CN111733150B - 一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，属于酶分离纯化技术领域。分离纯化方法为：从猪胰中提取粗胰酶，向600‑700份水中加入1‑2份冰醋酸，再加入20‑30份粗胰酶和20‑30份聚乙二醇，在10‑20℃条件下静置12‑16h；板框压滤静置后的混合液获得清液；将清液上样至阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠洗脱；将洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，静置分相；取分相后的有机相加入等体积的反萃取水相，漩涡混合，静置分相；取分相后的水相加入稳定剂冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。本申请获得的胰激肽原酶具有较高的酶活力和纯度，且分离纯化方法操作简单，原料成本低廉，特别适合工业大生产。

Description

一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法
技术领域
本申请涉及酶分离纯化技术领域，特别涉及一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法。
背景技术
胰激肽原酶也称胰激肽释放酶，是丝氨酸蛋白酶家族的一员,但和典型丝氨酸蛋白酶不同的是其专一性较强,对酪蛋白、血红蛋白等常见蛋白质底物几乎不起作用,而专一的作用于蛋白质底物激肽原而释出激肽。
激肽释放酶分为血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。组织激肽释放酶是一种单链的酸性糖蛋白,平均分子量范围是25-45KD，等电点为4.05。组织激肽释放酶最初的形式是激肽释放酶原,它以激肽释放酶原的形式在组织中合成,然后被释放到组织液中,经过胰蛋白酶、内毒素激活就形成了活性的激肽释放酶。激活的组织激肽释放酶作用于低分子量的组织激肽原,生成活性产物胰激肽,也称血管舒缓素或赖氨酸缓激肽,后者可以进入组织毛细血管,经过毛细血管中的氨基肽酶水解去掉赖氨酸后就形成了活性更强的缓激肽从而发挥作用。所以，组织激肽释放酶可以使毛细血管和动脉血管舒张以及通透性增加,使冠状动脉、脑、视网膜处的血流供应增加,适用于高血压冠状血管以及动脉血管硬化等症,对心绞痛、血管痉挛、血栓性闭塞性脉管炎、冻疮以及创伤等症也有作用。同时，激肽释放酶通过与其它血管活性物质相互作用,参与肾脏功能调节,降低血压,促进电解质和葡萄糖的转运。激肽释放酶也可以作为活化因子,使纤溶酶原激活成纤溶酶,将不溶性的纤维蛋白水解成可溶性的小肽,从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等起到治疗作用,并用于治疗血栓、预防血栓再形成。
目前临床用药主要是从组织中提取激肽释放酶，组织激肽释放酶以猪胰激肽释放酶为主。猪胰激肽释放酶纯化技术研究已有近30年的历史，主要以猪胰脏的丙酮粉或胰酶为原料提取激肽释放酶。纯化方法主要有有机溶剂分级沉淀法、离子交换层析法和亲和层析法。有机溶剂沉淀法对酶蛋白有破坏作用,所得产品比活较低。而亲和层析法虽然可以制备高纯度的激肽释放酶,但操作容积小,成本较高不适用于工业化生产。离子交换法虽然能够制备活性较高的酶蛋白且符合工业化生产，但是不论采用哪种介质,想要制备高纯度的激肽释放酶需要经过多次的层析，操作繁琐, 步骤繁多，胰脏资源的利用率低，导致生产成本增高。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本申请的目的是提供一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，以获得一条工艺简单、成本低、提取效率高的胰激肽原酶纯化路线，使用该纯化方法可以获得符合药品质量标准的高纯度胰激肽原酶。
本申请的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
a. 从猪胰中提取粗胰酶，向600-700份水中加入1-2份冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20-30份粗胰酶和20-30份聚乙二醇，在10-20℃条件下静置12-16h；
b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；
c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，采用pH 5.10.5M的乙酸钠进行洗脱；
d.将步骤c中获得的洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，漩涡混合1-5min，静置分相；
e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合1-5min，静置分相；
f.取步骤e中静置后的水相，加入0.01-0.1份稳定剂，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。
通过采用上述技术方案，本申请首先采用冰醋酸对胰激肽原酶进行提取，并在醋酸溶液中加入聚乙二醇，聚乙二醇的加入起到了保护剂的作用，可以提高胰激肽原酶的活性和稳定性，防止胰激肽原酶的降解；然后采用板框压滤获得含有胰激肽原酶的清液，板框压滤比离心分离的效率高，处理的时间短，充分的保证了胰激肽原酶的酶活，且板框压滤特别适宜工业化生产，提高单次处理量，降低了生产成本；将板框压滤后获得的清液进行阴离子交换层析，阴离子交换层析对胰激肽原酶具有很好的纯化效果，纯化倍数和活性回收率佳；将阴离子交换层析后获得的酶液进行反胶束萃取，反胶束是溶解在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚集体，反胶束萃取操作时间短，胶束内的蛋白质不易变性，样品处理量大，可连续操作，而且反胶束系统可以重复利用,降低了生产成本，特别适合工业生产。反胶束通过酶蛋白表面与表面活性剂极性头之间的静电相互作用溶解酶蛋白,增溶了酶蛋白的反胶束扩散进入有机相中,再将其提取至另一水相,从而实现酶蛋白的相转移,达到分离和提纯的目的。通过调整水相条件及表面活性剂浓度,对反胶束与酶蛋白的相互作用加以控制,可调节酶蛋白高选择性的萃取和反萃取；最后将反胶束萃取获得的胰激肽原酶进行冷冻干燥获得高纯度胰激肽原酶。通过本申请方法纯化获得的胰激肽原酶具有较高的纯度和酶活力以及良好的稳定性，符合药典和卫生部标准，能够满足制备激肽原酶片剂和注射剂的要求。而且本申请分离纯化方法操作步骤简单，原料成本低廉，特别适合工业大生产。
优选的，步骤a中，粗胰酶的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ.在0-4℃条件下，将新鲜猪胰或冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状；
Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于0-4℃放置6-12h；
Ⅲ.加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；
Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；
Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，搅拌10-20min，0-4℃条件下3000-5000r/min离心3-8min，收集沉淀；
Ⅵ.向沉淀中加入胰脏重量1-2倍的预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。
通过采用上述技术方案，本申请采用新鲜猪胰或冷冻猪胰脏作为初始原料，其资源丰富，且其内富含大量的胰激肽原酶，特别适合胰激肽原酶的提取。将新鲜猪胰或冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状后，胰脏中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶以酶原形式存在在浆液中，因此需要采用多种激活剂在适当条件下对其激活；保护剂的加入可以保证酶蛋白的活性和稳定性，保证后续提取工艺的进行。本申请采用低浓度乙醇对胰酶进行溶解，并采用壳聚糖进行沉淀，壳聚糖作为胰酶的沉淀剂，不仅来源丰富，而且沉淀效率高，用量少，无毒，使用安全，最重要的是壳聚糖对沉淀胰激肽原酶具有较好的专一性,使与胰激肽原酶共同沉淀的杂质较少。最后将壳聚糖沉淀后的胰激肽原酶置于循环脱脂机器中加入丙酮脱脂，获得粗胰酶。本申请粗胰酶的提取方法简单，提取率高，且提取获得的粗胰酶活性和稳定性都有保证，为后续胰激肽原酶的分离纯化奠定了基础。
优选的，步骤Ⅱ中，所述激活剂为CaCl2和十二指肠中的一种或两种；所述激活剂的加入量为胰浆质量的0.2%-0.5%。
通过采用上述技术方案，本申请选用CaCl2和十二指肠中的一种或两种作为激活剂并选定加入量。CaCl2为最常用的激活剂，对胰酶有激活作用,并且能保护胰酶的活性。十二指肠中含有大量的胰蛋白酶，胰蛋白酶可以对酶原起到激活作用，而且，本申请将猪的十二指肠作为激活剂，其与猪胰具有同源性，可以起到更好的激活作用。
优选的，步骤Ⅱ中，所述保护剂为乳糖、蔗糖和马铃薯淀粉中的一种或几种；所述保护剂的加入量为胰浆质量的0.2%-0.5%。
通过采用上述技术方案，本申请的保护剂选用乳糖、蔗糖和马铃薯淀粉中的一种或几种并限定加入量，可以有效的保证胰酶的活性，可使胰酶稳定性增强，便于后续操作获得高活力的胰激肽原酶。
优选的，步骤Ⅴ中壳聚糖的加入量为胰浆质量的0.1-0.3%。
通过采用上述技术方案，本申请壳聚糖的使用量限定在胰浆质量的0.1-0.3%，此范围内胰酶的活力较高，高于或低于此范围，胰酶活力逐渐下降。
优选的，步骤c中，阴离子交换层析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸钠进行平衡，阴离子介质为QAE-Sephadex阴离子介质。
通过采用上述技术方案，本申请采用的QAE-Sephadex阴离子介质对胰激肽原酶具有较好的纯化效果，纯化倍数高，且目的蛋白集中在一个主峰，活性回收率高。而且QAE-Sephadex阴离子介质本身价格低廉，适合工业化生产。
优选的，步骤d中，所述反胶束溶液的配置方法为取十六烷基三甲基溴化铵溶于有机溶剂中，配置成10-20mmol/L的溶液。
优选的，所述有机溶剂为正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的体积比为4-5:1。
通过采用上述技术方案，本申请选用正己烷作为十六烷基三甲基溴化铵的溶剂，这是因为溶剂的极性越大, 越容易与表面活性剂极性头结合, 使水与极性头结合相对减少，同时, 反胶束的聚集数也会变少。本申请选用正丁醇作为助表面活性剂，正丁醇在水中的溶解度较低，可以减少损失。另外，本发明将正己烷和正丁醇的加入比例限定在4-5:1，这是因为，随着正丁醇的含量减少，虽然胰激肽原酶的萃取率增加，但是分相比较困难，所以，本申请将正己烷和正丁醇的体积比限定在4-5:1。
优选的，步骤e中，所述反萃取水相为含有1.0-2.0mol/L KBr和10-25%异丙醇的混合液。
通过采用上述技术方案，本申请选用1.0-2.0mol/L KBr作为反萃取水相，其分相较快而且界面清晰。这是因为离子的水合半径越大，其从反胶束内表面双电层被排斥的效应就越强，因而静电屏蔽作用减弱，反胶束中表面活性剂极性头之间的斥力减弱，形成的反胶束就越大，在相同的离子强度下，对蛋白质的萃取率也越高。另外，10-25%异丙醇的加入一方面可以显著提高胰激肽原酶的反萃取率，另一方面可以保证胰激肽原酶的活性。这是因为异丙醇可以减弱蛋白质和反胶束内表面之间的作用力，从而使酶蛋白更容易从反胶束中萃取出来，同时减少酶和表面活性剂极性头之间强烈的静电作用而导致的蛋白质变性。
优选的，步骤f中，所述稳定剂为海藻糖和透明质酸中的一种或两种。
通过采用上述技术方案，在冷冻干燥过程中加入海藻糖和/或透明质酸可以增加胰激肽原酶的稳定性。这是因为在冷冻和溶液状态下，海藻糖和/或透明质酸优先与蛋白质表面的水分子结合，使得蛋白质表面稳定剂浓度比溶液中的低，蛋白质优先水合，其表面张力增加，化学势升高，结构更稳定。所以，通过在反萃取过程中获得的含有胰激肽原酶的水相中加入海藻糖和/或透明质酸再进行冷冻干燥，可以增加胰激肽原酶的稳定性，保证了获得的胰激肽原酶具有高比活。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请方法纯化获得的胰激肽原酶具有较高的纯度和较高的酶活力，且获得的胰激肽原酶稳定性好；
2、本申请方法纯化获得的胰激肽原酶符合药典和卫生部标准，能够满足制备激肽原酶片剂和注射剂的要求；
3、本申请分离纯化方法操作步骤简单，提取效率高，使用的原料成本低廉，特别适合工业大生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请的十六烷基三甲基溴化铵的CAS号: 57-09-0；
本申请的壳聚糖的CAS号: 9012-76-4。
制备例1
一种粗胰酶的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.在4℃条件下，将冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状，制得胰浆1000kg；
Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于4℃放置12h；
所述激活剂为CaCl2，CaCl2的加入量为2 kg；
所述保护剂为乳糖和蔗糖，所述保护剂的加入量为5 kg，其中乳糖2kg、蔗糖3kg；
Ⅲ.加入2000 kg 4℃预冷的25%乙醇，置于15℃搅拌3h，搅拌转速为300r/min，过滤；
Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入2000 kg的4℃预冷的25%乙醇，置于15℃搅拌3h，搅拌转速为300r/min，过滤；
Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，壳聚糖的加入量为1kg，搅拌20min，搅拌转速为300r/min，4℃条件下3000r/min离心8min，收集沉淀；
Ⅵ.向沉淀中加入3000kg 4℃预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。
制备例2
一种粗胰酶的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.在4℃条件下，将冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状，制得胰浆1000kg；
Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于4℃放置6h；
所述激活剂为CaCl2，CaCl2的加入量为5 kg；
所述保护剂为乳糖和马铃薯淀粉，所述保护剂的加入量为2kg，其中乳糖1kg、马铃薯淀粉1kg；
Ⅲ.加入3000kg的4℃预冷的25%乙醇，置于25℃搅拌1h，搅拌转速为500r/min，过滤；
Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入3000kg的4℃预冷的25%乙醇，置于25℃搅拌1h，搅拌转速为500r/min，过滤；
Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，壳聚糖的加入量为3kg，搅拌10min，搅拌转速为500r/min，4℃条件下5000r/min离心3min，收集沉淀；
Ⅵ.向沉淀中加入2000kg 4℃预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。
制备例3
一种粗胰酶的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.在0℃条件下，将新鲜猪胰进行搅碎并研磨成浆状，制得胰浆1000kg；
Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于0℃放置8h；
所述激活剂为猪的十二指肠，所述激活剂的加入量为3kg；
所述保护剂为乳糖、蔗糖和马铃薯淀粉；所述保护剂的加入量4kg，其中乳糖1kg、蔗糖1kg、马铃薯淀粉2kg；
Ⅲ.加入2500kg 0℃预冷的25%乙醇，置于18℃搅拌2.5h，搅拌转速为380r/min，过滤；
Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入2500kg 0℃预冷的25%乙醇，置于18℃搅拌2.5h，搅拌转速为380r/min，过滤；
Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，壳聚糖的加入量为1.5kg，搅拌12min，搅拌转速为420r/min，0℃条件下3200r/min离心6min，收集沉淀；
Ⅵ.向沉淀中加入2500kg 0℃预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。
制备例4
一种粗胰酶的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.在0℃条件下，将新鲜猪胰进行搅碎并研磨成浆状，制得胰浆1000kg；
Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于0℃放置10h；
所述激活剂为猪的十二指肠，所述激活剂的加入量为4kg；
所述保护剂为蔗糖和马铃薯淀粉；所述保护剂的加入量为3kg，其中蔗糖1kg、马铃薯淀粉2kg；
Ⅲ.加入2600kg 0℃预冷的25%乙醇，置于22℃搅拌1.5h，搅拌转速为420r/min，过滤；
Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入2600kg 0℃预冷的25%乙醇，置于22℃搅拌1.5h，搅拌转速为420r/min，过滤；
Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，壳聚糖的加入量为胰浆质量的2.5kg，搅拌18min，搅拌转速为380r/min，0℃条件下3800r/min离心5min，收集沉淀；
Ⅵ.向沉淀中加入2600kg 0℃预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。
制备例5
一种粗胰酶的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.在2℃条件下，将新鲜猪胰进行搅碎并研磨成浆状，制得胰浆1000kg；
Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于2℃放置9h；
所述激活剂为CaCl2和十二指肠，所述激活剂的加入量为3kg，其中CaCl2 1kg、十二指肠2kg；
所述保护剂为乳糖、蔗糖和马铃薯淀粉；所述保护剂的加入量为3kg，其中乳糖1kg、蔗糖1kg、马铃薯淀粉1kg；
Ⅲ.加入2500kg 2℃预冷的25%乙醇，置于20℃搅拌2h，搅拌转速为400r/min，过滤；
Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入2500kg 2℃预冷的25%乙醇，置于20℃搅拌2h，搅拌转速为400r/min，过滤；
Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，壳聚糖的加入量为2kg，搅拌15min，搅拌转速为400r/min，2℃条件下4000r/min离心5min，收集沉淀；
Ⅵ.向沉淀中加入2500kg 2℃预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。
制备例6
一种粗胰酶的制备方法，与制备例5的区别在于：步骤Ⅱ中，不加入保护剂。
制备例7
一种粗胰酶的制备方法，与制备例5的区别在于：省去步骤Ⅳ。
制备例8
一种粗胰酶的制备方法，与制备例5的区别在于：将Ⅴ中的壳聚糖换成无水乙醇。
实施例1
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
a.向600kg水中加入2kg冰醋酸，再向醋酸溶液中加入30kg制备例1制备的粗胰酶和20kg聚乙二醇，在10℃条件下静置16h；
b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；
c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的QAE-Sephadex阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠进行洗脱；阴离子交换层析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸钠进行平衡；
d.将步骤c中获得的洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，漩涡混合5min，静置分相；
所述反胶束溶液的配置方法为取十六烷基三甲基溴化铵溶于有机溶剂中，配置成20mmol/L的溶液；所述有机溶剂为正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的体积比为4:1；
e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合1min，静置分相；所述反萃取水相为含有2.0mol/L KBr和10%（体积百分数）异丙醇的混合液；
f.取步骤e中静置后的水相，加入0.1 kg透明质酸，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。
实施例2
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
a.向700kg水中加入1kg冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20kg制备例2制备的粗胰酶和30kg聚乙二醇，在20℃条件下静置12h；
b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；
c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的QAE-Sephadex阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠进行洗脱；阴离子交换层析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸钠进行平衡；
d.将步骤c中获得的洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，漩涡混合1min，静置分相；
所述反胶束溶液的配置方法为取十六烷基三甲基溴化铵溶于有机溶剂中，配置成10mmol/L的溶液；所述有机溶剂为正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的体积比为5:1；
e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合5min，静置分相；所述反萃取水相为含有1.0mol/L KBr和25%（体积百分数）异丙醇的混合液；
f.取步骤e中静置后的水相，加入0.01kg海藻糖，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。
实施例3
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
a.向620kg水中加入1.2kg冰醋酸，再向醋酸溶液中加入28kg制备例3制备的粗胰酶和22kg聚乙二醇，在12℃条件下静置14h；
b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；
c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的QAE-Sephadex阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠进行洗脱；阴离子交换层析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸钠进行平衡；
d.将步骤c中获得的洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，漩涡混合3min，静置分相；
所述反胶束溶液的配置方法为取十六烷基三甲基溴化铵溶于有机溶剂中，配置成12mmol/L的溶液；所述有机溶剂为正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的体积比为4.8:1；
e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合4min，静置分相；所述反萃取水相为含有1.8mol/L KBr和15%（体积百分比）异丙醇的混合液；
f.取步骤e中静置后的水相，加入0.05 kg透明质酸，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。
实施例4
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
a.向680kg水中加入1.8kg冰醋酸，再向醋酸溶液中加入22kg制备例4制备的粗胰酶和28kg聚乙二醇，在18℃条件下静置13h；
b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；
c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的QAE-Sephadex阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠进行洗脱；阴离子交换层析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸钠进行平衡；
d.将步骤c中获得的洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，漩涡混合4min，静置分相；
所述反胶束溶液的配置方法为取十六烷基三甲基溴化铵溶于有机溶剂中，配置成18mmol/L的溶液；所述有机溶剂为正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的体积比为4.2:1；
e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合3min，静置分相；所述反萃取水相为含有1.2mol/L KBr和20%（体积百分比）异丙醇的混合液；
f.取步骤e中静置后的水相，加入0.08 kg海藻糖，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。
实施例5
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
a.向650kg水中加入1.5kg冰醋酸，再向醋酸溶液中加入25kg制备例5制备的粗胰酶和25kg聚乙二醇，在15℃条件下静置15h；
b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；
c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的QAE-Sephadex阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠进行洗脱；阴离子交换层析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸钠进行平衡；
d.将步骤c中获得的洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，漩涡混合2min，静置分相；
所述反胶束溶液的配置方法为取十六烷基三甲基溴化铵溶于有机溶剂中，配置成15mmol/L的溶液；所述有机溶剂为正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的体积比为4.5:1；
e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合2min，静置分相；所述反萃取水相为含有1.5mol/L KBr和20%（体积百分比）异丙醇的混合液；
f.取步骤e中静置后的水相，加入0.08kg稳定剂，所述稳定剂为海藻糖和透明质酸，其中海藻糖0.04kg、透明质酸0.04kg，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。
对比例1
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，与实施例1区别在于：省去步骤c。
对比例2
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，与实施例2区别在于：步骤c中将QAE-Sephadex阴离子介质换成Q Sepharose FF阴离子介质。
对比例3
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，与实施例3区别在于：省去步骤d和e。
对比例4
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，与实施例4区别在于：步骤f中不加入稳定剂。
对比例5
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，与实施例5区别在于：采用制备例6制备的粗胰酶作为原料。
对比例6
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，与实施例5区别在于：采用制备例7制备的粗胰酶作为原料。
对比例7
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，与实施例5区别在于：采用制备例8制备的粗胰酶作为原料。
性能测试
采用本申请实施例1-5和对比例1-7方法制备的胰激肽原酶的鉴别、酸碱度、脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量、纯度和比活力等参数均参照国家药品标准WS1-XG-003-2006进行测定，测定结果参见表1。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从表1可以看出，实施例1-5分离纯化的胰激肽原酶在酸碱度、脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量、纯度和比活力方面均符合国家药品标准。最为突出的是其纯度和比活力，实施例1-5分离纯化的胰激肽原酶的纯度可达99.7%，比活力可达1255 U/mg，均优于现有的纯化方法获得的胰激肽原酶。另外，从表1的实验数据还可以看出，实施例5的各项参数均优于实施例1-4，这是因为在粗胰酶的制备过程中，向胰浆中加入CaCl2和十二指肠作为激活剂，加入乳糖、蔗糖和马铃薯淀粉作为保护剂，同时在胰激肽原酶提取的冷冻干燥过程中加入海藻糖和透明质酸，以上物质的加入均能够增加酶活力，同时提高酶的稳定性，尤其是海藻糖和透明质酸在冷冻干燥过程中还起到了协同作用，从而进一步保证了最终获得的胰激肽原酶的各项性能。
对比例1与实施例1的区别在于不进行阴离子交换层析，对溶解于醋酸溶液中的酶直接进行反胶束萃取。从表1可以看出，由于不进行阴离子交换层析，最终获得的胰激肽原酶中脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量均有所增加，但也在规定范围，这表明阴离子交换层析对胰激肽原酶具有选择作用；另外，对比例1获得的胰激肽原酶的纯度为80.5%，比活力为712 U/mg，均大大低于实施例1，这表明离子交换层析对胰激肽原酶的分离纯化起到重要作用。
对比例2与实施例2的区别在于阴离子交换层析采用Q Sepharose FF阴离子介质。从表1可以看出，对比例2方法获得的胰激肽原酶中的脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量均略高于实施例2，而且，对比例2获得的胰激肽原酶的纯度为97.1%，比活力为1181 U/mg，也均略低于实施例2，这表明阴离子交换层析采用QAE-Sephadex阴离子介质对胰激肽原酶的纯化效果高于Q Sepharose FF阴离子介质。
对比例3与实施例3的区别在于不进行反胶束萃取，只对溶解于醋酸溶液中的酶进行阴离子交换层析。从表1可以看出，由于不进行反胶束萃取，最终获得的胰激肽原酶中脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量均大幅增加，这表明虽然进行阴离子交换层析，但是一次阴离子交换层析并不能得到符合要求的国家药品标准的胰激肽原酶，尤其是对比例3获得的胰激肽原酶纯度只有51.7%，比活力只有259 U/mg，实施例3制备的胰激肽原酶中含有大量的杂蛋白，反胶束萃取步骤能够很好的去除杂蛋白，提高胰激肽原酶产品中的纯度和比活力。
对比例4与实施例4的区别在于在最后冷冻干燥过程中不加入稳定剂。从表1可以看出，由于不加入稳定剂，最终获得的胰激肽原酶中脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量均略有增加，纯度和比活力均略有下降，这表明有部分胰激肽原酶在冷冻干燥过程中被降解或失活。综上，稳定剂的加入可以很好的保证最终获得的胰激肽原酶具有良好的稳定性。
对比例5与实施例5的区别在于在粗胰酶提取过程中不加入保护剂。从表1可以看出，由于在粗胰酶提取过程中不加入保护剂，最终获得的胰激肽原酶中脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量均略有增加，纯度和比活力均略有下降，这表明有部分胰酶在提取过程中被降解或失活，导致最终提取获得的胰激肽原酶的性能有所下降。所以，保护剂的加入可以很好的保证胰酶在提取过程中的稳定性以及获得的胰激肽原酶的纯度和比活力。
对比例6与实施例5的区别在于在采用后25%乙醇提取胰酶后不进行第二次提取。从表1可以看出，由于不对胰酶进行二次提取，最终获得的胰激肽原酶中脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量均略有增加，纯度和比活力均略有下降，这表明有部分胰酶并没有被提取出来，从而影响最终获得的胰激肽原酶的纯度和比活力。所以，对猪胰中的胰酶进行二次提取，可以提高最终获得的胰激肽原酶的含量。
对比例7与实施例5的区别在于采用无水乙醇对胰酶进行沉淀。从表1可以看出，采用无水乙醇对胰酶进行沉淀，最终获得的胰激肽原酶中脂肪含量、蛋白酶含量、干燥失重、灼烧残渣、重金属含量、砷盐含量、热原、细菌内毒素含量均略有增加，纯度和比活力均略有下降，这表明无水乙醇对胰酶的沉淀效果不如壳聚糖好，而且壳聚糖对胰激肽原酶具有较好的专一性，使与胰激肽原酶共同沉淀的杂质较少，从而提高了获得的胰激肽原酶的纯度和比活力。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.从猪胰中提取粗胰酶，向600-700份水中加入1-2份冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20-30份粗胰酶和20-30份聚乙二醇，在10-20℃条件下静置12-16h；
b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；
c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠进行洗脱；
d.向步骤c中获得的洗脱液中加入等体积的反胶束溶液，漩涡混合1-5min，静置分相；
e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合1-5min，静置分相；
f.取步骤e中分相后的水相，加入0.01-0.1份稳定剂，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶；
步骤d中，所述反胶束溶液的配置方法为取十六烷基三甲基溴化铵溶于有机溶剂中，配置成10-20mmol/L的溶液，所述有机溶剂为正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的体积比为4-5:1；
步骤e中，所述反萃取水相为含有1.0-2.0mol/L KBr和10-25%异丙醇的混合液。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中，粗胰酶的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ.在0-4℃条件下，将新鲜猪胰或冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状；
Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于0-4℃放置6-12h；
Ⅲ.加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；
Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；
Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，搅拌10-20min，0-4℃条件下3000-5000r/min离心3-8min，收集沉淀；
Ⅵ.向沉淀中加入胰脏重量1-2倍的预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。
3.根据权利要求2所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤Ⅱ中，所述激活剂为CaCl2和猪的十二指肠中的一种或两种；所述激活剂的加入量为胰浆质量的0.2%-0.5%。
4.根据权利要求2所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤Ⅱ中，所述保护剂为乳糖、蔗糖和马铃薯淀粉中的一种或几种；所述保护剂的加入量为胰浆质量的0.2%-0.5%。
5.根据权利要求2所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤Ⅴ中壳聚糖的加入量为胰浆质量的0.1-0.3%。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中，阴离子交换层析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸钠进行平衡，阴离子介质为QAE-Sephadex阴离子介质。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤f中，所述稳定剂为海藻糖和透明质酸中的一种或两种。
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