KR20110028444A - 헤파린 결합 단백질 및 헤파린―히드록시알킬 전분 접합체를 포함하는 복합체 - Google Patents

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한스-헤오르흐 프랑크
앤디 푀트헨스
마르코 엠겐브로이히
안드레아스 리브카
카롤라 쉬뢰더
크리스토프 칸니히트
올라프 발터
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옥타파마 아게
아플라겐 게엠베하
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Abstract

하나 이상의 표적 단백질 및 상기 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 결합 분자를 포함하고, 상기 결합 친화도를 갖는 분자는 하나 이상의 수용성 중합체에 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 결합되는 것인 복합체. 특정한 구체예에서, 본 발명은 헤파린 결합 부위를 갖는 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 헤파린 또는 헤파린-유사 분자를 포함하고, 상기 헤파린 또는 헤파린-유사 분자는 히드록시알킬 전분에 공유결합에 의해 결합된 것인 복합체에 관한 것이다.

Description

헤파린 결합 단백질 및 헤파린―히드록시알킬 전분 접합체를 포함하는 복합체{Complex comprising both heparin binding proteins and heparin-hydroxyalkyl starch conjugates}
본 발명은 표적 단백질, 결합 분자 및 중합체의 복합체(complex)에 관한 것이다. 상기 복합체의 제조 방법 및 상기 복합체의 용도가 또한 개시된다.
치료적 적용을 위한 단백질과 같은 폴리펩티드의 용도가 최근에 주로 다수의 질병의 근본적인 분자 생물학적 원리에 대한 고급 지식 및 인간 폴리펩티드를 위한 개선된 재조합 발현 및 전달 시스템의 이용가능성 때문에 확대되었다. 폴리펩티드 치료제는 환자에서 특히, 유전된 유전자 결함 때문에, 특정한 천연 폴리펩티드가 결함이 있거나 결실된 것인 질환에서 주로 이용된다.
예를 들면, 혈우병은 특정한 혈장 단백질의 결핍에 의해 유발된 질환이다. 혈우병 환자들은 혈액 응고 캐스캐이드의 단백질 성분들의 교란된 기능에 의해 유발된 출혈 이환(hemorrhagic morbidity)을 겪는다. 영향받은 응고 인자에 따라, 두 종류의 혈우병으로 구별될 수 있다. 두 종류의 혈우병은 모두 가용성 피브리노겐의 불용성 피브린-덩이(fibrin-clot)로의 전환 억제를 공통으로 갖는다. 혈우병은 주로 남성 집단에 영향을 미치는 열성 X-염색체-연관 유전 질환이다.
혈우병 A는 10,000 명의 남성 당 1 내지 2명에게 영향을 미친다. 혈우병 A는 혈액 응고 캐스캐이드의 중요한 요소인, 매우 큰 당단백질(약 330 kDa의 Mwa (Furie B., Furie B.C., Cell (1988) 53, 505-518)), 인자 VIII의 결핍 또는 부재에 의해 유발된다. 인자 VIII 폴리펩티드 서열은 3개의 영역, 소위 A1 및 A2-도메인으로 구성된 N-말단 영역, 중앙 B-도메인 영역 및 A3, C1 및 C2 도메인으로 구성된 C-말단 영역으로 세분될 수 있다. 혈액에서, 응고 인자 VIII은 불활성 전구체로 나타난다. 응고 인자 VIII은 안정화시키는 담체 단백질로 작용하는 폰 빌브란트 인자(von Willebrand Factor, vWF)에 강하게 비-공유결합에 의해 결합된다. 3개의 특정한 위치(740, 372, 1689)에서 트롬빈에 의한 인자 VIII의 단백질분해성 절단(proteolytic cleavage)은 인자 VIII의 vWF로부터의 해리를 초래하고 혈액 응고 캐스캐이드 내에서 응고촉진 기능을 가져온다. 그의 활성화 형태에서, 인자 VIII은 인자 IXa의 보조인자로 작용하고, 그에 의해 인자 X의 단백질분해성 활성화를 수십배 가속화시킨다.
혈우병 B는 25,000명의 남성당 약 1명에서 발생한다. 혈우병 B는 세린 프로테아제 인자 IX(크리스마스 인자)의 결핍을 특징으로 한다. 이 45개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드는 간에서 56 kDa 당단백질로 합성된다. 그의 적합한 기능을 얻기 위해, 비타민 K의 존재 하에서만 일어나는 번역후 카르복시화 단계가 요구된다.
두 종류의 출혈 질환의 치료는 통상적으로 인자 VIII 또는 인자 IX의 인간 혈장-유래 단백질 농축물의 주입을 포함한다. 이 방법은 혈우병을 위한 효율적인 치료법이나, 간염이나 AIDS를 유발하는 바이러스와 같은 다양한 감염성 매개체, 또는 혈전색전성 인자(thromboembolic factor)의 전달 위험을 갖는다. 대안적으로, 응고 인자의 제조를 위한 여러 재조합 DNA 기법이 개시되었다. 이 목적을 위해, 야생형 인자 VIII 및 인자 IX의 cDNA가 분리되고 적합한 발현 벡터로 클로닝되었다 (EP-A-160457; WO-A-86/01961, 미국특허 제4,770,999호, 제5,521,070호 및 제5,521,070호).
인자 VIII의 경우, 응고제 활성을 보이는 복합체의 생성을 위한 서브유닛의 재조합 발현이 당해 기술 분야에서 공지되어 있다(예를 들면, EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, 미국특허 제5,045,455호 및 제5,789,203호). 또한, 고도로 글리코실화된(highly glycosylated) B-도메인을 코딩하는 서열이 부분적으로 또는 완전히 결핍된 절단된(truncated) cDNA-버전의 발현이 개시되었다(예를 들면, WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, WO-94/29471, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, 미국특허 제4,868,112호 및 제4,980,456호, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 및 WO-91/09122). 보다 최근에, 활성화된 단백질 C에 의한 인자 VIII의 단백질분해성 불활성화를 억제하거나 또는 치료된 환자에 의한 억제성 항체의 형성을 초래하는 면역원성을 감소시키기 위해 다양한 선택된 점 돌연변이가 도입되었다(예를 들면, 미국특허 제5,859,204호, 제5,422,260호 및 제5,451,521호, WO-97/49725, WO-99/29848, 및 M. L. Liu et al., British J. Haematol. 103: 1051-1060 (1998) 참조).
그러나, 인자 VIII과 같은 폴리펩티드 치료제는 짧은 순환 반감기(circulating half-life), 면역원성 및 단백질분해성 분해를 포함한 다수의 단점과 연관된다. 예를 들면, 인체 내에서 단백질 인자 VIII의 반감기는 약 12시간이고, 7명의 폰 빌브란트 질환(vWD) 환자에서, 그 반감기는 약 2시간이다. 최근에, 예방적 치료는 선진국에서 혈우병 환자의 첨단 치료를 나타낸다. 예방적 치료는 통상적으로 주당 2 내지 4회의 주입을 가져온다.
치료 목적을 위해 이용되는 다수의 단백질, 예를 들면, 에리트로포이에틴, 과립구-콜로니 자극 인자(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF), 단일클론 항체 등이 있다.
다수의 경우에, 환자에게 적용된 치료 단백질의 효율성을 증가시키거나 또는 그 양을 감소시키기 위해 치료 단백질의 반감기를 증가시키는 것이 유용할 것이다. 이는 또한 치료 비용을 감소시킬 것이다.
종래 기술에서, 폴리펩티드 치료제의 짧은 순환 반감기는 중합체를 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착시키는 것에 의해 다루어졌다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란, 또는 히드록시에틸 전분(HES)의 부착은 일부 폴리펩티드의 반감기의 개선을 보였다.
그러나, 중합체의 부착에 따른 다수의 문제가 발견되었다. 예를 들면, 중합체의 부착은 약물 활성의 감소를 초래할 수 있다. 또한, 중합체를 단백질에 결합시키기 위해 이용된 일부 시약은 반응성이 충분하지 않고 따라서 긴 반응 시간을 요구하며, 그 반응 시간 동안 단백질 변성 및/또는 불활성화가 일어날 수 있다. 또한, 불완전한 또는 불-균일한 부착은 상이한 특성을 갖는 화합물의 혼합 집단을 초래한다.
본 발명의 하나의 목표는 종래 기술의 단점을 극복하는 것이고, 특히, 주입 비율(infusion rate)을 감소시키고 환자의 삶의 질을 개선하기 위해 인간 또는 동물 순환에서 단백질의 반감기를 연장시키는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 인간 또는 동물의 순환에서 표적 단백질의 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 표적 단백질 및 상기 표적 단백질에 대한 결합 친화도(binding affinity)를 갖는 하나 이상의 결합 단백질을 포함하고, 상기 결합 친화도를 갖는 분자는 하나 이상의 수용성 중합체에 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 결합되는 것인 복합체를 개시한다.
놀랍게도, 표적 단백질과 강하게 결합할 수 있는 결합 분자를 통한 중합체의 표적 단백질로의 비-공유결합에 의한 커플링(coupling)이 환자에 대한 큰 잇점인, 유의성 있게 증가된 반감기를 가져온다는 것이 발견되었다.
결합 분자가 단백질의 특정한 결합 부위로 결합하기 때문에, 결합 분자에 커플링된 중합체는 단백질의 주위에 위치하고, 따라서, 상기 단백질의 생리학적 특성에 영향을 미친다. 중합체의 크기 및 물리적 특성 때문에, 신장을 통한 단백질의 순환으로부터의 제거(clearance) 및/또는 단백질의 분해, 예를 들면, 특정한 세포로의 흡수를 통한 분해가 손상되는 것으로 사료된다.
일부 경우에, 형성된 복합체의 전체 크기는 순환으로부터 제거될 수 있는 분자의 최대 크기를 초과할 수 있다. 특히, 중합체에 결합된 단백질은 신장에서 막을 통과할 수 없고, 따라서, 혈류 중에 남고 소변을 통해 배출되지 않는다.
결합 분자와 중합체는 함께 접합체(conjugate)를 형성하고 표적 단백질은 상기 접합체에 비-공유결합에 의해 커플링된다. 바람직하게는, 결합 분자는 상기 접합체 중의 중합체에 공유결합에 의해 결합된다.
접합체는 또한 세포에 의한 단백질의 흡수 및/또는 분해 효소에 의한 단백질의 인식 및 결합을 방해할 수 있다. 특히, 단백질에 결합된 경우, 접합체는 분해 및/또는 제거에 관여된 특정한 단백질 영역을 가리거나 또는 단백질의 전체 전하를 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 접합체는 (i) 단백질의 세포 내로의 흡수를 촉진하는 수용체 또는 인자 및/또는 (ii) 프로테아제, 유비퀴틴-접합 효소, 프로테오솜 등과 같은 분해 경로에 관여된 단백질에 의해 인식되는 단백질의 결합 영역을 가린다.
또한, 본 발명의 복합체 및 방법은 치료에서 사용된 단백질이 순환 중 반감기를 연장하기 위해 화학적으로 변형될 필요가 없다는 장점을 제공한다. 오히려, 본 발명에 따른 접합체는 그들의 기능을 발휘하기 위해 예를 들면, 기존의 약제학적 조성물에 내포될 수 있다. 임상적 허가에 의존하는 약제학적 적용을 위해, 치료 주체(therapeutic entity)가 변하는 것이 아니기 때문에 이것은 통상적인 커플링 전략에 비해 장점이다. 본 발명에 따른 복합체는 바람직하게는 체외에서(ex vivo) 형성된다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 표적 단백질 및 상기 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 결합 분자를 포함하는 복합체로서, 상기 결합 친화도를 갖는 결합 분자는 하나 이상의 중합체에 바람직하게는 공유결합에 의해 결합되는 것인 복합체를 제공한다. 상기 결합 분자와 중합체는 함께 표적 단백질의 결합 부위에 결합하는 접합체를 형성한다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 복합체에 존재하는 접합체 및 복합체를 형성하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 표적 단백질을 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제1 양태에 따른 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 표적 단백질을 중합체 및 상기 표적 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 결합 분자를 포함하는 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 또는 동물의 순환에서 표적 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 각각 의약에서 및 약제학적 조성물의 제조를 위한 제1 양태에 따른 복합체의 용도에 관한 것이다. 또한, 이 양태는 제1 양태에 따른 복합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 중합체를 결합 분자에 커플링시키는 단계를 포함하는, 제3 양태에 따른 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이 양태들의 특정한 구체예가 하기에서 및 첨부된 청구항에 기재된다.
정의:
본 명세서에서 사용된, 하기의 표현들은 그들이 사용된 문맥이 달리 표시하지 않는 한, 일반적으로 바람직하게는 하기에 기재된 의미를 갖도록 의도된다.
본 명세서에서 사용된 표현, "포함하다(comprise)"는 또한 표현 "필수적으로 구성되다(consist essentially of)" 및 "구성되다(consist of)"를 포함하고 구체적으로 이들을 의미한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "복합체(complex)"는 구체적으로 둘 이상의 화합물 간의 비-공유결합성 물리적 결합(physical association)을 의미한다. 복합체의 화합물, 이 경우, 적어도 표적 단백질과 접합체는 하나 이상의 (비-공유결합성) 분자간 힘, 예를 들면, 이온성 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용(dipole-dipole interaction), 수소결합, 반-데르-발스(van-der-Waals) 상호작용 및/또는 소수성 효과를 통해 결합된다.
용어 "접합체(conjugate)"는 각 화합물로부터의 특성의 적어도 일부가 접합체 내에서 유지되도록 상호 연결된 둘 이상의 화합물을 의미한다. 연결(linking)은 공유 결합 또는 비-공유 결합에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 접합체의 화합물은 공유 결합을 통해 연결된다. 접합체의 상이한 화합물은 화합물의 원자들 간의 하나 이상의 공유 결합을 통해 상호 간에 직접 결합될 수 있다. 대안적으로, 화합물은 화합물의 원자들에 공유결합에 의해 부착되는 것인 링커 분자를 통해 상호 간에 결합될 수 있다. 접합체가 두 개보다 많은 화합물로 구성된 경우, 이 화합물들은 예를 들면, 하나의 화합물이 다음 화합물에 결합되는 것인 사슬 구조(chain conformation)으로 연결되거나, 또는 여러 화합물 각각이 하나의 중심 화합물에 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "단백질(protein)"은 아미노산의 분자 사슬 또는 둘 이상의 아미노산 사슬의 복합체를 의미한다. 단백질은 천연 아미노산 및 인공 아미노산을 포함할 수 있고 생물학적 기원 또는 합성 기원일 수 있다. 단백질은 자연적으로(번역-후 변형) 또는 합성에 의해, 예를 들면, 글리코실화, 아미드화(amidation), 카르복실화(carboxylation) 및/또는 인산화에 의해 변형될 수 있다. 단백질은 두 개 이상의 아미노산을 포함하나, 특정 길이일 필요는 없다; 이 용어는 크기 제한을 포함하지 않는다. 본 출원에서, 용어 "단백질", "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "펩티드(peptide)"는 호환적으로 이용된다. 바람직하게는, 단백질은 10개 이상의 아미노산을 포함하고, 바람직하게는 50개 이상의 아미노산, 100개 이상의 아미노산을 포함하고, 가장 바람직하게는 100개 이상의 아미노산을 포함한다.
용어 "핵산(nucleic acid)"은 단일-가닥 핵산 및 이중-가닥 핵산 및 리보핵산 및 데옥시리보핵산을 포함한다.
용어 "결합 부위(binding site)"는 구체적으로 그의 형태, 소수성 및/또는 (부분적) 전하의 결과, 결합하는 단백질의 영역을 의미한다. 유리하게는, 결합 부위는 자연적으로 예를 들면, 헤파린과 같은 표적 분자와 비-공유결합에 의해 결합될 수 있다.
결합 부위의 특정한 예는 헤파린 및/또는 헤파란 술페이트, 헤파리노이드, 및/또는 그의 유도체와 같은 밀접하게 관련된 화합물에 결합할 수 있는 헤파린 결합 부위이다. 또 다른 예는 1가 금속 이온, 2가 금속 이온, 3가 금속 이온 및 4가 금속 이온으로 구성된 군으로부터 선택된 금속 이온에 결합할 수 있는 금속 이온 결합 부위이다. 대표적인 금속 이온은 아연 이온, 구리 이온, 코발트 이온, 카드뮴 이온, 및 수은 이온이다. 추가적인 예는 RGD 펩티드, 즉, 아미노산 서열, 아르기닌(R), 글리신(G), 아스파르테이트(D)를 포함하는 펩티드, 또는 밀접하게 관련된 서열을 갖는 펩티드 및/또는 이들의 유도체에 결합할 수 있는 RGD 결합 부위이다. 추가적인 예는 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 스핑고리피드, 사카로리피드(saccharolipid), 폴리케티드(polyketide), 스테롤 지질, 프레놀 지질 및 지방산을 포함한 지질에 결합할 수 있는 지질 결합 부위이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "결합 분자(binding molecule)"는 단백질의 결합 부위에 비-공유결합에 의해 결합할 수 있는 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 결합 부위로의 결합은 특이적이고, 즉, 그 결합은 단백질의 자연적 환경, 예를 들면, 인간 또는 동물 순환에 존재하는 대부분의 다른 분자와의 상호작용보다 더 강하다. 바람직한 구체예에서, 결합 모이어티는 생리적 조건 하에서 1 mM 이하, 보다 바람직하게는 300 μM 이하, 100 μM 이하, 30 μM 이하, 10 μM 이하, 3 μM 이하, 1μM 이하, 300 nM 이하, 100 nM 이하, 30 nM 이하 및 가장 바람직하게는 10 nM 또는 1 nM 이하의 해리 상수(dissociation constant)를 갖는 친화도로 결합 부위에 결합한다. 결합 모이어티의 구조 및 조성은 결합 모이어티가 결합 부위에 결합할 수 있는 한, 어떤 방식으로도 제한되지 않는다. 바람직하게는, 결합 모이어티는 무독성이고 생리학적으로 허용가능하다. 예를 들면, 결합 모이어티는 펩티드 모이어티, 당(saccharide) 모이어티, 핵산 모이어티, 지질 모이어티, 또는 그의 모방체(mimetic) 화합물, 또는 그의 조합일 수 있다. 결합 분자의 특정한 예는 헤파린, 헤파란 술패이트, 헤파린-유사 분자, 예를 들면, 특히, 헤파린-모방체 펩티드, RGD 펩티드,금속 이온 모방체, 지질, 이들의 유도체 및 이들의 모방체이다.
용어 "중합체(polymer)"는 구체적으로 공유결합에 의해 결합된 보다 큰 분자를 형성하는 둘 이상의 분자 종("단량체")으로 구성된 화합물을 의미한다. 중합체는 천연물이거나 또는 합성물이고, 직쇄형, 분지형, 또는 수지상(dendritic)일 수 있다. 중합체는 반응성 작용기와 같은 적합한 치환기에 의해 더 유도체화될 수 있다.
용어 "수용성 중합체(water-soluble polymer)"는 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate), 튜브, 등을 제조하기 위해 이용되는 고체 중합체와 대조적으로, 물에서 가용성인 중합체를 의미한다. 1 mg/ml의 농도에서, 수용성 중합체는 상 분리 없이 물과 용액을 형성한다.
용어 "히드록시알킬 전분(hydroxyalkyl starch)" 또는 "HAS"는 하나 이상의 히드록시알킬 기에 의해 치환된 전분 유도체를 의미한다. 전분은 바람직하게는 감자 전분 또는 옥수수 전분과 같은 천연 전분이다. 히드록시알킬 기는 바람직하게는 글루코오스 유닛의 C2, C3 및/또는 C6 탄소 원자에 있는 산소에 결합하고 주로 C2 및 C6에서 나타난다. 도입된 히드록시알킬기의 양은 글루코오스 분자당 히드록시알킬기의 평균 갯수로 정의된, 몰 치환도(molar degree of substitution, MS)로 표현될 수 있다 (최대 MS = 3.0; 통상적으로 0.4 내지 0.7임). 결합된 히드록시알킬기는 적합한 화학 구조를 가질 수 있으나, 바람직하게는 예를 들면, 1개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 또는 분지형 저급 알킬기이다. 바람직하게는, 히드록시알킬기는 2개 내지 8개의 탄소 원자를 가지며, 보다 바람직하게는 2개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다. 예를 들면, 히드록시알킬기는 히드록시에틸, 히드록시프로필 또는 히드록시부틸기일 수 있고, 히드록시에틸, 특히, 2-히드록시에틸이 가장 바람직하다. 히드록시알킬기가 히드록시에틸, 바람직하게는 2-히드록시에틸인 것인 히드록시알킬 전분은 "히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch)" 또는 "HES"로 지칭된다.
화합물의 "유도체(derivative)"는 해당 화합물이 하나 이상의 화학적 모이어티에 의해 치환되고 및/또는 하나 이상의 화학적 모이어티가 결실된 것인 화합물을 의미한다. 유도체는 자연적 과정(예를 들면, 단백질의 인산화, 핵산의 메틸화 등)에 의해 수득된 유도체 및 화학적 합성에 의해 수득된 유도체를 포함한다. 유도체의 대표적 치환기는 히드록시, 카르복시, 케토, 알데히드, 아미노, 술피트, 술페이트 및 포스페이트기와 같은 관능기; 또는 알킬, 아릴, 알콕시, 등과 같은 다른 기이다.
본 명세서에서 사용된, 표적 화합물의 "모방체(mimetic)"은 구체적으로, 표적 화합물의 특성과 유사한 하나 이상의 특성을 갖는 화합물을 의미한다. 특히, 표적 화합물이 단백질의 특정한 결합 부위에 결합할 수 있는 경우, 표적 화합물, 예를 들면, 헤파린의 모방체도 상기 결합 부위에, 바람직하게는 비슷한 친화도로 결합할 수 있다. 보다 바람직하게는, 결합 부위에 대한 친화도를 정의하는, 모방체의 해리 상수는 표적 화합물의 해리 상수(dissociation constant)의 1000배 이하, 보다 바람직하게는 표적 화합물의 해리 상수의 500배 이하, 100배 이하, 50배 이하, 20배 이하, 10배 이하, 5배 이하, 2배 이하, 1.5배 이하, 1.2배 이하이고, 가장 바람직하게는 표적 화합물의 해리 상수와 동일하거나 그보다 더 낮다.
바람직한 구체예에서, 모방체의 삼차원 구조 및/또는 전하의 공간적 분포는 표적 화합물과 비슷하고, 적어도 결합 부위로의 결합과 관련된, 부분, 또는 그의 일부에서 비슷하다.
"링커(linker)"는 둘 이상의 표적 화합물을 상호 간에 연결시키는 화학적 모이어티이다. 이를 위해, 링커 분자는 표적 화합물에 커플링되기 전에, 표적 화합물과 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기를 보인다. 두 개의 표적 화합물 간의 연결(link)은 하나의 링커 분자를 이용하여 형성될 수 있거나, 또는 제2 (또는 두 개의) 표적 분자가 커플링되기 전에 일련의 링커 분자가 상호 간에 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "순환(circulation)"은 구체적으로 심장, 혈액 및 혈관을 포함하는, 인간 또는 동물의 심혈관계 및/또는 림프계를 의미한다.
화합물의 "반감기(half-life)"는 구체적으로 화합물의 양이 최초 값의 반까지 감소되는데 소요되는 시간을 의미한다. 예를 들면, 순환 중 화합물의 반감기는 순환 중 화합물의 농도가 최초 농도, 즉, 화합물이 순환에 첨가된 시점의 농도의 반까지 감소시키는데 소용되는 시간이다. 순환 중 화합물의 반감기는 화합물의 신장 제거 속도(renal clearing rate), 화합물의 (효소에 의한) 분해 속도, 화합물의 세포로의 흡수 속도 등과 같은 다양한 인자들에 의해 영향받는다.
용어 "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 구체적으로 인간 또는 동물에 투여하기에 적합한 조성물, 즉, 약제학적으로 허용가능한 성분을 포함하는 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 담체, 희석제 또는, 완충제, 보존제, 및 장성 변형제(tonicity modifier)와 같은 약제학적 부형제와 함께 활성 화합물, 또는 그의 염 또는 전구체 약물을 포함한다.
용어 화합물의 "분자량(molecular weight)"은 구체적으로 화합물의 1 몰의 중량을 의미한다. 화합물이 복잡분산계(polydisperse)인 경우, 분자량은 표시된 중량-평균 분자량보다 더 높거나 또는 더 낮은 분자량을 갖는 단일 화합물을 포함할 수 있는, 복잡분산계 혼합물의 중량-평균 분자량(weight-average molecular weight)을 의미한다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 과학 문헌 및 기타 문서는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 인간 또는 동물 순환 중 표적 단백질의 반감기가 중합체에 커플링된 결합 분자를 이용하여 중합체를 상기 표적 단백질에 비-공유결합에 의해 결합시키는 것에 의해 증가될 수 있다는 발견에 근거한다.
이 양태에서, 본 발명은 표적 단백질 및 중량체 모이어티 및 상기 표적 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 결합 모이어티를 포함하는 접합체를 포함하는 복합체로서, 상기 표적 단백질은 상기 접합체에 비-공유결합에 의해 커플링되는 것인 복합체에 관한 것이다.
순환 반감기가 증가될 표적 단백질은 표적 단백질이 결합 모이어티와 결합할 수 있는 결합 부위를 보이는 한, 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 물에 용해될 수 있다. 특정한 구체예에서, 단백질은 인간 및/또는 동물에서 약리적 활성을 가지며 바람직하게는 질병, 예를 들면, 하기에서 검토되는 질병의 치료에서 유용하다. 바람직하게는, 표적 단백질은 치료에서 예를 들면, 정맥내(intravenal) 또는 동맥내 주사에 의해 순환으로 직접 투여된다.
바람직한 구체예에서, 표적 단백질은 치료적 활성을 갖는다. 적합한 표적 단백질은 헤파린 결합 부위, RGD 펩티드 결합 부위, RGD 모티프, 금속 이온 결합 부위, 지질 결합 부위 및 핵산 결합 부위로 구성된 군으로부터 선택된 결합 부위를 포함한다.
적합한 표적 단백질은 인자 IX, 인자 VIII (야생형 및 B-도메인 결실 인자 VIII), 인자 VII/VIIa, 트롬빈, 항트롬빈, 조직 플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator) 및 폰 빌브란트 인자(vWF)와 같은 (혈장 유래 또는 재조합) 혈액 응고 인자, 에리트로포이에틴과 같은 성장인자, 과립구 자극 인자(G-CSF), 대식구 CSF(M-CSF) 및 과립구-대식구 CSF(GM-CSF)와 같은 콜로니-자극 인자(CSF), 인터루킨과 같은 사이토카인, 알파-1-안티트립신(A1AT)과 같은 프로테아제 억제제, 인테그린, 디스인테그린(disintegrin), 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 세포외 매트릭스 단백질, 매트릭스 메탈로프로테아제 및 ADAM/ADAMTS 단백질과 같은 메탈로프로테아제(metalloprotease), 아포리포프로테인(apolipoprotein), 수송 단백질, 억제성 또는 조절성 단백질 및 이들의 유도체 및 돌연변이체로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 표적 단백질은 10 kDa 이상, 바람직하게는 30 kDa 이상, 및 가장 바람직하게는 50 kDa 이상의 분자량을 갖는다. 또한, 표적 단백질은 1000 kDa 이하, 바람직하게는 500 kDa 이하, 가장 바람직하게는 200 kDa 이하의 분자량을 가질 수 있다.
헤파린 결합 부위를 갖는 적합한 표적 단백질은 예를 들면, 항트롬빈, 트롬빈, 폰 빌브란트 인자, 조직 플라스미노겐 활성자, 인자 VIII, 인자 IX, 비트로넥틴, 단백질 C 억제제, 조직 인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 혈소판 인자 4, 히스티딘-풍부 당단백질(histidine-rich glycoprotein), 트롬보스폰딘, 우로키나아제, 피브로넥틴, 섬유모세포 성장 인자, 간세포(hepatocyte) 성장 인자, 리파아제, 아포리포프로테인 B, 아포리포프로테인 E이다.
본 발명을 위해 적합한 결합 부위의 예는 헤파린 결합 부위, RGD 펩티드 결합 부위, RGD 모티프, Src 상동성 2 (Src Homology 2, SH2) 도메인, Src 상동성 3 (SH3) 도메인, 금속 이온 결합 부위, 지질 결합 부위, 핵산 결합 부위이다. 바람직한 구체예에서, 표적 단백질은 도 1에 도시된 혈액 응고 인자 VIII의 헤파린 결합 부위와 같은 헤파린 결합 부위를 포함한다.
RGD 결합 부위를 포함하는 표적 단백질은 예를 들면, 인테그린을 포함한다. RGD 모티프 함유 표적 단백질의 예는 디스인테그린, 및 피브로넥틴과 비트로넥틴과 같은 세포외 매트릭스 단백질이다.
금속 이온 결합 부위를 포함하는 표적 화합물은 예를 들면, 매트릭스 메탈로프로테아제 및 ADAM/ADAMTS 단백질과 같은 메탈로프로테아제; 및 메탈로테오네인(metallotheonein)을 포함한다.
지질 결합 부위를 포함하는 표적 화합물은 예를 들면, 아포리포프로테인을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 표적 단백질은 표적 단백질의 분해 및/또는 제거에 적어도 부분적으로 참여하는 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다.
순환 중 반감기가 증가될 표적 단백질에 따라, 접합체의 결합 모이어티가 선택되어야 한다. 바람직하게는, 결합 모이어티는 선택적으로 표적 단백질에 결합한다. 통상적으로, 표적 단백질과 접합체의 복합체는 결합 모이어티에 결합할 수 있는 다른 단백질의 부재 하에 인 비트로에서 형성된다.
복합체가 일정 시간 동안 완전하게 유지되게 하기 위해, 즉, 투여 후 결합된 상태로 유지되게 하기 위해, 표적 단백질에 대한 결합 모이어티의 강한 친화도 및 특이성이 바람직하다. 이는 반감기의 연장을 달성하기 위해 중요하다. 두 화합물의 상호작용의 결합 강도는 해리 상수(dissociation constant) Kd로 표현된다. 해리 상수 Kd는 결합 화합물 대비 미결합(unbound) 화합물의 비, 예를 들면, 단백질-접합체 복합체 대비 유리 표적 단백질과 유리 접합체의 농도의 비를 나타내는, 평형 상수이다. 생물계에서 통상적인 범위는 마이크로몰 내지 피코몰이다. 예를 들면, 생리적 염 농도에서, 헤파린의 단백질(즉, 헤파린-결합 단백질)로의 결합의 Kd 값은 낮은 나노몰 내지 높은 나노몰의 범위이다. 예를 들면, Olson 등, 1981 J. Biol. Chem., 256, 11073-11079은 헤파린의 항트롬빈 III로의 결합에 대한 해리 평형 상수 7.2 +/-1.9 X 10-8 M을 결정했고, 이는 단백질-헤파리노이드 상호작용의 높은 친화도를 나타낸다.
따라서, 표적 단백질-결합 모이어티 상호작용 및 마찬가지로, 표적 단백질-접합체 상호작용의 해리 상수 Kd는 바람직하게는 마이그로몰 이하의 범위이다. 바람직하게는 상기 해리 상수는 100 μM 이하, 보다 바람직하게는 100 nM 이하이다.
결합 분자는 펩티드 모이어티, 당(saccharide) 모이어티, 핵산 모이어티, 지질 모이어티 및 기타 유기 화합물을 포함한 임의의 화학적 물질일 수 있다.
일 구체예에서, 결합 분자는 표적 단백질의 천연 리간드, 또는 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드의 일부를 포함한다. 그러나, 결합 분자가 표적 단백질의 천연 리간드를 포함할 필요는 없다. 일 구체예에서, 결합 분자는 표적 단백질의 천연 리간드의 모방체를 포함한다. 그와 같은 모방체는 임의의 화학적 물질을 수 있고, 바람직하게는 천연 및/또는 인공 아미노산을 포함하는 펩티드 모방체; 천연 및/또는 인공 단당류를 포함하는 당 모방체; 천연 및/또는 인공 뉴클레오티드 또는 정상적인 포스포디에스테르 결합 또는 인공 결합(artificial linkage)을 통해 연결된 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함하는 핵산 모방체; 또는 유기 화합물 모방체이다.
따라서, 표적 화학물이 헤파린 결합 부위를 포함하는 경우, 결합 분자는 헤파린 모이어티, 헤파린 술페이트 모이어티, 또는 푸코이단(fucoidan)과 같은 헤파린-유사 모이어티, 술페이트화 푸칸(sulphated fucan) 또는 헤파리노이드, 즉, 높은 산성의 다당류, 예를 들면, 고도로 술페이트화된 다당류(highly sulphated polysaccharide), 또는 그의 모방체일 수 있다. 헤파린은 에녹사파린(enoxaparin) (Clexan; Mw = 4,2 kDa)과 같은, 약 8000 Da 미만의 중량-평균 분자량을 갖는 저분자량 헤파린(LMWH) 또는 완전한 합성 펜타사카라이드 폰다파리눅스(Fondaparinux) (Arixtra; 1726.77 g/mol)일 수 있다. 바람직하게는, 헤파린, 헤파란 술페이트, 또는 헤파리노이드는 평균적으로 3개 내지 20개의 단당류 유닛, 보다 바람직하게는 펜타사카라이드와 같이, 5개 내지 15개의 단당류 유닛으로 구성된다.
바람직하게는, 헤파린-유사 분자는 헤파린 모방체 펩티드와 같은 표적 단백질의 헤파린 결합 부위에 결합하는 펩티드이다. 따라서, 헤파린 또는 헤파란 술페이트의 모방체는 Glu 또는 Asp와 같은 음전하를 띤 아미노산, 술페이트화 아미노산, 특히, 술페이트화 티로신과 같은 음전하를 띤 작용기에 의해 변형된 아미노산, 및 인산화 아미노산, 특히, 인산화 티로신, 세린 또는 쓰레오닌, 및/또는 곁사슬에 산 모이어티를 갖는 비-천연 아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 헤파린 모방체 펩티드는 술페이트화 티로신과 같은 하나 이상의 술페이트화 아미노산을 포함한다. 일 구체예에서, 모방체 펩티드는 아미노산 모티프 X1-Y(SO3)-X2-Y(SO3)를 포함하고, 상기에서 Y(SO3)는 술페이트화 티로신이고, X1은 음전하를 띤 아미노산, 세린, 알라닌, 또는 글리신이고, X2는 아스파르테이트, 알라닌이거나 또는 존재하지 않는다. 대표적인 모방체 펩티드는 하기의 아미노산 모티프를 포함한다:
-SY(SO3)DY(SO3),
-SY(SO3)DY(SO3)SY(SO3)DY(SO3) 또는
-Y(SO3)Y(SO3)GGY(SO3)DY(SO3).
또한, 헤파린 또는 헤파란 술페이트의 모방체는 수라민(surmain) 또는 그의 유도체와 같은 화학적 화합물; 술폰화 중합체, 아미노산 곁사슬을 갖는 중합체 및 단당류 또는 이당류 곁사슬을 갖는 중합체와 같은 유기 중합체; 또는 술페이트화 당류, 특히, 술페이트화 펜타사카라이드일 수 있다.
헤파린의 적절한 모방체가 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, H. H. A. M. Hassan, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 7: 1206-1235 (2007), S. H. Kim and K. L. Kiick, Peptides 28: 2125-2136 (2007), 및 H. D. Maynard and J.A. Hubbell, Acta Biomateriala 1:451-459 (2005)에 기재된다.
표적 단백질이 RGD 결합 부위를 포함하는 경우, 결합 모이어티는 RGD 모티프를 포함하는 천연 또는 합성 펩티드일 수 있다. 적합한 서열이 디스인테그린 및 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들면, 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 인테그린 결합 단백질에서 발견될 수 있다.
표적 단백질이 RGD 모티프를 포함하는 경우, 결합 모이어티는 예를 들면, 여러 인테그린에서 발견되는 RGD 결합 단백질과 같은 RGD 결합 모티프, 또는 RGD 모티프에 특이적으로 결합하는 합성 화합물, 예를 들면, WO 90/03983 또는 WO 97/08203에 기재된 것과 같은 고리형 펩티드일 수 있다.
표적 단백질이 SH2 도메인을 포함하는 경우, 결합 모이어티는 바람직하게는 티로신 잔기를 포함하는 SH2 결합 펩티드, 보다 바람직하게는 인산화 티로신 잔기 또는 SH2 결합 펩티드의 모방체일 수 있다.
표적 단백질이 SH3 도메인을 포함하는 경우, 결합 모이어티는 바람직하게는 프롤린 잔기를 포함하는 SH3 결합 펩티드, 또는 SH3 결합 펩티드의 모방체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 SH3 결합 펩티드는 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 지방족 아미노산인 것인 아미노산 모티프 P-X-X-P; 또는 R은 아르기닌이고, K는 라이신이며, X는 임의의 아미노산인 것인 아미노산 모티프 R-X-X-K를 포함한다.
표적 단백질이 금속 이온 결합 부위를 포함하는 경우, 결합 분자는 아민, 카르복실레이트 또는 티올과 같은 금속 복합체의 리간드일 수 있다.
표적 단백질이 지질 결합 부위를 포함하는 경우, 결합 모이어티는 인지질 또는 지방산과 같은 지질일 수 있다.
표적 단백질이 핵산 결합 부위를 포함하는 경우, 결합 모이어티는 단일-가닥 또는 이중-가닥 리보핵산 또는 데옥시리보핵산과 같은 천연 핵산 또는 합성 핵산, 또는 펩티드 핵산과 같은 그의 모방체일 수 있다. 핵산 결합 부위가 서열 특이적인 경우, 결합 모이어티는 바람직하게는 결합 모티프의 전체 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 서열과 같은 요구되는 서열 또는 밀접하게 관련된 서열을 갖는 핵산이다.
일 구체예에 따르면, 결합 분자는 항체 또는 가변 영역 또는 그의 결합 부분을 포함하는 항체의 일부가 아니다. 추가적인 구체예에 따르면, 표적 단백질은 항체 또는 가변 영역 또는 그의 결합 부분을 포함하는 항체의 일부가 아니다. 또한, 일 구체예에 따르면, 결합 분자나 표적 단백질 중 어느 것도 항체 또는 가변 영역 또는 그의 결합 부분을 포함하는 항체의 일부가 아니다.
바람직한 구체예에서, 표적 단백질은 인자 VIII 또는 인자 IX와 같은 헤파린 결합-부위 포함 단백질이고 결합 모이어티는 헤파린, 헤파란 술페이트, 헤파리노이드, 또는 그의 모방체이다.
표적 단백질의 기능에 대한 결합 분자의 영향을 최소화하기 위해, 결합 모이어티는 바람직하게는 가능한 한 작아야 한다. 따라서, 결합 모이어티는 바람직하게는 50 kDa 이하, 보다 바람직하게는 10 kDa 이하, 훨씬 더 바람직하게는 5 kDa 이하의 분자량을 갖는다. 또한, 결합 분자는 100 Da 이상, 예를 들면, 500 Da 이상의 분자량을 가질 수 있다.
표적 단백질의 반감기의 증가는 주로 접합체의 부착에서 기인된다. 따라서, 표적 단백질에 결합된 경우, 접합체는 바람직하게는 인간 또는 동물 신체의 순환에서 표적 단백질의 반감기를 증가시킨다. 예를 들면, 표적 단백질에 결합된 경우, 접합체는 표적 단백질의 순환으로부터의 제거 또는 표적 단백질의 분해를 방해하고 및/또는 세포에 의한 표적 단백질의 흡수 및/또는 분해 효소에 의한 표적 단백질의 인식 및 결합에 관련된 표적 단백질의 하나 이상의 영역을 차단(mask)할 수 있다.
중합체는 하나 이상의 천연 또는 합성의 직쇄형, 분지형 또는 수지상 중합체를 포함하고 바람직하게는 물 및 체액에 용해될 수 있고 보다 바람직하게는 친수성이다. 바람직한 구체예에서, 중합체 모이어티는 생물학적으로 비활성이고 및/또는 약제학적으로 허용가능하다.
중합체는 원하는 목적을 위해 적절한 크기일 수 있다. 이를 고려하여, 중합체는 5 kDa 이상, 보다 바람직하게는 10 kDa 이상의 분자량을 갖는다. 상한으로서, 중합체는 바람직하게는 1000 kDa 이하, 보다 바람직하게는 300 kDa 이하, 및 가장 바람직하게는 200 kDa 이하의 분자량을 갖는다.
특정한 구체예에서, 중합체는 다당류, 폴리펩티드, 핵산, 폴리에테르, 폴리에스테르 및 폴리올레핀으로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함한다. 바람직하게는, 중합체 모이어티는 단일중합체와 공중합체는 미치환이거나 또는 일 말단에서 예를 들면, 아실기에 의해 치환된 것인, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), PEG 단일중합체(homopolymer), mPEG, 폴리프로필렌글리콜 단일중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함한 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체; 폴리글리세리드 또는 폴리실리알산; 히드록시프로필 메타크릴레이트 (HPMA) 및 그의 공중합체; 폴리글루타메이트, 탄수화물, 셀룰로오스, 및 메틸셀룰로오스와 카르복시메틸셀룰로오스를 포함한 셀룰로오스 유도체; 히드록시알킬 전분(HAS), 특히, 히드록시에틸 전분 (HES) 및 덱스트린과 같은 전분, 및 그의 유도체; 덱스트란, 및 덱스트란술페이트(dextransulfat), 카르복시메틸 덱스트란, 가교된 덱스트란, 및 카르복시메틸 덱스트린을 포함한 덱스트란 유도체; 키토산, 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐 에틸 에테르; 폴리비닐피롤리돈; 알파,베타-폴리[(2-히드록시에틸)-D1-아스파르타미드; 및 폴리에톡실화 폴리올로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함한다.
특정한 구체예에서, 중합체는 5kDa 이상, 바람직하게는 최대 1000 kDa, 보다 바람직하게는 8 내지 50OkDa 및 훨씬 더 바람직하게는 10 내지 300kDa 및 100 내지 30OkDa의 평균 분자량(Mw)을 갖는 히드록시알킬 전분, 바람직하게는 히드록시에틸 전분을 포함한다. 중합체는 약 0.4 내지 약 1.3, 바람직하게는 0.4 내지 0.9, 또는 0.4 내지 0.7의 글루코오스 유닛 당 히드록시알킬 (히드록시에틸)의 몰 치환도를 가질 수 있다.
중합체는 결합 모이어티에 직접 커플링(couple)될 수 있다. 중합체 모이어티 및/또는 결합 모이어티가 적합한 커플링 기를 갖지 않는 경우, 상기 중합체 및/또는 결합 분자가 접합체를 형성하기 위해 다른 분자 상의 하나 이상의 반응성 기와 반응할 수 있도록 하기 위해 상기 중합체 및/또는 결합 분자를 적절하게 변형하기 위해 하나 이상의 링커가 이용될 수 있다. 이를 위해, 당해 기술 분야에서 공지된 적합한 커플링 전략이 이용될 수 있다. 적합한 링커, 중합체 모이어티 및 접합(conjugation) 방법이 또한 참조에 의해 본 명세서에 포함된, WO 2007/101698 및 Orlando, Michele, Dissertation, Modification of proteins and low molecular weight substances with hydroxyethyl starch (HES), Justus-Liebig-Universitat Giessen, Germany, 2003에서 상세하게 설명된다. 바람직하게는, 커플링은 반응 분자 및/또는 중합체의 단 하나의 반응성 기 또는 정해진 갯수의 반응성 기가 커플링에 이용되도록 특이적이다. 중합체, 결합 분자 및 선택적으로, 하나 이상의 링커의 상호 간의 커플링을 위해, 적합한 반응성 기가 이용될 수 있다.
따라서, 반응 분자 또는 중합체가 펩티드를 포함하는 경우, 커플링 반응은 바람직하게는 펩티드 중에서 단 1회 나타나는 알파-사슬 아미노기 또는 카르복시기 또는 아미노산의 곁사슬 반응성 기에 대해 특이적일 수 있다. 적합한 곁사슬 반응성 기의 예는 시스테인 티올기, 라이신, 아르기닌, 또는 히스티딘의 아미노기, 아스파르테이트 또는 글루타메이트의 카르복시기, 아스파라긴 또는 글루타민의 아미도기, 및 세린, 쓰레오닌 또는 티로신의 히드록시기이다. 그러나, 인공 아미노산에 의해 도입된 반응성 기도 커플링을 위해 이용될 수 있다.
반응 분자 또는 중합체가 펩티드를 포함하는 경우, 다른 모이어티에 존재하거나 또는 도입된 하기의 반응성 기들이 커플링을 위해 이용될 수 있다:
- 펩티드의 아미노기와 반응하는 아실화 기, 예를 들면, 산 무수물(acid anhydride)기, N-아실이미다졸기, 아지드기, N-카르복시 무수물기, 디케톤기, 디알킬 피로카르보네이트기, 이미도에스테르기, 및 카르보디이미드-활성화된 카르복시기. 전술된 기들 모두는 아미노기, 예를 들면, 단백질 상의 아미노기와 반응하여, 아실 결합(linkage) 또는 유사한 결합을 포함하는 공유 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다;
- 펩티드의 설프히드릴(머캅토), 티오메틸, 이미다조, 또는 아미노기와 반응하는 알킬화기, 예를 들면, 할로-카르복시기, 말레이미드기, 활성화된 비닐기, 에틸렌이민기, 아릴 핼라이드(aryl halide)기, 2-히드록시-5-니트로-벤질 브로마이드기; 및 펩티드의 아미노기와 반응하는, 환원제를 동반한 지방족 알데히드 및 케톤기;
- 펩티드의 카르복시기와 반응하는 에스테르 및 아미드 형성기, 예를 들면, 디아조카르복실레이트기, 및 카르보디이미드 및 아민기;
- 펩티드의 설프히드릴기와 반응하는 디술피드 형성기, 예를 들면, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조에이트)기, 요오드와 같은 산화제의 존재 하에 설프히드릴기와 반응하는 알킬머캅탄기 및 오르토-피리딜 디술피드;
- 디카르보닐기, 예를 들면, 시클로헥산디온기, 및 펩티드의 구아니딘 모이어티와 반응하는 다른 1,2-디케톤기;
- 펩티드의 페놀기와 반응하는, 디아조기;
- 펩티드의 아미노기와 반응하는, 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide)와 다당류 간의 반응으로부터의 반응성 기.
커플링 반응을 수행하기 위한 적합한 아미노산이 펩티드를 포함하는 결합/중합체 모이어티에서 결핍된 경우, 개별적인 아미노산이 상기 펩티드에, 바람직하게는 그의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에 도입될 수 있다.
결합 모이어티 및/또는 중합체 모이어티가 사카라이드를 포함하는 경우, 커플링 반응은 각각 사카라이드의 환원성 말단(reducing end) 상의 알데히드/헤미아세탈기 또는 케토/헤미케탈기에 대해 특이적일 수 있다. 적합한 커플링 전략이 예를 들면, WO 2004/024776 Al에 설명된다.
예를 들면, 환원성 말단에 있는 알데히드/헤미아세탈기는 다른 모이어티에 존재하거나 또는 도입된 일차 아미노기와의 환원적 아민화(reductive amination)를 수행할 수 있다. 상기 반응은 바람직하게는 수소화 붕소(boron hydride)(예를 들면, 소디움 시아노보로히드리드, 소디움 트리아세톡시히드리드, 소디움 보로히드리드) 또는 유기 붕소 복합체와 같은 환원제의 존재 하에 수행된다. 대안적으로, 알데히드/헤미아세탈기는 요오드, 브롬, 또는 적합한 금속 이온과 같은 산화제를 이용한 선택적 산화, 또는 전기화학적 산화를 수행하여 카르복시기, 또는 에스테르, 락톤 또는 아미드와 같은 활성화된 카르복시기의 생성을 초래할 수 있다. 그 후, (활성화된) 카르르복시기는 예를 들면, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시프탈이미드, 티오페놀, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, 트리클로로페놀, 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀, 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 (HOBt), 3-히드록시-l,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온 (HOOBt), 4-히드록시-3-니트로벤젠 술폰산 (HNSA), 2-히드록시피리딘, 3-히드록시피리딘, 3,4-디히드로-4-옥소벤조트리아진-3-올, 4-히드록시-2,5-디페닐-3(2H)-티오페논-1,1-디옥시드, 3-페닐-1-(p-니트로페닐)-2-피라졸린-5-온), [1-벤조트리아졸릴-N-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트] (BOP), [1-벤조트리아졸릴옥시트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트] (PyBOP), [0-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 2-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU), [0-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), [O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-비스(펜타메틸렌)우로늄 헥사플루오로포스페이트, [O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)우로늄 헥사플루오로포스페이트, 카르보닐디이미다졸 (CDI), 또는 카르보디이미드, 예를 들면, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 (EDC), 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 또는 디이소프로필카르보디이미드 (DIPC)와 같은 활성화제의 존재 하에 아미노기와 반응할 수 있다.
결합 모이어티 및/또는 중합체 모이어티가 핵산을 포함하는 경우, 커플링은 2'-히드록시기, 3'-히드록시기, 또는 5'-히드록시를 통해 이루어질 수 있다. 결합 모이어티가 지방산을 포함하는 경우, 그의 카르복시기가 이용될 수 있다. 중합체 모이어티가 폴리에스테르, 폴리에테르 또는 폴리올레핀과 같은 유기 중합체를 포함하는 경우, 중합체의 말단에 있는 반응성 기(존재하는 경우)인 중합체의 단량체 유닛의 반응성 기 또는 도입된 반응성 기가 커플링을 위해 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 접합체는 선택적으로, 먼저 중합체 모이어티 및/또는 결합 모이어티를 화학적으로 변형시켜 다른 모이어티 상의 이용가능하거나 또는 도입된 화학 기와 반응할 수 있는 하나 이상의 화학기를 갖는 중합체 모이어티 및/또는 결합 모이어티를 생성하고, 그 후, 상기 중합체 모이어티와 결합 모이어티를 함께 반응시켜 공유결합에 의해 결합된 접합체를 형성하는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 선택적으로 변형된 중합체 모이어티 또는 선택적으로 변형된 결합 모이어티가 먼저 (추가적인) 링커에 커플링되고, 그 후, 상기 링커가 선택적으로 변형된 다른 모이어티에 커플링될 수 있다.
커플링 반응의 특정한 구체예에서, 제1 링커가 중합체 모이어티에 커플링되며, 상기 제1 링커는 중합체 모이어티와 반응하지 않고, 중합체 모이어티에 존재하지 않는 반응성 기를 갖는다. 제2 링커가 결합 모이어티에 커플링되고, 상기 제2 링커는 상기 결합 모이어티와 반응하지 않고 상기 결합 모이어티에 존재하지 않는 반응성 기를 갖는다. 그 후, 제3 링커가 제1 링커 및 제2 링커에 연속적으로 또는 동시에 커플링된다. 제3 링커를 제1 링커 및 제2 링커에 커플링시키기 위해 이용된 반응성 기는 이 목적을 위해 적합한 반응성 기일 수 있다. 또한, 제1 링커와 제2 링커를 각각 중합체 모이어티 및 결합 모이어티에 커플링시키는 동안, 링커의 반응성 기들은 보호기에 의해 보호될 수 있다.
중합체 모이어티, 결합 모이어티 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 상호 간에 커플링시키기 위해 이용될 수 있는 대표적인 반응성 기들은 C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합, 아실 할로겐화물, 할로, 히드록시, 알데히드, 아미도, 아미노, 아미노옥시, 히드록시아미노, 카르보닐, 카르복시, 활성화된 에스테르, 시아노, 티오시아노, 이미노, 니트로, 니트로소, 니트릴, 퍼옥시, 포스포, 술포닐, 술피닐, 티올, 히드라진, 및 히드라지드기이다. 링커를 상호 간에 커플링시키기 위해 유용한 반응성기의 쌍은 예를 들면, 아미노기와 숙신이미드 에스테르기, 티올기와 말레이미드기이다.
커플링 반응에서 이용될 수 있는 보호기의 예는 하기와 같다:
-알코올의 보호: 아세틸 (Ac), β-메톡시에톡시메틸 에테르 (MEM), 메톡시메틸 에테르 (MOM), p-메톡시벤질 에테르 (PMB), 메틸티오메틸 에테르, 피발로일 (Piv), 테트라히드로피란 (THP), 트리메틸실릴 (TMS), 터트-부틸디메틸실릴 (TBDMS), 및 트리이소프로필실릴 (TIPS) 에테르와 같은 실릴 에테르, 메틸 에테르, 및 에톡시에틸 에테르 (EE);
-아민의 보호: 카르보벤질옥시 (Cbz), p-메톡시벤질 카르보닐 (Moz 또는 MeOZ), 터트-부틸옥시카르보닐 (BOC), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (FMOC), 벤질 (Bn), p-메톡시벤질 (PMB), 3,4-디메톡시벤질 (DMPM), p-메톡시페닐 (PMP), 토실 (Ts), 및 술폰아미드 (Nosyl & Nps);
-카르보닐기의 보호: 아세탈, 케탈, 아실랄 및 디티안; 및
-카르복시산의 보호: 메틸 에스테르, 벤질 에스테르, 터트-부틸 에스테르 및 실릴 에스테르.
접합체 중 결합 분자의 갯수 및 중합체의 갯수는 적합하도록 자유롭게 선택될 수 있다. 따라서, 접합체는 단 1개, 2개 이상, 3개 이상 및 4개 이상과 같이 하나 이상의 결합 분자를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 접합체는 단 1개, 2개 이상, 3개 이상 및 4개 이상과 같이 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 접합체는 하나의 결합 분자와 하나의 중합체를 포함한다.
링커가 결합 분자를 중합체에 커플링시키기 위해 이용되는 경우, 1개의 링커가 두 개의 분자를 상호 간에, 예를 들면, 하나의 결합 모이어티를 하나의 중합체 모이어티에 커플링시킬 수 있거나, 또는 하나의 링커가 3개 이상의 분자를 상호 간에, 예를 들면, 1개의 결합 모이어티를 2개 이상의 중합체에, 2개 이상의 결합 분자를 하나의 중합체에, 또는 2개 이상의 결합 분자를 2개 이상의 중합체에 커플링시킬 수 있다.
링커는 적절한 길이를 가질 수 있으나, 바람직하게는 가능한 한 짧다. 그러나, 링커는 바람직하게는 중합체 모이어티가 결합 모이어티와 표적 단백질 간의 상호작용을 방해하지 않도록 충분히 길다. 분자를 커플링하기 위한 적합한 링커가 선행 기술에서 잘 알려져 있고 또한 상업적으로 이용가능하다.
접합체 중 링커를 형성하기 위해 적합한 분자는 링커를 결합 분자, 중합체 및/또는 또 다른 링커 분자에 커플링시키기 위한 2개 이상의 (전술된 바와 같은) 관능기를 포함한다. 이 관능기들은 바람직하게는 지방족 탄수화물 또는 방향족 탄수화물로부터 유래된 것들과 같은 약제학적으로 허용가능한 다리 기(bridging group)를 통해 연결된다. 링커는 호모-이관능성(homo-bifunctional)이거나 또는 헤테로-이관능성일 수 있다.
전체 접합체는 원하는 적용을 위해 적합한 크기를 가질 수 있다. 그러나, 접합체는 바람직하게는 5 내지 1000 kDa, 바람직하게는 20 내지 300 kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명의 복합체는 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 표적 단백질 및 하나 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 접합체로부터 형성될 수 있다. 일 구체예에서, 복합체는 단 1개의 표적 단백질과 단 1개의 접합체를 포함한다.
인간 또는 동물 순환에 투여된 경우, 본 발명의 복합체 중 표적 단백질의 반감기는 유리 형태(예를 들면, 본 발명의 접합체가 아닌, 작은 이온들에만 결합된 형태)로 투여된 경우에 비해 1.1배 이상, 보다 바람직하게는 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 1.8배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 및 가장 바람직하게는 10배 이상 증가된다.
본 발명의 복합체는 의약에서 이용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 복합체의 표적 단백질은 특정 질환의 치료 또는 예방에서 유용한 약학적 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 표적 단백질은 인간 또는 동물 환자의 순환에서 그의 약학적 활성을 발휘한다. 바람직하게는, 치료 또는 예방 대상 질환은 인간 또는 동물의 신체에서 천연 단백질의 결함, 또는 감소된 양 또는 부재에 의해 유발된다. 특히, 상기 질환은 특정 단백질의 유전자 중 유전성 결함 또는 후천적 결함에 의해 유발될 수 있다. 그와 같은 질환의 구체적인 예는 혈우병 A 및 혈우병 B이다. 예를 들면, 표적 단백질은 인자 VIII이고 복합체는 혈우병 A의 치료에서 이용될 수 있거나, 또는 표적 단백질은 인자 IX이고, 복합체는 혈우병 B의 치료에서 이용될 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 복합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 인간 또는 동물 환자에게 복합체를 투여하기 위해 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 그들은 바람직하게는 비경구로, 특히, 주사에 의해, 예를 들면, 정맥내 주사 또는 동맥내 주사에 의해 투여된다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 단일 투여량 당 1 pM 1 mM 범위의 농도, 또는 1 pg 내지 500 mg, 바람직하게는 100 ng 내지 500 mg의 양으로 본 발명의 복합체를 포함한다.
본 발명의 복합체는 표적 단백질을 접합체와 접촉시키는 것에 의해 제조될 수 있다. 표적 단백질은 적합한 용매, 바람직하게는 수성 용매, 예를 들면, 생리적 염 농도 및 약 6.0 내지 약 8.5 범위의 생리적 pH를 갖는 물 중에서 접합체와 접촉될 수 있다. 그러나, 표적 단백질은 용매 및 조건이 복합체의 형성을 억제하지 않는 한, 다른 용매 중에서 다른 조건 하에 접합체와 접촉될 수 있다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 복합체를 형성하기 위해 이용되는 접합체에 관한 것이다. 접합체의 특정한 구체예가 본 발명의 복합체를 다루는 섹션에서 전술되며, 전술된 개시를 참조한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 복합체를 제조하기 위한 개별적인 접합체의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 복합체는 체외에서(ex vivo) 제조된다.
또한, 본 발명은 표적 단백질을 중합체 모이어티 및 상기 표적 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 결합 모이어티를 포함하는 본 발명의 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 또는 동물의 순환에서 표적 단백질의 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 표적 단백질을 접합체와 접촉시킨 후, 이들이 복합체를 형성한다. 복합체는 접촉시 직접적으로 형성되거나 또는 표적 단백질과 접합체를 적합한 환경, 예를 들면, 인간 또는 동물의 순환으로 옮긴 후에만 형성될 수 있다. 바람직하게는, 표적 단백질은 인간 또는 동물의 신체로 투여되기 전에 접합체와 접촉된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 인간 또는 동물의 신체 외부에서 수행된다.
표적 단백질은 10:1 내지 1:10000, 바람직하게는 1.2:1 내지 1:100, 및 보다 바람직하게는 1:1 내지 1:10의 몰비로 접합체와 접촉될 수 있다.
하기에서, 표적 단백질이 헤파린 결합 부위를 포함하는 것인 바람직한 구체예가 보다 상세하게 설명된다.
지혈에 관여하는 다수의 단백질이 헤파린 또는 헤파리노이드에 결합한다. 특히, 항트롬빈, 트롬빈, 폰 빌브란트 인자, 조직 플라스미노겐 활성자, 인자 VIII 및 인자 IX가 헤파린 또는 헤파린-유사, 산성 다당류에 결합한다. 헤파리노이드의 결합은 단백질 표면상에 발현된 소위 헤파린 결합 도메인에 의해 매개된다. 헤파리노이드-단백질 상호작용의 비교적 높은 친화도는 헤파리노이드, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체에 의한 헤파린-결합 단백질의 비-공유결합성 변형을 가능하게 한다.
혈액 응고 인자 VIII의 결정학적 구조에서 알 수 있는 바와 같이(도 1 참조), 위치 S558-Q565의 헤파린 술페이트 프로테오글리칸은 히드록시알킬 전분으로의 커플링을 위해 자유롭다.
추가적으로, 위치 R484-F509 및/또는 E1811-K1818에서 FVIII에 결합된 저밀도 리포프로테인-수용체-관련 단백질(low-density lipoprotein-receptor-related protein, LRP)이 커플링을 위해 표적화될 수 있다(도 1 참조).
일반적으로, 이화작용 및/또는 활성과 같은 생물학적 메카니즘의 변형이 의도되어, 특정한 분자-분자 상호작용의 증가 또는 억제를 초래한다. 결과적으로, 표적 단백질의 반감기가 증가된다.
결합 리간드는 예를 들면, 헤파린과 같은, 산성이고 음전하를 띤 다당류, 또는 모방체 펩티드, 핵산 및/또는 유기 분자와 같은 다른 결합 물질일 수 있다.
결합 분자로서, 이와 같은 고 친화도 리간드(highly affine ligand)는 그 자체로 이용되거나 특정한 변형에 의해 이용될 수 있다. 접합체를 형성하기 위해, 그들은 히드록시알킬 전분(HAS/HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 올리고사카라이드 등과 같은 중합체에 커플링되어야 한다.
산성 다당류는 헤파린, 헤파란 술페이트, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸 및 기타 산성의 탄수화물 중합체, 바람직하게는 음이온성의 탄수화물 중합체, 예를 들면, 푸코이단(fucoidan), 술페이트화 푸칸(fucan) 또는 갈락탄(galactan)일 수 있다.
'헤파리노이드(heparinoid)'로 불리는, 헤파린-유사 산성 올리고사카라이드는 높은 산성이고, 예를 들면, 고도로 술페이트화된 다당류(highly sulfated polysaccharide)이다. 헤파리노이드는 대부분의 종에서 발견되고, 적어도 헤파린 술페이트는 실질적으로 모든 동물에서 발견된다.
헤파린은 통상적으로 D-글루코사민과 D-글루큐론산 또는 1-이두론산(1-iduronic acid)으로부터 생성된 반복 이당류로 구성된다. D-글루코사민은 N-아세틸화 아미노헥소오스 또는 N-술페이트화 아미노헥소오스로 존재할 수 있고, C6 또는 C3에서 더 술페이트화될 수 있다. 다당류-사슬은 3 kDa 내지 40 kDa 범위의 분자량 및 환원성 말단과 비-환원성 말단을 가지며, 상이한 길이일 수 있다. 환원성 말단은 다수의 화학적 반응, 즉, 단백질, 탄수화물 및 기타 반응 파트너로의 커플링을 위해 이용될 수 있다. 헤파린, 헤파린 술페이트의 구조는 H. Edward Conrad에 의한 'Heparin-Binding Proteins', Academic Press, 1998에 완전하게 설명된다.
헤파린은 인 비보에서 항응고를 위해서 및 의료 장치의 표면 코팅을 위해 상업적으로 이용된다.
헤파린 및 헤파리노이드의 탁월한 특성은 다수의 소위 헤파린-결합 단백질과의 강한 상호작용이다. 100개 이상의 단백질이 헤파리노이드에 결합하는 것으로 확인되었다. 특히, 응고 인자 VIII 또는 IX, 및 응고 및 피브린 용해(fibrinolysis)와 관련된 다수의 다른 단백질들도 특이적으로 및 강하게 헤파리노이드에 결합한다. 헤파린-결합 단백질의 가장 두드러지고 전형적인 예는 항트롬빈이다.
다른 헤파린 결합 단백질은 예를 들면, 항트롬빈, 트롬빈, 폰 빌브란트 인자, 조직 플라스미노겐 활성자, 인자 VIII, 인자 IX, 비트로넥틴, 단백질 C 억제제, 조직 인자 경로 억제제, 혈소판 인자 4, 히스티딘-풍부 당단백질, 트롬보스폰딘, 우로키나아제, 피브로넥틴, 섬유모세포 성장 인자, 간세포 성장 인자, 리파아제, 아포리포프로테인 B, 아포리포프로테인 E이다.
특히, 다수의 응고 및 피브린 용해와 관련된 단백질이 헤파리노이드에 특이적으로 및 강하게 결합한다. 헤파린-결합 단백질의 가장 두드러지고 전형적인 예는 항트롬빈이다.
헤파린-결합 단백질은 하나 이상의 소위 헤파린-결합 도메인을 보인다. 헤파린-결합 도메인의 속성 및 공통된 구조적 특징이 이전에 예를 들면, H. E. Conrad에 의한 'Heparin-Binding Proteins', Academic Press, 1998에 기재되었다.
헤파린-단백질 결합의 현저한 특징은 그의 상태적으로 높은 친화도이다. 헤파리노이드-단백질 결합의 결합 강도는 통상적으로 전술된 바와 같은, 해리 상수 Kd로 표현된다.
단백질의 헤파린 결합 부위로의 비-공유결합성 결합을 위한 인공 산성 다당류의 합성은 리간드들, 즉, 인공 산성 다당류와 결합 단백질 간의 훨씬 더 높은 결합 친화도를 가져올 수 있다.
따라서, 헤파리노이드와 같은 산성 다당류 및 특이적으로 합성된, 인공 산성 다당류가 헤파린-결합 단백질, 예를 들면, 인간 또는 재조합 응고 인자 VIII, 인간 또는 재조합 응고 인자 IX, 인간 또는 재조합 폰 빌브란트 인자 및 기타 결합 단백질과 같은 지혈에 관련된 헤파린-결합 단백질로의 고-친화도, 비-공유결합성 결합을 위한 이상적인 리간드이다.
헤파린 및 헤파란 술페이트는 다양한 상이한 결합 파트너와 상호작용하고, 따라서, 두드러진 결합 거동(behavior)을 보이는, 풍부한 분자이다.
다른 헤파리노이드에 의한 헤파린의 대체는 표적 단백질에 대한 결합 친화도 및 특이성을 유발하고 최적화시킬 수 있다. 또한, 바이러스 또는 프리온과 같은 감염 매개체를 포함할 위험이 예를 들면, 인공적으로 합성되거나 또는 식물 기원인 음이온성 다당류로 교체하거나 또는 헤파린 모방체 펩티드를 이용하는 것에 의해 감소될 수 있다.
헤파린에 대한 하나의 가능한 대안은 푸코이단 또는 술페이트화 푸칸이다. 푸코이단은 전세계적으로 연안수(coastal water)에 풍부한 술페이트화 식물성 다당류 (Mw 평균 20.000 Da)이다. 그들은 주로 갈조류(피애오피새(Phyaeophyceae)) 및 해양 무척추동물에서 발견된다. 갈조류로부터 유래된 푸코이단은 복합적이고, 고도로 분지되고 술페이트화된 다당류 구조를 포함하나, 해양 무척추동물로부터 유래된 술페이트화 푸칸은 단일 결합 타입만을 포함하고, 규칙적인, 반복 올리고사카라이드 구조이나, 다양한 술페이트화(sulphating) 패턴을 보이는, 푸코오스의 직쇄형 호모중합체이다 (Pomin & Mourao, 2008; reviewed in Berteau & Mulloy, Glycobiology 13, 2003). 푸코이단과 술페이트화 푸칸은 글리코사미노글리칸 및 기타 술페이트화 글루칸 상의 술페이트 치환의 패턴을 모방할 수 있는 능력 때문에 다수의 생물학적 활성을 공유하므로(Berteau & Mulloy, 2003), 헤파린 대체물로 제안된다. 헤파린처럼, 그들은 응고의 조절자로 작용하고(Chargaff et al., 1936) 염증, 세포 증식 및 부착, 바이러스 감염 및 수정과 같은 다수의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다 (Boisson-Vidal et al., 1995). 그들의 식물 기원 때문에, 푸코이단은 바이러스 또는 프리온과 같은 감염성 매개체를 포함할 가능성이 낮다. 이는 그들이 푸코이단-중합체 접합체로서 반감기 연장 목적을 위해 헤파린-결합 단백질로의 비-공유결합성 결합을 위한 헤파린에 대한 바람직한 대체물이 될 수 있게 한다.
헤파린 및 헤파리노이드와 독립적으로, 상기 표적 단백질들에 대해 높은 특이성 및 친화도(affine) 비-공유결합성 결합 파트너인 다수의 가능한 종들이 존재한다. 이 결합 종들은 특이적 결합 펩티드(예를 들면, 항체 인식 도메인으로부터 유래된 서열), 또는 모방체 펩티드, 비-중화성(non-neutralizing) 항체, 소형 분자, 또는 DNA/RNA 단편(예를 들면, 앱타머)을 포함한다.
앱타머는 인 비트로 선택, 또는 동등하게 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (Tuerk. & Gold (1990) Science)의 반복을 통해 소형 분자, 단백질, 핵산, 및 심지어 세포, 조직 및 개체와 같은 다양한 분자 표적에 결합하도록 작제된(engineered) 핵산 종이다(Ellington & Szostak (1990) Nature). 앱타머는 통상적으로 이용되는 생체분자, 항체, 즉, 낮은 나노몰 내지 피코몰 범위에서 높은 특이성 및 친화도를 갖는 분자들과 경쟁하는 분자 인식 특성을 제공하므로 치료적 응용에서 유용하다. 그들의 차별적 인식 외에, 앱타머는 시험관에서 완전하게 작제될 수 있고, 화학적 합성에 의해 용이하게 제조될 수 있으며, 원하는 보관 특성을 갖고, 치료적 응용에서 면역원성을 거의 또는 전혀 유도하지 않기 때문에 항체에 비해 장점을 제공한다.
본 발명에서, 앱타머는 표적 단백질에 대한 매우 특이적이고 높은 친화도 결합을 보이기 때문에, 앱타머-중합체-접합체(도 3 참조) 내의 표적 단백질에 대한 비-공유결합성 결합 파트너로 제안된다. 그들의 인 비트로 기원 때문에, 앱타머는 바이러스 또는 프리온과 같은 감염성 매개체를 전혀 포함하지 않아서, 반감기 연장 방법을 위한 바람직한 성분이 된다.
약간 상이한 방법은 반감기 연장을 위한 비-공유결합성 결합 파트너와의 특이적 상호작용을 위한 가능한 표적으로서 번역후 변형(posttranslational modification, PTM, 예를 들면, 글리코실화)에 중점을 둘 수 있다.
예로서, 글리코실화 FVIII/vWF 복합체가 본 명세서에서 주어진다. 예를 들면, FVIII/vWF의 탈시알릴화(desialylation)가 아시알로글리코프로테인 수용체(ASGP-R; Sodetz et al., JBC 1977 & 1978)에 의한 신속한 혈장 제거(plasma clearance)를 가져온다. 이와 같은 특성이 규명된 ASGP-R 상호작용(Meier 2005)의 지식에 근거하여, ASGP-R 모방체 펩티드가 생성되고 합성되며 짧은 링커를 통해 중합체, 예를 들면, HES/HAS-모이어티(도 4 참조)에 결합될 수 있다. 그 후, 이 접합체는 ASGP-R 결합 부위를 차단하고 차폐(shielding) 효과 또는 입체적 방해(steric hindrance)에 의해 수용체-매개 제거를 억제하여, 혈장 반감기를 연장시키기 위해 이용될 수 있다.
표적 단백질과 효소 간의 특이적 비-공유결합성 상호작용에 기반한 모방체 펩티드를 이용하는 것에 대한 또 다른 예는 엘라스타아제(Elastase)와 G-CSF 간의 상호작용이다:
호중구 엘라스타아제(neutrophil elastase, NE) 또는 인간 호중구 엘라스타아제(HNE)로도 알려진, 엘라스타아제는 특이적으로 G-CSF에 결합한다 (Hunter et al., 2003). 엘라스타아제 결합 영역의 아미노산 서열에 근거하여, G-CSF의 반감기를 연장하기 위해, 모방체 펩티드가 생성되고, 합성되고, 중합체에 예를 들면, 짧은 링커를 통해 HES/HAS-모이어티에 결합될 수 있다.
G-CSF의 기존의 X-선 구조 (Hill et al., PNAS (90) 1993) 및 여러 알려진 비-중화성 항-G-CSF 항체(Layton et al., JBC (266) 1991)에 근거하여, G-CSF 약제학적 약물의 반감기를 연장하기 위해 표적 단백질, 이 예에서는 G-CSF에 대한 중합체로의 중합체의 비-공유결합성 커플링을 수행하기 위해 표적 사건(target event)를 모방하는 모방체 펩티드가 생성될 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명은 헤파린 결합 부위를 갖는 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 헤파린 또는 헤파린-유사 분자를 포함하고, 상기 헤파린 또는 헤파린-유사 분자는 공유결합에 의해 히드록시알킬 전분에 결합된 것인 복합체에 관한 것이다.
상기 단백질은 인자 VIII, 항트롬빈, 트롬빈, 폰 빌브란트 인자, 조직 플라스미노겐 활성자, 및 인자 IX로부터 선택될 수 있다.
히드록시알킬 전분은 히드록시에틸 전분일 수 있다. 히드록시알킬 전분의 분자량은 예를 들면, 100 내지 300 kD의 범위이다. 하나 이상의 헤파린 또는 헤파린-유사 분자의 커플링 외에, 2개 이상의 헤파린 분자 또는 헤파린-유사 분자가 또한 하나의 히드록시알킬 전분 분자에 공유결합에 의해 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은 전술된 복합체를 제조하는 방법으로서:
-하나 이상의 헤파린 분자 또는 헤파린-유사 분자를 하나 이상의 히드록시알킬 전분에 커플링시켜, 헤파린-히드록시알킬 전분 접합체를 생성하는 단계,
-상기 접합체를 헤파린 결합 부위를 갖는 단백질과 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 히드록시알킬 전분은 히드록시에틸 전분일 수 있다. 하나 이상의 헤파린 분자 또는 헤파린-유사 분자가 이관능성 링커, 예를 들면, 호모이관능성이거나 또는 헤테로이관능성일 수 있는 링커를 통해 하나 이상의 HAS 분자에 결합될 수 있다.
하나 이상의 헤파린 또는 헤파린-유사 분자 및 히드록시알킬 전분이 하기의 단계에 의해 변형될 수 있다:
- 알데히드 기를 도입하기 위한 산화
- 환원적 아민화(reductive amination).
일 구체예에서, 2개 이상의 헤파린 분자 또는 헤파린-유사 분자가 하나의 히드록시알킬 전분 분자에 결합된다.
본 발명은 또한 헤파린-히드록시알킬 전분 또는 헤파린-유사 분자-히드록시알킬 전분 접합체; 단백질은 인자 VIII일 수 있는 것인 전술된 복합체를 포함하는 약제학적 조성물; 및 출혈성 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 전술된 복합체의 용도에 관한 것이다.
일 구체예에서, 상기 복합체는 헤파린 결합 부위를 갖는 하나 이상의 단백질 및 히드록시알킬 전분에 공유결합에 의해 결합되는 것인 하나 이상의 헤파린 또는 헤파린-유사 분자를 포함하지 않는다.
일 구체예에서, 상기 복합체를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함하지 않는다:
- 하나 이상의 헤파린 분자 또는 헤파린-유사 분자를 하나 이상의 히드록시알킬 전분에 커플링시켜 헤파린-히드록시알킬 전분 접합체를 수득하는 단계, 및
- 상기 접합체를 헤파린 결합 부위를 갖는 단백질과 인큐베이션시키는 단계.
일 구체예에서, 접합체는 헤파린-히드록시알킬 전분 접합체나 헤파린-유사 분자-히드록시알킬 전분 접합체가 아니다.
도 1은 저밀도 리포프로테인 수용체-관련 단백질(LRP)과 헤파란 술페이트 프로테오글리칸(HSPG)의 상호작용 부위가 강조된 것인 혈액 응고 인자 VIII의 삼차원 구조를 보여준다.
도 2는 인자 VIII과 1:1 헤파리노이드-HES 접합체의 복합체의 구조를 보여준다.
도 3은 공유결합성 앱타머-HES 접합체를 갖는 표적 단백질의 개략도(scheme)을 보여준다 (A = 앱타머).
도 4는 번역후 변형된 표적 단백질과 모방체 분자-HES 접합체의 결합에 대한 개략도를 보여준다.
도 5는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용한 HES 헤파린 접합체의 결합 연구를 보여준다.
도 6은 인 비트로에서 인자 VIII 대비 인자 VIII HES 접합체의 반감기 연장을 보여준다.
도 7은 인 비보에서 인자 VIII 대비 인자 VIII HES 접합체의 혈장 반감기 연장을 보여준다.
도 8은 인간 인자 VIII 및 인자 IX의 푸코이단으로의 결합의 표면 플라스몬 공명 기반 연구를 보여준다.
도 9는 활성화된 HES (C1MaleimideHES - 점선), 티올 변형된 LMWH (실선) 및 정제된 LMWH-HES 접합체 (파선)의 SEC-dRI/UV/MALS의 측정으로부터 수득된 굴절률 크로마토그램을 보여준다. 컬럼: Superdex200 10/300 GL; 이동상: 150 mM NaCl을 포함하는 5O mM 인산염 완충액 pH = 6.5. (피크 > 40분: 염).
실시예 1: 합성 화학: HES - 헤파리노이드 -접합체
재조합 인자 VIII의 인 비보 반감기 연장을 위한 한가지 방법은 인자 VIII상의 선택적 결합 부위를 통해 비-공유결합에 의해 결합된 거대분자 담체(macromolecular carrier)인 히드록시에틸 전분에 기반한다. 이 비-공유결합성 결합을 위해, 헤파린, 그의 유도체 또는 그의 모방체가 인자 VIII 결합 분자로서 이용될 수 있다. HES가 이 헤파리노이드에 결합되어 단백질의 표면 일부를 뒤덮고 보호하는 큰 복합체를 형성한다.
이 원리의 증거를 표면 플라스몬 공명 및 뒤이은 헤파리노이드와 히드록시에틸 전분 간의 공유결합성 1:1 접합체를 이용한 집중적인 인 비보 연구에 의해 평가하였다. 도 2는 1:1 헤파리노이드-HES 접합체와의 복합체에서 인자 VIII의 삼차원 구조를 보여준다.
이 1:1 접합체를 수득하기 위해, 헤파린과 HES를 상보적인 관능기를 갖는 위치에서만 화학적으로 변형시켰고, 이는 선택적 접합을 가능하게 했다. 두 분자는 모두 다당류 사슬의 환원성 말단에 정확하게 하나의 독특한 관능기, 알데히드/세미아세탈기를 가졌고, 상기 관능기는 이 분자 중의 모든 다른 관능기와 화학적으로 상이하다. 따라서, 개발된 합성 전략은 환원성 말단의 유도체화(derivatization)에 기반했다.
히드록시에틸 전분은 두 개의 상이한 크기 분획으로 분리될 수 있고, 인자 VIII-결합 분자로서, 저분자량 헤파린(LMWH), 예를 들면, 에녹사파린(Enoxaparin)이 이용될 수 있다. C1-활성화 히드록시에틸 전분과 C1-변형 LMWH의 1:1 접합은 말레이미드 관능기에 의한 유리 티올의 Michael-첨가에 기반한다.
HES450 /0.7의 가수분해 및 분획화 ( fractionation )
Figure pct00001
도표 1: 히드록시에틸 전분.
30 g HES450/0.7 (450 kDa의 중량-평균 분자량 및 글루코오스 유닛 당 0.7의 히드록시에틸 몰 치환도를 갖는 히드록시에틸 전분)을 300 ml의 물에 용해시키고 pH가 2.0에 도달할 때까지 1M 염산을 서서히 첨가하였다. 그 후, 용액을 80℃까지 가열하고 16시간 동안 강하게 교반시켰다. 용액을 50℃ 미만까지 냉각시키고 1 M 수산화나트륨 용액을 서서히 첨가하여 pH 5-6으로 조정하였다. 부분적으로 가수분해된 HES450/0.7을 연동 펌프(peristaltic pump) 및 상이한 분자량 컷-오프(예를 들면, MWCO= 1OO, 30, 10, 5 kDa)를 갖는 PES 한외여과 막을 이용한 순차적인 접선 유동 한외여과(tangentia1-flow ultrafiltration) 단계에 의해 분획시켰다.
사용된 HES 분획: HES25/0.7 (Mw= 25 kDa) 및 HES 54/0.7 (54 kDa)
C1AminoHES 의 합성
Figure pct00002
도표 2: 히드록시에틸 전분에서 환원성 말단의 환원적 아민화.
200 mg HES25/0.7을 12 ml 50 mM 붕산염 완충액 pH 8.2 및 0.168 ml 1,3-디아미노프로판에 용해시키고 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 0.126 g 소디움 시아노보로히드리드를 첨가하고 50℃에서 3일 동안 교반시켰다. 생성물을 1 kDa 한외여과 막을 통한 한외여과에 의해 정제하고 그 후 생성물을 동결건조시켰다. 수득된 백색 고체를 실온에서 보관하였다.
OxHES 를 통한 C1AminoHES 의 합성
수산화나트륨 중 요오드에 의한 산화에 의해 OxHES를 수득하였다(Michele Orlando PhD 논문, Giessen, Germany 2003에 근거함).
1 g HES25/0.7을 물 및 9.0 ml의 0.1 N 요오드 용액에 용해시키고 뒤이어 1.4 ml의 1 N NaOH 용액을 첨가하였다. 용액을 밤새 교반시켰다. 반응 생성물을 1 kDa PES 한외여과 막을 통한 한외여과에 의해 정제하였다. 최종 용액을 양이온 교환 수지(Amberlite IR-120 H+)를 통해 통과시키고 동결건조시켰다. 수득된 생성물을 건조시켜 대부분의 잔류 수를 제거하였다.
0.1 g의 수득된 OxHES를 1.5 ml DMSO에 용해시켰다. 115 mg HOBt 및 36.7 mg DMAP를 첨가하였다. 그 후, 190 mg HATU 및 1,3-디아미노프로판을 첨가하고 용액을 37℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 추가적인 190 mg HATU를 첨가하고 용액을 37℃에서 밤새 교반시켰다.
25 ml 아세톤/에탄올 1:1을 첨가하여 생성물을 침전시키고 침전물을 아세톤/에탄올 1:1로 세척하였다. 펠릿을 다시 2 ml DMSO에 용해시키고 25 ml 아세톤/에탄올 1:1을 첨가하여 생성물을 다시 침전시키고 뒤이어 세척 단계를 수행하였다.
남은 생성물을 100 ml 물에 용해시키고 1 kDa 막을 통한 한외여과에 의해 더 정제하였다. 그 후, 생성물을 동결건조시켰다.
C1MalemideHES 의 합성
Figure pct00003
도표 3: 히드록시에틸 전분 중 전자의(former) 환원성 말단에 있는 아미노기의 말레이미드 활성화.
500 mg C1AminoHES를 15 ml 1-메틸-2-피롤리디논(NMP)에 용해시켰다. 10 ml NMP 및 85.6 ㎕ N,N-디이소프로필에틸아민 중의 140 mg N-[g-말레이미도부티릴옥시] 숙신이미드 에스테르의 용액을 첨가하였다. 용액을 90분 동안 교반하거나 진탕시켰다. 100 ml 아세톤/에탄올 1:1 중에 상기 용액을 붓고 -20℃까지 냉각시키는 것에 의해 생성물을 침전시켰다. 침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 상층액을 버리고, 펠릿을 아세톤/에탄올 1:1로 2회 더 세척하고 원심분리시켜 분리하였다. 생성물을 1 kDa 한외여과 막을 통한 한외여과에 의해 정제하고 동결건조시켰다. 수득된 고체 생성물을 -20℃에 보관하였다.
저분자량 헤파린( LMWH )의 화학적 변형
Figure pct00004
도표 4: 시스타민 및 환원제 소디움 시아노보로히드리드에 의한 환원성 말단(C1)의 환원적 아민화.
Figure pct00005
도표 5: 환원제 DTT에 의한 C1-시스타민의 환원.
250 mg 동결건조 LMWH를 1M 염화나트륨을 포함하는 0.3 M 인산염 완충액 pH 5.0 12 ml에 용해시켰다. 1.34 g의 시스타민 디히드로클로라이드를 첨가하고 용액을 40℃에서 1시간 동안 교반하거나 진탕시켰다. 그 후, 0.374 g 소디움 시아노보로히드리드를 첨가하고 혼합물을 40℃에서 3일 동안 교반하거나 진탕시켰다.
생성물을 HiLoad 26/60 Superdex 30 프렙 등급(prep grade) 컬럼 상에서 4.4 ml/분의 유속으로 100 mM NaCl을 포함한 50 mM 인산염 완충액 pH 6.5를 이동상으로 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 합쳐진 생성물 분획을 직접 다음 단계에서 사용하였다.
수득된 분획에 91.8 mg D1-l,4-디티오트레이톨 (DTT, 0.6 mmol, 10 당량)을 첨가하고 용액을 실온에서 밤새 교반시켰다. 생성물을 HiLoad 26/60 Superdex 30 프렙 등급 컬럼 상에서 4.4 ml/분의 유속으로 물을 이동상으로 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 분획을 합치고 동결건조시켰다. 수득된 백색 고체를 -20℃에서 보관하였다.
C1 말레이미드 HES 와 티오LMWH 의 접합
Figure pct00006
도표 6: Michael 첨가를 통한 말레이미드 활성화 HES와 티올-활성화 LMWH의 접합.
32.2 mg의 C1LMWH-시스테아민 및 420 mg의 C1MaleimideHES를 총 14.5 ml의 100 mM 인산염 완충액 pH 7.5에 첨가하고, 혼합하고 37℃에서 밤새 진탕시켰다.
LMWH-HES 접합체를 유속 5 ml/분으로 선형 구배를 이용하여 결합을 위해 50 mM Tris HC1-완충액 pH 7.5 및 용리를 위해 1M NaCl을 포함한 50 mM Tris HC1-완충액에 의해 HiPrep 16/10 Q FF 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 정제하였다. 30 mS/cm 보다 큰 전도도에서 용리되는 분획을 0.1 M NaCl을 포함한 50 mM 인산염 완충액 pH 6.5 및 4 ml/분의 유속을 이용하여 HiLoad 26/60 Superdex200 프렙 등급 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 더 정제하였다. 생성물을 물을 이동상으로 이용하여 4 ml/분의 유속으로 HiLoad 26/60 Superdex200 프렙 등급 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 탈염시켰다. 크로마토그램이 도 9에 도시된다. 수득된 생성물을 동결건조시키고 -20℃에서 보관하였다.
헤파린- HES
실시예 1 및 2는 응고 인자 VIII과 HES-헤파린-접합체의 비-공유결합성 복합체로 구성되었다(도 2 참조). FVIII은 A2-도메인에 정의된 헤파린-결합 부위를 가지며 높은 친화도로 헤파린 및 헤파리노이드(예를 들면, 저분자량 헤파린(예를 들면, Clexane) 또는 푸코이단)를 결합할 수 있다. 헤파린 또는 헤파리노이드는 짧은 링커 영역을 통해 HES-모이어티에 공유결합에 의해 결합된다. 이 HES-헤파린-접합체의 FVIII으로의 비공유결합성 결합은 차폐(shielding) 효과에 의해 반감기 연장을 매개한다.
표면 플라스몬 공명 결합 연구
Biacore T1OO 시스템 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)을 이용하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 결합 연구를 수행하였다. 검출 시스템은 실시간으로 분자 상호작용을 모니터링하기 위해 표면 플라스몬 공명에 기반한다(Malmquist and Karlsson, 1997; Rich and Myszka, 2003; Piliarek 2009).
결합 반응은 표면 플라스몬 공명의 변화를 유발하고, 이는 광학적으로 검출되고, 공명 단위(resonance unit, RU)로 측정된다. 1000 RU는 평균 단백질에 대한 표면 플라스몬 공명 각의 0.1°이동(shift) 및 약 1 ng/mm2의 표면 농도 변화에 해당한다(Johnsson et al., 1991).
분석 전에, 인간 재조합 혈액 응고 인자 VIII, 인간-CL rFVIII, 및 인간 재조합 혈액 응고 인자 IX, rFIX를 10 mM NaAc pH 5/pH 5.5에 의한 완충액 교환을 위해 NAP5 컬럼에 적재하고 공급자에 의해 설명된 바와 같이 아민 커플링 키트를 이용하여 CM5 바이오센서 칩의 덱스트란 매트릭스 상에 고정화시켰다. 단백질의 부재 하에 기준 채널(reference channel)을 활성화시키고 차단시켰다.
분석물 HES-헤파린 접합체와 푸코이단의 결합(association)을 10 mM Hepes, 150 mM NaCl 및 0.005% (v/v) Tween 20 (pH 7.4) 중에서 25℃에서 10 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 평가하였다. 동일한 완충액 흐름에서 15분 동안 해리(dissociation)되게 하였다.
해리 후에, 800 mM NaCl을 1시간 동안 주입시키는 것에 의해 바이오센서 칩을 재생시켰다. HES-헤파린 접합체와 푸코이단의 인간-CL rFVIII 및 인간 rFIX-코팅 채널로의 결합을 대조군 채널에 대한 비특이적 결합에 대해 보정하였다.
결합 상수의 결정을 위해, 고정화된 인간 재조합 혈액 응고 인자 VIII에 분석물의 농도 증가를 적용하였다. 결합 프로파일을 Biaevaluation 소프트웨어를 이용하여 평가하여 동역학적 적정 데이터(kinetic titration data)에 적합(fit)시켰다. 결합 데이터의 컴퓨터-기반 평가에 의해 동역학적 데이터(결합 속도 상수[ka], 해리 속도 상수 [kd]) 및 친화도 데이터 (해리 평형 상수 Kd)를 계산하였다.
SPR 방법을 이용하여 HES-헤파린-접합체의 rFVIII로의 결합 연구를 수행하였다. 인간-CL rFVIII을 센서 칩에 고정화시키고 증가되는 접합체 농도(14 -227 μM)에서 SPR을 통해 30 kDa HES-헤파린-접합체의 결합 및 해리를 모니터링하였다. 도 5는 전형적인 세트의 결합 곡선을 보여주어 모든 농도에서 HES-헤파린-접합체의 인간-CL rFVIII로의 결합을 입증한다. 결합 곡선의 소프트웨어-기반 분석은 6 (± 0.6) 10-7M의 해리 상수 Kd를 생성하여, HES-헤파린 접합체의 인간-CL rFVIII로의 강한 결합을 명확하게 입증했다.
인 비트로 안정성 연구
인공 시스템에서 약동학적 연구를 시뮬레이션하고 HES-헤파린-접합체의 결합의 FVIII 안정성에 대한 효과를 결정하기 위해 인 비트로 안정성 연구를 수행하였다. 따라서, 4 IU의 인간-CL rFVIII를 두 개의 상이한 HES-접합체(각각, HES(30 kDa)-접합체 및 HES(60 kDa)-접합체)와 1:2의 공칭 몰비(nominal molar ratio)로 혼합하고, 40 ㎕ 완충액에 용해시키고, 20 g 체중의 혈우병 마우스의 전혈 부피와 비슷한, 1.7 mL의 FVIII 결핍 혈장 (Coachrom Cat.no. FDP08-10, Lot no. D8-22)에 첨가하였다. 3가지 상이한 방식(기준인 인간-CL rFVIII, HES-접합체(30 kDa)와 복합체를 형성한 인간-CL rFVIII, HES-접합체(60 kDa)와 복합체를 형성한 인간-CL rFVIII)을 37℃에서 인큐베이션시키고 정해진 시간 간격 후에 시료를 채취하고 -80℃에서 직접 동결시켰다.
해동 후에, 발색 분석법(Coachrom Diagnostica GmbH, order # 221402; lot # 72502-PK:6)에 의해 FVIII 활성에 대해 시료를 분석하였다. 이 발색 분석법은 두 개의 연속된 단계에서 FVIII:C 활성을 결정한다: 활성화된 FIX (FIXa), 인지질 및 칼슘을 FVIII 시료에 첨가하여 FX를 FXa로 활성화시키고 후자가 뒤이어 첨가된 FX-기질을 절단하여 분광분석법에 의해 정량될 수 있는 발색단을 생성한다. 적합한 분석 조건 하에서, FXa 형성(및 따라서 발색단 생성)과 FVIII 농도 간의 관계는 선형적이다.
FVIII-결핍 혈장 및 37℃에서의 인큐베이션은 전술된 바와 같이 혈우병 마우스 모델을 모방했다. 뒤이어 FVIII:C 활성을 테스트하는 발색 분석법을 이용하여 혈장 시료를 분석하였다. 결과적으로 수득된 데이터를 시그마 플롯 계산(sigma plot computation) 소프트웨어를 이용하여 반감기로 전환시켰다. HES-접합체를 포함하지 않는 인간-CL rFVIII의 상대적 반감기(%)와 HES-접합체 (60 kDa)와 복합체를 형성한 인간-CL rFVIII의 직접 비교는 인 비트로 혈장 반감기가 1.4배 연장되었다는 것을 보여주었다. HES-접합체 (30 kDa)와의 복합체 형성은 1.35배의 반감기 연장을 가져와서, 인 비트로에서 FVIII에 비-공유결합에 의해 결합된 두 개의 HES-접합체의 반감기 연장 효과를 명확하게 나타냈다(도 6 참조).
혈우병 마우스에서의 약동학 연구
혈우병 마우스에서의 약동학 연구를 하기와 같이 수행하였다:
본 연구를 위해 20 내지 25 g의 암컷 및 수컷의 12주령 C57 BL/6 FVIII 넉아웃 마우스를 이용하였다.
하기에 기술된 바와 같이, 다음의 FVIII 변이체를 테스트하고 제조하였다:
기준인 인간-CL rFVIII, 60 kDa 또는 30 kDa HES-헤파린-접합체와 복합체를 형성한 인간-CL rFVIII 및 음성 대조군인 완충액. 인간-CL rFVIII을 1:2 공칭 몰비로 HES-헤파린-접합체와 복합체를 형성시키고 멸균 여과시키고, HES-헤파린-접합체를 포함하지 않는 기준 인간-CL rFVIII 및 완충액 음성 대조군도 멸균 여과시켰다.
4 IU의 FVIII를 포함하는 40 ㎕ (약 200 IU/kg에 해당함)를 혈우병 마우스에 꼬리 정맥을 통한 단일 투여로서 주사하였다. 주사 전 및 후와 투여 후 정해진 시간 간격에 시료를 채취하였다(시료채취 시간 및 물질당 그룹은 5마리의 마우스로 구성됨). 오스트리아, 비엔나의 Coachrom Diagnostica GmbH로부터 구매한 발색 분석법을 이용하여 FVIII:C 활성을 결정하고 이 결과로부터 시그마 플롯 계산 소프트웨어(Systat Software GmbH, Germany)를 이용하여 FVIII의 약동학을 계산하고 통계적으로 분석(t-검정 포함)하여 반감기를 결정하였다(T1 /2).
혈우병 마우스에서 혈장 반감기를 비교하기 위해, 하기의 FVIII 변이체를 테스트하였다:
기준인 인간 C1-rFVIII(그룹 1), 60 kDa HES-접합체와 복합체를 형성한 인간-CL rFVIII(그룹 2), 30 kDa HES-접합체와 복합체를 형성한 인간-CL rFVIII (그룹 3) 및 음성 대조군인 완충액 (그룹 4). 전체적으로, 물질당 25마리의 혈우병 마우스에 마우스당 40 ㎕의 총 주사 용량으로 4 IU의 rFVIII를 주사하였다. 주사 전과 후 및 주사 후 정해진 시간 간격 후에 시료를 채취하였고, 시료 채취 시간 및 물질 당 5마리씩 포함시켰다(예외: 그룹 3, 재료 한정 때문에 총 19마리의 마우스만 사용됨).
FVIII:C 활성에 대해 시료를 테스트하고 약동학적 파라미터에 대해 전술된 바와 같이 데이터를 분석하고, 결과를 하기의 표에 요약하였다:
그룹 # 테스트 물질 마우스의 수 상대적 반감기[%] 인간-CL rFVIII 대비 반감기 연장의 비율(factor) 통계적 분석의 P-값
1 인간-CL rFVIII 25 100 1 0.017
2 인간-CL rFVIII-HES-접합체(60 kDa) 25 170 1.7 0.006
3 인간-CL rFVIII-HES-접합체(30 kDa) 19 155 1.6 0.016
직접 비교에서, 두 종의 HES-접합체와 복합체를 형성한 인간-CL rFVIII는 연장된 혈장 반감기를 보였고; 보다 작은 HES-접합체(30 kDa)와 복합체를 형성한 경우 혈장 반감기는 1.6배 연장되었고, 보다 큰 HES-접합체(60 kDa)와 복합체를 형성한 경우 1.7배 연장된 혈장 반감기를 보였다(도 7 참조).
이 데이터는 혈우병 마우스 모델에서 비-공유결합에 의해 결합된 HES-헤파린-접합체의 FVIII에 대한 보호적인 반감기 연장 효과를 명확하게 보여주며, 이 효과는 보다 작은 HES-헤파린 접합체(30 kDa)에서보다 보다 큰 HES-헤파린 접합체(60 kDa)에서 약간 더 현저했다.
음성 대조군으로서, 혈우병 마우스에 완충액을 주사했고, 예상된 바와 같이, 발색 분석법에 의해 FVIII 활성이 확인되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
푸코이단
헤파린에 대한 가능한 대안을 예시하기 위해, 응고 인자 VIII 및 IX와 같은 헤파린-결합 단백질로의 결합 특성에 대해 푸코이단을 테스트하였다. SPR-기반 결합 실험은 푸코이단이 표적 단백질로의 비-공유결합성 결합을 위해 반감기 연장 HES-헤파린-접합체 내에서 헤파린을 대체할 수 있다는 것을 입증했다.
푸코이단을 가능한 헤파린 대체물로 평가하는 SPR-기반 결합 연구를 헤파린-결합 단백질인 인간-CL rFVIII 및 rFIX에 대해 수행하였다. 도 8은 각각 푸코이단의 rFVIII(직선) 및 rFIX(파선)로의 결합 및 해리를 도시하고, 푸코이단의 탐색된(probed) 단백질로의 결합을 명확하게 보여주며 결과적으로 가능한 헤파린-대체물로서의 적합성을 확인한다.

Claims (18)

  1. 하나 이상의 표적 단백질 및 상기 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 결합 분자를 포함하고, 상기 결합 친화도를 갖는 분자는 하나 이상의 수용성 중합체에 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 결합되는 것인 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 분자 및 상기 하나 이상의 수용성 중합체는 접합체(conjugate)를 형성하고, 상기 접합체는 상기 표적 단백질에 비-공유결합에 의해 커플링(couple)되는 것인 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단백질은 인자 IX, 인자 VIII (야생형 및 B-도메인 결실 인자 VIII), 인자 VII/VIIa, 트롬빈, 항트롬빈, 조직 플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator) 및 폰 빌브란트 인자(vWF)와 같은 (혈장 유래 또는 재조합) 혈액 응고 단백질, 에리트로포이에틴과 같은 성장인자, 과립구 자극 인자(G-CSF), 대식구 CSF(M-CSF) 및 과립구-대식구 CSF(GM-CSF)와 같은 콜로니-자극 인자(CSF), 인터루킨과 같은 사이토카인, 알파-1-안티트립신(A1AT)과 같은 프로테아제 억제제, 인테그린, 디스인테그린(disintegrin), 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 세포외 매트릭스 단백질, 매트릭스 메탈로프로테아제 및 ADAM/ADAMTS 단백질과 같은 메탈로프로테아제(metalloprotease), 아포리포프로테인(apolipoprotein), 수송 단백질, 호르몬, 억제성 또는 조절성 단백질 및 이들의 유도체 및 돌연변이체로부터 선택되는 것인 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 분자는 50 kD 미만, 바람직하게는 10 kD 미만의 분자량을 갖는 것인 복합체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 RGD 펩티드 및 RGD 결합 도메인과 같은 펩티드 모이어티(moiety), 헤파린 및 헤파란 술페이트 및 헤파린-유사 분자, 헤파린-모방체(heparin-mimetic) 분자와 같은 당(saccharide) 모이어티, 핵산 모이어티, 지방산과 같은 지질 모이어티, 이들의 유도체 및 모방체로부터 선택되는 것인 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 헤파린-유사 분자는 헤파린-모방체 펩티드인 것인 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 헤파린-모방체 펩티드는 아미노산 모티프 X1-Y(SO3)X2-Y(SO3)를 포함하고, 상기에서 Y(SO3)는 술페이트화 티로신이고, X1은 음전하를 띤 아미노산, 세린, 알라닌 또는 글리신이고, X2는 아스파르테이트 또는 알라닌이거나 또는 존재하지 않는 것인 복합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 중합체는 히드록시알킬 전분(HAS), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 및 덱스트란으로부터 선택되는 것인 복합체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 중합체의 분자량은 10 내지 500 kD, 10 내지 300 kD, 20 내지 20O kD, 30 내지 15O kD 또는 100 내지 300 kD의 범위인 것인 복합체.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는
    - 단 하나의 결합 분자 및 둘 이상의 중합체,
    - 둘 이상의 결합 분자 및 단 하나의 중합체, 또는
    - 둘 이상의 결합 분자 및 둘 이상의 중합체를 포함하는 것인 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 제조하는 방법으로서,
    - 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 결합 분자를 하나 이상의 수용성 중합체에 커플링시켜 접합체를 형성하는 단계,
    - 상기 접합체를 상기 분자가 결합 친화도를 갖는 표적 단백질과 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 분자는 이관능성 링커(bifunctional linker)를 통해 상기 수용성 중합체에 결합되는 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 복합체는 체외에서 형성되는 것인 방법.
  14. 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 분자와 수용성 중합체의 접합체.
  15. 표적 단백질을 제14항에 따른 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 또는 동물의 순환에서 표적 단백질의 반감기를 증가시키는 방법.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 복합체의 용도.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 표적 단백질은 인자 IX와 인자 VIII (야생형 및 B-도메인 결실 인자 VIII)로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 결합 분자는 헤파린-모방체 분자이며 상기 하나 이상의 중합체는 히드록시에틸 전분인 것인 복합체.
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