CN105385670A - 一种高度纯化胰激肽酶原的方法及提高胰激肽酶原稳定性的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高度纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物。本发明的技术方案是以猪胰为原料提取、沉淀猪胰制成丙酮粉后,灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀,乙醚脱脂脱水,氯化钠-氨水、丙酮协同除杂,离子交换树脂DEAE-琼脂糖快胶分步洗脱等传统与现代相结合的蛋白纯化技术,高度纯化胰激肽酶原。本发明具有生产周期短,对化学和热稳定性好、成本低的特点,非常适用于规模化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说是以猪胰为原料提取、沉淀猪胰制成丙酮粉后,灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀,乙醚脱脂脱水,氯化钠-氨水、丙酮协同除杂,离子交换树脂DEAE-琼脂糖快胶分步洗脱等传统与现代相结合的蛋白纯化技术,制备胰激肽酶原。
背景技术
胰激肽酶原(kallikein)是从猪胰脏中分离纯化制得的天然酶类药物,临床上又称血管舒缓素,具有舒展毛细血管和小动脉的作用,在临床上常用来治疗高血脂,防治脂肪肝、动脉粥样硬化、高血压、心绞痛等多种疾病,它的开发具有重要的医学和社会价值。在我国,胰激肽酶原生产还存在很大的发展空间。
传统的纯化胰激肽酶原的工艺由于工艺复杂、成本较高;离子交换层析是目前是适合胰激肽酶原工业化生产的最普遍方法;但通常需要采用多种进口离子交换介质对胰激肽酶原进行纯化,不仅操作繁琐,且因多次上柱使得回收率很低,以最具有实用价值的周祖萌等人的方法为例,通过在pH7.0、pH5.0、pH6.7条件下,依次将所得样品上DEAE-Cellulose、DEAE-Sepharosecl-6B,得到了比活1500u/mg左右的胰激肽酶原,收率为40%。除此之外,目前国际上大多采用阴离子交换,结合阳离子交换,最后加一步凝胶过滤层析,并且离子交换过程中胰激肽酶原的洗脱都采用改变pH的方式,由于缓冲溶液的缓冲作用,使得柱内pH改变缓慢,周期延长,耗费大量缓冲液,以法国GrahamS.Bailey的纯化过程,虽然经三步纯化后,胰激肽酶原比活高达1254u/mg,但收率只有28.4%;其次有采用离子交换层析与亲和层析或疏水层析相结合,步骤较多,纯化周期较长且成本高昂,以英国TalalS.EI.Thaher的纯化过程为例,虽然收率达到87%,但胰激肽酶原比活只有156.3u/mg;再次,采用一种离子交换介质想要通过一次纯化就获得高纯度和高收率的胰激肽酶原几乎是不可能完成的任务,以李立桓等利用Amberlite-CG50一步从胰酶中分离纯化胰激肽酶原,但其比活和收率分别只有107.4u/mg和12.1%。
而本发明是灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀,乙醚脱脂脱水,氯化钠-氨水、丙酮协同除杂,离子交换树脂DEAE-琼脂糖快胶分步洗脱等传统与现代相结合的蛋白纯化技术,使用DEAE-琼脂糖快胶具有高流速、高载量,可以有效的缩短生产周期,且对化学和热稳定性好,产品的收率在同类工艺中处于领先地位;而胰激肽酶原分步洗脱的方法,虽然不能达到国际最高标准,但是依然超过了临床用药的要求,适合工业化生产。
发明内容
本发明的目的是高度纯化从合格的猪胰脏中提取的胰激肽酶原。
本发明的技术方案是:以猪胰为原料提取、沉淀猪胰制成丙酮粉后,灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀,乙醚脱脂脱水,氯化钠-氨水、丙酮协同除杂,离子交换树脂DEAE-琼脂糖快胶分步洗脱等传统与现代相结合的蛋白纯化技术,高度纯化胰激肽酶原。本发明具有生产周期短,对化学和热稳定性好、成本低的特点,非常适用于规模化大生产。包括如下步骤:
(1)醋酸提取:将猪胰脏制成丙酮粉后,加醋酸溶液搅拌提取,离心,得上清液;
(2)丙酮沉淀:收集上清液,加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脱脂、脱水,干燥,得胰激肽酶原粗品;
(3)氯化钠-氨水、丙酮协同除杂:将粗品用氯化钠溶液溶解,用氨水调PH,搅拌混合,过滤,得滤液;将滤液中加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗涤,干燥,得胰激肽酶原中间品;
(4)离子交换层析:将胰激肽酶原中间品溶于18~22倍量的0.0005~0.0015mol/L醋酸缓冲液(pH4.5)中,离心,得上清液;取上清液,按1:8~12的体积比上DEAE-琼脂糖快胶柱吸附,吸附平衡后,用含0.15~0.25mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱至基线,再用含0.25~0.45mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱,收集洗脱液;将洗脱液透析脱盐,冻干,得胰激肽酶原精品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
所述的以猪胰为原料提取、沉淀猪胰制成丙酮粉后,灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀,乙醚脱脂脱水,氯化钠-氨水、丙酮协同除杂,离子交换树脂DEAE-琼脂糖快胶分步洗脱等传统与现代相结合的蛋白纯化技术,制备胰激肽酶原,包括如下步骤:
(1)醋酸提取:将猪胰脏10Kg制成丙酮粉后,加入30倍量的醋酸溶液,搅拌提取,离心,得上清液29.8L。
(2)丙酮沉淀:收集上清液,加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脱脂、脱水,干燥,得胰激肽酶原粗品93g。
(3)氯化钠-氨水、丙酮协同除杂:将粗品用50倍量氯化钠溶液溶解,用氨水调PH,搅拌混合,过滤,得滤液;,加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗涤,干燥,得胰激肽酶原中间品60g。
(4)离子交换层析:将胰激肽酶原中间品溶于20倍量的0.001mol/L醋酸缓冲液(pH4.5)中,离心,得上清液;取上清液,按1:10的体积比上DEAE-琼脂糖快胶柱吸附,吸附平衡后,用含0.2mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱至基线,再用含0.35mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液洗脱,收集洗脱液;将洗脱液透析脱盐,冻干,得胰激肽酶原精品42g。
实施例2
将实施例1制备的胰激肽原酶6000单位、预胶化淀粉21.7g置混合机内,搅拌5分钟,再加入糊精32.5g、糖粉20.1g、柠檬酸三钠0.08g、羧甲基纤维素钠1.5g于混合机内,搅拌20分钟后将预先配好的粘合剂(取L-羟丙基纤维素2.0g加75%乙醇20ml使溶解,即得)和润滑剂硬脂酸镁0.0037g,缓缓均匀地加入混合机内搅拌,至颗粒形成,放入制粒机中制粒,中间体检验,合格后用压片机制成1000片,片芯检验合格后包肠溶衣。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.一种高度纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)醋酸提取:将猪胰脏制成丙酮粉后,加醋酸溶液搅拌提取,离心,得上清液;
(2)丙酮沉淀:收集上清液,加入丙酮沉淀;沉淀用丙酮、乙醚脱脂、脱水,干燥,得胰激肽酶原粗品;
(3)氯化钠-氨水、丙酮协同除杂:将粗品用氯化钠溶液溶解,用氨水调PH,搅拌混合,过滤,得滤液;将滤液中加入丙酮沉淀;沉淀用丙酮、乙醚洗涤,干燥,得胰激肽酶原中间品;
(4)离子交换层析:将胰激肽酶原中间品溶于醋酸缓冲液中,离心,得上清液;取上清液,上DEAE-琼脂糖快胶柱吸附,吸附平衡后,用含氯化钠的醋酸缓冲液洗脱至基线,再用含氯化钠的醋酸缓冲液洗脱,收集洗脱液;将洗脱液透析脱盐,冻干,得胰激肽酶原精品。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(4)中,胰激肽酶原中间品与醋酸溶液的比例为:1Kg:18~22L,醋酸溶液的浓度为:0.0005~0.0015mol/L,pH值为4.5。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(4)中,洗脱至基线的含氯化钠的醋酸缓冲液为含0.15~0.25mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液;第二次洗脱用的含氯化钠的醋酸缓冲液为含0.25~0.45mol/L氯化钠的0.01mol/L醋酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(4)中用新型的阴离子交换柱吸附,所用的离子交换介质为DEAE-琼脂糖快胶,DEAE-琼脂糖快胶与上清液的体积比为:8~12:1。
5.一种药物组合物,其含有根据权利要求1-4制备的胰激肽酶原作为活性成分,还含有预胶化淀粉、糊精、糖粉、L-羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、柠檬酸三钠、75%乙醇。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
CN111733150A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-10-02 | 浙江丰安生物制药有限公司 | 一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103667223A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-26 | 青岛康原药业有限公司 | 一种氯化钠-氨水、丙酮协同纯化激肽释放酶的方法 |
CN103725664A (zh) * | 2013-11-28 | 2014-04-16 | 青岛康原药业有限公司 | 一种高度纯化激肽释放酶的方法 |
CN103740686A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-04-23 | 青岛康原药业有限公司 | 一种用醋酸提取激肽释放酶的方法 |
CN104480091A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-01 | 青岛康原药业有限公司 | 一种高度纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物 |
CN104513816A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-15 | 青岛康原药业有限公司 | 一种用醋酸提取胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物 |
CN104531647A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-22 | 青岛康原药业有限公司 | 一种氯化钠-氨水、丙酮协同纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物 |
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103667223A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-26 | 青岛康原药业有限公司 | 一种氯化钠-氨水、丙酮协同纯化激肽释放酶的方法 |
CN103725664A (zh) * | 2013-11-28 | 2014-04-16 | 青岛康原药业有限公司 | 一种高度纯化激肽释放酶的方法 |
CN103740686A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-04-23 | 青岛康原药业有限公司 | 一种用醋酸提取激肽释放酶的方法 |
CN104480091A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-01 | 青岛康原药业有限公司 | 一种高度纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物 |
CN104513816A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-15 | 青岛康原药业有限公司 | 一种用醋酸提取胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物 |
CN104531647A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-22 | 青岛康原药业有限公司 | 一种氯化钠-氨水、丙酮协同纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111733150A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-10-02 | 浙江丰安生物制药有限公司 | 一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法 |
CN111733150B (zh) * | 2020-07-02 | 2022-02-11 | 浙江丰安生物制药有限公司 | 一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法 |
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