CN101544968A - 一种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法，属于生物技术领域。鲜蚯蚓或冷冻蚯蚓加0.14mol/L NaCl、匀浆、搅拌提取、离心上清调节pH7.5－9.5、电导率1－5ml/Ω；加活化的大孔阴离子交换树脂搅拌交换2－4小时，洗涤，3－4mol/L NaCl洗脱；或者树脂装离交柱、动态交换、0.5－4.5mol/L NaCl梯度洗脱；洗脱液冷酒精沉淀或超过滤脱盐、浓缩，低温干燥得蚯蚓纤溶酶。本发明技术产品白色、无异味、易溶于水，生物活性由≥12uku/mg提高到40uku/mg以上，收得率提高10％以上，节约大量化工原料、生产成本降低50％左右。适用于工业化生产。

Description

一种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法

一、技术领域

本发明涉及一种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法，是一种利用离子交换树脂直接提取、作为原料药或保健食品功效成分的蚯蚓纤溶酶的工业化生产技术，属于生物技术领域。

二、背景技术

选用适合的树脂在适当的条件下进行离子交换或吸附层析，直接从动植物或微生物粗提液中、直接从发酵液中提取—浓缩目标蛋白或目标多糖或其他生化物质，是目前最常用的快速简便、成本低廉的工业化分离纯化技术。

蚯蚓纤溶酶亦称蚓激酶，作为口服溶血栓药的主要原料药在我国与日本已经应用多年，同时还有若干种以蚯蚓纤溶酶为功效成分的保健食品上市，两大类产品在我国年销售额已超过10亿元，目前仍呈快速上升趋势。

蚯蚓纤溶酶的实验室提取、提纯，通常采用蚯蚓匀浆—抽提—离心—硫酸铵分级盐析或有机溶剂分级沉淀—透析或凝胶过滤、脱盐—离交层析或亲和层析—透析—冷冻干燥。

药用蚯蚓纤溶酶的工业化提取，在我国和日本目前是将鲜蚯蚓(或蚯蚓粉)加水(或0.1mol/L NaCl)保温、搅拌、自溶，或者蚯蚓匀浆加水(或0.1mol/L NaCl)抽提—离心或过滤取上清—硫酸铵分级盐析或乙醇、丙酮等有机溶剂分级沉淀—超过滤、洗涤、浓缩—冷冻干燥或有机溶剂沉淀、真空干燥。有的还插入活性炭等吸附剂吸附、脱色、脱腥工序。

上述工业化制备蚯蚓纤溶酶的生产工艺，缺点是收得率低、产品纯度和生物活性较低、生产成本高、需要耗费大量硫酸铵或乙醇、丙酮等化工原料。因此，寻找一种简易、高效的工业化制备蚯蚓纤溶酶生产工艺，取代目前国内外采用的生产工艺，是一项具实用价值的迫切任务。

三、发明内容

技术问题

本发明是针对目前蚯蚓纤溶酶工业化生产工艺收得率低、产品纯度和生物活性较低、生产成本高、需要耗费大量硫酸铵或乙醇、丙酮等化工原料等缺点，公开一种简易、高效的工业化制备蚯蚓纤溶酶的工艺技术。该提取工艺的核心工序：离子交换，即直接从蚯蚓粗提液中提取并浓缩纤溶酶。蚯蚓纤溶酶的收得率、生物活性得到提高，生产周期缩短、生产成本降低。

技术方案

利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法，包括：

(1)洗净的鲜蚯蚓或冷冻的鲜蚯蚓加0.14mol/L NaCl溶液、匀浆，搅拌提取1-2小时，离心或过滤取上清液，沉渣加0.14mol/L NaCl溶液搅拌提取0.5小时、离心、合并上清；

(2)上清液用1mol/L NaOH调节pH7.5-9.5，加无离子水调节离子强度(按电导率计)至1-5ml/Ω；

(3)静态离子交换-阶梯洗脱：加入活化的大孔阴离子交换树脂搅拌交换2-4小时、抽干；常水漂洗、抽干，重复洗涤一次；加入0.8-1.2mol/L NaCl溶液搅拌洗涤、抽干，重复洗涤一次；加入2.5-4.5mol/L pH 5-6 NaCl溶液搅拌洗脱2-4小时、抽干、收集洗脱液，重复洗脱1次、合并洗脱液；

或者采用动态离交层析-梯度洗脱：活化的树脂装层析柱，第(2)项下的上清液上柱，无离子水洗涤，0.5-4.5mol/L pH 5-6 NaCl溶液梯度洗脱，收集、合并纤溶酶洗脱峰；

(5)洗脱液用冷酒精或冷丙酮沉淀，有机溶剂脱水，真空干燥；或者洗脱液通过超过滤洗涤、浓缩，冷冻干燥。

所用大孔阴离子交换树脂是指大孔强碱性阴离子交换树脂或大孔弱碱性阴离子交换树脂如D254、D290、ZGA351或ZGA451。

有益效果

目前国内外普遍利用赤子爱胜蚓(Eisenia Foetide)作为提取纤溶酶的原料，赤子爱胜蚓至少含有6种纤溶酶的同工酶，它们的分子量范围在2.5—4.5万D.，等电点范围3.5—4.5，pH稳定范围5—12，完全失活温度70℃、60分钟。对于这种稳定的酸性蛋白，选择适合的阴离子交换树脂直接从蚯蚓粗提液中提取，照理并不十分困难，但实际并非如此。正因为此，至今国内外仍沿用硫酸铵或有机溶剂分级沉淀从蚯蚓粗提液中提取纤溶酶。即便利用离子交换、疏水层析、亲和层析等提纯技术，也只能放在初步分离提纯之后才能有效地进行。

我们的试验证明，是因为生产过程中含量占细胞核98％以上、等电点pI 1.0左右的DNA及其降解产物—分子量大小不一的核苷酸，干扰并阻碍了蚯蚓纤溶酶与离子交换树脂的结合与洗脱。只有消除了数量与荷电量占绝对优势的DNA与核苷酸的干扰，才有可能利用适合的离子交换树脂直接从蚯蚓粗提液中提取、浓缩蚯蚓纤溶酶。

蚯蚓纤溶酶工业化生产过程中，防止DNA溶解与降解，并通过离心或过滤将DNA沉淀从蚯蚓粗提液中除去乃是技术之关键。新鲜或冰冻的蚯蚓，在0.14mol/L NaCl中匀浆、提取，占细胞核98％以上的DNA易溶于水，但在0.14mol/L NaCl溶液中几乎不溶，较容易除去。在上述操作过程中扣紧生产环节、在夏季0.14mol/L NaCl溶液预冷或在较低温度环境下操作、防止DNA被细胞固有的DNA酶降解，也是一个重要方面。

采用本技术方案可以有效去除蚯蚓粗提物中数量和荷电量占绝对优势的DNA并防止降解，因而有可能直接用大孔阴离子交换树脂从蚯蚓粗提液中提取、浓缩纤溶酶。实践表明，

本发明具有以下优点：

1.提高蚯蚓纤溶酶产品的生物活性和纯度：本发明技术的产品白色、无异味、易溶于水，生物活性大于40uku/mg(蚓激酶单位40000u/mg)，高于目前工业化产品的一般生物活性≥12uku/mg(蚓激酶单位12000u/mg)。

2.简化生产过程、降低生产成本、节省大量化工原料—硫酸铵、乙醇、丙酮：本发明通过核心工序—离交层析，一次完成目标蛋白的提取—浓缩，大幅度减少后续工序的设备体积和化工原料用量；树脂可反复再生使用；而且树脂再生、洗涤、洗脱仅仅使用最便宜、最常用的化工原料—NaCl、NaOH、HCl，极少量的乙醇仅用于纤溶酶脱水干燥。据估算，本发明的工业化生产技术使生产成本降低50％左右。

3.提高产品收得率：本发明由于缩短工业化生产工序、提高吸附目标蛋白的特异性，使得纤溶酶的收得率普遍提高10％以上。

具体实施方式

1.生产工艺

(1)鲜蚯蚓洗净、沥干，或冷冻的鲜蚯蚓，加0.14mol/L NaCl溶液、匀浆、搅拌提取1-2小时，离心或过滤取上清液，沉渣用0.14mol/L NaCl溶液搅拌提取0.5小时、离心、合并上清；

(2)上清液用1mol/L NaOH调节pH7.5-9.5，加适量无离子水调节离子强度(按电导率计)1-5ml/Ω；

(3)加入活化的大孔阴离子交换树脂如D254、D290、ZGA351、ZGA451等、搅拌交换2-4小时、抽干；无离子水漂洗、抽干，重复洗涤一次；

(4)加入0.8-1.2mol/L NaCl溶液搅拌洗涤1-2小时、抽干，重复洗涤一次；

(5)加入2.5-4.5mol/L pH 5-6 NaCl溶液搅拌洗脱2-4小时、抽干、收集洗脱液，重复洗脱1次、合并洗脱液；

(6)洗脱液抽滤、冷酒精沉淀，收集沉淀物、有机溶剂脱水，真空干燥；或者洗脱液经超过滤洗涤、浓缩，冷冻干燥。

(7)上述第(2)项的上清液，也可通过动态离交层析-梯度洗脱、代替(3)-(5)项静态离子交换-阶梯洗脱。即：活化的离子交换树脂装层析柱，(2)项上清液在调节pH和离子强度后上柱，无离子水洗涤，配制pH 5-6的梯度洗脱液：0.5mol/L NaCl、4.5mol/L NaCl溶液，梯度洗脱、收集、合并纤溶酶活性洗脱峰。以下操作同第(6)项.

2.实施例一

鲜赤子爱胜蚓22Kg、配制0.14mol/L NaCl溶液，蚯蚓匀浆，共加0.14mol/LNaCl溶液22L，搅拌、提取2小时，5000g、10℃离心45分、取上清。沉淀物加5L0.14mol/L NaCl溶液、搅拌提取0.5小时，离心，合并2次离心上清。用1mol/LNaOH调节pH 8.5，加无离子水调电导率2.3ml/Ω，加入活化的D254树脂(大孔强碱性阴离子交换树脂)4.4Kg搅拌4小时，抽干。常水充分漂洗、抽干，重复漂洗一次。树脂加10L 1mol/L NaCl溶液，搅拌洗涤2小时、抽干，重复洗涤1小时。抽干的树脂加6L 3.5mol/L NaCl溶液(pH 5.5)、搅拌洗脱4小时，抽干；同样搅拌洗脱2小时、抽干，合并2次洗脱液、抽滤(滤过液澄明微黄)。洗脱液搅拌加入冷酒精至终末浓度78％(V/V)，置4℃过夜，收集沉淀，无水酒精脱水，真空干燥，粉碎，得白色、无异味的蚯蚓纤溶酶粉末101.4g。

以(牛血)纤维蛋白平板法、尿激酶国际标准品为对照，测得蚯蚓纤溶酶活性为48uku/mg(48000蚓激酶单位)。D254树脂对蚯蚓粗提液中纤溶酶的交换率为92.6％、洗脱率为91.5％，总收得率为76.3％。

3.实施例二

冰冻的鲜赤子爱胜蚓28Kg、匀浆，同上用0.14mol/L NaCl抽提两次、共用NaCl溶液34L。蚯蚓粗提液用1mol/L NaOH溶液调节pH9.0，加无离子水调节电导率1.8ml/Ω。活化的ZGA451sc树脂(大孔弱碱性阴离子交换树脂)6kg、装离交柱—蚯蚓粗提液上样—无离子水洗涤—0.5mol/L、4.5mol/L NaCl溶液(pH5.3)各8L、梯度洗脱。继一个大而平缓的杂蛋白洗脱峰之后，出现相连的纤溶酶活性峰，收集、合并纤溶酶洗脱峰，抽滤。滤液经中空纤维超过滤器(截留分子量10000D.)超过滤、无离子水洗涤、浓缩。浓缩液冷冻干燥，得白色、无异味的纤溶酶粉末104.4g。

以(牛血)纤维蛋白平板法、尿激酶国际标准品为对照，测得蚯蚓纤溶酶活性为56uku/mg(蚓激酶单位56000u/mg)。D254树脂对蚯蚓粗提液中纤溶酶的交换率为92.2％、洗脱率为86.7％，总收得率为72.0％。

用大孔阴离子交换树脂D290或ZGA351代替D254和ZGA451可以同样取得以上的效果。

Claims (2)

1.利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法，包括：

(1)鲜蚯蚓或冷冻蚯蚓，在0.14mol/L NaCl溶液中匀浆并随即搅拌提取，防止数量占绝对优势、pI 1.0左右的DNA溶解或被细胞固有的DNA酶降解，随即离心或过滤除去DNA沉淀，得蚯蚓粗提液；

(2)无离子水调节蚯蚓粗提液的电导率1-5ml/Ω，再用大孔阴离子交换树脂进行静态或动态离子交换；

(3)用2.5-4.5mol/L pH5-6的NaCl溶液搅拌洗脱纤溶酶，或者0.5-4.5mol/L pH5-6的NaCl溶液梯度洗脱、收集纤溶酶洗脱峰；

(4)洗脱液用冷酒精或其它有机溶剂沉淀、有机溶剂脱水、真空干燥，或者洗脱液通过超过滤洗涤、浓缩，冷冻干燥，得蚯蚓纤溶酶；

2.根据权利要求1所述利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法，其特征在于，所用大孔阴离子交换树脂是指大孔强碱性阴离子交换树脂或大孔弱碱性阴离子交换树脂如D254、D290、ZGA351或ZGA451。