CN100344769C - 一种制备低分子量肝素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备低分子量肝素的方法。本发明的制备低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解肝素，得到低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白，是具有序列表中的SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明的方法采用具有较高酶活的麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白制备肝素，通过控制降解时间，得到具有理想平均分子量和分子量分布较窄的低分子量肝素寡糖。本发明为低分子量肝素的酶法工业化生产提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备低分子量肝素的方法，特别涉及一种利用肝素酶I融合蛋白MBP-HepA制备低分子量肝素的方法。
背景技术
肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖重复单位的线形链状结构，其分子量在3000-37000之间，平均分子量为15000。自1916年首次发现肝素以来，其在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂的应用越来越受到人们的关注。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用，从而大大限制了肝素在临床上的应用。
低分子量肝素(低分子量肝素寡糖)(简称LMWHs)(Robert J.Linhardt，PH.D.AndNur Sibel Guany，M.S，Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25(3)：5-16)是在分离普通肝素时得到的一些低分子量组分，或肝素裂解后产生的小分子片段，长度约为普通肝素的1/3。LMWHs分子量在3000-8000Da之间，平均分子量为5000Da左右。与普通肝素相比，通过体内、外实验发现，在同等剂量下，LMWHs的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于肝素。此外，LMWHs还具有一些其它优势，如分子量小，生物利用度高，血浆半衰期长；不与肝素结合蛋白结合，因此有更稳定的量效关系，按体重给药，控制剂量，不需要进行实验室监测；较少与血小板结合，不易引起血小板减少。所以LMWHs既能有效防止血栓形成，又能减少出血等不良反应，是一种安全有效的抗血栓药物，可作为肝素的替代物。不同聚合度(dp)的肝素寡糖能和不同蛋白因子作用，从而呈现不同的生物学作用。分子量分布范围窄，相对比较均一的LMWHs的药效较好。在对LMWHs进行质量控制方面，各生产单位均规定了其平均分子量及分子量分布范围。所以，生产所需平均分子量的LMWHs及分子量分布范围窄的肝素寡糖，具有重要的意义。
目前，LMWHs的制备方法(张万忠，王云山，马润宇，苏志国，国生化药物杂志，2001，22(1)：48-51)主要有化学裂解法和酶降解法。化学降解法是工业上常采用的方法，主要有亚硝酸降解法、β-消去降解法、过氧化氢降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和γ-照射法等。但是，化学裂解肝素反应剧烈，使得肝素分子中的某些功能基团在反应过程中或多或少地被破坏，因而，某些生物活性功能在不同程度被或多或少的破坏。而酶降解法由于反应条件温和、产率高及对环境无毒性，成为许多糖生物学研究工作者的研究热点。美国专利(Nielsen，US 5106734，1992)利用232nm处的吸光度值控制产品质量，可制备出具有理想平均分子量的低分子肝素产品。于广利等(于广利，王群，管华诗，徐家敏，Robert J.Linhardt， 青岛海洋大学学报，2002，32(2)：231-235)利用肝素酶对牛肺肝素进行控制酶解，得到了聚合度2～20的寡糖纯品。高宁国等(高宁国，程秀兰，杨敬，张树政，微生物学报，1999，39(1)：64-67)筛选出了一种能产肝素酶的鞘胺醇肝菌，并利用所产生的酶降解肝素，得到了一系列具有抗平滑肌增生活性而抗凝活很低的肝素寡糖。但是，这些方法中所用到的肝素酶需要经过多步的纯化步骤，收率较低，造成酶的成本非常昂贵(肝素黄肝菌产生的商品肝素酶的价格为40美元/U)，限制了酶法制备低分子肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的途径，但通常情况下重组肝素酶I极容易形成包涵体，需要复杂的复性过程才能形成活性蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备低分子量肝素的方法。
本发明所提供的制备低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)降解肝素，得到低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)，是具有序列表中的SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。
序列表中的序列1由756个氨基酸残基组成。
所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)可按照以下方法制备：将pMal-hepA转化大肠杆菌TB1，得到含有pMal-hepA的重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，培养重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，诱导表达，得到麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)；所述pMal-hepA是将具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列的所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)编码基因插入pMal-p2x或pMal-c2x载体的BamHI和PstI识别位点间得到的重组载体。
序列2中的DNA序列由2271个脱氧核苷酸组成，该基因的编码序列为自5’端第1到第2271位脱氧核苷酸。
所述肝素可从商业途径获得，也可按照现有的方法合成。
所述肝素的初始浓度为1-100g/l，优选为25g/l。
用于溶解所述肝素的溶剂可为含3.5mM Ca(CH3COO)2和0.05％NaN3的pH为6.5-8.0浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液。
所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量为1.875-187.5IU/g底物，优选为7.5IU/g底物。
所述方法中，反应温度可为10-45℃，优选为15-20℃。
所述方法中，反应时间为6-12小时。
反应时间优选为9-12小时；尤其优选为9小时。
所述方法中，可按照以下方法纯化低分子量肝素：终止反应后将混合物进行截留分子量为10000Da的超滤，将得到的滤液利用TSK-GEL G2000SW柱进行凝胶过滤层析，收集保留时间为18-20分钟的洗脱峰，得到低分子量肝素；所述凝胶过滤层析中所用的缓冲液为含质量百分含量为0.05％的NaN3，pH为7.0浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液，所述缓冲液的流速为0.5ml/min。
本发明的方法采用具有较高酶活的麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白制备肝素，由于麦芽糖结合蛋白具有和麦芽糖亲和吸附的能力，因此重组表达MBP-HepA有利于肝素酶的分离纯化，一步纯化就可以得到纯度为95％左右的MBP-HepA，从而可以大大降低酶的分离纯化成本；利用麦芽糖结合蛋白(MBP)的亲和吸附能力，可以很容易实现肝素酶I的定向固定化，使酶的反复使用成为可能，从而提高酶反应效率，降低酶的使用成本；从而降低低分子量肝素的生产成本。本发明通过控制酶解反应时间，得到了分子量分布范围窄的低分子量肝素(平均分子量在5000-6000)。由于MBP-HepA的生产、分离纯化和使用成本可以大幅度的降低，因此利用该融合蛋白生产具有理想平均分子量且分子量分布范围窄的低分子量肝素的方法具有巨大的工业应用价值。
附图说明
图1为表达载体pMal-hepA的构建过程示意图
图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱
图3为凝胶色谱中分子量与停留时间的标准曲线图
图4为MBP-HepA降解肝素6小时所得肝素寡糖的凝胶色谱图
图5为MBP-HepA降解肝素9小时所得肝素寡糖的凝胶色谱图
图6为MBP-HepA降解肝素0.5小时所得肝素寡糖的凝胶色谱图
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-HepA)的获得
1、含有肝素酶I编码基因的表达载体pMal-hepA的构建
表达载体pMal-hepA的构建过程如图1所示，具体过程如下：从肝素黄杆菌Flavabacterium heparinum(购买自IAM)的染色体组DNA中扩增肝素酶I基因，所用的上下游引物分别为5’GCCT
GGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’(带下划线的碱基为BamHI的酶识别位点)，5’GCTT
CTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’(带下划线的碱基为PstI酶识别位点)，分别引入BamHI和PstI酶识别位点，50μL扩增反应体系为：50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司)，200μmol/L每种dNTP，1单位高保Pfu酶；扩增程序为：95摄氏度变性5分钟，50-60摄氏度引物退火45秒，72摄氏度引物延伸90秒，30个循环后，72摄氏度延伸5分钟结束反应。该PCR结果如图2所示，表明扩增得到1.1kb的肝素酶I基因片段。图2中，1-6分别为引物退火温度为50、51、53、55、58或59℃扩增结果，7为分子量marker 15kb，箭头所指处为1.1kb目标片断。
将pMal-p2x或pMal-c2x载体(购自NEB公司))和PCR产物分别用BamHI和PstI双酶切，用T4DNA连接酶连接，转化JM109，以5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC3’和5’GCTTCTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’为引物，通过菌落PCR筛选转化子，提取可得到1.1kb PCR产物的转化子中的质粒通过BamHI和PstI双酶切验证。将通过BamHI和PstI双酶切得到1.1kb片段的质粒进行测序，将含有具有序列表中序列2的核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白编码基因MBP-HepA的质粒命名为pMal-hepA。
将pMal-hepA转化大肠杆菌TB1，得到两株含正确连接的重组质粒载体菌株，其中一株命名为重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)。
2、肝素酶I融合蛋白MBP-HepA的表达
将重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)在LB培养基(含100μg/ml Amp)37℃培养3小时，加入1mM IPTG，于15℃，200rpm进行诱导培养21小时，得到的培养液在4℃，10000rpm离心10min，收集菌体，用pH为7.0浓度为0.017M(0.017mol/L)含0.2M NaCl的Tris缓冲液洗涤菌体2次，按每2ml菌液离心得到的菌体加入1mlTris缓冲液的比例，将菌体悬浮在相同的缓冲液中，在冰浴中超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理99次)。细胞破碎液在4℃，13000rpm离心30min，取上清液得无细胞粗提酶液。测定粗提酶液的酶活力，酶活的检测采用232nm的光吸收法，1IU的酶活的定义为30℃每小时降解1mg底物肝素所需要的蛋白量。结果表明比活力为10.69IU/mg培养液。
3、肝素酶I融合蛋白MBP-HepA的一步纯化：用pH为7.0浓度为0.017M含0.2MNaCl的Tris缓冲液平衡2ml的直链淀粉(amylose)亲和分离柱，上清液以0.5ml/min的速度通过亲和柱，再用含10mM麦芽糖的10mM的Tris缓冲液洗脱，收集具有酶活性部分，得2ml酶液。
4、肝素酶I融合蛋白MBP-HepA活力的测量：酶活的检测采用232nm的光吸收法，1IU的酶活的定义为30℃每小时降解1mg底物肝素所需要的蛋白量。取肝素底物溶液0.5ml，加入步骤3中纯化的酶液，其它体积以Tris缓冲液补充，最终的反应液体积为1.5ml，测单位时间内在232nm的吸光度变化ΔA232。消光系数ε＝3800M-1。测定结果表明纯化得到的麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白比活力为15.57IU/mg培养液。经过步骤3的一步纯化得到纯度为95％的MBP-HepA。
实施例2、低分子量肝素寡糖的制备
1、标准曲线的制作
低分子量肝素寡糖平均分子量的测定方法如下：以葡聚糖标准品(sigma)，通过凝胶过滤层析(TSK-GEL G2000SW，TOSOH公司，日本)，得到分子量与停留时间的标准曲线，如图3，(标准品为葡聚糖标准品，分子量分别为1000Da，5000Da，12000Da，25000Da)。其中，该凝胶过滤层析中所用的缓冲液为含质量百分含量为0.05％的NaN3，pH为7.0浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液；该缓冲液的流速为0.5ml/min。
平均分子量的计算公式为
其中，Mr为平均分子量，Mwi为各峰对应物质的分子量，Ai为各峰面积。
2、生产低分子量肝素
以商品肝素(北京鼎国，效价150U/mg)为原料，所用的肝素溶液为将商品肝素加入到含3.5mM Ca(CH3COO)2，0.05％ NaN3，pH7.0的浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液中，使肝素的浓度为25g/l。取495μl肝素溶液，加入5μl一步纯化的MBP-HepA酶液(18.6IU/ml)，反应液于15℃摇床上分别反应6小时和9小时后，此时吸光度值A232分别为0.638，和0.908，于100℃的金属浴中3-5min终止酶反应。反应过程中每隔0.5h，取15μl反应液，加入1485μl 30mM的HCl终止反应，测定A232以监测反应过程。反应液经截留分子量为10000的超滤膜滤除去大分子肝素和酶蛋白后，利用凝胶过滤层析(TSK-GEL G2000SW，TOSOH公司，日本)分析其分子量分布。该凝胶过滤层析中所用的缓冲液为含质量百分含量为0.05％的NaN3，pH为7.0浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液，该缓冲液的流速为0.5ml/min。用紫外检测器测定A232，分别得到了6h反应液与9h反应液的色谱图，反应6h得到的肝素寡糖混合物的色谱图(图4)中出现了三个主要峰，根据分子量与停留时间的标准曲线，得出各峰对应的分子量(如表1)。从表1可以看出，在混合物中，分子量小于8000的峰主要有两个，所占的峰面积百分比18.13％和31.15％，两者总和占总峰面积的一半。根据公式(1)，得出反应6h得到的肝素寡糖的平均分子量为6176.7。
表1反应6h后的图4的肝素寡糖色谱图中各峰对应的主要参数
| 保留时间(min) | 分子量(Da) | 峰面积％ | |
| 峰1 | 17.85 | 9609.1 | 18.13 |
| 峰2 | 18.45 | 7470.1 | 31.15 |
| 峰3 | 19.42 | 4022.6 | 47.60 |
| 平均分子量为6176.7 | |||
反应9h得到的肝素寡糖混合物的色谱图(图5)中出现了两个主要峰，各峰对应的分子量如表2所示。从表2可以看出，这两个峰的分子量都小于8000，分别为7202.7、3933.5，所占的峰面积分别为37.51％和61.11％。根据公式(1)，得出反应9h得到的肝素寡糖的平均分子量约为5176.8。
表2反应9h后的图5肝素寡糖色谱图中各峰对应的参数
| 停留时间(min) | 分子量(D) | 峰面积％ | |
| 峰1 | 18.53 | 7202.7 | 37.51 |
| 峰2 | 19.44 | 3933.5 | 61.11 |
| 平均分子量为5176.8 | |||
而对于反应0.5h得到的肝素寡糖混合物的色谱图(图6)，出现了四个主要峰，而且出峰时间比图4、5都要早，表明降解反应不充分，一些分子量较大的肝素寡糖未降解成分子量更低的肝素寡糖。所以控制酶反应时间是得到理想平均分子量的肝素寡糖混合物的主要因素之一。
本实施例说明MBP-HepA能和商品肝素酶一样有效的降解肝素，通过控制酶降解反应时间，能够得到具有理想平均分子量的低分子量肝素寡糖。
序列表
<160>2
<210>1
<211>756
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
370 375 380
Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Gly Ser Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn
385 390 395 400
Ile Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala
405 410 415
Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala
420 425 430
Leu Gln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg
435 440 445
Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly
450 455 460
Glu Thr Lys Gly Arg Thr Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn
465 470 475 480
Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu
485 490 495
Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser
500 505 510
Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn
515 520 525
Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala Pro Ser Arg Thr Leu
530 535 540
Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe
545 550 555 560
Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile Ala His Asp
565 570 575
Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly
580 585 590
Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala
595 600 605
Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg
610 615 620
Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn
625 630 635 640
Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile
645 650 655
Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr
660 665 670
Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr
675 680 685
Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn
690 695 700
Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile
705 710 715 720
Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg
725 730 735
Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser
740 745 750
Glu Thr Ala Arg
755
<210>2
<211>2271
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140
aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatccc agcaaaaaaa atccggtaac 1200
atcccttacc gggtaaatgt gcaggccgac agtgctaagc agaaggcgat tattgacaac 1260
aaatgggtgg cagtaggcat caataaacct tatgcattac aatatgacga taaactgcgc 1320
tttaatggaa aaccatccta tcgctttgag cttaaagccg aagacaattc gcttgaaggt 1380
tatgctgcag gagaaacaaa gggccgtaca gaattgtcgt acagctatgc aaccaccaat 1440
gattttaaga aatttccccc aagcgtatac caaaatgcgc aaaagctaaa aaccgtttat 1500
cattacggca aagggatttg tgaacagggg agctcccgca gctatacctt ttcagtgtac 1560
ataccctcct ccttccccga caatgcgact actatttttg cccaatggca tggtgcaccc 1620
agcagaacgc ttgtagctac accagaggga gaaattaaaa cactgagcat agaagagttt 1680
ttggccttat acgaccgcat gatcttcaaa aaaaatatcg cccatgataa agttgaaaaa 1740
aaagataagg acggaaaaat tacttatgta gccggaaagc caaatggctg gaaggtagaa 1800
caaggtggtt atcccacgct ggcctttggt ttttctaaag ggtattttta catcaaggca 1860
aactccgacc ggcagtggct taccgacaaa gccgaccgta acaatgccaa tcccgagaat 1920
agtgaagtaa tgaagcccta ttcctcggaa tacaaaactt caaccattgc ctataaaatg 1980
ccctttgccc agttccctaa agattgctgg attacttttg atgtcgccat agactggacg 2040
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Claims (13)
1、一种制备低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解肝素，得到低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白按照以下方法制备：将质粒pMal-hepA转化大肠杆菌TB1，得到含有pMal-hepA的重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，培养重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，诱导表达，得到麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白；
所述pMal-hepA是将具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列的所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白编码基因插入pMal-p2x或pMal-c2x载体的BamHI和PstI识别位点间得到的重组载体。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述肝素的初始浓度为1-100g/l。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述肝素的初始浓度为25g/l。
5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：用于溶解所述肝素的溶剂为含3.5mMCa(CH3COO)2和0.05％NaN3的pH为6.5-8.0浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液。
6、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量为1.875-187.5IU/g底物。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量为7.5IU/g底物。
8、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，反应温度为10-45℃。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，反应温度为15-20℃。
10、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，反应时间为6-12小时。
11、根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述反应时间为9-12小时。
12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述反应时间优选为9小时。
13、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，按照以下方法纯化低分子量肝素：终止反应后将混合物进行截留分子量为10000Da的超滤，将得到的滤液利用TSK-GEL G2000SW柱进行凝胶过滤层析，收集保留时间为18-20分钟的洗脱峰，得到低分子量肝素；所述凝胶过滤层析中所用的缓冲液为含质量百分含量为0.05％的NaN3，pH为7.0浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液，所述缓冲液的流速为0.5ml/min。
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