CN1308446C - 来自赤子爱胜蚓的蚯蚓纤溶酶多种组分的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蚯蚓纤溶酶多种组分及其分离、纯化、制备工艺，该工艺包括(1)粗分离：蚓激酶粗品过阴离子交换层析柱，得到三个活性峰，D1，D2，D3；(2)精细纯化：D1过阴离子交换层析柱，得到三个活性峰，每个活性峰分别过疏水层析柱得到纯品：EFE-f，EFE-e，EFE-d；D2过疏水层析柱，收集活性峰过阴离子交换层析柱纯化，得到活性组分EFE-a纯品；D3过疏水层析柱得到两个活性峰：D3H1、D3H2，将D3H1过阴离子交换层析柱纯化，得到活性组分EFE-b和EFE-c纯品；将D3H2过疏水层析柱收集活性峰，得到活性组分EFE-g的纯品。本发明的优点是：能系统地获得纯度和活性都较高的蚯蚓纤溶酶的七个组分，可满足实验室规模的制备，经适当放大可适应生产规模的制备。
Description
技术领域
本发明公开来自赤子爱胜蚓的蚯蚓纤溶酶多种组分的制备方法，属于生物化学制药技术领域。
背景技术
自从1983年日本Mihara等发现蚯蚓体内存在强烈溶解血纤维蛋白及血栓作用的蛋白酶以来(Mihara H，Sumi H，Akazawa T，et al.Fibrinolytic enzyme extracted from theearthworm.Thromb Haemostas，1983，50：258-263.)，蚯蚓纤溶酶在国内外得到了广泛的研究，并作为新型溶栓药物被应用于临床，中科院生物物理所以赤子爱胜蚓(Eisenia Fetida)为原料已制成用于预防和治疗血栓病的口服胶囊。该胶囊的主要成分(蚓激酶粗品)中含有多种活性组分。但是，到目前为止，蚯蚓纤溶酶究竟有多少种组分，哪种组分具有纤溶酶原激化物活性等重要问题并未得到详细的研究，各种组分的生化性质国内外的报道也并不一致(从玉文，刘耀明，陈家佩.蚓激酶的研究进展.中国生化药物杂志，2001，21(3)：159-162.)，除Mihara等1993年比较全面地报道了Lurnbricus rubellus蚯蚓纤溶酶各组分外，其它关于蚯蚓纤溶酶的报道都不够系统、深入。这使得对蚯蚓纤溶酶，特别是我国广泛使用的EiseniaFetida蚯蚓纤溶酶进行进一步系统、深入的研究成为必要，包括该酶各组分的生化性质、药理、药效、毒理实验以及蚯蚓纤溶酶的结构与功能的研究等，而对于所有这些研究，制备大量的蚯蚓纤溶酶各组分的纯品都是首要的前提。
CN1089369C的专利公开了一种蚓激酶粗品的制备方法，但是目前尚未见关于赤子爱胜蚓中蚯蚓纤溶酶各组分精确的分子量、N端序列、等电点以及可以规模化地从赤子爱胜蚓中系统地分离、纯化、制备蚯蚓纤溶酶各个组分生产工艺的报道。
发明内容
本发明的目的是提供来自赤子爱胜蚓的蚯蚓纤溶酶七种组分精确的分子量、N端序列和等电点。
本发明的另一个目的是提供一种以蚓激酶粗品为原料制备蚯蚓引纤溶酶各组分纯品的工艺，且制备工艺可根据需要逐级放大。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
蚯蚓纤溶酶多种组分及其分离、纯化、制备工艺，该工艺包括如下步骤：
(1)粗分离：溶解蚓激酶粗品，用阴离子交换层析柱进行粗分离，得到三个活性峰，D1，D2，D3；
(2)精细纯化：
D1过阴离子交换层析柱，得到三个活性峰：D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3，每个活性峰分别过疏水层析柱得到纯品：D1RQ1H即EFE-f，D1RQ2H即EFE-e，D1RQ3H即EFE-d；
D2过疏水层析柱，收集活性峰过阴离子交换层析柱纯化，得到一活性组分纯品，即EFE-a；
D3过疏水层析柱得到两个活性峰：D3H1、D3H2，将D3H1过阴离子交换层析柱纯化，得到两个活性组分纯品：D3H1M1即EFE-b，D3H1M2即EFE-c；将D3H2过疏水层析柱收集活性峰，得到一活性组分的纯品D3H2P1即EFE-g。
所述的阴离子交换层析柱选自DEAE柱、RESOURCE Q柱、SOURCE15Q柱和MonoQ柱。
所述的疏水层析柱选自RESOURCE ISO柱、RESOURCE PHE柱和SOURCE15PHE柱。
根据所述的工艺制备的蚯蚓纤溶酶多种组分，它们分别具有下列分子量(MOLDI-TOFMS测定值)、N末端序列和等电点值：
(1)EFE-a，24663，VIGGTNASPGEFPWQLQ，3.46；
(2)EFE-b，29515，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.50；
(3)EFE-c，29690，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.50；
(4)EFE-g，29595，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.46；
(5)EFE-d，24201，IIGGSNASPGEFPWQL，3.68；
(6)EFE-e，24170，IIGGSNASPGEFPWQL，3.62；
(7)EFE-f，23028，VVGGSDTTKGQYP，3.94。
本发明的优点是：1.首次公开了来源于赤子爱胜蚓的蚯蚓纤溶酶7种组分的精确分子量、N端序列、等电点；2.通过本流程可以系统地制备7个组分EFE-a、EFE-b、EFE-c、EFE-d、EFE-e、EFE-f、EFE-g。3.通过本流程制备的活性组分纯度较高。每种组分在15％的SDS-PAGE上均为一条带(见说明书附图)，高效液相层析呈现一个峰的水平(EFE-d、EFE-e除外)，在适宜条件下都可以结晶，表明其纯度较高，且处于活性形式。4.本流程制备的各组分用纤维平板法测得其纤溶活性从每mg250尿激酶活性单位到800尿激酶活性单位。5.本流程可以直接满足实验室规模的制备，对于生产规模的制备经适当调整相应放大后也可满足。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
附图说明
图1为本发明纯化组分的SDS-PAGE电泳图
具体实施方式
实施例1：蚯蚓纤溶酶多种组分的分离、提纯、制备工艺
一、材料：
1、蚓激酶粗品，中科院生物物理所蚯蚓纤溶酶研究组提供。
2、层析柱：HiPrep16/10DEAE柱，阴离子交换层析柱
RESOURCE Q(6ml)，阴离子交换层析柱
Mono Q HR5/5，阴离子交换层析柱
RESOURCE ISO，疏水层析柱
RESOURCE PHE，疏水层析柱
以上层析柱均购自Pharmacia Biotech公司。
3、溶液：(1)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5；
(2)20mmol/LTris-HCl Buffer，pH7.5，含1mol/L NaCl；
(3)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5；
(4)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl；
(5)0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，含3.0mol/L(NH4)2SO4；
(6)50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，含1.5mol/L(NH4)2SO4；
(7)50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0。
二、方法：
1、样品的准备：
取蚓激酶粗品5克，用20mmol/L pH7.5的Tris-HCl Buffer溶解，配成50mg/ml的溶液。
2、层析柱的使用：以下所用层析柱(均为Pharmacia Biotech公司预装柱)的使用均按照层析柱所附说明书进行。
3、粗分离：
采用HiPrep 16/10DEAE柱进行粗分离。每次取上述溶解好的样品4ml(200mg)上样。以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5为初始缓冲液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5，含1mol/LNaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为3ml/min，温度为19℃，得到三个活性峰，D1，D2，D3。
4、精细纯化：
(1)D1浓缩后对50mmol/L NH4HCO3透析，然后冻干。每次取冻干产物15mg溶解在20mmol/L pH8.5的Tris-HCl Buffer中，过RESOURCE Q(6ml)柱，以20mmol/L Tris-HClBuffer，pH8.5为初始缓冲液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/LNaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为3ml/min，温度为19℃，得到三个活性峰：D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3；
每个活性峰浓缩、换缓冲液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5后与含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH7.0等体积混合，然后过RESOURCE ISO柱，以50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0含1.5mol/L(NH4)2SO4，为初始缓冲液，50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0为洗脱缓冲液进行(NH4)2SO4梯度洗脱，流速为1ml/min，温度为23℃，得到纯品：D1RQ1H(即EFE-f)，D1RQ2H(即EFE-e)，D1RQ3H(即EFE-d)；
(2)D2浓缩后对50mmol/L NH4HCO3透析，然后冻干。每次取冻干产物3mg溶解在50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，含1.5mol/L(NH4)2SO4，中过RESOURCE ISO柱，以50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0含1.5mol/L(NH4)2SO4，为初始缓冲液，50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0为洗脱缓冲液进行(NH4)2SO4梯度洗脱，流速为1ml/min，温度为23℃，收集活性峰，浓缩、换缓冲液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5后过Mono Q HR5/5纯化，以20mmol/LTris-HCl Buffer，pH7.5为初始缓冲液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5，含1mol/L NaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为0.5ml/min，温度为19℃，得到一活性组分纯品，即EFE-a；
(3)将D3浓缩、换缓冲液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5后(总体积80ml)与含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/LNa-Pi Buffer，pH7.0等体积混合。每次取混合好的样品溶液1ml，上RESOURCE ISO柱，初始缓冲液为50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH7.0，洗脱缓冲液为50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0，采用(NH4)2SO4梯度洗脱，流速为1ml/min，温度为23℃，得到两个活性峰：D3H1、D3H2；
将D3H1浓缩、换缓冲液至20mmol/l Tris-HCl Buffer，pH7.5后过Mono Q HR5/5纯化，以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5为初始缓冲液，20mmol/l Tris-HCl Buffer，pH7.5，含1mol/LNaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为0.5ml/min，温度为19℃，得到两个活性组分纯品：D3H1M1(即EFE-b)，D3H1M2(EFE-c)；
将D3H2浓缩后对50mmol/L NH4HCO3透析，然后冻干。每次取冻干产物3mg溶解在50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH7.0中，过RESOURCE PHE，初始缓冲液为50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH7.0，洗脱缓冲液为50mmol/L Na-PiBuffer，pH7.0，采用(NH4)2SO4梯度洗脱，流速为1ml/min，温度为23℃，收集活性峰，得到一活性组分的纯品D3H2P1(即EFE-g)。
三、结果：
通过以上流程，得到各活性组分EFE-a 10.2mg，EFE-b 7.3mg，EFE-c 11.3mg，EFE-d14.2mg，EFE-e 8.6mg，EFE-f5.2mg，EFE-g 8mg。
实施例2：蚯蚓纤溶酶多种组分的分离、提纯、制备工艺
一、材料：
1、蚓激酶粗品，购自中国科学院生物物理所百奥公司。
2、层析柱：HiPrep16/10DEAE柱，阴离子交换层析柱，
RESOURCE Q(6ml)，阴离子交换层析柱
Mono Q HR5/5，阴离子交换层析柱
RESOURCE ISO，疏水层析柱
RESOURCE PHE，疏水层析柱
以上层析柱均购自Pharmacia Biotech公司。
3、溶液：(1)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5；
(2)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5；
(3)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl；
(4)0.1mol/L Na-Pi Buffar，pH7.0，含3.0mol/L(NH4)2SO4；
(5)50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，含1.5mol/L(NH4)2SO4；
(6)50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0；
二、方法：
2.样品的准备：
取蚓激酶粗品5克，用20mmol/L pH8.5的Tris-HCl Buffer溶解，配成50mg/ml的溶液。
3.层析柱的使用：以下所用层析柱(均为Pharmacia Biotech公司预装柱)的使用均按照层析柱所附说明书进行。
4.粗分离：
采用HiPrep 16/10DEAE柱进行粗分离。每次取上述溶解好的样品4ml(200mg)上样。以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5为初始缓冲液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为3ml/min，温度为19℃，得到三个活性峰，D1，D2，D3。
4.精细纯化：
(1)D1浓缩后换缓冲液至20mmol/L pH8.5 Tris-HCl Buffer(总体积26ml)，每次取750ul，过RESOURCE Q(6ml)柱，以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5为初始缓冲液，20mmol/l Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为3ml/min，温度为19℃，得到三个活性峰：D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3；
每个活性峰浓缩、换缓冲液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5后与含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH7.0等体积混合，然后过RESOURCE ISO柱，以50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0含1.5mol/L(NH4)2SO4，为初始缓冲液，50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0为洗脱缓冲液进行(NH4)2SO4梯度洗脱，流速为1ml/min，温度为23℃，得到纯品：D1RQ1H(即EFE-f)，D1RQ2H(即EFE-e)，D1RQ3H(即EFE-d)；
(2)将D3浓缩、换缓冲液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5后(总体积80ml)与含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH7.0等体积混合。每次取混合好的样品溶液1ml，上RESOURCE ISO柱，初始缓冲液为50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH7.0，洗脱缓冲液为50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，采用(NH4)2SO4梯度洗脱，流速为1ml/min，温度为23℃，得到两个活性峰：D3H1、D3H2；
将D3H1浓缩、换缓冲液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5后过Mono Q HR5/5纯化，以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5为初始缓冲液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl为洗脱缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为0.5ml/min，温度为19℃，得到两个活性组分纯品：D3H1M1(即EFE-b)，D3H1M2(EFE-c)；
将D3H2浓缩、换缓冲液至50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0后与含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH7.0等体积混合过RESOURCE PHE，初始缓冲液为50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH7.0，洗脱缓冲液为50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，采用(NH4)2SO4梯度洗脱，流速为1ml/min，温度为23℃，收集活性峰，得到一活性组分的纯品D3H2P1(即EFE-g)。
三、结果：
通过以上流程，得到各活性组分EFE-b 6.0mg，EFE-c 9.9mg，EFE-d 25.2mg，EFE-e 6.7mg，EFE-f2.7mg，EFE-g10.9mg。
备注：基于实验目的，本实施例未对EFE-a进行纯化；如需纯化，其方法同实施例1。
实施例3：蚯蚓纤溶酶多种组分的鉴定
1、分子量、N末端序列和等电点测定
通过以上流程制备的七种组分(EFE-a、EFE-b、EFE-c、EFE-d、EFE-e、EFE-f、EFE-g)的精确分子量(MOLDI-TOF MS测定值)、N端序列和等电点如下：
| 种类 | 分子量 | N端序列 | 等电点 |
| EFE-a | 24663 | VIGGTNASPGEFPWQLQ | 3.46 |
| EFE-b | 29515 | IVGGIEARPYEFPPQVSVR | 3.50 |
| EFE-c | 29690 | IVGGIEARPYEFPPQVSVR | 3.50 |
| EFE-g | 29595 | IVGGIEARPYEFPPQVSVR | 3.46 |
| EFE-d | 24201 | IIGGSNASPGEFPWQL | 3.68 |
| EFE-e | 24170 | IIGGSNASPGEFPWQL | 3.62 |
| EFE-f | 23028 | VVGGSDTTKGQYP | 3.94 |
2、纯度测定
按照常规操作进行SDS-PAGE电泳，凝胶浓度15％，点样量25ug/孔。结果如图1所示，其中1为Marker，2为EFE-f，3为EFE-e，4为EFE-d，5为EFE-a，6为EFE-b，7为EFE-c，8为EFE-g，每种组分在15％的SDS-PAGE上均为一条带。
对各组分进行高效液相层析，呈现一个峰的水平(EFE-d、EFE-e除外)，各组分在适宜条件下都可以结晶，表明其纯度较高，且处于活性形式。
3、活性测定
本流程制备的各活性组分用纤维平板法测得其纤溶活性从每mg250尿激酶活性单位到800尿激酶活性单位。
序列表
<110>中国科学院生物物理研究所
<120>蚯蚓纤溶酶多种组分及其分离、纯化、制备工艺
<130>
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>赤子爱胜蚓(Eisenia Fetida)
<220>
<221>EFE-a的N末端序列
<222>(1)..(17)
<223>VIGGTNASPGEFPWQLQ
<400>1
Val Ile Gly Gly Thr Asn Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Leu
1 5 10 15
Gln
<210>2
<211>19
<212>PRT
<213>赤子爱胜蚓(Eisenia Fetida)
<220>
<221>EFE-b的N末端序列
<222>(1)..(19)
<223>IVGGIEARPYEFPPQVSVR
<400>2
Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Pro Gln Val
1 5 10 15
Ser Val Arg
<210>3
<211>19
<212>PRT
<213>赤子爱胜蚓(Eisenia Fetida)
<220>
<221>EFE-c的N末端序列
<222>(1)..(19)
<223>IVGGIEARPYEFPPQVSVR
<400>3
Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Pro Gln Val
1 5 10 15
Ser Val Arg
<210>4
<211>19
<212>PRT
<213>赤子爱胜蚓(Eisenia Fetida)
<220>
<221>EFE-g的N末端序列
<222>(1)..(19)
<223>IVGGIEARPYEFPPQVSVR
<400>4
Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Pro Gln Val
1 5 10 15
Ser Val Arg
<210>5
<211>16
<212>PRT
<213>赤子爱胜蚓(Eisenia Ferida)
<220>
<221>EFE-d的N末端序列
<222>(1)..(16)
<223>IIGGSNASPGEFPWQL
<400>5
Ile Ile Gly Gly Ser Asn Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Leu
1 5 10 15
<210>6
<211>16
<212>PRT
<213>赤子爱胜蚓(Eisenia Fetida)
<220>
<221>EFE-e的N末端序列
<222>(1)..(16)
<223>IIGGSNASPGEFPWQL
<400>6
Ile Ile Gly Gly Ser Asn Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Leu
1 5 10 15
<210>7
<211>13
<212>PRT
<213>赤子爱胜蚓(Eisenia Fetida)
<220>
<221>EFE-f的N末端序列
<222>(1)..(13)
<223>VVGGSDTTKGQYP
<400>7
Val Val Gly Gly Ser Asp Thr Thr Lys Gly Gln Tyr Pro
1 5 10
Claims (1)
1.来自赤子爱胜蚓的蚯蚓纤溶酶多种组分的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)粗分离：溶解蚓激酶粗品，用HiPrep 16/10 DEAE阴离子交换层析柱进行粗分离，得到三个活性峰，D1，D2，D3；
(2)精细纯化：
D1过阴离子交换层析柱RESOURCEQ柱，得到三个活性峰：D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3，每个活性峰分别过疏水层析柱RESOURCE ISO柱得到纯品：D1RQ1H即EFE-f，D1RQ2H即EFE-e，D1RQ3H即EFE-d；
D2过疏水层析柱RESOURCE ISO柱，收集活性峰过强阴离子交换层析柱Mono Q柱纯化，得到一活性组分纯品，即EFE-a；
D3过疏水层析柱RESOURCE ISO柱得到两个活性峰：D3H1、D3H2，将D3H1过阴离子交换层析柱Mono Q柱纯化，得到两个活性组分纯品：D3H1M1即EFE-b，D3H1M2即EFE-c；将D3H2过疏水层析柱RESOURCE PHE柱收集活性峰，得到一活性组分的纯品D3H2P1即EFE-g。
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| CN101544968B (zh) * | 2009-05-06 | 2010-12-08 | 南京农业大学 | 一种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法 |
-
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- 2002-12-05 CN CNB021538484A patent/CN1308446C/zh not_active Expired - Fee Related
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| Characterization of Potent Fibrinolytic Enzymes in Earthworm Lumbricus rubellus BIOSCI BIOTECH BIOCHEM,Vol.57 No.10 1993 * |
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Application publication date: 20040616 Assignee: Kaiping Genuine Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. Assignor: Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences Contract record no.: 2010440000368 Denomination of invention: Earthworm plasmin multi-component and the separating, purifying and preparing technology thereof Granted publication date: 20070404 License type: Exclusive License Record date: 20100412 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070404 Termination date: 20111205 |