CN107625957A - 包含胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的用于治疗癌的药物组合物 - Google Patents

包含胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的用于治疗癌的药物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN107625957A
CN107625957A CN201710885368.4A CN201710885368A CN107625957A CN 107625957 A CN107625957 A CN 107625957A CN 201710885368 A CN201710885368 A CN 201710885368A CN 107625957 A CN107625957 A CN 107625957A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cancer
activating agent
pharmaceutical composition
chymotrypsinogen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710885368.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107625957B (zh
Inventor
J·N·凯尼恩
P·R·克莱顿
D·托什
F·费尔库尔
R·布兰德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Propanc Pty Ltd
Original Assignee
Propanc Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2009905147A external-priority patent/AU2009905147A0/en
Application filed by Propanc Pty Ltd filed Critical Propanc Pty Ltd
Publication of CN107625957A publication Critical patent/CN107625957A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107625957B publication Critical patent/CN107625957B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/04—Sulfur, selenium or tellurium; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/095—Sulfur, selenium, or tellurium compounds, e.g. thiols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4826—Trypsin (3.4.21.4) Chymotrypsin (3.4.21.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Abstract

本发明总的涉及含有糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的药物组合物和其用于治疗实体肿瘤的用途。

Description

包含胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的用于治疗癌的药物组合物
本申请是申请日为2010年10月22日、发明名称为“包含胰蛋白酶原和/或糜蛋白酶原和选自硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂的活性剂的用于治疗癌的药物组合物”的中国发明专利申请No.201080054056.5的分案申请。
【技术领域】
本发明总的涉及含有蛋白酶酶原的药物组合物和其癌治疗用途。
【背景技术】
在治疗癌中使用蛋白酶的想法已有大于100年。在1905年，John Beard建议使用新鲜胰酶提取物作为可能的癌治疗，并用Jersen氏小鼠肉瘤模型进行了成功的实验。将小鼠用蛋白酶胰蛋白酶注射之后，观察肿瘤退行。由Beard获得的结果在当时产生大的兴趣，及自绵羊胰腺制备的粗酶提取物用于治疗人癌患者，以减少肿瘤进展及延长存活时间。
近来，酶的口服施用已显示被在一系列癌包括胰，肠，结直肠和晚期阶段骨髓瘤有良好存活率的患者良好耐受。已需要高剂量的酶的使用，因为通过消化的损失和灭活及来自血浆中的其他酶灭活剂，诸如丝氨酸蛋白酶抑制物。
酶原(酶的无活性前体形式)已用于克服迎对酶的口服施用的问题。包括胰蛋白酶原(其为丝氨酸蛋白酶抑制物胰蛋白酶的酶原形式)的酶原混合物已显示在治疗癌中有用，并被相信在肿瘤细胞表面选择性地活化(Novak J and Trnka F,Proenzyme Therapy ofCancer,Anticancer Research,25:1157-1178,2005；US 5,858,357)。胰蛋白酶的作用机理被认为通过肿瘤细胞的蛋白水解的方式发生。
存在对于鉴定及提供对于治疗癌有效的增强的酶原组合物的需求。
【发明概述】
第1方面提供包含蛋白酶酶原和活性剂的药物组合物，所述组合物能提供治疗癌的多-功能方法。
第2方面提供药物组合物，其包含：
蛋白酶酶原，其能在肿瘤细胞的表面或接近肿瘤细胞的表面活化而增强肿瘤细胞的细胞间粘接，实现肿瘤细胞的蛋白水解，或诱导肿瘤细胞凋亡，分化或免疫识别；以及
活性剂，其能诱导肿瘤细胞的细胞内活性。
在第2方面的一实施方式中，细胞内活性是肿瘤细胞凋亡，免疫识别或分化。
在第1或第2方面的一实施方式中，药物组合物包含蛋白酶酶原和活性剂，所述组合物能提供治疗癌的多-功能方法，其中蛋白酶酶原选自胰蛋白酶原和糜蛋白酶原中的至少一种，及活性剂选自下列中的至少一种：硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂，及任选地糖苷水解酶。在进一步实施方式中，蛋白酶酶原是胰蛋白酶原和糜蛋白酶原。
第3方面提供癌治疗用剂或组合物，其中癌治疗用剂包含蛋白酶酶原和活性剂，它们一起能提供治疗癌的多-功能方法。
第4方面提供癌治疗用剂或组合物，其中癌治疗用剂包含：
蛋白酶酶原，其能在肿瘤细胞的表面或接近肿瘤细胞的表面活化而增强肿瘤细胞的细胞间粘接，实现肿瘤细胞的蛋白水解，或诱导肿瘤细胞凋亡，分化或免疫识别；以及
活性剂，其能诱导肿瘤细胞的细胞内活性。
第5方面提供蛋白酶酶原用于制备包含癌治疗用活性剂的药物的用途。
第6方面提供活性剂用于制备包含癌治疗用蛋白酶酶原的药物的用途。
第7方面提供蛋白酶酶原和活性剂用于制备癌治疗用药物的用途。
第8方面提供蛋白酶酶原用于制备用于治疗用活性剂治疗的受试者中的癌的药物的用途，其中活性剂和蛋白酶酶原一起能影响肿瘤细胞，且任选地其中活性剂能诱导细胞内活性而增强蛋白酶酶原的效应。
第9方面提供活性剂用于制备用于治疗用蛋白酶酶原治疗的受试者中的癌的药物的用途，其中活性剂和蛋白酶酶原一起能影响肿瘤细胞，且任选地其中活性剂能诱导细胞内活性而增强蛋白酶酶原的效应。
第10方面提供治疗癌的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的蛋白酶酶原和活性剂。
在第10方面的一实施方式中，方法包括蛋白酶酶原和活性剂，及任选地额外的活性剂的共施用或连续施用。共施用可包括施用包含第1和第2方面的药物组合物的单药物，或各包含蛋白酶酶原和活性剂，及任选地额外的活性剂的独立的药物的共施用。连续施用可涉及任何顺序施用蛋白酶酶原，活性剂或额外的活性剂。连续和共施用可涉及不同途径施用蛋白酶酶原，活性剂或额外的活性剂。
根据第10方面的方法可包括给已分别用活性剂或蛋白酶酶原独立地治疗的受试者施用蛋白酶酶原或活性剂。
第11方面提供制备第1和第2方面的药物组合物，或其制备物或制剂的方法，其通过将蛋白酶酶原与活性剂混合来实施。
在第11方面的进一步实施方式中，方法可还包括将根据第1和第2方面的一实施方式的额外的活性剂与蛋白酶酶原和/或活性剂混合。
在以上方面的一实施方式中，蛋白酶酶原是丝氨酸蛋白酶酶原。丝氨酸蛋白酶酶原可为胰蛋白酶原，糜蛋白酶原或其混合物。在另一实施方式中，蛋白酶酶原包含第1和第2蛋白酶酶原，其中第1蛋白酶酶原是糜蛋白酶原，而第2蛋白酶酶原是胰蛋白酶原，且糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在4:1至8:1之间的范围内。在进一步实施方式中，糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在5:1至7:1之间的范围内。在进一步实施方式中，糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是6:1。
在以上方面的一实施方式中，活性剂选自下列中的至少一种：硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂，及任选地糖苷水解酶。例如，活性剂可为硒化合物，或由下列组成的组合：硒化合物，类香兰素化合物，糖苷水解酶和细胞质糖酵解减少剂。
在以上方面的一实施方式中，药物组合物包含蛋白酶酶原和活性剂，所述组合物能提供治疗癌的多-功能方法，其中蛋白酶酶原选自胰蛋白酶原和糜蛋白酶原中的至少一种，而活性剂选自下列中的至少一种：硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂，及任选地糖苷水解酶。
在以上方面的进一步实施方式中，硒化合物能提供可通过身体吸收进血浆或细胞间液的生物可利用的硒源。在一特定实施方式中，含硒化合物是甲基硒代半胱氨酸或其药学可接受的盐。
在以上方面的一实施方式中，糖苷水解酶是淀粉酶，例如α-淀粉酶。
在以上方面的另一实施方式中，细胞质糖酵解减少剂是2-脱氧-D-葡萄糖。
在以上方面的另一实施方式中，类香兰素化合物选自辣椒酸酯，即4-羟基-3-甲氧基苄基(E)-8-甲基-6-壬烯酸酯，二氢辣椒酸酯，即4-羟基-3-甲氧基苄基8-甲基壬酸酯，及正二氢辣椒酸酯，即4-羟基-3-甲氧基苄基7-甲基辛酸酯。优选地，类香兰素化合物是辣椒酸酯。
在以上方面的一实施方式中，活性剂选自下列中的至少一种：甲基硒代半胱氨酸，辣椒酸酯，α-淀粉酶和2-脱氧-D-葡萄糖。在特定实施方式中，活性剂由下列组成：甲基硒代半胱氨酸，辣椒酸酯，α-淀粉酶和2-脱氧-D-葡萄糖。
第12方面提供药物组合物，其包含第1和第2蛋白酶酶原，所述第1和第2蛋白酶酶原能在肿瘤细胞的表面或接近肿瘤细胞的表面活化而增强肿瘤细胞的细胞间粘接，实现肿瘤细胞的蛋白水解，或诱导肿瘤细胞凋亡，分化或免疫识别，其中第1蛋白酶酶原是糜蛋白酶原，而第2蛋白酶酶原是胰蛋白酶原，且糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在4:1至8:1之间的范围内。
在第12方面的一实施方式中，糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在5:1至7:1之间的范围内。在另一实施方式中，糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是6:1。
在第12方面的另一实施方式中，药物组合物还包含在上述实施方式中任一项中定义的活性剂。
第13方面提供药物组合物，其包含第1和第2活性剂，所述第1和第2活性剂各能诱导肿瘤细胞的细胞内活性，其中第1活性剂是硒化合物，而第2活性剂是细胞质糖酵解减少剂。
在第13方面的一实施方式中，细胞内活性是肿瘤细胞凋亡，免疫识别或分化。在一实施方式中，硒化合物是根据上述任何一实施方式定义的。在优选的实施方式中，硒化合物是甲基硒代半胱氨酸。在另一实施方式中，细胞质糖酵解减少剂是2-脱氧-D-葡萄糖。
在第13方面的另一实施方式中，药物组合物还包含在上述实施方式中任一项中定义的蛋白酶酶原。在另一实施方式中，药物组合物还包含选自在上述实施方式中任一项中定义的类香兰素化合物和糖苷水解酶的活性剂。
第14方面提供根据第12或第13方面的药物组合物用于制备癌治疗用药物的用途。
第15方面提供治疗癌的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的根据第12或第13方面的药物组合物。
以上方面的药物组合物，蛋白酶酶原或活性剂，可提供到药学可接受的媒质，载体或稀释剂中，且可包括一种或更多药学可接受的赋形剂。
在以上方面的进一步实施方式中，药物组合物，剂，用途或方法，可包含一种或更多额外的活性剂，其能增强蛋白酶酶原，活性剂或药物组合物的功效，或减少不期望的副作用。
在以上方面的进一步实施方式中，药物组合物，蛋白酶酶原，活性剂和任选地额外的活性剂，可一起，独立地或以任何组合，以栓剂形式提供。
【附图说明】
图1A～D各显示以光学密度492nm的分别Caco2，HEK293，OE33和Panc1细胞的细胞数标准曲线的图；
图2显示用酶原参照制剂B处理的OE33细胞的显微照片；
图3显示用一系列浓度的酶原参照制剂B处理的OE33细胞的图；
图4A～C各显示分别用酶原参照制剂B，J和T处理的Panc1细胞的图；
图5A～C各显示分别用酶原参照制剂B，J和T处理的Caco2细胞的图；
图6A和6B各提供显示用酶原参照制剂J处理后OE33细胞中的β-连环蛋白的上调的显微照片；
图7A和7B各提供显示用酶原参照制剂J处理后OE33细胞中的E-钙粘蛋白的上调的显微照片；
图8A和8B各提供显示用酶原参照制剂J处理后Panc1细胞中的β-连环蛋白的上调的显微照片；
图9A和9B各提供显示用酶原参照制剂J处理后Panc1细胞中的E-钙粘蛋白的上调的显微照片；
图10A和10B各提供显示用酶原参照制剂J处理后Caco2细胞中的E-钙粘蛋白的上调的显微照片；
图11A和11B各提供显示用酶原参照制剂J处理后Caco2细胞中的β-连环蛋白的上调的显微照片；
图12提供显示用酶原参照制剂T处理后Panc1细胞中的β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的上调的显微照片；
图13提供显示用酶原参照制剂T处理后Caco2细胞中的β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的上调的显微照片；
图14提供A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中JBp1vP和DCM的等效线分析；
图15提供A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的等效线分析；
图16提供A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中胰蛋白酶原和α-淀粉酶的等效线分析；
图17提供A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中糜蛋白酶原和α-淀粉酶的等效线分析；
图18提供A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中TA和糜蛋白酶原的等效线分析；
图19提供A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中CA和胰蛋白酶原的等效线分析；
图20提供A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中TC和α-淀粉酶的等效线分析；
图21提供显示在安装纤维囊的小鼠的比较体内抗-血管发生研究中组1～5的各制剂的平均囊重量的条形图；
图22A和22B提供HCT-15细胞中JBp1vP和甲基硒代半胱氨酸的等效线分析；
图23A和23B提供HCT-15细胞中JBp1vP和2-脱氧葡萄糖的等效线分析；
图24A和24B提供HCT-15细胞中JBp1vP和辣椒酸酯的等效线分析；以及
图25A和25B提供HCT-15细胞中2-脱氧葡萄糖和甲基硒代半胱氨酸的等效线分析。
【缩写说明】
在实施例中，参照下列缩写，其中：
【发明详述】
尽管蛋白酶酶原制剂已显示在治疗癌中提供治疗性益处，但本领域不是完全明白蛋白酶酶原对癌细胞和恶性肿瘤的作用机理。申请人因此从事用包含胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的丝氨酸蛋白酶酶原制剂处理癌细胞系涉及的效应和机理的调查，其涉及对3种不同癌细胞系(Panc1,Caco2和OE33)的调查。值得注意的是惊人地发现，蛋白酶酶原涉及CaCo2肿瘤细胞的分化(恶性细胞可能的转变为非-恶性细胞)及在全部3种细胞系中E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达上调。
申请人相信由丝氨酸蛋白酶酶原制剂的转移的减少通过涉及细胞间粘接的E-钙粘蛋白/β-连环蛋白表达的上调和E-钙粘蛋白/β-连环蛋白复合物的形成出现。增加的细胞间粘接的推论是转移的减少，因为恶性细胞欠可能从原发性肿瘤漏出或逃逸。
随着此新信息的利用，本发明人研究了包含与能在治疗癌中提供工作相互关系的一种或更多活性剂组合的蛋白酶酶原的制剂。例如，活性剂可对关于E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达的不同功能肿瘤细胞操作来给单独酶原提供改善的癌治疗活性通过，但当总体结果在于提供增强的治疗时，其可包括转移的减少和/或凋亡的增加，免疫识别或肿瘤细胞的分化。换言之，第1和第2方面的药物组合物提供与活性剂组合的蛋白酶酶原，组合致使靶向或治疗癌细胞的多-细胞或多-功能方法。例如，酶原在肿瘤细胞的表面或接近肿瘤细胞的表面活化而促进细胞间粘接分子的表达和由此减少转移，而独立的活性剂，诸如甲基硒代半胱氨酸，可以细胞内水平操作而辅助肿瘤细胞的转移，分化或死亡(例如坏死,凋亡,免疫识别)的减少。
【蛋白酶酶原】
酶原(也称之为酶原)是不具有酶的特定活性的酶的前体形式，由此一般称之为无活性形式的酶。酶原维持它们的无活性状态直到需要，从而防止或减少在不期望的位点的酶活性的非特异性效应。酶原可通过导致活化级联的其他酶活化成对应活性酶，其包括多酶作用和自-活化。酶原被认为被癌细胞选择性地活化，其进而通过活性酶经历蛋白水解。
本文所用的术语"蛋白酶酶原"是指可原位活化成有活性的蛋白酶的蛋白酶的前体形式。蛋白酶酶原可为人或动物原。蛋白酶可作用而提供一种或更多细胞效应，包括蛋白水解，E-钙粘蛋白和/或β-连环蛋白的表达上调，凋亡，增强的免疫识别，及肿瘤细胞分化。蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶，苏氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶或谷氨酸蛋白酶。蛋白酶可为内肽酶或外肽酶。内肽酶(或内蛋白酶)是断裂非-末端(即在分子内)氨基酸的肽键的蛋白水解肽酶，相反，外肽酶在分子末端断裂肽键。
在一实施方式中，蛋白酶酶原是自3.4类酶的肽酶的酶的前体，特别是3.4.21类酶的丝氨酸内肽酶，及更特别是自3.4.21.1类酶的糜蛋白酶，自酶3.4.21.2的糜蛋白酶C或自3.4.21.4类酶的胰蛋白酶(根据国际生物化学与分子生物学联合会的命名委员会的分类分组的类)。
在一实施方式中，蛋白酶酶原是丝氨酸蛋白酶酶原。丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶或糜蛋白酶类型形式，舒替兰酶-型，α/β水解酶，及信号肽酶。丝氨酸蛋白酶可包括下列丝氨酸内肽酶：糜蛋白酶，metridin，胰蛋白酶，凝血酶，凝血因子Xa，纤溶酶，肠肽酶，顶体蛋白，α-裂解性内肽酶，谷氨酰内肽酶，组织蛋白酶G，凝血因子VIIa，凝血因子IXa，黄瓜素，脯氨酰寡肽酶，凝血因子Xia，brachyuran，血浆激肽释放酶，组织激肽释放酶，胰弹性蛋白酶，白细胞弹性蛋白酶，凝血因子XIIa，胃促胰酶，活化的补体C1r，活化的补体C1s，典型-补体-通路C3/C5转化酶，补体因子I，补体因子D，替代性的-补体-通路C3/C5转化酶，干酵母菌，皮下素C，赖氨酰内肽酶，内肽酶La，γ-肾素，腹蛇毒素AB，亮氨酰内肽酶，类胰蛋白酶，野黄芩苷，kexin，枯草杆菌蛋白酶，水稻素，肽酶K，嗜热霉菌素，热酶，内肽酶So，t-纤溶酶原活化物，蛋白C(活化的)，胰内肽酶E，胰弹性蛋白酶II，IgA-特异性丝氨酸内肽酶，u-纤溶酶原活化物，腹蛇毒素A，弗林蛋白酶，成髓细胞素，精胶蛋白酶，粒酶A，粒酶B，链灰菌素A，链灰菌素B，谷氨酰内肽酶II，寡肽酶B，鲎凝血因子C，鲎凝血因子B，鲎凝集酶，阻遏物LexA，信号肽酶I，披膜病毒素，黄病毒素，内肽酶Clp，蛋白原转化酶1，蛋白原转化酶2，蛇毒因子V活化物，lactocepin，次晶蛋白，肝病毒素，spermosin，sedolisin，xanthomonalisin，C-端处理肽酶，physarolisin，甘露聚糖-结合凝集素-关联的丝氨酸蛋白酶-2，菱形蛋白酶，hepsin，肽酶Do，HtrA2肽酶，matriptase，C5肽酶，aqualysin 1，位点-1蛋白酶，瘟病毒NS3多聚蛋白肽酶，马动脉病毒丝氨酸肽酶，感染性胰坏死双核糖核酸病毒Vp4肽酶，SpoIVB肽酶，角质层糜蛋白酶酶，激肽释放酶8，激肽释放酶13，oviductin。
在特定实施方式中，丝氨酸蛋白酶酶原是胰蛋白酶原，糜蛋白酶原或其混合物。酶原胰蛋白酶原和糜蛋白酶原可为选自3.4.21.1或3.4.21.2类的糜蛋白酶或自3.4.21.4类的胰蛋白酶的酶的前体，或选自任何其他适合的源。这些酶是可商购的和可为牛或猪起源。
糜蛋白酶原是酶糜蛋白酶的酶原形式，其优先在下列氨基酸切割蛋白：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸和亮氨酸。糜蛋白酶可指或包括糜蛋白酶A，糜蛋白酶B(包括B1和B2形式)，糜蛋白酶C，α-chymarophth，糜蛋白酶(avazyme)，糜蛋白酶(chymar)，糜蛋白酶(chymotest)，糜蛋白酶(enzeon)，糜蛋白酶(quimar)，糜蛋白酶(quimotrase)，α-糜蛋白酶(chymar)，α-糜蛋白酶A，α-糜蛋白酶。糜蛋白酶C可由猪糜蛋白酶原C或由羧肽酶原A的牛亚基II形成，及优先在下列氨基酸切割蛋白：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺。糜蛋白酶原包括糜蛋白酶原B1和糜蛋白酶原B2。
胰蛋白酶原是胰蛋白酶的酶原形式，其优先在精氨酸和赖氨酸切割蛋白。胰蛋白酶可指或包括α-胰蛋白酶，β-胰蛋白酶，茧酶，胰蛋白酶(parenzyme)，胰蛋白酶(parenzymol)，胰蛋白酶(tryptar)，胰蛋白酶(trypure)，假胰蛋白酶，类胰蛋白酶，胰蛋白酶(tripcellim)，精子受体水解酶β-胰蛋白酶可由胰蛋白酶原通过切割一个肽键形成。进一步肽键切割产生α和其他亚型。多种阳离子和阴离子胰蛋白酶可从许多脊椎动物的胰腺及自低等物种包括螯虾，昆虫(茧酶)和微生物(灰色链霉菌(Streptomyces griseus))分离。在消化期间的正常过程中，无活性胰蛋白酶原通过存在于肠粘膜的肠肽酶活化而形成是丝氨酸蛋白酶的酶胰蛋白酶，然后发挥在碱性氨基酸/蛋白的羧基侧切割肽键的作用。
如上所述，酶原形式基本上提供会原位活化(例如体内或体外活化)的灭活的形式的酶。例如，酶原的活化(酶原转变为活性酶)可在与肿瘤细胞的表面接触处发生。认为酶原胰蛋白酶原和糜蛋白酶原在与肿瘤细胞接触处及而非与健康细胞接触处选择性地活化成酶胰蛋白酶和糜蛋白酶。酶原的使用减少与原位提供活性酶关联的问题，诸如在达到旨在的肿瘤细胞靶之前酶的不期望的反应或灭活。
关于肿瘤细胞，蛋白酶可通过切割存在于细胞壁的肽链的酰胺键(蛋白水解)来发挥断裂恶性细胞的细胞壁的作用。也明白在恶性肿瘤细胞中缺乏蛋白酶抑制物，其存在于非-恶性细胞及抑制或降低酶在断裂细胞壁中的效应。除了提供蛋白水解活性之外，蛋白酶酶原可上调肿瘤细胞中β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的表达。通过在细胞表面β-连环蛋白和E-钙粘蛋白之间的复合物形成或键合辅助细胞间粘接，由此β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的增加的表达导致增强的细胞间粘接和由此减少肿瘤细胞的转移。蛋白酶酶原也可提供其他细胞活性诸如增加的免疫识别或分化。
【活性剂】
第1方面，第2方面，第12方面和第13方面的活性剂，用于治疗癌或诱导细胞内活性而增强肿瘤细胞的治疗。
在一实施方式中，细胞内活性是肿瘤细胞凋亡，坏死，免疫识别或分化。
关于多-功能方法，在一实施方式中活性剂能在治疗癌中提供与蛋白酶酶原的工作相互关系。例如，活性剂可提供可或可不涉及E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达的改善的癌治疗活性，但其中总体结果是提供增强的治疗，诸如转移的减少和/或凋亡的增加，肿瘤细胞的免疫识别或分化。活性剂可以细胞内水平操作而辅助肿瘤细胞的转移，分化或死亡(例如坏死,凋亡,免疫识别)的减少。
在一实施方式中，活性剂选自下列中的至少一种：硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂，及任选地糖苷水解酶。例如，活性剂可由硒化合物组成，或可为由下列组成的活性剂的组合：硒化合物，类香兰素化合物，糖苷水解酶，及细胞质糖酵解减少剂。
【硒化合物】
在一实施方式中，术语"硒化合物"表示能提供生物可利用的硒源的任何含有硒的化合物。硒化合物可包括无机化合物，诸如含有亚硒酸盐和硒酸盐的矿物质，及有机化合物，诸如甲基硒代半胱氨酸。硒化合物可作为植物提取物或自商业合成获得。在特定实施方式中，硒化合物提供可容易被身体吸收到血浆或细胞间液的生物可利用的硒源。
在一实施方式中，术语"硒化合物"是指含有二价或四价硒化合物的氨基酸。氨基酸可选自异亮氨酸，丙氨酸，亮氨酸，天冬酰胺，赖氨酸，天冬氨酸，甲硫氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺，色氨酸，甘氨酸，缬氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸，精氨酸，组氨酸。二价或四价硒也可存在于可在这些氨基酸中天然地发生的硫或其他二价物质的取代中的氨基酸。
在一实施方式中，术语"硒化合物"是指含有式I的二价硒化合物或式II的四价硒化合物的化合物：
或其药学可接受的盐，其中：
R1和R3各独立地选自H，OH，-C(O)H，-C(O)OH，-C(O)-OR5，C1～4烷基及C2～6烯基，其中C1～4烷基和C2～6烯基任选地被独立地选自下列的0～3种取代基取代：卤素，OH，-NH2，-C(O)OH，-C(O)-OR5；
R2和R4各独立地选自H，OH，-C(O)H，-C(O)OH，-C(O)-OR5，C1～12烷基和C2～12烯基，其中C1～12烷基和C2～12烯基任选地被选自下列的一种或更多基团间断：-NH-，-N(C1～4烷基)-，-NH(CO)-，-C(O)-，-C(O)O-，-O-及-C(NH2)H-C(O)O-，及任选地被独立地选自下列的0～3种取代基取代：卤素，-NH2，-OH，-C1～4烷基，-C(O)OH，-C(O)H，-C(O)-OR5，-N(C1～4烷基)H，-N(C1～4烷基)2，-C(NH2)H-C(O)OH，环烷基，环烯基和芳基；以及
其中R5选自烷基，烯基，环烷基和环烯基，特别是C1～12烷基。
在以上实施方式中，需知：
C1～4烷基和C1～12烷基是指直链，分支的或环烷基链，或其组合；以及
C2～6烯基和C2～12烯基是指直链，分支的或环烯基链，或其组合。
在特定实施方式中，R1和R3各独立地选自H，OH和C1～4烷基，且更特别是甲基。
在另一特定实施方式中，R2和R4各独立地选自H，OH及-C1～6烷基-C(NH2)H-C(O)OH，且更特别是-C1～3烷基-C(NH2)H-C(O)OH。
在另一实施方式中，硒化合物选自甲基硒代半胱氨酸，甲基硒醇和甲基硒酸，或其药学可接受的盐或混合物。在特定实施方式中，硒化合物是甲基硒代半胱氨酸或其药学可接受的盐。
选择硒化合物而通过提供治疗癌的工作相互关系或多功能方法来增强蛋白酶酶原的治疗功效。例如，硒化合物可诱导细胞内活性而通过肿瘤细胞凋亡，免疫识别和/或分化的方式来增强肿瘤细胞的治疗。
硒摄入和癌之间的关联已知道有数十年。硒是具有55μg的推荐膳食供给量(RDA)的必要的痕量矿物质。硒是对于活化各种关键酶必要的，诸如抗氧化谷胱甘肽过氧化物酶，代谢酶硫氧还蛋白还原酶，及甲状腺-激素-活化酶碘甲状腺原氨酸脱碘酶。硒已被认为通过增强细胞和肝抗氧化活性(谷胱甘肽过氧化物酶)或通过促进环境致癌物的去除(谷胱甘肽S-转移酶)来提供抗癌保护。有机形式的硒，诸如硒代蛋氨酸，可在约3500μg/天的水平有毒性，而无机形式的硒，诸如亚硒酸钠/硒酸盐，可在约1500μg有毒性。硒以约400mcg/天水平长期施剂是安全的，尽管癌治疗流程可以约900～2,000mcg硒/天的范围治疗。
一些硒抗癌效应已显示在接近于潜在地毒性剂量水平的剂量发生，仍硒蛋白酶一般(活性最大化的)在仅90mcg硒/天的饮食摄入饱和，远在最佳抗癌剂量以下。
相比典型有机形式，诸如硒代蛋氨酸，无机形式，诸如亚硒酸盐/硒酸盐，已显示在治疗癌上更有效。亚硒酸盐/硒酸盐形式可代谢成硒化氢，其对于癌细胞和健康细胞均有毒性，且通过欠选择性和更侵袭性坏死机理(与凋亡相反)操作。硒代蛋氨酸少毒性，但大大地掺入无抗癌活性的一般的体蛋白。
甲基硒代半胱氨酸(也称之为Se-甲基硒代半胱氨酸)是阻断细胞周期进展和恶变前乳腺损伤的增殖，及诱导癌细胞系的凋亡，具有非常低毒性和身体蓄积的化学保护剂。甲基硒代半胱氨酸在高硒土壤上生长的各种植物，包括大蒜，野生韭菜，洋葱和嫩茎花椰菜上天然地形成，且富含甲基硒代半胱氨酸的食品显示了良好抗癌活性，无过量组织蓄积或毒性。甲基硒代半胱氨酸通过β-裂合酶转化为甲基硒醇。关于针对肿瘤细胞的活性，甲基硒醇已知抑制血管发生及导致凋亡，但具有低毒性，且容易被身体清除。
各种硒化合物的下列化学结构是：
根据以上实施方式的硒化合物可包括全部药学可接受的盐，水合物，溶剂化物，结晶单形，非对映异构体，构象异构体(例如顺式和反式异构体)，互变异构体，药物前体，代谢物和其对映体形式。
【类香兰素化合物】
在一实施方式中，术语"类香兰素化合物"表示含有香兰基或香兰酰类型部分或药团的任何化合物。类香兰素化合物包括知道的天然存在的类香兰素的化学品类诸如resiniferanoid，类辣椒素，不饱和的二醛，及三异戊二烯基苯酚。例如，自这些知道的化学品类的化合物分别包括仙人掌毒素，辣椒素，isovelleral及scutigeral。其他类香兰素化合物的例包括香兰素，香兰酸，诺香草胺，奥伐尼，二氢辣椒素和香兰基扁桃酸。类香兰素化合物可包括天然地获得的化合物，诸如辣椒素或半-合成或合成类香兰素诸如抗辣椒素。
在另一实施方式中，术语"类香兰素化合物"是指通式III的化合物：
或其药学可接受的盐，其中：
R1和R2各独立地选自H，OH，OCH3，C(O)H，OC2～6烷基，OC2～6烯基，SH，SC1～6烷基，NH2，NHC1～6烷基和N(C1～6烷基)2；
R3和R4各独立地选自H，C1～20烷基，C2～20烯基和C2～20炔基，其中C1～20烷基，C2～20烯基和C2～20炔基，任选地被选自下列的一种或更多基团间断：-NR6-，-NH(CO)-，-C(O)-，-C(O)O-，-O-，-C(NR6R6)H-C(O)O-，-C(S)-，-C(S)NR6-及-NR6-C(S)-NR6，及任选地被独立地选自下列的0～3种取代基取代：卤素，-NH2，-OH，-C1～4烷基，-C(O)OH，-C(O)OR5，-C(O)H，-N(C1～4烷基)H，-N(C1～4烷基)2，-C(NH2)H-C(O)OH，-C(S)-，任选地取代的环烷基，任选地取代的环烯基和任选地取代的芳基；以及
其中R5选自烷基，烯基，环烷基，环烯基，特别是C1～12烷基；及R6选自H，C1～6烷基；及R3和R4可接合而形成任选地取代的不饱和的或饱和的环，在所述环中具有3～8个碳原子，且所述环包括选自O，S和N的0～3个杂原子。
在以上实施方式中，需知：
C2～6烷基和C1～20烷基是指直链，分支的或环烷基链，或其组合；
C2～6烯基和C2～20烯基是指直链，分支的或环烯基链，或其组合；
C2～20炔基是指直链，分支的或环炔基链，或其组合；
任选地取代的环烷基，任选地取代的烷基环烯基和任选的取代的芳基是指被一种或更多选自下列的基团任选的取代：卤素，-NH2，-OH，-C1～4烷基，-C(O)，-C(O)OH，-C(O)OR5，-C(O)H，-N(C1～4烷基)H，-N(C1～4烷基)2，-C(NH2)H-C(O)OH，环烷基，环烯基和芳基，及例如会包括仙人掌毒素。
在特定实施方式中，R1和R2各独立地选自OH，C(O)H和OCH3，且更特别是OH和OCH3。
在另一特定实施方式中，R3选自-C1～4烷基-NH-C(O)-C1～12烯基，-C1～4烷基-NH-C(O)-C1～12烷基，且更特别是-CH2-NH-C(O)-C4H8-CH＝CH-CH(CH3)CH3。需知，在此实施方式中，烷基或烯基链可为直链或分支的。
在另一特定实施方式中，R3选自-C1～4烷基-O-C(O)-C1～12烯基，-C1～4烷基-O-C(O)-C1～12烷基，且更特别是-CH2-O-C(O)-C4H8-CH＝CH-CH(CH3)CH3。需知，在此实施方式中，烷基或烯基链可为直链或分支的。
在另一特定实施方式中，R4是H。
类香兰素化合物可选自辣椒素，二氢辣椒素和正二氢辣椒素。
优选地，类香兰素化合物选自辣椒酸酯，二氢辣椒酸酯和正二氢辣椒酸酯。在一实施方式中，类香兰素化合物是辣椒酸酯。辣椒酸酯，二氢辣椒酸酯和正二氢辣椒酸酯，优选以基本上无辣椒素的形式提供，例如具有至少80％，85％，90％，95％，98％，99％或99.9％的纯度。需知，辣椒酸酯，其一般作为自辣椒的提取物获得，通常含有小量的辣椒素和其他结构上类似的化合物。辣椒素可呈现不期望的炎性应答(通过引发大局部组胺释放)，由此，特定类型的施用方案可为对于特定化合物，或对于特定量或纯度的那些化合物欠期望，其可剪切以适合特定需求。高纯度辣椒酸酯的一个来源由Ajinomoto Co产的"CH-19"甜椒提供。
在另一实施方式中，类香兰素化合物选自8-甲基-N-香兰基-6-壬-烯酰胺；N-香兰基壬酰胺；N-(9-癸烯基)-4-羟基-3-甲氧基-乙酰苯胺；N-(9Z-十二烯基)-4-羟基-3-甲氧基苯基乙酰胺；N-(9Z-十四烯基)-4-羟基-3-甲氧基苯基乙酰胺；N-((4-羟基-3-甲氧基苯基)-甲基)-9-癸烯酰胺；N-((4-羟基-3-甲氧基苯基)-甲基)-9Z-十二烯酰胺；N-((4-羟基-3-甲氧基苯基)-甲基)-9Z-十四烯酰胺和N-((4-(3-苯基-2(S)-2-氨基-1-丙氧基)-3-甲氧基苯基)-甲基)-壬酰胺。
在另一实施方式中，类香兰素化合物是抗辣椒素，即N-[2-(4-氯苯基)乙基]-7,8-二羟基-1,3,4,5-四氢-2-苯并氮-2-硫代甲酰胺。
许多类香兰素，显著地辣椒素，结合到瞬时受体潜在类香兰素1型(TRPV1)受体，天然地应答有害刺激诸如高温和酸性pH的离子通道。对TRPV1作用的其他类香兰素包括仙人掌毒素和奥伐尼。
类香兰素化合物包括辣椒素和辣椒酸酯，其也称之为类辣椒素。类辣椒素，其包括辣椒酸酯，二氢辣椒酸酯和正二氢辣椒酸酯，是天然地存在于辣椒的物质。尽管它们结构上类似于是造成辣椒辛辣的化合物的辣椒素，类辣椒素大大地缺乏此特征，且具有辣椒素的估计的“热味觉阈限”的约1/1000的估计的“热味觉阈限”。
辣椒素是(E)-N-[(4-羟基-3-甲氧基苯基)甲基]-8-甲基-6-壬烯酰胺，及其类似物包括二氢辣椒素，其是辣椒素的6,7-二氢衍生物。如上所述，类辣椒素包括辣椒酸酯，即4-羟基-3-甲氧基苄基(E)-8-甲基-6-壬烯酸酯，二氢辣椒酸酯，即4-羟基-3-甲氧基苄基8-甲基壬酸酯，及正二氢辣椒酸酯，即4-羟基-3-甲氧基苄基7-甲基辛酸酯。这些化合物的一些的化学结构如下：
辣椒酸酯可提供凋亡及减少的肿瘤发病率。辣椒酸酯被认为通过经细胞线粒体影响细胞的氧化还原状态来诱导凋亡。
选择类香兰素化合物而通过提供治疗癌的工作相互关系或多功能方法来增强蛋白酶酶原的治疗功效。例如，类香兰素化合物可诱导细胞内活性而通过肿瘤细胞凋亡，免疫识别和/或分化的方式来增强肿瘤细胞的治疗。
香兰素，香兰酸和仙人掌毒素的下列化学结构是：
根据以上实施方式的类香兰素化合物可包括全部药学可接受的盐，水合物，溶剂化物，结晶单形，非对映异构体，构象异构体(例如顺式和反式异构体)，互变异构体，药物前体，代谢物和其对映体形式。
【糖苷水解酶】
在一实施方式中，术语"糖苷水解酶"表示可水解2个或更多碳水化合物之间，或碳水化合物和非-碳水化合物部分之间的糖苷键的任何酶。糖苷水解酶可为自3.2.1类的酶，特别是自3.2.1.1～3.2.1.3类的酶。在一实施方式中，糖苷水解酶是淀粉酶。淀粉酶可选自α-淀粉酶，β-淀粉酶和γ-淀粉酶，更特别是淀粉酶2，淀粉酶α1A，淀粉酶α1B，淀粉酶α1C，淀粉酶α2A，淀粉酶α2B。在一实施方式中，淀粉酶是α-淀粉酶。
淀粉酶是糖苷水解酶及作用于α-1,4-糖苷键。淀粉酶断裂存在于肿瘤细胞的表面糖蛋白上的碳水化合物。选择淀粉酶而通过提供治疗癌的工作相互关系或多功能方法来增强蛋白酶酶原的治疗功效。淀粉酶可为人，动物，细菌或种植起源。例如，α-淀粉酶可获自米曲霉(Aspergillus oryzae)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，大麦麦芽，猪胰腺，人胰腺，猪胰腺，及小麦(Triticum aestivum)中的任一种。
【细胞质糖酵解减少剂】
在一实施方式中，术语"细胞质糖酵解减少剂"表示能减少细胞质糖酵解的剂。在另一实施方式中，细胞质糖酵解减少剂是2-脱氧-D-葡萄糖，或其药学可接受的盐，酯或药物前体。
选择细胞质糖酵解减少剂而通过提供治疗癌的工作相互关系或多功能方法来增强蛋白酶酶原的治疗功效。
细胞质糖酵解减少剂可为糖酵解的阻断剂或抑制物，例如，对于厌氧地代谢细胞更特异性和可抑制乳酸脱氢酶的草氨酸酯，或可抑制在甘油醛3-磷酸脱氢酶的糖酵解的碘代乙酸酯。
糖酵解抑制物可包括2-脱氧-D-葡萄糖的亲脂性类似物或药物前体。亲脂性类似物包括羟基的衍生物，如酯，醚，磷酸酯。其他包括去除羟基和用卤素如氟或碘，或用氢硫基或烷硫基取代。脂质体配制的2-脱氧-葡萄糖和其类似物可提供或是2-脱氧葡萄糖的酶学地可切割的衍生物。例包括糖苷在C-1位置的葡萄糖醛酸苷。可作为2-脱氧-D-葡萄糖的药物前体作用的2-脱氧-D-葡萄糖的亲脂性类似物，诸如2-脱氧-D-葡萄糖的单酯和二酯，可包括例诸如戊酸酯，肉豆蔻酸酯和棕榈酸酯。
糖酵解抑制物也可包括6-脱氧-D-葡萄糖，6-氟-D-葡萄糖，6-O-甲基-D-葡萄糖，6-硫代-D-葡萄糖,2-脱氧-D-葡萄糖本身和其类似物，2-脱氧-2-卤代-D-葡萄糖，例如2-溴-，2-氟-或2-碘-D-葡萄糖，3-脱氧或3-氟-D-葡萄糖或4-脱氧或4-氟-D-葡萄糖，2-氟或3-氟-甘油醛或甘油酸，例如，3-氟-2-磷酸甘油酸，2-氟-丙酸或其盐，2,2-二氟-丙酸，3-卤代-丙酮酸，3-卤代丙酸，2,2-甲硫基乙酸，1-脱氧-D-葡萄糖，5-硫代-D-葡萄糖，3-氟-D-葡萄糖和4-氟-D-葡萄糖，2-氟-，2-碘-，2-硫代或2-甲氧基-甘油醛或甘油酸，3-氟-，3,3-二氟-，烯醇酶3-碘-，3-羧基-及3-硫代甘油酸。
在一实施方式中，术语"细胞质糖酵解减少剂"是指式IV的化合物：
式IV
或其药学可接受的盐，药物前体或酯，其中：
X选自O和S；
R1选自H，卤素，OH，-OC(O)R6；
R2～R4各独立地选自H，卤素，OH，-OC(O)R6；
R5选自卤素，OH，SH，-OC(O)R6；以及
R6是C1～20烷基。
卤素优选是指F，Br或I，更优选F。可个别或以任何其组合取各下列各种实施方式。X是O。R1是OH。R2是H或F。R3是OH或F。R4是OH或F。R5是OH，F或SH。
在另一实施方式中，X是O，R1选自OH，R2选自H，Br，F，I，OH，-C(O)-OR6，其中R6选自C1～20烷基，及R3～R5是OH。优选地，R2是H。
【额外的活性剂】
第1方面，第2方面，第12方面和第13方面的药物组合物，可还包含其他活性剂。这些活性剂的添加可增强癌的治疗。使用此方法，用更低剂量的各剂可能达到治疗性功效，由此减少潜在不利的副作用。也可能减少不期望的副作用及允许使用更高剂量的各剂。额外的活性剂可提供补充性，额外的或增强的治疗剂功能。
第1方面，第2方面，第12方面和第13方面的药物组合物，可因此含有提供补充性，额外的或增强的治疗剂功能的下列额外的活性剂中的一种或更多种：
●抗氧化剂，包括维生素C(抗坏血酸)，维生素E(生育酚,生育酚)，多酚抗氧化剂(白藜芦醇,类黄酮)，类胡萝卜素(蕃茄红素,胡萝卜素,叶黄素)。白藜芦醇显示了抗肿瘤和化学保护能力，特别是用于治疗人乳腺癌细胞的反式-白藜芦醇。
●L-苏氨酸，即γ-谷氨酰乙基酰胺或5N-乙基-谷氨酰胺，其是谷氨酸类似物或氨基酸衍生物。
●类姜黄素，姜黄素或其衍生物。
●β葡聚糖(1-3,1-6β葡聚糖)。
●氰化氢(HCN)-例如LPO产生的OSCN离子可加速蛋白水解。
●植物营养物提取物，包括黄酮醇，叶黄素，liminoid。
●蛋白酶抑制物，例如抑肽酶，也称之为牛胰腺胰蛋白酶抑制物。酶抑制物与药物组合物组合使用可辅助抑制可存在于远离肿瘤细胞的系统/身体的任何蛋白酶，由此减少该活性酶的任何不期望的效应。
●生长因子(例如,BMP,TGF-P,FGF,IGF)。
●细胞因子(例如,白细胞介素和CDF)。
●抗生素。
●肿瘤坏死因子(TNF)，能抑制或中和酸性或碱性成纤维细胞生长因子(FGF)的血管发生活性的抗体，或肝脏细胞生长因子(HGF)，能抑制或中和组织因子，蛋白C或蛋白S的促凝活性的抗体，能结合HER2受体的抗体。
●对于治疗癌有益的任何其他活性剂。
当其他额外的治疗剂与第1和第2方面的蛋白酶酶原或活性剂组合使用时，它们可以医师案头参考(PDR)注意的或通过本领域普通技术人员另外测定的量使用。
【术语】
关于蛋白酶酶原，"活化"是指蛋白酶酶原原位(例如体外或体内)转变为能增强肿瘤细胞的细胞间粘接，实现肿瘤细胞的蛋白水解，或诱导肿瘤细胞凋亡，分化或免疫识别的形式。
"凋亡"是通常控制的，有序的，小心的细胞自身-破坏的过程，其可通过各种刺激引发。凋亡相比坏死欠侵袭性，其可损伤周围组织及导致发炎。
“血管发生”指称血管形成，特别是新毛细管自既有血管增殖。对于癌细胞生长为肿瘤，血管发生是必需的，因为相比正常细胞，癌细胞需求显著更大血供给来生存。血管发生或血管发生事件涉及许多病理学过程，显著地肿瘤生长和转移，及血管增殖的其他病情，尤其微血管系统增加，诸如糖尿病性视网膜病变，银屑病和关节病。
术语"细胞外周"是指在细胞周围组织，接近细胞周围组织或在细胞周围组织之内。更具体而言，术语是指在肿瘤细胞周围组织或在肿瘤细胞周围组织之内。
术语"细胞内"是指细胞之内。
术语"分化"，"分化"或其类似变异是指细胞成为就不同功能更特化的能力。在一个水平，恶性肿瘤细胞被认为是脱分化了的细胞，其是指它们是成为欠特化了的更特化的细胞，且在该过程中，身体的限制这些恶性细胞生长的能力变得缓和。肿瘤细胞的分化因此涉及恶性细胞，至少部分，向健康或正常细胞类型的转化，其是指恶性细胞以减少不受控的生长，侵入和/或转移的性质的方式的转化。
术语"免疫识别"是指被免疫系统识别，和随后被免疫系统移出或消除。免疫系统的一种作用是鉴定及消除肿瘤。转化的肿瘤细胞表达正常细胞上未发现的抗原。对于免疫系统，这些抗原呈现为外源，及它们的存在导致免疫细胞攻击转化的肿瘤细胞。一些形式的癌细胞也具有预防或减少免疫识别的能力。
术语"转移(metastasis)"，"转移的(metastasized)"或其类似变化形式指称疾病自身体的一种器官或部分扩散到身体的另一非-相邻器官或部分。恶性肿瘤细胞和感染具有转移的能力。例如，癌细胞可自原发性肿瘤掉下或逃逸，进入淋巴和血管，通过血流循环，及在身体的别处再沉积。转移后自原发性肿瘤形成的新肿瘤称之为继发性或转移性肿瘤，且与原发性或原肿瘤包含相同的细胞。例如，转移到肺的乳腺癌形成包含异常乳腺细胞，而非异常肺细胞的继发性肿瘤，且称之为转移性乳腺癌，而非肺癌。
术语"恶性(malignancy)"，"恶性(malignant)"或其类似变化形式指称癌细胞和肿瘤持续生长及发育的趋势，其涉及退行性变化，侵袭性和转移的特性。例如，恶性肿瘤可与非-癌性良性肿瘤对比，其中恶性不是其生长被自身-限制的，能侵袭进相邻组织，且可能扩散到远处的组织(转移)，而良性肿瘤无那些性质。
"退行性变化"指称细胞分化的逆转，其为恶性肿瘤的特征。此术语含盖增加的倍增能力。退行性变化涉及分化的缺乏，增加的脱分化或存在于正常细胞的结构和功能分化的增加的损失。
"蛋白水解"是被称之为蛋白酶的细胞酶或由分子内消化的蛋白的导向的降解(消化)。更具体而言，蛋白水解是通过蛋白酶切割，通过水解蛋白中的酰胺/肽键的蛋白的断裂。
术语"细胞间粘接"，"细胞粘接分子"或其类似术语指称通常位于细胞的外部表面及涉及一个细胞与另一细胞的结合的一系列知道的细胞间粘接分子，E-钙粘蛋白和β-连环蛋白是其例。不同细胞类型可具有这些分子的替代性的形式。这些分子可额外地涉及与细胞外基质的粘接。其他细胞间粘接分子可选自钙粘蛋白，整联蛋白，选择素和免疫球蛋白细胞粘着蛋白家族。
术语"同源物"和"功能相当体"应包括其他蛋白或变体，诸如知道的同一蛋白家族之内的分子，除了重组分子之外。
"上调"是指，此包括相对预定的参照水平增加分子的表达或活性水平。此可为参照水平以上至少5％的增加。但是，特别优选的，会是相对参照水平上调至少10％，20％、30％，40％或50％或更多。参照水平可通过各种手段，诸如根据在治疗之前的分子的表达或活性，或根据给定细胞类型的正常或预期的水平来测定。
【方法和用途】
第5～第9方面或第14方面的用途，或第10方面或第15方面的方法，可涉及下列效应中的一种或更多：减少恶性肿瘤的再发生，减少恶性肿瘤转移，减小肿瘤数或尺寸，肿瘤细胞的分化，恶性肿瘤中β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的表达而辅助细胞间粘接和减少转移，减小肿瘤细胞阻止免疫识别的能力。
一实施方式提供在受试者中使癌细胞分化的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的第1和第2方面的蛋白酶酶原和活性剂一定时间及在诱导癌细胞分化足够的条件下。第5和第6方面的用途和第7方面的方法可涉及癌细胞分化。在一特定实施方式中，癌细胞分化是结肠癌细胞的分化。
在一实施方式中，第5～第9方面或第14方面的用途，或第10方面或第15方面的方法，当用于治疗转移性癌时有益。转移是疾病扩散到身体的其他部分的癌的阶段。转移的预防或延迟因此特别重要，因为此阶段伴随显著的其他治疗的成功的减少和受试者存活的减少。在另一实施方式中，通过给受试者施用有效量的第1和第2方面的蛋白酶酶原和活性剂来上调癌细胞中的细胞间粘接分子提供预防，延迟或另外改善癌转移的安全的和有效手段。
“治疗”或“治疗”指称治疗性治疗和预防性或预防性量度，其中目的是预防，改善，减少或减慢(减少)癌或其扩散(转移)。
“预防(Preventing)”，“预防(prevention)”，“预防(preventative)”或“预防(prophylactic)”指称保持不发生，或阻碍，防御或保护免于病情，疾病，病症或表型，包括异常或症状发生。需求预防的受试者可倾向于发展病情。
术语“改善”或“改善”指称减小，减小或消除病情，疾病，病症或表型，包括异常或症状。需求治疗的受试者可已患病情，或可倾向于患病情或可为待预防病情的受试者。
“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可为人，或可为家养，动物园或伴侣动物。而本发明的方法特别涵盖的是适合于人的医疗治疗，它们也可应用于兽医学治疗，包括治疗伴侣动物诸如狗和猫，及家畜诸如马，牛和绵羊，或动物园动物诸如猫科动物，犬科动物，牛科动物和有蹄动物。受试者可患癌或其他病症，或可不患癌或其他病症(即,无可检测的疾病)。
术语“治疗有效量”指称能治疗，预防或改善癌或其扩散(转移)的量的组合物，或在组合物中剂或化合物。治疗有效量可依经验及以关于治疗癌的常规方式测定，且会导致增加的预期寿命。
第5～第9方面或第14方面的用途，或第10方面或第15方面的方法，可涉及肿瘤及相关的病情，癌，肿瘤，恶性和转移性病情的治疗。与可用第1和第2方面的蛋白酶酶原和活性剂治疗的实体瘤和转移关联的组织和器官包括，但不是限于，胆道，膀胱，血，脑，乳腺，子宫颈，结肠，子宫内膜，食管，头，颈，肾，喉，肝，肺，髓，黑色素，卵巢，胰腺，前列腺，直肠，肾，视网膜，皮肤，胃，睾丸，甲状腺，尿道，及子宫。
第5～第9方面或第14方面的用途，或第10方面或第15方面的方法，特别适合于治疗下列类型的癌和转移性癌：胰腺癌，食管癌，结肠癌，肠癌，前列腺癌，卵巢癌，胃癌，乳腺癌，恶性黑色素瘤或肺癌。
第5～第9方面或第14方面的用途，或第10方面或第15方面的方法，可提供治疗癌的多效应方法，例如通过增加肿瘤细胞凋亡，细胞间粘接，分化和免疫原性(靶向免疫系统及被免疫系统清除)。其因此对于在可抑制或伤害免疫系统的任何其他治疗的缺失下进行治疗有益。
在一实施方式中，第5～第9方面或第14方面的用途，或第10方面或第15方面的方法，涉及具有低水平的E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达的受试者的治疗。也可鉴定特别适合于根据以上方面的方法或用途治疗的其他患者组。
第5～第9方面或第14方面的用途，或第10方面或第15方面的方法，可通过导向增殖性病症(例如,肿瘤)的治疗或预防的其他常规抗-癌治疗方法补充。例如，该方法可用于预防性癌预防，预防癌复发和手术之后转移，及作为其他常规癌治疗的佐剂。
【药学组合物，制剂和施用途径】
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，可，例如，通过采用常规固体或液体媒质或稀释剂，以及对于期望的施用模式适当的类型的药学添加剂(例如,赋形剂,结合剂,防腐剂,稳定剂,香料,等)，根据技术诸如药学制剂领域熟知的那些配制。
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，可由任何适合的手段施用，例如，经口，诸如以片剂，胶囊，颗粒剂或粉剂形式；舌下；经颊；肠胃外，诸如通过皮下，静脉内，肌内或池内注射或输注技术(例如,作为无菌可注射的水性或非-水溶液或悬浮液)；经鼻诸如通过吸入喷雾剂；局部，诸如以霜剂或软膏形式；或经直肠诸如以栓剂形式；以含有非-毒性，药学可接受的媒质或稀释剂的剂量单元制剂。它们可，例如，以适合于立即释放或缓释的形式施用，例如，通过使用装置诸如皮下植入物，包裹的球或渗透泵。
除了灵长类动物，诸如人之外，各种其他哺乳动物可根据第10方面的方法治疗。例如，可治疗哺乳动物包括但不限于牛，绵羊，山羊，马，狗，猫，豚鼠，大鼠或其他牛，绵羊，马，狗，猫，啮齿动物或鼠物种。
本文所用的术语"组合物"旨在包括包含蛋白酶酶原和一种或更多活性剂，及任选地一种或更多额外的活性剂的产品，以及由其直接或间接产生的任何产品。
本文所用的术语"药学可接受的"是指对其受者不是有害的载体，稀释剂或赋形剂。
术语"施用(administration of)"和/或"施用(administering)"应理解为是指提供给需求治疗的个体。
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，及其制备物或制剂可通过将组合物的组分，即蛋白酶酶原与包括硒化合物和/或类香兰素化合物的一种或更多活性剂一起混合来制备。在进一步实施方式中，组分可包括本文所述的额外的活性剂。混合可依次或同时进行。
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，可便利地以剂量单元形式提供，且可通过药学领域熟知的任何方法制备。全部方法包括使活性剂和蛋白酶酶原与构成一种或更多附属成分的载体结合的步骤。一般而言，药物组合物通过均匀和密切地使活性剂和蛋白酶酶原与液体载体或精致切分的固体载体或二者结合来制备，然后，如果必需，将产物整形为期望的制剂。活性剂和蛋白酶酶原以在单次或重复的施用之后足以对疾病的过程或条件产生期望效果的量的剂量单元形式提供。
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，可为适合于口服用途的形式，例如，作为片剂，含片，锭剂，水性或油性悬浮液，可分散粉剂或颗粒剂，乳剂，硬质或软胶囊，或糖浆或酏剂。旨在口腔用途的组合物可根据制备药物组合物领域知道的任何方法来制备，且该组合物可含有选自下列的一种或更多剂：甜味化剂，调味剂，着色剂及保存剂，以便提供药学优美及可口的制备物。片剂含有第1和第2方面的蛋白酶酶原和活性剂，其与适合于片剂制备的非-毒性药学可接受的赋形剂混合。这些赋形剂可为例如，惰性稀释剂，诸如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；粒化及解离剂，例如，玉米淀粉或藻酸；结合剂，例如淀粉，明胶或阿拉伯胶，及润滑剂，例如硬酯酸镁，硬脂酸或滑石粉。片剂可未包被或它们可通过知道的技术包被以延迟消化道中的解离和吸收，由此提供更长时期持续的作用。可采用例如，时间延迟物质诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可经包被而形成控制释放用渗透性治疗性片剂。
口腔用途用制剂也可提供为硬质明胶胶囊，其中第1和第2方面的蛋白酶酶原和活性剂与惰性固体稀释剂，例如，碳酸钙，磷酸钙或高岭土混合，或提供为软明胶胶囊，其中第1和第2方面的蛋白酶酶原和活性剂与水或油介质，例如花生油，液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬浮液含有与适合于水性悬浮液制备的赋形剂混合的活性剂和蛋白酶酶原。该赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟基-丙基甲基纤维素，藻酸钠，聚乙烯基-吡咯烷酮，黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或润湿剂可为天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷烃与脂肪酸，例如聚氧乙烯硬酯酸的缩合产物，或环氧乙烷与长链脂肪族醇，例如十七乙烯氧基鲸蜡醇的缩合产物，或环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇的部分酯诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯的缩合产物，或环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇酐的部分酯，例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯的缩合产物。水性悬浮液也可含有一种或更多防腐剂，例如乙基，或n-丙基，p-羟基苯甲酸酯，一种或更多着色剂，一种或更多调味剂，及一种或更多甜味化剂，诸如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可通过在植物油，例如花生油，橄榄油，芝麻油或椰子油中，或在矿物油诸如液体石蜡中悬浮活性剂和蛋白酶酶原来配制。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡，硬质石蜡或鲸蜡基醇。可将甜味化剂诸如以上所述的那些，及调味剂加入，以提供可口的口服制备物。这些可通过添加抗氧化剂诸如抗坏血酸来保存。
适合于通过添加水制备水性悬浮液的可分散粉剂和颗粒剂提供与分散或润湿剂，悬浮剂和一种或更多防腐剂混合的第1和第2方面的蛋白酶酶原和活性剂。适合的分散或润湿剂和悬浮剂以已上述那些为例。也可存在额外的赋形剂，例如甜味化，调味及着色剂。
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，也可为水包油乳剂形式。油相可为植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或这些的混合物。适合的乳化剂可为天然存在的胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆，卵磷脂和源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或部分酯，例如山梨糖醇酐单油酸酯，及所述部分酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂也可含有甜味化及调味剂。
糖浆和酏剂可用甜味化剂，例如甘油，丙二醇，山梨糖醇或蔗糖配制。它们也可含有缓和剂，防腐剂及调味及着色剂。
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，可为无菌可注射的水性或油性悬浮液形式。此悬浮液可使用以上提及的那些适合的分散或润湿剂和悬浮剂，根据知道的技术配制。第1和第2方面的药物组合物也可为非-毒性肠胃外-可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁烷二元醇中的溶液。可接受的媒质和溶剂之中可采用的是水，Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌，不挥发油是作为溶剂或悬浮介质常规采用的。为此目的，可采用的任何温和的不挥发油包括合成单-或二甘油脂。此外，脂肪酸诸如油酸可在可注射的制备物中使用。
在特定实施方式中，第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，制成用于药物的直肠施用的栓剂。这些制剂可通过将第1和第2方面的蛋白酶酶原和活性剂与在常温是固体但在直肠温度是液体，因此会在直肠中熔解而释放药物的适合的非-刺激赋形剂混合来制备。该物质包括可可脂和聚乙二醇。直肠施用可用于消除与酶的口服施用相关的胃肠道段中的肠-肝脏初次通过效应。
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，也可配制进脂质体。如本领域知道，脂质体通常源于磷脂或其他脂质物质。脂质体由在水性介质中分散的单-或多层水合的液晶形成。可使用能形成脂质体的任何非-毒性，生理学可接受的和可代谢的脂质。脂质体制剂可含有稳定剂，防腐剂，赋形剂等。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱，天然的和合成的。本领域知道形成脂质体的方法。
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物，可与施用用使用说明一起包括在容器，包装或分注器中。在第5～第9方面的用途或第10方面的方法中，药物组合物的蛋白酶酶原和活性剂，及任选地额外的活性剂可作为在相同的或不同时间，独立地或一起取的容器，包装或分注器中的分离的组分提供。
【剂量和治疗有效量】
第1和第2方面，或第12或第13方面的药物组合物的适当的剂量水平，会通常是可以单或多剂量施用的约0.01～500mg/kg患者体重/天。其可为约0.1～约250mg/kg/天；或约0.5～约100mg/kg/天。适合的剂量水平可为约0.01～250mg/kg/天，约0.05～100mg/kg/天，或约0.1～50mg/kg/天。在此范围之内，剂量可为0.05～0.5，0.5～5或5～50mg/kg/天。对于口服施用，第1和第2方面的药物组合物可以片剂形式提供，所述片剂含有1.0～4000mg的蛋白酶酶原和活性剂，特别是对于待治疗的患者症状性剂量调节的1.0，5.0，10.0，15.0。20.0，25.0，50.0，75.0，100.0，150.0，200.0，250.0，300.0，400.0，500.0，750.0，1000，1500，2000，2500，3000，3500和4000mg的蛋白酶酶原和活性剂。本文所述的药物组合物可以1～4次/天，一次或两次/天，或一次/天的方案施用，伴随通常导致更大依从性的减少的施用需求。
剂量可依赖于是否给组合物的单施用形式及是否在组合物或片剂(或其他施用形式)中作为活性剂包括类香兰素化合物而广泛改变。一般而言，类香兰素化合物诸如辣椒酸酯或辣椒素可以0.1～5g之间，且更特别是约1～2g/施用的相对大剂量提供。
用于本文所述的药物组合物的一实施方式的适合的单施用可包含：
●胰蛋白酶原，以下列量：1～100mg之间，特别是2～50mg，更特别是(以mg)1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，15.0。20.0，25.0，30.0，40.0，50.0；
●糜蛋白酶原，以下列量：1～100mg之间，特别是2～50mg，更特别是(以mg)1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0，40.0，50.0；
●硒化合物，以下列量：0.01～3mg之间，特别是0.1～1mg，更特别是(以mg)0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0；
●类香兰素化合物，以下列量：0.1～4000mg之间，特别是0.5～3000mg，更特别是(以mg)500，1000，1500，2000，2500，3000；
●淀粉酶，以下列量：0.1～100mg之间，特别是1～15mg，更特别是1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5，10.0，15.0；
●2-脱氧-D-葡萄糖，以下列量：0.1～100mg之间，特别是1～15mg，更特别是1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5，10.0，15.0。
但是，需知，用于任何特定患者的特定剂量水平和剂量的频度可改变且会依赖于各种因素，包括采用的特定化合物的活性，代谢稳定性和该化合物的作用时间，龄，体重，一般健康，性别，摄食，施用模式和时间，排泄速度，药物组合，特定病情的严重性，及经历治疗的宿主。
本文所述的药物组合物的一实施方式的各种组分(如果存在)的适合的剂量水平可包含：
●糜蛋白酶原，以下列量：至少0.2mg/kg，或在以下范围内：0.2～5mg/kg，在以下范围内：0.5～2.0mg/kg，或约0.8mg/kg；
●胰蛋白酶原，以下列量：小于0.5mg/kg，或在以下范围内：0.01～0.4mg/kg，或在以下范围内：0.05～0.20mg/kg，或约0.1mg/kg；
●甲基硒代半胱氨酸，以下列量：至少0.0001mg/kg，或在以下范围内：0.001-0.01mg/kg，在以下范围内：0.002～0.005mg/kg，或约0.003mg/kg；
●辣椒酸酯，以下列量：至少1mg/kg，或在以下范围内：5～500mg/kg，或在以下范围内：10～100mg/kg，或约30mg/kg；
●淀粉酶，以下列量：至少0.001mg/kg，或在以下范围内：0.01～0.1mg/kg，在以下范围内：0.02～0.05mg/kg，或约0.03mg/kg；
●2-脱氧-D-葡萄糖，以下列量：至少1mg/kg，或在以下范围内：5～500mg/kg，或在以下范围内：10～100mg/kg，或约30mg/kg。
本文所述的药物组合物的一实施方式的各种组分(如果存在)的以wt％计的适合的比，可包含：200～400:25～75:5～15:5,000～20,000:5,000～20,000:0.1-10，或约300:50:10:10,000:10,000:1的比的糜蛋白酶原:胰蛋白酶原:淀粉酶:2-脱氧葡萄糖:辣椒酸酯:甲基硒代半胱氨酸。
(如果存在)可在肿瘤细胞表面或接近肿瘤细胞表面特别有效的本文所述的药物组合物的各种组分(如果存在)的适合的浓度可包含：
●糜蛋白酶原，以至少0.5mg/ml的浓度，或在以下范围内：1～2mg/ml；
●胰蛋白酶原，以小于0.25mg/ml的浓度，或在以下范围内：0.1～0.2mg/ml；
●淀粉酶，以至少0.01mg/ml的浓度，或在以下范围内：0.02～0.1mg/ml；
●类香兰素化合物，以至少5mg/ml的浓度，或在以下范围内：10～20mg/ml；
●2-脱氧-D-葡萄糖，以至少5mg/ml的浓度，或在以下范围内：10～20mg/ml；
●硒化合物，以小于0.01mg/ml的浓度，或在以下范围内：0.001-0.005mg/ml。
当存在时，如果硒化合物的浓度，或相对量保持在特定范围之内，可为药物组合物提供进一步增强的活性。甲基硒代半胱氨酸的浓度可小于0.01mg/ml，小于0.005mg/ml，小于0.001mg/ml，或小于0.0005mg/ml，或在0.0005～0.01mg/ml的范围内，或在0.001～0.005mg/ml的范围内。
【糜蛋白酶原/胰蛋白酶原酶原制剂】
提供的药物组合物包含第1和第2蛋白酶酶原，其能在肿瘤细胞的表面或接近肿瘤细胞的表面活化而增强肿瘤细胞的细胞间粘接，实现肿瘤细胞的蛋白水解，或诱导肿瘤细胞凋亡，分化或免疫识别，其中第1蛋白酶酶原是糜蛋白酶原，而第2蛋白酶酶原是胰蛋白酶原，且糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在4:1至8:1之间的范围内。药物组合物可还包含一种或更多根据上述实施方式的任何的活性剂。
在一实施方式中，糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在5:1至7:1之间的范围内，优选6:1。
【活性剂制剂】
提供的药物组合物包含第1和第2活性剂，其各能诱导肿瘤细胞的细胞内活性，其中第1活性剂是硒化合物，而第2活性剂是细胞质糖酵解减少剂。
在一实施方式中，细胞内活性是肿瘤细胞凋亡，免疫识别或分化。硒化合物和/或细胞质糖酵解减少剂是指以上实施方式中描述的化合物。优选地，硒化合物是甲基硒代半胱氨酸。优选地，细胞质糖酵解减少剂是2-脱氧-D-葡萄糖。
药物组合物可还包含根据上述实施方式中的任何一种的蛋白酶酶原。药物组合物可还包含选自根据上述实施方式中的任何一种类香兰素化合物和糖苷水解酶的活性剂。
【筛选及鉴定方法】
进一步实施方式提供鉴定在癌细胞的细胞间粘接分子的表达上调中有用的剂的方法，方法包括使癌细胞或癌细胞的细胞间粘接分子与上述组合物接触，添加测试剂，监控或测量细胞间粘接分子的细胞间粘接或表达水平，及评定测试剂的效应。小化合物化学库筛选及抗体展示淘选是可使用此类型的方法容易评定的测试剂的可利用的来源的例。例如，可容易利用高通量化学筛选(HTS)使用机器人和微孔板来筛选数千分子诸如化学品或抗体。为了开发该筛选，必需提供待在筛选期间进行的适合的筛选检定。此筛选测定会合并细胞间粘接分子或癌细胞诸如转移性癌细胞。测定会包括参照细胞和任选地提供添加测试化合物，酶原和任选的酶的比较。类似地，可容易利用噬菌体展示技术来提供用于在癌细胞的细胞间粘接分子的表达上调中有用的潜在剂的评定的高通量方法。
【总的要点】
已包括在本说明书中的文献，文件，物质，装置，物品等的任何讨论单独提供本发明的情景的目的。并非承认任何或全部这些形成部分现有技术基础，或是在本申请的各权利要求的优先权日之前在澳大利亚存在的与本发明关联的领域中的公知常识。
此说明书提及的全部出版物通过引用并入本文。
本领域技术人员会同意，可对在特定实施方式中显示的发明进行多种变异和/或修饰而不离开广泛地描述的本发明的精神或范围。因此，本实施方式被认为全部是例证性及不限制性的。
如说明书中使用，单数形式“a”“an”和“the”包括复数个参照物，除非情景明显别样定义。由此，例如，说到“溶剂”包括溶剂的混合物，说到“剂”包括2种或更多此类剂的混合物，等。
在后随权利要求中及在前本发明的描述中，除了其中情景另外需要之外，由于表达语言或必需含义，词汇“包含(comprise)”或变异诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”用于包括的意义，即用于特定陈述的特征的存在，但不在本发明的各种实施方式中排除进一步特征的存在或添加。
【材料和方法】
为了本发明的性质可被更明确明白，现在会通过引用下列非限制性实验和实施例描述本发明的优选的形式。
【实验1：酶原作用机理的鉴定】
对3不同类型的细胞系进行涉及用包含胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的药物组合物治疗癌细胞系的效应和机理的调查。使用的细胞系是Panc1：人胰管癌细胞系，Caco2：人结肠腺癌细胞系，及OE33：食管腺癌细胞系。
在T 75培养瓶中于37℃，在含有5％CO2的湿润的气氛中维持全部细胞系。用以在培养中维持细胞的培养基是：对于PANC1是Dulbecco氏修饰的Eagle培养基(DMEM)；对于CaCO2是Eagle氏最小必要的培养基(EMEM)，对于OE33是RPMI培养基1640(Invitrogen,Merelbeke,比利时)。全部培养基补充10％胎牛血清(FBS；Invitrogen)，100IU/ml青霉素(Invitrogen)，100μg/ml链霉素(Invitrogen)和2mM L-谷氨酰胺(Sigma)。
胰蛋白酶原(Try)和α-糜蛋白酶原(Chy)可购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)及获自牛胰腺来源。制剂提供到磷酸盐缓冲液(PBS,Sigma)中，及当必需时用10％胎牛血清稀释。
制备及测试一系列制剂，并根据下表1给代码。
表1：制剂代码
制备各种浓度以收获影响细胞活力的制剂浓度的理解。基于各混合物的原开始浓度指定为1X，给各制剂的6个不同稀释代码及如下表2显示制造。
表2：酶浓度
为了获得光学密度和细胞数之间的关联，知道的细胞数接种及细胞之后附接，细胞染色用磺基罗丹明B(SRB)。此方法提供染色之后细胞的吸光度或光学密度的数据，及允许对各细胞类型标准曲线的发展以将吸光度转变为细胞数，如显示于图1。
【制剂对测试细胞系的效应】
为了测定制剂对测试细胞系的细胞毒性效应，将细胞平铺及用制剂处理。通过蛋白测定和显微镜检评定效应。
使用SRB蛋白染色用于测试不同制剂对细胞增殖的效应。染料结合细胞蛋白的碱性氨基酸及通过比色评估提供关于细胞数的总蛋白质量的估计。从对于各制剂的对数-线性剂量-应答曲线测定半数最大抑制性浓度(IC50)值。
第1天：将细胞以低密度(1000～3000个细胞/孔依赖于细胞类型)接种于24孔培养皿。使用的细胞系是Panc1：人胰管癌细胞系，Caco2：结直肠癌细胞系，OE33：食管癌细胞系和HEK293。HEK293是源于人胚胎肾的转化的细胞系。将各细胞系的1个24孔培养板用于测试各不同组合制剂。在4孔中测试各制剂稀释物。将各细胞系的1个24孔培养板用作对照，接种相同的数的细胞及随着治疗的细胞变化培养基。
第2天：去除培养基及将含有制剂的不同稀释物的新鲜培养基加入细胞。
第5天：再次移出培养基，并将含有制剂的不同稀释物的新鲜培养基加入细胞。
第6天或7：用10％感冒(4℃)三氯乙酸(TCA)固定细胞。轻轻抽吸培养基之后，将TCA加入孔。将板于4℃静置30min，用去离子水洗涤3次，于室温干燥至少24h。
将固定的细胞如下用SRB染色。将1ml的0.4％SRB(以1％乙酸溶液的w/v)加入各孔，并于室温静置20min。将SRB移出，并在空气干燥之前将板用1％乙酸洗涤3次。将结合的SRB用500ml的10mM Tris-碱溶液溶解，并使板在平板摇床上至少10min。将100ml的各孔转移到96-孔板的孔，将此进行3次/24-孔板的孔。在96-孔平板读数仪上在492nm处读吸光度。
【制剂对食管癌细胞系(OE33)活力的效应】
将OE33细胞以3000细胞/ml的密度接种(第1天)。在第2天和第5天将细胞用0.25x；0.5x；1x；1.25x；2.5x和5×的不同制剂处理。在第7天固定细胞。
用显微镜，用制剂B的处理导致细胞展示圆形的形态，也导致细胞收缩及增加的脱离。由此，48小时温育之后，仅少细胞保持附接，并在培养基中可见细胞碎片及浮动细胞(图2)。
通过光学显微镜检观察的结果通过SRB蛋白-染色测定确证。表3显示各治疗的4个重复孔的平均值，制剂B对细胞死亡的影响依赖于浓度；2.5×和5×杀孔中的全部细胞。通过针对浓度标绘吸光度来获得IC50值，如显示于图3。
对照，显示为浓度0的OD是24个重复孔的平均值。在固定时，对照板的全部24孔完全汇合。
表3：不同浓度的制剂B对OE33细胞的效应
CONC(1) OE33 B(1)
0 0.851
0.4 0.819
0.2 0.814
1 0.812
1.25 0.815
2.5 0.076
5 0.076
【制剂对人胰管癌(Panc1)细胞的效应】
将Panc1细胞以20,000细胞/ml的密度接种(第1天)。在第2天和第4天将细胞用0.25x；0.5x；1x；1.25x；2.5x和5×的不同制剂处理。在第5天固定细胞。对照制剂C在测试的浓度未对Panc1细胞活力具有任何效应(数据未显示)。用显微镜，制剂B，J和T显示对细胞活力的效应，将用2.5x和5×的这些制剂处理的细胞是圆形的且死亡的(数据未显示)。
通过光学显微镜检观察的结果通过SRB蛋白染色测定确证。表4显示使用的制剂的各浓度的4个重复孔的平均值。制剂B，J和T对细胞死亡的效应依赖于浓度；2.5x和5×杀孔中的全部细胞，如显示于图4。通过针对浓度标绘吸光度获得IC50值，如显示于图4。对照，显示为浓度0的OD，是24个重复孔的平均值。
表4：制剂B，J和T对Panc1细胞的效应
浓度 B J T
OD OD OD
0 0.442 0.442 0.442
0.4 0.447 0.542 0.514
0.2 0.465 0.548 0.529
1 0.440 0.517 0.538
1.25 0.450 0.501 0.599
2.5 0.237 0.284 0.511
5 0.063 0.046 0.076
【制剂对结直肠癌细胞(Caco2)的效应】
将Caco2细胞以20,000细胞/ml的密度接种(第1天)。在第2天和第4天，将细胞用0.25x；0.5x；1x；1.25x；2.5x和5×的不同制剂处理。在第5天固定细胞。制剂C在测试的浓度未对Caco2细胞活力具有任何效应，在第5天处理之后，细胞显示汇合和健康的单层细胞(数据未显示)。
SRB蛋白染色测定(表5)显示使用的制剂的各浓度的4个重复孔的平均值，制剂B，J和T对细胞死亡的效应依赖于浓度：2.5x和5×杀孔中的全部细胞，如显示于图5。更低浓度的这3种制剂未对细胞活力具有效应，如可观察到，记录的光学密度(OD)不是显著不同于对照组。对照是24个重复孔的平均值，在固定时，对照板的全部24孔完全汇合。
表5：制剂B，J和T对Caco2细胞的效应
CONC(1) B(1) J(1) T(1)
0 0.421 0.421 0.421
0.4 0.370 0.387 0.440
0.2 0.393 0.440 0.431
1 0.384 0.429 0.515
1.25 0.395 0.458 0.478
2.5 0.251 0.131 0.304
5 0.078 0.074 0.176
治疗B，J和T对测试的全部细胞类型具有毒性效应。对细胞活力展示效应的制剂B，J和T的浓度是2.5x和5x。处理之后细胞展示圆形的形态，细胞收缩及增加的脱离。
【制剂的IC50的确定】
通过针对浓度标绘吸光度获得各制剂的IC50值。当一周施用两次时，对于下列细胞系获得不同制剂的IC50：Caco2，Panc1和OE33。将最终IC50值(用对应实际mg/ml浓度)用于随后细胞测定。
表6A：制剂对Panc1的IC50
B(2.4x) J(2.5x) T(2.5x)
胰蛋白酶原(mg/ml) 0.031 0.0032 0.0032
糜蛋白酶原(mg/ml) 0.031 0.0032 0.0032
弹性蛋白酶(mg/ml) 0.0048 0.0075 -
表6B：制剂对OE33细胞的IC50
B(2.4x) J(2.5x) T(2.5x)
胰蛋白酶原(mg/ml) 0.031 0.0032 0.0032
糜蛋白酶原(mg/ml) 0.031 0.0032 0.0032
弹性蛋白酶(mg/ml) 0.0048 0.0075 -
表6C：制剂对Caco2细胞的IC50
B(2.5x) J(2.4x) T(2.5x)
胰蛋白酶原(mg/ml) 0.032 0.0031 0.0032
糜蛋白酶原(mg/ml) 0.032 0.0031 0.0032
弹性蛋白酶(mg/ml) 0.005 0.0072 -
【细胞间粘接标记物的表达】
在Panc1，OE33和Caco2细胞中研究了在用IC50浓度的制剂J和T处理后细胞间粘接标记物β-连环蛋白和E-钙粘蛋白的表达变化。
将细胞用IC50浓度的制剂处理。收获细胞，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤3次，并用PBS中的4％多聚甲醛固定30分钟。将细胞用PBS洗涤3次，并于-20℃用冰冷的丙酮/甲醇(1:1)后固定5分钟。将细胞用PBS洗涤3次，并在2％阻断缓冲溶液中于室温阻断1小时。然后将细胞用在阻断缓冲溶液中稀释的第一抗体于4℃温育过夜。将细胞用PBS洗涤3次，然后与阻断缓冲溶液中的第二抗体温育2小时。将细胞用PBS洗涤3次，并在1:1000DAPI/PBS(为展示核染色)中于室温温育15分钟。将盖玻片用封固介质封固于载玻片。用非-处理的细胞作为对照。
使用针对E-钙粘蛋白的单克隆抗体(Transduction Labs BD Biosciences克隆36)和针对β-连环蛋白的单克隆抗体(Transduction Labs BD Biosciences克隆14)进行间接免疫荧光染色。使用的第二抗体是马抗-小鼠荧光素(Vector Labs FI2000)。
将用测试的制剂处理之后β-连环蛋白和E-钙粘蛋白表达的增量通过在荧光显微镜检下测量样品荧光强度来定量，测量相同的样品的不同区域，并将强度收集的平均值显示于表7。
表7：用制剂J和T处理的细胞的荧光强度的平均值
【总结】
当用IC50浓度的制剂J和T处理时，Panc1，Caco2和OE33细胞显示相比非处理细胞免疫荧光强度的增加。此关联于癌细胞相比对照细胞β-连环蛋白和E-钙粘蛋白表达增加，如显示于图6～13。β-连环蛋白和E-钙粘蛋白显示为绿色，核显示为蓝色。
【实施例】
【实施例1：增强的酶原制剂】
从事研究以测定包含胰蛋白酶原(pT)，糜蛋白酶原(pC)和α-淀粉酶(A)的酶原制剂(称之为JBp1的制剂)对24个癌细胞系生长的效应。基于此初始研究中产生的IC50和最大抑制值，选择3个细胞系用于进一步明白JBp1中的3种个体组分对癌细胞生长的效应。研究应用了等效线方法，以明白JBp1的3种组分：α-淀粉酶，胰蛋白酶原和糜蛋白酶原之间的相互作用。基于的获得的结果，建议增强的制剂(JBp1vP)，并在等效线研究中用包含2-脱氧-D-葡萄糖(D)，辣椒酸酯(C)和甲基硒代半胱氨酸(M)的第2制剂测试。
【总结】
在一组24个人癌细胞系中研究酶原制剂JBp1的细胞生长抑制性性质。获得此组的大多数细胞系的IC50值。基于IC50值和最大生长抑制，选择3个细胞系，A-549，HCT-15和MIAPaCa-2，使用等效线方法用于进一步组合研究。等效线图的使用允许研究JBp1的3种个体组分：α-淀粉酶，胰蛋白酶原和糜蛋白酶原之间的相互作用水平。通过研究彼此组合的个体组分和2种组分的混合物的生长抑制活性，鉴定JBp1制剂的增强的组合物及称之为"JBp1vP"。在针对包含2-脱氧-D-葡萄糖(D)，辣椒酸酯(C)和甲基硒代半胱氨酸(M)的第2制剂的组合检定中测试此增强的制剂，其中第2制剂称之为DCM，第1和第2制剂的组合称之为JBp1vP-DCM。JBp1vP和DCM之间的相互作用的等效线分析显示协同作用的潜力，尤其以低浓度的DCM(见图14和表8中MIAPaCa-2细胞系的结果)。
表8：糜蛋白酶原，胰蛋白酶原，α-淀粉酶和双组合在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中的等效线分析的总结
图标：
T：胰蛋白酶原
C：糜蛋白酶原
A：α-淀粉酶
TC：糜蛋白酶原:胰蛋白酶原(6:1)
CA：糜蛋白酶原:α-淀粉酶(1:0.25)
TA：胰蛋白酶原:α-淀粉酶(1:0.25)
WR：宽-范围协同相互作用(大于7g值低于1.0)
NR：窄-范围协同相互作用(3～7g值低于1.0)
N：非-协同相互作用(小于3g值低于1.0)
【等效线方法】
剂的剂量-应答关系可用于构建给组合的预期的效应的模型。药物A和B的组合应称为(da,db)，其中da及db是A和B的剂量。将效应作为数学函数，E(da,db)处理。E有时表达为分级效应，然后存活级分是S：S＝1-E。最终，Da和Db是独立地给的药物A和B的剂量，其与组合产生等效应答。可基于组合中使用的药物之间无相互作用的推定构建等效图(等效曲线)。组合(da,db)由具有代表个体药物的剂量的轴的图上的点代表。预期，如果药物不相互作用，此点应落到连接代表与组合(da,db)等效的剂量(Da和Db)的值之间的2轴的直线(等效图)。2个化合物的0相互作用等效图的方程是：
当组合中化合物数是n时，方程是
当组合中药物与个体剂量等效时，等效图是直线。但是，如果组合的效应大于来自个体剂量-应答曲线的预期，则需要更小量的da和/或db，以产生对Da和Db的等效效应(均未变化)，由此
此比也称之为g值，且其用于确定相互作用的类型。在此情况中，计算的等效图是凹线。拮抗会产生对反方向的效应；因此代表此类型的相互作用的等效图会是凸线。
总之，g值可为：
研究新制剂JBp1的3种组分(α-淀粉酶,胰蛋白酶原和糜蛋白酶原)之间的相互作用。此外，采用等效线方法来测定制剂中3种组分的增强的比。然后与第2制剂DCM组合研究增强的JBp1制剂。
【材料和方法】
无菌平-底96-孔细胞培养板获自Becton-Dickinson(North Ryde,NSW,澳大利亚)；RPMI 1640和DMEM细胞培养基，FBS，GlutaMax，青霉素-链霉素，丙酮酸钠，HEPES，HAM氏，FCS和DPBS获自Invitrogen澳大利亚(Mt Waverley,VIC,澳大利亚)；锥虫蓝获自Sigma-Aldrich(Castle Hill,NSW,澳大利亚)；细胞滴度-细胞活力测定获自Promega(Madison,WI,USA)；SpectraMax Gemini XPS荧光计获自Molecular Devices(Sunnyvale,CA,USA)。
这些研究中使用的全部细胞系是人来源及获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD,USA)。
下列表9显示在全部IC50测定和组合测定中使用的生长条件和以细胞/孔的初始细胞接种密度。在供给95％空气/5％CO2的湿润的细胞培养温育器中于37℃培养细胞。
表9：用于IC50研究和组合检定的生长条件及接种密度
【测试品和制剂】
测试品1是胰蛋白酶原，其获自Applichem(Darmstadt,德国)。测试品2是糜蛋白酶原，其获自BBI Enzymes(Gwent,UK)。测试品3是α-淀粉酶，其获自Annecis Ltd(Lancaster,UK)。测试品4是2-脱氧葡萄糖，其获自Sigma-Aldrich(Castle Hill,NSW,澳大利亚)。测试品5是辣椒酸酯，其获自Propanc Pty Ltd。测试品6是甲基硒代半胱氨酸，其获自Sigma-Aldrich(Castle Hill,NSW,澳大利亚)。
将α-淀粉酶，胰蛋白酶原和糜蛋白酶原溶于磷酸盐缓冲液(PBS)及立即使用或于4℃存储而用于进一步使用。测试品DCM由1:1:0.0001的比的2-脱氧葡萄糖，辣椒酸酯和甲基硒代半胱氨酸组成。这3种组分以这些比混合在一起，重悬浮于PBS，并在制备之后立即使用。
【细胞生长测定】
对于IC50分析，在接种后24小时将测试品添加到细胞。对各细胞系以一式三份测试测试品浓度。在测试品添加后72小时对全部平板进行细胞滴度-检定。
对于组合测定，对于各细胞系和测试品组合接种2个96孔板，以允许各实验的重复。在接种后24小时根据下列移液方案(A3:G11之内的细胞含有第2列和行H中给的浓度的两种药物的组合)将测试品添加到细胞。
基于以各药物的IC50落到稀释系列的浓度之内的方式计算的IC50确定各细胞系中各化合物的初始浓度。在测试品添加后72小时对全部平板进行细胞滴度-检定。
在含有测试品的培养基中温育细胞之后，将10μL的细胞滴度- 加入各孔并与细胞温育达4小时。使用Spectramax Gemini XPS荧光计测量荧光。记录全部数据，并载入Excel空白表格用于解析。
收集自细胞滴度-测定的数据标绘为用于IC50确定的剂量应答曲线，并标绘为等效线图，以评定测试品组合之间的相互作用类型。对于IC50确定，计算生长抑制，并针对化合物浓度标绘。在这些标绘图中，X-轴(化合物浓度)以对数尺度表示。IC50浓度使用用于Mac OSX的GraphPad Prism 5.0版(GraphPad软件,San Diego California,USA)计算为各化合物的半数最大(50％)抑制性浓度(IC)。
对于组合研究，使用vivoPharm的专利分析模板进行等效线分析。等效线分析提供2个化合物之间发生的相互作用(即协同,添加剂或拮抗)类型的量度。定义相互作用类型的1个参数是g值。如以上描述，超过1.0的g值指示拮抗相互作用，而1.0以下的g值指示协同相互作用。各等效线测定导致9个g值，对于组合中第2化合物(分析模板中的化合物B)的各浓度是1个。对于此研究，2个化合物之间的相互作用分类为3组：显示1.0以下的大于7个g值的宽-范围协同相互作用，导致1.0以下的3～7个g值的窄-范围协同相互作用，和产生1.0以下的小于3个g值的非-协同相互作用。表5显示此研究中分析的全部相互作用的总结。
根据标准操作过程进行此研究的进行中使用的全部过程。
【结果】
对24癌细胞系中的JBp1进行IC50确定测定。如见于表10，对15个细胞系(A2780,HOP-92,BxPc-3,HT-29,KYSE-30,MIAPaCa-2,OE-33,A549,HCT-15,OE-21,NCI-H82，HCT-116，MDA-MB468，NCI-H460和BT474)获得IC50值。余下细胞系显示最大抑制值或剂量-应答曲线，其未允许此研究中测试的JBp1的浓度范围之内的IC50值的确定。表10以最大生长抑制的降序显示全部24细胞系的IC50和最大生长抑制值。
基于对于24个细胞系获得的IC50和最大抑制值和各细胞系对随后动物研究的适应性，选择3种细胞系用于等效线研究。这些细胞系，A-549，HCT-15和MIAPaCa-2，在表10中以粗体亮显。
表10：24细胞系中JBp1的IC50值的总结
细胞系 IC50 JBp1(mg/mL) 最大抑制％
A2780 0.09 93.4
HOP-92 0.13 91.1
BxPc-3 0.16 90.7
HT-29 0.04 87.6
KYSE-30 0.03 86.2
MIAPaCa-2 0.08 85.0
OE-33 0.15 84.1
A549 0.15 83.9
HCT-15 0.08 82.3
OE-21 0.42 68.2
NCI-H82 0.06 66.9
HCT-116 0.14 62.4
MDA-MB468 0.10 62.3
COLO-205 - 61.7
NCI-H460 0.07 58.9
BT474 0.01 55.3
SK-OV-3 - 54.5
PANC-1 - 52.8
NCI-596 - 51.4
MDA-MB-231 - 47.5
COLO-201 - 36.3
NCI-H520 - 34.0
MDA-MB-453 - 16.2
OVCAR-3 - 9.3
研究化合物之间的相互作用的等效线方法需要确定在运行组合测定之前那些组分的IC50值。因此，在3个选择的细胞系A-549，HCT-15和MIAPaCa-2中，对JBp1的3种个体组分，即胰蛋白酶原，糜蛋白酶原和α-淀粉酶进行IC50确定测定。如见于表11，在全部3个细胞系中胰蛋白酶原显示0.23～0.41mg/mL的IC50值。α-淀粉酶和糜蛋白酶原未呈现测试的浓度范围之内的IC50值。
表11：在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中胰蛋白酶原，糜蛋白酶原和α-淀粉酶的IC50值和最大生长抑制的总结。
等效线分析提供2个化合物之间发生的相互作用(即协同,添加剂或拮抗)类型的量度。定义相互作用类型的一个参数是g值。如上所述，超过1.0的g值指示拮抗相互作用，而1.0以下的g值指示协同相互作用。各等效线测定导致9个g值，对于组合中第2化合物的各浓度(分析模板中的化合物B)是1个g值。对于此研究，2个化合物之间的相互作用分类为3组：显示1.0以下的大于7个g值的宽-范围协同相互作用，导致1.0以下的3～7个g值的窄-范围协同相互作用，产生1.0以下的小于3个g值的非-协同相互作用。表8显示此研究中分析的全部相互作用的总结。
尽管对于α-淀粉酶，及糜蛋白酶原未获得IC50值，在组合测定中研究彼此之间及与胰蛋白酶原之间的相互作用，由于明白，这些组分当与第2化合物组合时仍相互作用。图15～17显示在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中，从在α-淀粉酶，胰蛋白酶原和糜蛋白酶原之间的组合检定得到的等效线图。
如见于图15和表8，胰蛋白酶原和糜蛋白酶原在A-549和MIAPaCa-2细胞中显示与宽-范围的协同相互作用一致的等效线结果。在HCT-15细胞中，等效线特征与非-拮抗相互作用一致(等效线位于几乎重叠于X-轴，且在图中可不明显可区分)。基于3个选择的细胞系中组合检定的总体结果，定义，制剂中胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的增强的比应设置为6:1(糜蛋白酶原:胰蛋白酶原)。此比由下列支持：(1)更高浓度的糜蛋白酶原显著改善生长抑制性效应，如A-549和MIAPaCa-2细胞中1和2mg/mL的糜蛋白酶原的非常低g值反映的；及(2)0.25mg/mL以上的胰蛋白酶原浓度未添加额外的抑制性效应。因此，将糜蛋白酶原的上2个浓度的平均(1.5mg/mL)除以胰蛋白酶原的上浓度(0.25mg/mL)而获得1.5比0.25或6:1的比。
图16显示在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中胰蛋白酶原和α-淀粉酶之间的相互作用的等效线图。这2种化合物的组合在A-549和MIAPaCa-2细胞中导致协同相互作用，而在HCT-15细胞中导致非-协同相互作用(表8)。正相互作用在MIAPaCa-2细胞中是宽-范围类型，而在A-549细胞中是窄-范围类型。假设对3个测试的细胞系中的此相互作用观察的应答范围，这些数据不用于测定JBp1制剂中这2种组分之间的比。
图17显示在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中糜蛋白酶原和α-淀粉酶之间的相互作用的等效线图。这2种化合物的组合在MIAPaCa-2细胞中导致协同相互作用，而在A-549和HCT-15细胞中导致非-协同相互作用。假定α-淀粉酶对糜蛋白酶原的细胞生长抑制性效应的负面效应，确定将JBp1的此组分与其他2种组分的比为原浓度(1:0.25,糜蛋白酶原:α-淀粉酶)。
总之，在第1轮组合测定之后，确定比糜蛋白酶原:胰蛋白酶原应设置为6:1，而糜蛋白酶原:α-淀粉酶和胰蛋白酶原:α-淀粉酶的比会以1:0.25的原浓度使用。
对于第2轮组合研究，将以上定义的化合物对和比作为新测试化合物如下重定义：
●糜蛋白酶原:胰蛋白酶原(6:1)＝TC
●糜蛋白酶原:α-淀粉酶(1:0.25)＝CA
●胰蛋白酶原:α-淀粉酶(1:0.25)＝TA
在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中，对这些重定义的化合物进行IC50确定测定。表12显示在3个选择的细胞系中3种化合物的剂量-应答曲线及计算的IC50值和最大生长抑制。在全部3个细胞系中对TC和TA获得IC50值。但是，在测试的浓度范围之内不可发现CA的IC50值。
表12：在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中TC，TA和CA的IC50值和最大生长抑制的总结。
在确定TC，CA和TA的IC50值之后，在JBp1制剂中的这3种组分和对应第3组分之间(即TA对比糜蛋白酶原,CA对比胰蛋白酶原和TC对比α-淀粉酶)进行组合测定。
图18显示组合TA和糜蛋白酶原之间的等效线图。这2种化合物的组合在A-549和MIAPaCa-2细胞中导致协同相互作用，而在HCT-15细胞中导致非-协同相互作用。
图19显示CA和胰蛋白酶原之间的组合的等效线图。这2种化合物的组合在HCT-15和MIAPaCa-2细胞中导致协同相互作用，而在A-549细胞中导致非-协同相互作用。总体上，观察的趋势指向这2种组分的正相互作用，与糜蛋白酶原和胰蛋白酶原之间观察到的协同相互作用一致。这些结果还证明基于之前讨论的结果选择的6:1(糜蛋白酶原:胰蛋白酶原)比。
图20显示TC和α-淀粉酶之间的相互作用的等效线图。对此组合观察的总体趋势与非-协同相互作用一致。为了进一步剖析α-淀粉酶对TC的生长-抑制性效应的此负面效应，从等效线分析模板提取TC的IC50值，并针对α-淀粉酶的对应浓度标绘。值与对全部3个细胞系的α-淀粉酶浓度成比例增加。这些结果提示，JBp1制剂中α-淀粉酶的水平应保持低，以便避免与糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的潜在拮抗效应。
以上表8总结个体和针对彼此的双组分的全部组合结果。
基于上述组合研究，将JBp1制剂中糜蛋白酶原，胰蛋白酶原和α-淀粉酶的比定义为6:1:0.25(糜蛋白酶原:胰蛋白酶原:α-淀粉酶)。通过后缀“vP”鉴定此增强的JBp1制剂，以将其与原JBp1制剂区分。
对增强的制剂JBp1vP测定IC50值，并与对于原制剂JBp1获得的值相比。表13显示在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中这2种制剂的剂量-应答曲线，IC50值和最大生长抑制。如这些结果显示，增强的JBp1vP制剂在A-549和HCT-15细胞中相比JBp1呈现更低的IC50值，在MIAPaCa-2细胞中类似的IC50值。重要的是，JBp1vP相比JBp1在全部3个细胞系中显示更高最大生长抑制值。
表13：在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中JBp1，JBp vP和DCM的IC50值和最大生长抑制的总结。
检查JBp1vP的与测试化合物DCM组合抑制细胞生长的能力。在组合测定之前，在A-549，HCT-15和MIAPaCa-2细胞中测定DCM的IC50。如见于表8和13，对于全部3个细胞系，DCM显示0.15～1.5mg/mL范围内的IC50值和超过92％的最大生长抑制值。
图14显示JBp1vP和DCM之间的组合的等效线图。等效线分析显示，在A-549和HCT-15细胞中这2种组分之间的相互作用是非-协同的。在MIAPaCa-2细胞中，JBp1vP和DCM的组合导致窄-范围协同相互作用，特别以更低浓度的DCM。对于DCM的最低2个浓度，此组合研究的g值良好在1.0以下。
在图中明白，M可提供对JBp1的拮抗效应，这些结果意外地显示，DCM与JBp1组合有效。
总之，JBp1vP和DCM以低浓度的DCM协同相互作用，JBp1vP也显示超过JBp1制剂的增强的体外癌细胞生长抑制性效应，而JBp1vP和DCM协同作用以便体外抑制癌细胞生长。
【实施例2：增强的酶原制剂的体内研究】
从事研究以测定JBp1(分别以0.13mg/kg，0.78mg/kg和0.03mg/kg施用的胰蛋白酶原,糜蛋白酶原和α-淀粉酶)单独及与佐剂，DCM(分别30.55mg/kg,29.12mg/kg,0.003mg/kg的2-脱氧葡萄糖,辣椒酸酯和甲基硒代半胱氨酸)组合的体内抗-血管发生功效，使用vivoPharm的AngioChamberTM测定进行研究。AngioChamberTM测定利用创伤治愈的正常生理学过程，以促进围绕移植的室的纤维囊形成(Wood,J.M.,Bold,G.,Buchdunger,E.,Cozens,R.,et al.PTK787/ZK 222584,a Novel and Potent Inhibitor of VascularEndothelial Growth Factor Tyrosine Kinases,Impairs Vascular EndothelialGrowth Factor-Induced Responses and Tumour Growth After OralAdministration.Cancer Research,60(8):2178-2189(2000))。室中包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)支持纤维囊形成而诱导血管发育。由此，此系统用于通过测量纤维囊形成(最终囊湿重)来评定抗-血管发生治疗的功效。
【总结】
50只雌性FvB小鼠各接收皮下移植的含或不含bFGF的AngioChamberTM。随机选择10只小鼠，并用不含bFGF的室移植。在研究的第0天将用含有bFGF的室移植的40只小鼠依体重随机化到4个10只小鼠的处理组。
分别以0.13mg/kg，0.78mg/kg和0.03mg/kg施用由胰蛋白酶原，糜蛋白酶原和α-淀粉酶组成的JpB1。DCM由分别30.55mg/kg，29.12mg/kg，0.003mg/kg的2-脱氧葡萄糖，辣椒酸酯和甲基硒代半胱氨酸组成。
各组中的小鼠用媒质对照(NMP:PEG300(1:9,v/v)，p.o.,5mL/kg)，JBp1(腹膜内,以10mL/kg的施剂体积)，JBp1-DCM(腹膜内,以10mL/kg的施剂体积)或索拉非尼(60mg/kg,p.o.,以5mL/kg的施剂体积)每天接收处理(第0～4天)。将媒质对照施用于2组，将其之一用装载bFGF的AngioChambersTM移植(基线对照)，其他用含bFGF的AngioChambersTM移植(诱导对照)。将化合物处理组用装载bFGF的AngioChambersTM移植。
在第1治疗日(第0天)对全部动物记录体重测量，然后每天直到研究终止日(第5天)。
在治疗开始后，全部组中的小鼠体重立即减轻，手术过程的预期的结果。用媒质对照(含bFGF)、JBp1和JBp1-DCM处理的小鼠在余下研究持续时间恢复体重，在终止日无平均体重的显著损失。用媒质对照(不含bFGF)和索拉非尼处理的小鼠中体重未恢复，两组在研究终止时具有显著体重损失，这在用NMP:PEG300处理的小鼠中常见。
最终治疗后24小时(第5天)自各小鼠切下AngioChambersTM。将围绕室的纤维囊移出，并记录湿重。
全部处理导致相比诱导对照bFGF-诱导的血管发生的显著抑制，如研究终止日的囊湿重指示。用JBp1-DCM和索拉非尼处理，其是有效血管发生药物比较物，相比JBp1单一治疗显著减少血管发生。在JBp1-DCM和索拉非尼之间的抗-血管发生活性中无显著差异。
因此，在此模型中，JBp1和JBp1-DCM在抑制纤维囊形成中有效。将DCM添加到JBp1制剂导致相比JBp1单独增强的抑制。在此模型中，JBp1-DCM的处理与索拉非尼同样有效。
【材料和方法】
肝素，NMP，PBS和PEG300获自Sigma-Aldrich(Castle Hill,NSW,澳大利亚)。0.22μM Acrodisc滤器获自Pall公司(Sydney,NSW,澳大利亚)。重组人bFGF获自ShenandoahBiotechnology(Warwick,PA,USA)。AngioChambersTM由Angst+Pfister AG(Stuttgart,德国)供给。琼脂糖由Omnigel Lo.M(Edwards Instruments Co.,NSW,澳大利亚)供给。
测试系统涉及50只雌性FvB小鼠，10只小鼠/组的5个研究组(2个对照和3处理组)。将标准条件和方案用于动物管理。
使用由全氟-烷氧基-特氟隆(-PFA,21mm×8mm直径,550μL体积)制造的以80个规则间隔0.8mm的空穴穿孔的多孔组织室(AngioChambersTM)。两端用相同的材料的可移出的封头密封。将室在无菌条件下用含有20IU/mL肝素的0.8％琼脂糖(含或不含4μg/mL bFGF)填充。在填充室之前于37℃维持琼脂糖溶液。
对于室移植，将小鼠通过异氟烷吸入麻醉。在各小鼠的中心背部皮肤制造小切口，并将室皮下插入，并放置在肩胛骨之间。将创伤用2 1.4mm创伤夹(Michel Clip)闭合。
【测试化合物和制剂】
媒质对照是NMP:PEG300(1:9v/v)。JpB1是测试品1，并由胰蛋白酶原，糜蛋白酶原和α-淀粉酶组成，分别以0.13mg/kg，0.78mg/kg和0.03mg/kg施用。DCM是测试品2，并由分别30.55mg/kg，29.12mg/kg，0.003mg/kg的2-脱氧葡萄糖，辣椒酸酯和甲基硒代半胱氨酸组成。将各化合物独立地溶解于PBS。浓储物溶液通过过滤(0.22μM)灭菌。在施剂的各天，将浓储物混合进适当的组合中。
索拉非尼是参照化合物，并作为含有200mg有活性的索拉非尼的315mg片剂供给。将片剂压碎及溶解于NMP，以配制有活性的索拉非尼的浓储物溶液，将其用PEG300稀释，以达到具有1:9的最终NMP:PEG300比的需要的剂量浓度。
随机选择10只小鼠，并用不含bFGF的室移植。在研究的第0天将用含有bFGF的室移植的40只小鼠依体重随机化为10只小鼠的4个处理组。在第0天(在小鼠已从手术恢复后2小时)开始处理，并持续5连日(第0～4天)。
以5mL/kg的施剂体积经口(p.o.)施用媒质对照(NMP:PEG300(1:9v/v))(组1和2)和索拉非尼(60mg/kg；组5)。
将JBp1(分别0.13mg/kg,0.78mg/kg和0.03mg/kg的胰蛋白酶原,糜蛋白酶原和α-淀粉酶)单独(组3)并与DCM(分别30.55mg/kg,29.12mg/kg,0.003mg/kg的2-脱氧葡萄糖,辣椒酸酯和甲基硒代半胱氨酸)组合(组4)施用。均由腹膜内注射(腹膜内)，以10mL/kg的施剂体积施用。当在组合中施用JBp1和DCM时，配制全部6种化合物，并在一次注射中一起施用。
在施剂之前立即测量各动物的体重。计算施用给各动物的施剂溶液的体积，并基于个体体重调整。
将动物根据以上日程表处理，小鼠自手术恢复之后开始2小时，以在研究的第0天移植AngioChamberTM。在终止日(第5天)自全部死后小鼠切下AngioChambersTM。将围绕各室形成的血管化的纤维囊小心地移出，并立即记录湿重。
如果在进入研究后其体重下降到85％以下，会停止任何动物的处理。如果此发生，体重测量会持续短时期。如果未测量到体重增加，将动物淘汰。如果观察到对处理的严重的不利的反应，动物也淘汰。使用列出症状及伴随评分的形式临床评分表(附录2中提供的指南)评定不利的反应的程度。观察到的症状及得到的总和的评分的组合确定关于动物的福利待取的作用过程。
使用下列式计算通过测试品的血管发生抑制(％)：
％抑制＝[(A-B)/(A-C)x 100]
其中A是自具有含有生长因子的移植的AngioChambersTM及用媒质对照处理的小鼠的平均囊重量(组2)，
B是自具有含有生长因子的移植的AngioChambersTM及用测试品处理的小鼠的平均囊重量(组3～5)，及
C是自具有不含生长因子的移植的AngioChambersTM及用媒质对照处理的小鼠的平均囊重量(组1)。
使用SigmaStat 3.0(SPSS Australasia,North Sydney,NSW,澳大利亚)进行全部统计学计算。配对的t检验用于测定研究的第0天和终止日之间的处理组之内的体重变化的显著性意义。当数据未通过正态性检验时，进行Wilcoxon符号秩和检验。余下统计学分析的目标是显示，参照化合物，索拉非尼和测试品通过bFGF显著抑制纤维囊的诱导。通过bFGF的纤维囊形成的显著诱导被认为是对于接受研究结果必要的。在研究终了对囊重量数据进行单因素方差分析(ANOVA)。当发现显著差异时，进行全部配对多比较和多比较对比对照组流程(Holm-Sidak方法)。p值小于0.05被认为是显著。
此研究的进行中使用的全部过程根据vivoPharm的标准操作流程进行，特别参照SOP#vP_EF0317"用于血管发生研究的通用的流程"。标准操作流程维持在vivoPharm的安全设备存档。
【结果和观察】
全部组中的全部小鼠在研究持续时间呈现竖毛。发现一只用媒质对照(含bFGF；组2)处理的小鼠在研究的第1天死亡，可能由于手术的并发症。一只用媒质对照(不含bFGF；组1)处理的小鼠在第4天具有粘附到腹部毛皮的后右腿。将此在吸入麻醉剂下分割。
全部组中的小鼠在处理开始后体重立即减轻，可能由于手术过程。用媒质对照(含bFGF；组2)JBp1(组3)和JBp1-DCM(组4)处理的小鼠在研究的余下持续时间稳定恢复体重，在终止日无平均体重的显著损失。
在用媒质对照(不含bFGF；组1)和索拉非尼(组5)处理的小鼠中体重未恢复，两组在研究终止时具有显著体重损失(分别5.5％和5.6％)。
纤维囊的湿重是主要由被AngioChambersTM中捕获的bFGF和随后通过内源性VEGF的刺激诱导的血管发生的程度驱动。小或轻纤维囊与小程度的血管形成关联，并因此与通过特定治疗的血管发生的更高抑制关联。
在此研究中，相比不含装载到室中的bFGF的媒质对照组(组1,基线对照)，在含室中装载bFGF的媒质对照组(组2,诱导对照)中切下的囊的纤维囊形成显著更大(图21)指示，bFGF充分和显著刺激囊形成。
由于全部处理组具有装载到室中的bFGF，以下讨论的与媒质对照组的全部比较指称诱导对照，组2(含装载到室中的bFGF)。
图21显示组1～5的测试的结果。组1是不含bFGF的媒质对照(NMP:PEG300(1:9,v/v))。组2是含bFGF的媒质对照(NMP:PEG300(1:9,v/v))。组3是含bFGF的JBp1*。组4是含bFGF的JBp1-DCM*。组5是索拉非尼，60mg/kg，含bFGF。参照符号“a”表示与诱导对照(媒质对照含bFGF(组2))显著不同(p<0.05：单因素ANOVA)。参照符号“b”表示与JBp1单一处理(含bFGF)(组3)显著不同(p<0.05：单因素ANOVA)。全部处理以一次/天施用5天(第0～4天)。
用JBp1，JBp1-DCM和索拉非尼(组3,4和5,分别)的处理导致相比诱导对照(组2)显著减少血管发生，如通过囊重量差异指示(图21)。用JBp1-DCM和索拉非尼处理(分别组4和5)相比JBp1单一处理(组3)显著减少血管发生。
相比用JBp1-DCM处理的那些(组4)，自用JBp1单独处理的小鼠(组3)收获的室在纤维囊和室之间的空间具有更多游离血。围绕自用JBp1-DCM处理的小鼠(组4)收获的室的纤维囊相比用媒质对照(分别不含及含bFGF；组1和2)处理的更刚性。
【结论】
在雌性FvB小鼠中使用vivoPharm的AngioChamberTM测定研究了用单独及与DCM(2-脱氧葡萄糖(30.55mg/kg)，辣椒酸酯(29.12mg/kg)和甲基硒代半胱氨酸(0.003mg/kg))组合施用的JBp1(胰蛋白酶原(0.13mg/kg)，糜蛋白酶原(0.78mg/kg)和α-淀粉酶(0.03mg/kg))腹膜内处理的体内抗-血管发生功效。将测试品的效应与参照化合物，索拉非尼(60mg/kg,p.o.)的效应进行了比较。
在此研究中，全部处理导致相比诱导对照bFGF-诱导的血管发生的显著抑制，如通过在研究的终止日的囊湿重指示。参照化合物，索拉非尼，及JBp1-DCM的组合相比JBp1单一处理显著减少血管发生。因此，JBp1-DCM显示在减少血管发生中有效。
【实施例3：酶原制剂的体外研究】
从事研究以测定含甲基硒代半胱氨酸(M)，辣椒酸酯(C)或2-脱氧葡萄糖(D)的活性剂的包含胰蛋白酶原(pT)，糜蛋白酶原(pC)和α-淀粉酶(A)的酶原制剂(制剂称之为JBp1vP)的效应。研究应用了等效线方法，以明白这些组分之间的相互作用。
【总结】
研究这些酶原制剂的细胞生长抑制性性质。基于IC50值和最大生长抑制，选择3个细胞系，A-549，HCT-15和MIAPaCa-2用于使用等效线方法的组合研究。等效线图的使用允许研究3种个体组分和JBp1vP之间的相互作用水平。通过研究彼此组合的个体组分及作为与JBp1vP的混合物的生长抑制活性，鉴定增强的制剂。这些增强的制剂的结果显示于图22～24，其提供在HCT-15细胞中分别JBp1vP和个别M，C和D的等效线分析。
【实施例4：含有2-脱氧葡萄糖和甲基硒代半胱氨酸的制剂的体外研究】
从事研究以测定包含甲基硒代半胱氨酸(M)和2-脱氧葡萄糖(D)的制剂的效应。研究应用了等效线方法，以明白这些组分之间的相互作用。
【总结】
研究这些酶原制剂的细胞生长抑制性性质。基于IC50值和最大生长抑制，选择3个细胞系，A-549，HCT-15和MIAPaCa-2用于使用等效线方法的组合研究。等效线图的使用允许研究这两种组分之间的相互作用水平。通过研究个体组分及彼此组合的生长抑制活性，鉴定增强的制剂。增强的制剂的结果显示于图25，其在HCT-15细胞中提供M和D组合的等效线分析。
本发明涉及以下实施方式：
1.药物组合物，其包含蛋白酶酶原和活性剂，所述组合物能提供治疗癌的多-功能方法，其中蛋白酶酶原选自胰蛋白酶原和糜蛋白酶原中的至少一种，及活性剂选自下列中的至少一种：硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂，及任选地糖苷水解酶。
2.实施方式1的药物组合物，其中蛋白酶酶原是胰蛋白酶原和糜蛋白酶原。
3.实施方式1或实施方式2的药物组合物，其中糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在4:1至8:1之间的范围内。
4.实施方式3的药物组合物，其中糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在5:1至7:1之间的范围内。
5.实施方式4的药物组合物，其中糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是6:1。
6.实施方式1～5中任一项的药物组合物，其中硒化合物是式I或式II的化合物：
或其药学可接受的盐，其中：
R1和R3各独立地选自H，OH，-C(O)H，-C(O)OH，-C(O)-OR5，C1～4烷基和C2～6烯基，其中C1～4烷基和C2～6烯基任选地被独立地选自下列的0～3种取代基取代：卤素，OH，-NH2，-C(O)OH，-C(O)-OR5；
R2和R4各独立地选自H，OH，-C(O)H，-C(O)OH，-C(O)-OR5，C1～12烷基和C2～12烯基，其中C1～12烷基和C2～12烯基任选地被选自下列的一种或更多基团间断：-NH-，-N(C1～4烷基)-，-NH(CO)-，-C(O)-，-C(O)O-，-O-及-C(NH2)H-C(O)O-，及任选地被独立地选自下列的0～3种取代基取代：卤素，-NH2，-OH，-C1～4烷基，-C(O)OH，-C(O)H，-C(O)-OR5，-N(C1～4烷基)H，-N(C1～4烷基)2，-C(NH2)H-C(O)OH，环烷基，环烯基和芳基；以及
其中R5选自烷基，烯基，环烷基和环烯基。
7.实施方式6的药物组合物，其中R1和R3各独立地选自H，OH和C1～4烷基。
8.实施方式6或实施方式7的药物组合物，其中R2和R4各独立地选自H，OH及-C1～6烷基-C(NH2)H-C(O)OH。
9.实施方式1～8中任一项的药物组合物，其中硒化合物是甲基硒代半胱氨酸或其药学可接受的盐。
10.实施方式1～9中任一项的药物组合物，其中类香兰素化合物是式III的化合物：
或其药学可接受的盐，其中：
R1和R2各独立地选自H，OH，OCH3，C(O)H，OC2～6烷基，OC2～6烯基，SH，SC1～6烷基，NH2，NHC1～6烷基和N(C1～6烷基)2；
R3和R4各独立地选自H，C1～20烷基，C2～20烯基和C2～20炔基，其中C1～20烷基，C2～20烯基和C2～20炔基，任选地被选自下列的一种或更多基团间断：-NR6-，-NH(CO)-，-C(O)-，-C(O)O-，-O-，-C(NR6R6)H-C(O)O-，-C(S)-，-C(S)NR6-及-NR6-C(S)-NR6，及任选地被独立地选自下列的0～3种取代基取代：卤素，-NH2，-OH，-C1～4烷基，-C(O)OH，-C(O)OR5，-C(O)H，-N(C1～4烷基)H，-N(C1～4烷基)2，-C(NH2)H-C(O)OH，-C(S)-，任选地取代的环烷基，任选地取代的环烯基和任选地取代的芳基；以及
其中R5选自烷基，烯基，环烷基，环烯基；R6选自H，C1～6烷基；及R3和R4可接合而形成任选地取代的不饱和的或饱和的环，在所述环中具有3～8个碳原子，且所述环包括选自O，S和N的0～3个杂原子。
11.实施方式10的药物组合物，其中：
R1和R2各独立地选自OH，C(O)H和OCH3；
R3选自H，C1～20烷基，C2～20烯基和C2～20炔基，其中C1～20烷基，C2～20烯基和C2～20炔基，任选地被选自下列的一种或更多基团间断：-NR6-，-NH(CO)-，-C(O)-，-C(O)O-，-O-，-C(NR6R6)H-C(O)O-，-C(S)-，-C(S)NR6-及-NR6-C(S)-NR6，及任选地被独立地选自下列的0～3种取代基取代：卤素，-NH2，-OH，-C1～4烷基，-C(O)OH，-C(O)OR5，-C(O)H，-N(C1～4烷基)H，-N(C1～4烷基)2，-C(NH2)H-C(O)OH，-C(S)-，任选地取代的环烷基，任选地取代的环烯基和任选地取代的芳基；以及
R4是H。
12.实施方式10或实施方式11的药物组合物，其中R3选自-C1～4烷基-NH-C(O)-C1～12烯基，-C1～4烷基-NH-C(O)-C1～12烷基，-C1～4烷基-O-C(O)-C1～12烯基，及-C1～4烷基-O-C(O)-C1～12烷基。
13.实施方式1～12中任一项的药物组合物，其中类香兰素化合物选自辣椒酸酯，即4-羟基-3-甲氧基苄基(E)-8-甲基-6-壬烯酸酯。
14.实施方式1～13中任一项的药物组合物，其中糖苷水解酶是α-淀粉酶。
15.实施方式1～14中任一项的药物组合物，其中细胞质糖酵解减少剂是2-脱氧-D-葡萄糖。
16.实施方式1～15中任一项的药物组合物，其中活性剂选自下列中的至少一种：甲基硒代半胱氨酸，辣椒酸酯，α-淀粉酶和2-脱氧-D-葡萄糖。
17.实施方式16的药物组合物，其中活性剂由下列组成：甲基硒代半胱氨酸，辣椒酸酯，α-淀粉酶和2-脱氧-D-葡萄糖。
18.药物组合物，其包含第1和第2蛋白酶酶原，所述第1和第2蛋白酶酶原能在肿瘤细胞的表面或接近肿瘤细胞的表面活化而增强肿瘤细胞的细胞间粘接，实现肿瘤细胞的蛋白水解，或诱导肿瘤细胞凋亡，分化或免疫识别，其中
第1蛋白酶酶原是糜蛋白酶原，而
第2蛋白酶酶原是胰蛋白酶原，且
糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在4:1至8:1之间的范围内。
19.实施方式18的药物组合物，其中糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在5:1至7:1之间的范围内。
20.实施方式19的药物组合物，其中糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是6:1。
21.实施方式18～20中任一项的药物组合物，其中药物组合物还包含实施方式1～17中任一项中定义的活性剂。
22.药物组合物，其包含第1和第2活性剂，所述第1和第2活性剂各能诱导肿瘤细胞的细胞内活性，其中第1活性剂是硒化合物，而第2活性剂是细胞质糖酵解减少剂。
23.实施方式22的药物组合物，其中硒化合物和细胞质糖酵解减少剂如实施方式1～17中任一项中定义。
24.实施方式22或实施方式23的药物组合物，还包含实施方式1～17中任一项中定义的蛋白酶酶原。
25.实施方式22～24中任一项的药物组合物，其还包含选自实施方式1～17中任一项中定义的类香兰素化合物和糖苷水解酶的活性剂。
26.癌治疗剂，其中所述癌治疗剂包含蛋白酶酶原和活性剂，它们一起能提供治疗癌的多-功能方法，其中蛋白酶酶原和活性剂如实施方式1～17中任一项中定义。
27.蛋白酶酶原用于制备包含癌治疗用活性剂的药物的用途，其中蛋白酶酶原和活性剂如实施方式1～17中任一项中定义。
28.活性剂用于制备包含癌治疗用蛋白酶酶原的药物的用途，其中蛋白酶酶原和活性剂如实施方式1～17中任一项中定义。
29.蛋白酶酶原和活性剂用于制备癌治疗用药物的用途，其中蛋白酶酶原和活性剂如实施方式1～17中任一项中定义。
30.蛋白酶酶原用于制备用于治疗用活性剂治疗的受试者中的癌的药物的用途，其中活性剂和蛋白酶酶原一起能影响肿瘤细胞，且任选地其中活性剂能诱导细胞内活性而增强蛋白酶酶原的效应，且其中蛋白酶酶原和活性剂如实施方式1～17中任一项中定义。
31.活性剂用于制备用于治疗用蛋白酶酶原治疗的受试者中的癌的药物的用途，其中活性剂和蛋白酶酶原一起能影响肿瘤细胞，且任选地其中活性剂能诱导细胞内活性而增强蛋白酶酶原的效应，且其中蛋白酶酶原和活性剂如实施方式1～17中任一项中定义。
32.治疗癌的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的蛋白酶酶原和活性剂，其中蛋白酶酶原和活性剂如实施方式1～17中任一项中定义。
33.制备实施方式1～17中任一项的药物组合物，或其制备物或制剂的方法，通过将蛋白酶酶原与活性剂混合来实施。
34.实施方式18～25中任一项的药物组合物，其用于治疗癌。
35.实施方式18～25中任一项的药物组合物用于制备癌治疗用药物的用途。
36.治疗癌的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的实施方式18～25中任一项的药物组合物。
37.栓剂，其包含治疗有效量的实施方式1～25中任一项的药物组合物。

Claims (10)

1.包含糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的药物组合物，其中糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比为4:1至8:1。
2.权利要求1的药物组合物，其中糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比为5:1至7:1。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中糜蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是6:1。
4.糜蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备根据权利要求1-3中任一项的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物用于治疗实体肿瘤。
5.权利要求4的用途，其中所述实体肿瘤选自卵巢癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胰癌、食管癌、乳腺癌、脑癌和肝癌。
6.权利要求5的用途，其中所述实体肿瘤选自卵巢癌、胰腺癌和结肠癌。
7.药物组合物，其包含蛋白酶酶原和活性剂，所述组合物能提供治疗癌的多-功能方法，其中蛋白酶酶原选自胰蛋白酶原和糜蛋白酶原中的至少一种，及活性剂选自下列中的至少一种：硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂，及任选地糖苷水解酶。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述活性剂选自下列中的至少一种：甲基硒代半胱氨酸，辣椒酸酯，α-淀粉酶和2-脱氧-D-葡萄糖。
9.药物组合物，其包含第1和第2活性剂，所述第1和第2活性剂各能诱导肿瘤细胞的细胞内活性，其中第1活性剂是硒化合物，而第2活性剂是细胞质糖酵解减少剂。
10.活性剂在制备用于对正进行蛋白酶酶原治疗的受试者治疗癌症的药物中的用途，其中所述活性剂和所述蛋白酶酶原一起能影响肿瘤细胞，任选地其中活性剂能诱导细胞内活性而增强蛋白酶酶原的效应，并且其中蛋白酶酶原和活性剂如权利要求7－8中任一项中定义。
CN201710885368.4A 2009-10-22 2010-10-22 包含胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的用于治疗癌的药物组合物 Active CN107625957B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2009905147A AU2009905147A0 (en) 2009-10-22 Pharmaceutical Compositions
AU2009905147 2009-10-22
AU2010902655A AU2010902655A0 (en) 2010-06-17 Cancer Cell Regulation
AU2010902655 2010-06-17
CN201080054056.5A CN102639145B (zh) 2009-10-22 2010-10-22 包含胰蛋白酶原和/或糜蛋白酶原和选自硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂的活性剂的用于治疗癌的药物组合物

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080054056.5A Division CN102639145B (zh) 2009-10-22 2010-10-22 包含胰蛋白酶原和/或糜蛋白酶原和选自硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂的活性剂的用于治疗癌的药物组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107625957A true CN107625957A (zh) 2018-01-26
CN107625957B CN107625957B (zh) 2021-06-15

Family

ID=43899732

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080054056.5A Active CN102639145B (zh) 2009-10-22 2010-10-22 包含胰蛋白酶原和/或糜蛋白酶原和选自硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂的活性剂的用于治疗癌的药物组合物
CN201710885368.4A Active CN107625957B (zh) 2009-10-22 2010-10-22 包含胰蛋白酶原和糜蛋白酶原的用于治疗癌的药物组合物

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080054056.5A Active CN102639145B (zh) 2009-10-22 2010-10-22 包含胰蛋白酶原和/或糜蛋白酶原和选自硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂的活性剂的用于治疗癌的药物组合物

Country Status (22)

Country Link
US (4) US9636359B2 (zh)
EP (2) EP2490711A4 (zh)
JP (1) JP5871805B2 (zh)
KR (1) KR101936439B1 (zh)
CN (2) CN102639145B (zh)
AU (1) AU2010310887B9 (zh)
BR (1) BR112012009521B1 (zh)
CA (1) CA2814958C (zh)
CL (1) CL2012001019A1 (zh)
DK (1) DK3095458T3 (zh)
ES (1) ES2692377T3 (zh)
HK (1) HK1249017A1 (zh)
IL (1) IL219216A (zh)
MX (1) MX355971B (zh)
NZ (1) NZ599996A (zh)
PE (1) PE20121709A1 (zh)
PT (1) PT3095458T (zh)
RU (1) RU2012120785A (zh)
SG (1) SG10201406651PA (zh)
TR (1) TR201815315T4 (zh)
WO (1) WO2011047434A1 (zh)
ZA (1) ZA201203689B (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011047434A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Propanc Pty Ltd A pharmaceutical composition for treating cancer comprising trypsinogen and/or chymotrypsinogen and an active agent selected from a selenium compound, a vanilloid compound and a cytoplasmic glycolysis reduction agent
SG10202101918RA (en) * 2013-03-15 2021-03-30 Alltech Inc Compositions comprising selenium and use of same for the treatment and prevention of disease or conditions associated with mitochondrial dysfunction
CZ307195B6 (cs) 2013-11-18 2018-03-14 František Trnka Farmaceutická kompozice obsahující směs proenzymů a enzymů
BR112016020233B1 (pt) * 2014-03-14 2022-07-19 Alltech Inc. Composições de compostos seleno orgânicos e seus usos
US10092550B2 (en) 2014-10-21 2018-10-09 Ions Pharmaceutical S.À R.L. Therapeutic compositions containing curcumin, harmine, and isovanillin components, and methods of use thereof
US9907786B2 (en) 2014-10-21 2018-03-06 Ions Pharmaceutical S.À R.L. Therapeutic compositions containing harmine and isovanillin components, and methods of use thereof
US20160106721A1 (en) 2014-10-21 2016-04-21 Life Plus, LLC Human therapeutic agents
CA3003835A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-18 Propanc Pty Ltd Proenzyme composition
NZ744845A (en) 2016-01-29 2023-04-28 Propanc Pty Ltd Cancer treatment
CN109152823A (zh) * 2016-04-12 2019-01-04 普罗潘克股份有限公司 用于癌症治疗的酶原的组合物
EP3517117A1 (en) * 2018-01-30 2019-07-31 Medizinische Universität Wien Medicament for prevention or treatment of rhinovirus infection
WO2022261440A1 (en) * 2021-06-11 2022-12-15 Sorrento Therapeutics, Inc. Administration of resiniferatoxin for treatment of pancreatic cancer

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4514388A (en) * 1983-03-22 1985-04-30 Psaledakis Nicholas G Proteolytic enzymes in the zymogen form to treat sarcoma cells
CZ307195A3 (en) * 1994-11-21 1996-08-14 Saint Gobain Vitrage Glazing pane provided with at least one thin layer, process process for producing such glazing pane and use
US5858357A (en) * 1995-05-17 1999-01-12 Trnka; Frantisek Pharmaceutical composition containing an isolated protease proenzyme, amylase, and aprotinin
CN1312072A (zh) * 2000-03-08 2001-09-12 台湾东洋药品工业股份有限公司 治疗肝细胞癌的药物组合物
CN1471925A (zh) * 2002-08-02 2004-02-04 丛繁滋 更适于硬质肿瘤直接给药的含砷组合物、制剂及制备方法
CN1557482A (zh) * 2004-02-04 2004-12-29 高春平 调节免疫功能、抗肿瘤的天然营养剂
CN1787834A (zh) * 2003-05-14 2006-06-14 马科斯药品有限责任公司 一种或几种含酶的组合物,及由其生产的饮食食物产品和药物,和其医药用途
CN1944641A (zh) * 2006-10-26 2007-04-11 上海林叶生物科技有限公司 高纯度糜蛋白酶的制备方法
KR100740989B1 (ko) * 2005-07-22 2007-07-19 넨시스(주) 구형 항염·항암효소 과립제 및 이의 제조방법
CN101287481A (zh) * 2005-05-26 2008-10-15 科学工业研究委员会 用于治疗肝细胞癌的药物组合物

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4978332A (en) * 1987-09-28 1990-12-18 Matrix Pharmaceutical, Inc. Treatments employing vasoconstrictive substances in combination with cytotoxic agents for introduction into cellular lesion areas
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US6670330B1 (en) * 2000-05-01 2003-12-30 Theodore J. Lampidis Cancer chemotherapy with 2-deoxy-D-glucose
AU2002226650A1 (en) * 2001-01-18 2002-07-30 Arnold Hoffman Redox therapy for tumors
JP2004182674A (ja) * 2002-12-05 2004-07-02 Kureha Chem Ind Co Ltd バニリル脂肪酸アミドを含む抗腫瘍医薬組成物
AU2004204778B2 (en) * 2003-01-10 2008-05-22 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancer with 2-deoxyglucose
GB2417685B (en) * 2003-05-13 2007-12-19 Health Research Inc Method for augmenting the antitumor activity of anti-cancer agents
JP2006151965A (ja) * 2004-10-28 2006-06-15 Mi Tec:Kk セレン含有組成物及びその製法
KR101058136B1 (ko) * 2007-11-09 2011-08-24 신동헌 캡시에이트 또는 디하이드로캡시에이트의 신규한 용도
WO2011047434A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Propanc Pty Ltd A pharmaceutical composition for treating cancer comprising trypsinogen and/or chymotrypsinogen and an active agent selected from a selenium compound, a vanilloid compound and a cytoplasmic glycolysis reduction agent
CZ307195B6 (cs) * 2013-11-18 2018-03-14 František Trnka Farmaceutická kompozice obsahující směs proenzymů a enzymů

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4514388A (en) * 1983-03-22 1985-04-30 Psaledakis Nicholas G Proteolytic enzymes in the zymogen form to treat sarcoma cells
CZ307195A3 (en) * 1994-11-21 1996-08-14 Saint Gobain Vitrage Glazing pane provided with at least one thin layer, process process for producing such glazing pane and use
US5858357A (en) * 1995-05-17 1999-01-12 Trnka; Frantisek Pharmaceutical composition containing an isolated protease proenzyme, amylase, and aprotinin
CN1312072A (zh) * 2000-03-08 2001-09-12 台湾东洋药品工业股份有限公司 治疗肝细胞癌的药物组合物
CN1471925A (zh) * 2002-08-02 2004-02-04 丛繁滋 更适于硬质肿瘤直接给药的含砷组合物、制剂及制备方法
CN1787834A (zh) * 2003-05-14 2006-06-14 马科斯药品有限责任公司 一种或几种含酶的组合物,及由其生产的饮食食物产品和药物,和其医药用途
CN1557482A (zh) * 2004-02-04 2004-12-29 高春平 调节免疫功能、抗肿瘤的天然营养剂
CN101287481A (zh) * 2005-05-26 2008-10-15 科学工业研究委员会 用于治疗肝细胞癌的药物组合物
KR100740989B1 (ko) * 2005-07-22 2007-07-19 넨시스(주) 구형 항염·항암효소 과립제 및 이의 제조방법
CN1944641A (zh) * 2006-10-26 2007-04-11 上海林叶生物科技有限公司 高纯度糜蛋白酶的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSEF F. NOVAK等: "Proenzyme Therapy of Cancer", 《ANTICANCER RESEARCH》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2814958A1 (en) 2011-04-28
US9636359B2 (en) 2017-05-02
JP2013508307A (ja) 2013-03-07
US20180064753A1 (en) 2018-03-08
MX2012004610A (es) 2012-11-12
US10350239B2 (en) 2019-07-16
KR101936439B1 (ko) 2019-01-08
ZA201203689B (en) 2013-02-27
JP5871805B2 (ja) 2016-03-01
IL219216A0 (en) 2012-06-28
EP3095458B1 (en) 2018-07-25
PT3095458T (pt) 2018-11-09
AU2010310887B2 (en) 2015-09-03
AU2010310887A1 (en) 2012-06-07
EP2490711A1 (en) 2012-08-29
KR20120128124A (ko) 2012-11-26
NZ599996A (en) 2014-06-27
ES2692377T3 (es) 2018-12-03
CN102639145B (zh) 2017-09-26
SG10201406651PA (en) 2014-11-27
BR112012009521B1 (pt) 2021-07-13
US20230137573A1 (en) 2023-05-04
AU2010310887B9 (en) 2015-10-08
US20190388463A1 (en) 2019-12-26
CA2814958C (en) 2023-09-26
MX355971B (es) 2018-05-07
CN102639145A (zh) 2012-08-15
EP2490711A4 (en) 2013-04-03
CN107625957B (zh) 2021-06-15
US20120251516A1 (en) 2012-10-04
CL2012001019A1 (es) 2013-07-12
IL219216A (en) 2017-03-30
EP3095458A1 (en) 2016-11-23
HK1249017A1 (zh) 2018-10-26
RU2012120785A (ru) 2013-11-27
BR112012009521A2 (pt) 2016-05-17
DK3095458T3 (en) 2018-11-19
PE20121709A1 (es) 2012-12-17
TR201815315T4 (tr) 2018-11-21
WO2011047434A1 (en) 2011-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102639145B (zh) 包含胰蛋白酶原和/或糜蛋白酶原和选自硒化合物，类香兰素化合物和细胞质糖酵解减少剂的活性剂的用于治疗癌的药物组合物
Deng et al. Flavonoid-rich extracts from okra flowers exert antitumor activity in colorectal cancer through induction of mitochondrial dysfunction-associated apoptosis, senescence and autophagy
Valentovic Evaluation of resveratrol in cancer patients and experimental models
You et al. Modulatory effect of fermented papaya extracts on mammary gland hyperplasia induced by estrogen and progestin in female rats
Kim et al. Surfactin exerts an anti-cancer effect through inducing allergic reactions in melanoma skin cancer
Godsey et al. Review of various herbal supplements as complementary treatments for oral cancer
Wu et al. α-Tomatine, a novel early-stage autophagy inhibitor, inhibits autophagy to enhance apoptosis via Beclin-1 in Skov3 cells
CN104547312B (zh) 一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品
EP3448372B1 (en) Formulations for use in the treatment or in the prevention of urological diseases
Roomi et al. Nutraceuticals in Cancer Prevention
KR102018085B1 (ko) 악테오사이드를 함유하는 뇌종양 치료 및 전이 억제용 약학 조성물
KR102135148B1 (ko) 악테오사이드를 함유하는 뇌종양 치료 및 전이 억제용 약학 조성물
Roomi et al. Inhibition of tumor growth and metastasis by a novel nutrient mixture of inoculation of mouse mammary 4T1 carcinoma in kidney of female Balb/c mice
Zalavadiya et al. Bromelain's Properties and Therapeutic Applications: A Review
KR101908075B1 (ko) 라폰티신을 포함하는 암 전이 억제용 조성물
Mottola et al. Genotoxicity Assessment of Quinoin, a Ribosome Inactivating Protein from Quinoa Seeds, in the Teleost Danio rerio
Roomi et al. Nutraceuticals in cancer prevention
Honey Organic Aloe Natural Raw Honey
KR20200114795A (ko) 개그물바탕말 추출물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
CN106748941A (zh) 含硒化合物及其用途
Fonmboh et al. Nutritional Management Approach for Possible Prevention of COVID-19 Infection and Transmission in Sub-Saharan and Biodiversity Endowed Countries

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1249017

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant