CN108004222B - 一种胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料药 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料药，解决了由于杂蛋白过多，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶很难分开，导致胰蛋白酶提取的纯度一直不高的问题，其技术方案要点包括有如下步骤：将动物胰脏切块搅碎加入到提取罐中提取；离心分层，压滤得到胰脏提取液；超滤浓缩后，加入（NH4）2SO4梯度盐析，得到胰酶混合物；加入胰蛋白酶晶体进行激活，得到胰酶粗提液；活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，将Sepharose 4B‑鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过Tris‑HCl缓冲液平衡；用0.1mol/L甲酸‑0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；将胰蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂，能够得到高纯度的胰蛋白酶产品。

Description

一种胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料药
技术领域
本发明涉及生物制药，特别涉及一种胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料药。
背景技术
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9；胰蛋白酶的分子量与其酶原接近(23300)，其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH＝3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰酶沉淀，活化后采用层析、沉淀等方法再次纯化。由于杂蛋白过多，且胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶很难分开，导致胰蛋白酶提取的纯度一直不高。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种胰蛋白酶的提取方法，对胰蛋白酶进行提取，能够得到高纯度的胰蛋白酶产品。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种胰蛋白酶的提取方法，包括有如下步骤：
步骤一：将动物胰脏预处理去除结缔组织和脂肪，切块搅碎，得到胰糜；
步骤二：将胰糜加入到提取罐中加乙酸酸化水至浸没胰糜，搅拌混合后，得到胰糜-水混合物；
步骤三：将胰糜-水混合物离心至分层，并对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合后得到胰脏提取液；
步骤四：对胰脏提取液进行超滤浓缩后，加入(NH4)2SO4梯度盐析，得到胰酶混合物；
步骤五：将胰酶混合物经过压滤后取滤饼，均匀向滤饼中加入0.1mol/L CaCl2溶液至滤饼完全溶解，加入胰蛋白酶晶体进行激活，得到胰酶粗提液；
步骤六：将胰酶粗提液压滤后取上清液再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；
步骤七：活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过Tris-HCl缓冲液平衡；
步骤八：将胰酶浓缩液过柱去除杂蛋白，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；
步骤九：将胰蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂。
通过采用上述技术方案，在上述步骤下对胰蛋白酶进行提取，通过Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白偶联，在层析过程中，胰酶浓缩液中的胰蛋白酶会与鸡卵粘蛋白结合，而杂蛋白则会随过柱液一起流出，经过洗脱液洗脱后能够将胰蛋白酶洗出，能够直接获得高纯度的胰蛋白酶产品，操作简单。
作为优选，步骤一中对胰脏的预处理包括有如下步骤：
Step1，剥除胰脏的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成块；
Step2，通过绞肉机将胰脏块绞成糜状的胰碎；
Step3，将胰碎浸没在碱性脱脂剂中，搅拌脱脂；
Step4，滤去碱性脱脂剂后，用pH＝3.0的乙酸酸化水冲洗2～3次，得到胰糜。
通过采用上述技术方案，将胰糜通过碱性脱脂剂脱脂，相较于仅靠机械剥离，对脂肪的去除效果更好，避免脂肪含量对后期胰蛋白酶的提取造成影响。
作为优选，所述碱性脱脂剂包括有占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L的磷酸三钠、1mol/L的丙酮和1mol/L的乙酸乙酯，溶剂为水。
通过采用上述技术方案，磷酸三钠、丙酮和乙酸乙酯都为碱性脱脂剂，同时磷酸三钠在与胰糜的混合液中，还能够起到保护稳定胰蛋白酶原的作用，减少在组织破碎过程由于自溶等原因造成的胰蛋白酶的产率损耗。
作为优选，步骤四中分别加入30g/L(NH4)2SO4溶液、60g/L(NH4)2SO4溶液、饱和(NH4)2SO4溶液和固体(NH4)2SO4进行盐析。
通过采用上述技术方案，梯度盐析的方式相较于一次性盐析，能够提取到产物的产率更高，提高了胰蛋白酶的整体产率，同时通过上述几个浓度的进行梯度提取，能够在尽可能少梯度中得到较多的沉淀。
作为优选，步骤五用0.1mol/L CaCl2溶液溶解滤饼，通过0.1mol/LCaCl2溶液或5mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，过滤去除沉淀后加入胰蛋白酶晶体。
通过采用上述技术方案，在pH为8.0的情况下，胰蛋白酶能够达到最佳的激活速度。
作为优选，步骤七中Sepharose 4B的活化包括如下步骤：
Step1，将Sepharose 4B用1mol/L NaCl溶液滤洗2～5次，再用去离子水冲洗1～2次，冻干成粉状；
Step2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；
Step3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；
Step4，抽滤出去活化液，得活化Sepharose 4B。
通过采用上述技术方案，上述方法相较于其他Sepharose 4B所产生的有害物质较少，对环境较为友好，减少了环境污染；在40℃水浴下进行活化具有较高的活化效率；活化液水浴加热至40℃预热能够进一步提高后期的活化反应的活化效率。
作为优选，步骤七中Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白偶联包括有如下步骤：
Step1，将pH9.5的Na2CO3缓冲液在40℃水浴中水浴加热；
Step2，至Na2CO3缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；
Step3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到鸡卵粘蛋白-Na2CO3混合液中，持续搅拌24h；
Step4，过滤除清液，完成Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白的偶联。
通过采用上述技术方案，将Na2CO3缓冲液预热至40℃，能够使Sepharose 4B快速适应反应环境，在40℃水浴状态下进行偶联，能够使Sepharose 4B保持较好的活化状态，同时加速鸡卵粘蛋白偶联。
作为优选，步骤七的Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。
通过采用上述技术方案，在pH为8.0的情况下，能够使胰蛋白酶适应层析柱的环境，提高胰蛋白酶与鸡卵粘蛋白的结合效果，进而提高提取产率。
本发明的第二个目的是提供一种含有胰蛋白酶的原料药，延缓胰蛋白酶的活性损失。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种含有胰蛋白酶的原料药，包括有由上述发明内容制备的胰蛋白酶作为活性成分，还包括有甘油磷脂酸、肌醇和CaCl2。
通过采用上述技术方案，甘油磷脂酸和肌醇能够使胰蛋白酶表面互相作用的区域排除了水而降低了自由能，增加了胰蛋白酶的稳定性，适当的钙离子浓度对胰蛋白酶具有促进作用和稳定作用，通过上述配方，在保证胰蛋白酶活性的同时，能够减少胰蛋白酶的自溶。
作为优选，所述甘油磷脂酸、肌醇和CaCl2的摩尔比为20:20:1。
通过采用上述技术方案，甘油磷脂酸、肌醇和CaCl2的摩尔比为20:20:1的条件下，胰蛋白酶的失活时间被延缓。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
该胰蛋白酶的提取方法能够直接获得高纯度的胰蛋白酶产品，操作简单；
该胰蛋白酶通过碱性脱脂剂的使用，除去了胰脏中难以除去的知法，提高了脂肪的去除率，进而提高了胰蛋白酶的提取产率。
附图说明
图1为胰蛋白酶提取方法的流程图。
具体实施方式
实施例一
参见图1
胰脏预处理
Step1.1，取离体时间小于8h的动物胰脏，利用刀具剥除胰脏中的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成3×3x3m3的块状；
Step1.2，将块状胰脏通过绞肉机搅成胰糜；
胰酶盐析
Step2.1，将胰糜加入到提取罐中，边加pH＝3.0的乙酸酸化水边搅拌至浸没胰糜，浸渍24h至乙酸酸化水呈乳白色，在浸渍过程中，每隔1h间隙搅拌10min，得到胰糜-水混合物；
Step2.2，将胰糜-水混合物通过卧式螺旋离心机离心，设定离心转速为2500r/min，离心时间6min；
Step2.3，离心结束后，若未分层，重新进行Step2.2；至分层，取上清液，通过板式压滤机对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合；
Step2.4，将Step2.3得到的混合液通过双层脱脂纱布滤去残渣，得到胰脏提取液；
Step2.5，通过截留分子量为100kD的中孔纤维超滤膜对胰脏提取液进行超滤浓缩至胰脏提取液的体积为原体积的十分之一；
Step2.6.1，向浓缩后的胰脏提取液加入占胰脏提取液体积十分之一的30g/L(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X1；
Step2.6.2，在Step2.6.1得到的上清液中加入占Step2.6.1得到的上清液体积二十分之一的60g/L(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X2；
Step2.6.3，在Step2.6.2得到的上清液中加入占Step2.6.2得到的上清液体积三十分之一的饱和(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X3；
Step2.6.4，在Step2.6.3得到的上清液中加入与Step2.6.3中饱和(NH4)2SO4溶液中(NH4)2SO4摩尔量一致的固体(NH4)2SO4，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X4；
Step2.6.5，混合X1、X2、X3、X4，通过板式压滤机压滤取滤饼。
胰酶激活
Step3.1，用0.1mol/L CaCl2溶液完全溶解滤饼，通过0.1mol/L CaCl2溶液或5mol/L NaOH溶液调节pH至8.0；
Step3.2，过滤后去除沉淀；
Step3.3，加入Step1.1所用胰脏质量万分之一的胰蛋白酶晶体，搅拌均匀得到胰酶粗提液。
胰蛋白酶提取纯化
Step4.1，将胰酶粗提液通过压滤后取上清液：
Step4.2，将Step4.1所得上清液过截留分子量为50kD的中孔纤维超滤膜再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；
Step4.3.1，将Sepharose 4B用1mol/LNaCl溶液滤洗2～5次，再用去离子水冲洗1～2次，冻干成粉状；
Step4.3.2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；
Step4.3.3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；
Step4.3.4，抽滤除去活化液，得活化Sepharose 4B；
Step4.4.1，将pH9.5的Na2CO3缓冲液在40℃水浴中水浴加热；
Step4.4.2，至Na2CO3缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；
Step4.4.3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到Step2中，持续搅拌24h，使Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白偶联；
Step4.5，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液平衡；
Step4.6，将胰酶浓缩液过柱去除杂蛋白，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；
Step4.7.1，将透析袋置于0.5mol/L EDTA溶液水浴加热40分钟，取出透析袋用蒸馏水冲洗2～3次；
Step4.7.2，将胰蛋白酶精提液注入透析袋中，将注有胰蛋白酶精提液的透析袋用流动的蒸馏水浸泡12h，收集酶液得到胰蛋白酶去盐液；
Step4.7.3，将胰蛋白酶去盐液过30KD超滤膜过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂。
实施例二
胰脏预处理
Step1.1，取离体时间小于8h的动物胰脏，利用刀具剥除胰脏中的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成3×3x3m3的块状；
Step1.2，将块状胰脏通过绞肉机搅成胰糜状；
Step1.3，以去离子水为溶剂配制碱性脱脂剂，向去离子水中加入磷酸三钠、丙酮和乙酸乙酯至磷酸三钠的浓度占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L、丙酮占碱性脱脂剂总含量1mol/L以及乙酸乙酯占碱性脱脂剂总含量1mol/L；
Step1.4，将碱性脱脂剂加入搅拌机中，边搅拌边均匀加入胰糜，设定搅拌转速为150r/min，搅拌时间为5min；
Step1.5，滤去碱性脱脂剂后，用pH＝3.0的乙酸酸化水冲洗2～3次，得到胰糜。
胰酶盐析
Step2.1，将胰糜加入到提取罐中，边加pH＝3.0的乙酸酸化水边搅拌至浸没胰糜，浸渍24h至乙酸酸化水呈乳白色，在浸渍过程中，每隔1h间隙搅拌10min，得到胰糜-水混合物；
Step2.2，将胰糜-水混合物通过卧式螺旋离心机离心，设定离心转速为2500r/min，离心时间6min；
Step2.3，离心结束后，若未分层，重新进行Step2.2；至分层，取上清液，通过版式压滤机对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合；
Step2.4，将Step2.3得到的混合液通过双层脱脂纱布滤去残渣，得到胰脏提取液；
Step2.5，通过截留分子量为100kD的中孔纤维超滤膜对胰脏提取液进行超滤浓缩至胰脏提取液的体积为原体积的十分之一；
Step2.6.1，向浓缩后的胰脏提取液加入占胰脏提取液体积十分之一的30g/L(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X1；
Step2.6.2，在Step2.6.1得到的上清液中加入占Step2.6.1得到的上清液体积二十分之一的60g/L(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X2；
Step2.6.3，在Step2.6.2得到的上清液中加入占Step2.6.2得到的上清液体积三十分之一的饱和(NH4)2SO4溶液，搅拌1h后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X3；
Step2.6.4，在Step2.6.3得到的上清液中加入与Step2.6.3中饱和(NH4)2SO4溶液中(NH4)2SO4摩尔量一致的固体(NH4)2SO4，搅拌10min后，静置至溶液分层，过滤保留沉淀X4；
Step2.6.5，混合X1、X2、X3、X4，通过板式压滤机压滤取滤饼。
胰酶激活
Step3.1，用0.1mol/L CaCl2溶液溶解滤饼，通过0.1mol/L CaCl2溶液或5mol/LNaOH溶液调节pH至8.0；
Step3.2，过滤去后除沉淀；
Step3.3，加入Step1.1所用胰脏质量万分之一的胰蛋白酶晶体，搅拌均匀得到胰酶粗提液。
胰蛋白酶提取纯化
Step4.1，将胰酶粗提液通过压滤后取上清液：
Step4.2，将Step4.1所得上清液过截留分子量为50kD的中孔纤维超滤膜再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；
Step4.3.1，将Sepharose 4B用1mol/LNaCl溶液滤洗2～5次，再用去离子水冲洗1～2次，冻干成粉状；
Step4.3.2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；
Step4.3.3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；
Step4.3.4，抽滤去除活化液，得活化Sepharose 4B；
Step4.4.1，将pH9.5的Na2CO3缓冲液在40℃水浴中水浴加热；
Step4.4.2，至Na2CO3缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；
Step4.4.3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到Step2中，持续搅拌24h，使Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白偶联；
Step4.5，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液平衡；
Step4.6，将胰酶浓缩液过柱去除杂蛋白，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；
Step4.7.1，将透析袋置于0.5mol/L EDTA溶液水浴加热40分钟，取出透析袋用蒸馏水冲洗2～3次；
Step4.7.2，将胰蛋白酶精提液注入透析袋中，将注有胰蛋白酶精提液的透析袋用流动的蒸馏水浸泡12h，收集酶液得到胰蛋白酶去盐液；
Step4.7.3，将胰蛋白酶去盐液过30KD超滤膜过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂。
实施例三
实施例三的区别与实施例二的区别仅在于，实施例三的碱性脱脂剂的配方为：以去离子水为溶剂配制碱性脱脂剂，向去离子水中加入磷酸三钠、丙酮、乙酸乙酯和氯化钙，至磷酸三钠的浓度占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L、丙酮占碱性脱脂剂总含量1mol/L、乙酸乙酯占碱性脱脂剂总含量1mol/L以及钙离子的浓度占总含量的0.05mol/L。
酶活力测定：
依次在试管中加入2.5mL0.05mol/LTirs-HCl缓冲液(pH＝8.0)，0.2mL0.01mol/LHCl溶液，0.1mL胰蛋白酶去盐液的稀释液，0.2mLBAEE，每次加入均混合摇匀，30s后开始记录A253的吸光值，每隔10s进行记录，连续记录9个点，绘制酶促动力学曲线，从曲线上求起始点吸光度随时间的变化率Km。一个酶活力单位(U)：在上述条件下，每分钟使△A253增加0.001，反应液中所加的酶量为1BAEE单位。
胰蛋白酶活力单位(U/mL)＝(△A253/min)/(0.001×胰蛋白酶去盐液体积)×稀释倍数。
测试结果见下表
Figure BDA0001514998360000081
根据实验数据可知，经过碱性脱脂剂处理的胰蛋白酶的活力单位要高于未经过碱性脱脂剂处理的胰蛋白酶的活力单位。
应用例
选取实施例二制得的胰蛋白酶，将4mol甘油磷脂酸、2mol肌醇和0.1mol固体CaCl2加800mL去离子水溶解，补加去离子水至1L，制得胰蛋白酶保护液。
将胰蛋白酶保护液和胰蛋白酶按照质量比为0:1、1000：8、100：4、1000：2、1000:1的比例混合，置于15℃下密封存放，并计算其1h、24h、3d、7d、30d的胰蛋白酶活力单位。
Figure BDA0001514998360000082
经过上表可知，保护液能够对胰蛋白酶起到保护作用，且当胰蛋白酶保护液和胰蛋白酶的比例按照1:4混合时，保护效果最好。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (4)

1.一种胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，包括有如下步骤：
步骤一：将动物胰脏预处理去除结缔组织和脂肪，切块搅碎，得到胰糜；
步骤二：将胰糜加入到提取罐中加乙酸酸化水至浸没胰糜，搅拌混合后，得到胰糜-水混合物；
步骤三：将胰糜-水混合物离心至分层，并对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合后得到胰脏提取液；
步骤四：对胰脏提取液进行超滤浓缩后，分别加入30g/L（NH4）2SO4溶液、60g/L（NH4）2SO4溶液、饱和（NH4）2SO4溶液和固体（NH4）2SO4进行梯度盐析，得到胰酶混合物；
步骤五：将胰酶混合物经过压滤后取滤饼，均匀向滤饼中加入0.1mol/L CaCl2溶液至滤饼完全溶解，通过5mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，过滤去除沉淀后加入胰蛋白酶晶体进行激活，得到胰酶粗提液；
步骤六：将胰酶粗提液压滤后取上清液再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；
步骤七：活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过Tris-HCl缓冲液平衡；
步骤八：将胰酶浓缩液过柱去除杂蛋白，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；
步骤九：将胰蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂；
步骤一中对胰脏的预处理包括有如下步骤：
Step1，剥除胰脏的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成块；
Step2，通过绞肉机将胰脏块绞成糜状的胰碎；
Step3，将胰碎浸没在碱性脱脂剂中，搅拌脱脂；
Step4，滤去碱性脱脂剂后，用pH=3.0的乙酸酸化水冲洗2~3次，得到胰糜；
所述碱性脱脂剂包括有占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L的磷酸三钠、1mol/L的丙酮、1mol/L的乙酸乙酯和0.05mol/L的氯化钙。
2.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤七中Sepharose4B的活化包括如下步骤：
Step1，将Sepharose 4B用1mol/L NaCl溶液滤洗2~5次，再用去离子水冲洗1~2次，冻干成粉状；
Step2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；
Step3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；
Step4，抽滤除去 活化液，得活化Sepharose 4B。
3.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤七中Sepharose4B与鸡卵粘蛋白偶联包括有如下步骤：
Step1，将pH9.5的Na2CO3缓冲液在40℃水浴中水浴加热；
Step2，至Na2CO3缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；
Step3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到鸡卵粘蛋白-Na2CO3混合液中，持续搅拌24h；
Step4，过滤除清液，完成Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白的偶联。
4.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤七的Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676484A (zh) * 2012-05-29 2012-09-19 通化东宝药业股份有限公司 高纯度牛胰蛋白酶的制备方法
CN105385672A (zh) * 2015-11-24 2016-03-09 青岛康原药业有限公司 一种胰蛋白酶的制备方法及提高胰蛋白酶复溶性的药物组合物
CN107338235A (zh) * 2017-08-03 2017-11-10 淮安麦德森制药有限公司 胰酶的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676484A (zh) * 2012-05-29 2012-09-19 通化东宝药业股份有限公司 高纯度牛胰蛋白酶的制备方法
CN105385672A (zh) * 2015-11-24 2016-03-09 青岛康原药业有限公司 一种胰蛋白酶的制备方法及提高胰蛋白酶复溶性的药物组合物
CN107338235A (zh) * 2017-08-03 2017-11-10 淮安麦德森制药有限公司 胰酶的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"胰蛋白酶的提取纯化及酶学性质的研究";丁凌霄等;《粮食与食品工业》;20130415;第20卷(第2期);第2.1-2.45节 *

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Pledgee: Xianju Branch of Industrial and Commercial Bank of China Ltd.

Pledgor: ZHEJIANG FENGAN BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

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