MX2012004610A - Una composicion farmceutica para tratar cancer que comprende tripsinogeno y/o quimotripsinogeno y un agente activo seleccionado a partir de un compuesto de selenio, un compuesto vainilloide y un agente reductor de glicolisis citoplasmica. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden una pro-enzima de proteasa y el uso de las mismas para tratar el cáncer. Las composiciones farmacéuticas están dirigidas a composiciones que comprenden una pro- enzima de proteasa y un agente activo, la composición que es capaz de proporcionar un enfoque multi-funcional para tratar el cáncer. Las composiciones farmacéuticas también están dirigidas a composiciones que comprenden una primera y segunda pro-enzima de proteasa susceptible a activación en o cerca de una superficie de una célula tumoral para mejorar la adhesión célula-a-célula de células tumorales, efectuar proteólisis de células tumorales, o inducir apoptosis, diferenciación o inmunoreconocimiento de célula tumoral, caracterizado porque la primera pro-enzima de proteasa es quimotripsinógeno y la segunda pro-enzima de proteasa es tripsinógeno. Las composiciones farmacéuticas están también dirigidas a composiciones que comprenden un primer y una segundo agente activo, cada uno capaz de inducir actividad intracelular en células tumorales.

Description

UNA COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA PARA TRATAR CÁNCER QUE COMPRENDE TRIPSINÓGENO Y/O QUIMOTRIPSINÓGENO Y UN AGENTE ACTIVO SELECCIONADO A PARTIR DE UN COMPUESTO DE SELENIO. UN COMPUESTO VAINILLOIDE Y UN AGENTE REDUCTOR DE GLICÓLISIS CITOPLÁSMICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere de manera general a composiciones farmacéuticas que contienen una pro-enzima de proteasa y el uso de las mismas para tratar el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La idea de usar proteasas en el tratamiento del cáncer ha estado latente aproximadamente durante más de 100 años. En 1905, John Beard propuso el uso de extractos de enzima pancreática frescos como una posible terapia para el cáncer y condujo experimentos útiles con el modelo de sarcoma de ratón de Jersen. Después de inyectar al ratón con enzima de tripsina proteasa, se observó una regresión de los tumores. Los resultados obtenidos por Beard produjeron un gran interés en ese tiempo, y los extractos de enzima crudos preparados a partir de páncreas de oveja fueron utilizados para tratar a pacientes humanos con cáncer a fin de reducir la progresión del tumor y prolongar el tiempo de sobrevivencia.

Más recientemente, la administración oral de enzimas ha demostrado ser bien tolerada por los pacientes con adecuados índices de sobrevivencia a través de un rango de cánceres que incluyen mielomas pancreáticos, intestinal, colorectal y de fase terminal. Se ha requerido del uso de altas dosis de enzimas debido a la pérdida e inactivación a través de la digestión y a partir de otros inactivadores de enzima en el plasma sanguíneo tales como serpinas.

El uso de pro-enzimas (forma precursora inactiva de enzimas) ha sido utilizado para superar los problemas encontrados con la administración oral de las enzimas. Se ha demostrado que una mezcla de pro-enzima que incluye tripsinógeno, el cual es la forma de pro-enzima de tripsina inhibidora de serina proteasa, es útil para tratar carcinomas y se considera que es selectivamente activada en la superficie de las células tumorales (Novak J and Trnka F, Proenzime Therapy of Cáncer, Anticancer Research, 25: 1 157-1 178, 2005; US 5,858,357). Se considera que el mecanismo de acción de la tripsina ocurre a manera de proteólisis de las células tumorales.

Existe la necesidad de identificar y proporcionar composiciones de proenzima mejoradas que sean efectivas para tratar cánceres.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto proporciona una composición farmacéutica que comprende una pro-enzima de proteasa y un agente activo, la composición que es capaz de proporcionar un enfoque multi-funcional para tratar el cáncer.

Un segundo aspecto proporciona una composición farmacéutica que comprende: una pro-enzima de proteasa susceptible a activación en o cerca de una superficie de una célula tumoral para mejorar la adhesión célula-a-célula de células tumorales, efectuar proteólisis de células tumorales, o inducir apoptosis, diferenciación o inmunoreconocimiento de célula tumoral; y un agente activo capaz de inducir actividad intracelular en células tumorales.

En una modalidad del segundo aspecto, la actividad intracelular es apoptosis, ¡nmunoreconocimiento o diferenciación de célula tumoral.

En una modalidad del primero o segundo aspecto, la composición farmacéutica comprende una pro-enzima de proteasa y un agente activo, la composición que es capaz de proporcionar un enfoque multi-funcional para tratar el cáncer, en donde la pro-enzima de proteasa es seleccionada a partir de por lo menos uno de tripsinógeno y quimotripsinógeno, y el agente activo es seleccionado por lo menos a partir de un compuesto de selenio, a compuesto vainilloide y un agente reductor de glicólisis citoplásmica, y de modo opcional una glucósido hidrolasa. En una modalidad adicional, la pro-enzima de proteasa es tripsinógeno y quimotripsinógeno.

Un tercer aspecto proporciona un agente o composición para tratar el cáncer, en donde el agente comprende una pro-enzima de proteasa y un agente activo, que juntos son capaces de proporcionar un enfoque multi-funcional para tratar el cáncer.

Un cuarto aspecto proporciona un agente o composición para tratar el cáncer, en donde el agente comprende: una pro-enzima de proteasa susceptible a activación en o cerca de una superficie de a célula tumoral para mejorar la adhesión célula-a-célula de células tumorales, efectuar la proteolisis de células tumorales, o inducir apoptosis, diferenciación o ¡nmunoreconocimiento de célula tumoral; y un agente activo capaz de inducir actividad intracelular en células tumorales.

Un quinto aspecto proporciona el uso de una pro-enzima de proteasa en la elaboración de un medicamento que comprende un agente activo para tratar el cáncer.

Un sexto aspecto proporciona el uso de un agente activo en la elaboración de un medicamento que comprende una pro-enzima de proteasa para tratar el cáncer.

Un séptimo aspecto proporciona el uso de una pro-enzima de proteasa y un agente activo en la elaboración de un medicamento para tratar el cáncer.

Un octavo aspecto proporciona el uso de una pro-enzima de proteasa en la elaboración de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto que es tratado con un agente activo, en donde el agente activo y la pro-enzima de proteasa juntos son capaces de afectar células tumorales, y de modo opcional en donde el agente activo es capaz de inducir actividad intracelular para mejorar el efecto de la pro-enzima de proteasa.

Un noveno aspecto proporciona el uso de un agente activo en la elaboración de un medicamento para tratar el cáncer en un paciente que es tratado con una pro-enzima de proteasa, en donde el agente activo y la pro-enzima de proteasa juntos son capaces de afectar a células tumorales, y de modo opcional en donde el agente activo es capaz de inducir actividad intracelular para mejorar el efecto de la pro-enzima de proteasa.

Un décimo aspecto proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una proenzima de proteasa y un agente activo.

En una modalidad del décimo aspecto, el método comprende coadministración o administración secuencial de la pro-enzima de proteasa y el agente activo, y de manera opcional agente activo adicional. La co-administración puede comprender administración de un medicamento individual que comprende la composición farmacéutica del primero y segundo aspectos, o co-administración de medicamentos separados cada uno que comprende una pro-enzima de proteasa y el agente activo, y de modo opcional agente activo adicional. La administración secuencial puede involucrar cualquier orden de administración de la pro-enzima de proteasa, agente activo, o agente activo adicional. La administración secuencial y la co-administración pueden involucrar diferentes vías de administración de la pro-enzima de proteasa, agente activo, o agente activo adicional.

El método de acuerdo con el décimo aspecto puede incluir la administración de la pro-enzima de proteasa o el agente activo a un sujeto que ya es tratado por separado con el agente activo o la pro-enzima de proteasa, respectivamente.

Un undécimo aspecto proporciona un método para preparar la composición farmacéutica del primero y segundo aspectos, o la preparación o formulación de la misma, a través de la mezcla de la pro-enzima de proteasa con el agente activo.

En una modalidad adicional del undécimo aspecto, el método puede comprender además la mezcla de un agente activo adicional de acuerdo con una modalidad del primer y segundo aspectos con las pro-enzimas de proteasa y/o agente activo.

En una modalidad de los aspectos anteriores, la pro-enzima de proteasa es una pro-enzima de serina proteasa. La pro-enzima de serina proteasa puede ser tripsinógeno, quimotripsinógeno o una mezcla de los mismos. En otra modalidad, la proenzima de proteasa comprende una primera y una segunda pro-enzima de proteasa, en donde la primera pro-enzima de proteasa es quimotripsinógeno y la segunda pro-enzima de proteasa es tripsinógeno, y la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno está en el rango de entre 4:1 a 8:1. En una modalidad adicional, la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno está en el rango de entre 5:1 hasta 7:1. En una modalidad adicional, la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno es 6: 1.

En una modalidad de los aspectos anteriores, el agente activo se selecciona a partir de por lo menos uno del grupo que comprende un compuesto de selenio, un compuesto vainilloide y un agente reductor de glicólisis citoplásmica, y de modo opcional una glucósido hidrolasa. Por ejemplo, el agente activo puede ser un compuesto de selenio, o una combinación que consta de un compuesto de selenio, un compuesto vainilloide, una glucósido hidrolasa y agente reductor de glicólisis citoplásmica.

En una modalidad de los aspectos anteriores, la composición farmacéutica comprende una pro-enzima de proteasa y un agente activo, la composición que es capaz de proporcionar un enfoque multi-funcional para tratar el cáncer, en donde la pro-enzima de proteasa es seleccionada a partir de por lo menos uno de tripsinógeno y quimotripsinógeno, y el agente activo es seleccionado a partir de por lo menos uno de un compuesto de selenio, un compuesto vainilloide y un agente reductor de glicólisis citoplásmica, y de forma opcional una glucósido hidrolasa.

En una modalidad adicional de los aspectos anteriores, el compuesto de selenio es capaz de proporcionar una fuente biodisponible de selenio que puede ser absorbido por el cuerpo dentro del plasma sanguíneo o fluidos inter-celulares. En una modalidad particular, el compuesto que contiene selenio es metilselenocisteina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

En una modalidad de los aspectos anteriores, la glucósido hidrolasa es una amilasa, por ejemplo a-amilasa.

En otra modalidad de los aspectos anteriores, el agente reductor de glicólisis citoplásmica es 2-desox¡-D-glucosa.

En otra modalidad de los aspectos anteriores, el compuesto vainilloide es seleccionado a partir de capsiato, a saber 4-hidroxi-3-metoxibencil (E)-8-metil-6-nonenoato, dihidrocapsiato, a saber 4-hidroxi-3-metoxibencil 8-metilnonanoato, y nordihidrocapsiato, a saber 4-hidroxi-3-metoxibencil 7-metiloctanoato. De preferencia, el compuesto vainilloide es capsiato.

En una modalidad de los aspectos anteriores, el agente activo se selecciona a partir de por lo menos uno del grupo que comprende metilselenocisteina, capsiato, a-amilasa, y 2-desoxi-D-glucosa. En una modalidad particular, el agente activo(s) consiste en metilselenocisteina, capsiato, a-amilasa, y 2-desoxi-D-glucosa.

Un décimo segundo aspecto proporciona una composición farmacéutica que comprende una primera y segunda pro-enzima de proteasa susceptible a activación en o cerca de una superficie de a célula tumoral para mejorar la adhesión célula-a-célula de células tumorales, efectuar la proteólisis de células tumorales, o inducir apoptosis, diferenciación o inmunoreconocimiento de célula tumoral, en donde la primera pro-enzima de proteasa es quimotripsinógeno y la segunda pro-enzima de proteasa es tripsinógeno, y la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno está en el rango de entre 4:1 hasta 8:1 .

En una modalidad del décimo segundo aspecto, la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno está en el rango de entre 5:1 hasta 7:1 . En otra modalidad, la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno es 6:1 .

En otra modalidad del décimo segundo aspecto, la composición farmacéutica comprende además un agente activo como se definió en una de las modalidades antes descritas.

Un décimo tercer aspecto proporciona una composición farmacéutica que comprende un primer y segundo agente activo cada uno de los cuales es capaz de inducir actividad intracelular en células tumorales, en donde el primer agente activo es un compuesto de selenio y el segundo agente activo es un agente reductor de glicólisis citoplásmica.

En una modalidad del décimo tercer aspecto, la actividad intracelular es apoptosis, inmunoreconocimiento o diferenciación de célula tumoral. En una modalidad, el compuesto de selenio es definido de acuerdo con cualquiera de las modalidades antes descritas. En una modalidad preferida, el compuesto de selenio es metilselenocisteina. En otra modalidad, el agente reductor de glicólisis citoplásmica es 2-Desoxi-D-glucosa.

En otra modalidad del décimo tercer aspecto, la composición farmacéutica comprende además una pro-enzima de proteasa como se definió en una de las modalidades antes descritas. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además un agente activo seleccionado a partir de un compuesto vainilloide y una glucósido hidrolasa como se definió en una de las modalidades antes descritas.

Un décimo cuarto aspecto proporciona un uso de la composición farmacéutica de acuerdo con el décimo segundo o décimo tercer aspectos en la elaboración de un medicamento para tratar el cáncer.

Un décimo quinto aspecto proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de acuerdo con el décimo segundo o décimo tercer aspectos.

Las composiciones farmacéuticas, pro-enzima de proteasa o agente activo, de los aspectos anteriores se pueden proporcionar en un vehículo, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, y puede incluir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

En una modalidad de los aspectos adicionales, las composiciones farmacéuticas, agentes, uso, o métodos, puede comprender uno o más agentes activos adicionales capaces de mejorar la eficacia de la pro-enzima de proteasa, agente activo o composiciones farmacéuticas, o reducir los efectos secundarios indeseables.

En una modalidad adicional de los aspectos anteriores, la composición farmacéutica, la pro-enzima de proteasa, agente activo, y opcionalmente agente activo adicional, pueden en conjunto, o por separado, o en cualquier combinación, ser proporcionados en la forma de un supositorio.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Cada una de las Figuras 1 A-1 D muestra una gráfica de curvas estándar de número de células para células Caco2, HEK293, OE33 y Panel, respectivamente, con densidad óptica de 492nm; La Figura 2 muestra una fotomicrografía de células OE33 tratadas con una formulación de referencia de pro-enzima B; La Figura 3 muestra una gráfica de células OE33 tratadas con un rango de concentraciones de formulación de referencia de pro-enzima B; Cada una de las Figuras 4A-4C muestra una gráfica de células Panel tratadas con formulaciones de referencia de pro-enzima B, J y T, respectivamente; Cada una de las Figuras 5A-5C muestra una gráfica de células Caco2 tratadas con formulaciones de referencia de pro-enzima B, J y T, respectivamente; Cada una de las Figuras 6A y 6B proporciona fotomicrografías que muestran la sobre-regulación de ß-catenina en células OE33 que siguen el tratamiento con la formulación de referencia de pro-enzima J; Cada una de las Figuras 7A y 7B proporcionan fotomicrografías que muestran la sobre-regulación de E-Cadherina en células OE33 que siguen el tratamiento con la formulación de referencia de pro-enzima J; Cada una de las Figuras 8A y 8B proporcionan fotomicrografías que muestran la sobre-regulación de ß-catenina en células Panel que siguen el tratamiento con la formulación de referencia de pro-enzima J; Cada una de las Figuras 9A y 9B proporcionan fotomicrografías que muestran la sobre-regulación de E-Cadherina en células Panel que siguen el tratamiento con la formulación de referencia de pro-enzima J; Cada una de las Figuras 10A y 10B proporcionan fotomicrografías que muestran la sobre-regulación de E- Cadherina en células Caco2 que siguen el tratamiento con la formulación de referencia de pro-enzima J; Cada una de las Figuras 1 1 A y 1 1 B proporcionan fotomicrografías que muestran la sobre-regulación de ß-catenina en células Caco2 que siguen el tratamiento con la formulación de referencia de pro-enzima J; La Figura 12 proporciona fotomicrografías que muestran la sobre-regulación de ß-catenina y E-Cadherina en células Panel que siguen el tratamiento con la formulación de referencia de pro-enzima T; La Figura 13 proporciona fotomicrografías que muestran la sobre-regulación de ß-catenina y E-Cadherina en células Caco2 que siguen el tratamiento con la formulación de referencia de pro-enzima T; La Figura 14 proporciona un análisis isobolográfico para JBplvP y DCM en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2; La Figura 15 proporciona un análisis isobolográfico para tripsinógeno y quimotripsinógeno en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2; La Figura 16 proporciona un análisis isobolográfico para tripsinógeno y a-amilasa en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2; La Figura 17 proporciona un análisis isobolográfico para quimotripsinógeno y a-amilasa en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2; La Figura 18 proporciona un análisis isobolográfico para TA y quimotripsinógeno en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2; La Figura 19 proporciona un análisis isobolográfico para CA y tripsinógeno en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2; La Figura 20 proporciona un análisis isobolográfico para TC y a-amilasa en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2; La Figura 21 proporciona una gráfica de barras que muestra los pesos de cápsula medios para varias formulaciones de los Grupos 1 a 5 en un estudio anti-angiogénico in vivo de comparación de ratones adaptados con cápsulas fibrosas; Las Figuras 22A y 22B proporcionan un análisis isobolográfico para JBpl vP y metilselenocisteina en células HCT-15; Las Figuras 23A y 23B proporcionan un análisis isobolográfico para JBpIvP y 2-desoxiglucosa en células HCT-15; Las Figuras 24A y 24B proporcionan un análisis isobolográfico para JBpIvP y capsiato en células HCT-15; y Las Figuras 25A y 25B proporcionan un análisis isobolográfico para 2-desoxiglucosa y metilselenocisteina en células HCT-15.

DESCRIPCIÓN DE LAS ABREVIATURAS En los Ejemplos, se hará referencia a las siguientes abreviaturas en las cuales: a-Amilasa A ANOVA Análisis de Varianza Avg Promedio bFGF Factor de Crecimiento de Fibroblasto Básico BSA Albúmina de Suero Bovino BW Peso Corporal °C Grados Celsius C Capsiato Caco2 Línea celular de adenocarcinoma de colon humano Qu'imotripsinógeno pC DAvg Cambio en peso corporal promedio DCM 2-Desox¡glucosa, Capsiato y Metilselenocisteina D 2-Desoxi-D-glucosa F Fahrenheit h Hora Hb Hemoglobina i.p. Intraperitoneal IU Unidades Internacionales JBpl Formulación de pro-enzima que comprende tripsinógeno, quimotripsinógeno y a-amilasa JBpIvP Formulación de pro-enzima que comprende tripsinógeno, quimotripsinógeno y a-amilasa (pC:pT: A) en 6:1 :0.25 en relación en peso JBpl- DCM Formulación de pro-enzima que comprende tripsinógeno, quimotripsinógeno, a-amilasa, 2-desoxiglucosa, capsiato y metilselenocisteina Mn Peso molecular promedio en número Mw Peso molecular promedio en peso MW Peso molecular M Metilselenocisteina MSeA Ácido metilselénico MTD Dosis tolerable máxima NMP N-metil-2-Pirrolidona OE33 Línea celular de adenocarcinoma esofágico Panel Línea celular de carcinoma pancreático humano de Panel PBS Solución Salina Regulada con Fosfato PEG300 Polietilen Glicol 300 ?.?. Per os, (sonda oral) RD Dosis recomendada SeMeT Selenometionina SE Error Estándar de la Media SRB Proteína sulforhodamina B-prueba de tinción Tripsinógeno PT Wt% porcentaje en peso v/v Volumen por volumen DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Aunque se ha demostrado que las formulaciones de pro-enzima de proteasa proporcionan beneficios terapéuticos en el tratamiento del cáncer, el mecanismo de acción de las pro-enzimas de proteasa en células cancerígenas y tumores malignos no está completamente entendido en la técnica. Por lo tanto, el solicitante emprendió una investigación de los efectos y mecanismo involucrados con el tratamiento de las líneas celulares cancerígenas con las formulaciones de pro-enzima de serina proteasa que comprenden tripsinógeno y quimotripsinógeno, lo cual involucró investigaciones en tres líneas celulares cancerígenas diferentes (Panel, Caco2 y OE33). Fue de particular importancia el hallazgo sorpresivo de que las pro-enzimas de proteasa estuvieran involucradas en la diferenciación de células tumorales CaCo2 (posible conversión de células malignas en células no malignas) y en la sobre-regulación de la expresión de E-cadherina y ß-catenina en las tres líneas celulares.

El solicitante considera que una reducción en la metástasis mediante las formulaciones de pro-enzima de serina proteasa se eleva a través de la sobre-regulación de la expresión y formación de complejos E-caderina/3-catenina, que están involucradas en la adhesión célula-a-célula. El corolario de la incrementada adhesión célula-a-célula es una reducción en la metástasis debido a que las células malignas tienen menor probabilidad de dispersarse o escapar desde el tumor primario.

Con la disponibilidad de esta nueva información, los inventores de la presente investigaron formulaciones que comprenden una pro-enzima de proteasa en combinación con uno o más agente activos que son capaces de proporcionar una interrelación funcional en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el agente activo puede proporcionar una actividad mejorada de tratamiento del cáncer a la pro-enzima sola mediante la operación de una función diferente de la célula tumoral con respecto a la expresión de E-cadherina y ß-catenina, cuando el resultado general es proporcionar un tratamiento mejorado, que puede incluir una reducción en la metástasis y/o un incremento en la apoptosis, inmunoreconocimiento o diferenciación de la célula tumoral. Dicho de otra manera, las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos proporcionan una pro-enzima de proteasa en combinación con un agente activo, la combinación que permite un enfoque multi-celular o multi-funcional para atacar o tratar una célula o células cancerígenas. Por ejemplo, las pro-enzimas son activadas en o cerca de la superficie de la célula tumoral para promover la expresión de moléculas de adhesión célula-a-célula y de este modo reducen la metástasis, en tanto que un agente activo separado, tal como metilselenocisteina, pueden operar en un nivel intracelular para ayudar con la reducción en la metástasis, diferenciación o muerte de la célula tumoral (por ejemplo necrosis, apoptosis, inmunoreconocimiento).

Pro-enzimas de Proteasa Una pro-enzima (conocida también como zimógeno) es una forma precursora de una enzima que no tiene la actividad específica de la enzima, y por tanto es referida de manera común como una forma inactiva de la enzima. Las pro-enzimas son mantenidas en su estado inactivo hasta que son requeridas de modo que se previenen o se reducen los efectos no específicos de la actividad enzimática en sitios indeseables. Las pro-enzimas pueden ser activadas en enzimas activas correspondientes por medio de otras enzimas lo que resulta en una cascada de activación, la cual incluye la acción de múltiples enzimas y la auto-activación. Se considera que las pro-enzimas son activadas de manera selectiva por las células cancerígenas, que a su vez son sometidas a proteólisis mediante la enzima activa.

El término "pro-enzima de proteasa" como se usa en la presente representa una forma precursora de una enzima de proteasa que puede ser activada in situ dentro de la enzima de proteasa activa. Las pro-enzimas de proteasa pueden ser originales de ser humano o animal. La enzima de proteasa puede actuar para proporcionar uno o más efectos celulares que incluyen proteólisis, sobre-regulación de la expresión de E-cadherina y/o ß-catenina, apoptosis, inmunoreconocimiento mejorado, y diferenciación de célula tumoral. Las enzimas de proteasa incluyen serina proteasas, treonina proteasas, cisteina proteasas, aspartato proteasas, metaloproteasas, o proteasas de ácido glutámico. Las proteasas pueden ser endopeptidasas o exopeptidasas. Las endopeptidasas (o endoproteinasa) son peptidasas proteolíticas que rompen los enlaces de péptido de aminoácidos no-terminales (es decir dentro de la molécula), en contraste con las exopeptidasas, las cuales rompen los enlaces de péptido en los extremos de la molécula.

En una modalidad, la pro-enzima de proteasa es un precursor de una enzima a partir de peptidasas de clase de enzima 3.4, en particular serina endopeptidasas de clase de enzima 3.4.21 , y de modo más particular quimotripsina de la clase de enzima 3.4.21 .1 , quimo tripsina C de la clase de enzima 3.4.21.2 o tripsina de la clase de enzima 3.4.21.4 (clases agrupadas de acuerdo con la clasificación del Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology).

En una modalidad, la pro-enzima de proteasa es una pro-enzima de serina proteasa. La(s) enzima(s) de serina proteasa incluye(n) formas tipo tripsina o quimotripsina, tipo subtilisina, alfa/beta hidrolasa, y peptidasas de señal. Las serina proteasas pueden incluir las siguientes serina endopeptidasas: quimotripsina, metridina, tripsina, trombina, factor de coagulación Xa, plasmina, enteropeptidasa, acrosina, a-Litic endopeptidasa, glutamil endopeptidasa, catepsina G, factor de coagulación Vila, factor de coagulación IXa, cucumisina, prolil oligopeptidasa, factor de coagulación Xia, braquiurano, calicreína de plasma, calicreína de tejido, elastasa pancreática, elastasa de leucocito, factor de coagulación Xlla, Quimasa, complemento activado CIr, complemento activado CIs, trayectoria-complemento-clásica C3/C5 convertasa, factor de complemento I, factor de complemento D, trayectoria-complemento-alternativa C3/C5 convertasa, cerevisina, hipodermina C, lisil endopeptidasa, endopeptidasa La, ?-renina, venombina AB, leucil endopeptidasa, triptasa, escutelarina, kexina, subtilisina, orizina, peptidasa K, termomicolina, termitasa, endopeptidasa So, activador t-plasminógeno, proteína C (activada), endopeptidasa pancreática E, elastasa pancreática II, serina endopeptidasa IgA-específica, activador u-plasminógeno, venombina A, furina, mieloblastina, semenogelasa, granzima A, granzima B, estreptogrisina A, estreptogrisina B, glutamil endopeptidasa II, oligopeptidasa B, factor de coagulación Limulus C, factor de coagulación Limulus B, enzima de coagulación Limulus, represor LexA, peptidasa de señal I, togavirina, fiavivirina, endopeptidasa Clp, proproteína convertasa 1 , proproteina convertasa 2, activador de factor de veneno de serpiente V, lactocepina, ensamble, hepacivirina, espermosina, sedolisina, xantomonalisina, peptidasa de procesamiento C- terminal, pisarolisina, serina proteasa-2 lectina-asociada de enlace a mañano, proteasa romboide, hepsina, peptidasa Do, HtrA2 peptidasa, matriptasa, C5a peptidasa, acualisina 1 , proteasa de sitio-1 , poliproteína peptidasa de pestivirus NS3, serina peptidasa de arterivirus equino, peptidasa Vp4 de birnavirus de necrosis pancreática infecciosa, SpolVB peptidasa, enzima quimotríptica de estrato córneo, calicreína 8, calicreína 13, oviductina.

En una modalidad particular, la pro-enzima de serina proteasa es tripsinógeno, quimotripsinógeno o una mezcla de los mismos. Las pro-enzimas tripsinógeno y quimotripsinógeno pueden ser precursores de las enzimas seleccionadas a partir de las clases quimotripsina 3.4.21 .1 o 3.4.21.2 o tripsina a partir de las clases 3.4.21.4, o seleccionadas a partir de cualquier otra fuente adecuada. Estas enzimas están comercialmente disponibles y pueden ser de origen bovino o porcino.

El quimotripsinógeno es una forma de pro-enzima de la enzima quimotripsina, la cual, de manera preferible, divide las proteínas en los siguientes amino ácidos: tirosina, triptofano, fenilalanina y leucina. La quimotripsina puede referirse a o incluir quimotripsina A, quimotripsina B (que incluye formas Bl y B2), quimotripsina C, a-quimaroft, avazima, quimar, quimotest, enzeon, quimar, quimotrasa, a-quimar, a-quimotripsina A, a-quimotripsina. La quimotripsina C se puede formar a partir de quimotripsinógeno C de cerdo o a partir de subunidad II de ganado vacuno de procarboxipeptidasa A, y de preferencia divide proteínas en los siguientes aminoácidos: tirosina, triptofano, fenilalanina, leucina, metionina, glutamina, y asparagina. El quimotripsinógeno incluye quimotripsinógeno Bl y quimotripsinógeno B2.

El tripsinógeno es una forma de pro-enzima de tripsina, la cual de preferencia divide las proteínas en arginina y licina. La tripsina puede referirse a o incluir a-tripsina, ß-tripsina, cocoonasa, parenzima, parenzimol, triptar, tripura, pseudotripsina, triptasa, tripcelim, hidrolasa ß-tripsina receptora de esperma que se puede formar a partir de tripsinógeno mediante división de un enlace péptido. Las divisiones adicionales del enlace de péptido producen formas a y otras iso-formas. Se pueden aislar múltiples tripsinas catiónicas y aniónicas a partir del páncreas de muchos vertebrados y a partir de especies inferiores que incluyen cangrejo, insectos (cocoonasa) y microrganismos {Streptomyces griseus). En los procesos normales durante la digestión, el tripsinógeno inactive es activado por la enteropeptidasa presente en la mucosa intestinal para formar la enzima tripsina, la cual es una serina proteasa que actúa para dividir los enlaces de péptido en el lado carboxilo de amino ácidos básicos/proteínas.

Como se mencionó, la forma de pro-enzima proporciona esencialmente la forma inactivada de la enzima que es activada in situ (por ejemplo activación in vivo o in vitro). Por ejemplo, la activación de la pro-enzima (conversión de pro-enzima a enzima activa) puede ocurrir en contacto con la superficie de la célula tumoral. Se considera que las pro-enzimas tripsinógeno y quimotripsinógeno son activadas de manera selectiva dentro de las enzimas tripsina y quimotripsina en contacto con las células tumorales y no en contacto con las células saludables. El uso de pro-enzimas reduce los problemas asociados con el suministro, in situ, de una enzima activa, tales como las reacciones indeseables o desactivación de la enzima antes de llegar a un objetivo pretendido de una célula tumoral.

En relación con las células tumorales, las enzimas de proteasa pueden actuar para romper la pared celular de las células malignas al dividir los enlaces amida presentes en las cadenas de péptido de las paredes celulares (proteólisis). Se comprende también que los inhibidores de proteasa, los cuales están presentes en las células no malignas e inhiben o reducen el efecto de las enzimas en la ruptura de las paredes celulares, no aparecen en las células tumorales malignas. Además de proporcionar la actividad proteolítica, las pro-enzimas de proteasa pueden sobre-regular la expresión de ß-catenina y E-cadherina en células tumorales. Se facilita la adhesión célula-a-célula mediante la formación de complejo o enlace entre ß-catenina y E-cadherina en la superficie celular, y por lo tanto la expresión incrementada de ß-catenina y E-cadherina conduce a la adhesión célula-a-célula mejorada y de este modo se reduce la metástasis de las células tumorales. Las pro-enzimas de proteasa pueden proporcionar también otra actividad celular tal como inmunoreconocimiento o diferenciación incrementados.

Agentes activos Los agentes activos del primer aspecto, segundo aspecto, décimo segundo aspecto y décimo tercer aspecto, son para tratar el cáncer o inducir actividad intracelular para mejorar el tratamiento de una célula tumoral.

En una modalidad, la actividad intracelular es apoptosis, necrosis, inmunoreconocimiento o diferenciación de célula tumoral.

En relación con el enfoque multi-funcional, en una modalidad los agentes activos son capaces de proporcionar una interrelación funcional con las pro-enzimas de proteasa en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el agente activo puede proporcionar actividad de tratamiento de cáncer mejorada que puede o no estar relacionada con la expresión de E-cadherina y ß-catenina, aunque el resultado general es proporcionar un tratamiento mejorado, tal como una reducción en la metástasis y/o un incremento en la apoptosis, inmunoreconocimiento o diferenciación de la célula tumoral. El agente activo puede operar en un nivel intracelular para ayudar con la reducción de la metástasis, diferenciación o muerte de la célula tumoral (por ejemplo, necrosis, apoptosis, inmunoreconocimiento).

En una modalidad, el agente activo se selecciona a partir de por lo menos uno del grupo que comprende un compuesto de selenio, a compuesto vainilloide y un agente reductor de glicólisis citoplásmica, y de modo opcional una glucósido hidrolasa.

Por ejemplo, el agente activo puede consistir en un compuesto de selenio, o puede ser una combinación de agentes activos que constan de un compuesto de selenio, a compuesto vainilloide, una glucósido hidrolasa, y un agente reductor de glicólisis citoplásmica.

Compuesto de Selenio En una modalidad, el término "compuesto de selenio" representa cualquier compuesto que contiene selenio que es capaz de proporcionar una fuente biodisponible de selenio. El compuesto de selenio puede incluir compuestos inorgánicos, tales como minerales que contienen selenitas y seleniatos, y compuestos orgánicos, tales como metilselenocisteina. El compuesto de selenio puede ser proporcionado como un extracto vegetal o a partir de una síntesis comercial. En una modalidad particular, el compuesto de selenio proporciona una fuente biodisponible de selenio que puede ser fácilmente absorbido por el cuerpo dentro del plasma sanguíneo o fluidos inter-celulares.

En una modalidad, el término "compuesto de selenio" representa un aminoácido que contiene un compuesto de selenio divalente o tetravalente. El aminoácido puede ser seleccionado a partir de isoleucina, alanina leucina, asparagina, lisina, aspartato, metionina, cisteina, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptofano, glicina, valina, prolina, serina, tirosina, arginina, histidina. El selenio divalente o tetravalente puede estar presente también en el aminoácido en remplazo al azufre u otras especies divalentes que pueden presentarse de manera natural en estos aminoácidos.

En una modalidad, el término "compuesto de selenio" representa un compuesto que contiene un compuesto de selenio divalente de la fórmula I o compuesto de selenio tetravalente de la fórmula II: Fórmula I Fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde: R, y R3 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, OH, -C(0)H, -C(0)OH, -C(0)-OR5, C1-4alquilo y C2.6alquenilo, en donde C1-4alquilo y C2. 6alquenilo son opcionalmente sustituidos con 0-3 sustituyentes seleccionados de manera independiente a partir de halógeno, OH, -NH2, -C(0)OH, -C(0)-ORs; R2 y R4 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, OH, -C(0)H, -C(0)OH, -C(0)-OR5, CL^alquilo y C2-i2alquenilo, en donde Ci-i2alquilo y C2.i2alquenilo son interrumpidos de modo opcional con uno o más grupos seleccionados a partir de -NH-, -N^alquilo)-, -NH(CO)-, -C(O)-, -C(0)0-, -O- y -C( H2)H-C(0)0, y opcionalmente sustituidos con 0-3 sustituyentes seleccionados de manera independiente a partir de halógeno, -NH2, -OH, -C^alquilo, -C(0)OH, -C(0)H, -C(0)-OR5, -N(Ci. 4alquilo)H, -N(C . alquilo)2, -C(H2)H-C(0)OH, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo; y en donde R5 es seleccionado a partir de alquilo, alquenilo, cicloalquilo y cicloalquenilo, en particular C ^alquilo.

En la modalidad anterior se apreciará que: d.4alquilo y d- i2alquilo representan una cadena alquilo recta, ramificada o cíclica, o combinación de las mismas; y C2-6alquenilo y C2-12alquenilo representan una cadena alquenilo recta, ramificada o cíclica, o combinación de las mismas.

En una modalidad particular, R, y R3 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, OH y d.4alquilo, y de modo más particular son metilo.

En otra modalidad particular, R2 y R4 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, OH y -C1.6alquilo-C(NH2)H-C(0)OH, y de modo más particular -C,.3alquilo-C( H2)H-C(0)OH.

En otra modalidad, el compuesto de selenio es seleccionado a partir de metilselenocisteina, metilselenol y ácido metilselenínico, o una sal farmacéuticamente aceptable o mezcla de los mismos. En una modalidad particular, el compuesto de selenio es metilselenocisteina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

Los compuestos de selenio son seleccionados para mejorar la eficacia del tratamiento de las pro-enzimas de proteasa al proporcionar una interrelación funcional o enfoque multifuncional para tratar el cáncer. Por ejemplo, el compuesto de selenio puede inducir actividad intracelular para mejorar el tratamiento de la célula tumoral por medio de la apoptosis, inmunoreconocimiento y/o diferenciación de célula tumoral.

Durante décadas se ha conocido una conexión entre la ingesta de selenio y el cáncer. El selenio es un mineral de traza esencial que tiene una Ración Alimenticia Recomendada (RDA, por sus siglas en inglés) de 55 microgramos. El selenio es esencial para activar varias enzimas clave, tales como la glutatión peroxidasa antioxidante, la enzima metabólica tioredoxina reductasa, y la enzima yodotironina desyodinasa de activación de hormona tiroidal. Se ha considerado que el selenio proporciona protección anticancerígena a través del mejoramiento de la actividad antioxidante celular y hepática (glutatión peroxidasa) o a través de la promoción de la remoción de sustancias carcinogénicas ambientales (glutatión S-transferasa). Las formas orgánicas de selenio, tales como selenometionina, pueden ser tóxicas en niveles de aproximadamente 3500 microgramos diarios, en tanto que las formas inorgánicas de selenio, como selenita/seleniato de sodio, pueden ser tóxicas a aproximadamente 1500 microgramos. El selenio es seguro en la dosificación a largo plazo aproximadamente en niveles de 400 meg/día, aunque los protocolos de tratamiento del cáncer pueden estar en rangos de aproximadamente 900 a 2,000 meg selenio al día.

Se ha demostrado que algunos efectos anticancerígenos del selenio se presentan en dosis cercanas a niveles de dosis potencialmente tóxicos, aunque las enzimas de selenioproteína comúnmente son saturadas (actividad incrementada al máximo) en ingestas dietéticas de tan sólo 90 meg de selenio por día, muy por debajo de las dosis anticancerígenas óptimas.

Las formas inorgánicas, tales como selenita/seleniato, han demostrado ser más efectivas en el tratamiento del cáncer que las formas orgánicas comunes, tales como selenometionina. Las formas de selenita/seleniato pueden ser metabolizadas para ácido selenhídrico, el cual es tóxico tanto para las células cancerígenas como para las células saludables y opera a través de un mecanismo menos selectivo y más invasivo de necrosis (en oposición a la apóptosis). La selenometionina es menos tóxica aunque se incorpora en gran medida dentro de las proteínas corporales generales que no tienen actividad anticancerígena.

La metilselenocisteina (conocida también como Se-metilselenocisteina) es un agente quimopreventivo que bloquea la progresión de ciclo celular y proliferación de lesiones mamarias pre-malignas, e induce apóptosis de líneas celulares de cáncer, con muy baja toxicidad y acumulación corporal. La metilselenocisteina se forma de manera natural en varias plantas, que incluyen el ajo, puerros silvestres, cebollas y brócoli cultivados en terreno con alto contenido de selenio, y los alimentos ricos en metilselenocisteina han mostrado una buena actividad anticancerígena, sin acumulación ni toxicidad tisular excesiva. La metilselenocisteina es convertida a metilselenol por medio de la enzima beta-Nasa. Con respecto a la actividad contra las células tumorales, se sabe que el metilselenol inhibe la angiogénesis y ocasiona la apóptosis aunque tiene baja toxicidad y es fácilmente eliminado del cuerpo.

Las siguientes estructuras químicas para varios compuestos de selenio son: Metilselenocisteina Selenometionina Acido Metilselénico (MSC) (Se eT) (MSeA) Selenita sódica Metilselenol Los compuestos de selenio de acuerdo con las modalidades anteriores pueden incluir todas las sales, hidratos, solvatos, formas de cristal, diastereómeros, isómeros de conformación (por ejemplo isómeros cis y trans), tautómeros, profármacos, metabolitos, y formas enantioméricas farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Compuesto Vainilloide En una modalidad, el término "compuesto vainilloide" representa cualquier compuesto que contiene una porción o "pharmacore" tipo vainillila o vainilloilo. Los compuestos vainilloides incluyen clases químicas conocidas de vainilloides que se presentan de manera natural tales como resiniferanoides, capsaicinoides, dialdehídos insaturados, y triprenil fenoles. Por ejemplo, los compuestos a partir de estas clases químicas conocidas incluyen resiniferatoxina, capsaicina, isoveleral, y escutigeral, respectivamente. Los ejemplos de otros compuestos vainilloides incluyen vainillina, ácido vainíllico, nonivamida, olvanila, dihidrocapsaicina y ácido vainillil mandélico. Los compuestos vainilloides pueden incluir compuestos de origen natural tales como capsaicina o vainilloides semi-sintéticos o sintéticos tales como capsazepina.

En otra modalidad, el término "compuesto vainilloide" representa compuesto de la fórmula general III: Formula III o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R1 y R2 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, OH, OCH3, C(0)H, OC2-6alquilo, OC2.alquenilo, SH, Sd.6alquilo, NH2, NHC^alquilo y (C1-6alquilo)2; R3 y R4 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, Ci.20alquilo, C2.20alquenilo y C2.20alquinilo, en donde el d^alquilo, C2.20alquenilo y C2. 20alquinilo, son interrumpidos de manera opcional con uno o más grupos seleccionados a partir de -NR6-, -NH(CO)-, -C(O)-, -C(0)0-, -O-, -C(NR6R6)H-C(0)0-, -C(S)-, -C(S)NR6- y -NR6-C(S)-NR6, y sustituidos de modo opcional con 0-3 sustituyentes seleccionados de manera independiente a partir de halógeno, -NH2> -OH, -Ci^alquilo, -C(0)OH, -C(0)OR5, -C(0)H, -N(d.4alquilo)H, -N(CMalquilo)2, -C(H2)H-C(0)OH, -C(S)-, cicloalquilo opcionalmente sustituido, cicloalquenilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido; y en donde R5 es seleccionado a partir de alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, en particular d.12alquilo; y R6 es seleccionado a partir de H, C1-6alquilo; y R3 y R4 se pueden unir para formar un anillo saturado o insaturado opcionalmente sustituido que tiene de 3 a 8 átomos de carbono en el anillo que incluye de 0 hasta 3 heteroátomos seleccionados a partir de O, S y N.

En la modalidad anterior se apreciará que: C2-6alquilo y C^oalquilo representan una cadena alquilo recta, ramificada o cíclica, o combinación de las mismas; C2.6alquenilo y C2-2oalquenilo representan una cadena alquenilo recta, ramificada o cíclica, o combinación de las mismas; C2.20alquinilo representa una cadena alquinilo recta, ramificada o cíclica, o combinación de las mismas; Cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquilcicloalquenilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido representan la sustitución opcional con uno o más grupos seleccionados a partir de halógeno, -NH2, -OH, -Ci_4alquilo, -C(O), -C(0)OH, -C(0)OR5, -C(0)H, -N(C1.4alquilo)H, -N(C1.4alquilo)2, -C(H2)H-C(0)OH, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo, y por ejemplo incluiría resiniferatoxina.

En una modalidad particular, y R2 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de OH, C(0)H y OCH3, y de modo más particular OH y OCH3.

En otra modalidad particular, R3 es seleccionado a partir de— C1-4alquilo-NH-C(0)-CM2alquenilo, -C^alquilo-NH-CtOJ-C^.^alquilo, y de modo más particular -CH2-NH-C(0)-C4H8-CH=CH-CH(CH3)CH3. Se apreciará en esta modalidad que la cadena alquilo o alquenilo puede ser recta o ramificada.

En otra modalidad particular, R3 es seleccionado a partir de -Ci-4alqu¡lo-0-C^-C^.^alquenilo, -C^alquilo-O-C^-C ^alquilo, y de modo más particular -CH2-0-C(0)-C4H8-CH=CH-CH(CH3)CH3. Se apreciará en esta modalidad que la cadena alquilo o alquenilo puede ser recta o ramificada.

En otra modalidad particular, R4 es H.

El compuesto vainilloide puede ser seleccionado a partir de capsaicina, dihirdocapsaicina y nordihidrocapsaicina.

De preferencia, el compuesto vainilloide es seleccionado a partir de capsiato, dihidrocapsiato y nordihidrocapsiato. En una modalidad, el compuesto vainilloide es capsiato. El capsiato, dihidrocapsiato y nordihidrocapsiato, son proporcionados de preferencia en una forma que está sustancialmentre libre de capsaicinas, por ejemplo que tiene una pureza de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99.9%. Se apreciará que los capsiatos, los cuales son obtenidos de manera común como extractos a partir de chiles, contienen de modo usual pequeñas cantidades de capsaicinas y otros compuestos estructuralmente similares. Las capsaicinas pueden presentar una respuesta inflamatoria indeseable (mediante activación de gran liberación de histamina localizada), y por lo tanto pueden ser menos deseables tipos particulares de regímenes de administración para compuestos particulares, o para cantidades o purezas particulares de esos compuestos, que pueden ser adaptados para adecuarse a los requerimientos específicos. Una fuente de capsiato de alta pureza es proporcionada por pimientos "CH-19" suministrados por Ajinomoto Co.

En otra modalidad, el compuesto vainilloide es seleccionado a partir de 8-metil-N-vainillil-6-non-enamida; N-vainillilnonanamida; N-(9-decenil)-4-hidroxi-3-metoxi-fenilacetamida; N-(9Z-dodecenil)-4-hidroxi-3-metoxifenilacetamida; N-(9Z-tetradecenil)-4-hidroxi-3-metoxifenilacetamida; N-((4-hidroxi-3-metoxifenil)-metil)-9-decenamida; N-((4-hidroxi-3-metoxifenil)-metil)-9Z-dodecenamida; N-((4-hidroxi-3-metoxifenil)-metil)-9Z-tetradecenamida y N-((4-(3-fenil-2(S)-2-amino-1 -propoxiy)-3-metoxifenil)-metil)-nonanamida.

En otra modalidad, el compuesto vainilloide es capsazepina, a saber N-[2-(4-clorofenil)etil]-7,8-dihidroxi-l,3,4,5-tetrahidro-2-benzazepin-2-carbotiomida.

Un número de vainilloides, en especial la capsaicina, se enlazan al receptor tipo I vainilloide potencial transitorio (TRPV1 ), un canal de ion que responde de modo natural a estímulos nocivos tales como altas temperaturas y pH ácido. Otros vainilloides que actúan en TRPV1 incluyen resiniferatoxina y olvanila.

Los compuestos vainilloides incluyen capsaicina y capsiato, los cuales también son conocidos como un capsinoide. Los capsinoides, los cuales incluyen capsiato, dihidrocapsiato, y nordihidrocapsiato, son sustancias de presencia natural presentes en los chiles. Aunque son estructuralmente similares a la capsaicina, que es el compuesto que ocasiona el picor en los chiles serranos, los capsinoides carecen por mucho de esta característica y tienen un "umbral de sabor picante" estimado de aproximadamente 1 /1000th a aquel de la capsaicina.

La capsaicina es (E)-N-[(4-hidroxi-3-metoxifenil)metil]-8-metil-6- nonenamida, y análogos de la misma incluyen dihidrocapsaicina, la cual es un derivado 6,7-dihidro de la capsaicina. Como se mencionó con anterioridad, los capsinoides incluyen capsiato, es decir 4-hidroxi-3-metoxibencil (E)-8-metil-6-nonenoato, dihidrocapsiato, es decir 4-hidroxi-3-metoxibencil 8-metilnonanoato, y nordihidrocapsiato, es decir 4-hidrox¡-3- metoxibencil 7-metiloctanoato. La estructura química de algunos de estos compuestos es como sigue: Capsaicina Los capsiatos pueden proporcionar apoptosis e incidencia de tumor reducida. Se considera que los capsiatos inducen apoptosis al afectar el estado redox de las células a través de la mitocondria celular.

Los compuestos vainilloides son seleccionados para mejorar la eficiencia del tratamiento de las pro-enzimas de proteasa al proporcionar una interrelación funcional o enfoque multifuncional para tratar el cáncer. Por ejemplo, el compuesto vainilloide puede inducir actividad intracelular para mejorar el tratamiento de la célula tumoral por medio de la apoptosis, inmunoreconocimiento y/o diferenciación de célula tumoral.

Las siguientes estructuras químicas para vainillina, ácido vainíllico y resiniferatoxina son: Vainillina Ácido vainíllico Resiniferatoxina Los compuestos vainilloides de acuerdo con las modalidades anteriores pueden incluir todas las sales, hidratos, solvatos, formas de cristal, diastereómeros, isómeros de conformación (por ejemplo isómeros cis y trans), tautómeros, profármacos, metabolitos, y formas enantioméricas farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Glucósido hidrolasa En una modalidad, el término "glucósido hidrolasa" representa cualquier enzima que puede hidrolizar el enlace glicosídico entre dos o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y una porción no-carbohidrato. La glucósido hidrolasa puede ser una enzima a partir de la clase 3.2.1 , en particular una enzima a partir de las clases 3.2.1.1 a 3.2.1.3. En una modalidad, la glucósido hidrolasa es una amilasa. La amilasa puede ser seleccionada a partir de a-amilasa, ß-amilasa y ?-amilasa, de modo más particular amilasa 2, amilasa alfa 1 A, amilasa alfa 1 B, amilasa alfa 1 C, amilasa alfa 2A, amilasa alfa 2B. En una modalidad, la amilasa es a-amilasa.

Las amilasas son glucósido hidrolasas y actúan sobre enlaces a-I, 4-glicosídicos. Las amilasas separan los carbohidratos presentes en las glicoproteínas de superficie de las células tumorales. La amilasa es seleccionada para mejorar la eficacia del tratamiento de las pro-enzimas de proteasa al proporcionar una interrelación funcional o enfoque multifuncional para tratar el cáncer. La amilasa puede ser de origen humano, animal, bacterial o vegetal. Por ejemplo, a-Amilasa puede ser suministrada a partir de Aspergillus oryzae, Bacillus licheniformis, malta de cebada, páncreas de cerdo, páncreas humano, páncreas porcino, y Tríticum aestivum.

Agente reductor de glicólisis citoplásmica En una modalidad, el término "agente reductor de glicólisis citoplásmica" representa un agente capaz de reducir la glicólisis citoplásmica. En otra modalidad, el agente reductor de glicólisjs citoplásmica es 2-desoxi-D-glucosa, o una sal, éster, o profármaco farmacéuticamente aceptable de la misma.

El agente reductor de glicólisis citoplásmica es seleccionado para mejorar la eficacia de tratamiento de la pro-enzima de proteasas al proporcionar una interrelación funcional o enfoque multifuncional para tratar el cáncer.

El agente reductor de glicólisis citoplásmica puede ser un bloqueador o inhibidor de glicólisis, por ejemplo oxamato, que es más específico para metabolizar anaeróbicamente las células y puede inhibir la deshidrogenasa láctica, o yodoacetato, el cual puede inhibir la glicólisis en gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa.

Los inhibidores glicolíticos pueden incluir análogos lipof ílicos o profármacos of 2-desoxi-D-glucosa. Los análogos lipófílicos incluyen derivados de grupos hidroxilo como ésteres, éteres, fosfoésteres. Otros incluyen la remoción del grupo hidroxilo y remplazo con halógenos como flúor o yodo, o con grupos tiol o tioalquilo. Se pueden proporcionar la 2-desoxi-glucosa liposoma formulada y sus análogos o los derivados enzimáticamente separables de 2-desoxiglucosa. Los ejemplos incluyen glucoronidas con glicósidos en la posición C-1 . Los análogos lipófílicos de 2-desoxi-D-glucosa, que pueden actuar como profármacos de 2-desoxi-D-glucosa, tales como mono y diésteres de 2-desoxi-D-glucosa, pueden incluir ejemplos tales como valerato, miristato y palmitato.

Los inhibidores glicolíticos pueden incluir también 6-desoxi-D-glucosa, 6-fluoro-D-glucosa, 6-O-metil-D-glucosa, 6-tio-D-glucosa, 2-desoxi-D-glucosa y sus análogos, 2-desoxi-2-halo-D-glucosa, por ejemplo 2-bromo-, 2-fluoro- o 2-iodo-D-glucosa, 3-desoxi o 3-fluoro-D-glucosa o 4-desoxi o 4-fluoro-D-glucosa, 2-fluoro o 3-fluoro-gliceraldehídos o gliceratos, por ejemplo, 3-fluoro-2-fosfoglicerato, ácido 2-fluoro-propiónico o sus sales, ácido 2,2-difluoro-propiónico, 3-halo-piruvato, ácido 3-halopropiónico, ácido 2,2-tiometilacético, 1 -desoxi-D-glucosa, 5-tio-D-glucosa, 3-fluoro-D-glucosa y 4-fluoro-D-glucosa, 2-fluoro-, 2-yodo-, 2-tio, o 2-metoxi-gliceraldehídos o gliceratos, 3-fluoro-, 3,3-difluoro-, enolasa 3-iodo-, 3-carboxilo- y 3-tiogliceratos.

En una modalidad, el término "agente reductor de glicólisis citoplásmica" representa un compuesto de la Fórmula IV: Fórmula IV o una sal farmacéuticamente aceptable, profármaco o éster del mismo, en donde: X es seleccionado a partir de O y S; es seleccionado a partir de H, halógeno, OH, -OC(0)R6; R2 a R4 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, halógeno, OH, -OC(0)R6; R5 es seleccionado a partir de halógeno, OH, SH, -OC(0)R6; y R6 es Ci-2oalquilo.

Halógeno representa de preferencia F, Br o I, de mayor preferencia F. cada una de las diversas modalidades puede ser tomada de modo individual o en cualquier combinación de las mismas. X es O. Ri es OH. R2 es H o F. R3 es OH o F. R4 es OH o F. R5 es OH, F o SH.

En otra modalidad, X es O, R, es seleccionado a partir de OH, R2 es seleccionado a partir de H, Br, F, I, OH, -C(0)-OR6, en donde R6 es seleccionado a partir de (-^ lquilo, y R3 a R5 es OH. De preferencia, R2 es H.

Agente Activos Adicionales Las composiciones farmacéuticas del primer aspecto, segundo aspecto, décimo segundo y décimo tercer aspectos, pueden comprender además otros agentes activos. La adición de estos agentes activos puede mejorar el tratamiento del cáncer. Utilizando este enfoque, es posible lograr la eficacia terapéutica con menores dosis de cada agente, reduciendo por tanto el potencial de efectos secundarios. Es posible reducir los efectos secundarios indeseables y permitir el uso de mayores dosis de cada agente. Los agentes activos adicionales pueden proporcionar funciones terapéuticas complementarias, adicionales, o mejoradas.

Las composiciones farmacéuticas del primer aspecto, segundo aspecto, décimo segundo y décimo tercer aspectos, pueden contener por tanto uno o más de los siguientes agentes activos adicionales que proporcionan funciones terapéuticas complementarias, adicionales, o mejoradas: • Antioxidantes que incluyen vitamina C (ácido ascórbico), vitamina E (tocoferoles, tocotrienoles), antioxidantes polifenólicos (resveratrol, flavonoides), carotenoides (licopeno, carotenos, luteina). Resveratrol ha demostrado capacidad antitumoral y quimopreventiva, en particular trans-resveratrol para tratar células de cáncer mamario humano.

• L-treanina, a saber gamma-glutamiletilamida o 5-N-etil-glutamina, que es un análogo de ácido glutámico o derivado de amino ácido.

• Curcuminoides, curcumina o derivados de los mismos.

• Beta glucanos (1 -3, 1 -6 beta glucanos). • Ácido cianhídrico (HCN) - por ejemplo iones OSCN LPO generados pueden acelerar la proteólisis.

• Extractos de fitonutrientes que incluyen flavanoles, xantofilos, liminoides.

• Inhibidores de enzima de proteasa, por ejemplo aprotinina conocida también como inhibidor de tripsina pancreática bovina. El uso de inhibidores de enzima en combinación con las composiciones farmacéuticas puede facilitar la inhibición de cualesquiera enzimas de proteasa que pueden estar presentes en el sistema/cuerpo lejos de la célula tumoral y reduce de este modo cualesquiera efectos indeseables de esas enzimas activas.

• Factores de crecimiento (por ejemplo, BMPs, TGF-P, FGF, IGF).

• Citocinas (por ejemplo, interleucinas y CDFs).

• Antibióticos.

• Factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica de factor de crecimiento de fibroblasto ácido o básico (FGF, por sus siglas en inglés) o factor de crecimiento de hepatocito (HGF, por sus siglas en inglés), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes de factor de tejido, proteína C, o proteína S, un anticuerpo capaz de enlazarse al receptor HER2.

• Cualquier otro agente activo benéfico para tratar el cáncer.

Cuando se usen otros agentes terapéuticos adicionales en combinación con la pro-enzima de proteasa o agente activo del primero y segundo aspectos se pueden utilizar en cantidades como las que se mencionan en Physician Desk Reference (PDR) o según lo determine alguien con experiencia ordinaria en la técnica.

Términos La "Activación" en relación a las pro-enzimas de proteasa representa la conversión in situ (por ejemplo in vitro o in vivo) de la pro-enzima de proteasa en una forma capaz de mejorar la adhesión célula-a-célula de las células tumorales, efectuar la proteólisis de células tumorales, o inducir apoptosis, diferenciación o inmunoreconocimiento de célula tumoral.

La "Apoptosis" es un proceso cuidadoso, ordenado, generalmente controlado de auto-destrucción celular que puede ser activado por varios estímulos. La apoptosis es menos invasiva que la necrosis, la cual puede dañar el tejido circundante y ocasionar inflamación.

La "Angiogénesis" se refiere a la formación de vasos sanguíneos, en particular a la proliferación de nuevas capilaridades a partir de los vasos sanguíneos preexistentes. La angiogénesis es necesaria para que las células cancerígenas crezcan en tumores debido a que las células cancerígenas necesitan un suministro sanguíneo significativamente mayor que las células normales para sobrevivir. La angiogénesis o eventos angiogénicos están involucrados en un número de procesos patológicos, en especial el crecimiento tumoral y la metástasis, y otras condiciones en la cual se incrementa la proliferación de vasos sanguíneos, en especial del sistema microvascular, tal como la retinopatía diabética, psoriasis y artropatías.

El término "pericelular" representa en, cerca, sobre o dentro de los tejidos que circundan una célula. De modo más particular, el término representa en o dentro de los tejidos que circundan una célula tumoral.

El término "intracelular" representa dentro de la célula.

Los términos "diferenciación", "diferenciar" o variaciones similares de los mismos representan la capacidad de las células para hacerse más especializadas para diferentes funciones. En un nivel, las células tumorales malignas son consideradas como células que se han desdiferenciado, lo que significa que fueron células más especializadas que se han vuelto menos especializadas, y en el proceso, se ha comprometido la habilidad del cuerpo para limitar el crecimiento de estas células malignas. La diferenciación de células tumorales implica por lo tanto una transformación de las células malignas, por lo menos en parte, hacia un tipo celular saludable o normal, lo cual significa una transformación de la célula maligna de una manera que reduce las propiedades de crecimiento descontrolado, invasión y/o metástasis.

El término "inmunoreconocimiento" represente el reconocimiento por medio del sistema inmune y la subsecuente remoción o eliminación del sistema inmune. Un rol del sistema inmune es identificar y eliminar tumores. Las células transformadas de los tumores expresan antígenos que no se encuentran en las células normales. Para el sistema inmune, estos antígenos parecen extraños, y su presencia ocasiona que las células inmunes ataquen a las células tumorales transformadas. Algunas formas de células cancerígenas poseen también la capacidad de prevenir o reducir el inmunoreconocimiento.

El término "metástasis", " metastatizado" o variaciones similares de los mismos se refiere a la dispersión de una enfermedad desde un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo no adyacente. Las células tumorales malignas e infecciones tienen la capacidad de metastatizarse. Por ejemplo, las células cancerígenas pueden separarse o escapar desde un tumor primario, entrar a los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo, y volverse a depositar en cualquier parte en el cuerpo. Un nuevo tumor formado a partir de un tumor primario después de la metástasis es llamado tumor secundario o metastásico y está comprendido por las mismas células que el tumor primario u original. Por ejemplo, el cáncer de mama que se metastatiza hacia los pulmones forma un tumor secundario que comprende células de mama anormales, no células pulmonares anormales, y se llama cáncer de mama metastásico, no cáncer pulmonar.

El término "malignidad", "maligno" o variaciones similares de los mismos de refiere a la tendencia de las células cancerígenas y tumores para seguir creciendo y desarrollándose, lo que involucra propiedades características de anaplasia, invasividad, y metástasis. Por ejemplo, un tumor maligno puede ser comparado con un tumor benigno no canceroso en que una malignidad no está auto-limitada en su crecimiento, es capaz de invadir tejidos adyacentes, y puede ser capaz de dispersarse hacia tejidos distantes (metastatizarse), en tanto que un tumor benigno no tiene esas propiedades.

"Anaplasia" se refiere a una reversión de la diferenciación en las células, la cual es característica de los tumores malignos. Este término cubre una capacidad incrementada para multiplicación. La anaplasia involucre la falta de diferenciación, desdiferenciación incrementada o pérdida incrementada de la diferenciación estructural y funcional presente en las células normales.

La "proteólisis" es la degradación dirigida (digestión) de proteínas por medio de enzimas celulares llamadas proteasas o por medio de digestión intramolecular.

De modo más particular, la proteólisis es la ruptura de las proteínas mediante enzimas de proteasa que separan, a través de hidrólisis, el enlace amida/péptido en las proteínas.

Los términos "adhesión célula-a-célula", "moléculas de adhesión celular" o términos similares a los mismos se refieren a un rango de moléculas de adhesión célula-a-célula conocidas que están ubicadas de manera general en la superficie externa de una célula y están involucradas en el enlace de una célula con otra u otras células, E-cadherina y ß-catenina que son ejemplos de las mismas. Diferentes tipos de células pueden tener formas alternativas de estas moléculas. Estas moléculas pueden de modo adicional estar involucradas en la adhesión con la matriz extracelular. Otras moléculas de adhesión célula-a-célula pueden ser seleccionadas a partir de cadherina, integrina, selectina, y familias de proteína de adhesión celular de inmunoglubulina.

Los términos "homólogo" y "equivalente funcional" serán considerados para incluir otras proteínas o variantes tales como moléculas conocidas dentro de la misma familia de proteína, además de las moléculas recombinantes.

Mediante "sobre-regulación" se entenderá que esta incluye el incremento del nivel de expresión o actividad de la molécula en relación con un nivel de referencia pre-determinado. Este puede ser un incremento de por lo menos 5% por encima del nivel de referencia. Sin embargo, de particular preferencia, sería la sobre-regulación en por lo menos 10%, 20% 30%, 40% o 50% o más en relación con el nivel de referencia. El nivel de referencia se puede determinar a través de una variedad de medios, como de acuerdo a la expresión o actividad de la molécula antes del tratamiento, o de acuerdo con el nivel normal o esperado para un tipo de célula determinado.

Métodos v Usos El uso del quinto al novena aspectos o el décimo cuarto aspecto, o el método del décimo aspecto o el décimo quinto aspecto, pueden involucrar uno o más de los siguientes efectos: reducción en la recurrencia de tumores malignos, reducción en la metástasis de tumores malignos, reducción en el número o tamaño de los tumores, diferenciación de células tumorales, expresión de ß-catenina y E-cadherina en tumores malignos para facilitar la adhesión célula-a-célula y la reducción en la metástasis, reducción en la habilidad de las células tumorales para evitar el inmunoreconocimiento.

Una modalidad proporciona un método para diferenciar una célula cancerígena en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una pro-enzima de proteasa y un agente activo del primero y segundo aspectos durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para inducir la diferenciación en la célula cancerígena. El uso del quinto y sexto aspectos y el método del séptimo aspecto pueden involucrar la diferenciación de una célula cancerígena. En una modalidad particular, la diferenciación de células cancerígenas es la diferenciación de células de carcinoma de colon.

En una modalidad, el uso del quinto al novena aspectos o el décimo cuarto aspecto, o el método del décimo aspecto o décimo quinto aspecto, es benéfico cuando se usa para el tratamiento de cáncer metastásico. La metástasis es la etapa del cáncer en donde la enfermedad se extiende a otras partes del cuerpo. Por lo tanto, la prevención o retraso de la metástasis es de particular importancia ya que esta etapa está acompañada por una marcada reducción en el éxito de otros tratamientos y una reducción en la sobrevivencia del sujeto. En otra modalidad se proporciona un medio seguro y efectivo para prevenir, retrasar o de otro modo mejorar la metástasis cancerígena al sobre-regular las moléculas de adhesión célula-célula en una célula cancerígena a través de la administración al sujeto de una cantidad efectiva de una pro-enzima de proteasa y un agente activo del primero y segundo aspectos.

"Tratar" o "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde la intención es prevenir, mejorar, reducir o desacelerar (atenuar) el cáncer o la dispersión (metástasis) del mismo.

"Prevenir", "prevención", "preventivo" o "profiláctico" se refiere a impedir la ocurrencia, o bien dificultar, defender de, o proteger de la ocurrencia de una condición, enfermedad, padecimiento, o fenotipo, que incluye una anormalidad o síntoma. Un sujeto que necesita de la prevención puede estar propenso a desarrollar la condición.

El término "mejorar" o "mejora" se refiere a una disminución, reducción o eliminación de una condición, enfermedad, padecimiento o fenotipo, que incluye una anormalidad o síntoma. Un sujeto que necesita de tratamiento puede tener ya la condición, o puede estar propenso a tener la condición o puede ser alguien en quien se va a prevenir la condición.

El "sujeto" incluye a un mamífero. El mamífero puede ser un humano, o puede ser un animal doméstico, de zoológico o de compañía. En tanto que se considera de manera particular que los métodos de la invención son adecuados para el tratamiento médico de seres humanos, también son aplicables para tratamiento veterinario, que incluye tratamiento de animales de compañía como perros y gatos, y animales domésticos tales como caballos, ganado vacuno y ovejas, o animales de zoológico tales como félidos, cánidos, bóvidos, y ungulados. Un sujeto puede estar afectado por el cáncer u otro padecimiento, puede no estar afectado por el cáncer u otro padecimiento (es decir, libre de enfermedad detectable).

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una composición, o agente o compuesto en la composición, capaz de tratar, prevenir o mejorar el cáncer o la dispersión (metástasis) del mismo. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser determinada de manera empírica y de un modo rutinario en relación a tratar el cáncer, y resultará en una incrementada expectativa de vida.

El uso del quinto al noveno aspectos o décimo cuarto aspecto, o método del décimo aspecto o décimo quinto aspecto, pueden involucrar el tratamiento de neoplasmas y condiciones relacionadas, cánceres, tumores, condiciones malignas y metastásicas. Los tejidos y órganos asociados con los tumores sólidos y las metástasis que pueden ser tratados con una pro-enzima de proteasa y un agente activo del primero y segundo aspectos incluyen, aunque no se limitan a, tracto biliar, vejiga, sangre, cerebro, mamas, cérvix, colon, endometrio, esófagos, cabeza, cuello, riñon, laringe, hígado, pulmón, médula, melanina, ovarios, páncreas, próstata, recto, renal, retina, piel , estómago, testículos, tiroides, tracto urinario, y útero.

El uso del quinto al noveno aspectos o décimo cuarto aspecto, o método del décimo aspecto o décimo quinto aspecto, son particularmente adecuados para tratar los cánceres y carcinomas metastásicos de los siguientes tipos: cáncer pancreático, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer de próstata, cáncer de ovarios, cáncer estomacal, cáncer de mama, melanoma maligno o cáncer pulmonar.

El uso del quinto al noveno aspectos o décimo cuarto aspecto, o método del décimo aspecto o décimo quinto aspecto, pueden proporcionar un enfoque de efecto múltiple para tratar el cáncer, por ejemplo mediante el incremento de la apoptosis de células tumorales, adhesión célula-a-célula, diferenciación y inmunogenicidad (reconocimiento y remoción mediante el sistema inmune). Por lo tanto es benéfico conducir el tratamiento en ausencia de cualesquiera otros tratamientos que pueden suprimir o dañar al sistema inmune.

En una modalidad, el uso del quinto al noveno aspectos o décimo cuarto aspecto, o método del décimo aspecto o décimo quinto aspecto, involucran el tratamiento de sujetos que tienen bajos niveles de expresión de E-cadherina y ß-catenina. Se pueden identificar también grupos de pacientes adicionales que son particularmente adecuados para el tratamiento de acuerdo con el método o uso de los aspectos anteriores.

El uso del quinto al noveno aspectos o décimo cuarto aspecto, o método del décimo aspecto o décimo quinto aspecto, pueden ser complementados por medio de otros enfoques terapéuticos anti-cancerígenos convencionales dirigidos al tratamiento o prevención de padecimientos proliferativos (por ejemplo, tumor). Por ejemplo, dichos métodos pueden ser utilizados en la prevención profiláctica del cáncer, prevención de recurrencia del cáncer y metástasis después de la cirugía, y como un auxiliar de otra terapia convencional del cáncer.

Composiciones Farmacéuticas, Formulaciones v Vías de Administración Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, pueden ser formuladas, por ejemplo, a través del empleo de vehículos o diluyentes sólidos o líquidos convencionales, así como aditivos farmacéuticos de un tipo apropiado para el modo de administración deseado (por ejemplo, excipientes, aglutinantes, conservadores, estabilizadores, saborizantes, etcétera.) de acuerdo con técnicas como aquellas bien conocidas en el área de la formulación farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, pueden ser administradas a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, por vía oral, tal como en la forma de tabletas, cápsulas, gránulos o polvos; por vía sublingual; bucal; parenteral, mediante inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, o intracisternal o técnicas de infusión (por ejemplo, como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas inyectables estériles); por vía nasal mediante aspersión de inhalación; por vía tópica, tal como en la forma de una crema o ungüento; o por vía rectal en la forma de supositorios; en formulaciones de unidad de dosis que contienen vehículos o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables. Pueden, por ejemplo, ser administradas en una forma adecuada para liberación inmediata o liberación prolongada, por ejemplo, a través del uso de dispositivos tales como implantes subcutáneos, esferoides encapsulados o bombas osmóticas.

Además de los primates, tales como los seres humanos, una variedad de otros mamíferos pueden ser tratados de acuerdo con los métodos del décimo aspecto.

Por ejemplo, los mamíferos que pueden ser tratados incluyen, aunque no se limitan a, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayos, ratas u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, de roedores o murinos.

El término "composición" como se usa en la presente está destinada a comprender un producto que contiene la pro-enzima de proteasa y uno o más agentes activos, y de manera opcional uno o más agentes activos adicionales, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente de los mismos.

El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente significa que el vehículo, diluyente o excipiente no es nocivo para el receptor del mismo.

Se entenderá que los términos "administración de" y/o "administrar" representan proporcionar a un individuo que necesita de tratamiento.

Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, y preparaciones o formulaciones de las mismas se pueden preparar al mezclar juntos los componentes de la composición, es decir las pro-enzimas de proteasa con uno o más agentes activos, los cuales incluyen un compuesto de selenio y/o un compuesto vainilloide. En una modalidad adicional, los componentes pueden incluir un agente activo adicional como se describe en la presente. El mezclado se puede efectuar de manera secuencial o simultánea.

Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, pueden ser presentadas convenientemente en forma de unidad de dosis y se pueden preparar a través de cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los métodos incluyen la etapa de llevar el agente activos y la pro-enzima de proteasa en asociación con el vehículo que constituye uno o más de los ingredientes adicionales. En general, las composiciones farmacéuticas son preparadas al llevar de manera uniforme y estrecha los agentes activos y las pro-enzimas de proteasa en asociación con un vehículo líquido o un vehículo sólido finamente dividido o ambos, y después, si es necesario, formar el producto en la formulación deseada. Los agentes activos y las pro-enzimas de proteasa se proporcionan en una forma de unidad de dosis en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado durante el proceso o condición de las enfermedades después de administración individual o repetida.

Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como tabletas, pastillas, comprimidos, suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersables o granulos, emulsiones, cápsulas duras o suaves, o jarabes o elíxires. Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para ala elaboración de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados a partir del grupo que comprende agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservadores a fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y apetecibles. Las tabletas contienen la proenzima de proteasa y el agente activo del primero y segundo aspectos en mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la elaboración de tabletas. Estos excipientes pueden ser por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulación y de desintegración, por ejemplo, almidón de maíz, o ácido algínico; agentes de enlace, por ejemplo almidón, gelatina o acacia, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden estar o no recubiertas a través de técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionar de este modo una acción sostenida durante un período prolongado. Por ejemplo, se puede emplear un material de retraso tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También pueden ser recubiertas para formar tabletas terapéuticas osmóticas para liberación controlada.

Las formulaciones para uso oral también pueden ser presentadas como cápsulas de gelatina dura en donde la pro-enzima de proteasa y el agente activo del primero y segundo aspectos se mezclan con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina suave en donde la pro-enzima de proteasa y el agente activo del primero y segundo aspectos se mezclan con agua o con un medio de aceite, por ejemplo aceited e cacahuate, parafina líquida, o aceite de olivo.

Las suspensiones acuosas contienen el agente activo y la pro-enzima de proteasa en mezcla con excipientes adecuados para la elaboración de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxi-propilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinil-pirrolidona, goma de tragacanto y goma acacia; los agentes de dispersión o de humectación pueden ser una fosfatida de presencia natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados a partir de pacidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados a partir de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilen sorbitan. Las suspensiones acuosas pueden contener también uno o más conservadores, por ejemplo etil, o n-propil, p-hidroxibenzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas se pueden formular al suspender el agente activo y la pro-enzima de proteasa en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de maní, aceite de olivo, aceite de ajonjolí o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina endurecida o alcohol cetílico. Los agentes edulcorantes como aquellos establecidos con anterioridad, y los agentes saborizantes pueden ser agregados a fin de proporcionar una preparación oral apetecible. Estos pueden ser conservados mediante la adición de un anti-oxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos y granulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan la pro-enzima de proteasa y el agente activo del primero y segundo aspectos en mezcla con un agente de dispersión o de humectación, agente de suspensión y uno o más conservadores. Los agentes de dispersión o de humectación adecuados y agentes de suspensión están ejemplificados por aquellos ya mencionados con anterioridad. Excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes, también pueden estar presentes.

Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, también pueden estar en la forma de emulsiones aceite-en-agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo aceite de olivo o aceite de maní, o un aceite mineral, por ejemplo parafina o mezclas de estos. Los agentes de emulsificación adecuados pueden ser gomas de presencia natural, por ejemplo goma acacia o goma de tragacanto, fosfatidas de presencia natural, por ejemplo frijol de soya, lecitina, y ésteres o ásteres parciales derivados a partir de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitan, y productos de condensación de los ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxi etilen sorbitan. Las emulsiones pueden contener también agentes edulcorantes y saborizantes.

Los jarabes y elíxires adecuados se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilen glicol, sorbitol o sacarosa. Pueden contener también un emoliente, un conservador y agentes saborizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, pueden estar en la forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede ser formulada de acuerdo con la técnica conocida utilizando aquellos agentes de dispersión o humectación y agentes de suspensión apropiados que se han mencionado con anterioridad. Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos pueden ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente-aceptable no tóxico, por ejemplo como una solución en 1 ,3-butan diol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están el agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijos estériles son empleados de manera convencional como solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo no irritante que incluye mono- o diglicérídos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico tienen uso en la preparación de compuestos inyectables.

En una modalidad particular, las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, son formuladas como supositorios para administración rectal del fármaco. Estas formulaciones se pueden preparar al mezclar la pro-enzima de proteasa y el agente activo del primero y segundo aspectos con un excipiente no irritante adecuado el cual es sólido a temperaturas ordinarias aunque es líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca de cacao y polietilen glicoles. La administración rectal puede ser utilizada para eliminar el efecto de primer paso entero-hepático en el tracto gastro-intestinal relacionado con la administración oral de las enzimas.

Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, también pueden ser formuladas en liposomas. Como se sabe en la técnica, los liposomas por lo general son derivados a partir de fosfolípidos u otras sustancias de lípido. Los liposomas están formados por cristales líquidos hidratados mono- o multilamelares que son dispersados en medio un medio acuoso. Se puede utilizar cualquier lípido no-tóxico, fisiológicamente aceptable y metabolisable capaz de formar liposomas. La formulación de liposoma puede contener estabilizadores, conservadores, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y fosfatidil colinas, tanto naturales como sintéticos. Los métodos para formar liposomas son conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, pueden estar incluidas en un recipiente, paquete o surtidor junto con instrucciones para administración. Las pro-enzimas de proteasa y los agentes activos, y de manera opcional agente activo adicional, de la composición farmacéutica se pueden proporcionar como componentes separados en el recipiente, paquete o surtidor, para ser tomados por separado o en conjunto al mismo tiempo o en diferentes momentos en el uso del quinto al noveno aspectos o el método del décimo aspecto.

Dosificaciones y Cantidades Terapéuticamente Efectivas Un nivelo de dosificación apropiado para las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos, o décimo segundo o décimo tercer aspectos, será por lo general de aproximadamente 0.01 a 500 mg por kg del peso corporal del paciente por día que se puede administrar en una dosis individual o en múltiples dosis. Puede ser de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 250 mg/kg por día; o aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 100 mg/kg por día. Un nivel de dosificación adecuado puede ser de aproximadamente 0.01 hasta 250 mg/kg por día, aproximadamente 0.05 hasta 100 mg/kg por día, o aproximadamente 0.1 hasta 50 mg/kg por día. Dentro de este rango la dosificación puede ser 0.05-0.5, 0.5-5 o 5-50 mg/kg por día. Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas del primero y segundo aspectos se pueden suministrar en la forma de tabletas que contienen 1 .0?1 -000 miligramos de la pro-enzima de proteasa y el agente activo, en particular 1.0, 5.0, 10.0, 15.0. 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 750.0, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, y 4000 miligramos de la pro-enzima de proteasa y el agente activo para el ajuste sintomático de la dosificación para el paciente al que se trata. Las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente pueden ser administradas en un régimen de 1 a 4 veces por día, una o dos veces por día, o una vez al día, con requerimientos reducidos de administración que conducen de modo general a un mayor cumplimiento.

La dosificación puede variar ampliamente dependiendo de si se suministra una sola forma de administración de la composición y si el compuesto vainilloide está incluido como un agente activo en la composición o tableta (u otra forma de administración). De manera común, los compuestos vainilloides tales como un capsiato o capsaicina pueden ser suministrados en dosificaciones relativamente grandes de entre 0.1 hasta 5g, y de modo más particular aproximadamente l-2g por administración.

Una administración individual adecuada para una modalidad de las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente puede comprender: ••Tripsinógeno en una cantidad de entre 1 -100 mg, en particular 2-50 mg, de modo más particular (en mg) 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0. 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0; • Quimotripsinógeno en una cantidad de entre 1 -100 mg, en particular 2-50 mg, de modo más particular (en mg) 1 .0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0. 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0; • Compuesto de selenio en una cantidad de entre 0.01 -3 mg, en particular 0.1 -1 mg, de modo más particular (en mg) 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 1.0; • Compuesto vainilloide en una cantidad de entre 0.1 -4000 mg, en particular 0.5- 3000 mg, de modo más particular (en mg) 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000; • Amilasa en una cantidad de entre 0.1 -100 mg, en particular 1 -15 mg, de modo más particular 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0; • 2-Desoxi-D-glucosa en. una cantidad de entre 0.1 -100 mg, en particular 1 -15 mg, de modo más particular 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0.

Sin embargo, se comprenderá que el nivel de dosificación específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente particular se puede variar y dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y duración de acción de ese compuesto, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármaco, la severidad de la condición particular y la terapia que experimenta el huésped.

Los niveles de dosificación adecuados para los diversos componentes (si están presentes) de una modalidad de las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente, pueden comprender: • Quimotripsinógeno en una cantidad de por lo menos 0.2 mg/kg, o en un rango de 0.2-5 mg/kg, en un rango de 0.5-2.0 mg/kg, o aproximadamente 0.8 mg/kg; · Tripsinógeno en una cantidad menor a 0.5 mg/kg, o en un rango de 0.01 - 0.4 mg/kg, o en un rango de 0.05-0.20 mg/kg, o aproximadamente 0.1 mg/kg; • Metilselenocisteina en una cantidad de por lo menos 0.0001 mg/kg, o en un rango de 0.001 -0.01 mg/kg, en un rango de 0.002-0.005 mg/kg, o aproximadamente 0.003 mg/kg; · Capsiato en una cantidad de por lo menos 1 mg/kg, o en un rango de 5- 500 mg/kg, o en un rango de 10-100 mg/kg, o aproximadamente 30 mg/kg; • Amilasa en una cantidad de por lo menos 0.001 mg/kg, o en un rango de 0.01 -0.1 mg/kg, en un rango de 0.02-0.05 mg/kg, o aproximadamente 0.03 mg/kg; • 2-Desoxi-D-glucosa en una cantidad de por lo menos 1 mg/kg, o en un rango de 5-500 mg/kg, o en un rango de 10-100 mg/kg, o aproximadamente 30 mg/kg.

Una adecuada relación de porcentaje en peso wt% para los diversos componentes (si están presentes) de una modalidad de las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente, puede comprender: Quimotripsinógeno:Tripsinógeno:Amilasa:2-Desoxiglucosa:Capsiato:Metilselenocisteina en una relación de 20(00:25-75:5-15:5,000- 20,000:5,000-20,000:0.1 -10, o aproximadamente 300:50: 10: 10,000: 10,000: 1.

Las concentraciones adecuadas para los diversos componentes (si están presentes) de las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente, que puede ser efectivas en particular si están presentes en o cerca de la superficie de una célula tumoral, pueden comprender: • Quimotripsinógeno en una concentración de por lo menos 0.5 mg/ml, o en un rango de 1 -2 mg/ml; • Tripsinógeno en una concentración menor a 0.25 mg/ml, o en un rango de 0.1 -0.2 mg/ml; • Amilasa en una concentración de por lo menos 0.01 mg/ml, o en un rango de 0.02-0.1 mg/ml; • Compuesto vainilloide en una concentración de por lo menos 5 mg/ml, o en un rango de 10- 20 mg/ml; • 2-Desoxi-D-glucosa en una concentración de por lo menos 5 mg/ml, o en un rango de 10-20 mg/ml; • Compuesto de selenio en una concentración menor a 0.01 mg/ml, o en un rango de 0.001 -0.005 mg/ml.

Se puede proporcionar actividad mejorada adicional para las composiciones farmacéuticas si la concentración, o cantidad relativa, del compuesto de selenio se mantiene dentro de un rango específico cuando está presente. La concentración de metilselenocisteina puede ser menor a 0.01 mg/ml, menor a 0.005 mg/ml, menor a 0.001 mg/ml, o menor a 0.0005 mg/ml, o en el rango de 0.0005 hasta 0.01 mg/ml, o en el rango de 0.001 hasta 0.005 mg/ml.

Formulación de Pro-enzima de Quimotriosinógeno/T ripsinógeno Se proporciona una composición farmacéutica que comprende una primera y una segunda pro-enzima de proteasa susceptible a activación en o cerca de una superficie de una célula tumoral para mejorar la adhesión célula-a-célula de las células tumorales, efectuar la proteólisis de células tumorales, o inducir apoptosis, diferenciación o inmunoreconocimiento de célula tumoral, en donde la primera pro-enzima de proteasa es quimotripsinógeno y la segunda pro-enzima de proteasa es tripsinógeno, y la relación en peso de qu¡motr¡psinógeno:tr¡ps¡nógeno está en el rango de entre 4:1 hasta 8:1. La composición farmacéutica puede comprender además uno o más agentes activos de acuerdo con cualquiera de las modalidades descritas con anterioridad.

En una modalidad, la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno está en el rango de entre 5:1 hasta 7:1 , de preferencia 6:1 .

Formulación de Agente Activo Se proporciona una composición farmacéutica que comprende un primer y segundo agente activo cada uno capaz de inducir actividad intracelular en células tumorales, en donde el primer agente activo es un compuesto de selenio y el segundo agente activo es un agente reductor de glicólisis citoplásmica.

En una modalidad, la actividad intracelular es célula tumoral apoptosis, inmunoreconocimiento o diferenciación. El compuesto de selenio y/o agente reductor de glicólisis citoplásmica representa un compuesto como se describió en las modalidades anteriores. De preferencia, el compuesto de selenio es metilselenocisteina. De modo preferente, el agente reductor de glicólisis citoplásmica es 2-Desoxi-D-glucosa.

La composición farmacéutica puede comprender además una pro-enzima de proteasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades antes descritas. La composición farmacéutica puede comprender además un agente activo seleccionado a partir de un compuesto vainiiioide y una glucósido hidrolasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades antes descritas.

Métodos de Tamizado e Identificación Una modalidad adicional proporciona un método para identificar un agente útil en la sobre-regulación de expresión de las moléculas de adhesión célula-célula de una célula(s) cancerígena(s), el método que comprende poner en contacto una célula cancerígena o moléculas de adhesión célula-célula de la célula cancerígena como una composición como la descrita hasta ahora, agregar un agente de prueba, monitorear o medir el nivel de adhesión célula-célula o expresión de las moléculas de adhesión célula-célula y evaluar el efecto del agente de prueba. El tamizado de biblioteca química de compuesto pequeño y cribado de exhibición de anticuerpo son ejemplos de fuentes disponibles de agentes de prueba que se pueden evaluar con facilidad utilizando este tipo de procedimiento. Por ejemplo, el Tamizado Químico de Alto Rendimiento (High Throughput Chemical Screening (HTS)) puede ser fácilmente utilizado para tamizar muchos miles de moléculas tales como agentes químicos o anticuerpos usando equipos robóticos y placas de microtitulación. Para desarrollar dicho tamiz es necesario proporcionar un tamizado adecuado para que sea ejecutado durante el tamiz. Esta prueba de tamizado incorporaría una molécula de adhesión célula-célula o una célula cancerígena tal como una célula cancerígena metastásica. La prueba incluiría células de referencia y de modo opcional ofrecería la comparación de la adición de compuestos de prueba, pro-enzimas y enzimas opcionales. De manera similar, las técnicas de exhibición de fago pueden ser utilizadas con facilidad para suministrar un método de alto rendimiento para la evaluación de agentes potenciales útiles en la sobre-regulación de expresión de moléculas de adhesión célula-célula de células cancerígenas.

Puntos Generales Cualquier descripción de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que han sido incluidos en la presente especificación es solamente para los fines de proporcionar un contexto para la presente invención. No se considerará como una admisión de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la base de técnica anterior o fueron un conocimiento general en el campo relevante para la presente invención como si existiese en Australia antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación están incorporadas a la presente mediante referencia.

Aquellos con experiencia en la técnica apreciarán que se pueden hacer numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se muestra en las modalidades específicas sin apartarse del espíritu o alcance de la invención como se describe ampliamente. Por lo tanto, las presentes modalidades serán consideradas en todos sentidos como ilustrativas y no como restrictivas.

Como se usan en la especificación las formas singulares "un" "una" y "el/la" incluyen las referencias al plural a menos de que el contexto determine claramente lo contrario. Por tanto, como ejemplo, la referencia a "un solvente" incluye mezclas de solventes, la referencia a "un agente" incluye mezclas de dos o más de dichos agentes, y similares.

En las reivindicaciones que siguen y en la descripción precedente de la invención, excepto cuando el contexto lo requiera de otro modo debido al lenguaje expreso o implicación necesaria, la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se usa en un sentido inclusivo, es decir para especificar la presencia de las características establecidas aunque no para impedir la presencia o adición de características adicionales en varias modalidades de la invención.

MATERIALES Y MÉTODOS A fin de que la naturaleza de la presente invención pueda ser comprendida más ampliamente, se describirán ahora formas preferidas de la invención mediante referencia a loa siguientes experimentos y ejemplos no-limitantes.

Experimento 1 : Identificación de Mecanismo de Acción de Proenzimas Se condujo una investigación de los efectos y mecanismos involucrados con el tratamiento de las líneas celulares cancerígenas con las composiciones farmacéuticas que comprenden tripsinógeno y quimotripsinógeno en tres distintos tipos de líneas celulares. Las líneas celulares utilizadas fueron Panel: una línea celular de carcinoma pancreático ductal humano, Caco2: una línea celular de adenocarcinoma de colon humano, y OE33: una línea celular de adenocarcinoma esofágico.

Todas las líneas celulares fueron mantenidas en matraces de cultivo T 75 a 37°C en una atmósfera humidificada que contiene 5% C02. Los medios utilizados para mantener las células en cultivo fueron: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) para PANC1 ; Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) para CaC02 y Medio RPMI 1640 para OE33 (Invitrogen, Merelbeke, Bélgica). Todos los medios fueron complementados con suero bovino fetal al 10% (FBS; Invitrogen), 100 lU/ml penicilina (Invitrogen), 100 pg/ml estreptomicina (Invitrogen) y 2 mML-Glutamina (Sigma).

Tripsinógeno (Try) y -quimotripsinógeno (Chy) se pueden adquirir con Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y originarse a partir de páncreas bovino. Las formulaciones fueron suministradas en solución salina regulada con fosfato (PBS, Sigma) y diluidas cuando fue necesario con suero bovino fetal al 10%.

Se preparó y probó un rango de formulaciones, y fueron codificadas de acuerdo con la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1: Códigos de Formulación Se prepararon varias para lograr una comprensión de la concentración de la formulación que afecta la viabilidad celular. En base a una concentración de inicio original de cada mezcla nominada como IX, seis diferentes diluciones de cada una de las formulaciones fueron enfriadas y conformadas como se muestra en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2: Concentraciones de Enzima Para obtener una correlación entre la densidad óptica y el número celular, se estableció un número celular conocido y después las células fueron fijadas, las células fueron teñidas con Sulforhodamina B (SRB). Este método produjo datos de absorbancia o densidad óptica de las células después de la tinción, y permitió el desarrollo de las curvas estándar para convertir la absorbancia en el número celular para cada tipo celular como se muestra en la Figura 1 .

Efecto de las formulaciones sobre las líneas celulares de prueba Para determinar el efecto citotóxico de las formulaciones sobre las líneas celulares de prueba, las células fueron colocadas en placas y tratadas con las formulaciones. El efecto fue determinado mediante prueba de proteína y microscopio.

Se utilizó la tinción de proteína SRB para probar el efecto de diferentes formulaciones sobre la proliferación celular. El tinte se enlaza a aminoácidos básicos de proteínas celulares y a través de evaluación colorimétrica proporciona una estimación de la masa de proteína total, la cual está relacionada con el número celular. Los valores de concentración inhibidora máxima media (IC50) se determinaron a partir de curvas de dosis-respuesta logarítmica-lineal para cada formulación.

Día 1 : Las células fueron cultivadas en platos de cultivo de 24 pozos a baja densidad (1000-3000 células por pozo dependiendo del tipo de célula). Las líneas celulares utilizadas fueron Panel: línea celular de carcinoma ductal pancreático humano, Caco2: línea celular de cáncer coiorectal, OE33: línea celular de cáncer esofágico y HEK293. HEK293 es una línea celular transformada derivada a partir de riñon embriónico humano. Se utiliza una placa de cultivo de 24 pozos para cada línea celular a fin de probar cada una de las diferentes formulaciones de combinación. Cada una de las diluciones de formulación fue probada en cuatro pozos. Se utilizó una placa de cultivo de 24 pozos de cada línea celular como control, se cultivó el mismo número de células y se cambió el medio según las células tratadas.

Día 2: Se retiró el medio y se agregó medio fresco que contiene las diferentes diluciones de las formulaciones a las células.

Día 5: El medio fue retirado de Nuevo y el medio fresco que contiene las diferentes diluciones de las formulaciones fue agregado a las células.

Día 6 o 7: Las células fueron fijadas con ácido tricloroacético (TCA) frío (4°C) al 10%.

Después de la aspiración moderada del medio, se agregó TCA a los pozos. Las placas se dejaron durante 30 minutos a 4°C, fueron lavadas 3 veces con agua desionizada y se dejaron secar a temperatura ambiente durante por lo menos 24 h.

Las células fijadas fueron teñidas con SRB como sigue: se agregó 1 mi de 0.4% SRB (w/v en solución de ácido acético al 1 %) a cada pozo y se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se removió SRB y las placas fueron lavadas 3 veces con ácido acético al 1 % antes de secar al aire. El SRB enlazado fue solubilizado con 500 mi de solución 10 mM Tris-base y las placas se dejaron en un agitador de placa durante por lo menos 10 minutos. 100 mi de cada pozo fueron transferidos a un pozo de una placa de 96-pozos, y esto se hizo 3 veces por cada pozo de la placa de 24-pozos. Se leyó la absorbancia en un lector de placa de 96-pozos a 492 nm.

Efecto de las formulaciones en la viabilidad de la Línea Celular de Cáncer Esofágico (OE33) Células OE33 fueron cultivadas a una densidad de 3000 células/ml (Día 1 ). Las células fueron tratadas con 0.25x; 0.5x; Ix; 1 .25x; 2.5x y 5x de las diferentes formulaciones en el Día 2 y el Día 5.

Las células fueron fijadas en el Día 7.

A nivel microscópico, el tratamiento con la formulación B ocasionó que las células exhibieran una morfología redonda, ocasionando también contracción celular y separación incrementada. Por tanto, después de 48 horas de incubación sólo unas cuantas células permanecieron fijadas y los desechos celulares y las células flotantes fueron visibles en el medio (Figura 2).

Los resultados observados mediante microscopio óptico fueron corroborados por medio de la prueba de tinción de proteína SRB. La Tabla 3 muestra el valor medio para 4 pozos replicados de cada tratamiento, el efecto de la muerte celular de la formulación B dependió de la concentración; 2.5x y 5x eliminó todas las células en los pozos. El valor IC50 se obtuvo mediante graficado de la absorbancia contra la concentración, como se muestra en la Figura 3.

El control, mostrado como la OD para la concentración 0, fue la media de 24 pozos replicados. En el momento de la fijación los 24 pozos de las placas de control fueron completamente confluentes.

Tabla 3: Efecto de diferentes concentraciones de formulación B sobre células OE33 Efecto de las formulaciones sobre células (Panel) de carcinoma ductal pancreático humano Se cultivaron células Panel a una densidad de 20,000 células/ml (día 1 ). Las células fueron tratadas con 0.25x; 0.5x; Ix; 1 .25x; 2.5x y 5x de las diferente formulaciones en el día 2 y el día 4. Las células fueron fijadas en el día 5. La formulación de control C en las concentraciones probadas no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad de las células Panel (datos no mostrados). A nivel microscópico, las formulaciones B, J y T mostraron un efecto sobre la viabilidad celular, las células tratadas con 2.5x y 5x de estas formulaciones se redondearon y murieron (datos nos mostrados).

Los resultados observados por medio de microscopía óptica fueron corroborados mediante la prueba de tinción de proteína SRB. La Tabla 4 muestra el valor medio para 4 pozos replicados de cada concentración de las formulaciones usadas. El efecto sobre la muerta celular de la formulación B, J y T dependió de la concentración; 2.5x y 5x que eliminan las células en los pozos como se muestra en la Figura 4. El valor de IC50 se obtuvo mediante graficado de la absorbancia contra la concentración como se muestra en la Figura 4. El control, mostrado como la OD para la concentración 0, fue la media de 24 pozos replicados.

Tabla 4: Efecto de las formulaciones B, J y T sobre las células Panel CONCENTRACION B J T OD OD OD 0 0.442 0.442 0.442 0.4 0.447 0.542 0.514 0.2 0.465 0.548 0.529 1 0.440 0.517 0.538 1 .25 0.450 0.501 0.599 2.5 0.237 0.284 0.51 1 5 0.063 0.046 0.076 Efecto de las formulaciones sobre células de cáncer colorectal (Caco2) Se cultivaron células Caco2 a una densidad de 20,000 células/ml (día 1 ). Las células fueron tratadas con 0.25x; 0.5x; Ix; 1 .25x; 2.5x y 5x de las diferentes formulaciones, en el día 2 y el día 4. Las células fueron fijadas en el día 5. La formulación C a las concentraciones probadas no tuvieron ningún efecto sobre la viabilidad celular Caco2, después del tratamiento en el día 5 las células mostraron una monocapa confluente y saludable (datos no mostrados).

La prueba de tinción de proteína SRB (Tabla 5) muestra el valor medio para 4 pozos replicados de cada concentración de las formulaciones usadas, el efecto sobre la muerte celular de la formulación B, J y T dependió de la concentración: 2.5x y 5x eliminó todas las células en los pozos como se muestra en la Figura 5. La menor concentración de estas tres formulaciones no tuvieron efecto sobre la viabilidad celular, como se pudo observar en las densidades ópticas (OD) registradas no fueron significativamente diferentes del grupo de control. El control fue la media de 24 pozos replicados, en el momento de la fijación los 24 pozos de la placa de control fueron completamente confluentes.

Tabla 5: Efecto de las formulaciones B, J T en células Caco2 CONC (1) B (l) J (l) T (l) 0 0.421 0.421 0.421 0.4 0.370 0.387 0.440 0.2 0.393 0.440 0.431 1 0.384 0.429 0.515 1.25 0.395 0.458 0.478 2.5 0.251 0.131 0.304 5 0.078 0.074 0.176 Los tratamientos B, J y T tienen un efecto tóxico en todos los tipos de células analizadas. La concentración de las formulaciones B, J y T que presentan un efecto en la viabilidad de la célula fueron de 2.5x y 5x. Después del tratamiento las células presentaron una morfología redonda, contracción celular y distancia incrementada.

Determinación de las formulaciones IC50 Los valores IC50 para cada formulación se obtuvieron al esquematizar la absorbancia contra la concentración. El IC50 de las diferentes formulaciones se obtuvo para las líneas celulares: Caco2, Pand y OE33 cuando se administró dos veces a la semana. Los valores finales IC50 (con concentraciones reales correspondientes mg/ml) se usaron en las pruebas de células subsecuentes.

Tabla 6A: IC50 de formulaciones en Pand Tabla 6B: IC50 de formulaciones en células OE33 Tabla 6C: IC5n de formulaciones en células Caco2 Expresión de marcadores de adhesión célula-célula Los cambios en la expresión de marcadores de adhesión de célula-célula ß- catenina y E-cadherina se investigaron en células Pand , OE33 u Cac2 después del tratamiento con la concentración IC50 de formulaciones J y T.

Las células se trataron con la concentración de IC50 de las formulaciones. Las células se cultivaron, se lavaron tres veces con solución salina regulada con fosfato PBS y se arreglaron con 4% de parafolmaldehído en PBS durante 30 minutos. Las células se lavaron tres veces con PBS y se después del arreglo se congelaron con acetona/metanol (1 :1 ) durante 5 minutos a -20 °C. La célula se lavó tres veces en PBS en 2% de solución reguladora de pH de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.

Luego se incubaron las células durante la noche en un anticuerpo primario diluido en solución reguladora de pH de bloqueo a 4 °C. Las células se lavaron tres veces en PBS y luego se incubaron durante 2 horas con anticuerpos secundarios en solución reguladora de pH de bloqueo. Las células se lavaron tres veces en PBS y se incubaron 15 minutos en 1 :1000 DAPI/PBS (para demostrar la tinción nuclear) a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se montaron sobre los pedazos con medios de montaje. Los controles se realizaron con células no tratadas.

La tinción de inmunofluorescencia indirecta se realizó usando anticuerpos monoclonados desarrollados a E-cadherina (Transduction Labs BD Biosciences Clone 36) y ß-catenina (Transduction Labs BD Biosciences Clone 14). El anticuerpo secundario usado es fluoresceína anti-ratón caballo (Vector Labs FI2000).

El incremento de la expresión de ß-catenina y E-cdherina después del tratamiento con las formulaciones probadas se cuantificó al medir la intensidad de la fluorescencia de las muestras bajo el microscopio de fluorescencia, diferentes campos de una misma muestra se midieron y el promedio de las recolecciones de intensidad se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7: Promedio de intensidad de la fluorescencia de las células tratadas con las formulaciones Jy T Resumen Las células Pand , Cac2 y OE33 cuando se trataron con la concentración de IC50 de las formulaciones J y T se mostró un incremento en la intensidad de la inmunofluorescencia cuando se comparó con células no tratadas. Esto se correlaciona con un incremento en la expresión de ß-catenina y E-cadherina en células cancerígenas con células de control, como se muestra en las figuras 6 a 13, ß-catenina y E-cadherina se muestran en verde y las nucléicas se muestran en azul.

Ejemplo 1 : Formulaciones de pro-enzima mejorada Se realizó un estudio para determinar el efecto de la formulación de proenzima que comprende tripsinónego 8pT), quimiotripsinógeno 8pC) y a-amilasa (A) (formulación referida como JBp1 ) sobre el crecimiento de 24 líneas celulares de cáncer. Con base en el IC50 y en los valores de inhibición máxima en este estudio inicial, tres líneas celulares se seleccionaron para después entender los efectos de los tres componentes individuales en JBp1 en el crecimiento celular del cáncer.

El estudio aplicó el método isobolográfico para entender la interacción entre los tres componentes de JBp1 : a-amilasa, tripsinónego y quimiotripsinógeno. Con base en los resultados obtenidos, se propuso una formulación mejorada (JBpI vP) y se probó con estudios isobolográficos con una segunda formulación que comprende 2-desoxi-D-glucosa (D), capsiato (C) y metilselenocisteína (M).

Resumen Las propiedades inhibitorias del crecimiento celular de la formulación de pro-enzima JBp1 se estudió en un panel de 24 líneas celulares de cáncer humanas, se obtuvieron los valores IC50 para la mayoría de las líneas celulares en este panel. Con base en los valores IC50 y la inhibición del crecimiento máximo, tres líneas celulares, A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2 se seleccionaron para estudios de combinación adicionales con el uso del método isobolográfico. El uso de isoboiogramas permitió el estudio del nivel de interacción entre los tres componentes individuales de JBp1 : a-amilasa, tripsinónego y quimiotripsinógeno. Al estudiar la actividad de inhibición del crecimiento de los componentes individuales en combinación con cada uno y mezclas de los dos componentes, se identificó una composición mejorada de la formulación JBp1 y se ha referenciado como "JBp P". Esta formulación mejorada se probó en combinación con los ensayos contra una segunda formulación que comprende 2-desoxi-D-glucosa (D), capsiato (C) y metilselenocisteína (M), en donde la segunda formulación que tiene la referencia DCM y la combinación de la primera y segunda formulación que tiene la referencia JBp1 vP-DCM. El análisis isobolográfico de la interacción entre JBpI vP y DCM mostró el potencial para actuar sinérgicamente, especialmente a bajas concentraciones de DCM (ver los resultados para la línea celular MIAPaCa-2 de la figura 14 y la tabla 8).

Tabla 8: Resumen de los análisis isobolográficos para quimiotripsinógeno, tripsinógeno, a-amilasa y composiciones duales en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2.

Leyenda: T: Tripsinógeno C: Quimiotrispinógeno A: a-amilasa TC: Quimiotripsinógeno:Tripsinógeno (6:1 ) CA: Qu¡m¡otrips¡nógeno:a-amilasa (1 :0.25) TA: tripsinónego:o amilasa (1 :0.25) WR: interacción sinérgica de amplio rango (valores de más de 7 g abajo de 1.0) NR: interacción sinérgica de rango limitado (valores de 3 a 7 g abajo de 1.0) N: interacción no sinérgica (valores de menos de 3 g abajo de 1 .0) Método isobolográfico Las relaciones de dosis-respuesta de agentes pueden ser usadas para construir un modelo que dé el efecto esperado de una combinación. La combinación de fármacos A y B deberá clasificarse (da, db) cuando da y db sean dosis de A y B. El efecto se trata como una función matemática, E(da,db). E es a veces expresado como un efecto fraccional, luego la fracción de supervivencia es S: S=1 -E. Finalmente, Da y Db son dosis de fármacos A y B dados de forma separada, que producen una respuesta isoefectiva con la combinación. Los ¡sobóles (curvas iso-efectivas) pueden construirse con base en la suposición de que no hay interacción entre los fármacos usados en combinación. La combinación (da,db) es representada por un punto sobre un gráfico que tiene ejes que representan dosis de los fármacos individuales. Se espera que si los fármacos no interactúan, este punto deberá caer en una línea recta (isobolo) que conecta los dos ejes entre los valores que representan las dosis (Da y Db) iso-efectivas con la combinación (da, db). La ecuación para el isobolo de interacción cero para dos compuestos es Cuando el número de compuestos en combinación es n, la ecuación es Cuando los fármacos en combinación son iso-efectivos con las dosis del individuo, el isobolo es una línea recta. Sin embargo, si el efecto de la combinación es mayor de lo esperado de las curvas de dosis-respuesta individual, las cantidades más pequeñas de da y/o db se necesitan para producir un efecto equipotente a Da y Db (ambas sin cambiar), por lo tanto d, , Í3) !.) . ü.

También se le llama a la relación valor g y se usa para determinar el tipo de interacción. En este caso el isobolo calculado es cóncavo. El antagonismo produciría efectos en la dirección opuesta; por lo tanto el isobolo que representa este tipo de interacción sería convexo.

En resumen, los valores g pueden ser: ... / D IX Se estudió la interacción entre los tres componentes de la nueva formulación JBp1 (a-amilasa, tripsinónego y quimiotripsinógeno). Asimismo, el método isobolográfico se empleó para determinar una relación mejorada de los tres componentes en la formulación. La formulación mejorada JBp1 se estudió después en combinación con una segunda formulación DCM.

Materiales y Métodos Las placas de 96 pocilios, de cultivo, de células estériles, de fondo plano se obtuvieron de Becton-Dickinson (North Ryde, NSW, Australia); el medio de cultivo RPMI 1640 y DMEM, FBS, GlutaMax, penicilina-estreptomicina, piruvato de sodio, HEPES, HA , FCS y DPBS se obtuvieron de Invitrogen Australia (Mt Waverley, VIC, Australia); Trypan Blue se obtuvo de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia); CelITiter-Blue® Cell Viability Assay se obtuvo de Promega (Madison, Wl, USA); SpectraMax Gemini XPS Fluorometer se obtuvo de Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA).

Todas las líneas celulares usadas en estos estudios fueron de origen humano y se originaron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC por sus siglas en inglés) (Rockville, MD, USA).

La siguiente tabla 9 muestra las condiciones de crecimiento y las densidades de cultivo celular inicial en células por buen uso en toda la determinación IC50 y ensayos de combinación. Estas células fueron cultivadas a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada, provista con 95% de aire/5% de C02.

Tabla 9: Condiciones de crecimiento y densidades de cultivo para el estudio de IC50 y ensayos de combinación.

El artículo de prueba 1 fue tripsinónego, que fue suministrado por Applichem (Darmstadt, Alemania). El artículo de prueba 2 fue quimiotripsinógeno, que fue suministrado por BBI Enzymes (Gwent, UK). El artículo de prueba 3 fue a-amilasa, que fue suministrado por Annecis Ltd (Lancaster, UK). El artículo de prueba 4 fue 2-desoxiglocosa, que fue suministrado por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). El artículo de prueba 5 fue capsiato, que fue suministrado por Propane Pty Ltd. El artículo de prueba 6 fue metilselenocisteína, que fue suministrado por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia).

Se disolvieron a-amilasa, tripsinónego y quimiotripsinógeno en salina amortiguada en fosfato (PBS) y se usaron inmediatamente o almacenaron a 4 °C para uso posterior. El artículo de prueba DCM está compuesto por 2-desoxiglucosa, capsiato y metilselenocisteína en una relación de 1 :1 :0.0001. Estos tres componentes se mezclaron juntos en estas relaciones, se resuspendieron en PBS y se usaron inmediatamente después de la preparación.

Ensayos de crecimiento celular Para los análisis de IC50, los artículos de prueba se añadieron a las células 24 horas después del cultivo. Las concentraciones del artículo de prueba se probaron por triplicado para cada línea celular. El ensayo CelITiter-Blue se llevó a acabo en todas las placas 72 horas después de la adición de los artículos de prueba.

Para los ensayos de combinación, dos placas de 96 pocilios se cultivaron para cada línea celular y combinación de artículo de prueba, para permitir la replicación de cada experimento. Los artículos de prueba se añadieron a las células 24 horas después del cultivo de acuerdo con el esquema de pipeteo (células dentro del rango A3:G1 1 contienen la combinación de ambos fármacos en concentraciones dadas en la columna 2 y fila H).

Se eligieron las concentraciones iniciales para cada compuesto en cada línea celular con base en el IC50 calculado de manera que el IC50 de cada fármaco cayó dentro de la concentración de la serie de diluciones. El ensayo CelITiter-Blue® se llevó a cabo en todas las placas 72 horas después de la adición de los artículos de prueba.

Después de la incubación de células en el medio que contiene los artículos de prueba, 10 pL de CelITiter-Blue® se añadieron a cada pocilio y se incubaron con las células por hasta 4 horas. La fluorescencia se midió usando un Fluorómetro Spectramax Gemini XPS. Todos los datos se registraron y metieron en hojas de cálculo de Microsoft® Excel para interpretación.

Los datos recolectados de los ensayos de CelITiter-Blue® se trazaron como curvas de respuestas de dosis para la determinación IC50, y como isobologramas para evaluar el tipo de interacción entre las combinaciones de artículos de pruebas. Para las determinaciones IC50, la inhibición del crecimiento se calculó y se trazó contra la concentración de compuesto. En estas gráficas, el eje X (concentración de compuesto) se representó en escala algorítmica. La concentración IC50 se calculó como la concentración inhibitoria (IC) media máxima (50%) para cada compuesto usando GraphPad versión 5.0 para Mac OSX (GraphPad Software, San Diego California, USA).

Para los estudios de combinación, se realizaron los análisis isobolográficos usando la plantilla de análisis de marca wVoPharm. Los análisis isobolográficos proporcionan una medición del tipo de interacción (p. ej. sinérgica, aditiva o antagonista) que ocurre entre dos compuestos. Un parámetro que define el tipo de interacción es el valor g. Como se describió antes, los valores g de más de 1.0 indican una interacción antagonista y los valor g abajo de 1.0 indican una interacción sinérgica. Cada ensayo isobolográfico resulta en 9 valores g, uno por cada concentración del segundo compuesto en la combinación (el compuesto B en la plantilla de análisis). Para este estudio, las interacciones entre dos compuestos se categorizan en tres grupos: interacciones sinérgicas de amplio rango que resultaron en 3 a 7 valores g abajo de 1 .0 y las interacciones no sinérgicas que produjeron menos de 1 .0. La tabla 5 muestra el resumen de todas las interacciones analizadas en el estudio.

Todos los procedimientos usados en la realización de este estudio se realizaron de acuerdo con los procedimientos de operación estándar.

Resultados Los ensayos de determinación IC50 se realizaron para JBp1 en 24 líneas celulares de cáncer. Como se ve en la tabla 10, los valores IC50 se obtuvieron para 15 de las líneas celulares ((A2780, HOP-92, BxPc-3, HT-29, KYSE-30, MIAPaCa-2, OE-33, A549, HCT-15, OE-21 , NCI-H82, HCT-1 16, MDA-MB468, NCI-H460 and BT474). Las líneas celulares restantes mostraron los valores de inhibición máxima o curvas de dosis-respuesta que no permitieron la determinación de valores IC50 dentro del rango de concentraciones de JBp1 probado en este estudio. La tabla 10 muestra el IC50 y los valores de inhibición del crecimiento máximo para todas las 24 líneas celulares en orden decreciente de inhibición del crecimiento máximo.

Con base en el IC50 y los valores de inhibición máxima obtenidos para las 24 líneas celulares y la estabilidad de cada línea celular para dar seguimiento a los estudios en animales, se seleccionaron tres líneas celulares para estudios isobolográficos. Estas líneas celulares, A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2, se remarcan en negritas en la tabla 10.

Tabla 10: Resumen de los valores IC50 para JBp1 en 24 líneas celulares.

El método isobolográfico para estudiar la interacción entre los compuestos requiere de la determinación de los valores IC50 para estos componentes antes de realizar los ensayos de combinación. Por consiguiente, los ensayos de determinación IC50 se realizaron para los tres componentes individuales de JBp1 , principalmente a-amilasa, tripsinónego y quimiotripsinógeno, en las tres líneas celulares seleccionadas A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. Como se ve en la tabla 1 1 , el tripsinógeno mostró los valores IC50 que van desde 0.23 a 0.41 mg/mL en todas las tres líneas, a-amilasa y quimiotripsinógeno no presentaron valores IC50 dentro del rango de las concentraciones probadas.

Tabla 11: Resumen de valores IC50 e inhibición del crecimiento máximo para a-amilasa, tripsinónego y quimiotripsinógeno en células A-549, HCT- 15 y MIAPaCa- Los análisis isobolográficos proporcionan una medida del tipo de interacción (p. ej. sinérgica, aditiva o antagonista) que ocurre entre dos compuestos. Un parámetro que define el tipo de interacción es el valor g. Como se describe arriba, los valores g de más de 1 .0 indican una interacción antagonista y los valores g abajo de 1 .0 indican una interacción sinérgica. Cada ensayo isobolográfico resulta en 9 valores g, uno por cada concentración del segundo compuesto en combinación (compuesto B en la plantilla de análisis). Para este estudio, las interacciones entre los dos compuestos se categorizaron en tres grupos: interacciones sinérgicas de amplio rango que mostraron más de 7 valores g por abajo de 1 .0, interacciones sinérgicas de rango limitado que resultaron en 3 a 7 valor por abajo de 1.0 e interacciones no sinérgicas que produjeron menos de 3 valores g por abajo de 1.0. La tabla 8 muestra el resumen de todas las interacciones analizadas en este estudio.

A pesar del hecho de que no se obtuvieron valores IC50 para a-amilasa, y quimitripsinógeno, la interacción entre cada uno y con trispinógeno se estudió en los ensayos de combinación, ya que se entiende que estos componentes todavía interactúan cuando están en combinación con un segundo compuesto. Las figuras 15 a 17 muestran los isobologramas que resultan de . los ensayos de combinación entre a-amilasa, tripsinógeno y quimiotripsinógeno en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2.

Como se ve en la figura 15 y tabla 8, tripsinógeno y quimiotripsinógeno mostraron resultados isobolográficos consistentes con un amplio rango de interacciones sinérgicas en células A-549 y MIAPaCa-2. En células HCT-15, el perfil isobolográfico fue consistente con una interacción no antagonista (la línea isobolográfica se localiza casi super impuesta en el eje X y puede no ser claramente distinguible en la figura). Con base en los resultados totales de los ensayos de combinación en las tres líneas celulares seleccionadas, se definió que la relación mejorada del tripsinógeno y quimiotripsinógeno en la formulación debería ser configurada a 6:1 (quimiotripsinógeno: tripsinónego). Esta relación es respaldada por: 1 ) altas concentraciones de quimiotripsinógeno mejoradas de manera significativa mejoraron el efecto inhibitorio de crecimiento, como es reflejado por valores g muy bajos de 1 y 2 mg/mL de quimiotripsinógeno en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2; y 2) las concentraciones de tripsinónego por arriba de 0.25 mg/mL no añadieron efectos inhibitorios posteriores. Por consiguiente, el promedio de las dos concentraciones superiores de quimiotripsinógeno (1 .5 mg/mL) se dividieron entre la concentración superior de tripsinógeno (0.25 mg/mL) para obtener una relación de 1.5 a 0.25 o 6:1.

La figura 16 muestra los isobologramos para la interacción entre tripsinónego y a-amilasa en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. La combinación de estos dos compuestos que resultó en interacciones sinérgicas en células A-549, y MIAPaCa-2 e interacción no sinérgica en células HCT-15 (tabla 8). La interacción positiva fue de tipo de amplio rango en células MIAPaCa-2 y de tipo de rango limitado en células A-549. Dado el rango de respuestas observadas para esta interacción en las tres líneas celulares probadas, estos datos no se usaron para determinar la relación entre estos dos componentes en la formulación JBp1 .

La figura 17 muestra los isobologramas para la interacción entre a-amilasa y quimiotripsinógeno en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. La combinación de estos dos compuestos resultó en una interacción sinérgica en células MIAPaCa-2 e interacción no sinérgica en A-549 y HCT-15. Debido al efecto negativo de la a-amilasa en los efectos inhibitorios del crecimiento celular de quimiotripsinógeno, se decidió dejar la relación de este componente a otros dos componentes de JBp1 en la concentración original (1 :0.25, quimiotripsinógeno: a-amilasa).

En resumen, después de la primera ronda de los ensayos de combinación, se determinó que la relación de quimiotripsinógeno:tripsinógeno se hubiera configurado a 6:1 y las relaciones de quimiotripsinógeno:a-amilasa y tripsinógeno:a-amilasa se usarían a concentraciones originales de 1 :0.25.

Para la segunda ronda de estudios de combinaciones, el par de compuestos y la relación definida arriba se re-definieron como los nuevos compuestos de prueba de la siguiente manera: - quimiotripsinógeno:tripsinógeno (6:1 )=TC - quimiotripsinógeno:a-amilasa (1 :0.25)=CA - tripsinógeno:a-amilasa (1 :0.25)=TA Los ensayos de determinación IC50 se realizaron para estos compuestos re-definidos en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. La tabla 12 presenta las curvas de dosis-respuesta y los valores IC50 calculados y la inhibición del crecimiento máximo para los tres compuestos en las tres líneas celulares seleccionadas. Se obtuvieron los valores IC50 para TC y TA en todas las tres líneas celulares. Sin embargo, los valores IC50 no pudieron ser encontrados para CA con el rango de concentraciones probadas.

Tabla 12: Resumen de valores IC50 e inhibición del crecimiento máximo para TC, TA y CA en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2.

Continuando con la determinación de valores IC50 para TC, CA y TA, los ensayos de combinación se realizaron entre estos componentes y el tercer componente correspondiente en la formulación JBp1 (p. ej. TA versus quimiotripsinogeno, CA versus tripsinógeno y TC versus a-amilasa).

' La figura 18 presenta los isobologramas para la combinación entre TA y quimiotripsinogeno. La combinación de estos dos compuestos resultó en interacciones sinérgicas en células A-549 y MIAPaCa-2 y en interacción no sinérgica en células HCT- 15.

La figura 19 presenta los isobologramas para la combinación entre CA y tripsinógeno. La combinación de estos dos compuestos resultó en interacciones sinérgicas en células HCT-15 y MIAPaCa-2 e interacciones no sinérgicas en células A-549. En total, la tendencia observada apuntó hacia una interacción positiva para estos dos componentes, consistente con la interacción sinérgica observada entre el quimiotripsinógeno y tripsinógeno. Estos resultados justificaron adicionalmente la relación 6:1 (quimiotripsinógeno: tripsinógeno) seleccionada con base en resultados previos discutidos.

La figura 20 presenta los isobologramas para la interacción entre TC y a-amilasa. La tendencia total observada para esta combinación fue consistente con las interacciones no sinérgicas. Para diseccionar posteriormente el efecto negativo de la a-amilasa en los efectos inhibitorios del crecimiento de TC, los valores IC50 para TC se extrajeron de la plantilla del análisis isobolográfíco y se trazaron contra la concentración correspondiente de a-amilasa. Los valores incrementaron proporcionalmente a la concentración de a-amilasa para todas las tres líneas celulares. Estos resultados sugieren que los niveles de a-amilasa en la formulación JBp1 deberían mantenerse bajos con el fin de evitar los efectos potenciales antagonistas con quimiotripsinógeno y tripsinógeno.

La tabla 8 anterior resume todos los resultados de las combinaciones para los componentes individuales y duales contra cada uno.

Con base en los estudios de combinación descritos arriba, las relaciones de quimiotripsinógeno, tripsinógeno y a-amilasa en la formulación JBp1 se definieron como 6:1 :0.25 (quimiotripsinógeno:tripsinógeno:a-amilasa). Esta formulación JBp1 mejorada se identificó por el sufijo "vP" par diferenciarla de la formulación original JBp1.

Los valores IC50 se determinaron para la formulación mejorada JBpI vP y comparada con los valores obtenidos para la formulación original JBp1 . La tabla 13 presenta las curvas de dosis-respuesta, los valores IC50 y la inhibición de crecimiento máximo para estas dos formulaciones en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. Como estos resultados lo muestran, la formulación JBpI vP mejorada presentó valores IC50 menores que JBp1 en células HCT-15 y A-549 y un valor similar IC50 en células MIAPaCa-2. Es importante mencionar que JBpI vP mostró valores de crecimiento máximo mayores que JBp1 en todas las tres líneas celulares.

Tabla 13: Resumen de valores IC50 e inhibición de crecimiento máximo para JBp1, JBp vP y DCM en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2.

El JBpl vP se examinó por su capacidad para inhibir el crecimiento celular en combinación con el compuesto de prueba DCM. Antes de los ensayos de combinación, el IC50 de DCM se determinó en células A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2. Como se ve en las tablas 8 y 13, el DCM mostró los valores IC50 en el rango de 0.15 a 1 .5 mg/mL y los valores de inhibición de crecimiento máximo de más de 92% para todas las tres líneas celulares.

La figura 14 muestra los isobologramas para la combinación entre JBp1 y DCM. El análisis isobolográfico mostró que la interacción entre estos dos componentes en las células A-549 y HCT-15 no era sinérgica. En las células MIAPaCa-2, la combinación de JBpI vP y DCM resultó en interacción de rango limitado, específicamente a concentraciones más bajas de DCM. Los valores g para esta combinación estaban abajo de 1 .0 para las dos concentraciones más bajas de DCM.

En vista de que se entiende que M puede proporcionar un efecto antagonista en JBp1 , estos resultados inesperadamente mostraron que DCM es efectivo en combinación con JBp1.

En resumen, el JBpI vP y DCM interactuaron sinérgicamente a bajas concentraciones de DCM, JBpI vP también muestra efectos inhibitorios del crecimiento celular de cáncer mejorado sobre la formulación JBp1 in vitro, y JBpI vP y DCM sinergizaron para inhibir el crecimiento celular in vitro.

Ejemplo 2: Estudio in vitro de formulaciones de pro-enzima mejorada Se llevó a cabo un estudio para determinar la eficacia anti-angiogénica in vivo de JBp1 (tripsinógeno, a-amilasa y quimiotripsinógeno), administrado a 0.13 mg/kg, 0.78 mg/kg y 0.03 mg/kg de manera respectiva), solo o en combinación con un adyuvante, DCM (2-desoxiglucosa, Capsiato y Metilselenocisteína a 30.55 mg/kg, 29.12 mg/kg, 0.003 mg/kg, de manera respectiva), se investigó usando el ensayo wVoPharm's AngioChamber™. EL ensayo AngioChamber™ utiliza el proceso psicológico normal de curación de heridas, para promover la formación de cápsula fibrosa alrededor de una cámara implantada (Wood, J.M., Bold, G., Buchdunger, E., Cozens, R., et al. PTK787/ZK 222584, a Novel and Potent Inhibitor of Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinases, Impairs Vascular Endothelial Growth Factor-lnduced Responses and Tumour Growth After Oral Administration. Cáncer Research, 60 (8):2178-2189 (2000)). La inclusión del Factor de Crecimiento de Fibroblasto Básico (bFGF) en la cámara soporta la formación de cápsula fibrosa mientras que induce al desarrollo de vasos sanguíneos. Por consiguiente, este sistema se usa para valorar la eficacia de los tratamientos anti-angiogénicos al medir la formación de cápsula fibrosa (peso húmedo de la cápsula al final).

Resumen Cincuenta ratones hembras FvB recibieron un AngioChamber™ implantado de manera subcutánea con o sin bFGF. Diez ratones se seleccionaron de manera aleatoria y se les implantó con canales sin bFGF. Cuarenta ratones que fueron implantados con canales que contienen bFGF se seleccionaron de manera aleatoria mediante el peso corporal en cuatro grupos de tratamiento de 10 ratones en el día 0 del estudio.

El JBp1 consistió de tripsinógeno, a-amilasa y quimiotripsinógeno, se administró a 0.13 mg/kg, 0.78 mg/kg y 0.03 mg/kg, respectivamente. El DCM consistió de 2-Desoxiglucosa, Capsiato y Metilselenocisteína a 30.55 mg/kg, 29.12 mg/kg, 0.003 mg/kg, respectivamente.

Los ratones de cada grupo recibieron el tratamiento diariamente (día 0 a 4) con Control de Vehículo (NMP:PEG300 (1 :9, v/v),p.o., 5 mL/kg), JBpl (i. p., en un volumen de dosis de 10 mL/kg), JBpl-DCM (i. p., en un volumen de dosis de 10 mL/kg) o Sorafenib (60 mg/kg, p.o., en un volumen de dosis de 5 mL/kg). El control de vehículo se administró a dos grupos, uno de los cuales se implanto con AngioChambers™ sin bFGF (Control de punto de partida), el otro implantado con AngioChambers™ con bFGF (Control de inducción). Los grupos de tratamiento de compuesto se implantaron con AngioChambers™ con bFGF.

Las mediciones del peso corporal se registraron para todos los animales en el primer día de tratamiento (día 0) y luego diariamente hasta del día de finalización del estudio (día 5).

Los ratones en todos los grupos perdieron peso corporal inmediatamente después del comienzo del tratamiento, un resultado esperado del procedimiento quirúrgico. Los ratones tratados con el Control de vehículo (con bFGF) JBp1 y JBp1 -DCM recuperaron el peso corporal durante el tiempo restante del estudio, sin pérdida significativa del peso corporal promedio en el día de finalización. Los ratones tratados con Control de vehículo (sin bFGF) y Sorafenib no recuperaron su peso corporal, los dos grupos tenían pérdida de peso corporal significativa en la finalización del estudio, que es común en los ratones tratados con NMP:PEG300.

Los AngioChamber™ fueron extirpados de cada ratón 24 horas después del tratamiento final (día 5). La cápsula fibrosa alrededor de la cámara se removió y se registró el peso húmedo.

Todos los tratamientos resultaron en inhibición significativa de angiogénesis inducida por bFGF comparada con el Control de Inducción, como es indicado por los pesos húmedos de la cápsula en el día de finalización del estudio. El tratamiento con JBp1 -DC y Sorafenib, que es un comparador de fármaco angiogénico efectivo, redujo de manera significativa la angiogénesis en comparación con la monoterapia JBp1 . No hubo una diferencia significativa en la actividad anti-angiogénica entre JBp1 -DCM y Sorafenib. Por consiguiente, en este modelo, tanto JBp1 como JBp1-DCM fueron eficaces en la inhibición de formación de cápsula fibrosa. La adición de DCM de la formulación de JBp1 resultó en una inhibición mejorada en comparación con JBp1 solo. El tratamiento de JBp1-DCM fue efectivo como Sorafenib en este modelo.

Materiales v métodos Heparina, NMP, PBS y PEG300 se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). Los filtros Acrodise de 0.22 µ? se obtuvieron de Pall Corporation (Sydney, NSW, Australia). El bGFG humano recombinante se obtuvo de Shenandoah Biotechnology (Warwick, PA, USA). Los AngioChamber™ se sustituían por Angst + Pfister AG (Stuttgart, Alemania). La agarosa se sustituía por Omnigel Lo.M (Edwards Instruments Co., NSW, Autralia).

El sistema de prueba involucraba 50 ratones FvB hembras, con 5 grupos de estudio de 10 ratones por grupo (2 grupos de control y 3 de tratamiento). Las condiciones estándar y los regímenes se usaron para administrar a los animales.

Las cámaras de tejido poroso (AngioChambers™) hechas de perfluoro-alcoxi-Teflón (Teflón®-PFA, 21 mm x 8 mm de diámetro, 550 pL de volumen), se hicieron hoyos de 0.8 mm perforados con espacio de 80 regularmente. Ambos extremos se sellaron con tapas removibles del mismo material. Las cámaras se llenaron bajo condiciones estériles con 0.8% de agarosa que contiene 20 lU/mL de heparina, con o sin 4 pg/mL bFGF. La solución de agarosa se mantuvo a 37 °C antes de llenar las cámaras.

Para la implantación de cámara, los ratones se anestesiaron con inhalación de isofluorano. Se hizo una pequeña incisión en la piel dorsal central de cada ratón y la cámara se insertó de manera subcutánea y se colocó entre los homoplatos. Se cerró la herida con dos clips para heridas de 1 .4 mm (Michel Clip).

Compuestos de prueba y formulaciones El control de vehículo fue NMP:PEG300 (1 :9 v/v). JBp1 fue el artículo de prueba 1 y consisitió en tripsinógeno, quimiotripsinógeno y a-amilasa, administrado a 0.13 mg/kg, 0.78 mg/kg y 0.03 mg/kg, respectivamente. El DCM fue el artículo de prueba 2 y concistió en 2-desoxiglucosa, Capsiato y Metilselenocisteína a 30.55 mg/kg, 29.12 mg/kg, 0.003 mg/kg, respectivamente. Cada compuesto se disolvió de forma separada en PBS. Las soluciones madre se esterilizaron mediante filtración (0.22 µ?). En cada día de dosis, las soluciones madre se mezclaron en combinaciones adecuadas.

Sorafenib fue el compuesto de referencia y se sustituyó por 315 mg de tabletas que contienen 200 mg de Sorafenib activo. Las tabletas se machacaron y disolvieron en NMP para formular una solución madre de Sorafenib activo, que se diluyó con PEG300 para lograr la dosis requerida de concentración con una relación NMP:PEG300 final de 1 :9.

Diez ratones se seleccionaron de forma alterna y se les implantó un Chambers sin bFGF. A cuarenta ratones se les implantaron Chambers que contienen bFGF y se seleccionaron de manera alterna por el peso corporal en cuatro grupos de tratamiento de 10 ratones el día 0 del estudio. Los tratamientos empezaron el día 0 (dos horas después de que los ratones se recuperaron de la cirugía) y continuaron durante cinco días consecutivos (día 0 a 4).

El control de vehículo (NMP:PEG300 (1 :9 v/v)) (grupos 1 y 2) y Sorafenib (60 mg/kg; grupo 5) se administraron oralmente (p.o.) en un volumen de dosis de 5 mlJkg. JBp1 (tripsinógeno, quimiotripsinógeno y a-amilasa a 0.13 mg/kg, 0.78 mg/kg y 0.03 g/kg, respectivamente) se administró solo (grupo 3) y en combinación con DCM (2-desoxiglucosa, Capsiato y metilselenocisteína a 30.55 mg/kg, 29.12 mg/kg, 0.003 mg/kg, respectivamente) (grupo 4). Ambos se administraron por medio de inyección intraperitoneal (i.p.) en un volumen de dosis de 10 mlJkg. Cuando JBp1 y DCM se administraron en combinación todos los compuestos se formularon y administraron juntos en una inyección.

Cada peso corporal del animal se midió inmediatamente antes de la dosis. El volumen de la solución de dosis administrado a cada animal se calculó y ajustó con base en el peso corporal individual.

Los animales se trataron de acuerdo con el programa anterior, empezando dos horas después de que los ratones se recuperaron de la cirugía para implantarles el AngioChamber™ en el día 0 del estudio. Los AngioChambers™ se extrajeron de todos los ratones post-mortem el día de finalización (día 5). La cápsula fibrosa vascularizada que se formó alrededor de cada cámara se removió cuidadosamente y se registró el peso húmedo inmediatamente.

El tratamiento de cualquier animal hubiera cesado si su peso corporal hubiera bajado a menos del 85% del peso que tenían al inicio del estudio. Si esto hubiera ocurrido, las mediciones del peso corporal hubieran continuado por un periodo corto. Si no se hubiera medido ninguna ganancia del peso corporal, el animal hubiera sido descartado. Los animales hubieran sido también descartados si la reacción secundaria severa al tratamiento hubiera sido observada. El alcance de las reacciones secundarias fue valorado usando una hoja de puntaje clínico de proforma que enlista los síntomas y un puntaje de acompañamiento (guía dada en el anexo 2). La combinación de los síntomas observados y resultantes sumaron el puntaje resultante sumado determinó el curso de acción que se tomaría con respecto a la protección del animal.

La inhibición de angiogénesis mediante artículos de prueba (5) se calculó usando la siguiente fórmula: % de inhibición = [(A-B)/(A-C) x 100] en donde A es el peso de la cápsula promedio de los ratones con AngioChamber™ implantado que contiene factor de crecimiento y que están tratados con el control de vehículo (Grupo 2).

B es el peso de la cápsula promedio de los ratones con AngioChamber™ implantado que contiene factor de crecimiento y que están tratados con artículo de prueba (grupos 3-5), y C es el peso de la cápsula promedio de los ratones con AngioChamber™ implantado sin factor de crecimiento y que están tratados con el control de vehículo (Grupo 1 ).

Todos los cálculos estadísticos se realizaron usando SigmaStat 3.0 (SPSS Australia, North Sydney, NSW, Australia). Se usó una prueba t para muestras pareadas para determinar la significancia en el cambio del peso corporal dentro del grupo de tratamiento entre el día 0 y el día de finalización del estudio. Cuando los datos no pasaron la prueba de Normalidad, se realizó la prueba de Suma de Clasificación de Wilcoxon. El objetivo de los análisis estadísticos restantes se hizo para mostrar que el compuesto referenciado, Sorafenib y los artículos de prueba inhibieron la inducción de la cápsula fibrosa mediante bFGF de manera significativa. La inducción significativa de la formación de cápsula fibrosa mediante bFGF se considera como esencial para aceptar los resultados del estudio. Se realizó un Análisis de Varianza de una vía (ANOVA) en los datos del peso de la cápsula al final del estudio. Cuando se encontraron diferencias significativas, se realizó la Comparación Múltiple por Pares y Comparación Múltiple versus los procedimientos de grupo de control (Método Holm-Sidak). Un valor p de menos de 0.05 se consideró como significativo.

Todos los procedimientos usados en la realización de este estudio se llevaron a cabo de conformidad con los procedimientos de operación estándar w'voPharm, con referencia particular a SOP # vP_EF0317 "General Procedures for Agiogenesis Studies". Los procedimientos de operación estándar se mantienen archivados en las instalaciones seguras de v/VoPharm.

Resultados y observaciones Todos los ratones en todos los grupos presentaron piloerección durante el estudio. Un ratón tratado con control de vehículo (con bFGF; grupo 2) se encontró muerto el día 1 del estudio, probablemente debido a las complicaciones de la cirugía. Un ratón tratado con control de vehículo (sin bFGF; grupo 1 ) tenía la pierna derecha trasera adherida al pelaje abdominal el día 4. Esto se separó bajo inhalación anestésica.

Los ratones en todos los grupos perdieron peso corporal inmediatamente después del empiezo del tratamiento, probablemente debido al procedimiento quirúrgico. Los ratones tratados con el control de vehículo (con bFGF; grupo 2) JBp1 (grupo 3) y JBp1 -DCM (grupo 4) recuperaron el peso corporal fácilmente durante el tiempo restante del estudio, sin ninguna pérdida significativa de peso corporal en el día de finalización.

Los ratones tratados con vehículo de control no recuperaron el peso corporal (sin bFGF; grupo 1 ) y Sorafenib (grupo 5), con ambos grupos que tienen pérdida de peso corporal significativa (5.5% y 5.6%, respectivamente) al finalizar el estudio.

El peso húmedo de la cápsula fibrosa es principalmente dirigido por el alcance de la angiogénesis inducida por el bFGF capturado en el AngioChambers™ y subsecuentemente por estimulación endógena VEGF. Una cápsula pequeña o fibrosa, ligera se correlaciona con grado pequeño de formación de vaso sanguíneo dentro, y por consiguiente inhibición mayor de angiogénesis mediante un tratamiento particular.

En este estudio, la formación de cápsula fibrosa de las cápsulas extraídas fue significativamente mayor en el grupo de control de vehículo con bFGF descargado en la cámara (grupo 2, control de inducción) que el grupo de control de vehículo sin bFGF descargado en la cámara (grupo 1 , control del punto de partida) (figura 21 ) que indica que el bFGF estimuló la formación de la cápsula de manera adecuada y significativa.

Ya que todos los grupos de tratamiento tenían bFGF descargado en la cámara, todas las comparaciones con el grupo de control de vehículo discutidas a continuación en la presente se refieren al control de inducción, grupo 2 (con bFGF descargado en la cámara).

La figura 21 muestra los resultados de la prueba para los grupos 1 -5. El grupo 1 es el control de vehículo (NMP:PEG300 (1 :9, v/v)) sin bFGF. El grupo 2 es el control de vehículo (N P:PEG300 (1 :9, v/v)), con bFGF. El grupo 3 es JBp1 *, con bFGF.

El grupo 4 es JBp1 -DCM*, con bFGF. El grupo 5 es Sorafenib, 60 mg/kg, con bFGF. El símbolo de referencia "a" significa diferente de manera significativa del control de inducción (control de vehículo bFGF (grupo 2)) (p<0.05: ANOVA de una vía). El símbolo de referencia "b" significa diferente de manera significativa de la monoterapia JBp1 (con bFGF) (grupo 3) (p<0.05: ANOVA de una vía). Todos los tratamientos se administraron una vez por día durante 5 días (día 0 a 4).

El tratamiento con JBp1 , JBp1 -DCM y Sorafenib (grupos 3, 4 y 5, respectivamente) resultaron en una reducción significativa en angiogénesis en comparación con el control de inducción (grupo 2), como se indica mediante la diferencia en el peso de la cápsula (figura 21 ). El tratamiento con JBp1 -DMC y Sorafenib (grupos 4 y 5, respectivamente) redujo de manera significativa la angiogénesis en comparación con la monoterapia JBp1 (grupo 3).

Las cámaras recolectadas de los ratones tratados con JBp1 solo (grupo 3) tenían más sangre libre en el espacio entre la cápsula fibrosa y la cámara que aquellos tratados con JBp1 -DCM (grupo 4). La cápsula fibrosa alrededor de las cámaras recolectadas de los ratones tratados con JBp1 -DCM (grupo 4) estaban más rígidas que las de los que se trataron con control de vehículo (sin y con bFGF; grupo 1 y 2, respectivamente).

Conclusión La eficacia angiogénica in wVo del tratamiento con JBp1 (tripsinógeno (0.13 mg/kg), quimiotripsinógeno (0.78 mg/kg) y a-amilasa (0.03 mg/kg)), administrado solo o en combinación con DCM (2-desoxiglucosa (30.55 mg/kg), capsiato (29.12 mg/kg) y metilselenocisteína (0.003 mg/kg)) se investigó en los ratones hembra FvB usando el ensayo v/VoPharm's AngioChamber™. El efecto de los artículos de prueba se comparó con aquel del compuesto de referencia, Sorafenib (60 mg/kg, p.o.).

En este estudio todos los tratamientos resultaron en inhibición significativa de angiogénesis inducida por bFGF en comparación con el control de inducción, como se indicó mediante los pesos húmedos de las cápsulas en el día de finalización del estudio. Tanto el compuesto de referencia, Sorafenib, como la combinación de JBp1 -DCM redujeron la angiogénesis en comparación con la monoterapia JBp1 . El JBp1 -DCM por consiguiente se mostró que era eficaz en la reducción de angiogénesis.

Ejemplo 3: Estudio in vitro de formulaciones de pro-enzima Se llevó a cabo un estudio para determinar el efecto de la formulación de pro-enzima que comprende tripsinógeno (pT), quimiotripsinógeno (pC) y a-amilasa (A) (formulación referida como JBpIvP) con agentes activos de metilselenocisteína (M), capsiato (C) o 2-desoxiglucosa (D). El estudio aplicó el método isobolográfico para entender la interacción entre estos componentes.

Resumen Las propiedades inhibitorias del crecimiento celular de estas formulaciones de pro-enzima se estudiaron. Con base en los valores IC50 y la inhibición de crecimiento máxima, las tres líneas celulares, A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2 se seleccionaron para los estudios de combinación usando el método isobolográfico. El uso de isobologramas permitió el estudio del nivel de interacción entre los tres componentes individuales y JBpI vP. Al estudiar la actividad de inhibición de crecimiento de los componentes individuales en combinación con cada uno y como mezclas con JBpI vP, se identificaron formulaciones mejoradas. Los resultados de estas formulaciones se muestran en las figuras 22A-24B, que proporcionan un análisis isobolográfico para JBpI vP y de manera individual M, C y D, respectivamente, en células HCT-15.

Ejemplo 4: Estudio in vitro de formulaciones que contienen 2-desoxiglucosa y metilselenocisteína Se llevó a cabo un estudio para determinar el efecto de una formulación que comprende metilcisteína (M) y 2-desoxiglucosa (D). El estudio aplicó el método isobolográfico para entender la interacción entre estos componentes.

Resumen Se estudiaron las propiedades inhibitorias del crecimiento celular de estas formulaciones de pro-enzima. Con base en los valores IC50 y la inhibición de crecimiento máxima, las tres líneas celulares, A-549, HCT-15 y MIAPaCa-2 se seleccionaron para los estudios de combinación usando el método isobolográfico. El uso de isobologramas permitió el estudio del nivel de interacción entre estos dos componentes. Se identificó una formulación mejorada al estudiar la actividad de inhibición de crecimiento de los componentes individuales y en combinación con cada uno. Los resultados de la formulación mejorada se muestran en las figuras 25A a 25B, lo que proporciona un análisis isobolográfico para la combinación de M y D, respectivamente, en células HCT-15.

Claims (32)

REIVINDICACIONES

1 . Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una pro-enzima de proteasa y un agente activo, la composición proporciona un enfoque multifuncional para tratar el cáncer, en donde la pro-enzima de proteasa se selecciona de al menos un de tripsinógeno y quimiotripsinógeno, y el agente activo se selecciona de al menos uno de un compuesto de selenio, un compuesto vanilloide y un agente reductor de glicólisis citoplásmica y opcionalmente una glucósido hidrolasa.

2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la pro-enzima proteasa es tripsinógeno y quimiotripsinógeno.

3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la relación de quimiotripsinógeno:tripsinógeno está en el rango de entre 4:1 a 8:1.

4. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la relación en peso de quimiotripsinógeno:tripsinógeno está en el rango de entre 5:1 a 7:1.

5. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la relación en peso de quimiotripsinógeno:tripsinógeno es 6:1 .

6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el compuesto de selenio es un compuesto de Fórmula I o Fórmula II: Fórmula I Fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde: FM y F¡3 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, OH, -C(0)H, -C(0)OH, -C(0)-OR5, (^alquilo y C2-6alquenilo, en donde C1-4alquilo y C2. 6alquenilo son opcionalmente sustituidos con 0-3 sustituyentes seleccionados de manera independiente a partir de halógeno, OH, -NH2, -C(0)OH, y -C(0)-ORs; R2 y R4 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, OH, -C(0)H, -C(0)OH, -C(0)-OR5, C^alquilo y C2.12alquenilo, en donde d^alquilo y C2.12alquenilo son interrumpidos de modo opcional con uno o más grupos seleccionados a partir de -NH-, -NKC^alquilo)-, -NH(CO)-, -C(O)-, -C(0)0-, -O- y -C(NH2)H-C(0)0, y opcionalmente sustituidos con 0-3 sustituyentes seleccionados de manera independiente a partir de halógeno, -NH2> -OH, -C^alquilo, -C(0)0H, -C(0)H, -C(0)-OR5, -?(? 4alquilo)H, -N(C1.4alquilo)2, -C(H2)H-C(0)OH, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo; y en donde R5 es seleccionado a partir de alquilo, alquenilo, cicloalquilo y cicloalquenilo.

7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque y R3 son cada una independientemente seleccionadas de H, OH y alquilo de C Jt.

8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque R2 y R4 son cada una independientemente seleccionadas de H, OH y alquilo de C,.6 -C(NH2)H-C(0)OH.

9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el compuesto de selenio es metilselenocisteína o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el compuesto de vanilloide es un compuesto de Fórmula III:' Formula III o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R1 y R2 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, OH, OCH3, C(0)H, OC2-6alquilo, OC2.alquenilo, SH, SC1-6alqu¡lo, NH2, NHC,.6alqu¡lo y (C^alquilofe; R3 y R4 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de H, d.^alquilo, C2.20alquenilo y C2.20alquinilo, en donde el C^oalquilo, C2.2oalquenilo y C2. 20alquinilo, son interrumpidos de manera opcional con uno o más grupos seleccionados a partir de -NR6-, -NH(CO)-, -C(O)-, -C(0)0-, -O-, -C(NR6R6)H-C(0)0-, -C(S)-, -C(S)NR6- y -N R6-C(S)-NR6, y sustituidos de modo opcional con 0-3 sustituyentes seleccionados de manera independiente a partir de halógeno, -NH2, -OH, -C1-4a!quilo, -C(0)OH, -C(0)OR5, -C(0)H, -N(C,.4alquilo)H, -N(C,.4alquilo)2, -C(H2)H-C(0)OH, -C(S)-, cicloalquilo opcionalmente sustituido, cicloalquenilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido; y en donde R5 es seleccionado a partir de alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, R6 es seleccionado a partir de H, C -6alquilo; y R3 y R4 se pueden unir para formar un anillo saturado o insaturado opcionalmente sustituido que tiene de 3 a 8 átomos de carbono en el anillo que incluye de 0 hasta 3 heteroátomos seleccionados a partir de O, S y N.

1 1. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque RT y R2 son seleccionados cada uno de manera independiente a partir de OH, C(0)H y OCH3, R3 es seleccionado a partir de H, C^oalquilo, C2-2oalquenilo y C2.20alqu¡n¡lo, en donde el C^oalquilo, C2.20alquenilo y C2.20alquinilo, son interrumpidos de manera opcional con uno o más grupos seleccionados a partir de -NR6-, -NH(CO)-, -C(O)-, -C(0)0-, -O-, -C(NR6R6)H-C(0)0-, -C(S)-, -C(S)NR6- y -NR6-C(S)-NR6, y sustituidos de modo opcional con 0-3 sustituyentes seleccionados de manera independiente a partir de halógeno, -NH2, -OH, -C,.4alquilo, -C(0)OH, -C(0)OR5, -C(0)H, -NKd^alquiloyH, -N(CV alquilo)2, -C(H2)H-C(0)OH, -C(S)-, cicloalquilo opcionalmente sustituido, cicloalquenilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido; y R4 es H.

12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque -C1-4alquilo-NH-C(0)-C1.,2alquenilo, -C,.4alqu¡lo-NH-C(0)-Ci. 12alquilo, -C^alquilo-O-C j-CM^Iquenilo, y -C1.4alqu¡lo-0-C(0)-Cl.12alquilo.

13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque le compuesto de vanilloide se selecciona de capsiato, principalmente de 4-hidroxi-3-metoxibencil (E)-8-metil-6-nonenoato

14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la glucósido hidrolasa es a-amilasa.

15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el agente reductor de glicólisis citoplásmica es 2-desoxi-D-glucosa.

16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el agente activo se selecciona de al menos uno de un grupo que consiste de metiiselenocisteína, capsiato, a-amilasa, y 2-desoxi-D-glucosa.

17. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el agente activo consiste de metiiselenocisteína, capsiato, a- amilasa y 2-desoxi-D-glucosa.

18. Una composición farmacéutica que comprende una primera y una segunda pro-enzima de proteasa susceptible a activación en o cerca de una superficie de una célula tumoral para mejorar la adhesión célula-a-célula de células tumorales, efectuar proteólisis de células tumorales, o inducir apoptosis de célula tumoral, diferenciación o inmunoreconocimiento, en donde la primera pro-enzima de proteasa es quimiotripsinógeno y la segunda pro-enzima de proteasa es tripsinógeno, y la relación en peso de qu¡m¡otripsinógeno:tripsinógeno está en el intervalo de entre 4:1 a 8:1.

19. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la relación en peso de quimiotripsinógenoitripsinógeno está en el intervalo de entre 5:1 a 7:1.

20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la relación de quimiotripsinógeno:tripsinógeno es 6:1.

21 . Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un primer y un segundo agente activo cada uno capaz de inducir actividad intracelular en células tumorales, en donde el primer agente activo es compuesto de selenio y el segundo agente activo es un agente reductor de glicólisis citoplásmica.

22. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada porque comprende además una pro-enzima proteasa seleccionada de al menos uno de tripsinógeno y quimiotripsinógeno.

23. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque comprende además un agente activo seleccionado de un compuesto vanilloide y una glucósido hidrolasa.

24. Un agente para tratar el cáncer, caracterizado porque el agente comprende una pro-enzima de proteasa y un agente activo, que juntos son capaces de proporcionar un enfoque multifuncional para tratar el cáncer, en donde la pro-enzima de proteasa y el agente activo se definen de conformidad con la reivindicación 1.

25. Uso de una pro-enzima de proteasa en la fabricación de un medicamento que comprende un agente activo para tratar el cáncer, en donde la pro-enzima de proteasa y el agente activo se definen de conformidad con la reivindicación 1 .

26. Uso de un agente activo en la fabricación de un medicamento que comprende una pro-enzima proteasa para tratar el cáncer, en donde la pro-enzima proteasa y el agente activo son de conformidad con la reivindicación 1 .

27. Uso de una pro-enzima proteasa y un agente activo en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer, en donde la pro-enzima proteasa y el agente activo se definen de conformidad con la reivindicación 1 .

28. Uso de una pro-enzima proteasa en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto que está siendo tratado con un agente activo, en donde el agente activo y la pro-enzima proteasa juntas son capaces de efectuar células tumorales, y opcionalmente en donde el agente activo es capaz de inducir actividad intracelular para mejorar el efecto de la pro-enzima proteasa, y en donde la proenzima proteasa y el agente activo se definen de conformidad con la reivindicación 1 .

29. Uso de un agente activo en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto que está siendo tratado con una pro-enzima proteasa, en donde el agente activo y la pro-enzima proteasa juntas son capaces de efectuar células tumorales, y opcionalmente en donde el agente activo es capaz de inducir actividad intracelular para mejorar el efecto de la pro-enzima proteasa, y en donde la pro-enzima proteasa y el agente activo se define de conformidad con la reivindicación 1.

30. Un método para tratar el cáncer caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una pro-enzima proteasa y un agente activo, en donde la pro-enzima proteasa y el agente activo son de conformidad con la reivindicación 1.

31. Un método para tratar el cáncer caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18.

32. Un supositorio caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1.