CN1421464A - 低分子肝素钠（钙）及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种低分子肝素钠(钙)及其制备方法，特征是：将精品肝素裂解技术不用化学裂解技术，而用生物酶解聚及超滤手段，对精品肝素进行二次Elastase酶裂解、二次超滤即采用中空纤维超滤器进行循环超滤，然后加热70℃～80℃除菌滤后，真空干燥或冷冻干燥制得低分子肝素钠(钙)，由本方法获得的低分子肝素钠(钙)溶血栓活力单位在100～125国际单位/毫克；抗凝血活力单位在25～35国际单位/毫克；产品平均分子量在3500～5500；成品溶液的吸收度在波长280nm处为0.060～0.080、波长260nm处为0.040～0.050，本发明的方法反应温和，天然物质纯度高，操作简便，无三废污染，适于工业化生产的一种新技术，产品溶血栓活力高、抗凝血活力低的无菌、无热源、无杂质，透光率均达到国际领先水平。

Description

低分子肝素钠(钙)及其制备方法
一、技术领域：
本发明公开了一种名为低分子肝素钠(钙)(LMWH)的生物制品及其制备方法。本制备方法属于一种生物药品的制备方法。
二、背景技术：
低分子肝素(LMWH)是一种天然的抗凝和抗血栓药物，是普通肝素(SH)的衍生物，它的商品有低分子肝素钠及低分子肝素钙。低分子肝素(LMWH)为由己糖氨的N-磺酸盐或乙酰化物与己糖酰酸(艾杜糖或葡萄糖酰酸)二糖聚合物的钠盐或者钙盐。分子量2500-8000。本品在医学上用于预止手术引起的血栓塞，静脉血栓塞和全身栓塞性疾病，在心血管疾病、血液透析、休克和Dic急性缺血性脑萃中，量效关系明确，具有广泛的临床用途。
人们已知肝素(SH)是一种粘多糖类药物，应用已有半个多世纪了，随着研究的深入发展，发现肝素(SH)不仅具有抗凝，抗血栓作用，还具有独特的抗炎、抗过敏、抗病毒和降血脂作用，然而肝素在应用中有比较严重的出血副作用。这种副作用高达35％，这样在相当程度上限制了肝素(SH)的使用。多年来医学界一直在寻找一种抗凝作用低、抗血栓作用强的肝素类制品。
近年来，美国和欧洲医学界成功地从普通SH中分离出了较小SH片断(LMWH)具有与SH同样的抗Xa因子作用。而活化凝血活酶时间(APTT)缩短。LMWH体现出比SH生物利用率高，血浆半衰期长的优点。然而国外的LMWH的工业化生产一般采用化学解聚技术，如亚硝酸钠工艺等方法，产品质量不稳定，成本高，且产生较大的三废。
三、发明内容：
本发明的目的是公开一种低分子肝素钠(钙)的制备方法，它不用化学裂解技术，而用生物酶解聚及超滤手段，此方法，反应温和，天然物质纯度高，操作简便，无三废污染。
本发明是这样实现的。本发明对肝素(SH)进行二次内切酶裂解，二次超滤技术，然后加热70℃-80℃除菌滤后，真空干燥或冷冻干燥制得低分子肝素精品。
(一)、工艺路线(见附图)
(二)、工艺过程(按以下次序进行)
1.将精品肝素(无热原、无菌)按重量的10倍量加入无热原1％的氯化钠(氯化钙)溶液中，不断搅拌使其全部溶解，再继续搅拌1小时。(“无热原”名词它是医药产品的专用名词，热原意思即是致热物质，动物体内的细菌内毒素。)
2.溶液用1N NaOH(Ca(OH)2)调PH8.5-9.0，然后在不断搅拌中加入Elastase酶[按肝素钠活力单位的3.5％计(即每1000万单位肝素加入35万单位)]缓缓升温至35℃-40℃，保温22小时。
3.次入用布氏漏斗过滤清液体后，调PH11.5-11.7升温至90℃±5℃，保温30分钟，然后迅速冷却到25℃±调PH6.5±0.1。
4.用中空纤维超滤器，分子量6000膜，进行循环超滤，收集外透液。
5.超至浓缩液的原体积的1/10量，再补充无热原的含1％氯化钠(氯化钙)溶液到原体积。
6.含1％氯化钠溶液用1N NaOH(Ca(OH)2)调PH8.5-9.0，然后在不断搅拌中加入Elastase酶，加酶量是第一次的1/3，缓缓升温至35℃-40℃，保温18小时。
7.次日用布氏漏斗过滤清液体后，调PH至11.5-11.7升温90℃±5℃保温30分钟，然后冷却到25℃±，调整PH6.5±0.1。
8.用中空纤维超滤器分子量6000膜，进行循环超滤超至原体积十分之一以后，收集外透液(浓缩液作为下批投料回收用)。
9.合并④与⑧的二次超滤外滤透液用HCL(HAC)调PH6.0-6.5，用0.2M无菌膜及板框压滤后(直接冻干)。
10.加入等倍量无热原酒精搅拌20分钟后静置在5℃-10℃冷室过夜。
11.次日虹吸出上清废乙醇(可回收)，沉淀物用无水乙醇(或丙酮)、搅拌、洗涤2-3次后，离心、收集沉淀物。
12.沉淀物放在无菌无热原盘中，进入真空干燥箱用五氧化二磷，真空干燥36小时以上。
13.干燥品装袋，称重后抽样，按EP2000版进行全项化验。
本发明能够工业化生产中运用二次，Elastase酶，在碱性条件下水解肝素精制品，然而用中空纤维超滤膜超滤所得的低分子肝素成品。经过药品测试所得测定：LMWH的溶血栓(Fxa)因子活力单位稳定在100-125国际单位/毫克。抗凝血(FIIa)的活力单位，则控制在每毫克25-35国际单位。产品的平均分子量3500-5500范围内，此种分子量占产品的68-88％之间。本发明的产品Fxa与FIIa的比值一般在3.3-5.3之间。大多可达到3.3-5.3之间；本发明的操作过程(不受外因干扰)产品全部达到无菌无热原。本发明产品仍可保持肝素精品所具有的一些理化指标。溶解度、澄清度，均达国内外优级产品指标，在波长280nm、吸收度(OD值)规定为0.20以下，而本发明产品在0.060-0.080，在波长260nm、OD值规定为0.15以下，而本发明产品在0.040-0.050。本发明因为用生物酶作为解聚技术制造LMWH。因此在产品制造过程中不含有害于人体的亚硝酸盐及硼类物质。
本申请人在2000年9月7日申请了名为一种肝素及其制备方法的发明专利，专利号为00125093.0，它的主要核心技术是从哺乳动物的肠粘膜中提取并纯化出一种名叫做肝素钠的生物制品，这种物质的纯品对人体有抗凝血的作用，临床上有广泛用途。
而本发明是用上述纯品再进行进一步的生物化学裂解，使它产生一种小分子的片断，它的生物特性发生了质的变化，即原来抗凝血效价明显减少，而出现了一种在血浆中溶解血栓特殊效价，临床医学用途可作为深部静脉血栓(DVT)的预防，急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛的治疗。
本发明与上述专利不同点在于以下几个方面：
1、本发明起始原料为专利申请号00125093.0中陈述的成品(精制品)进行分解的起始原料为从哺乳动物肠粘膜中提取和提纯的一种物质。
2、本专利发明的低分子肝素(伊诺肝素)与普通肝素(原专利)从分子结构及理化性质都存在明显区别，欧洲药典及英国药典已经分别收载了不同类型的低分子量肝素及普通肝素，中国药典目前仅仅记载了普通肝素药品。
3、本发明在说明书中发表了一种E酶(内切水解酶)方法来裂解普通肝素的链，这与专利号00125093.0中陈述用酶水解普通肝素有根本的区别，内切水解酶是用来切断普通肝素的长链，使其成分子片断，而00125093.0专利号中水解蛋白酶是用来消化杂蛋白杂质，从而纯化肝素的目的。
4、本发明在说明书中陈述LMWH最终产品的单位效价(活力单位)与00125093.0专利号中每毫克170国际单位完全不一样，LMWH的活力单位表现在Fxa因子活力单位，而SH(普通肝素)为抗凝血活力，同时提及在波长280nm及260nm波长时，这是分别指二个不同性质产品在相同波长上检验其所夹带的杂蛋白及不明核酸物质吸收度。
5、本发明是专利号00125093.0发明的肝素的衍生物，一种用生物技术重新裂解制造的新药品，其在用途及性质上已与肝素有很大的区别，详见情况表。
                附表：普通肝素与LMWH的比较
                  普通肝素                          LMWH
分子量          10000～56000                      3000～7000
抗Fxa活性            ++                              ++++
抗FIIa活性          ++++                              ++
作用持续时间        4～5h                            ＞24h
与血小板结合能力    ++++                               +
与内皮细胞结合能力  ++++                               +
被清除率             +++                               +
活化纤溶作用          +                               +++
对PF4、HRGP作用      +++                               +
对鱼精蛋白作用      ++++                               +
ATII结合力           +++                             ++++
延长APTT            ++++                              ++
出血倾向            ++++                               +
致血小板减少         +++                               +
四、附图说明：
附图为本发明工艺路线方框图
备注：Elastase酶是一种从哺乳动物胰脏中提取的一种活化蛋白酶。每毫克的活力单位应大于80Elastase酶单位。
五、具体实施方式：
实施例：
称取精品肝素钙25亿单位(每毫克175国际单位)14.3公斤，放入200升的反应锅内，加入143Kg无热原纯水，同时加入无热原氯化钙1.43Kg，不断搅拌，使其全部溶解。搅拌1小时。(测PH7.15)用1-2N Ca(OH)2调PH8.5-9.0，然后在不断搅拌中加入Elastase酶8750万u(每毫克89E单位)重量983克。在不断搅拌中缓缓升温至35℃-45℃，保温22小时，用布氏漏斗过滤清液体145.2升，调PH11.5-11.7升温至到96℃保温30分钟，然后迅速冷却到25℃，用HAC调PH到6.55。用中空纤维超滤器，分子量6000膜，进行循环超滤，收集外透液约130.5升，另外存放。其余约17升浓缩液，加入128.7升无热原纯水，同时加入无热原氯化钙1.45Kg；充分搅拌后，用1-2N Ca(OH)2调PH8.5-9.0，缓缓加入Elastase酶2917万u(每毫克89E单位)重量为328克。在不断搅拌中缓缓升温至35℃-45℃，保温18小时，用布氏漏斗过滤清液体共145.7升，调PH11.5-11.7，升温至90℃±5℃保温30分钟，然后冷却到25℃±调整PH6.5±0.1，再用中空纤维超滤器分子量6000膜，进行循环超滤，超出外透液共130升(其余浓缩液，置冰箱下次生产回收用)与第一次超滤外透液合并共258.7升。冷却到5℃-10℃后，用0.2M除菌板板框压滤后的清液256升，再用-10℃95％药用酒精262升，在反应锅中，缓缓加入256升外透液。搅拌20分钟后，静置过夜，次日虹吸上清废乙醇。沉淀物离心收集再用无水乙醇(或丙酮)脱水2-3次，放入无热原盘中，五氧化二磷、真空干燥48小时，即开箱收成品，共得低分子肝素钙成品10.65Kg。经化验检出Fxa活力单位为每毫克121.5国际单位，FIIa活力单位为每毫克26.8国际单位，Fxa比FIIa比值为4.53，平均分子量为5100，2000-8000分子量占78％。研制出了一种称为伊诺型的低分子量肝素。
本发明研制出了一种称为低分子肝素的物质及为一种独特的酶解超滤工艺的生产技术。本发明所获得的低分子肝素，质量达到了溶血栓活力高，抗凝血活力低的无菌、无热原、无杂质，透光率均达到国际领先水平，且操作简便，并适合于工业化生产的一种新颖技术。

Claims (4)

1、一种低分子肝素钠(钙)的制备方法，包括将精品肝素裂解、加热、除菌滤、干燥，其特征在于：精品肝素裂解技术不用化学裂解技术，而用生物酶解聚及超滤手段，对精品肝素进行二次Elastase酶裂解、二次超滤即采用中空纤维超滤器进行循环超滤，然后加热70℃～80℃除菌滤后，真空干燥或冷冻干燥制得低分子肝素钠(钙)。
2、根据权利要求1所述的低分子肝素钠(钙)的制备方法，其特征在于：所述的中空纤维超滤器，分子量6000膜。
3、根据权利要求1或2所述的低分子肝素钠(钙)的制备方法，其特征在于：所述真空干燥箱用五氧化二磷，真空干燥时间≥36小时。
4、一种由上述权利要求制备方法所获得低分子肝素钠(钙)，其特征在于：低分子肝素钠(钙)溶血栓活力单位在100～125国际单位/毫克；抗凝血活力单位在25～35国际单位/毫克；产品平均分子量在3500～5500；成品溶液的吸收度在波长280nm处为0.060～0.080、波长260nm处为0.040～0.050。
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