MX2010012044A - Complejo que comprende proteinas de union a heparina y conjugados de heparina-almidon de hidroxialquilo. - Google Patents

Abstract

Un complejo que comprende al menos una proteína objetivo y al menos una molécula de unión que tiene una afinidad de unión para la proteína objetivo, en donde la molécula objetivo que tiene una afinidad de unión está covalente o no covalentemente enlazada a al menos un polímero soluble en agua. En modalidades específicas, la invención está dirigida a un complejo que comprende por lo menos una proteína con un sitio de unión de heparina o una molécula de tipo heparina, en donde la heparina o la molécula de tipo heparina están covalentemente unida a almidón de hidroxialquilo.

Description

COMPLEJO QUE COMPRENDE PROTEINAS DE UNION A HEPARINA Y CONJUGADOS DE HEPARINA-ALMIDON DE HIDROXIALQUILO Campo de la Invención La presente invención se refiere a complejos para activar proteínas, moléculas de unión y polímeros. Además se describen métodos para la preparación de los complejos y el uso de los complejos.

Antecedentes de la Invención El uso de polipéptidos tales como proteínas para aplicaciones terapéuticas se ha expandido en los años recientes principalmente debido al avance de los conocimientos de los principios biológicos moleculares subyacentes de muchas enfermedades y la disponibilidad de sistemas de expresión y distribución recombinante mejorada para polipéptidos humanos. Los terapéuticos de polipéptido principalmente se utilizan en enfermedades en donde un cierto polipéptido natural es defectuoso o falto en el paciente, en particular debido a defectos genéticos heredados.

Por ejemplo, la hemofilia es una enfermedad causada por deficiencia de una cierta proteína en el plasma. Los hemofílicos sufren de morbidez hemorrágica causada por una función alterada de los componentes de la proteína de la cascada de coagulación sanguínea. Dependiendo del factor de coagulación afectado se pueden distinguir dos tipos de Ref. 215204 hemofilia. Ambas tienen en común la conversión inhibida del fibrinógeno soluble para un coagulo de fibrina insoluble. Existen enfermedades genéticas enlazadas cromosómicamente a X recesivas que afectan principalmente a la población masculina.

La hemofilia A afecta de 1-2 individuos por 10,000 hombres. Es causada por la deficiencia o ausencia del factor VIII, una muy grande glicoproteína (Pm de aproximadamente 330 kDa (Furie B. , Furie B.C., Cell (1988) 53, 505-518)), que representa un elemento importante de la cascada de coagulación sanguínea. La secuencia de polipéptido puede subdividirse en tres regiones, una región N-terminal que consiste de los denominados dominios Al y A2 , una región del dominio B central y una región C-terminal compuesta de los dominios A3 , Cl y C2. En la sangre, el factor de coagulación VIII aparece como un . precursor inactivo. Está unido herméticamente y no covalentemente. al factor von Willebrand (vWF) , que actúa como una proteína portadora estabilizante. La escisión proteolítica del factor VIII a través de trombina en tres posiciones específicas (740, 372, 1689) conduce a su disociación de vWF y libera la función pro-coagulante dentro de la cascada. En su forma activa, el factor VIII funciona como un co-factor para el factor IXa, por lo tanto acelerando la activación proteolítica del factor X a través de varias órdenes de magnitud.

La hemofilia B ocurre en aproximadamente 1 de 25,000 hombres. Se caracteriza por la deficiencia del factor IX se serina proteasa (factor Christmas) . Este polipéptido del aminoácido 415 se sintetiza en el hígado como una glicoproteína de 56 kDa . Con el fin de retener su función apropiada se requiere un paso de carboxilación post-transferencia que solamente ocurre en la presencia de la vitamina K.

El tratamiento de ambos tipos de trastorno de sangrado tradicionalmente involucra infusiones de concentrados de proteína derivados de plasma humano del factor VIII o del factor IX. Aunque este método representa una terapia eficiente para hemofílicos lleva el riesgo de la transmisión de varios agentes infeccioso, tales como virus que causan hepatitis o SIDA, o factores tromboembólicos . Alternativamente, se han descrito varias técnicas de ADN recombinantes para la producción de factores de coagulación. Para este propósito, los ADNc correspondientes del factor VIII de tipo silvestre y del factor IX se han aislado y clonado en vectores de expresión adecuados (EP-A- 160457 ; WO-A-86/01961, Patentes de E. U. A. Nos. 4,770,999, 5,521,070 y 5, 521, 070) .

En el caso del factor VIII, la expresión recombinante de las subunidades para la producción de complejos que muestran una actividad coagulante son conocidos en la técnica (por ejemplo, de EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, Patentes de E. U. A. Nos. 5,045,455 y 5,789,203). Además, la expresión de las versiones de ADNc truncadas parcial o enteramente carentes de la secuencia de codificación para el dominio B altamente glicosilado han sido descritas (por ejemplo, en WO-86/06101, O-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, WO-94/29471, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, Patentes de E. U. A. Nos. 4,868,112 y 4,980,456, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 y WO- 1/09122 ) . Más recientemente se han introducido una variedad de mutaciones de puntos seleccionados para inhibir la inactivación proteolítica del factor VIII a través de. la proteína C activada o para reducir la inmunogenicidad resultante en la formación de anticuerpos inhibidores a través de pacientes tratados (ver, por ejemplo, las Patentes de E. U. A. Nos. 5,859,204, 5,422,260 y 5,451,521, WO-97/49725, O-99/29848, y M. L. Liu et al., British J. Haematol. 103: 1051-1060 (1998)).

Sin embargo, los terapéuticos de polipéptido tales como el - factor VIII están asociados con muchos inconvenientes, incluyendo una corta media vida de la circulación, inmunogenicidad y degradación proteolítica. Por ejemplo, la vida media del factor VIII de proteína en el cuerpo humano es de aproximadamente 12 horas mientras en pacientes con enfermedad Willebrand (vWD) es de aproximadamente 12 horas. Hoy en día el tratamiento profiláctico representa el estado del tratamiento de la técnica de pacientes con hemofilia en países desarrollados. El tratamiento profiláctico usualmente da como resultado de 2 a 4 infusiones por semana.

Existe un número de proteínas adicionales que se utilizan para propósitos terapéuticos por ejemplo eritropoyetina, factor estimulador de colonia de granulocito (G-CSF) , interferones , anticuerpos monoclonales y similares.

En muchos casos, sería útil incrementar la vida media de las proteínas terapéuticas para aumentar la eficiencia o reducir la cantidad de proteínas terapéuticas aplicadas al paciente. Esto también reduciría los costos del tratamiento .

En la técnica anterior, la corta vida media circulante de los terapéuticos de polipéptido ha sido tratada a través de la unión covalente de un polímero a un polipéptido. Por ejemplo, la unión de polietilenglicol (PEG) , dextrina, o almidón de hidroxietilo (HES) han demostrado una mejora en la vida media de algunos polipéptidos .

Sin embargo, se han observado un número de problemas con la unión de los polímeros. Por ejemplo, la unión de polímeros puede conducir a disminuciones en la actividad del fármaco. Además, ciertos reactivos utilizados para los polímeros de acoplamiento a la proteína no son lo suficientemente reactivos y por consiguiente requieren más largos tiempos de reacción durante los cuales la desnaturalización y/o inactivación de la proteína puede ocurrir. También, la unión incompleta o no uniforme conduce a una población mixta de compuestos que tienen diferentes propiedades .

Un objetivo de la presente invención es superar los - inconvenientes de la técnica anterior, especialmente proporcionar un método mejorado para prolongar la vida media de las proteínas en la circulación de humanos o animales con el fin de reducir los grados de infusión y aumentar la calidad de vida del paciente. ' Breve Descripción de la Invención En una modalidad, la presente invención está dirigida a un método para aumentar la vida media de una proteína objetivo en la circulación de un humano o animal.

En una. modalidad, la presente invención describe un complejo que comprende por lo menos una proteína objetivo y por lo menos una molécula de unión que tiene una afinidad de unión para la proteína objetivo, en donde la molécula que tiene una afinidad de ..- unión está covalente o no covalentemente unida a por lo menos un polímero soluble en agua .

Sorprendentemente, se ha encontrado que el acoplamiento no covalentemente unido a la proteína objetivo a través de una molécula de unión capaz de herméticamente asociar la proteína da como resultado una vida media significativamente incrementada lo que revela un beneficio dramático para los pacientes.

Debido a la asociación de la molécula de unión con el sitio de unión específico de la proteína, el polímero acoplado a la molécula de unión se localiza en proximidad a la proteína, de esta forma influenciando las propiedades fisiológicas de la proteína. Se cree que debido al tamaño y las propiedades físicas del polímero, la depuración de la proteína de la circulación a través del riñon y/o la degradación de la proteína, por ejemplo, a través de la absorción en ciertas células, se perjudica.

En algunos casos, el tamaño global del complejo formado puede exceder el tamaño máximo de las moléculas que pueden depurarse de la circulación. En particular, la unión de la. proteína al. polímero no puede pasar las membranas en el riñon y de esta forma, permanece en la corriente sanguínea y no se excreta a través de la orina.

La molécula de unión y el polímero juntos forman un conjugado y la proteína objetivo no está covalentemente acoplada al conjugado. Preferiblemente, la molécula de unión está acoplada covalente al polímero en ese conjugado.

El conjugado también puede interferir con la absorción de la proteína a traVés de células y/o el reconocimiento y la unión de la proteína mediante las enzimas degradadoras . En particular, el conjugado, cuando se une a la proteína, puede enmascarar ciertas regiones de la proteína involucradas en la degradación y/o depuración o cambio de la carga global de la proteína. Por ejemplo, el conjugado enmascara las regiones de unión de la proteína que se reconocen por (i) los receptores o factores que facilitan la absorción de las proteínas en las células y/o (ii) las proteínas involucradas en las trayectorias de degradación tales como proteasas, enzimas de conjugación de ubiquitina, proteasomas , etc.

Además, el complejo y también los métodos de la invención proporcionan la ventaja de que las proteínas utilizadas en la terapia no tienen que ser químicamente modificadas con el fin de prolongar su vida media en la circulación. Más bien, los conjugados de acuerdo con la invención pueden incorporarse por ejemplo, en composiciones farmacéuticas preexistentes con el fin de ejercer su función. Para aplicaciones farmacéuticas que se basan en la aprobación clínica, esto es una ventaja sobre estrategias de acoplamiento convencionales, ya que la entidad terapéutica no se altera. El complejo de acuerdo con la presente invención preferiblemente se forma ex vivo.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un complejo que comprende por lo menos una proteína objetivo y por lo menos una molécula de unión que tiene una afinidad de unión para la proteína objetivo, en donde la molécula de unión que tiene una afinidad de unión preferiblemente está covalentemente unida a por lo menos un polímero, la molécula de unión y .el polímero juntos forman un conjugado que se une al sitio de unión de la proteína objetivo .

En un segundo aspecto, la presente invención está dirigida al conjugado presente en el complejo del primer aspecto y al uso del mismo para formar un complejo.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un complejo de acuerdo con el primer aspecto, que comprende el paso de poner en contacto la proteína objetivo con el conjugado.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para incrementar la vida media de una proteína objetivo en la circulación de un humano o animal, que comprende el paso de poner en contacto la proteína objetivo con un conjugado que comprende un polímero y una molécula de unión que tiene una capacidad de unión a la proteína objetivo.

En un quinto aspecto, la presente invención está dirigida al uso del complejo de acuerdo con el primer aspecto en medicina y para la preparación de una composición farmacéutica, respectivamente. Además, este aspecto también está dirigido a una composición farmacéutica que comprende el complejo de acuerdo con el primer aspecto.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar el conjugado de acuerdo con el tercer aspecto, que comprende el paso de acoplar el polímero a la molécula de unión.

Las modalidades específicas de estos aspectos de la invención se describen a continuación y en las reivindicaciones anexas al mismo.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la estructura tridimensional del factor de coagulación de sangre VIII en donde los sitios de interacción con la proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) y el proteoglicanos de heparanosulfato (HSPG) están resaltados.

Las Figuras 2A-2D muestran una estructura del complejo del factor VIII con un conjugado de 1:1 de heparinoide-HES .

La Figura 3 muestra un esquema de una proteína objetivo con un conjugado de~ aptámero covalente-HES (A = Aptámero) .

La Figura 4 muestra un esquema para la -unión de una proteína objetivo modificada después de la transferencia con un conjugado mimético de molécula-HES .

La Figura 5 muestra los estudios de unión de los conjugados de heparina HES utilizando resonancia de plasmón de superficie.

La Figura 6 muestra la prolongación de la vida media de los conjugados HES del factor VIII comparado con el factor VIII in vitro.

La Figura 7 muestra la prolongación de la vida media en plasma de un conjugado HES del factor VIII comparado con el factor VIII in vivo.

La Figura 8 muestra la resonancia de plasmón de superficie con base en los estudios de unión del factor VIII humano y del factor IX a fucoidano.

La Figura 9 muestra los cromatogramas de índice de refracción tomados de las mediciones SEC-dRI/UV/MALS de HES activado (Cl Maleimida HES -línea punteada) , LMWH modificado con tiol (línea sólida) y el conjugado LMWH-HES purificado (línea discontinua) . Columna: Superdex200 10/300 GL; fase móvil: 50 mM de regulador de pH de fosfato pH = 6.5 con 150 mM de NaCl . (picos mayores de 40 min: sales) .

Descripción Detallada de la Invención Definiciones : Como se utiliza en las presente, las siguientes expresiones generalmente pretenden preferiblemente tener el significado establecido más adelante, excepto al grado en donde el contexto en el cual se utilizan indica lo contrario.

La expresión "comprende", como se utiliza en la presente, también incluyen y específicamente se refiere a las expresiones "esencialmente consiste de" y "consiste de" .

Como se utiliza en la presente, el término "complejo" particularmente significa una asociación física no covalente entre dos - o más compuestos. Los compuestos del complejo, en la presente al menos la proteína objetivo y el conjugado están asociados a través de una o más -fuerzas intermoleculares (no covalentes) , por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones de dipolo-dipolo, unión de hidrógeno, interacciones van-der-Waals y/o efectos hidrófobos.

El término "conjugado" particularmente significa dos o más compuestos que se enlazan juntos de tal forma que por lo menos algunas de las propiedades de cada compuesto se retienen en el conjugado. El enlace puede lograrse a través de un enlace covalente o no covalente. Preferiblemente, los compuestos del conjugado se enlazan a través de un enlace covalente. Los diferentes compuestos de un conjugado pueden directamente unirse entre sí a través de uno o más enlaces covalentes entre átomos de los compuestos . Alternativamente, los compuestos pueden unirse entre sí a través de una molécula enlazadora en donde el enlazador está covalente unido a los átomos de- los compuestos. Si el conjugado está compuesto de más de dos compuestos, entonces estos compuestos pueden,, por ejemplo, enlazarse en una conformación de cadena, un compuesto unido al siguiente compuesto, o varios compuestos cada uno puede unirse a un compuesto central.

Como se utiliza en la présente, el término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos o un complejo de más de una cadena de aminoácidos. Una proteína puede contener cualquier aminoácido de existencia natural así como aminoácidos artificiales y puede se de origen biológico o sintético. Una proteína puede modificarse, naturalmente (modificaciones después de la transferencia) , o sintéticamente, a través de, por ejemplo, glicosilación, amidación, carboxilación y/o fosforilación. Una proteína comprende por lo menos dos aminoácidos, pero no tienen que ser de una longitud específica; el término no incluye ninguna restricción de tamaño. En la presente solicitud, los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se utilizan de manera intercambiable. Preferiblemente, una proteína comprende por lo menos 10 aminoácidos, preferiblemente al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, y más preferido al menos 100 aminoácidos.

El término "ácido nucleico" incluye ácidos nucleicos y ácidos ribonucleicos de estructura de cadena individual o de estructura de cadena doble así como ácidos desoxirribonucleicos .

El término "sitio de unión" particularmente se refiere a una región de una proteína que, es un resultado de su forma, hidrofobicidad y/o carga (parcial) . Favorablemente, el sitio de unión es naturalmente capaz de asociarse no covalentemente con una molécula objetivo tal como por ejemplo, heparina.

Los ejemplos particulares de sitios de unión son sitios de unión de heparina capaces de unirse a la heparina y/o compuestos cercanamente relacionados tales como sulfato de heparano, heparinoides y/o sus derivados. Otro ejemplo son sitios de unión de ión metálico capaces de unirse a un ión metálico seleccionado del grupo que consiste de iones metálicos monovalentes, iones metálicos divalentes, iones metálicos trivalentes, e iones metálicos tetravalentes. Los iones metálicos ilustrativos son iones de zinc, cobre, cobalto, cadmio y mercurio. Un ejemplo más son sitios de unión RGD capaces de unirse a péptidos RGD, es decir, péptidos que contienen la secuencia de aminoácido de arginina (R) , glicina (G) , aspartato (D) , o péptidos que tienen una secuencia cercanamente relacionada y/o sus derivados. Un ejemplo son sitios de unión de lípido capaces de unirse a lípidos incluyen monoglicéridos , diglicéridos , triglicéridos , fosfolípidos , esfingolípidos, . sacarolípidos , policetidas, esterol lípidos, prenol lípidos y ácidos grasos.

Como se utiliza en la presente, el término "molécula de unión" significa un compuesto capaz de la unión no covalente a un sitio de unión de una proteína. Preferiblemente, la unión al sitio de unión es específica, es decir, es más fuerte que sus interacciones con la mayor parte de las otras moléculas presentes en el entorno natural de la proteína, por ejemplo, la circulación de humano o de animal. En modalidades preferidas, la fracción de unión se une al sitio de unión con una afinidad que tiene una constante de disociación bajo condiciones fisiológicas de 1 mM o menor, más preferiblemente 300 µ? o menor, 100 µ? o menor, 30 µ? o menor, 10 µ? o menor, 3 µ? o menor, 1 µ? o menor, 300 nM o menor, 100 nM o menor, 30 nM o menor y más preferiblemente 10 nM o 1 nM o menor. La estructura y la composición de la fracción de unión no están restringidas en ninguna forma mientras sean capaces de. unirse al sitio de unión. Preferiblemente, la fracción de unión es no tóxica y fisiológicamente aceptable. Por ejemplo, la fracción de unión puede ser una fracción de unión de péptido, una fracción de sacárido, una fracción de ácido nucleico, una fracción de lípido o uno de sus compuestos miméticos, o una combinación de éstos. Los ejemplos particulares de la molécula de unión son heparina, sulfato de heparano, moléculas de tipo heparina tales como péptidos miméticos de heparina particulares, péptidos RGD, miméticos de ión metálico, y lípidos, y sus derivados y sus miméticos.

El término "polímero" particularmente se refiere a un compuesto que está compuesto de dos o más especies moleculares ( "monómeros" ) que forman una molécula más grande covalentemente unida. Los polímeros pueden ser naturales o sintéticos y lineales, ramificados o dendríticos. El polímero puede además derivatizarse con sustituyentes adecuados tales como grupos reactivos.

El término "polímero soluble en agua" se refiere a un polímero que es soluble en el agua. El contraste con los polímeros sólidos, que se utilizan para producir por ejemplo placas de micro-titulación, tubos y similares. A una concentración de 1 rag/ral, el polímero soluble en agua forma una solución con agua sin la separación de fase.

El término "almidón de hidroxialquilo" o "HAS" se refiere a un derivado del. almidón que está sustituido por lo menos grupo hidroxialquilo. El almidón preferiblemente es almidón de existencia natural como almidón de papa o almidón de maíz. Los grupos hidroxialquilo preferiblemente se unen al oxígeno en el átomo de carbono C2, C3 y/o C6 de las unidades de glucosa y principalmente ocurre en C2 y C6. La cantidad de grupos hidroxialquilo introducidos puede expresarse como el grado molar de sustitución MS, que se define como el número promedio de grupos hidroxialquilo por molécula de glucosa (MS máxima = 3.0; usualmente . entre 0.4 y 0.7) . Los grupos hidroxialquilo" unidos pueden tener cualquier estructura química adecuada pero preferiblemente son grupos alquilo inferiores de cadena o ramificados que tienen, por ejemplo, de 1 a 10 átomos de carbono. Preferiblemente, el grupo hidroxialquilo tiene de 2 a 8, y más preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. Por ejemplo, el grupo hidroxialquilo puede ser un grupo hidroxietilo, hidroxipropilo o hidroxibutilo, con hidroxietilo, n particular 2 -hidroxietilo siendo el más preferiblemente. El almidón de hidroxialquilo en donde el grupo hidroxialquilo es hidroxietilo, preferiblemente 2-hidroxietilo, se denomina "almidón de hidroxietilo" o "HES" .

Un "derivado" de un compuesto particularmente se refiere al compuesto que está sustituido por una o más fracciones químicas y/o en donde una o más de las fracciones químicas ha sido eliminada. Los derivados incluyen aquellos que se obtienen por procedimientos de existencia natural (por ejemplo, fosforilación de proteínas, metilación de ácidos nucleicos, etc.) así como los obtenidos por síntesis química. Los sustituyentes ilustrativos de un derivado son grupos funcionales tales como grupos hidroxi, carboxi , ceto, aldehido, amino, sulfito, sulfato y fosfato; u otros grupos tales como alquilo, arilo, alcoxi, etc.

Un "mimético" de un compuesto objetivo, como se utiliza en la presente, particularmente significa un compuesto que tiene una o más propiedades que son similares a las- propiedades del compuesto objetivo. En particular, si el compuesto objetivo es capaz de unirse al sitio de unión específico de una proteína, el mimético del compuesto objetivo, por ejemplo, heparina, también es capaz de unirse al sitio de unión, preferiblemente con una afinidad comparable. Más preferiblemente, la constante de disociación del mimético, que definen la afinidad del sitio de unión, es a lo sumo 100 veces la constante de disociación del compuesto objetivo, más preferiblemente a lo sumo 500 veces, a lo sumo 50 veces, a lo sumo 20 veces, a lo sumo 10 veces, a lo sumo 5 veces, a lo sumo 2 veces, a lo sumo 1.5 veces, a lo sumo 1.2 veces la constante de disociación del compuesto objetivo, y más preferiblemente es igual a o menor que la constante de disociación del compuesto objetivo.

En una modalidad preferida, la estructura tridimensional y/o la distribución espacial de la carga de un. mimético se asemeja al compuesto objetivo, al menos en la porción, o una de sus partes, relevante a la unión al sitio obj etivo .

Un "enlazador" es una fracción química que enlaza dos o más compuestos objetivos entre sí. En este punto, la molécula enlazadora, antes de acoplarse a los compuestos objetivos, exhibe grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con los compuestos objetivo. El enlace entre dos compuestos objetivo puede formarse utilizando una molécula enlazadora, o una secuencia de moléculas enlazadoras pueden unirse entre sí antes de que la segunda (o ambas) moléculas objetivo se acoplen.

El término "circulación" como se utiliza en la presente, particularmente se refiere al sistema 'cardiovascular y/o el sistema linfático de un humano o animal, preferiblemente el sistema cardiovascular, que incluyen el corazón, la sangre y los vasos sanguíneos.

La "vida media" de un compuesto particularmente se refiere al tiempo requerido para que la cantidad del compuesto decaiga a la mitad de su valor inicial. Por ejemplo, la vida media de un compuesto en circulación es el tiempo requerido para que la concentración del compuesto en circulación disminuya a la mitad de la concentración inicial, por ejemplo, la concentración en el momento en que el compuesto ha sido adicionado a la circulación. La vida media en un compuesto en circulación está influenciada por una variedad de factores tales como el grado de depuración renal del compuesto, el grado de degradación del compuesto (enzimática) , el grado de absorción del compuesto en las células, etc.

El término "composición farmacéutica" particularmente se refiere a una composición adecuada para la administración a un humano o animal, es decir una composición que . contiene componentes que son farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, una composición farmacéutica comprende un compuesto activo o una sal o uno de sus profármacos junto con un portador, diluyente, o excipiente farmacéutico tal como un regulador de pH, conservantes, y modificador de tonicidad.

El término "peso molecular" de un compuesto particularmente se refiere al peso de un mol de tal compuesto. Si el compuesto es polidisperso, los pesos moleculares se refieren al peso molecular promedio en peso de la mezcla polidispersa la -cual, de esta forma puede incluir compuestos individuales que tienen un peso molecular mayor o menor que el peso molecular promedio en el peso indicado.

Todas las patentes., solicitudes de patentes, artículos específicos y otros documentos mencionados en la presente se incorporan aquí por referencia.

La présente invención se basa en el hallazgo de que la vida media de una proteína objetivo en la circulación de un humano o animal puede aumentarse a través de la unión no covalente de un polímero a la proteína objetivo utilizando una molécula de unión que se acopla al polímero.

A este respecto, la invención está dirigida a un complejo que comprende una proteína objetivo y a un conjugado que comprende una fracción polimérica y una fracción de unión que tiene capacidad de unión a la proteína objetivo, en donde la proteína objetivo está no covalentemente acoplada al conjugado. - . ¦ La proteína objetivo cuya vida media en circulación se va a aumentar puede ser cualquier proteína mientras se exhiba un sitio de unión capaz - de asociarse con la fracción de unión. Preferiblemente, la proteína es soluble en agua. En ciertas , modalidades, la proteína tiene actividad farmacológica en humanos y/o animales y preferiblemente es útil en el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad como se explica a continuación. Preferiblemente, la proteína objetivo está directamente administrada a la circulación en el tratamiento, por ejemplo, a través de inyección intravenosa o intraarterial .

En modalidades preferidas, la proteína objetivo tiene actividad terapéutica. Las proteínas objetivo adecuadas comprenden sitios de unión seleccionados del grupo que consiste de un sitio de unión de heparina, un sitio de unión del péptido RGD, un motivo RGD, un sitio de unión de ión metálico, un sitio de unión de lípido y un sitio de unión de ácido nucleico.

Las proteínas objetivo adecuadas se seleccionan del proteínas de coagulación sanguínea tales como el factor IX, el factor VIII (el dominio de tipo silvestre y el dominio B eliminado), el factor VII/VIIa, trombina, . antitrombina, activador de- plasminógeno tisular y el factor von illebrand (vWF) , factores de crecimiento tales como eritropoyetina, factores estimuladores de colonia (CSFs) tales como el factor estimulador de granulocito (G-CSF) , CSF de macrófago (M-CSF) y CSF de macrófago de granulocito (GM-CSF) , citocinas tales como interleucinas , inhibidores de proteasa tales como alfa-1-antitripsina (A1AT) , integrinas, desintegrinas , proteínas de matriz extracelular tales como fibronectina y vitronectina, metaloproteasas tales como metaloproteasas de matriz y proteínas ADAM/ADAMTS , metaloproteasas, apolipoproteínas , proteínas de transporte, hormonas, proteínas que actúan como inhibidoras o reguladoras, y sus derivados y mutantes .

En algunas modalidades, la proteína objetivo tiene un peso molecular de 10 kDa o más, preferiblemente 30 kDa o más, y más preferiblemente 50 kDa o más. Además, la proteína puede tener un peso molecular de 1000 kDa o menor, preferiblemente 500 kDa o menor, más preferiblemente 200 kDa o menor .

Las proteínas objetivo adecuadas comprenden un sitio de unión de heparina que son, por ejemplo, antitrombina , trombina, factor von Willebrand, activador de plasminógeno tisular, factor VIII, factor IX, vitronectina, inhibidor de proteína C, inhibidor de la trayectoria del factor tisular, factor 4 de plaqueta, glicoproteína rica en histidina, trombospondina, urocinasa, fibronectina, factores de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento de hepatocito, lipasas, apolipoproteína B, apolipoproteína E.

Los ejemplos de sitios de unión adecuados para la invención son sitios de unión de heparina, sitios de unión del péptido RGD, motivos RGD, dominios de homología 2 Src (SH2) , dominios de homología 3Src (SH3) , sitios de unión de ión metálico, sitios de unión de lípido, sitios de unión de ácido nucleico. En una modalidad preferida, la proteína comprende un sitio de unión de heparina tal como el factor de coagulación sanguíneo VIII mostrado en la Figura 1.

Las proteínas objetivo comprenden un sitio de unión RGD que incluye, por ejemplo, integrina. Los ejemplos de proteínas objetivo que contienen el motivo RGD son desintegrinas y proteínas de matriz extracelular tales como fibronectina y vitronectina .

Las proteínas objetivo que comprenden un sitio de unión de ión metálico incluyen, por ejemplo, metaloproteasas tales como metaloproteasas de matriz y proteínas ADAM/ADAMTS; y metaloteoninas .

Las proteínas objetivo comprenden un sitio de unión y de lípido, que incluye, por ejemplo, apolipoproteínas .

En modalidades preferidas, la proteína objetivo comprende un sitio de unión para la fracción de unión que al menos parcialmente participa en la degradación y/o depuración de la proteína objetivo.

Dependiendo de la proteína objetivo cuya vida media en circulación se va a incrementar, la fracción de unión del conjugado tiene que seleccionarse. Preferiblemente, la fracción de unión se une selectivamente a la proteína objetivo. Normalmente, el complejo de la proteína objetivo y el conjugado se forman in vitro en ausencia de otras proteínas capaces de unirse a la fracción de unión.

Una fuerte afinidad y especificidad de la fracción de unión a la proteína objetivo es preferida con el fin de segurar que el complejo permanezca durante un cierto periodo de tiempo intacto, es decir, asociado después de la administración. Esto es importante con el fin de lograr la prolongación de la vida media. La resistencia de unión de la interacción de dos compuestos usualmente se expresa a través de su constante de disociación Kd. La constante de disociación Kd es una constante de equilibrio, que describe la relación de compuestos no unidos a compuestos unidos, por ejemplo, las concentraciones de la proteína objetivo libre y el conjugado libre al complejo de proteína-conjugado. El intervalo típico en sistemas biológicos está entre micro-y picomolar. Por ejemplo, bajo concentraciones de sal fisiológica, el valor Kd de la unión de heparina a las proteínas (es decir, proteínas de unión a heparina) está en el intervalo nanomolar de bajo a alto. Por ejemplo, Olson et al., 1981 J. Biol . Chem. , 256, 11073-11079 determinó una constante -de equilibrio de disociación de 7.2 +/- 1.9 X 10"8 M para la unión a heparina a antitrombina III, que demuestra la alta afinidad de las interacciones de proteína-heparinoides .

De esta forma, la constante de disociación Kd de la interacción de la fracción de unión a proteína objetivo e igualmente, de la interacción del conjugado de proteína objetivo, preferiblemente está en el intervalo micromolar o por debajo. Preferiblemente, la constante de disociación es 100 µ? o menor, más preferiblemente 100 nM o menor.

La molécula de unión puede ser de cualquier naturaleza química incluyendo fracciones de péptido, fracciones de sacárido, fracciones de ácido nucleico, fracciones de lípido y otros compuestos orgánicos.

En una modalidad, la molécula de unión comprende el ligando natural de la proteína objetivo, o una parte del ligando capaz de unirse a la proteína objetivo. Sin embargo, la molécula de unión no tiene que comprometer al ligando natural de la proteína objetivo. En una modalidad, la-molécula de unión comprende un mimético de ligando natural de la proteína objetivo. Tales miméticos pueden ser de cualquier naturaleza química, y preferiblemente son miméticos de péptido que comprenden aminoácidos naturales y/o artificiales; los miméticos de sacárido comprenden monosacáridos naturales y/o artificiales; los miméticos de ácido nucleico comprenden nucleótidos naturales y/o artificiales o ácidos nucleicos de péptido acoplados a través de enlaces de fosfodiéster normales o enlaces artificiales, o miméticos del compuesto orgánico.

De esta forma, en el caso de la proteína objetivo que comprende un sitio de unión, de heparina, la molécula de unión puede ser una fracción de heparina, una fracción de sulfato de heparano, o una fracción de tipo heparina tales como fucoidanos, fucanos sulfatados o heparinoides , es decir, altamente ácidos, por ejemplo, polisacáridos altamente sulfatados, o sus miméticos. La heparina puede ser una heparina de bajo peso molecular (LMWH) que tiene un peso molecular promedio en peso menor de aproximadamente 8000 Da, tal como enoxaparina (Clexan; Mw = 4.2 kDa) o Fondaparinux de pentasacárido completamente sintético (Arixtra; 1726.77 g/mol) . Preferiblemente, la heparina, el sulfato de heparano heparinoide está en promedio compuesto de 30 a 20 uniones de monosacárido, más preferiblemente de 5 a 15 unidades de monosacárido, tales como pentasacáridos .

Preferiblemente, la molécula de tipo heparina es un péptido de unión al sitio de unión de heparina de la proteína objetivo tal como el péptido mimético de heparina. De esta forma, el mimético de heparina o sulfato de heparano puede ser un péptido preferiblemente comprendiendo aminoácidos relativamente cargados como Glu o Asp, aminoácidos modificados con un grupo negativamente cargado tales como aminoácidos sulfatados, en particular tirosina sulfatada, y aminoácidos fosforilados , en particular, tirosina fosforilada, serina o treonina, y/o aminoácidos no naturales con fracciones de ácido en la cadena lateral. Preferiblemente, el péptido mimético de heparina comprende uno o más aminoácidos sulfatos tales como tirosina sulfatada. En una modalidad, el péptido mimético comprende el motivo de aminoácido ? -? (S03) -X2-Y (S03) , en donde Y(S03) es una tirosina sulfatada, X1 es un aminoácido negativamente cargado, serina, alanina o glicina y X2 es un aspartato, alanina o está ausente. Los péptidos miméticos ilustrativos comprenden un motivo de aminoácido: - - SY(S03)DY(S03) , SY(S03)DY(S03)SY(S03)DY(S03) O - Y(S03) Y(S03)GGY(S03)DY(S03) .

Además, el mimético de heparina o el sulfato de heparano pueden ser un .compuesto químico tal como suramina o sus derivados; polímeros orgánicos tales como polímeros sulfonados, polímeros con cadenas laterales de aminoácido y polímeros con cadenas laterales de mono disacárido; o sacáridos sulfatados, en particular pentasacáridos sulfatados .

Los miméticos adecuados de heparina se describen, por ejemplo, en H. H. A. M. Hassan, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 7:1206-1235 (2007), S. H. Kim and K. L. Kiick, Peptides^ 28:2125-2136 (2007), y H. D. Maynard and J.A. Hubbell, Acta Biomateriala 1:451-459 (2005), que se incorporan aquí por referencia.

Si la proteína objetivo comprende un sitio de unión RGD, la fracción de unión puede ser un péptido natural o sintético que comprende un motivo RGD. Las secuencias adecuadas pueden encontrarse en proteínas de unión a integrina tales como desintegrinas y proteínas de matriz extracelular, por ejemplo, fibronectina y vitronectina .

Si la proteína objetivo comprende un motivo RGD, la fracción de unión puede ser un péptido de unión RGD tal como un dominio de la proteína de unión RGD como se encuentra, por ejemplo, en varias integrinas, o un compuesto sintético específicamente uniéndose al motivo RGD, por ejemplo, un péptido cíclico como se describe en WO 90/03983 o WO 97/08203.

En el caso de la proteína objetivo que comprende un dominio SH2 , la fracción de unión puede ser un péptido de unión SH2 que preferiblemente comprende un residuo de tirosina, más preferiblemente un residuo de tirosina fosforilado, o un mimético de un péptido de unión SH2.

En el caso en donde la proteína objetivo comprende un dominio SH3 , la fracción de unión puede ser un péptido de unión SH3 que preferiblemente comprende un residuo de prolina, o un mimético de un péptido de unión SH3. Preferiblemente, el péptido de unión SH3 comprende el motivo de aminoácido P-X-X-P en donde P es prolina y X es cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido alifático; o el motivo del aminoácido R-X-X-K con R siendo arginina, K siendo lisina y X siendo cualquier aminoácido.

En el caso de la proteína objetivo que comprende un sitio de unión de ión metálico la molécula de unión puede ser un ligando de un complejo metálico tal como una amina, un carboxilato o un tiol .

En el caso en donde la proteína comprende un sitio de unión de lípido, la fracción de unión puede ser un lípido tal como un fosfolípidos o un ácido graso.

Si la proteína objetivo comprende un sitio de unión de ácido nucleico, la fracción de unión puede ser un ácido nucleico de existencia natural o sintético, tal como un ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico de estructura de cadena individual o de . estructura de cadena doble, o uno de sus miméticos tal como un ácido nucleico de péptido. Si el sitio de unión de ácido nucleico es específico de secuencia, la fracción de unión preferiblemente es un ácido nucleico que tiene la secuencia requerida o la secuencia cercanamente relacionada, tal como una secuencia que tiene aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia con la secuencia completa del motivo de unión.

De acuerdo con una modalidad, la molécula de unión no es un anticuerpo o una parte de anticuerpo que comprende una región variable o una parte de unión del mismo. De acuerdo con una modalidad más, la proteína objetivo no es un anticuerpo o una parte de anticuerpo que comprende región variable o una parte de unión del mismo. Además, de acuerdo con una modalidad ni la molécula de unión ni la proteína objetivo son un anticuerpo o una parte de un anticuerpo que comprende una región variable o una parte de unión del mismo.

En una modalidad preferida, la proteína de unión es un sitio de unión de heparina que comprende una proteína tal como el factor VIII o el factor IX y la fracción de unión es heparina, sulfato de heparano, un heparinoide o uno de sus miméticos .

Para minibar la influencia de la molécula de unión sobre la función de la proteína objetivo, la fracción de unión preferiblemente deberá ser tan pequeña como sea posible. De esta forma, la fracción de unión preferiblemente tiene un peso molecular de 50 kDa o menor, más preferiblemente 10 kDa o menor, aún más preferiblemente 5 kDa. Además, la molécula de unión puede tener un peso molecular de 100 kDa o más, por ejemplo 500 o más.

Para aumentar la vida media de la proteína objetivo principalmente se atribuye a la unión del conjugado. De esta forma, el conjugado, cuando se une a la proteína objetivo, preferiblemente aumenta la vida media de la proteína objetivo en -la circulación de un. cuerpo de humano o animal. Por ejemplo, el conjugado, cuando se une a la proteína objetivo, puede ser capaz de interferir con la depuración de la proteína objetivo de la circulación o con la degradación de la proteína objetivo y/o enmascara una o más de las regiones de la proteína objetivo involucradas en la absorción de la proteína objetivo por las células y/o el reconocimiento de la unión de la proteína objetivo a través de enzimas degradables.

El polímero comprende . por lo menos un polímero lineal natural o sintético ramificado o dendrítico y preferiblemente soluble en agua y fluidos corporales y más preferiblemente es hidrófilo. En modalidades preferidas, la fracción polimérica es biológicamente inerte y/o farmacéuticamente aceptable.

El polímero puede ser de cualquier tamaño adecuado para el propósito deseado. En vista de esto, . el., polímero preferiblemente tiene un peso molecular de 5 kDa o más, más preferiblemente 10 kDa o más. Como límite superior, el polímero preferiblemente tiene un peso molecular de 1000 kDa o menos, más preferiblemente 300 kDa o menos, y más preferiblemente 200 kDa o menos.

En ciertas modalidades, el polímero comprende un polímero seleccionado del grupo que consiste de polisacáridos , polipéptidos, ácidos nucleicos, poliésteres, poliésteres., y ... poliolefina ._ Preferiblemente, la fracción polimérica comprende un polímero seleccionado del grupo que consiste de polialquilenglicol y sus. derivados, incluyendo polietilenglicol (PEG) , homopolímeros de PEG, mPEG, homopolímeros de polipropilenglicol , copolímeros de etilenglicol con propilenglicol , en donde los homopolimeros y copolímeros están sin sustituir o sustituidos en un extremo, por ejemplo, con un grupo acilo; poliglicerinas o ácido polisiálico ; hidroxipropil metacrilato (HP A) y sus copolímeros; poliglutamato, carbohidratos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo metilcelulosa y carboximetilcelulosa ; almidones tales' como almidón de hidroxialquilo (HAS) , especialmente almidón de hidroxietilo (HES) y dextrinas, y sus - derivados ; dextrina y derivados de dextrina, incluyendo dextrinsulfato, carboximetil dextrina, dextrina entrelazada y dextrina de carboximetilo ; quitosano, alcohol polivinílico y éteres de polivinil etilo; polivinil pirrolidona; alfa, beta-poli [ (2-hidroxietil) -DL-aspartamida; y polioles polioxietilados .

En una cierta modalidad, el polímero comprende almidón de hidroxialquilo, preferiblemente almidón de hidroxietilo, que tiene un peso molecular promedio (Pm) de por lo menos 5 kDa y preferiblemente, máximo 1000 kDa, más preferiblemente entre 8 y 500 kDa y aún más preferiblemente entre 10 y -300 kDa y de 100 a 300 kDa. Puede tener un grado molecular de sustituciones de hidroxialquilo (hidroxietilo) por unidad de glucosa de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 1.3, preferiblemente de 0.4 a 0.9 o de 0.4 a 0.7.

El polímero puede estar directamente acoplado a la fracción de unión. En el caso en donde la molécula polimérica y/o la fracción de unión no posean un grupo de acoplamiento apropiado, se pueden utilizar uno o más enlazadores para apropiadamente modificar el polímero y/o molécula de unión con el fin de que reaccionen con por lo menos un grupo reactivo en la otra molécula para formar el conjugado. En este punto, cualquier estrategia de acoplamiento adecuada conocida en la técnica puede utilizarse. Los enlazadores adecuados, las fracciones poliméricas y los métodos de conjugación también se describen con detalle en WO 2007/101698 y Orlando, Michele, Dissertation, Modification of proteins and low molecular eight substances with hydroxyethyl starch (HES) , Justus-Liebig-Universitat Giessen, Alemania, 2003, que se incorporan por referencia. Preferiblemente, el acoplamiento es específico de tal forma que solamente se utiliza uno o un número definido de grupos reactivos de la molécula de unión y/o el polímero para el acoplamiento. Para el acoplamiento del polímero, la molécula de unión y opcionalmente uno o más enlazadores entre sí, cualquier grupo reactivo puede utilizarse.

De esta forma, si la molécula de unión o polímero comprenden un péptido, la reacción de acoplamiento puede específicamente dirigirse al amino de la cadena alfa o el grupo carboxi o al grupo reactivo de la cadena lateral del aminoácido que .preferiblemente ocurre solamente una vez en el péptido. Los ej emplos de grupos reactivos de cadena lateral adecuados son el grupo cisteína tiol, el grupo lisina, arginina o histidina amino, el grupo aspartato o glutamato carboxi, el grupo asparagina o glutamina amido, y el grupo serina, treonina o tirosina hidroxi . Sin embargo, también los grupos reactivos introducidos por los aminoácidos artificiales pueden utilizarse para el acoplamiento.

En el caso de la molécula de unión, con el polímero que comprende un péptido, los siguientes grupos reactivos están presentes en o se introducen en otra fracción pueden utilizarse para el acoplamiento: grupos de acilación que reaccionan con grupos amino de un péptido, por ejemplo grupos de anhídrido ácido, grupos N-acilimidazol , grupos azida, grupos anhídridos N-carboxi, grupos diceteno, grupos dialquil pirocarbonato, grupos imidoéster, y grupos carboxilo activados por carbodiimida . Todos los grupos anteriores se sabe que reaccionan con grupos aminos por ejemplo, proteínas para formar enlaces covalentes, involucrando enlaces de acilo o similares; grupos de alquilación que reaccionan con grupos sulfhidrilo (mercapto) , tiometilo, imidazo o amino de un péptido, tales como grupos halo-carboxilo, grupos maleimida, grupos vinilo activados, grupos etileno imina, grupos de aril haluro, grupos 2-hidroxi-5-nitro-bencil bromuro; y grupos alifático aldehido y cetona junto con agentes de reducción, que reaccionan con grupos amino de un péptido; los formadores de- éster y amida que reaccionan con grupos carboxilo de un péptido, tales- como grupos diazocarboxilato, y grupos carbodiimida y amina juntos; grupos formadores de disulfuro que reaccionan con grupos sulfhidrilo de un péptido, tales como grupos 5,5'-ditiobis (2 -nitrobenzoato) , disulfuro orto-piridilo y grupos alquilmercaptano que reaccionan con grupos sulfhidrilo en la presencia de agentes de oxidación tales como yodo; grupos dicarbonilo, tales como grupos ciclohexandiona, y otros grupos 1,2-dicetona que reaccionan con fracciones de guanidina de un péptido,- grupos diazo, que reaccionan con grupos fenolico de un péptido; grupos reactivos de la reacción de bromuro de cianógeno con un polisacárido, que reaccionan con grupos amino de un péptido.

Si un aminoácido adecuado para llevar la reacción de acoplamiento falta en una fracción de unión/polimérica que comprende un péptido, el aminoácido respectivo puede introducirse en el péptido, preferiblemente en el extremo terminal amino con carboxi del mismo.

Si la fracción de unión y/o la fracción polimérica comprende un sacárido, la reacción de acoplamiento puede específicamente dirigirse al grupo aldehído/hemiacetal o al grupo ceto/hemicetal , respectivamente, en el extremo de reducción del sacárido. Se describen las estrategias de acoplamiento adecuadas, por ejemplo, en WO 2004/024776 Al.

Por ejemplo, _. el grupo aldehído/hemiacetal en el extremo de reducción puede someterse a una aminación reductiva con. un grupo., amino primario presente en o introducido en la otra fracción. La reacción preferiblemente se lleva a cabo en la presencia de un agente de reducción tales como hidruros de boro (por ejemplo, cianoborohidruro de sodio, triacetoxiborohidruro de sodio, borohidruro de sodio) , o complejos de boro orgánicos. Alternativamente, el grupo aldehído/hemiacetal puede someterse a una oxidación selectiva utilizando un agente de oxidación tal como yodo, bromo o un ion metálico adecuado, u oxidación electroquímica, dando como resultado un grupo carboxi o un grupo carboxi activado tal como un éster, lactona o amida. El grupo carboxi (activado) después puede hacerse reaccionar con un grupo amino, por ejemplo en la presencia de un agente de activación tal como N-hidroxisuccinimida, N-hidroxiftalamida, tiofenol, p-nitrofenol ,— o, p-dinitrofenol , triclorofenol , trifluorofenol , pentaclorofenol , pentafluorofenol , 1-hidroxi-lH-benzotriazol (HOBt) , 3-hidroxi-l , 2 , 3 -benzotriazin-4 (3H) -ona (HOOBt) , ácido 4-hidroxi-3-nitrobencen sulfónico (HNSA) , 2 -hidroxipiridina, 3 -hidroxipiridina, 3 , 4-dihidro-4-oxobenzotriazin-3-ol , 4-hidroxi-2 ,5-difenil-3 (2H) -tiofenon-1, 1-dioxido, 3-fenil-l- (p-nitrofenil) -2-pirazolin-5-on) , [hexafluorofosfato de 1-benzotriazolil-N-oxi-tris (dimetilamino) fosfonio] (BOP) , hexafluorofosfato de [1-benzotriazoliloxitris (pirrolidino) fosfonio (PiBOP) , hexafluorofosfato de [0- (benzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' -tetrametilur.onio (HBTU) ., hexafluorofosfato de 2-(lH-7-azabenzotriazol-l-il)--N,N,N' ,?' -tetrametiluronio (HATU) , tetrafluoroborato de [0- (benzotriázol-l-il) -?,?,?' ,?' -tetrametiluronio (TBTU) , hexafluorofosfato de [O- (benzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' -bis (pentametilen) uronio, hexafluorofosfato de [0- (benzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' -bis (tetrametilen) uronio, carbonildiimidazol (CDI), o carbodiimidas , por ejemplo, 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC) , diciclohexilcarbodiimida (DCC) , o diisopropilcarbodiimida (DIPC) . - Si la fracción de unión y/o la fracción polimérica comprende un ácido nucleico, el acoplamiento puede hacerse a través de un grupo 2'hidroxi, un grupo 3'-hidroxi, o un grupo 5'-hidroxi. Si la fracción de unión comprende un ácido graso, el grupo carboxi del-- mismo puede utilizarse. Si la fracción polimérica __comprende un. polímero orgánico tal como un poliéster, poliéter o poliolefina, el grupo reactivo en el extremo, del polímero, si está presente, un grupo reactivo de una unidad monomérica del polímero o un grupo reactivo introducido puede utilizarse para el acoplamiento.

De esta forma, el conjugado de acuerdo con la invención puede hacerse a través de, opcionalmente , primero modificando - la fracción polimérica y/o la fracción de unión químicamente para producir una fracción polimérica y/o una fracción de unión que tiene por lo menos un grupo químico en el mismo que es capaz de reaccionar con un grupo químico disponible o introducido en la otra fracción, y después reaccionar junto la fracción polimérica y la fracción de unión para formar uno de sus conjugados covalentemente unido. Alternativamente, la fracción polimérica opcionalmente modificada o la fracción de unión opcionalmente modificada pueden primero acoplarse a un enlazador (adicional) y después en el enlazador puede acoplarse a la otra fracción opcionalmente modificada.

En una modalidad específica de la reacción de acoplamiento, un primer enlazador se acopla a la fracción polimérica, en donde el primer enlazador lleva un grupo reactivo que no reacciona con la fracción polimérica y que no está presente en la fracción polimérica. Un segundo enlazador se acopla a la fracción de unión, en donde el segundo enlazador lleva un grupo reactivo que no reacciona con la fracción de unión y que no está presente en la fracción de unión. Después un tercer ehlazador se acopla ya sea sucesiva o simultáneamente al primero y al segundo enlazador. Los grupos reactivos utilizados para el acoplamiento del tercer enlazador al primero y segundo enlazador pueden ser cualquier grupo reactivo adecuado para este propósito. Además, durante el acoplamiento del primero y segundo enlazadores a la fracción polimérica y la fracción de unión, respectivamente, los grupos reactivos del enlazador pueden protegerse a través de un grupo protector.

Los grupos reactivos ilustrativos, que pueden utilizarse para el acoplamiento de la fracción polimérica, la fracción de unión y opcionalmente uno o más enlazadores entre sí, son enlaces dobles C-C o enlaces triples C-C o enlaces C- C aromáticos, grupos haluro de acilo, halo, hidroxi, aldehido, amido, amino, aminooxi , hidroxiamino, carbonilo, carboxi, éster activado, ciano, tiociano, imino, nitro, nitroso, nitrilo, peroxi, fosfo, sulfonilo, sulfinilo, tiol, " hidrazina, e hidrazida. Los pares de grupos reactivos útiles para el acoplamiento de los enlazadores entre sí, por ejemplo, un grupo amino y un grupo éster succinimida, un grupo tiol y un grupo maleimida.

Los ejemplos de grupos protectores que pueden utilizarse en las reacciones de acoplamiento son: para la protección de alcoholes: acetilo (Ac) , éter ß-metoxietoximetilo (MEM) , éter metoximetilo (MOM) , éter p-metoxibencilo (PMB) , éter metiltiometilo, pivaloilo (Piv) , tetrahidropirano (TP) , silil éter tal como trimetilsililo (TMS) , ter-butildimetilsililo (TBD S) , y triisopropilsililo (TIPS) éteres, éteres metílicos, y éteres etoxietílieos (EE) ; - ·- - para la protección de aminas: carbobenciloxi (Cbz) , p-metoxibencilo carbonilo (Moz o MeOZ) , ter-butiloxicarbonilo (BOC) , 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) , bencilo (Bn) , p-metoxibencilo (PMB) , 3 , 4 -dimetoxibencilo (DMPM) , p-metoxifenilo (PMP) , tosilo (Ts) , y sulfonamidas (Nosil & Nps) ; - para la protección de grupos carbonilo: acétales cetales, acilales y ditianos; y para la protección de ácidos .carboxílicos : ásteres metílicos, ésteres bencílicos, ésteres ter-butílicos y ésteres silílicos.

El número de moléculas de unión y el número de polímeros en el conjugado pueden libremente seleccionarse según . se adapten. De esta forma, el conjugado puede comprender Una o más moléculas de unión tales solamente una, dos o más, tres o más y cuatro o más. Igualmente, el conjugado puede comprender uno o más polímeros tales como solamente uno, dos o más, tres o más y cuatro o más. En una modalidad, el conjugado comprende una molécula de unión y un polímero .

Si se utilizan enlazadores para el acoplamiento las moléculas de unión al polímero, un enlazador puede acoplar dos moléculas entre sí, por ejemplo, una fracción de unión a una fracción polimérica, o un enlazador puede acoplar más de dos moléculas entre sí, por ejemplo, una fracción de unión a dos o más polímeros, dos o más moléculas de unión a un polímero, o dos o más moléculas de unión a dos o más polímeros.

El enlazador puede tener cualquier longitud adecuada, pero preferiblemente es tan corto como sea posible. Sin embargo, el enlazador preferiblemente es lo suficientemente largo de tal forma que la fracción polimérica no interfiere con la interacción de la fracción de unión y la proteína objetivo. Los enlazadores adecuados para el acoplamiento de moléculas son bien conocidos en la técnica anterior y también están comercialmente disponibles.

Una molécula adecuada para formar un enlazador en el conjugado comprende dos o más grupos funcionales (como se describe anteriormente) para el acoplamiento del enlazador a la molécula objetivo, el polímero y/o otra molécula enlazadora. Estos grupos funcionales preferiblemente están conectados a través de un grupo de puenteo farmacéuticamente aceptable tales como los derivados de carbohidratos alifáticos o aromáticos. El enlazador puede ser homo- o hetero-bifuncional .

El conjugado completo puede tener cualquier tamaño adecuado para la aplicación deseada. Sin embargo, el conjugado preferiblemente tiene un peso molecular de 5 a 1000 kDa, preferiblemente de 20 a 300 kDa. ^ El complejo de la invención puede formarse de uno o más, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o más, proteínas objetivo y uno o más, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o más conjugados. En una modalidad, el complejo comprende solamente una proteína objetivo y solamente un conjugado.

La vida media de la proteína objetivo cuando se administra a la circulación de humano o animal en el complejo de la invención preferiblemente se aumenta comparado con su vida media cuando se administra en su forma libre (por ejemplo, solamente unido a pequeños iones pero .al conjugado de la invención) a través de un factor de por lo menos 1.1, más preferiblemente un factor de al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.5, al menos 1.8, al menos 2, al menos 3, al menos 5, y más preferiblemente un factor de al menos 10.

El complejo de la invención puede utilizarse en medicina. Preferiblemente, la proteína objetivo del complejo tiene una actividad farmacéutica útil en el tratamiento o prevención de ciertas enfermedades. Más preferiblemente, la proteína objetivo ejerce su actividad farmacéutica en la circulación de un paciente humano o animal. Preferiblemente, la enfermedad a ser tratada o evitada es causada por defectos en las cantidades disminuidas o la ausencia de una proteína natural en el cuerpo de humano o animal. En particular, la enfermedad puede ser causada por un defecto heredado o adquirido en el gen de una proteína particular. Los ejemplos particulares de tales enfermedades son hemofilia A y hemofilia B. Por ejemplo, la proteína objetivo puede ser el factor VIII y el complejo puede utilizarse en el tratamiento de hemofilia A, o la proteína objetivo puede ser el factor IX y el complejo puede utilizarse en el tratamiento de hemofilia B.

De esta forma, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el complejo de la invención. La composición farmacéutica puede además comprender cualquier portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración del complejo a un paciente humano o animal. Preferiblemente se administran parenteralmente , particularmente a través de inyección, por ejemplo, inyección intravenosa o intraarterial .

Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende el complejo de la invención en una concentración de 1 pM a 1 mM o en una cantidad de 1 pg a 500 mg, preferiblemente de 100 ng a 500 mg por dosis individual.

El complejo de la invención puede prepararse poniendo en contacto la proteína objetivo con el conjugado.

La proteína objetivo puede ponerse en contacto con el conjugado en un solvente . adecuado, preferiblemente un solvente acuoso, por ejemplo agua con una concentración de sal fisiológica a un pH fisiológico de un intervalo de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.5. Sin embargo, la proteína objetivo también puede ponerse en contacto con el conjugado en otros solventes y bajo otras condiciones mientras el solvente y la condición no inhiban la formación del complejo.

En un aspecto más, la invención está dirigida al conjugado utilizado para formar el complejo. Las modalidades especiales del conjugado se describen anteriormente en las secciones que tratan con el complejo de la invención y son requeridas en la descripción anterior. Además, la invención pertenece al uso de un conjugado respectivo para prepara el complejo de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, el complejo se prepara ex vivo.

Además, la invención está dirigida a un método para aumentar la vida media de una proteína en la circulación de un humano o animal, que comprende el paso de poner en contacto la proteína objetivo con el conjugado de la invención que comprende una fracción polimérica y una fracción de unión que tiene una capacidad de unión a la proteína objetivo. Después de poner en contacto la proteína objetivo con el conjugado, se forma un complejo. El complejo puede formarse directamente después del contacto o puede formarse solamente después transferir la proteína objetivo y el conjugado -en un entorno apropiado tal como, por ejemplo, la circulación de un humano o animal. Preferiblemente, la proteína objetivo se pone en contacto con el conjugado antes de la administración al cuerpo del humano o animal. En ciertas modalidades, el método se lleva a cabo fuera del cuerpo del humano o animal .

La proteína objetivo pude ponerse en contacto con el conjugado en una relación molar de 10:1 a 1:10000, preferiblemente de 1.2:1 a 1:100, y más preferiblemente de 1:1 a 1:10.

A continuación, una modalidad preferida en donde la protéína objetivo comprende un sitio de unión de- heparina se describe con mayor detalle.

Un número de proteínas involucradas en la hemostasis se unen a heparina o heparinoides . Entre otras, la antitrombina, trombina, el factor von illebrand, el activador de plasminógeno tisular, el factor VIII y el factor IX se . unen a heparina a polisacáridos ácidos de tipo heparina. La unión de los heparinoides está mediada por el denominado dominio de unión de heparina expresado en. la superficie de . la proteína. La afinidad relativamente alta de las interacciones de heparinoide con proteína permite la modificación monovalente de las proteínas de unión de heparina a través de heparinoides o sus derivados químicamente modificados.

Como se puede ver en la estructura cristalográfica del factor de coagulación de sangre VIII (ver Figura 1) , el proteoglicanos de sulfato de heparano en la posición S558-Q565 está libre del acoplamiento de almidón de hidroxialquilo .

Adicionalmente , la proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) unido a FVIII en la posición R484-F509 y/o E 1811-K1818 podría activarse para el acoplamiento (ver Figura 1) .

En general, una modificación del mecanismo biológico es prevista de tal forma que el catabolismo y/o la actividad, da como resultado un aumento o inhibición de las interacciones de molécula-molécula específicas. Como una consecuencia resultante, la vida media de la proteína objetivo se aumenta.

Los ligandos de unión pueden ser polisacáridos relativamente cargados ácidos, tales como, por ejemplo, heparina u otras sustancias de unión tales como péptidos miméticos, ácido nucleico y/o moléculas orgánicas.

Como moléculas de unión, estos ligandos altamente afines que podrían utilizarse como tales o con modificaciones especiales. Con el fin de formar el conjugado, tiene que acoplarse a polímeros tales como almidón de hidroxialquilo (HAS/HES) , polietileno glicol (PEG) , oligosacáridos , y similares.

Los polisacáridos ácidos pueden ser heparina, sulfato de heparano, proteoglicanos , glucosaminoglicanos y otros polímeros ácidos preferiblemente carbohidratos aniónicos, como por ejemplo fucoidano, fucanos sulfatos o galactanos .

Los oligosacáridos ácidos de tipo heparina, denominados "heparinoides" son altamente ácidos, por ejemplo polisacáridos altamente sulfatados. Los heparinoides se encuentran ubicuamente en la mayor parte de las especies, al menos sulfato de heparano se encuentra en virtualmente todos los animales.

Heparina típicamente consiste de disacáridos de repetición construidos de D-glucosamina y cualquier ácido D-glucorónico o ácido L-hidrurónico . La D-glucosamina puede existir como aminohexosa N-acetilada o N-sulfatada y además puede sulfatarse en C6 o C3. La cadena de polisacárido puede ser de longitudes diferentes con pesos moleculares típicamente en el intervalo de 3 kDa y 40 kDa, con un extremo de reducción y un extremo no de reducción. El extremo de reducción puede utilizarse para un número de reacciones químicas, es decir, para el acoplamiento a proteínas, carbohidratos y otros asociados de reacción. La estructura de heparina, sulfato de heparina se describe completamente en Heparin-Binding Proteins' by H. Edward Conrad, Academic Press, 1998.

La heparina se utiliza comercialmente para anticoagulación in vivo y para recubrimiento de superficie de dispositivos médicos.

Una propiedad impresionante de la heparina y los heparinoides es, su fuerte interacción con un número de las denominadas proteínas de unión a heparina. Más de 100 proteínas se han encontrado que se unen a heparinoides. Entre estas, no solamente el factor VIII o IX de coagulación, sino un número de otras proteínas no solamente relacionadas con la coagulación y fibrinólisis , específica y fuertemente se unen a heparinoides. El ejemplo más prominente y típico de una proteína de unión a heparina es antitrombina .

Otras proteínas de unión de heparina son por ejemplo: antitrombina, trombina, factor von Willebrand, activador de plasminógeno tisular, factor VIII, factor IX, vitronectina, inhibidor de proteína C, inhibidor de la trayectoria del factor tisular, factor 4 de plaqueta, glicoproteína rica en histidina, trombospondina, urocinasa, fibronectina , factores de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento de hepatocito, lipasas, apolipoproteína B, apolipoproteína E.

Entre estos, un número de proteínas relacionadas con la coagulación y fribinólisis específica y fuertemente se unen a heparinoides. El ejemplo más prominente y típico de proteínas de unión a heparina es la antitrombina.

Las proteínas de unión a heparina exhiben por lo menos un dominio denominado de unión a heparina. La naturaleza y las características estructurales comunes de los dominios de unión a heparina han sido descritos previamente por H. E. Conrad, Heparin-Binding Proteins', Academic Press, 1998.

Una propiedad notable de la unión de proteína a heparina es una relativamente alta afinidad. La resistencia de la unión de la proteína heparinoide usualmente se expresa por su constante de disociación Kd, como se describe anteriormente .

La síntesis de los polisacáridos ácidos artificiales para la unión no covalente al sitio de unión de heparina de las proteínas puede dar como resultado afinidades de unión aún más altas entre los ligandos, es decir, el polisacárido ácido artificial y la proteína de unión.

De esta forma, los polisacáridos ácidos de tipo heparinoides y específicamente sintetizados, polisacáridos ácidos artificiales son ligandos ideales para una alta afinidad, una unión no covalente a las proteínas de unión de heparina, por ejemplo, proteínas de unión a heparina involucradas en la hemostasis como el factor VIII de coagulación humano o recombinante , factor IX de coagulación humano o recombinante, factor von Willebrand o recombinante y otras proteínas de unión.

La heparina y el sulfato de heparano son moléculas abundantes, que interactúan con una gran variedad de diferentes asociados de unión y por consiguiente despliegan alguna clase de comportamiento de unión promiscuo. El reemplazo de heparina por otros heparinoides podría activar y optimizar la afinidad de unión y la especificidad para la proteína objetivo. Además, el riesgo de contener agentes infecciosos tales como virus o priones podría reducirse cambiando por ejemplo un polisacárido aniónico artificialmente sintetizado o el origen de la planta o utilizando péptidos miméticos de heparina.

Una alternativa posible para heparina son fucoidanos o fucanos sulfatados.

Los fucoidanos son polisacáridos de planta sulfatos (peso molecular promedio 20,000 Da) abundantes en las aguas de la costa en todo el mundo. Principalmente se encuentran en el alga café (Phyaeophyceae) y los. invertebrados marinos. Los fucoidanos de alga café comprenden el complejo, de I estructuras de polisacárido altamente ramificadas y sulfatadas, mientras los fucanos sulfatados de invertebrados marinos son homopolímeros lineales de fucosa, comprendiendo solamente un solo tipo de enlace y mostrando una estructura de oligosacáridos de repetición regular, pero un asociado de sulfatación variable (Pomin & Mourao, 2008; revisada en Berteau & Mulloy, Glycobiology 13, 2003). El fucoidano y los fucanos sulfatados se sugieren . como alternativas de heparina, porque comparten muchas actividades biológicas (Berteau & Mulloy, 2003), debido a su habilidad para imitar patrones de sustitución de sulfato en glucosaminoglicanos y otros glucanos sulfatados. Al igual que heparina, pueden actuar como moduladores de coagulación (Chargaff et al., 1936) y pueden afectar muchas actividades biológicas tales como inflamación, proliferación y adhesión celular, infección viral y fertilización (Boisson-Vidal et al., 1995). Debido a su origen vegetal, los fucoidanos es menos probable que contengan agentes infecciosos tales como virus o priones. Esto los convierte en una alternativa deseable para heparina como es decir conjugados de polímero-fucoidanos , para la unión no covalente de las proteínas de unión a heparina para un propósito de prolongar la vida media.

Independientemente de . la heparina y los heparinoides existen muchas posibles especies como asociados de unión altamente específicos y afines no covalentes para las proteínas objetivo. Estas especies de unión incluyen: específicamente péptidos de unión (secuencias derivadas por ejemplo de dominios de reconocimiento de anticuerpo) o péptidos miméticos, anticuerpos no neutralizantes, moléculas pequeñas o fragmentos de ADN/AR (por ejemplo, aptámeros) .

Los aptámeros son especies de ácido nucleico que han sido modificadas a través de rondas repetidas de selección in vitro o equivalentemente, SELEX (evolución sistémica de ligandos a través de enriquecimiento exponencial) (Tuerk. & Gold (1990) Science) para unir a varios objetivos moleculares tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, y aún células, tejidos y organismos (Ellington & Szostak (1990) Nature) . Los aptámeros son útiles en aplicaciones terapéuticas ya que ofrecen propiedades de reconocimiento molecular que rivalizan las de las biomoléculas comúnmente utilizadas, anticuerpos, principalmente de alta especificidad y afinidades en el intervalo de nanomolar bajo a picomolar. Además de su reconocimiento discriminador, los aptámeros ofrecen ventajas sobre los anticuerpos ya que pueden modificarse completamente en un tubo de ensayo, se producen fácilmente a través de síntesis química, poseen propiedades de almacenamiento deseables, y. provocan poca o nada de inmunogenicidad en aplicaciones terapéuticas.

Los aptámeros se sugieren en la presente como asociados de unión no covalentes para una proteína objetivo dentro de un conjugado de aptámero-polímero (ver Figura 3) porque exhiben una unión muy específica y altamente afín al mismo. Debido a su origen in vitro, los aptámeros están complemente libres de agentes infecciosos tales virus 6 priones, convirtiéndolos en un componente deseable para el método y prolongación de. vida media.

Un método ligeramente diferente podría enfocarse en las modificaciones post-transferencia (PTMs, tales como glicosilaciones) como posibles objetivos para interacciones específicas con asociados de unión no covalentes para la prolongación de la vida media.

Como un ejemplo, el complejo FVIIl/vWF glicosilado se da en la presente. La desilalilación de FVIII/v F por ejemplo es responsable de la depuración rápida en plasma a través del receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R; Sodetz et al., JBC 1977 & 1978). Con base en el conocimiento de estas interacciones ASGP-R bien caracterizadas (Meier 2005) un péptido mimético ASGP-R podría generarse y sintetizarse y unirse a través de un corto enlazador a un polímero, por ejemplo, una fracción HES/HAS (ver Figura 4) . Este conjugado después podría utilizarse para bloquear el- sitio de unión ASGP-R e inhibir la depuración mediada por el receptor a través de efectos protectores o impedimento estérico, de esta forma prolongando la vida media en plasma.

Otro agente para utilizar un péptido . mimético con base en una interacción no covalente específica entre una proteína objetivo y una enzima, es la interacción entre elastasa y G-CSF: La elastasa, también conocida como neutrófilo elastasa (NE) o neutrófilo elastasa humana (HNE) específicamente se une a G-CSF (Hunter et al., 2003). Con base en la secuencia de aminoácido de la región de unión de elastasa un péptido mimético podría generarse, sintetizare y unirse a un polímero, por ejemplo a través de un corto enlazador a una fracción HES/HAS para prolongar la vida media de G-CSF.

Con base en la estructura de rayos X existente de G-CSF (Hill" et al., PNAS (90) 1993) y varios- anticuerpos anti-G-CSF no neutralizantes conocidos (Layton et al., JBC (266) 1991), los péptidos miméticos podrían generarse imitando el evento positivo con el fin de llevar a cabo el • acoplamiento no covalente de un polímero para la proteína objetivo, G-CSF en este ejemplo con el fin de prolongar la vida media del fármaco farmacéutico G-CSF.

En modalidades específicas, la invención está dirigida a un complejo que comprende por lo menos una proteína con un sitio de unión de heparina y por lo menos una heparina o una molécula de tipo heparina, en donde la heparina o la molécula de tipo heparina están covalentemente unida al almidón de . hidroxialquilo .

La proteína puede seleccionarse del factor VIII, antitrombina , trombina, factor von illebrand, activador de plasminógeno tisular, y el factor IX.

El almidón de hidroxialquilo puede ser almidón de hidroxietilo . El peso molecular del almidón de hidroxialquilo está por ejemplo en el intervalo de 100 a 300 kD. Aparte del acoplamiento por lo menos una molécula de heparina o de tipo heparina, también por lo menos dos moléculas de heparina o moléculas de tipo heparina pueden covalentemente unirse a una molécula de almidón de hidroxialquilo.

Además, la invención proporciona un método para preparar un complejo como se describe anteriormente, que comprende los pasos de: acoplar por lo menos una molécula de heparina o molécula de tipo heparina a por lo menos un almidón de hidroxialquilo para obtener un conjugado de heparina-almidón de hidroxialquilo; incubar el conjugado con una proteína que tiene un sitio' de unión de heparina.

En el método, el almidón de hidroxialquilo puede ser almidón de hidroxietilo. La al menos una molécula de heparina o molécula de tipo heparina puede unirse a por lo menos una molécula HAS a través de un enlazador funcional, que por ejemplo puede ser homobifuncional o heterobifuncional .

Por lo menos una de la molécula de heparina o de tipo heparina y almidón de hidroxialquilo puede modificarse por los pasos siguientes: - ~ oxidación para introducir los grupos aldehido aminación reducida.

En una modalidad, por lo menos dos moléculas de heparina o moléculas de tipo heparina se unen a una molécula de almidón de hidroxialquilo.

La invención además está dirigida a un conjugado de heparina-almidón de hidroxialquilo o molécula de tipo heparina-almidón de hidroxialquilo; una composición farmacéutica que comprende el complejo descrito anteriormente, en donde la proteína puede ser el factor VIII; y el uso del complejo descrito anteriormente para la preparación de un medicamento para tratar trastornos de sangrado.

En una modalidad. el complejo no comprende por lo menos una proteína con un-sitio de unión de heparina y por lo menos una heparina o una molécula de tipo heparina, en donde la heparina o la molécula de tipo heparina están covalentemente unidas al almidón de hidroxialquilo.

. En una modalidad, un método para preparar el complejo no comprende los pasos: acoplar por lo menos una molécula de heparina a una molécula de tipo heparina a por lo menos un almidón de hidroxialquilo para obtener un conjugado de heparina-almidón de hidroxialquilo y incubar el conjugado con una proteína que tienen un sitio de unión de heparina.

En una modalidad el conjugado no es un conjugado de heparina-almidón de hidroxialquilo o un conjugado de heparina-molécula de tipo heparina-almidón de hidroxialquilo.

Ejemplos Ejemplo 1: Química sintética: Conjugados HES-heparinoides Un método para la prolongación de la vida media in vivo del factor VIII recombinante se basa en almidón de hidroxietilo como portador macromolecular que se une no covalentemente a través de un sitio de unión no específico al factor VIII. Para esta unión no covalente heparina, sus derivados o sus miméticos pueden utilizarse como moléculas de unión del factor VIII. HES es una unión a estos heparinoides para formar un gran complejo que cubre y protege parte de la superficie de la proteína. - La prueba de este principio se evaluó mediante estudios de unión del factor VIII a través de resonancia de plasmón de superficie seguido por un estudio in vivo extenso utilizando un conjugado de 1:1 covalente entre el heparinoides y almidón de hidroxietilo. La Figura 2 muestra la estructura tridimensional del factor VIII en complejo con un conjugado de 1:1 de heparinoide-HES.

Para obtener este conjugado de 1:1, ambos heparina y HES se modificaron químicamente solamente en una posición con grupos funcionales complementarios, que permitieron una conjugación selectiva. Ambas moléculas tienen exactamente un único . grupo funcional, el grupo de aldehido/semiacetal en el extremo de reducción de la cadena de polisacárido, que es químicamente diferente de todas las otras funcionalidades en estas moléculas. De esta forma, la estrategia sintética desarrollada se basó en derivatizaciones de los extremos de reducción.

El almidón de hidroxietilo puede separarse en dos" fracciones de diferente tamaño y como molécula de unión al factor VIII una heparina de bao peso molecular (LMWH, por sus siglas en inglés) , por ejemplo puede utilizarse Enoxaparina. La conjugación de 1:1 del almidones de hidroxietilo de 1:1 activada con Cl es con LMWH modificada con Cl se basa en la adición de un tiol libre con una funcionalidad de maleimida.

Hidrólisis y fraccionamiento de HES450/0.7 Esquema de Reacción 1: Almidón de hidroxietilo.

Se disolvieron 30 g de HES450/0.7 (almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio en peso de 450 kDa y un grado molar de sustitución de hidroxietilo por unidad de glucosa de 0.7) en 300 mi de agua y 1M de ácido clorhídrico se agregó lentamente hasta que el pH alcanzó 2.0. La solución después se calentó hasta 80°C y se agitó vigorosamente por 16 h. Después la solución se enfrió por debajo de 50°C y se llevó a un pH de 5-6 por la lenta adición de 1M de solución de hidróxido de sodio. El HES450/0.7 parcialmente hidrolizado se fraccionó por pasos de ultra-filtración de flujo tangencial secuencial utilizando bombas peristálticas y membranas de ultra-filtración PES con diferentes umbrales de peso (por ejemplo MWCO= 100, 30, 10, 5 kDa) .

Fracción HES utilizada: HES25/0.7 - (Pm= 25 kDa) y HES 54/0.7 (54 kDa) Síntesis de ClAminoHES Esquema de Reacción 2 : Aminación Reductiva del extremo de reducción en almidón de hidroxietilo .

Se disolvieron 200 mg de HES25/0.7 en 12 mi 50 mM de regulador de pH de borato pH 8.2 y 0.168 mi de 1,3-diaminopropano y ser agitó por 1 h a 50°C. Después se agregaron 0.126 g de cianoborohidruro de sodio y se agitó a 50°C por 3 días. El producto se purificó por ultra- filtración a través de una membrana de ultra-filtración de 1 kDa y enseguida el producto se liofilizó. El sólido blanco obtenido se almacenó a temperatura ambiente.

Síntesis de ClAminoHES a través de OxHES OxHES se obtuvo a través de oxidación con yodo en hidróxido de sodio (con base en la tesis del PhD Michele Orlando, Giessen, Alemania 2003) .

Se disolvió 1 g de HES25/0.7 en agua y 9.0 mi de 0.1 N se solución de yodo seguido por la adición de 1.4 mi de solución de 1N de NaOH. La solución se agitó durante la noche. El producto de reacción se purificó a través de un medio ultrafiltrado en una- membrana de 1 kDa de PES . La solución final se pasó a través de una resina de intercambio de ión de catión (Amberlite IR-120 H+) y se liofilizó. El producto obtenido se secó para remover el agua residual.

Se disolvió 0.1 g del OxHES obtenido en 1.5 mi de DMSO. Se agregaron 115 mg de HOBt y 36.7 mg de DMAP. Después se agregaron 190 mg de HATU y a continuación 1,3-diaminopropano y la solución se agitó 1 h a 37 °C. Se agregaron otros 190 mg de HATU y la solución se agitó durante la noche 37°C.

El producto se precipitó por la adición de 25 mi de acetona/etanol 1:1 y el precipitado se lavó con acetona/etanol 1:1. El granulado se disolvió de nuevo en 2 mi DMSO y el producto se volvió a precipitar mediante la adición de 25 mi de acetona/etanol 1:1, seguido por otro paso de lavado .

El producto restante se disolvió en 100 mi agua y además se purificó por medio de ultra-filtración en una membrana de 1 kDa. Después el producto se liofilizó.

Síntesis de CIMalemidaHES Esquema de Reacción 3: Activación de maleimida de los grupos amino en el extremo de reducción anterior en almidón de hidroxiet i lo .

Se disolvieron 500 mg de ClAminoHES en 15 mi 1 -met i 1 - 2 - i rrol idinona (NMP) . Se agregó una solución de 140 mg éster - [g -male imidobut i ri loxi ] succ inimida en 10 mi de NMP y se agregaron 85.6 µ? de N,N-diisopropilet ilamina . La solución se agitó o sacudió por 90 min. El producto se precipitó vertiendo la solución en 100 mi de acetona/etanol 1:1 y enfriando a -20°C. El precipitado se centrifugó, el sobrenadante se decantó y el granulado se lavó dos veces más con acetona/ etanol 1:1 y centrifugó. El producto se purificó a través de . ultra- filtración a través de una membrana de ul t ra - f i 11 rae ión de 1 kDa y liofilizó. El producto sólido obtenido se almacenó a 20°C.

Modificación química de una Heparina de Bajo Peso Molecular (LMWH) Esquema de Reacción 4 : Aminación Reductiva del extremo de reducción (Cl) con cistamina y el agente de reducción de cianoborohidruro de sodio.

Esquema de Reacción 5: Reducción de Cl-cistamina con el agente de reducción DT .

Se- disolvieron 250 mg de LM H liofilizado en 12 mi de 0.3 M de regulador de pH de fosfato, pH 5.0 conteniendo 1M de cloruro de sodio. Se agregaron 1.34 g de diclorhidrato de cistamina y la solución se agitó o sacudió por 1 h a 40°C. Después se agregaron 0.374 g de cianoborohidruro de sodio y la mezcla se agitó o sacudió por 3 días a 40°C.

El producto se purificó a través de cromatografía de exclusión de tamaño utilizando 50 mM regulador de pH de fosfato pH 6.5 con 100 mM de NaCl como fase móvil en una columna HiLoad 26/60 Superdex 30 de grado prep y un flujo de 4.4 ml/min. Las fracciones del producto unificadas se utilizaron directamente en el siguiente paso.

A las fracciones obtenidas se agregaron 91.8 mg de DL- 1 , 4 -dit iotreitol (DTT, 0.6 minóles, 10 eq.) y la solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El producto se purificó a través de a cromatografía de exclusión de tamaño utilizando agua como fase móvil en una columna HiLoad 26/60 Superdex 30 de grado prep y un flujo de 4.4 ml/min. Las fracciones del producto se unificaron y 1 iof i 1 i zaron . El sólido blanco obtenido se almacenó a 20°C.

Conjugación de Cl maleimida HES y tiolMWH Esquema de Reacción 6: Conjugación de HES activado con maleitnida y LM H activado con tiol a través de la adición Michael.

Se disolvieron 32.2 mg de CILMWH-cisteamina y 420 mg de ClMaleimidaHES en un total de 14.5 mi 100 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.5, mezclaron y agitaron durante la noche a 37°C.

El conjugado LMWH-HES se purificó en una columna HiPrep 16/10 Q FF (GE Healthcare) con 50 mM de regulador de pH TrisHCl, pH 7.5 para la unión y 50 mM de regulador de pH^ TrisHCl, pH 7.5 con 1M de NaCl para elución utilizando un gradiente lineal con un flujo de 5 ml/min. La fracción que se eluye a conductividades mayores de 30 mS/cm además se purificó en una columna HiLoad 26/60 Superdex200 de grado prep (GE Healthcare) utilizando 50 mM de regulador de pH de fosfato pH 6.5 con 0.1 M de NaCl y un flujo de 4 ml/min. El producto se desaló en una columna HiLoad 26/60 Superdex200 de grado prep (GE Healthcare) con agua como fase móvil y un flujo de 4 ml/min. Los cromatogramas se muestran en la figura 9. El producto obtenido además se liofilizó y almacenó a -20°C.

Heparina -HES Los Ejemplos 1 y 2 se componen de complejos no covalentes del factor VIII de coagulación y conjugados HES-heparina (ver figura 2) . FVIII posee un sitio de unión a heparina en el dominio A2 y es capaz de unir heparina heparinoides (tales como heparinas de bajo peso molecular (por ejemplo Clexano) o fucoidanos) con alta afinidad. La heparina o heparinoides están covalentemente unidos a través de región enlazadora corta a una fracción HES . La unión no covalente de este conjugado de HES-heparina a FVIII media la prolongación de la vida media mediante efectos protectores.

Estudios de Unión de Resonancia de plasmón de superf ic ie Los estudios de Resonancia de plasmón de superficie (SPR) se llevaron a cabo utilizando un sistema Biacore T100 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania) . El sistema de detección se basa en resonancia de plasmón de superficie para monitorear interacciones' en tiempo real (Malmquist y Karlsson, 1997; Rich y Myszka, 2003; Piliarek 2009) .

Las reacciones de unión causan un cambio en la resonancia de plasmón de superficie, que se detectan ópticamente y se miden en unidades de resonancia. Mil RU corresponden a un cambio de 0.1° en el ángulo de la resonancia de plasmón de superficie y un cambio en la concentración de la superficie de aproximadamente 1 ng/mm2 para la proteína promedio (Johnsson et al., 1991) .

Antes del análisis, se cargó el factor VIII de coagulación de sangre recombinante , CL rFVIII humana, y factor IX de coagulación de sangre recombinante humana, rFIX, en una columna NAP5 para cambio de regulador de pH con 10 mM de NaAc , pH 5/pH 5.5 y después se inmovilizaron en una matriz de dextrina de un chip biosensor CM5 utilizando el kit de acoplamiento de amina como se prescribe por el proveedor. Se activo un canal de referencia y se bloqueó en la ausencia de la proteína.

La asociación de los analitos conjugados de HES-heparina y Fucoidano se evaluó en 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl y 0.005%. (v/v) de Tween 20 (pH 7.4) a 25°C con una velocidad de flujo de 10 µ? / min por 3 min. La disociación se dejó durante 15 min., en el mismo flujo de regulador de pH .

Después de la disociación el chip biosensor se regeneró por inyección de 800 mM de NaCl por 1 min. La unión de los conjugados de HES-heparina y Fucoidano al CL rFVIII humano y canales recubiertos con rFIX humano se corrigieron para la unión no específica al canal de control .

Para la determinación de las constantes de unión, se aplicaron concentraciones en aumento al factor VIII de coagulación de sangre recombinante humana inmovilizado. Los perfiles de unión se evaluaron utilizando el software Biaevaluat ion software para adaptar los datos de titulación cinéticos. Los datos cinéticos (constante de grado de asociación [ka] , constante de grado de disociación [kd] ) así como datos de afinidad (constante de equilibrio de disociación Kd) se calcularon mediante evaluación por computadora de los datos de unión.

Los estudios de unión de los conjugados de HES-heparina a rFVIII se realizaron utilizando el método SPR. El rFVIII CL humano se inmovilizó para el chip sensor y la asociación y disociación del conjugado de 30 kDa de HES-heparina se monitoreó a través de SPR a concentraciones conjugadas en aumento (14-227 µ?) . La Figura 5 muestra un grupo típico de curvas de unión, lo que demuestra la unión del conjugado HES-heparina a rFVIII CL humano para todas las concentraciones. El análisis basado en el software de las curvas de unión produjeron una constante de disociación K¿ de 6 (+ 0.6) 10"7 M, lo que demuestra claramente una fuerte unión del conjugado HES-heparina a rFVIII CL humano.

Estudio de estabilidad in vitro Se realizó un estudio de estabilidad in vitro para simular el estudio de £armacocinéticos en un sistema artificial y determinar el efecto de unión de los conjugados HES-heparina en la estabilidad de FVIII. Por consiguiente se mezclaron 4 IU de rFVIII CL humano en una relación molar nominal del: 2 con los dos diferentes conjugados HES (el conjugado de HES (30 kDa) - y el HES (60 kDa) , respectivamente) , resueltos en 40 µ? de regulador de pH y se agregaron a 1.7 mi de plasma deficiente de FVIII (Coachrom Cat . no . FDPO 8 - 10 , Lot no. D8-22) , que imita el volumen de sangre completa de un ratón hemof ílico que comprende un peso corporal de 20 g. Se incubaron tres métodos diferentes (rFVIII CL humano como referencia, rFVIII CL humano en complejo con el- conjugado HES (30 kDa) , rFVIII CL humano en complejo con el conjugado HES (60 kDa)) a 37°C y se tomaron muestran que se congelaron directamente a -80°C, cada una después de un intervalo def inido .

Después de descongelar, las muestras se analizaron para la actividad de FVIII mediante un ensayo cromogénico (Coachrom Diagnostica GmbH, orden # 221402 ; lote # 72502 - PK : 6 ) . Este ensayo cromogénico determina la actividad de FVIII :C en dos pasos consecutivos: adición de FIX activado (FlXa), fosfolípidos y calcio para las muestras FVIII activan FX a FXa y lo anterior posteriormente divide un sustrato FX adicionado produciendo un cromóforo que puede cuant i f i carse espectrofotomét ricamente . Bajo las condiciones de ensayo apropiadas la relación entre la formación de FXa (y de esta forma la generación del cromóforo) y la concentración de FVIII es lineal.

El plasma deficiente de FVIII y la incubación a 37°C emularon el modelo de ratón hemofílico como se describe anteriormente. Las muestras de plasma posteriormente se analizaron utilizando una prueba de ensayo cromogénico para la actividad de FVIII :C. Los datos resultantes se convirtieron en la vida media utilizando el software de computadora sigma plot . Una comparación directa dé la vida media relativa (en %) de rFVIII CL humano sin conjugados HES con rFVIII CL humano en complejo con conjugado HES (60 kDa) mostró una vida media de 1.4 veces prolongada en plasma in vitro. La formación de complejos con el conjugado- HES- (30 kDa) reveló una prolongación de la vida media del factor. 1.35, lo que indica claramente un efecto prolongador de la vida media de ambos conjugados HES no covalentemente unidos a FVIII in vitro (ver figura 6) .

Estudio de farmacocinét icos en ratones hemof í lieos Los estudios farmacocinét icos en ratones hemofílicos se realizaron como sigue: Se utilizaron ratones agénicos de 12 semanas de edad C57 BL/6 FVIII de sexos mixtos y un peso corporal de 20-25 g para este estudio.

Se ensayaron y prepararon las siguientes variantes de FVIII como se describe a continuación: Human-CL rFVIII como referencia, rFVIII CL humano en complejo con un conjugado de 60 kDa o 30 kDa de HES-heparina y regulador . de pH como control negativo. El rFVIII CL humano se formó en complejo con los los conjugados de HES-heparina en una relación molar nominal de 1:2 y se filtraron esterilizados, así como el rFVIII CL humano de referencia sin conjugados HES-heparina y el regulador de pH como control negativo.

Se inyectaron 40 µ? comprendiendo 4 IU de FVIII (consistente con alrededor de 200 IU/kg) como una sola administración en la vena de la cola en los ratones hemofílicos. Las muestras se tomaron antes y después de la inyección a intervalos de tiempo -definidos después de la administración (con grupos de 5 ratones por tiempo de muestreo y sustancia) . La actividad de FVIII :C se determinó utilizando un ensayo cromogénico comercialmente disponible de Coachrom Diagnostica GmbH, Viena, Austria y los farmacocinét icos de FVIII se calcularon de estos resultados y se analizaron estadísticamente (incluyendo la prueba t) utilizando el software de computación sigma. plot (Systat Software GmbH, Alemania) para obtener los tiempos de la vida media (Ti 2) .

Se ensayaron las siguientes variantes FVIII en comparación con su vida media en plasma en ratones hemof ílicos : Human CL-rFVIII como referencia (grupo 1) , rFVIII CL humano en complejo con un conjugado de 60 kDa de HES (grupo 2) , rFVIII CL humano en complejo con un conjugado de 30 kDa de HES (grupo 3) y regulador de pH como control negativo (grupo 4) . En general, se inyectaron 25 ratones hemofílicos por sustancia con 4 IU de rFVIII en un volumen de inyección total de 40 µ? por ratón. Las muestras se tomaron antes y después de la inyección y a intervalos de tiempo definidos después de la administración, con 5 ratones por tiempo de muestreo y. sustancia (excepción: grupo 3, fueron solamente 19 ratones en total utilizados debido a las limitaciones del material) .

Las muestras se ensayaron para actividad de FVIII :C y los datos se analizaron con respecto a los parámetros. farmacocinét icos como se describe anteriormente, los resultados se resumen siguiente tabla: Tabla 1: En comparación directa, rFVIII CL humano en complejo con ambos conjugados HES muestra una vida media en plasma prolongada: para la formación del complejo con conjugados HES más pequeños (30 kDa) la vida media en plasma se prolongó para el factor 1.6, la formación del complejo con el conjugado HES más grande (60 kDa) produjo una vida media en plasma incrementada de 1.7 veces (ver Figura 7) .

Estos datos claramente indican un efecto de prolongación de la vida media, protector de los conjugados de HES-heparina covalentemente unidos en FVIII en el modelo de ratón hemofílico, este efecto siendo ligeramente más pronunciado para el conjugado de HES-heparina más grande (60 kDa) que para conjugados HES-heparina más cortos (30 kDa) .

Como un control negativo, los ratones hemofílicos se inyectaron con regulador de pH y, como se esperaba, no se encontró ninguna actividad en FVIII mediante el ensayo cromogénico (datos no mostrados) Fucoidano Con el fin de ejemplificar una posible alternativa para heparina, el fucoidano se ensayó para sus propiedades de unión a heparina-proteínas de unión, tales como el factor VIII y XI de coagulación. Los experimentos de unión con base en SPR demostraron, que fucoidano podría reemplazar heparina dentro los conjugados HES-heparina que prolongan la vida media para la unión no covalente a la proteína objetivo.

Los estudios de unión con base en SPR que evalúan fucoidano como un posible sustituto de heparina se realizaron contra rFVIII CL humano y rFIX como proteínas de unión a heparina. La Figura 8 muestra' la asociación y disociación de fucoidano a rFVIII (línea recta) y rFIX (línea · punteada) respectivamente, claramente demuestra la unión de fucoidano a las proteínas sondeadas, y en consecuencia confirma su adecuación como un posible sustituto de heparina.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. - Un complejo caracterizado porque contiene por lo menos una proteína objetivo y por lo menos una molécula de unión que tiene una afinidad de unión para la proteína objetivo, dónde la molécula tiene afinidad de unión y está covalente o no covalentemente unida a por lo menos un polímero soluble en agua.

2. - El complejo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una molécula de unión y al menos un polímero soluble forman un conjugado, el conjugado no está covalentemente acoplado a la proteína objetivo.

3. - El complejo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína se selecciona de proteínas de coagulación de sangre (derivadas de plasma o recombinantes ) tales como el factor IX, el factor VIII (el dominio de tipo silvestre y el dominio B-eliminado) , el factor VII/VIIa, trombina, antitrombina , activador de plasminógeno tisular y el factor von Willebrand (vWF) , factores de crecimiento tales como eritropoyetina , factores estimuladores de colonia (CSFs) tales como el factor estimulador de granulocito (G-CSF) , CSF de macrófago (M-CSF) y CSF macrófago de granulocito (GM-CSF) , citocinas tales como interleucinas , inhibidores de. proteasa tales como alfa- 1 -antitripsina (A1AT) , integrinas, desintegrinas , proteínas de matriz extracelular tales como fibronectina y vitronectina , metaloproteasas tales como metaloproteasas de matriz y proteínas ADAM/ADAMTS , metaloproteasas, apolipoproteínas , proteínas de transporte, hormonas, proteínas que actúan como inhibidoras o reguladoras, y sus derivados y mutantes .

4. - El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque al menos una molécula de unión tiene un peso molecular por debajo de 50 kD, preferiblemente por debajo de 10 kD .

5. - El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la molécula de unión se selecciona del grupo que consiste de fracciones de péptido tales como péptidos RGD y dominios de unión RGD, fracciones de sacárido tales como heparinas y sulfato de heparano, y moléculas de tipo heparina, moléculas miméticas de heparina, fracciones de—ácido nucleico, fracciones de lípido tales como ácidos grasos, sus derivados y sus miméticos.

6. - El complejo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de tipo heparina es un péptido mimético de heparina.

7. - El complejo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido mimético de heparina comprende el motivo de aminoácido X1-Y (S03) X2-Y(S03), en donde Y(S03) es una t'irosina X1 sulfatada, aminoácidos negativamente cargados, serina, alanina o glicina y X2 es un aspartato, alanina o está ausente.

8. - El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el polímero soluble se selecciona de almidón de hidroxialquilo (HAS), " polietilenglicol (PEG) , polivinilpirrolidona (PVP) , y dextrano.

9. - El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el peso molecular del polímero soluble en agua está en el intervalo de 10 a 500 kD, 10 a 300 kD, 20 a 200 kD, 30 a 150 kD o 100 a 300 kD .

10. - El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque el complejo comprende solamente una molécula de unión y dos o más polímeros, dos o más moléculas de unión y solamente un polímero o dos o más moléculas de unión y dos o más polímeros .

11. - Un método para preparar un complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende los pasos de: acoplar por lo menos una molécula de unión que tiene una afinidad de unión para la proteína objetivo a por lo menos un polímero soluble en agua para formar un conjugado, - incubar el conjugado con la proteína objetivo para la cual la molécula tiene una afinidad de unión .

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque por lo menos una molécula de unión se une al polímero soluble en agua a través de un enlazador bifuncional.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque el complejo se forma ex vivo.

14.- Un conjugado de una molécula caracterizado porque tiene una afinidad de unión para una proteína y un polímero soluble en agua.

15.- Un método para aumentar la vida media de proteínas objetivo en la circulación de un humano o animal, caracterizado porque comprende el paso de poner en contacto la proteína objetivo con un conjugado de conformidad con la reivindicación 14.

16. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

17. - El uso del complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la preparación de un medicamento.

18. - El complejo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque al menos una proteína objetivo se selecciona del factor IX y el factor VIII (el dominio de tipo silvestre y el dominio B eliminado) , la al menos una molécula de unión es una molécula mimética de heparina y el al menos un polímero es almidón de hidroxietilo .