是因子IX，那么所述复合物可用于血友病B的治疗。
因此，在另一方面，本发明涉及包含本发明的复合物的药物组合物。所述药物组合物可进一步包含适合对人或动物患者给予所述复合物的任何药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。优选胃肠外给药，尤其是通过注射(如静脉内注射或动脉内注射)给药。
优选地，所述药物组合物包含本发明的复合物，所述复合物的浓度为1pM-1mM；或每一单次剂量的复合物含量为1pg-500mg，优选为100ng-500mg。
本发明的复合物可通过将缀合物与靶蛋白接触而制备。所述靶蛋白可与所述缀合物在合适的溶剂中接触，优选是水性溶剂，如具有生理的盐浓度和生理pH范围(约6.0-约8.5)的水。然而，所述靶蛋白还可与缀合物在其他溶剂和其他条件下接触，只要所述溶剂和条件不抑制复合物的形成即可。
在另一方面，本发明涉及用于来形成所述复合物的缀合物。上面关于本发明的复合物的部分，记载了所述缀合物特定的实施方式，且参考上述公开。另外，本发明涉及各个缀合物在制备本发明的复合物方面的用途。优选地，所述的复合物通过间接体内的方式进行制备。
另外，本发明涉及一种使靶蛋白在人或动物循环系统中的半衰期延长的方法，所述方法包括将靶蛋白与本发明的缀合物接触的步骤，所述缀合物包含聚合物部分和对靶蛋白具有结合能力的结合部分。在靶蛋白与缀合物接触后，它们生成复合物。所述复合物可直接通过接触形成或可仅通过将靶蛋白和缀合物转移到合适的环境(例如，人或动物的循环系统)中形成。优选地，所述靶蛋白与缀合物在给予人或动物体之前进行接触。在某些实施方式中，所述方法在人体或动物体外进行。
所述靶蛋白与缀合物可以按从10∶1-1∶10000、优选1.2∶1-1∶100、更优选1∶1-1∶10的摩尔比接触。
以下更详细地记载了优选的实施方式，其中，所述的靶蛋白包含肝素结合位点。
与止血有关的许多蛋白都结合到肝素或类肝素。在其他蛋白中，抗凝血酶、凝血酶、冯·维勒布兰德因子、组织纤溶酶原激活物、因子VIII和因子IX与肝素或肝素类似物、酸性多糖结合。类肝素的结合由在蛋白表面表达的、所谓的肝素结合域介导。类肝素-蛋白相互作用的相对高的亲和性允许通过类肝素或其化学修饰的衍生物非共价地修饰所述肝素结合蛋白。
如在凝血因子VIII的晶体结构中所见(参见图1)，在S558-Q565位的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可自由偶联到羟烷基淀粉。
另外，与FVIII在R484-F509和/或E1811-K1818位结合的低密度脂蛋白-受体相关蛋白(LRP)可作为偶联的靶标(参见图1)。
通常，意在改进如分解代谢和/或活性的生物学机制，使得特定的分子-分子的相互作用的增加或抑制。结果延长了所述靶蛋白的半衰期。
结合配体可以是酸性的、带负电荷的多糖，例如肝素；或是其它结合物质，如模拟肽、核酸和/或有机分子。
作为结合分子，这些高度亲和(affine)的配体可以原样使用或使用时进行特定的修饰。为了形成所述缀合物，它们必须偶联到聚合物，如羟烷基淀粉(HAS/HES)、聚乙二醇(PEG)和低聚糖等。
酸性多糖可以是肝素、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖、葡糖胺聚糖及其它酸性的、优选阴离子碳水化合物聚合物，像如岩藻聚糖、硫酸化岩藻聚糖或半乳聚糖。
类似肝素的酸性低聚糖(称为“类肝素”)是高度酸性的，如高度硫酸化的多糖。在大多数物种中发现类肝素普遍存在，至少在几乎所有的动物体内都发现了硫酸乙酰肝素。
肝素通常由重复的二糖组成，所述二糖由D-葡萄糖胺以及D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸构成。D-葡萄糖胺能以N-乙酰化的氨基己糖或N-硫酸化的氨基己糖形式存在，并能在C6或C3上进一步硫酸化。所述多糖链可以是不同长度的，分子量通常在3kDa-40kDa之间，其具有还原性的末端或非还原性的末端。所述还原性末端可用于许多化学反应，即用于偶联到蛋白、碳水化合物或其他的反应参与者。在H.Edward Conrad，Academic Press，1998“Heparin-Binding Proteins”中充分记载了肝素、硫酸肝素的结构。
肝素在商业上用于体内的抗凝作用及用于医疗设备的表面涂层。
肝素和类肝素的优异性能是它们与许多所谓的肝素结合蛋白的相互作用强烈。已发现超过100种蛋白结合到类肝素。其中，不仅有凝血因子VIII或IX，还有许多不仅与凝固和血纤蛋白溶解有关的其他蛋白特异性地且强烈地结合到类肝素。肝素结合蛋白最显著和典型的实例是抗凝血酶。
其他肝素结合蛋白例如：抗凝血酶、凝血酶、冯·维勒布兰德因子、组织纤溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、玻连蛋白、蛋白C抑制剂、组织因子通路抑制剂、血小板因子4、富含组氨酸的糖蛋白、血小板反应蛋白、尿激酶、纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、脂肪酶、载脂蛋白B和载脂蛋白E。
在它们当中，与凝固和血纤蛋白溶解有关的许多蛋白特异性且强烈地结合到类肝素。肝素结合蛋白最显著和典型的例子是抗凝血酶。
肝素结合蛋白显示出至少一个所谓的肝素结合域。以前已经在如1998年H.E.Conrad，‘Heparin-Binding Proteins’，Academic Press中记载了肝素结合域的性质和常见的结构特征。
所述的肝素-蛋白结合的一个显著特性是其相对高的亲和性。如上所述，所述的类肝素-蛋白结合的结合强度通常通过其解离常数Kd表示。
用于非共价地结合到蛋白的肝素结合位点的人造酸性多糖的合成，可使得配体(即人造的酸性多糖)与结合蛋白之间的结合亲和性进一步提高。
因此，酸性多糖(如类肝素及特异性合成的人造酸性多糖)是高亲和性地、非共价地结合到肝素结合蛋白(例如与止血有关的肝素结合蛋白，如人凝血因子VIII或重组的凝血因子VIII、人凝血因子IX或重组的凝血因子IX、人冯·维勒布兰德因子或重组的冯·维勒布兰德因子)及其他结合蛋白的理想配体。
肝素和硫酸乙酰肝素是大量存在的分子，它们与各种各样不同的结合参与物相互作用，因此显示出各种混杂的结合性能。
肝素被其他类肝素取代后，能引发并优化靶蛋白的结合亲和性和特异性。另外，可通过转换成例如人工合成的阴离子多糖或植物来源的阴离子多糖，或采用肝素的模拟肽来降低包含传染物(如病毒或朊病毒)的风险。
一种可能的肝素替代物是岩藻聚糖或硫酸化岩藻聚糖。
岩藻聚糖是在全世界的沿海水中很丰富的硫酸化植物多糖(平均分子量为20,000Da)。主要是在褐藻(褐藻纲(Phyaeophyceae))和海洋无脊椎动物中发现它们。来自于褐藻的岩藻聚糖包括复杂的、高度支链的和硫酸化多糖结构，而来自海洋无脊椎动物的硫酸化岩藻聚糖是岩藻糖的直链均聚物，包括仅一种单一的连接键型，并显示有规则的、重复的低聚糖结构，但却是多样的硫酸化模式(Pomin & Mourao，2008；reviewedin Berteau & Mulloy，Glycobiology 13，2003)。建议将岩藻聚糖和硫酸化岩藻聚糖作为肝素的替代物，这是由于它们能仿效葡糖胺聚糖和其它硫酸化葡聚糖上的硫酸盐取代的模式，因而具有许多共同的生物活性(Berteau & Mulloy，2003)。同肝素一样，它们能作为凝固的调节器(Chargaff等，1936)和可以影响许多生物活性，如炎症、细胞增殖和粘附、病毒性感染及受精(Boisson-Vidal等，1995)。由于它们是植物来源的，岩藻聚糖不太可能包含如病毒或朊病毒的传染物。这使得它们成为肝素的令人满意的替代物(即岩藻聚糖-聚合物缀合物)，其用于非共价地结合到肝素结合蛋白来达到延长半衰期的目的。
除了肝素和类肝素外，还有很多可能的物质，作为所述靶蛋白高度特异性和亲和力(affine)的非共价结合参与物。这些结合物质包括：特异性结合肽(源于例如抗体识别域的序列)或模拟肽、非中和抗体、小分子或DNA/RNA片段(如适配体)。
适配体是核酸物质，该物质已通过在体外重复多轮筛选或等同地通过SELEX(指数富集配体的系统进化技术)(Tuerk.& Gold(1990)Science)进行制造，以结合到各种分子靶点，如小分子、蛋白、核酸，以及甚至是细胞、组织和器官(Ellington & Szostak(1990)Nature)。适配体可用于医疗应用，因为它们提供与通常使用的生物分子、抗体相匹敌的分子识别性质，即在低的纳摩尔到皮摩尔范围内具有高的特异性和亲和性。除了它们的区别识别，适配体还提供优于抗体之处，即它们能完全在试管中制造，很容易通过化学合成生产，享有期望的存储性质及在医疗应用中不引起或几乎不引起免疫原性。
在适配体-聚合物-缀合物(参见图3)中，本文建议将适配体作为靶蛋白的非共价结合参与物，因为它们显示出对靶蛋白具有非常特异和高度亲和的结合。由于它们源自体外，适配体完全没有如病毒或朊病毒的传染物，从而使得它们在半衰期延长的方法中成为所希望的组分。
一个稍微不同的方法可着重在翻译后修饰(PTM，如糖基化)，作为与非共价结合参与物的特异性相互作用的可能靶点，用来延长半衰期。
这里给出糖基化的FVIII/vWF复合物作为实例。例如FVIII/vWF的去唾液酸作用(desialylation)负责通过脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R；Sodetz等，JBC 1977&1978)进行快速血浆清除。基于对这些ASGP-R的相互作用进行充分表征的知识(Meier 2005)，可产生并合成ASGP-R模拟肽并通过短接头将其连接到聚合物，如HES/HAS部分(参见图4)。然后该缀合物可被用来通过屏蔽效应或空间位阻，阻断ASGP-R结合位点并抑制受体介导的清除作用，从而延长血浆半衰期。
基于靶蛋白和酶之间特异性的非共价相互作用使用模拟肽的另一个实例是弹性蛋白酶和G-CSF之间的相互作用：
弹性蛋白酶，也称为中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)或人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)，其特异地结合到G-CSF(Hunter等，2003)。基于弹性蛋白酶结合区的氨基酸序列，可使模拟肽产生、合成并连接到聚合物，例如通过短接头连接到HES/HAS部分，以延长G-CSF的半衰期。
基于现有的G-CSF的X-射线结构(Hill等，PNAS(90)1993)和几种已知的非中和的抗-G-CSF抗体(Layton等，JBC(266)1991)，可生成模拟肽模仿靶向事件(target event)，以将聚合物非共价地偶联到靶蛋白(即在本实例中的G-CSF)，以延长G-CSF药物的半衰期。
在特定的实施方式中，本发明涉及下述复合物，所述复合物包含至少一个具有肝素结合位点的蛋白和至少一个肝素或类似肝素的分子，其中，所述的肝素或类似肝素的分子共价地结合到羟烷基淀粉。
所述蛋白可以选自因子VIII、抗凝血酶、凝血酶、冯·维勒布兰德因子、组织纤溶酶原激活物和因子IX。
所述的羟烷基淀粉可以是羟乙基淀粉。所述的羟烷基淀粉的分子量为例如在100-300kD的范围。除了偶联至少一个肝素或类似肝素的分子，也可以将至少两种肝素分子或类似肝素的分子共价地结合到一个羟烷基淀粉分子。
另外，本发明提供制备如上所述的复合物的方法，该方法包括以下步骤：
-将至少一个肝素分子或类似肝素的分子偶联到至少一个羟烷基淀粉，以得到肝素-羟烷基淀粉缀合物；以及
-用具有肝素结合位点的蛋白培养所述缀合物。
在所述的方法中，所述的羟烷基淀粉可以是羟乙基淀粉。所述的至少一个肝素分子或类似肝素的分子可通过双官能团接头(例如可能是双同官能团或双异官能团)结合到所述的至少一个HAS分子。
所述的肝素或类似肝素的分子及羟烷基淀粉中的至少一个可通过下面的步骤进行修饰：
-氧化以引入醛基；
-还原胺化。
在一个实施方式中，至少两个肝素分子或肝素类似的分子结合于一个羟烷基淀粉分子。
本发明进一步涉及肝素-羟烷基淀粉缀合物或类似肝素的分子-羟烷基淀粉缀合物；包含上述复合物的药物组合物，其中，所述蛋白可以是因子VIII；及上述复合物在制备治疗出血疾病的药剂中的应用。
在一个实施方式中，所述的复合物不包含至少一个具有肝素结合位点的蛋白及至少一个肝素或类似肝素的分子，其中，所述的肝素或类似肝素的分子共价地结合到羟烷基淀粉。
在一个实施方式中，制备所述复合物的方法并不包括如下步骤：
-将至少一个肝素分子或类似肝素的分子偶联到至少一个羟烷基淀粉，以得到肝素-羟烷基淀粉缀合物；以及
-用具有肝素结合位点的蛋白培养所述缀合物。
在一个实施方式中，所述的缀合物不是肝素-羟烷基淀粉缀合物或类似肝素的分子-羟烷基淀粉缀合物。
实施例
实施例1：合成化学：HES-类肝素-缀合物
使重组因子VIII在体内半衰期延长的一种方法基于羟乙基淀粉作为大分子载体，该大分子载体通过因子VIII上的选择性结合位点非共价地得以连接。对于这种非共价连接的肝素，其衍生物或其模拟物能用作因子VIII的结合分子。HES结合到这些类肝素以形成覆盖和保护部分蛋白表面的大的复合物。
通过因子VIII的结合研究来评价本原则的证据，该研究如下：进行表面等离子体共振，随后再采用类肝素和羟乙基淀粉(1∶1)的共价缀合物进行大范围的体内研究。图2显示出含有类肝素-HES(1∶1)缀合物的复合物中，因子VIII的三维结构。
为了得到这种1∶1的缀合物，肝素和HES两者都用互补官能团在仅一个位置进行了化学修饰，这使得形成选择性的缀合物。两种分子都恰好具有一个独一无二的官能团，即多糖链的还原端的醛基/半缩醛基，这在化学上不同于这些分子中所有其他的官能团。因此，所开发的合成策略以所述的还原端的衍生化作用为基础。
羟乙基淀粉可被分离为两种不同尺寸的组分(fractions)，并且作为因子VIII-结合分子时，可使用低分子量的肝素(LMWH)，如依诺肝素(Enoxaparin)。C1-改性的LMWH与C 1-活化的羟乙基淀粉的1∶1的缀合作用以游离的巯基与马来酰亚胺官能团的迈克尔加成为基础。
HES450/0.7的水解和分级分离(fractionation)
Figure BPA00001290378500271
示意图1：羟乙基淀粉
将30g HES450/0.7(重均分子量为450kDa、每葡萄糖单元的羟乙基摩尔取代度为0.7的羟乙基淀粉)溶解在300ml的水中，再缓慢地添加1M的盐酸直到pH达到2.0。再将所述的溶液加热到80℃，剧烈搅拌16个小时。然后，将溶液冷却到50℃以下，再通过缓慢地添加1M的氢氧化钠溶液将pH调成5-6。用蠕动泵和具有不同截留分子量(如MWCO＝100、30、10、5kDa)的PES超滤膜，通过连续的切向流超滤步骤分级分离部分水解的HES450/0.7。
使用的HES组分：HES25/0.7(Mw＝25kDa)和HES54/0.7(54kDa)
C1氨基HES的合成
Figure BPA00001290378500272
示意图2：羟乙基淀粉的还原末端的还原胺化。
将200mg HES25/0.7溶解于12ml 50mM的硼酸盐缓冲液(pH 8.2)和0.168ml 1，3-二氨基丙烷中，并在50℃搅拌1h。然后，添加0.126g氰基硼氢化钠，并在50℃搅拌3天。所得产物经过1kDa超滤膜通过超滤作用进行纯化，之后冻干所得产物。所得到的白色固体在室温下贮存。
通过OxHES合成C1氨基HES
在氢氧化钠中，通过与碘的氧化作用得到OxHES(基于PhD论文，Michele Orlando，Giessen，德国2003)。
将1g HES25/0.7溶解在水中，先后添加9.0ml的0.1N碘溶液和1.4ml的1N NaOH溶液。将所述溶液搅拌过夜。所得反应产物经过1kDa PES膜通过超滤作用进行纯化。将最终的溶液通过阳离子交换树脂(AmberliteIR-120H+)后冻干。将所得到的产物干燥，以除去大部分残留水。
将0.1g所得到的OxHES溶解在1.5ml DMSO中。添加115mg HOBt和36.7mg DMAP。然后，添加190mg HATU，之后添加1，3-二氨基丙烷，并在37℃搅拌所述溶液1h。添加另外的190mg HATU，将所得的溶液在37℃过夜搅拌。
所得产品通过添加25ml 1∶1的丙酮/乙醇进行沉淀，将所得的沉淀用1∶1的丙酮/乙醇洗涤。将所述的颗粒再次溶解在2ml DMSO中，通过添加25ml 1∶1的丙酮/乙醇再次沉淀所述产物，随后再进行洗涤步骤。
将剩下的产物溶解在100ml水中，再经过1kDa的膜通过超滤作用进一步纯化。然后，将所述产物冻干。
C1马来酰亚胺HES的合成
Figure BPA00001290378500281
示意图3：在羟乙基淀粉原先的还原末端，氨基的马来酰亚胺活化
将500mg C1氨基HES溶解在15ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。添加处于10ml NMP中的140mg N-[g-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯的溶液和85.6μl N，N-二异丙基乙胺。搅拌或震荡所述溶液90分钟。将所述溶液倒入100ml 1∶1的丙酮/乙醇中并冷却到-20℃，从而将所述产物沉淀。将所述沉淀物离心，滗出上清液，并将所得的颗粒用1∶1的丙酮/乙醇再洗涤两次，然后再次离心。所得产品经过1kDa超滤膜通过超滤进行纯化，然后冻干。所得到的固体产物在-20℃贮存。
低分子量的肝素(LMWH)的化学修饰
Figure BPA00001290378500291
示意图4：还原端(C1)与胱胺和还原剂氰基硼氢化钠的还原胺化
Figure BPA00001290378500292
示意图5：还原剂DTT对C1-胱胺的还原作用
将250mg冻干的LMWH溶解在含1M的氯化钠的12ml 0.3M的磷酸盐缓冲液(pH为5.0)中。添加1.34g胱胺二盐酸盐，再将所得的溶液在40℃搅拌或震荡1小时。然后添加0.374g氰基硼氢化钠，再将所得混合物在40℃搅拌或震荡3天。
所述产物用尺寸排阻色谱进行纯化，该色谱采用50mM pH为6.5的磷酸盐缓冲液，在HiLoad26/60 Superdex 30的预装柱上，用100mM NaCl作为流动相，流速为4.4ml/min。将单一的(unified)产物组分直接用于下一步骤。
在所得到的组分中，添加91.8mg DL-1，4-二硫苏糖醇(DTT，0.6mmol，10eq)，再将所得溶液在室温下搅拌过夜。所述的产物用尺寸排阻色谱进行纯化，该色谱在HiLoad 26/60Superdex 30预装柱上用水作流动相，流速为4.4ml/min。使所述的产物组分单一化，并将其冻干。所得的白色固体在-20℃贮存。
C1马来酰亚胺HES和硫代LMWH的缀合作用
Figure BPA00001290378500311
示意图6马来酰亚胺活化的HES和硫醇活化的LMWH经迈克尔加成的缀合。
将32.2mg C1LMWH-胱胺和420mg C1马来酰亚胺HES溶解在总共14.5ml的100mM磷酸盐缓冲液(pH为7.5)中，混合后在37℃震荡过夜。
将所述的LMWH-HES缀合物在HiPrep 16/10Q FF柱(GE Healthcare)上纯化，所述柱用50mM Tris HCl-缓冲液(pH 7.5)结合，用含1M NaCl的50mM Tris HCl-缓冲液(pH 7.5)采用线性梯度进行洗脱，流速为5ml/min。对于在电导率超过30mS/cm时洗脱的组分，进一步在HiLoad 26/60Superdex200预装柱(GE Healthcare)上用含0.1M NaCl的50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)纯化，流速为4ml/min。所述产物在HiLoad 26/60Superdex200预装柱(GE Healthcare)上用水作为流动相进行脱盐，流速为4ml/min。图9显示出所述的色谱图。将所得到的产物进一步冻干，并在-20℃贮存。
肝素-HES
实施例1和实施例2由凝血因子VIII和HES-肝素-缀合物的非共价复合物组成(参见图2)。FVIII在A2域具有确定的肝素结合位点，并且能以高亲和性结合肝素和类肝素(如低分子量肝素(如依诺肝素)或岩藻聚糖)。所述肝素或类肝素通过短接头区域共价地连接到HES-部分。HES-肝素-缀合物非共价地结合至FVIII，通过屏蔽效应介导了半衰期的延长。
表面等离子体共振结合研究
用Biacore T100系统(GE Healthcare Europe GmbH，Freiburg，Germany)进行表面等离子体共振(SPR)结合研究。所述的检测系统以表面等离子体共振为基础，以实时监测分子间相互作用(Malmquist和Karlsson，1997；Rich和Myszka，2003；Piliarek 2009)。
结合反应引起表面等离子体共振的变化，对该变化在光学上进行监测，并在共振设备中进行测量。1000RU相当于表面等离子体共振角度偏转0.1°，相当于平均蛋白的表面浓度改变约1ng/mm2(Johnsson等，1991)。
在分析前，将人重组凝血因子VIII(人-CL rFVIII)和人重组凝血因子IX(rFIX)上样至与10mM NaAc(pH 5/pH 5.5)进行缓冲液交换的NAP5柱上，然后再用如供应商规定的胺偶联试剂盒，将上述凝血因子固定在CM5生物传感器芯片的葡聚糖基质上。在不存在蛋白时活化并阻断参照通道。
在25℃时，在10mM Hepes、150mM NaCl和0.005％(v/v)吐温20(pH7.4)中，以10μl/min的流速，对分析物HES-肝素缀合物和岩藻聚糖的缔合作用进行3分钟的评估。使解离作用在相同的缓冲液流中进行15分钟。
解离后，通过注射800mM NaCl 1分钟，使所述的生物传感器芯片再生。用相对于HES-肝素缀合物和岩藻聚糖与对照通道的非特异性结合，将HES-肝素缀合物和岩藻聚糖与人-CL rFVIII和人的rFIX-涂覆的通道的结合进行校准。
为确定结合常数，将不断增加的分析物浓度施用于固定的人重组凝血因子VIII。用Biaevaluation软件拟合动力学滴定数据来评估结合曲线。基于计算机对结合数据的评估，计算出所述的动力学数据(缔合速率常数[ka]、解离速率常数[kd])及亲和性数据(解离平衡常数kd)。
采用SPR法进行HES-肝素-缀合物与rFVIII的结合研究。将人-CLrFVIII固定到传感器芯片上，在不断增加缀合物浓度(14-227μM)下，通过SPR监测30kDa的HES-肝素-缀合物的缔合和解离。图5显示出一组典型的结合曲线，表明了所有浓度下HES-肝素-缀合物与人-CL rFVIII的结合。基于软件对结合曲线的分析，得到了Kd为6(±0.6)×10-7M的离解常数，清楚地表明了HES-肝素缀合物对人-CL rFVIII的强结合。
体外稳定性研究
为了在人造体系中模拟药物动力学的研究，并确定HES-肝素-缀合物的结合对FVIII稳定性的影响，进行了体外稳定性研究。因此，4IU的人-CL rFVIII与两种不同的HES-缀合物(分别为HES(30kDa)-缀合物和HES(60kDa)-缀合物)以1∶2的标称摩尔比(nominal molar ratio)混合，溶解在40μL的缓冲液中，再添加到1.7mL FVIII缺乏的血浆中(Coachrom产品编号FDP08-10，批号D8-22)，这模拟了体重为20g的血友病小鼠的全血容量。三种不同的处理(作为参照的人-CL rFVIII、与HES-缀合物(30kDa)复合的人-CL rFVIII、与HES-缀合物(60kDa)复合的人-CL rFVIII)都在37℃下培养，在每一规定的间隔后取样并直接在-80℃冷冻。
解冻后，通过生色测定法(Coachrom Diagnostica GmbH，订单号221402；批号72502-PK：6)分析所述试样的FVIII活性。这种生色测定法通过如下两个连续的步骤确定FVIII：C的活性：向FVIII试样中添加经活化的FIX(FIXa)、磷脂和钙，将FX活化为FXa；后者随后将添加的FX-底物切断，产生能用分光光度法定量的发色团。在合适的测定条件下，FXa形成(以及由此生成的发色团)与FVIII浓度之间的关系是线性的。
FVIII缺乏的血浆和在37℃的培养模拟了如上所述的血友病小鼠模型。随后，用测试FVIII：C活性的生色测定法分析所述血浆样品。用sigmaplot计算软件将所得数据转换为半衰期。无HES-缀合物的人-CL rFVIII和与HES-缀合物(60kDa)复合的人-CL rFVIII的相对半衰期(以％表示)的直接比较显示出，体外血浆半衰期延长到1.4倍。与HES-缀合物(30kDa)的复合作用显示，半衰期延长到1.35倍，清楚地表明非共价地结合到FVIII的两种HES-缀合物在体外的半衰期延长效应(参见图6)。
血友病小鼠的药物动力学研究
如下进行血友病小鼠的药物动力学研究：
本研究使用敲除FVIII的C57BL/6小鼠，所述小鼠12周龄，混合性别，体重为20-25g。
如下所述，测试和制备下面的FVIII变体：
人-CL rFVIII作为参照、与60kDa或30kDa的HES-肝素-缀合物复合的人-CL rFVIII、缓冲液作为阴性对照。人-CL rFVIII与HES-肝素-缀合物以1∶2的标称摩尔比复合，再灭菌过滤；作为参照的、不含HES-肝素-缀合物的人-CL rFVIII以及作为阴性对照的缓冲液进行相同处理。
将40μL包含4IU的FVIII(与约200IU/kg一致)通过尾部静脉以单次给药注射到血友病小鼠体内。在注射前、注射后及给药后规定的时间间隔(各组中，每种物质均在每个取样时间对五只小鼠取样)进行取样。采用从Coachrom Diagnostica GmbH，Vienna，Austria商购的生色测定装置测定FVIII：C的活性，从这些结果计算FVIII的药物动力学，并用sigma plot计算软件(Systat Software GmbH，德国)进行统计分析(包括t-检验)，以获得半衰期的时间(T1/2)。
通过比较血友病小鼠中它们的血浆半衰期，测试下面的FVIII变体：
人CL-rFVIII作为参照(第1组)、与60kDa HES-缀合物复合的人-CLrFVIII(第2组)、与30kDa HES-缀合物复合的人-CL rFVIII(第3组)、缓冲液作为阴性对照(第4组)。通常，对于每种物质，给25只血友病小鼠分别注射4IU的rFVIII，每只小鼠的注射总体积为40μL。在注射前后及给药后规定的时间间隔进行取样，每种物质均在每个取样时间对五只小鼠取样(例外：第3组，其中由于材料的限制，总共只使用了19只小鼠)。
对试样的FVIII：C的活性进行测试，并分析上述有关药物动力学参数的数据，所得结果总结在下表中：
表1
在直接比较中，与两种HES-缀合物复合的人-CL rFVIII显示出延长的血浆半衰期：对于与较小的HES-缀合物(30kDa)的复合作用，所述血浆半衰期延长到1.6倍；与较大的HES-缀合物(60kDa)的复合作用产生了延长到1.7倍的血浆半衰期(参见图7)。
这些数据清楚地表明在血友病小鼠模型中，非共价结合的HES-肝素-缀合物对FVIII具有保护性的、半衰期延长的作用；相比于较短的HES-肝素缀合物(30kDa)而言，较大的HES-肝素缀合物(60kDa)的这一作用略微明显。
正如所预期的那样，作为阴性对照，用缓冲液注射血友病小鼠通过生色测定法没有发现FVIII的活性(数据未示出)。
岩藻聚糖
为了例证肝素可能的替代物，测试岩藻聚糖对肝素结合蛋白(如凝血因子VIII和IX)的结合性质。基于SPR的结合试验表明，岩藻聚糖能非共价地结合到靶蛋白，代替半衰期延长的HES-肝素-缀合物中的肝素。
针对作为肝素结合蛋白的人-CL rFVIII和rFIX进行基于SPR的结合用于评估岩藻聚糖作为可能的肝素替代物。图8分别显示出岩藻聚糖与rFVIII(直线)和rFIX(短划线)的缔合和解离，清楚地表明岩藻聚糖与所探测蛋白的结合，因此证明岩藻聚糖适合作为可能的肝素替代物。

Claims (18)

1.包含至少一个靶蛋白和至少一个结合分子的复合物，所述结合分子对所述靶蛋白具有结合亲和性，其中，所述具有结合亲和性的分子共价或非共价地结合于至少一个水溶性聚合物。
2.权利要求1所述的复合物，其中，所述的至少一个结合分子和所述的至少一个可溶性聚合物形成缀合物，所述缀合物非共价地偶联到所述靶蛋白。
3.权利要求2所述的复合物，其中，所述蛋白选自：凝血蛋白(源自血浆的凝血蛋白或重组的凝血蛋白)，如因子IX、因子VIII(野生型和去B域的)、因子VII/VIIa、凝血酶、抗凝血酶、组织纤溶酶原激活物和冯·维勒布兰德因子(vWF)；生长因子，如红细胞生成素；集落刺激因子(CSFs)，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；细胞因子，如白介素；蛋白酶抑制剂，如α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)；整联蛋白；解联蛋白；胞外基质蛋白，如纤连蛋白和玻连蛋白；金属蛋白酶，如基质金属蛋白酶和ADAM/ADAMTS蛋白；金属蛋白酶；载脂蛋白；转运蛋白；激素；抑制性作用蛋白或调解性作用蛋白；以及上述蛋白的衍生物和突变体。
4.权利要求1-3任意一项所述的复合物，其中，所述的至少一个结合分子具有低于50kD、优选低于10kD的分子量。
5.权利要求1-3任意一项所述的复合物，其中，所述结合分子选自以下物质组成的组：肽部分，如RGD肽和RGD结合域；糖部分，如肝素和硫酸乙酰肝素和类似肝素的分子、肝素模拟分子；核酸部分；脂质部分，如脂肪酸；以及上述物质的衍生物及其模拟物。
6.权利要求5所述的复合物，其中类似肝素的分子是肝素模拟肽。
7.权利要求6所述的复合物，其中，所述的肝素模拟肽包含氨基酸基序X1-Y(SO3)X2-Y(SO3)，其中，Y(SO3)是硫酸化的酪氨酸；X1是带负电的氨基酸、丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸；以及X2是天门冬氨酸、丙氨酸或不存在。
8.权利要求1-7任意一项所述的复合物，其中，所述的可溶性聚合物选自羟烷基淀粉(HAS)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和葡聚糖。
9.权利要求1-7任意一项所述的复合物，其中，所述的水溶性聚合物的分子量在10-500kD、10-300kD、20-200kD、30-150kD或100-300kD的范围内。
10.权利要求2-9任意一项所述的复合物，所述缀合物包含：
-仅一个结合分子与两个以上的聚合物；
-两个以上的结合分子与仅一个聚合物；或
-两个以上的结合分子与两个以上的聚合物。
11.制备权利要求1-10任意一项所述复合物的方法，所述方法包括以下步骤：
-将至少一个对靶蛋白具有结合亲和性的结合分子与至少一个水溶性聚合物偶联以形成缀合物；
-用所述靶蛋白培养所述缀合物，其中所述分子对所述靶蛋白具有结合亲和性。
12.权利要求11所述的方法，其中，所述的至少一个结合分子通过双官能团接头结合于所述水溶性聚合物。
13.权利要求11或12所述的方法，其中，所述的复合物以间接体内的方式形成。
14.对蛋白具有结合亲和性的分子与水溶性聚合物的缀合物。
15.一种延长人或动物的循环系统中靶蛋白半衰期的方法，所述方法包括将所述靶蛋白与权利要求14所述的缀合物接触的步骤。
16.包含权利要求1-10任意一项所述复合物的药物组合物。
17.权利要求1-10任意一项所述的复合物在制备药剂方面的用途。
18.权利要求1-10所述的复合物，其中，所述的至少一个靶蛋白选自因子IX和因子VIII(野生型和去B域的)，所述的至少一个结合分子是肝素模拟分子，并且所述的至少一个聚合物是羟乙基淀粉。
CN2009801263251A 2008-05-06 2009-05-06 含有肝素结合蛋白和肝素-羟烷基淀粉缀合物的复合物 Pending CN102083469A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08155718 2008-05-06
EP08155718.3 2008-05-06
PCT/EP2009/055503 WO2009135888A2 (en) 2008-05-06 2009-05-06 Complex

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102083469A true CN102083469A (zh) 2011-06-01

Family

ID=39760858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801263251A Pending CN102083469A (zh) 2008-05-06 2009-05-06 含有肝素结合蛋白和肝素-羟烷基淀粉缀合物的复合物

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20110189752A1 (zh)
EP (1) EP2385844A2 (zh)
JP (1) JP2011519898A (zh)
KR (1) KR20110028444A (zh)
CN (1) CN102083469A (zh)
AU (1) AU2009245734A1 (zh)
CA (1) CA2723746A1 (zh)
IL (1) IL209058A0 (zh)
MX (1) MX2010012044A (zh)
RU (1) RU2010149797A (zh)
WO (1) WO2009135888A2 (zh)
ZA (1) ZA201007863B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105358583A (zh) * 2013-05-27 2016-02-24 新加坡科技研究局 硫酸乙酰肝素

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9011920B2 (en) 2008-12-06 2015-04-21 B. Braun Melsungen Ag Transport-mediating colloidal pharmaceutical compounds
RU2549492C2 (ru) 2009-03-31 2015-04-27 Б. Браун Мельзунген Аг Продукты слияния аминированных полисахаридов
WO2011095604A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Octapharma Biopharmaceuticals Gmbh Half-life prolongation of proteins
CN103889446B (zh) * 2011-10-18 2017-03-08 德国杰特贝林生物制品有限公司 硫酸化糖胺聚糖与透明质酸酶组合用于改善因子viii的生物利用度
US9925270B2 (en) * 2011-11-28 2018-03-27 The Regents Of The University Of California bFGF-polymer conjugates, methods for making the same and applications thereof
KR101409301B1 (ko) * 2012-05-24 2014-06-20 인하대학교 산학협력단 ＬＨＰ-ｃＲＧＤ를 유효성분으로 포함하는 간경화 예방 또는 치료용 조성물
US20180251574A1 (en) * 2018-05-02 2018-09-06 Arc Medical Devices Inc. Fucan-dendrimer based compounds and complexes

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
CN101659704A (zh) * 2004-03-11 2010-03-03 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 通过还原氨基化制备的羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物
PT1835938E (pt) * 2004-12-27 2013-11-06 Baxter Int Conjugados de polímero-factor de von willebrand

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105358583A (zh) * 2013-05-27 2016-02-24 新加坡科技研究局 硫酸乙酰肝素

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110028444A (ko) 2011-03-18
WO2009135888A3 (en) 2010-07-01
US20110189752A1 (en) 2011-08-04
RU2010149797A (ru) 2012-06-20
IL209058A0 (en) 2011-01-31
ZA201007863B (en) 2011-07-27
CA2723746A1 (en) 2009-11-12
WO2009135888A2 (en) 2009-11-12
JP2011519898A (ja) 2011-07-14
MX2010012044A (es) 2011-05-19
EP2385844A2 (en) 2011-11-16
AU2009245734A1 (en) 2009-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102083469A (zh) 含有肝素结合蛋白和肝素-羟烷基淀粉缀合物的复合物
Thakor et al. Polymer–drug conjugates: Recent advances and future perspectives
Pelegri-O’Day et al. Controlled radical polymerization as an enabling approach for the next generation of protein–polymer conjugates
CN101557830B (zh) 具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物
Haag et al. Polymer therapeutics: concepts and applications
JP7054407B2 (ja) オキシム連結のための求核触媒
CA2613208C (en) N, n-bis- (2-hydroxyethyl) glycine amide as linker in polymer conjugated prodrugs
Mero et al. Conjugation of hyaluronan to proteins
AU2010281453A1 (en) Blood coagulation protein conjugates
WO2013173543A1 (en) Nucleophilic catalysts for oxime linkage
Ferguson et al. Polysaccharides for protein and peptide conjugation
US20190240295A1 (en) Factor viii with extended half-life and reduced ligand-binding properties
Sagita et al. Synthesis of Polymer-Drug Conjugates Using Natural Polymer: What, Why and How?
JPH02238879A (ja) Ｎ―ポリオシル―ポリペプチド
McLeod Dextran prodrugs for colon-specific drug delivery
Treetharnmathurot Effect of polymer types and architectures on the properties and activities of polymer-protein conjugates
Lee Trehalose Glycopolymers and Hydrogels for Enhancing Protein Stability
Gilbert Bioresponsive polymer-protection conjugates as a unimolecular drug delivery system
Treetharnmathurot et al. Chemical modification and thermal stability study of β-cyclodextrin-and PAMAM-trypsin conjugates
WO2015104008A1 (es) Conjugado que comprende eritropoyetina y una estructura polimérica ramificada

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110601