CZ283972B6 - Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory a jeho použití - Google Patents
Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory a jeho použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ283972B6 CZ283972B6 CZ951272A CZ127295A CZ283972B6 CZ 283972 B6 CZ283972 B6 CZ 283972B6 CZ 951272 A CZ951272 A CZ 951272A CZ 127295 A CZ127295 A CZ 127295A CZ 283972 B6 CZ283972 B6 CZ 283972B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- day
- mice
- total
- experiment
- mouse
- Prior art date
Links
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 25
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 55
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 41
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000018690 Trypsinogen Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108010027252 Trypsinogen Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000235 effect on cancer Effects 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 15
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 abstract description 4
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 abstract description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 abstract description 3
- 101800003414 Pro-elastase Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 86
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 59
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 55
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 21
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 11
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 6
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 5
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 5
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 3
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- PPQNQXQZIWHJRB-UHFFFAOYSA-N Methylcholanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC4=CC=C(C)C(CC5)=C4C5=C3C=CC2=C1 PPQNQXQZIWHJRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OMOVVBIIQSXZSZ-UHFFFAOYSA-N [6-(4-acetyloxy-5,9a-dimethyl-2,7-dioxo-4,5a,6,9-tetrahydro-3h-pyrano[3,4-b]oxepin-5-yl)-5-formyloxy-3-(furan-3-yl)-3a-methyl-7-methylidene-1a,2,3,4,5,6-hexahydroindeno[1,7a-b]oxiren-4-yl] 2-hydroxy-3-methylpentanoate Chemical compound CC12C(OC(=O)C(O)C(C)CC)C(OC=O)C(C3(C)C(CC(=O)OC4(C)COC(=O)CC43)OC(C)=O)C(=C)C32OC3CC1C=1C=COC=1 OMOVVBIIQSXZSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000003511 ectopic pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 2
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940122644 Chymotrypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710137926 Chymotrypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000055157 Complement C1 Inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 108700040183 Complement C1 Inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 102000010631 Kininogens Human genes 0.000 description 1
- 108010077861 Kininogens Proteins 0.000 description 1
- 108010093008 Kinins Proteins 0.000 description 1
- 102000002397 Kinins Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 102000032628 PAR-2 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010070503 PAR-2 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710082148 Trypsin alpha Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940009550 c1 esterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 101150047356 dec-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001173 gonocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000016412 positive regulation of cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010086836 trypsin drug combination papain chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005851 tumor immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4826—Trypsin (3.4.21.4) Chymotrypsin (3.4.21.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4853—Kallikrein (3.4.21.34 or 3.4.21.35)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/486—Elastase (3.4.21.36 or 3.4.21.37)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
- A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory obsahuje proenzymy proteáz ze skupiny trypsinogen, chymotrypsinogen, proelastáza, prekallikrein, a amylázy v poměru od 1:100 až 100:1 v jednotkách enzymatické aktivity, případně další komponenty jako je například inhibitor proteáz. Uvedený prostředek slouží k modulaci nádorového bujení u člověka nebo zvířat. Použití prostředku, který v sobě zahrnuje jeden nebo více proenzymů proteáz a amylázy k modulaci biologické odpovědi organismu na nádor a aplikuje se rektálně, intramuskulárně nebo subkutánně.
ŕ
Description
Vynález se týká enzymatických organopreparátů z proenzymú proteáz a amylázy, které jsou použitelné k farmakologickému ovlivnění odpovědi organizmu při jeho interakci se zhoubnými nádory. Tyto prostředky jsou využitelné v humánní a veterinární medicíně.
Dosavadní stav techniky
Současná onkologická terapie využívá především eradikačních metod typu chirurgie a aktinoterapie ve snaze o likvidaci nebo alespoň redukci primárního nádoru. Při tom se předpokládá, že zbývající, latentní nádorovou populaci zvládne přirozený imunitní dohled organizmu sám. Tento základní terapeutický přístup je modifikován adjuvantní a v poslední době i neadjuvantní formou chemoterapie. Užívaná terapeutická kombinace je pak kompromisem mezi žádoucím terapeutickým a nežádoucím imunosupresivním účinkem všech uvedených metod a samotným kancerogenním účinkem aktinoterapie i chemoterapie. Pro úplnost je nutno uvést ještě terapii hormony, která však metodicky spadá pod chemoterapii i s uvedenými nežádoucími, tj. imunosupresivními a kancerogenními účinky. Výsledný příznivý efekt uvedené kombinované léčby tak předpokládá výraznou imunotoleranci organizmu jak na probíhající onemocnění, tak na léčbu. Tato však není pravidlem ani častým úkazem. Navazující nebo současně probíhající terapeutická snaha o imunomodulaci imunoterapií zákonitě selhává díky pokročilosti onemocnění a tkáňového katabolismu. V soutěži o oprávněnou účast na onkologické terapii prodělává v současné době renesanci enzymová terapie, sahající svými historickými kořeny do první dekády našeho století /Beard, Chadto et Windus, London 1911/. Na něho navazují práce Freunda A Kaminera /Freund E., Kaminer G.. Springerverlag, Wien 1925; Freund E., Med. Wechr., 12, 1934/ a Christianiho /Christiani A., Krebeforsch., 1938, 47, 176/. Na teoretické a experimentální poznatky zmíněných autorů navázali později klinickými studiemi Wolf a Benitezová, Wolf a Ransberger /Wolf M., Ransberger K..: Enzymtherapie. Maudrich, Wien 1970/. Tito autoři prokázali selektivní onkolytický účinek živočišných a rostlinných hydroláz (proteáz) a účast enzymů různé provenience v potenciaci onkolytického účinku. Tito autoři zjistili též enterální resorpci hydroláz i glukosidáz (amyláz) a položili tak základ k perorální terapii známé řady WOBE-MUGOS. Systémová enzymoterapie je založena na klinickém využití experimentálně získaných dat o účincích aktivních proteáz. Jsou to: systémový protizánětlivý účinek a vliv na fibrinolýzu, stimulace tvorby cytokinů (TNF-alfa, II 2,6). stimulace aktivity polymorfonukleámích leukocytů a makrofágového systému. Z lokálních protinádorových účinků je to selektivní onkolytický vliv na omezení adhezivních molekul buněčných nádorových membrán a spolu se systémovou fibrinolytickou aktivitou zamezení tvorby metastáz. Pro úplnost je nutné se ještě zmínit o práci Yoneda a spol. /Yoneda T. a spol., Cancer Res. 1994, 54, 2509/, kteří podáním částečně purifikovaného extraktu vepřových pankreatů myším s lidským spinocelulámím kožním nádorem prokázali jeho pozitivní vliv na anorexii, ztrátu váhy, vývoj kachexie a dobu přežívání. Autoři účinný faktor pankreatu částečné purifikovali, aniž by definovali povahu účinné složky.
Při použití aktivních proteáz k terapii je nutno mít na zřeteli několik okolností, které účinek této terapie limitují:
a) Pankreatické proteázy jsou v krevním oběhu a intersticiálních prostorech rychle inaktivovány přítomnými polyvalentními inhibitory (alfal-inhibitorem proteáz, antitrombinem lil. Cl-inhibitorem a inhibitorem chymotrypsinu). Možnost disociace komplexu alfa2-Makroglobulin-proteáza v přítomnosti substrátu s velkou afintou pro proteázu byla prokázána pro mnohé proteolytické systémy (např. alfa2-MG-plasmin-fibrin), nicméně v systému alfa2-MG- 1 CZ 283972 B6 trypsin-receptor pro trypsin buněčné stěny nádorové buňky je dosud ve stadiu teoretických úvah. Za výhodou vazby inhibitor-proteáza lze považovat snížení antigenicity cizorodé proteázy v důsledku tvorby komplexu.
b) Trypsin-like proteázy podobně jako i další proteázy (např. lyzozomální katepsin B) mohou zvyšovat invazivnost nádorových buněk destrukcí přilehlých tkání hostitele. /Koivanen E., Int. J. Cancer 1991,47 (4), 592/
c) Trypsin může zasahovat do systému krevních proteáz, které jsou vzájemně propojeny aktivačními a inhibičními mechanismy (trypsin zasahuje do koagulačně-fibrinolytického systému nežádoucím způsobem, přímo uvolňuje kininy - mediátory zánětu a bolesti z plazmatických kininogenů, atd.).
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje
a) proenzymy proteáz a
b) amylázy v poměru od 1:100 až 100:1 v jednotkách enzymatické aktivity.
Jako proenzymy proteáz může obsahovat jednu nebo více složek ze skupiny, zahrnující
- trypsinogen
- chymotrypsinogen
- proelastázu a
- prekallikrein.
V prostředku podle vynálezu může být amyláza původu lidského, zvířecího, bakteriálního, eventuelně rostlinného, a proenzym proteáz může být původu lidského nebo zvířecího.
Farmaceutický prostředek může obsahovat jako další složku polyvalentní inhibitor proteáz, například aprotinin.
Konečně se vynález týká použití kombinace proenzymů proteáz a amyláz pro výrobu léčiv s modulačním účinkem na zhoubné nádory.
Teoretickým východiskem pro ovlivnění nádorových buněk je ryze biologický přístup ke kancerogenezi i snaze o ovlivnění nádorů. Maligní nádor je chápán jako ektopické těhotenství, vznikající z uvízlých primoridálních gonocytů v průběhu embryonální migrace do základu gonád. Toto ektopické těhotenství v nesprávném místě a stejným dílem i v opačném (samčím) pohlaví pozbývá tak zákonité regulačních mechanismů, které fyziologickému těhotenství náležejí. Jde především o regulační vliv embrya na trofoblast, který je pojímán jako analog maligních tumorů. Jako jedinečná fyziologická kvalita, existující v přírodě, trofoblast inaduje, metastázuje a nekonečně roste, pokud je embryo defektní, nebo když embryo chybí (molámí syndromy, komplikovaná molla nebo choriokarcinom). Bylo zjištěno, že v době ukončení organogeneze, v tzv. kritické periodě, embryo ovlivňuje a zastavuje proliferaci trofoblastu. Dochází k diferenciaci trofoblastu, vzniku syntitiotrofoblastu a vymizení do té doby překotných mitoz. Jestliže embryo chybí neboje malformované, k diferenciaci a ubrzdění trofoblastu nedochází.
-2 CZ 283972 B6
Vzniká tak již zmíněný choriokarcinom, který je chápán jako ideový model vzniku všech malignit. Ve snaze o ovlivnění a napodobení embryologické regulace bylo používáno embryonálních výtěžků, z nichž nejúčinnější byly pankreatické výtažky novorozených jehňat, telat a selat. Později bylo použito směsi dvou enzymů - trypsinu a amylázy. Dosáhlo se určitých výsledků v ovlivnění trofoblastu, avšak tato metoda nebyla vůbec reprodukovatelná. /Beard, Chadto et Windus, London 1911/.
Navrhovaný způsob podle vynálezu, tedy použití proenzymů proteáz, především trypsinogenu a amylázy, se vyznačuje proti dříve používané enzymoterapii několika znaky:
1. aplikace aktivních proteáz pro zmíněné účely je považována za nefyziologickou zátěž organismu, a
2. aplikace proenzymů proteáz, jako zdroje aktivní proteázy in šitu (tumoru), je fyziologičtější než aplikace aktivních proteáz.
3. Organizmus je v menší míře vystaven nebezpečí iniciace nežádoucích pochodů, jako je zásah do kallikrein-kinin-kininázového systému, aktivace koagulačního a fibrinolytického systému, vedoucí k diseminované intravaskulámí koagulaci, možnost napadení tkání aktivními proteázami (např. tlustého střeva) je při použití proenzymů proteáz zanedbatelná.
4. Interakce s inhibitory, spojená často s nevratnou inaktivaci proteázy a tvorba cirkulujících komplexů enzym-inhibitor je v případě použití proenzymů proteáz minimální.
Na základě více ukazatelů byl vytvořen model mechanizmu účinku, založený na předpokladu, že k aktivaci proenzymů na účinný enzym dochází na povrchu nádorové buňky účinkem aktivátorů, přítomných v maligní buňce a nepřítomných v buňce zdravé. Přítomnost těchto aktivátorů byla prokázána u řady různých nádorových buněk. Zmíněný předpoklad o mechanizmu účinků je podporován nálezem, že inhibitory proteáz jsou přítomny na buňkách benigních nádorů, nikoli však na buňkách maligních /Bohe H., Bohe M., Lindstrom M., Ohlsson K.., J. Clin. Pathol. 1990, 43, 901/. U vysoce nespecifické proteázy, jako je trypsin, je velká pravděpodobnost štěpení bílkovinných řetězců buněčné stěny v sousedství bazických aminokyselin argininu, lysinu a histidinu. Amyláza, která je nezbytnou součástí prostředku podle předloženého vynálezu, doplňuje účinek proteáz štěpením cukerné složky povrchových glykoproteinů maligní buňky. Proteázy tento účinek usnadňují.
Pochody aktivace a účinku proteáz se odehrávají na povrchu a v těsné blízkosti nádorové buňky . Vzhledem k intaktnosti proenzymů proteáz nebudou přispívat na zvýšení invazivity nádorové buňky jako aktivní proteázy.
Některé pokusy byly provedeny s vysoce purifikovanými enzymy (trypsinogenem a amylázou), a srovnáním s povahou pankreatických extraktů, používaných Yonedou a spol., je průkazné, že tyto fenomény nejsou totožné a nález japonských autorů nároky původců vynálezu nijak neomezuje. Použitím proenzymů na místě aktivních proteáz lze organizmu zajistit in vivo podmínky pro možnost uplatnění zásahu proteáz, pozorovaný in vitro (onkolýza, snížení počtu adhezivních molekul, zvýšení imunogennosti nádoru a potlačení tvorby metastáz). Účinek proteáz je přitom klíčový, účinek amylázy doplňující. Tímto způsobem lze organizmu připravit podmínky pro finální doléčení vlastním imunitním systémem. Z těchto příčin modulační zásah může být úspěšný jen nepředchází-li výrazná cytostatická a imunosupresivní léčba.
- j CZ 283972 B6
Příklady provedení vynálezu
Metody
Následující metody a materiály byly použity v příkladech uvedených níže, jestliže není jinak uvedeno.
Myši
Samičky myší C57B16 váhy cca 24 g byly umístěny v plastikových akváriích, krmeny dietou DOS 2b a napájeny vodou ad libitum.
Proenzymy proteáz a amyláza
Trypsinogen (EC 3.4.21.4) z hovězích pankreatu (SIGMA Co, USA) byl preparát vysoce purifikovaný (15000 BAEE (benzoyl-Arg-ethylester) jednotek/mg bílkoviny po aktivaci na trypsin a obsahující 430 BAEE jednotek/mg bílkoviny aktivního trypsinu).
Obsah bílkovin: 97 %.
Trypsinogen z vepřových pankreatů částečně purifikovaný byl připraven kyselou extrakcí a vysolováním sulfátem amonným. /Mansfeld a spol. Organopreparáty 1958/.
alfa-Amyláza (EC 3.2.1.1) z vepřových pankreatů (SIGMA Co, USA) byl vysoce purifikovaný enzym, 2x krystalizován, 790 jednotek/mg bílkoviny /E28O 1% roztoku/.
Extrakt pankreatických enzymů byl připraven z čerstvých vepřových pankreatů extrakcí fyziologickým roztokem a dále purifikován na karboxymetylcelulóze. Hlavními podíly byly trypsinogen a alfa-amyláza, jejichž poměr byl pro aplikaci na myších upravován přídavkem purifikovaného trypsinogenu nebo amylázy.
Všechny preparáty, určené pro aplikaci myším, byly rozpouštěny, respektive ředěny fyziologickým roztokem NaCl.
Definice aktivity proteáz a jejich proenzymů a metody jejich stanovení
Trypsinogen hovězí (SIGMA Co, USA) je výrobcem deklarován na základě BAEE jednotek (1 jednotka je definovaná jako A253 = 0,001/min s BAEE jako substrátem při pH 7,6 a 25 °C. reakční objem 3,2 ml, dráha paprsku 1 cm). Vlastní hodnocení aktivity trypsinogenu (trypsinu) bylo prováděno za použití syntetických chromogenních substrátů, které jsou peptidickou obdobou substrátů přirozených (-p-nitroanilidy). Hydrolýzou odštěpený p-nitroanilin je mírou aktivity a jeho množství je stanoveno spektrofotometricky při 405 nm/min a vyjádřeno v nkat/ml podle vztahu:
A 4(ΐ5 x V x ředění 1000 aRkat ” ^77 X 60 ’ kde V je objem směsi při měření, v je objem vzorku, e je extinkční molární koeficient (10,4) pro p-nitroanilin.
Teplota při stanovení 25 °C, pH 7,6 Tris-Ca pufru. Byl zjištěn vzájemný vztah obou způsobů určení aktivity a vyjádřen graficky. Obsah bílkovin byl stanoven spektorfotometricky (A280) a
-4CZ 283972 B6 specifická aktivita (stupeň čistoty) byl vyjádřen jako poměr mezi aktivitou a obsahem bílkovin. Tato hodnota plně charakterizuje preparát z hlediska relativní čistoty enzymu.
Trypsin byl stanoven pomocí Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilidu. Chymotrypsin byl stanoven pomocí Glt-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidu /-p-NA/. Elastáza byla stanovena pomocí GltAla-Ala-Ala-p-NA a kallikrein pomocí NO-Pro-Phe-Arg--p-NA. Aprotinin byl stanoven jako inhibitor trypsinu pomocí Z-Gly-Pro-Arg-p-NA.
Jelikož trypsinogen je základní složkou každého preparátu (kompozice) a aktivní trypsin aktivuje všechny ostatní pankreatické proenzymy proteáz, přítomné v preparátu, je jejich stanovení provedeno po aktivaci tryspinogenu enteropeptidázou. /Borgstrom A. a spol., Scand. J. Gastroenterol. 1993, 28 /5/, 455/
Definice aktivity amyláz a jejich metoda stanovení
Komerční alfa-amyláza (SIGMA Co, USA) je definována na základě uvolňování maltózy ze škrobu (1 jednotka uvolní 1 mg maltózy ze škrobu za 3 min při pH 6,9 a 20 °C). Amyláza (alfaamyláza) byla stanovena pomocí komerčního tabletového testu (Slovakofarma Hlohovec, SR), používaného pro stanovení alfa-amylázy v krevním séru a biologických tekutinách v klinických laboratořích. Tableta obsahuje síťovaný škrob s kovalentně vázanou barvou, aktivátor a pufr. Hydrolýzou nerozpustného barevného škrobu přechází tento do formy rozpustné a je stanoven spektrofotometricky při 620 nm a vyjádřen v nkat/ml, ev. nkat/mg. Závislost mezi absorbancí a aktivitou je odečítána z grafu. Postup je podle návodu výrobce.
Experimentálně byl zjištěn vztah mezi oběma způsoby vyjádření aktivity amylázy a vyjádřen graficky. Vysoce purifikovaná amyláza byla použita jako standard.
Indukce nádorů metylcholantrenem
Nádory byly u myší uměle vyvolány methylcholantrenem, který byl podáván rozpuštěný v olivovém oleji (100 ml metylcholantrenu se za stálého míchání rozpustí v 50 ml olivového oleje). Aplikován byl subkutánné v dávce 0,2 ml olejové substance na myš (tj. 400 mg metylcholantrenu na myš). Aplikace byla opakována 3 dny po sobě do stejného místa na pravém boku, každá myš obdržela tedy celkovou dávku 1,2 mg metylcholantrenu. Při aplikaci se první nádory objeví při subkutánním podání za 5 - 6 týdnů po aplikaci metylcholantrenu.
Vyvolání melanomu transplantací buněk melanomu B16
- namnožení nádorových buněk
Transplantované nádorové buňky byly namnoženy ve formě ascitu v břišní dutině. Desátý den po intraperitoneální transplantaci 2 x 106 nádorových buněk byl ascites odebrán do Henksova roztoku, buňky spočítány a naředěny na koncentraci 2 x 106 ascitických buněk na 0,2 ml suspenze.
-transplantace a rozvoj nádoru a metastáz
Suspenze v koncentraci 2 x 106 nádorových buněk na 0,2 ml suspenze ascitických buněk byla transplantována intradermálně na levý bok myši. Desátý den po transplantaci melanomu B16 byly myši uvedeny do pentobarbitalové narkózy a narostlé nádory vyoperovány. Desátý den pro excizi nádorů byl zvolen na základě předchozích pokusů, kdy byla testována metastatická aktivita melanomu B16 (při vynětí primárního nádoru desátý den po transplantaci ascitických buněk všechny myši uhynou v průběhu 5 týdnů na metastázy).
-5CZ 283972 B6
Příklad 1
Ovlivnění primárního nádoru a doby přežití
V rámci tohoto pokusu byla použita skupina myší, u kterých byl nádor indukován aplikací metylcholantrenu subkutánně v dávce 0,2 ml olejové směsi na myš, tj. 400 pg metylcholantrenu. Aplikace byla opakována po tři dny po sobě do stejného místa na pravém boku, takže každá myš obdržela celkovou dávku 1,2 pg metylcholantrenu. Nádory se objevily mezi 37. až 44. dnem po aplikaci metylcholantrenu. 45. den po první aplikaci metylcholantrenu byla skupina myší rozdělena do tří skupin léčených myši po deseti a jedné kontrolní skupině v počtu 8 myší. Kontrolní skupině byl aplikován fyziologický roztok na místo sledovaných kompozic ve stejných časových intervalech (24 hod.) a stejných objemech (0,1 ml).
Testovaná léčebná látka byla dodávána v zamraženém stavu jako substance označená A a B (specifikace viz níže). Obě látky byly těsně před podáním rozmraženy a smíchány v poměru 1:1. Testovaná látka byla aplikována pokusným myším subkutánně na místo co nej vzdálenější od indukovaného tumoru v dávce 0,1 ml na myš v časových intervalech 24 hodin. Kontrolní skupině byl aplikován fyziologický roztok ve stejném množství a stejných časových intervalech, jako u pokusných skupin.
V příkladu 1 bylo použito celkem 38 myší, které byly rozděleny do 4 skupin:
př. 1.1. 10 myší - aplikace směsi roztoků A+B v základním ředění. Látka A byla amyláza v koncentraci 133.3 jednotek SIGMA/ml, látka B byl trypsinogen v koncentraci 15000 ΒAEE jednotek/ml (792 nkat/Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilid) př. 1.2. 10 myší - aplikace směsi roztoků A+B v ředění lOx koncentrovanějším než základní.
př. 1.3. 10 myší - aplikace směsi roztoků A+B v ředění 30x koncentrovanějším než základní.
př. 1.4. 8 myší - kontrolní skupina, aplikován stejným způsobem a ve stejném objemu fyziologický roztok.
Dvakrát týdně byla měřena velikost nádorů. Přežívání myší bylo sledováno každý den po dobu 100 dní.
Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách a grafech:
Tab. 1: Růst nádorů, indukovaných metylcholantrenem, při aplikaci léčebných látek A+B a u kontrolní skupiny
| růst nádorů, indukovaných metylcholantrenem | ||||||||
| den | koncentrace aplikovaných látek A+B | kontrola | ||||||
| pokusu | př. 1 | 1 | př. 1.2 | př. 1.3 | př. 1.4 | |||
| N | v | N | v | N | V | N | V | |
| 1 | 9 (10) | 6,3 | 10 (10) | 10,8 | 7 (10) | 14,0 | 8 (8) | 10,5 |
| 5 | 10 (10) | 44,2 | 10 (10) | 39,1 | 10 (10) | 39,1 | 8 (8) | 34,5 |
| 8 | 10 (10) | 39,1 | 10 (10) | 33,9 | 10 (10) | 34,4 | 8 (8) | 62,9 |
| 12 | 10 (10) | 50,7 | 10 (10) | 47,6 | 9 (10) | 40,3 | 8 (8) | 67,4 |
| 15 | 10 (10) | 56.0 | 10 (10) | 43,8 | 8 (10) | 51,3 | 8 (8) | 80,3 |
| 17 | 10 (10) | 31,9 | 10 (10) | 23,9 | 8 (10) | 38,8 | 8 (8) | 87,1 |
| 19 | 10 (10) | 35,5 | 10 (10) | 40,6 | 8 (10) | 74,0 | 8 (8) | 80,8 |
| 22 | 10 (10) | 48,0 | 10 (10) | 66,2 | 8 (10) | 66,9 | 8 (8) | 98,6 |
-6CZ 283972 B6
Tabulka 1 - pokračování
| růst nádorů, indukovaných metylcholantrenem | ||||||||
| den | koncentrace aplikovaných látek A+B | kontrola | ||||||
| pokusu | př. 1 | 1 | př. 1.2 | př. 1.3 | př. 1.4 | |||
| N | V | N | V | N | v | N | V | |
| 26 | 10 (10) | 36,7 | 10 (10) | 57,9 | 8 (10) | 94,6 | 8 (8) | 88,5 |
| 29 | 10 (10) | 62,1 | 10 (10) | 50,3 | 8 (10) | 97,6 | 8 (8) | 106,0 |
| 33 | 10 (10) | 74,3 | 10 (10) | 63,5 | 8 (10) | 83,6 | 8 (8) | 114,6 |
| 36 | 10 (10) | 113,0 | 10 (10) | 105,1 | 8 (10) | 150,1 | 8 (8) | 184,0 |
| 40 | 10 (10) | 130,0 | 10 (10) | 148,6 | 8 (10) | 155,9 | 7 (7) | 174,0 |
| 43 | 10 (10) | 120,8 | 10 (10) | 108,2 | 7 (9) | 102,4 | 7 (7) | 201,1 |
| 47 | 10 (10) | 160,7 | 10 (10) | 168,8 | 6 (9) | 126,5 | 7 (7) | 253,1 |
| 50 | 10 (10) | 204,8 | 10 (10) | 196,3 | 6 (9) | 163,2 | 6 (6) | 365,0 |
| 54 | 8 (9) | 205,1 | 10 (10) | 277,6 | 6 (9) | 183,7 | 4 (5) | 388,3 |
| 57 | 8 (9) | 254,8 | 9 (9) | 276,7 | 6 (9) | 213,5 | 3 (4) | 251,3 |
| 61 | 7 (8) | 289,9 | 8 (8) | 328,0 | 6 (9) | 273,5 | 2 (3) | 328,0 |
| 64 | 7 (8) | 301,9 | 6 (7) | 424,3 | 7 (9) | 391,7 | 2 (3) | 332,0 |
| 68 | 6 (6) | 429,8 | 4 (4) | 471,0 | 6 (8) | 443,2 | 0 (0) | — |
| 71 | 4 (4) | 234,0 | 3 (3) | 337,7 | 6 (8) | 428,3 | 0 (0) | — |
| 75 | 4 (4) | 262,5 | 3 (3) | 384,7 | 4 (6) | 489,8 | 0 (0) | — |
| 78 | 4 (4) | 400,5 | 3 (3) | 461,3 | 2 (4) | 656,5 | 0 (0) | — |
| 82 | 3 (3) | 565,0 | 3 (3) | 494,3 | 3 (4) | 836,0 | 0 (0) | — |
| 85 | 3 (3) | 871,7 | 2 (2) | 963,0 | 2 (3) | 565,0 | 0 (0) | — |
| 89 | 3 (3) | 1232 | 1 (0 | 1575 | 2 (3) | 600,5 | 0 (0) | — |
| 92 | 2 (3) | 1567 | 0 (1) | - | 2 (3) | 727,5 | 0 (0) | — |
| 96 | 0 (0) | - | 0 (0) | - | 2 (3) | 790,0 | 0 (0) | — |
| 99 | 0 (0) | - | 0 (0) | - | 1 (2) | 110,0 | 0 (0) | — |
| celkem | 10 | 10 | 8 | 8 | ||||
| uhynulo | ||||||||
| celkem | 0 | 0 | 2 | 0 | ||||
| přežilo |
N V - průměrný objem nádoru x (y): x - počet měřitelných nádorů, y - počet myší ve skupině
Tab. 2: Úhyn myší s nádory, indukovanými metylcholantrenem
| den pokusu | úhyn myší s nádory, indukovanými metylcholantrenem | |||||||
| koncentrace aplikovaných látek A+B | kontrola př. 1.4 | |||||||
| př. 1.1 | př. 1.2 | př. 1.3 | ||||||
| N | % celkem | N | % celkem | N | % celkem | N | % celkem | |
| 40 | - | - | - | - | — | — | 1 | 12,5 |
| 43 | - | - | - | - | 1 | 10,0 | — | — |
| 54 | 1 | 10,0 | - | - | - | — | 2 | 37,5 |
| 57 | - | - | 1 | 10,0 | — | — | 1 | 50,0 |
| 61 | 1 | 20,0 | 1 | 20,0 | — | — | 1 | 62,5 |
| 64 | - | - | 1 | 30,0 | — | — | — | — |
| 65 | - | - | - | - | 1 | 20,0 | 1 | 75,0 |
Tabulka 2 - pokračování
| den pokusu | úhyn myší s nádory, indukovanými metylcholantrenem | |||||||
| koncentrace aplikovaných látek A+B | kontrola př. 1.4 | |||||||
| př. 1.1 | př- 1-2 | př. 1.3 | ||||||
| N | % celkem | N | % celkem | N | % celkem | N | % celkem | |
| 66 | 1 | 30,0 | 3 | 60,0 | - | — | 1 | 87,5 |
| 67 | 1 | 40,0 | - | - | - | - | 1 | 100,0 |
| 71 | 2 | 60,0 | 1 | 70,0 | - | — | ||
| 75 | - | - | - | — | 2 | 40,0 | ||
| 78 | - | — | - | - | 2 | 60,0 | ||
| 82 | 1 | 70,0 | - | — | — | |||
| 85 | - | - | 1 | 80,0 | 1 | 70,0 | ||
| 88 | - | 1 | 90,0 | — | — | |||
| 94 | 1 | 80,0 | — | — | — | — | ||
| 95 | 1 | 90,0 | - | — | — | |||
| 96 | 1 | 100,0 | 1 | 100,0 | — | |||
| 97 | 1 | 80,0 | ||||||
| uhynulo | 10 | 100,0 | 10 | 100,0 | 8 | 80,0 | 8 | 100,0 |
| přežilo | 0 | 0,0 | 0 | 0,0 | 2 | 20,0 | 0 | 0,0 |
Obr. 1. Grafické vyjádření tabulky 2.
Procento hynutí myší s induk. nádory
ředění 1 + ředění 2 -s- ředění 3 * kontroly
Metylcholantren byl aplikován subkutánně 50 myším, nádor byl indukován u 38, tj. u 76 %.
Aplikace byla provedena na myších, u kterých se objevily nádory mezi 37. - 44. dnem po
-8CZ 283972 B6 aplikaci první dávky metylcholantrenu. Myši s nádory byly náhodně rozděleny na 3 testované a 1 kontrolní skupinu. Průměrná velikost nádoru na začátku testu byla 10,4 mm'.
Příklad 1.1- účinek koncentrace 1 látek A+B
Skupinu tvořilo 10 myší. Ve srovnání s kontrolní skupinou byl růst nádorů opožděn (tab. 1). zatímco u kontrol průměrná velikost nádoru přesáhla hodnotu 100 29. den pokusu, u testované skupiny byla tato hodnota naměřena až 36. den, tj. se 7denním zpožděním. Průměrná hodnota velikosti nádoru 200 byla zjištěna 43. den u kontrolní a 50. den u pokusné skupiny - opět se 7denním zpožděním. Ještě významnější rozdíl než ve velikosti nádoru byl pozorován v přežívání myší pokusné a kontrolní skupiny (tab. 2). 57. den pokusu, kdy uhynulo 50% myší kontrolní skupiny, přežívalo 90 % myší pokusné skupiny. Všechny myši kontrolní skupiny uhynuly do 67. dne pokusu (pokusných myší přežívalo tento den ještě 60 %). Poslední myš s aplikací preparátu uhynula 96. den, tj. o 29 dní později.
Příklad 1.2 - účinek koncentrace 2 látek A+B
Skupinu tvořilo 10 myší. Ve srovnání s kontrolní skupinou byl růst nádorů opožděn (tab. 1). Zatímco u kontrol průměrná velikost nádoru přesáhla hodnotu 100 29. den pokusu, u pokusné skupiny byla tato hodnota naměřena až 36. den, tj. se 7denním zpožděním. Průměrná hodnota velikosti nádoru 200 byla zjištěna 43. den u kontrolní a 50. den u pokusné skupiny - opět se 7denním zpožděním. Koncentrace 2 léčebných látek A+B ovlivnila růst nádoru se stejným výsledkem, jako koncentrace 1.
Ještě významnější rozdíl než ve velikosti nádoru byl pozorován v přežívání myší pokusné a kontrolní skupiny (tab. 2). 57. den pokusu, kdy uhynulo 50 % myší kontrolní skupiny, přežívalo 90 % myší pokusné skupiny. Všechny myši kontrolní skupiny uhynuly do 67. dne pokusu (pokusných myší přežívalo tento den ještě 70 %). Poslední myš s aplikací preparátu uhynula 96. den, tj. o 29 dní později.
Příklad 1.3 - účinek koncentrace 3 látek A+B
Skupinu tvořilo 10 myší. Ve srovnání s kontrolní skupinou byl růst nádorů opožděn (tab. 1). Zatímco u kontrol průměrná velikost nádoru přesáhla hodnotu 100 29. den pokusu, u pokusné skupiny byla tato hodnota naměřena až 36. den, tj. se 7denním zpožděním. Průměrná hodnota velikosti nádoru 200” byla zjištěna 43. den u kontrolní a 57. den u pokusné skupiny - tj. se 14denním zpožděním.
Ještě významnější rozdíl než ve velikosti nádoru byl pozorován v přežívání myší pokusné a kontrolní skupiny (tab. 2). 57. den pokusu, kdy uhynulo 50 % myší kontrolní skupiny, přežívalo 90 % myší pokusné skupiny. Všechny myši kontrolní skupiny uhynuly do 67. den pokusu (pokusných myší přežívalo tento den ještě 80 %). 100 dní přežily 2 myši, tj. 20 % z celkového počtu sledovaných.
Ředění 3 léčebných látek A+B bylo nejúčinnější. Dvě myši byly vyléčeny úplně - u jedné došlo po 51 dnech k relapsu, druhá byla zdravá ještě 100. den, kdy bylo sledování pokusů ukončeno.
-9CZ 283972 B6
ZÁVĚR
Ze získaných výsledků vyplývá, že podávání testovaných látek A+B výrazně ovlivňuje přežití inbredních myší C57B16 s chemicky indukovnaým nádorem. Zatímco kontrolní myši zcela vyhynuly do 67. dne, z pokusné skupiny č. 3 (nejvyšší koncentrace podávané látky) přežívalo 20% myší déle než 100 dní. Vliv množství účinné látky je patrný ze srovnání výsledků jednotlivých skupin. Nejlepší výsledek prokazovala skupina s nejvyšším množstvím podané látky (př. 1.3).
Příklad 2
Ovlivnění vzniku a vývoje metastáz a doby přežití
Látky byly aplikovány na linii myší C57B16 a nádoru melanomu B16, který je pro danou linii syngenní (tzn., že neexistuje při transplantacích imunologická bariéra) a má vysokou metastatickou aktivitu.
Transplantované nádorové buňky byly namnoženy ve formě ascitu v břišní dutině. Desátý den po intraperitoneální transplantaci 2 x 106 nádorových buněk byl ascites odebrán do Hanksova roztoku, buňky spočítány a naředěny na koncentraci 2xl06 ascitických buněk na 0,2 ml suspenze. Suspenze ascitických buněk byla transplantována intradermálně na levý bok myši. Desátý den po transplantaci melanomu B16 byly myši uvedeny do pentobarbitalové narkózy a narostlé nádory vyoperovány. Desátý den pro excizi nádorů byl zvolen na základě předchozích pokusů, kdy byla testována metastatická aktivita melanomu B16 (při vynětí primárního nádoru desátý den po transplantaci ascitických buněk všechny myši uhynou v průběhu 5 týdnů v důsledku vzniku metastáz).
Testované látky byly skladovány v zamraženém stavu při -20 °C. Látky byly rozmraženy těsně před podáním a temperovány. Látky A a B (specifikace stejná jako v příkl. 1.1) byly smíchány v poměru 1:1, látka C (specifikace viz níže) byla podávána jako taková. Testované látky byly aplikovány pokusným myším subkutánně na místo co nej vzdálenější od primárního tumoru, v dávce 0,1 nebo 0,05 ml na myš v časových intervalech 24 nebo 48 hodin. Kontrolním skupinám byly aplikovány samotné látky A, B nebo fyziologický roztok ve stejném množství a stejných časových intervalech jako u pokusných skupin.
Přežívání myší bylo sledováno každý den po dobu 100 dní. Uhynulé myši byly označeny, uchovávány ve formalinu do provedení pitvy (stanovení příčiny exitu a průkazu metastáz).
Označení látky A i B je obdobné jako v příkladu 1. Látka C je částečně purifikovaný extrakt pankreatu. Jeho amylolytická aktivita a obsah trypsinogenu jsou stejné, jako ve směsi A+B. Mimo to obsahuje jisté množství chymotrypsinogenu.
Příklad 2.1
Pokusnou skupinu tvořilo 10 myší. Léčebná látka A+B byla aplikována subkutánně v množství 0,1 ml v časových intervalech 24 hodin. 22. den pokusu uhynuly 2 myši (20% z celkového počtu), 25. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu), 28. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu), 36. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu) a 42. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu). 100 dní přežily 4 myši, tj. 40 % z celkového počtu 10 sledovaných.
- 10CZ 283972 B6
Příklad 2.2
Pokusnou skupinu tvořilo 10 myší. Léčebná látka A+B byla aplikována subkutánně v množství 0,1 ml v časových intervalech 48 hodin. 22. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 34. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu), 38. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu) a 40. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu). 100 dní přežilo 6 myší, tj. 60 % z celkového počtu 10 sledovaných.
Příklad 2.3
Pokusnou skupinu tvořilo 10 myší. Léčebná látka A+B byla aplikována subkutánně v množství 0,05 ml v časových intervalech 48 hodin, 12. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 16. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu), 23. den pokusu uhynuly 2 myši (20 % z celkového počtu), 28. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu), 33. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 35. den uhynula 1 myš (10% z celkového počtu) a 39. den uhynula rovněž 1 myš (10 % z celkového počtu). 100 dní přežily 2 myší, tj. 20 % z celkového počtu 10 sledovaných.
Příklad 2.4 - základní kontrolní skupina
Kontrolní skupinu tvořilo 6 myší. Byl aplikován pouze samotný fyziologický roztok subkutánně v množství 0,1 ml v časových intervalech 48 hodin. 17. den pokusu uhynula 1 myš (16,6% z celkového počtu). 19. den pokusu uhynuly 2 myši (33,2 % z celkového počtu), 23., 29. a 34. den pokusu uhynula 1 myš (tj. pokaždé 16,6 % z celkového počtu), 100 dní nepřežila žádná myš, tj. uhynulo celých 100 % z celkového počtu 6 sledovaných.
Příklad 2.5 - první kontrolní skupina
Pokusnou skupinu tvořilo 10 myší. Byla aplikována pouze samotná látka A subkutánně v množství 0,05 ml v časových intervalech 48 hodin. 24. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 26. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 27. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 33. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 35. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu), 37. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu). 39. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu) a 47. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu). 100 dní přežily 2 myši, tj. 20 % z celkového počtu 10 sledovaných.
Příklad 2.6 - druhá kontrolní skupina
Pokusnou skupinu tvořilo 10 myší. Byla aplikována pouze samotná látka B subkutánně v množství 0,05 ml v časových intervalech 48 hodin. 23. den pokusu uhynuly 2 myši (20% z celkového počtu), 25. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 26. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 30. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 31. den uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu), 34. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu) a 50. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu). 100 dní přežily 2 myši, tj. 20 % z celkového počtu sledovaných.
- 11 CZ 283972 B6
Příklad 2.7
Pokusnou skupinu tvořilo 10 myší. Byla aplikována látka C subkutánně v množství 0,1 ml v časových intervalech 48 hodin. 36. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu), 38. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 42. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu) a 43. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu). 100 dní přežilo 6 myší, tj. 60 % z celkového počtu sledovaných.
Příklad 2.8 - třetí kontrolní skupina
Kontrolní skupinu tvořilo 14 myší. Byl aplikován pouze samotný fyziologický roztok subkutánně v množství 0,1 ml v časových intervalech 48 hodin. 5. den pokusu uhynula 1 myš (7,1 % z celkového počtu), 15. den pokusu uhynuly 2 myši (14,3 % z celkového počtu), 19. den pokusu uhynula 1 myš (7,1 % z celkového počtu), 20., 21., 22., 23., 27. a 29. den pokusu uhynulo po 1 myši (po 7,1 % z celkového počtu), 30. den pokusu uhynuly 2 myši (14,3 % z celkového počtu), a 31. a 32. den pokusu uhynula 1 myš (tj. pokaždé 7,1 % z celkového počtu), 100 dní nepřežila žádná myš, tj. uhynulo celkem 100 % z celkového počtu sledovaných.
Příklad 2.9 - kontrolní skupina
Kontrolní skupinu tvořilo 14 myší. Bylo sledováno pouze přežívání po excizi melanomu B16. Nádor byl vyoperován 10. den po intradermální transplantaci 2.106 ascitických buněk.
Přežívání myší viz tabulka č. 4.
100 dní nepřežila žádná myš, tj. 0 %.
Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 3 a 4.
Příklad 2.10
Účinek směsi, ve které komponenta B (trypsinogen) byla nahrazena koncentrátem, jehož hlavní složkou byl prekallikrein (trypsinogen-like, Bp) s menším podílem trypsinogenu.
Pro pokus byl použit koncentrát z vepřových pankreatů, jehož složení bylo definováno na základě hydrolýzy Tosyl-Arg-p-nitroanilinu a NO-Pro—Phe-Arg-p-nitroanilidu. Zatímco samotný trypsinogen (po aktivaci na trypsin) štěpí Tos-Arg-p-NA i NO-Pro-Phe-Arg-p-NA, aktivovaný prekallikrein (nejvýznamnější trypsinogen-like enzym pankreatu) štěpí pouze NOPro-Phe-Arg-p-NA.
Použitý koncentrát obsahoval 77 % prekallikreinu a 23 % trypsinogenu. Aktivita byla v relaci s aktivitou látky B.
Pokusnou skupinu tvořilo 10 myší. Léčebná látka A+Bp byla aplikována subkutánně, v množství 0,1 ml v časových intervalech 48 hodin. 26. den pokusu uhynula 1 myš (10% z celkového počtu), 31. den pokusu uhynula 1 myš (10 % z celkového počtu). V dalším pak 52., 55. a 60. den uhynula 1 myš (30% z celkového počtu). 100 dní přežilo 5 myší, tj. 50% z celkového počtu sledovaných myší.
- 12CZ 283972 B6
Tabulka 3: Výsledky příkladů 2.1 - 2.8
| příklad č. | počet myší | aplikovaná látka | exity | přežil 100 dní | % přežitých | |||
| typ | dávka (ml) | čas. int. (hod) | celkem | denpočet | ||||
| 2.1 | 10 | A+B | 0.1 | 24 | 6 | 22-2 25-1 28-1 36-1 42-1 | 4 | 40 |
| 2.2 | 10 | A+B | 0,1 | 48 | 4 | 22-1 34-1 38-1 40-1 | 6 | 60 |
| 2.3 | 10 | A+B | 0,05 | 48 | 8 | 12-1 16-1 23-2 28-1 33-1 35-1 39-1 | 2 | 20 |
| 2.4 | 6 | fyz. roztok | 0,1 | 48 | 6 | 17-1 19-2 23-1 29-1 35-1 | 0 | 0 |
| 2.5 | 10 | A | 0,05 | 48 | 8 | 24-1 26-1 27-1 33-1 35-1 37-1 39-1 47-1 | 2 | 20 |
| 2.6 | 10 | B | 0,05 | 48 | 8 | 23-2 25- 1 26- 1 30- 1 31- 1 34-1 50-1 | 2 | 20 |
| 2.7 | 10 | C | 0,1 | 48 | 4 | 36-1 38-1 42- 1 43- 1 | 6 | 60 |
| 2.8 | 14 | fyz. roztok | 0,1 | 48 | 14 | 5-1 15-2 19- 1 20- 1 21-1 22-1 23-1 | 0 | 0 |
- 13 CZ 283972 B6
Tabulka 3 - pokračování
| příklad č. | počet myší | aplikovaná lát | ca | exity | přežil 100 dní | % přežitých | ||
| typ | dávka (ml) | čas. int. (hod) | celkem | denpočet | ||||
| 27-1 29- 1 30- 2 31- 1 32- 1 |
Tab. 4: Úhyn kontrolních myší na metastázy po excizi primár. nádoru.
| den pokusu | počet ex | procento | |
| uhynulých | přežívajících | ||
| 5 | 1 | 7,14 | 92,86 |
| 15 | 2 | 21,43 | 78,57 |
| 19 | 1 | 28,57 | 71,43 |
| 20 | 1 | 35,71 | 64,29 |
| 21 | 1 | 42,86 | 57,14 |
| 22 | 1 | 50,00 | 50,00 |
| 23 | 1 | 57,14 | 42,86 |
| 27 | 1 | 64,29 | 35,71 |
| 29 | 1 | 71,43 | 28,57 |
| 30 | 2 | 85,71 | 14,29 |
| 31 | 1 | 92,86 | 7,14 |
| 32 | 1 | 100,00 | 0,00 |
| celkem z 14 myší ex | 14 | 100,00 | 0,00 |
ZÁVĚR
Z výsledků vyplývá, že látky A+B i látka C inhibují vznik metastáz melanomu B16. V případě kombinace látek A+B se ukázala jako vhodnější dávka 0,2 ml/20 g a časový interval 48 hodin, kdy přežilo 60% pokusných myší déle než 100 dní, zatímco kontrolní skupina 2.5 vyhynula na metastázy do 35. dne pokusu a druhá rozšířená kontrolní skupina 2.9 vyhynula do 32. dne pokusu.
Vzhledem k tomu, že melanom B16 je agresivní metastazující nádor na inbredních myších C57BU, jsou získané výsledky za použití amylázy + trypsinogenu a pankreatického extraktu pozitivní a látky jsou perspektivní pro svůj protinádorový efekt.
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory, vyznačující se t í m , že obsahujea) proenzym proteáz ab) amylázu v poměru 1:100 až 100:1 v jednotkách enzymatické aktivity, přičemž jako proenzym proteáz obsahuje jednu nebo více složek ze skupiny, zahrnující- trypsinogen- chymotiypsinogen- prekallikrein.
- 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že amyláza je původu lidského, zvířecího, bakteriálního nebo rostlinného.
- 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že proenzym proteáz je původu lidského nebo zvířecího.
- 4. Použití farmaceutického prostředku podle nároků 1 až 3 pro výrobu léčiv s modulačním účinkem na zhoubné nádory.
- 5. Použití farmaceutického prostředku podle nároků 1 až 3 pro výrobu léčiv s účinkem zvýšení imunogennosti zhoubného nádoru.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ951272A CZ283972B6 (cs) | 1995-05-17 | 1995-05-17 | Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory a jeho použití |
| CA002176771A CA2176771C (en) | 1995-05-17 | 1996-05-16 | Pharmaceutical preparation with modulatory effect on malign tumours and its usage |
| US08/649,184 US5858357A (en) | 1995-05-17 | 1996-05-17 | Pharmaceutical composition containing an isolated protease proenzyme, amylase, and aprotinin |
| EP96107917A EP0743070A3 (de) | 1995-05-17 | 1996-05-17 | Verwendung von Protease-Proenzymen und Amylasen als Wirkstoffe in pharmazeutischen Mitteln zur Krebstherapie sowie ihre Herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ951272A CZ283972B6 (cs) | 1995-05-17 | 1995-05-17 | Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory a jeho použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ127295A3 CZ127295A3 (en) | 1996-12-11 |
| CZ283972B6 true CZ283972B6 (cs) | 1998-07-15 |
Family
ID=5463046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ951272A CZ283972B6 (cs) | 1995-05-17 | 1995-05-17 | Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory a jeho použití |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5858357A (cs) |
| EP (1) | EP0743070A3 (cs) |
| CA (1) | CA2176771C (cs) |
| CZ (1) | CZ283972B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015070828A1 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Frantisek Trnka | Pharmaceutical composition containing a mixture of proenzymes and enzymes |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6642011B2 (en) * | 1998-04-15 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins |
| US6833373B1 (en) | 1998-12-23 | 2004-12-21 | G.D. Searle & Co. | Method of using an integrin antagonist and one or more antineoplastic agents as a combination therapy in the treatment of neoplasia |
| US6858598B1 (en) | 1998-12-23 | 2005-02-22 | G. D. Searle & Co. | Method of using a matrix metalloproteinase inhibitor and one or more antineoplastic agents as a combination therapy in the treatment of neoplasia |
| ES2178517B1 (es) * | 1999-05-31 | 2004-09-16 | Universidad De Salamanca | Procedimiento para el estudio de la activacion funcional de leucocitos, plaquetas y otras celulas. |
| AU2002246447A1 (en) * | 2002-03-22 | 2003-10-08 | Ramon Suarez Mendoza | Topical pathogenic-tissue-destroying liquid |
| US7153504B2 (en) * | 2004-07-30 | 2006-12-26 | Can Technologies, Inc. | Stabilized pancreas product |
| SG10201406651PA (en) | 2009-10-22 | 2014-11-27 | Propanc Pty Ltd | A pharmaceutical composition for treating cancer comprising trypsinogen and/orchymotrypsinogen and an active agent selected from a selenium compound, a vanilloid compoundand a cytoplasmic glycolysis reduction agent |
| MY196737A (en) * | 2015-11-12 | 2023-05-03 | Propanc Pty Ltd | Proenzyme composition |
| NZ744845A (en) * | 2016-01-29 | 2023-04-28 | Propanc Pty Ltd | Cancer treatment |
| EP3442564B1 (en) * | 2016-04-12 | 2023-12-06 | Propanc Pty Ltd | Composition of proenzymes for cancer treatment |
| US9943387B2 (en) | 2016-06-29 | 2018-04-17 | International Business Machines Corporation | Unmanned aerial vehicle-based system for livestock parasite amelioration |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3956483A (en) * | 1968-10-24 | 1976-05-11 | Wilson Pharmaceutical & Chemical Corporation | Preparing pancreatin |
| US4514388A (en) * | 1983-03-22 | 1985-04-30 | Psaledakis Nicholas G | Proteolytic enzymes in the zymogen form to treat sarcoma cells |
| JPH01186820A (ja) * | 1988-01-19 | 1989-07-26 | Teijin Ltd | 悪性腫瘍治療剤 |
| DE3830924A1 (de) * | 1988-09-12 | 1990-03-15 | Knoll Ag | Verwendung von fibrinolytika zur kombinationsbehandlung von tumoren |
| DE58909121D1 (de) * | 1989-10-06 | 1995-04-20 | Mucos Emulsions Gmbh | Katabolische Enzyme zur Induktion des Tumornekrose-Faktors (TNF). |
| AT402367B (de) * | 1990-10-11 | 1997-04-25 | Immuno Ag | Pharmazeutische zubereitung auf basis von lys-plasminogen |
-
1995
- 1995-05-17 CZ CZ951272A patent/CZ283972B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-05-16 CA CA002176771A patent/CA2176771C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-17 US US08/649,184 patent/US5858357A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-17 EP EP96107917A patent/EP0743070A3/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015070828A1 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Frantisek Trnka | Pharmaceutical composition containing a mixture of proenzymes and enzymes |
| US11185587B2 (en) | 2013-11-18 | 2021-11-30 | Frantisek Trnka | Pharmaceutical composition containing a mixture of proenzymes and enzymes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0743070A2 (de) | 1996-11-20 |
| US5858357A (en) | 1999-01-12 |
| EP0743070A3 (de) | 1998-03-11 |
| CZ127295A3 (en) | 1996-12-11 |
| CA2176771A1 (en) | 1996-11-18 |
| CA2176771C (en) | 2002-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5972636A (en) | ATP-dependent protease and use of inhibitors for same in the treatment of cachexia and muscle wasting | |
| Molan | Why honey is effective as a medicine: 2. The scientific explanation of its effects | |
| Kucukguven et al. | Matrix metalloproteinases as potential targets in the venous dilation associated with varicose veins | |
| AU748870B2 (en) | Method of inhibiting membrane-type matrix metalloproteinase | |
| Ohnishi et al. | Effects of urinary trypsin inhibitor on pancreatic enzymes and experimental acute pancreatitis | |
| CZ283972B6 (cs) | Farmaceutický prostředek s modulačním účinkem na zhoubné nádory a jeho použití | |
| US4514388A (en) | Proteolytic enzymes in the zymogen form to treat sarcoma cells | |
| Sylvén et al. | Studies on the histochemical “leucine aminopeptidase” reaction: IV. Chemical and histochemical characterization of the intracellular and stromal LNA reactions in solid tumor transplants | |
| KR20130050923A (ko) | 위 내성 효소 제약 조성물 | |
| Giraldi et al. | Lysosomal enzyme inhibitors and antimetastatic activity in the mouse | |
| Erdos et al. | Inactivation and potentiation of the effects of bradykinin | |
| Schmid et al. | Protease-antiprotease interactions and the rationale for therapeutic protease inhibitors | |
| ES2251953T3 (es) | Uso de desmopresina en la preparacion de un medicamento inhibidor de la diseminacion metastasica durante la cirugia del cancer. | |
| TW200305431A (en) | Thermolysin enzymatic wound debrider | |
| WO2018220537A1 (en) | Adjuvant supplement for oncological patients | |
| Leach et al. | Influence of chloroquine on diet-induced pancreatitis | |
| EP4101467A1 (en) | Agent for treating or preventing pancreatic fistula | |
| Karakiulakis et al. | Basement membrane collagen-degrading activity from a malignant tumor is inhibited by anthracycline antibiotics | |
| CN110496128B (zh) | 利培酮或帕潘立酮在制备治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的药物中的应用 | |
| US20250127845A1 (en) | Medicinal uses of oligopeptides in combination with an antiandrogen | |
| JPH04500961A (ja) | 膵炎を治療および／または予防するためのプロテアーゼインヒビターの使用法 | |
| RU2341282C2 (ru) | Фармацевтическая композиция, обладающая панкреатотропной активностью, и способ получения фармацевтической композиции | |
| WO2024144461A1 (en) | Serine protease inhibitory effects of health supplements in human cancerus cell lines | |
| SU1581321A1 (ru) | Ингибитор протеолиза | |
| Nagelschmidt et al. | Activity Patterns of Proteolytic Enzymes–Relationship to Neoplastic Events during Experimental Carcinogenesis and Preliminary Results from Colorectal Tumor Patients |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20000517 |