CN108118046B - 一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法及其应用 - Google Patents

一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法及其应用，解决了往往在提取其中一种酶的同时，其他酶都被作为杂质去除的问题，其技术方案要点是包括有如下步骤：胰脏切块搅碎加入到提取罐中提取，弃掉沉淀，胰脏提取液加入（NH4）2SO4盐析后激活，超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，对胰蛋白酶进行提取；将过柱液备用再次激活后，过平衡苯基‑琼脂糖快胶提取糜蛋白酶；达到了对胰蛋白酶和糜蛋白酶同时进行提取，减少资源浪费。

Description

一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药，特别涉及一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法及含有胰蛋白酶的药物组合物。
背景技术
胰蛋白酶和糜蛋白酶是目前临床常用药和现代生物学研究中的重要工具，而且价格昂贵。其存在于动物胰脏中。
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活。胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近(23300)，其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH＝3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
糜蛋白酶和胰蛋白酶的理化性质相近，区别在于糜蛋白酶专一性不强，其催化中心的袋穴比较宽，并且完全由疏水侧链排列而成。激活后的糜蛋白酶为α-糜蛋白酶，分子量24000左右，等电点为8.6。糜蛋白酶可以通过胰蛋白酶或者其糜蛋白酶本身进行激活。
目前从胰脏中提取其中一种单一酶的成熟工艺屡见不鲜，往往在提取其中一种酶的同时，其他酶都被作为杂质除出，造成资源的浪费。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法，对胰蛋白酶和糜蛋白酶同时进行提取，减少资源浪费。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法，包括有如下步骤：
步骤一：将动物胰脏预处理去除结缔组织和脂肪，切块搅碎，得到胰糜；
步骤二：将胰糜加入到提取罐中加乙酸酸化水至浸过胰糜，搅拌混合后，得到胰糜-水混合物；
步骤三：将胰糜-水混合物离心至分层，并对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合后得到胰脏提取液；
步骤四：对胰脏提取液进行超滤浓缩后，加入(NH4)2SO4盐析，得到胰酶混合物；
步骤五：将胰酶混合物经过压滤后取滤饼，向滤饼中加入0.1mol/L CaCl2溶液溶解至滤饼溶解后，加入胰脏质量万分之一的胰蛋白酶晶体进行激活，得到胰酶粗提液；
步骤六：将胰酶粗提液压滤后取上清液再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；
步骤七：活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过PBS缓冲液平衡；
步骤八：将胰酶浓缩液过柱收集并过柱液备用，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，流出液为胰蛋白酶精提液；
步骤九：将胰蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂；
步骤十：步骤八过柱液为糜蛋白酶浓缩粗提液，加入糜蛋白酶晶体进行二次活化；
步骤十一：用(NH4)2SO4-乙酸混合体系平衡苯基-琼脂糖快胶，将活化的苯基-琼脂糖快胶装柱，将步骤十活化后的糜蛋白酶粗提液过柱；
步骤十二：用(NH4)2SO4溶液进行洗涤，除去柱上的杂蛋白，洗涤至流出液检测不到杂蛋白；
步骤十三：用乙酸-乙酸钠体系从柱上洗脱糜蛋白酶，收集位于活性峰位置的流出液，流出液为糜蛋白酶精提液；
步骤十四：将糜蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到糜蛋白酶干粉制剂。
通过采用上述技术方案，在上述步骤下对胰蛋白酶进行提取，通过Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白偶联，在层析过程中，胰蛋白酶浓缩粗提液中的胰蛋白酶会与鸡卵粘蛋白结合，而杂蛋白则会随过柱液一起流出，经过洗脱液洗脱后能够将胰蛋白酶洗出，能够直接获得高纯度的胰蛋白酶产品，操作简单；同时，鸡卵粘蛋白无法与糜蛋白酶结合，糜蛋白酶随着其他杂蛋白从流出，除去胰蛋白酶的流出液中，活化后的糜蛋白酶在分离过程中不会再与胰蛋白酶混杂，再将糜蛋白酶分离出来，能够提高糜蛋白酶分离过程的纯度，PBS缓冲液能够起到对糜蛋白酶的保护效果，减少糜蛋白酶的自溶现象；而将胰蛋白酶晶体的质量限定为胰脏质量的万分之一，能够避免过多的胰蛋白酶晶体激活糜蛋白酶，进一步减少糜蛋白酶的自溶现象，通过上述条件，能够实现胰蛋白酶和糜蛋白酶的联产，减少资源浪费。
作为优选，步骤一中对胰脏的预处理包括有如下步骤：
Step1，剥除胰脏的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成块；
Step2，通过绞肉机将胰脏块切成糜状的胰碎；
Step3，将胰碎浸没在碱性脱脂剂中，搅拌脱脂；
Step4，滤去碱性脱脂剂后，用pH＝3.0的乙酸酸化水冲洗2～3次，得到胰糜。
通过采用上述技术方案，将胰糜通过碱性脱脂剂脱脂，相较于仅靠机械剥离，对脂肪的去除效果更好，避免脂肪含量对后期胰蛋白酶的提取造成影响。
作为优选，所述碱性脱脂剂包括有占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L的磷酸三钠、1mol/L的丙酮和1mol/L的乙酸乙酯，溶剂为水。
通过采用上述技术方案，磷酸三钠、丙酮和乙酸乙酯都为碱性脱脂剂，同时磷酸三钠在与胰糜的混合液中，还能够起到保护稳定胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的作用，减少在组织破碎过程由于自溶等原因造成的胰蛋白酶和糜蛋白酶原的产率损耗。
作为优选，步骤四中分别加入25g/L(NH4)2SO4溶液、50g/L(NH4)2SO4溶液、饱和(NH4)2SO4溶液和固体(NH4)2SO4进行梯度盐析。
通过采用上述技术方案，梯度盐析的方式相较于一次性盐析，能够提取到产物的产率更高，提高了胰酶的整体产率，同时通过上述几个浓度的进行梯度提取，能够在尽可能少梯度中得到较多的沉淀。
作为优选，步骤五用0.1mol/L CaCl2溶液溶解滤饼，过滤去除沉淀后加入胰蛋白酶晶体。
通过采用上述技术方案，CaCl2为酸式盐，糜蛋白酶在酸性条件下自溶较为缓慢，减少糜蛋白酶的损耗，同时Ca2+能够对胰蛋白酶起到保护作用。
作为优选，步骤七中Sepharose 4B的活化包括如下步骤：
Step1，将Sepharose 4B用1mol/LNaCl溶液滤洗2～5次，再用去离子水冲洗1～2次，冻干成粉状；
Step2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；
Step3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；
Step4，抽滤出去活化液，得活化Sepharose 4B。
通过采用上述技术方案，上述方法相较于其他Sepharose 4B所产生的有害物质较少，对环境较为友好，减少了环境污染；在40℃水浴下进行活化具有较高的活化效率；活化液水浴加热至40℃预热能够进一步提高后期的活化反应的活化效率。
作为优选，步骤七中Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白偶联包括有如下步骤：
Step1，将pH9.5的Na2CO3缓冲液在40℃水浴中水浴加热；
Step2，至Na2CO3缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；
Step3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到Step2中，持续搅拌24h。
通过采用上述技术方案，将Na2CO3缓冲液预热至40℃，能够使Sepharose 4B快速适应反应环境，在40℃水浴状态下进行偶联，能够使Sepharose 4B保持较好的活化状态，同时加速鸡卵粘蛋白偶联。
作为优选，步骤七的PBS缓冲液的pH为8.0。
通过采用上述技术方案，在pH为8.0的情况下，能够使胰蛋白酶适应层析柱的环境，提高胰蛋白酶与鸡卵粘蛋白的结合效果，进而提高提取产率，同时选用PBS缓冲液，磷酸盐能够保护糜蛋白酶，减少糜蛋白酶的自溶现象。
本发明的第二个目的是提供一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法的应用，延缓胰蛋白酶在储存中的活性损失。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法的应用，包括有由上述发明内容所提供的制备方法得到的胰蛋白酶作为活性成分，还包括有甘油磷脂酸、肌醇和CaCl2。
通过采用上述技术方案，甘油磷脂酸和肌醇能够使胰蛋白酶表面互相作用的区域排除了水而降低了自由能，增加了糜蛋白酶的稳定性，适当的钙离子浓度对糜蛋白酶具有促进作用和稳定作用，通过上述配方，在保证糜蛋白酶活性的同时，能够减少糜蛋白酶的自溶。
作为优选，所述甘油磷脂酸、肌醇和CaCl2的摩尔比为30：10：1。
通过采用上述技术方案，在经过实验比较后，上述配比的甘油磷脂酸、肌醇和CaCl2对糜蛋白酶的保护效果较好，活性损失最少。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
该提取方法能够直接获得高纯度的胰蛋白酶产品，操作简单；
该胰蛋白酶通过碱性脱脂剂的使用，除去了胰脏中难以除去的知法，提高了脂肪的去除率，进而提高了胰蛋白酶的提取产率；
该提取方法能够将糜蛋白酶和胰蛋白酶联合提取，减少了资源的浪费。
附图说明
图1为胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法的流程图。
具体实施方式
实施例一
参见图1
胰脏预处理
Step1.1，取离体时间小于8h的动物胰脏，利用刀具剥除胰脏中的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成3×3x3m3的块状；
Step1.2，将块状胰脏通过绞肉机搅成胰糜。
胰酶盐析
Step2.1，将胰糜加入到提取罐中，边加pH＝3.0的乙酸酸化水边搅拌至乙酸酸化水浸没胰糜，浸渍24h至乙酸酸化水呈乳白色，在浸渍过程中，每隔1h间隙搅拌10min，得到胰糜-水混合物；
Step2.2，将胰糜-水混合物通过卧式螺旋离心机离心，设定离心转速为2500r/min，离心时间6min；
Step2.3，离心结束后，若未分层，重新进行Step2.2；至分层，取上清液，通过板式压滤机对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合；
Step2.4，将Step2.3得到的混合液通过双层脱脂纱布滤去残渣，得到胰脏提取液；
Step2.5，通过截留分子量为100kD的中孔纤维超滤膜对胰脏提取液进行超滤浓缩至胰脏提取液的体积为原体积的十分之一；
Step2.6.1，向浓缩后的胰脏提取液加入占胰脏提取液体积十分之一的30g/L(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X1；
Step2.6.2，在Step2.6.1得到的上清液中加入占Step2.6.1得到的上清液体积二十分之一的60g/L(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X2；
Step2.6.3，在Step2.6.2得到的上清液中加入占Step2.6.2得到的上清液体积三十分之一的饱和(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X3；
Step2.6.4，在Step2.6.3得到的上清液中加入与Step2.6.3中饱和(NH4)2SO4溶液中(NH4)2SO4摩尔量一致的固体(NH4)2SO4，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X4；
Step2.6.5，混合X1、X2、X3、X4，通过板式压滤机压滤取滤饼。
胰酶激活
Step3.1，用0.1mol/L CaCl2溶液完全溶解滤饼，通过0.4mol/L HCl溶液调节pH至5以下；
Step3.2，过滤去除沉淀；
Step3.3，加入Step1.1所用胰脏质量万分之一的胰蛋白酶晶体，搅拌均匀得到胰酶粗提液。
胰蛋白酶提取纯化
Step4.1，将胰酶粗提液通过压滤后取上清液：
Step4.2，将Step4.1所得上清液过截留分子量为50kD的中孔纤维超滤膜再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；
Step4.3.1，将Sepharose 4B用1mol/L NaCl溶液滤洗2～5次，再用去离子水冲洗1～2次，冻干成粉状；
Step4.3.2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；
Step4.3.3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；
Step4.3.4，抽滤除去活化液，得活化Sepharose 4B；
Step4.4.1，将pH9.5的Na2CO3缓冲液在40℃水浴中水浴加热；
Step4.4.2，至Na2CO3缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；
Step4.4.3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到Step2中，持续搅拌24h，使Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白偶联；
Step4.5，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过pH＝8.0的PBS缓冲液平衡；
Step4.6，将胰酶浓缩液过柱收集过柱备用，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；
Step4.7.1，将透析袋置于0.5mol/L EDTA溶液水浴加热40分钟，取出透析袋用蒸馏水冲洗2～3次；
Step4.7.2，将胰蛋白酶精提液注入透析袋中，将注有胰蛋白酶精提液的透析袋用流动的蒸馏水浸泡12h，收集酶液得到胰蛋白酶去盐液；
Step4.7.3，将胰蛋白酶去盐液过30KD超滤膜过滤浓缩后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂。
糜蛋白酶提取
Step5.1，将Step4.6收集的过柱液加入Step1.1所用胰脏质量二十万分之一的糜蛋白酶晶体进行二次活化；
Step5.2，将苯基-琼脂糖快胶浸泡于0.01mol/L(NH4)2SO4溶液中，边搅拌边加入乙酸调节pH至小于5.0，静置1h；
Step5.3，将活化后的苯基-琼脂糖快胶装柱，将步骤十活化后的糜蛋白酶粗提液过柱；
Step5.4，用0.01mol/L(NH4)2SO4溶液对step5.4层析柱进行洗涤，通过点导率监测流出液，洗涤至流出液检测不到杂蛋白；
Step5.5，用乙酸-0.01mol/L乙酸钠混合溶液从柱上洗脱糜蛋白酶，收集位于活性峰位置的流出液，流出液为糜蛋白酶精提液；
Step5.6.1，将透析袋置于0.5mol/L EDTA溶液水浴加热40分钟，取出透析袋用蒸馏水冲洗2～3次；
Step5.6.2，将糜蛋白酶精提液注入透析袋中，注有糜蛋白酶精提液的透析袋用流动的蒸馏水浸泡12h，收集酶液得到糜蛋白酶精提液；
Step5.6.3，将糜蛋白酶精提液过30KD超滤膜过滤后，冻干成粉，即得到糜蛋白酶干粉制剂。
实施例二
胰脏预处理
Step1.1，取离体时间小于8h的动物胰脏，利用刀具剥除胰脏中的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成3×3x3m3的块状；
Step1.2，将块状胰脏通过绞肉机搅成胰糜状；
Step1.3，以去离子水为溶剂配制碱性脱脂剂，向去离子水中加入磷酸三钠、丙酮和乙酸乙酯至磷酸三钠的浓度占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L、丙酮占碱性脱脂剂总含量1mol/L以及乙酸乙酯占碱性脱脂剂总含量1mol/L；
Step1.4，将碱性脱脂剂加入搅拌机中，边搅拌边均匀加入胰糜，设定搅拌转速为150r/min，搅拌时间为5min；
Step1.5，滤去碱性脱脂剂后，用pH＝3.0的乙酸酸化水冲洗2～3次，得到胰糜。
胰酶盐析
Step2.1，将胰糜加入到提取罐中，边加pH＝3.0的乙酸酸化水边搅拌至浸没胰糜，浸渍24h至乙酸酸化水呈乳白色，在浸渍过程中，每隔1h间隙搅拌10min，得到胰糜-水混合物；
Step2.2，将胰糜-水混合物通过卧式螺旋离心机离心，设定离心转速为2500r/min，离心时间6min；
Step2.3，离心结束后，若未分层，重新进行Step2.2；至分层，取上清液，通过版式压滤机对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合；
Step2.4，将Step2.3得到的混合液通过双层脱脂纱布滤去残渣，得到胰脏提取液；
Step2.5，通过截留分子量为100kD的中孔纤维超滤膜对胰脏提取液进行超滤浓缩至胰脏提取液的体积为原体积的十分之一；
Step2.6.1，向浓缩后的胰脏提取液加入占胰脏提取液体积十分之一的30g/L(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X1；
Step2.6.2，在Step2.6.1得到的上清液中加入占Step2.6.1得到的上清液体积二十分之一的60g/L(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X2；
Step2.6.3，在Step2.6.2得到的上清液中加入占Step2.6.2得到的上清液体积三十分之一的饱和(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X3；
Step2.6.4，在Step2.6.3得到的上清液中加入与Step2.6.3中饱和(NH4)2SO4溶液中(NH4)2SO4摩尔量一致的固体(NH4)2SO4，搅拌10min后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X4；Step2.6.5，混合X1、X2、X3、X4，通过板式压滤机压滤取滤饼。
胰酶激活
Step3.1，用0.1mol/L CaCl2溶液溶解滤饼，通过0.4mol/L HCl溶液调节pH至5以下；
Step3.2，过滤去除沉淀；
Step3.3，加入Step1.1所用胰脏质量万分之一的胰蛋白酶晶体，搅拌均匀得到胰酶粗提液。
胰蛋白酶提取纯化
Step4.1，将胰酶粗提液通过压滤后取上清液：
Step4.2，将Step4.1所得上清液过截留分子量为50kD的中孔纤维超滤膜再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；
Step4.3.1，将Sepharose 4B用1mol/LNaCl溶液滤洗2～5次，再用去离子水冲洗1～2次，冻干成粉状；
Step4.3.2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；
Step4.3.3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；
Step4.3.4，抽滤去除活化液，得活化Sepharose 4B；
Step4.4.1，将pH9.5的0.1mol/L Na2CO3缓冲液在40℃水浴中水浴加热；
Step4.4.2，至0.1mol/L Na2CO3缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；
Step4.4.3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到Step2中，持续搅拌24h，使Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白偶联；
Step4.5，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过pH＝8.0的PBS缓冲液平衡；
Step4.6，将胰酶浓缩液过柱去除杂蛋白，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；
Step4.7.1，将透析袋置于0.5mol/L EDTA溶液水浴加热40分钟，取出透析袋用蒸馏水冲洗2～3次；
Step4.7.2，将胰蛋白酶精提液注入透析袋中，将注有胰蛋白酶精提液的透析袋用流动的蒸馏水浸泡12h，收集酶液得到胰蛋白酶去盐液；
Step4.7.3，将胰蛋白酶去盐液过30KD超滤膜过滤浓缩后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂；
糜蛋白酶提取
Step5.1，将Step4.6收集的过柱液加入Step1.1所用胰脏质量二十万分之一的糜蛋白酶晶体进行二次活化；
Step5.2，将苯基-琼脂糖快胶浸泡于0.01mol/L(NH4)2SO4溶液中，边搅拌边加入乙酸调节pH至小于5.0，静置1h；
Step5.3，将活化后的苯基-琼脂糖快胶装柱，将步骤十活化后的糜蛋白酶粗提液过柱；
Step5.4，用0.01mol/L(NH4)2SO4溶液对step5.4层析柱进行洗涤，通过点导率监测流出液，洗涤至流出液检测不到杂蛋白；
Step5.5，用乙酸-0.01mol/L乙酸钠混合溶液从柱上洗脱糜蛋白酶，收集位于活性峰位置的流出液，流出液为糜蛋白酶精提液；
Step5.6.1，将透析袋置于0.5mol/L EDTA溶液水浴加热40分钟，取出透析袋用蒸馏水冲洗2～3次；
Step5.6.2，将糜蛋白酶精提液注入透析袋中，注有糜蛋白酶精提液的透析袋用流动的蒸馏水浸泡12h，收集酶液得到糜蛋白酶去盐液；
Step5.6.3，将糜蛋白酶去盐液过30KD超滤膜过滤后，冻干成粉，即得到糜蛋白酶干粉制剂。
实施例三
实施例三的区别与实施例二的区别仅在于，实施例三的碱性脱脂剂的配方为：以去离子水为溶剂配制碱性脱脂剂，向去离子水中加入磷酸三钠、丙酮、乙酸乙酯和氯化钙，至磷酸三钠的浓度占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L、丙酮占碱性脱脂剂总含量1mol/L、乙酸乙酯占碱性脱脂剂总含量1mol/L以及钙离子的浓度占总含量的0.05mol/L。
胰蛋白酶活力测定：
依次在试管中加入2.5mL 0.05mol/L Tirs-HCl缓冲液(pH＝8.0)，0.2mL0.01mol/L HCl溶液，0.1mL胰蛋白酶去盐液的稀释液，0.2mLBAEE，每次加入均混合摇匀，30s后开始记录A253的吸光值，每隔10s进行记录，连续记录9个点，绘制酶促动力学曲线，从曲线上求起始点吸光度随时间的变化率Km。一个酶活力单位(U)：在上述条件下，每分钟使△A253增加0.001，反应液中所加的酶量为1BAEE单位。
胰蛋白酶活力单位(U/mL)＝(△A253/min)/(0.001×胰蛋白酶去盐液体积)×稀释倍数。
糜蛋白酶的活力测定：
Step1，取N-乙酰-L-酪氨酸乙酯23.7mg，置100mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液(取0.067mol/L磷酸二氢钾溶液38.9mL与0.067mol/L磷酸氢二钠溶液61.1mL，混合，pH值为7.0)50mL，温热使溶解，冷却后再稀释至刻度，摇匀，作为底物溶液；
Step2，取底物溶液2.0mL、0.00lmol/L盐酸溶液0.2mL与上述磷酸盐缓冲液(pH7.0)lmL，混匀，作为空白对照，
Step4，精确量取糜蛋白酶去盐液，进行稀释，取稀释液1mL；，加底物溶液(预热至25℃士0.5℃)3.0mL，立即计时并摇匀，使比色池内的温度保持在25℃±0.5℃，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在237nm的波长处，每隔30秒读取吸光度，共5分钟，每30秒钟吸光度的变化率应恒定，且恒定时间不得少于3分钟；
糜蛋白酶活力单位(U/mL)＝(△A237/min)/(0.001×糜蛋白酶去盐液体积)×稀释倍数测试结果见下表：
Figure BDA0001515000990000101
应用例1a
选取实施例二制得的糜蛋白酶，将4mol甘油磷脂酸、2mol肌醇和0.1mol固体CaCl2加800mL去离子水溶解，补加去离子水至1L，制得糜蛋白酶保护液。
将糜蛋白酶保护液和糜蛋白酶按照1000:4的比例混合，并计算其1h、24h、3d、7d、30d的糜蛋白酶活力单位。
应用例1b
选取实施例二制得的糜蛋白酶，将3mol甘油磷脂酸、1mol肌醇和0.1mol固体CaCl2加800mL去离子水溶解，补加去离子水至1L，制得糜蛋白酶保护液。
将糜蛋白酶保护液和糜蛋白酶按照1000:4的比例混合，置于15℃下密封存放，并计算其1h、24h、3d、7d、30d的糜蛋白酶活力单位。
应用例1c
选取实施例二制得的糜蛋白酶，将2mol甘油磷脂酸、2mol肌醇和0.2mol固体CaCl2加800mL去离子水溶解，补加去离子水至1L，制得糜蛋白酶保护液。
将糜蛋白酶保护液和糜蛋白酶按照1000:4的比例混合，置于15℃下密封存放，并计算其1h、24h、3d、7d、30d的糜蛋白酶活力单位。
应用例1d
选取实施例二制得的糜蛋白酶，将1mol甘油磷脂酸、3mol肌醇和0.1mol固体CaCl2加800mL去离子水溶解，补加去离子水至1L，制得糜蛋白酶保护液。
将糜蛋白酶保护液和糜蛋白酶按照1000:4的比例混合，置于15℃下密封存放，并计算其1h、24h、3d、7d、30d的糜蛋白酶活力单位。
对比例
将去离子水和糜蛋白酶按照质量比为1000：4，置于15℃下密封存放，并计算其1h、24h、3d、7d、30d的糜蛋白酶活力单位。
Figure BDA0001515000990000111
经过上表可知，保护液能够对糜蛋白酶起到保护作用，且当糜蛋白酶保护液和糜蛋白酶的比例按照1:4，且糜蛋白酶保护液的含量摩尔比为甘油磷脂酸、肌醇和固体CaCl2加为30：10:1时，混合时，保护效果最好。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法，其特征在于，包括有如下步骤：
步骤一：将动物胰脏预处理去除结缔组织和脂肪，切块搅碎，得到胰糜；
步骤二：将胰糜加入到提取罐中加乙酸酸化水至浸过胰糜，搅拌混合后，得到胰糜-水混合物；
步骤三：将胰糜-水混合物离心至分层，并对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合后得到胰脏提取液；
步骤四：对胰脏提取液进行超滤浓缩后，分别加入25g/L（NH4）2SO4溶液、50g/L（NH4）2SO4溶液、饱和（NH4）2SO4溶液和固体（NH4）2SO4进行梯度盐析，得到胰酶混合物；
步骤五：将胰酶混合物经过压滤后取滤饼，向滤饼中加入0.1mol/L CaCl2溶液溶解至滤饼溶解，过滤去除沉淀后加入胰脏质量万分之一的胰蛋白酶晶体进行激活，得到胰酶粗提液；
步骤六：将胰酶粗提液压滤后取上清液再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；
步骤七：活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过PBS缓冲液平衡；
步骤八：将胰酶浓缩液过柱收集并过柱液备用，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，流出液为胰蛋白酶精提液；
步骤九：将胰蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂；
步骤十：步骤八过柱液为糜蛋白酶浓缩粗提液，加入糜蛋白酶晶体进行二次活化；
步骤十一：用（NH4）2SO4-乙酸混合体系平衡苯基-琼脂糖块胶，将活化的苯基-琼脂糖块胶装柱，将步骤十活化后的糜蛋白酶粗提液过柱；
步骤十二：用（NH4）2SO4溶液进行洗涤，除去柱上的杂蛋白，洗涤至流出液检测不到杂蛋白；
步骤十三：用乙酸-乙酸钠体系从柱上洗脱糜蛋白酶，收集位于活性峰位置的流出液，流出液为糜蛋白酶精提液；
步骤十四：将糜蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到糜蛋白酶干粉制剂。
2.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法，其特征在于，步骤一中对胰脏的预处理包括有如下步骤：
Step1，剥除胰脏的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成块；
Step2，通过绞肉机将胰脏块绞成糜状的胰碎；
Step3，将胰碎浸没在碱性脱脂剂中，搅拌脱脂；
Step4，滤去碱性脱脂剂后，用pH=3.0的乙酸酸化水冲洗2~3次，得到胰糜。
3.根据权利要求2所述的一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法，其特征在于，所述碱性脱脂剂包括有占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L的磷酸三钠、1mol/L的丙酮和1mol/L的乙酸乙酯，溶剂为水。
4.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法，其特征在于，步骤七中Sepharose 4B的活化包括如下步骤：
Step1，将Sepharose 4B用1mol/LNaCl溶液滤洗2~5次，再用去离子水冲洗1~2次，冻干成粉状；
Step2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；
Step3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；
Step4，抽滤出去活化液，得活化Sepharose 4B。
5.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法，其特征在于，步骤七中Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白偶联包括有如下步骤：
Step1，将pH9.5的Na2CO3缓冲液在40℃水浴中水浴加热；
Step2，至Na2CO3缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；
Step3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到Step2中，持续搅拌24h。
6.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法，其特征在于，步骤七的PBS缓冲液的pH为8.0。
7.一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法的应用，其特征在于，应用于制备包含包括权利要求1-6任一项制备方法得到的糜蛋白酶作为活性成分、包含有甘油磷脂酸、肌醇和CaCl2作为保护剂的混合物。
8.根据权利要求7所述一种胰蛋白酶和糜蛋白酶联合提取方法的应用，其特征在于，所述甘油磷脂酸、肌醇和CaCl2的摩尔比为30：10：1。
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