KR20120128124A - 트립시노겐 및/또는 키모트립시노겐 그리고 셀레늄 화합물, 바닐로이드 화합물 및 세포질 해당 저감제로부터 선택된 활성제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로테아제 효소전구체를 함유하는 약학 조성물 및 이것의 암 치료를 위한 용도에 일반적으로 관련된다. 상기 약학 조성물은 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 포함하는 조성물로 지향되고, 상기 조성물은 암 치료를 위한 다기능 접근법을 제공할 수 있다. 상기 약학 조성물은 종양 세포의 세포 대 세포 부착을 향상시키거나, 종양 세포의 단백질분해를 가져오거나, 종양 세포 아포프토시스, 분화 또는 면역인식을 유도하기 위해 종양 세포의 표면에서 또는 표면 근처에서 활성화 가능한 제1 및 제2 프로테아제 효소전구체를 포함하는 약학 조성물로 지향되고, 상기 제1 프로테아제 효소전구체는 키모트립시노겐이고 상기 제2 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐이다. 상기 약학 조성물은 종양 세포에서 세포 내 활동을 각각 유도할 수 있는 제1 및 제2 활성제를 포함하는 조성물로 또한 지향된다.

Description

트립시노겐 및/또는 키모트립시노겐 그리고 셀레늄 화합물, 바닐로이드 화합물 및 세포질 해당 저감제로부터 선택된 활성제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING CANCER COMPRISING TRYPSINOGEN AND/OR CHYMOTRYPSINOGEN AND AN ACTIVE AGENT SELECTED FROM A SELENIUM COMPOUND, A VANILLOID COMPOUND AND A CYTOPLASMIC GLYCOLYSIS REDUCTION AGENT}

본 발명은 프로테아제 효소전구체(protease proenzyme)를 함유하는 약학 조성물 및 이것의 암 치료를 위한 용도에 일반적으로 관련된다.

암 치료에 있어 프로테아제를 사용하는 아이디어는 100년 이상 되었다. 1905년 존 베어드(John Beard)는 가능한 암 치료로서 신선한 췌장 효소 추출물의 사용을 제안하였고 저센(Jersen)의 마우스 육종 모델(mouse sarcoma model)로 성공적인 실험을 수행했다. 마우스에 프로테아제 효소 트립신을 주입한 후, 종양의 퇴행이 관측되었다. 베어드가 얻은 결과는 그 당시 대단한 관심을 불러일으켰고, 양의 췌장으로부터 마련된 미가공(crude) 효소 추출물이 종양 진행을 줄이고 생존 기간을 연장하기 위해 인간 암 환자를 치료하는데 사용되었다.

좀더 최근에, 효소의 경구 투여는 췌장, 장, 직장 및 말기 골수종을 포함하는 암 범위에 걸쳐 좋은 생존율과 함께 환자가 잘 견디는 것으로 나타났다. 다량의 효소의 사용이 요구되는데, 소화를 통한 그리고 세르핀 같은 혈장 내 다른 효소 불활성물질로부터의 손실과 불활성화 때문이다.

효소전구체(효소의 불활성 전구체 형태)는 효소의 경구 투약에서 맞닥뜨리는 문제를 극복하기 위해 사용되어 왔다. 세린 프로테아제 억제제 트립신의 효소전구체인 트립시노겐을 포함하는 효소전구체 혼합물은 암종(carcinoma)을 치료하는데 유용한 것으로 나타났고 종양 세포의 표면에서 선택적으로 활성화되는 것으로 믿어진다 (Novak J and Trnka F, Proenzyme Therapy of Cancer, Anticancer Research, 25: 1157-1178, 2005; US 5,858,357). 트립신 작용의 메커니즘은 종양 세포의 단백질가수분해(proteolysis)에 의해 일어나는 것으로 믿어진다.

암 치료에 효과적인 개선된 효소전구체 조성물을 찾아내고 제공하는 필요성이 존재한다.

본 발명은 암 치료에 효과적인 개선된 효소전구체 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

첫 번째 양상(aspect)은 암 치료를 위한 다기능 접근법(multi-functional approach)을 제공할 수 있는, 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

두 번째 양상은 다음을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다:

종양 세포의 세포 대 세포 부착(cell-to-cell adhesion)을 향상시키거나, 종양 세포의 단백질가수분해를 가져오거나, 종양 세포 아포프토시스(apoptosis), 분화(differentiation) 또는 면역인식(immunorecognition)을 유도하기 위해 종양 세포의 표면에서 또는 표면 근처에서 활성화 가능한 프로테아제 효소전구체; 및

종양 세포에서 세포 내 활동(intracellular activity)을 유도할 수 있는 활성제.

두 번째 양상의 구현예에서, 상기 세포 내 활동은 종양 세포 아포프토시스, 면역인식 또는 분화이다.

첫 번째 및 두 번째 양상의 구현예에서, 약학 조성물은 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 포함하고, 상기 조성물은 암 치료를 위한 다기능 접근법을 제공할 수 있고, 여기서 상기 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐(trypsinogen) 및 키모트립시노겐(chymotrypsinogen) 중 적어도 하나로부터 선택되고, 상기 활성제는 셀레늄 화합물, 바닐로이드(vanilloid) 화합물 및 세포질 해당 저감제(cytoplasmic glycolysis reduction agent), 그리고 옵션으로(optionally) 글리코시드 가수분해효소(glycoside hydrolase) 중 적어도 하나로부터 선택된다. 추가 구현예에서, 상기 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐 및 키모트립시노겐이다.

세 번째 양상은 암 치료를 위한 작용제(agent) 또는 조성물을 제공하는 것이고, 상기 작용제는 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 포함하고, 이들은 함께 암 치료를 위한 다기능 접근법을 제공할 수 있다.

네 번째 양상은 암 치료를 위한 작용제 또는 조성물을 제공하는 것이고, 상기 작용제는 다음을 포함한다:

종양 세포의 세포 대 세포 부착을 향상시키거나, 종양 세포의 단백질가수분해를 가져오거나, 종양 세포 아포프토시스, 분화 또는 면역인식을 유도하기 위해 종양 세포의 표면에서 또는 표면 근처에서 활성화 가능한 프로테아제 효소전구체; 및

종양 세포에서 세포 내 활동을 유도할 수 있는 활성제.

다섯 번째 양상은 암 치료를 위한 활성제를 포함하는 약제(medicament)의 제조에 있어 프로테아제 효소전구체의 용도를 제공하는 것이다.

여섯 번째 양상은 암 치료를 위한 프로테아제 효소전구체를 포함하는 약제의 제조에 있어 활성제의 용도를 제공하는 것이다.

일곱 번째 양상은 암 치료를 위한 약제의 제조에 있어 프로테아제 효소전구체 및 활성제의 용도를 제공하는 것이다.

여덟 번째 양상은 활성제로 처리되고 있는 대상(subject)에서 암 치료를 위한 약제의 제조에 있어 프로테아제 효소전구체의 용도를 제공하는 것이고, 여기서 상기 활성제 및 프로테아제 효소전구체는 함께 종양 세포에 작용할 수 있고, 옵션으로 상기 활성제는 상기 프로테아제 효소전구체의 영향을 향상시키는 세포 내 활동을 유도할 수 있다.

아홉 번째 양상은 프로테아제 효소전구체로 처리되고 있는 대상에서 암을 치료하기 위한 약제 제조에 있어 활성제의 용도를 제공하는 것이고, 여기서 상기 활성제 및 프로테아제 효소전구체는 함께 종양 세포에 작용할 수 있고, 옵션으로 상기 활성제는 상기 프로테아제 효소전구체의 영향을 향상시키는 세포 내 활동을 유도할 수 있다.

열 번째 양상은 치료적으로 유효한 양의 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 대상에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공하는 것이다.

열 번째 양상의 구현예에서, 상기 방법은 프로테아제 효소전구체 및 활성제, 그리고 옵션으로 추가 활성제의 공동 투여(co-administration) 또는 순차 투여(sequential administration)를 포함한다. 공동 투여는 첫 번째 및 두 번째 양상의 약학 조성물을 포함하는 단일 약제의 투여, 또는 프로테아제 효소전구체 및 활성제, 그리고 옵션으로 추가 활성제를 각각 포함하는 별개 약제의 공동 투여를 포함할 수 있다. 순차 투여는 프로테아제 효소전구체, 활성제, 또는 추가 활성제를 임의의 순서로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 순차 및 공동 투여는 프로테아제 효소전구체, 활성제, 또는 추가 활성제의 서로 다른 루트의 투여를 포함할 수 있다.

열 번째 양상에 따른 방법은 각각 활성제 또는 프로테아제 효소전구체로 이미 별도로 처리되고 있는 대상에 프로테아제 효소전구체 또는 활성제의 투여를 포함할 수 있다.

열한 번째 양상은 프로테아제 효소전구체를 활성제와 혼합하여 첫 번째 및 두 번째 양상의 약학 조성물, 또는 이것의 제제(preparation) 또는 제형(formulation)을 조제하는 방법을 제공하는 것이다.

열한 번째 양상의 추가 구현예에서, 상기 방법은 첫 번째 및 두 번째 양상의 구현예에 따른 추가 활성제를 상기 프로테아제 효소전구체 및/또는 활성제와 혼합하는 것을 더 포함할 수 있다.

전술한 양상의 구현예에서, 프로테아제 효소전구체는 세린(serine) 프로테아제 효소전구체이다. 세린 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐, 키모트립시노겐, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 다른 구현예에서, 프로테아제 효소전구체는 제1 및 제2 프로테아제 효소전구체를 포함하고, 여기서 제1 프로테아제 효소전구체는 키모트립시노겐이고 제2 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐이고, 키모트립시노겐 대 트립시노겐의 중량비는 4:1 내지 8:1의 범위에 있다. 추가 구현예에서, 키모트립시노겐 대 트립시노겐의 중량비는 5:1 내지 7:1의 범위에 있다. 추가 구현예에서, 키모트립시노겐:트립시노겐 중량비는 6:1이다.

전술한 양상의 구현예에서, 상기 활성제는 셀레늄 화합물, 바닐로이드 화합물, 글리코시드 가수분해효소 및 세포질 해당 저감제로 이루어진 그룹의 적어도 하나로부터 선택된다. 예컨대, 상기 활성제는 셀레늄 화합물, 또는 셀레늄 화합물과 바닐로이드 화합물과 글리코시드 가수분해효소와 세포질 해당 저감제로 이루어진 조합물일 수 있다.

전술한 양상의 구현예에서, 약학 조성물은 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 포함하고, 상기 조성물은 암 치료를 위한 다기능 접근법을 제공할 수 있고, 여기서 상기 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐 및 키모트립시노겐 중 적어도 하나에서 선택되고, 상기 활성제는 셀레늄 화합물, 바닐로이드 화합물 및 세포질 해당 저감제, 그리고 옵션으로 글리코시드 가수분해효소로부터 선택된다.

전술한 양상의 추가 구현예에서, 상기 셀레늄 화합물은 몸에 의해 흡수될 수 있는 셀레늄의 생물학적으로 이용할 수 있는 소스(bioavailable source)를 혈장으로 또는 세포간액(inter-cellular fluids)으로 공급할 수 있다. 한 특정 구현예에서, 셀레늄 포함 화합물은 메틸셀레노시스테인(methylselenocysteine) 또는 이것의 약학적 허용 염이다.

전술한 양상의 한 구현예에서, 상기 글리코시드 가수분해효소는 아밀라아제, 예컨대 α-아밀라아제이다.

전술한 양상의 한 구현예에서, 상기 세포질 해당 저감제는 2-데옥시-D-글루코오스이다.

전술한 양상의 다른 구현예에서, 상기 바닐로이드 화합물은 캅시에이트(capsiate) 즉, 4-히드록시-3-메톡시벤질 (E)-8-메틸-6-노네노에이트(nonenoate), 디하이드로캅시에이트(dihydrocapsiate) 즉, 4-히드록시-3-메톡시벤질 8-메틸노나노에이트(methylnonanoate), 그리고 노르디히드록시캅시에이트(nordihydrocapsiate) 즉, 4-히드록시-3-메톡시벤질 7-메틸옥타노에이트(methyloctanoate)에서 선택된다. 바람직하게는 상기 바닐로이드 화합물은 캅시에이트이다.

전술한 양상의 한 구현예에서, 상기 활성제는 메틸셀레노시스테인, 캅시에이트, α-아밀라아제 및 2-데옥시-D-글루코오스로 이루어진 그룹의 적어도 하나에서 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 활성제는 메틸셀레노시스테인, 캅시에이트, α-아밀라아제 및 2-데옥시-D-글루코오스로 이루어진다.

열두 번째 양상은 종양 세포의 세포 대 세포 부착을 향상시키거나, 종양 세포의 단백질가수분해를 가져오거나, 종양 세포 아포프토시스, 분화 또는 면역인식을 유도하기 위해 종양 세포의 표면에서 또는 표면 근처에서 활성화 가능한 제1 및 제2 프로테아제 효소전구체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이고, 여기서 제1 프로테아제 효소전구체는 키모트립시노겐이고 제2 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐이고, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비는 4:1 내지 8:1의 범위에 있다.

열두 번째 양상의 한 구현예에서, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비는 5:1 내지 7:1의 범위에 있다. 다른 구현예에서, 키모트립시노겐 대 트립시노겐의 중량비는 6:1이다.

열두 번째 양상의 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 전술한 구현예 중 임의의 것에 규정된 것과 같은 활성제를 더 포함한다.

열세 번째 양상은 각각 종양 세포에서 세포 내 활동을 유도할 수 있는 제1 및 제2 활성제를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이고, 여기서 제1 활성제는 셀레늄 화합물이고 제2 활성제는 세포질 해당 저감제다.

열세 번째 양상의 구현예에서, 상기 세포 내 활동은 종양 세포 아포프토시스, 면역인식 또는 분화이다. 한 구현예에서, 상기 셀레늄 화합물은 전술한 구현예 중 임의의 것에 따라 규정된다. 바람직한 구현예에서, 셀레늄 화합물은 메틸셀레노시스테인이다. 다른 구현예에서, 상기 세포질 해당 저감제는 2-데옥시-D-글루코오스이다.

열세 번째 양상의 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 전술한 구현예 중 임의의 것에서 규정된 것과 같은 프로테아제 효소전구체를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 전술한 구현예 중 임의의 것에 규정된 것과 같은 바닐로이드 화합물 및 글리코시드 가수분해효소로부터 선택된 활성제를 더 포함한다.

열네 번째 양상은 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어 열두 번째 또는 열세 번째 양상에 따른 약학 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

열다섯 번째 양상은 열두 번째 또는 열세 번째 양상에 따른 치료적으로 유효한 양의 약학 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공하는 것이다.

전술한 양상의 약학 조성물, 프로테아제 효소전구체 또는 활성제는 약학적으로 허용 가능한 비히클(vehicle), 캐리어(carrier) 또는 희석제(diluent)에 제공될 수 있고, 하나 이상의 약학적 허용 부형제(excipient)를 포함할 수 있다.

전술한 양상의 추가 구현예에서, 상기 약학 조성물, 작용제, 용도, 또는 방법은 상기 프로테아제 효소전구체, 활성제 또는 약학 조성물의 효능을 향상시키거나 원하지 않은 부작용을 줄일 수 있는 하나 이상의 추가 활성제를 포함할 수 있다.

전술한 양상의 추가 구현예에서, 상기 약학 조성물, 프로테아제 효소전구체, 활성제, 그리고 옵션으로 추가 활성제는 함께, 별도로, 또는 임의의 조합으로, 좌약의 형태로 제공될 수 있다

본 발명은 명세서 전반에 걸쳐 설명되거나 인식될 수 있는 유리한 효과를 제공한다.

도 1A-D는 각각 Caco2, HEK293, OE33 및 Panc1 세포에 대한 세포 수 표준 곡선의 그래프를 나타내고, 광학밀도(optical density) 492nm이다.
도 2는 효소전구체 기준 제형(reference formulation) B로 처리된 OE33 세포의 현미경사진(photomicrograph)을 나타낸다.
도 3은 다양한 농도의 효소전구체 기준 제형 B로 처리된 OE33 세포의 그래프를 나타낸다.
도 4A-C는 각각 효소전구체 기준 제형 B, J 및 T로 각각 처리된 Panc1 세포의 그래프를 나타낸다.
도 5A-C는 각각 효소전구체 기준 제형 B, J 및 T로 각각 처리된 Caco2 세포의 그래프를 나타낸다.
도 6A 및 6B는 각각 효소전구체 기준 제형 J로 처리 후 OE33 세포에서 β-카테닌(catenin)의 상향조절(up-regulation)을 나타내는 현미경사진을 제공한다.
도 7A 및 7B는 각각 효소전구체 기준 제형 J로 처리 후 OE33 세포에서 E-카데린(cadherin)의 상향조절을 나타내는 현미경사진을 제공한다.
도 8A 및 8B는 각각 효소전구체 기준 제형 J로 처리 후 Panc1 세포에서 β-카테닌의 상향조절을 나타내는 현미경사진을 제공한다.
도 9A 및 9B는 각각 효소전구체 기준 제형 J로 처리 후 Panc1 세포에서 E-카데린의 상향조절을 나타내는 현미경사진을 제공한다.
도 10A 및 10B는 각각 효소전구체 기준 제형 J로 처리 후 Caco2 세포에서 E-카데린의 상향조절을 나타내는 현미경사진을 제공한다.
도 11A 및 11B는 각각 효소전구체 기준 제형 J로 처리 후 Caco2 세포에서 β-카테닌의 상향조절을 나타내는 현미경사진을 제공한다.
도 12는 효소전구체 기준 제형 T로 처리 후 Panc1 세포에서 β-카테닌 및 E-카데린의 상향조절을 나타내는 현미경사진을 제공한다.
도 13은 효소전구체 기준 제형 T로 처리 후 Caco2 세포에서 β-카테닌 및 E-카데린의 상향조절을 나타내는 현미경사진을 제공한다.
도 14는 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 JBp1vP 및 DCM에 대한 이소볼로그래픽 분석(isobolographic analysis)을 제공한다.
도 15는 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 트립시노겐 및 키모트립시노겐에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 16은 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 트립시노겐 및 α-아밀라아제에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 17은 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 18은 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 TA 및 키모트립시노겐에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 19는 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 CA 및 트립시노겐에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 20은 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 TC 및 α-아밀라아제에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 21은 섬유피막(fibrous capsule)으로 핏팅된(fitted) 마우스의 비교 in vivo 항혈관형성(anti-angiogenic) 연구에서 그룹 1 내지 5의 다양한 제형에 대한 평균 피막 중량(mean capsule weight)을 나타내는 막대그래프를 제공한다.
도 22A 및 22B는 HCT-15 세포에서 JBp1vP 및 메틸셀레노시스테인에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 23A 및 23B는 HCT-15 세포에서 JBp1vP 및 2-데옥시글루코오스에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 24A 및 24B는 HCT-15 세포에서 JBp1vP 및 캅시에이트에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.
도 25A 및 25B는 HCT-15 세포에서 2-데옥시글루코오스 및 메틸셀레노시스테인에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.

약어의 설명

실시예에서, 다음 약어로 참조될 것이다:

α-아밀라아제: A

ANOVA: 분산분석(analysis of variance)

Avg: 평균

Bfgf: 염기성 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor)

BSA: 소혈청알부민(bovine serum albumin)

BW: 체중

℃: 섭씨

C: 캅시에이트

Caco2: 인간 결장 선암(adenocarcinoma) 세포계(cell line)

키모트립시노겐: pC

DAvg: 평균체중의 변화

DCM: 2-데옥시글루코오스, 캅시에이트 및 메틸셀레노시스테인

D: 2-데옥시-D-글루코오스

F: 화씨

h: 시간

Hb: 헤모글로빈

i.p.: 복강 내(intraperitoneal)

IU: 국제 단위

JBp1: 트립시노겐, 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제를 포함하는 효소전구체 제형

JBp1vP: 트립시노겐, 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제(pC:pT:A)를 6:1:0.25 중량비로 포함하는 효소전구체 제형

JBp1- DCM: 트립시노겐, 키모트립시노겐, α-아밀라아제, 2-데옥시글루코오스, 캅시에이트 및 메틸셀레노시스테인을 포함하는 효소전구체 제형

Mn: 수평균 분자량

Mw: 중량평균 분자량

MW: 분자량

M: 메틸셀레노시스테인

MSeA: 메틸셀렌산(methylselenic acid)

MTD: 최대 감내 투여량(maximum tolerable dose)

NMP: N-메틸-2-피롤리돈

OE33: 식도 선암 세포계

Panc1: 인간 췌관 암종 세포계

PBS: 인산완충액(phosphate buffered saline)

PEG300: 폴리에틸렌 글리콜 300

p.o.: 경구(per os), (경구 위관영양(oral gavage))

RD: 권장 투여량

SeMeT: 셀레노메티오닌

SEM: 평균의 표준오차

SRB: 술포로다민 B 단백질-착색 분석(protein-staining assay)

트립시노겐: pT

Wt%: 중량 퍼센트

v/v: 용량에 대한 용량

상세한 설명

프로테아제 효소전구체 제형이 암을 치료하는데 있어 치료적 혜택을 제공하는 것을 나타내 왔을지라도, 암 세포 및 악성 종양에 대한 프로테아제 효소전구체의 작용 메커니즘은 당해 기술분야에서 완전히 이해되지 않는다. 따라서 본 출원인은 트립시노겐 및 키모트립시노겐을 포함하는 세린 프로테아제 효소전구체 제형으로 암 세포계를 치료하는 것과 연관된 효과 및 메커니즘의 조사를 착수했고, 이것은 세 가지의 다른 암 세포계(Panc1, Caco2 및 OE33)에 대한 조사를 포함하였다. 프로테아제 효소전구체가 Caco2 종양 세포의 분화(악성 세포의 악성이 아닌 세포로 가능한 전환)에 그리고 세 가지 세포계 모두에서 E-카데린 및 β-카테닌의 발현의 상향조절에 관련되었다는 놀라운 발견이 특별히 중요하였다.

본 출원인은 세린 프로테아제 효소전구체에 의한 전이 감소가 세포 대 세포 부착에 관련되는 E-카데린 및 β-카테닌 복합체의 발현 및 형성물의 상향조절이 원인인 것으로 믿는다. 증가된 세포 대 세포 부착의 필연적 결과는 전이에 있어 감소인데, 악성 세포가 원발성 종양(primary tumour)으로부터 누출 또는 탈출할 가능성이 더 적기 때문이다.

이러한 새로운 정보의 유용성을 이용하여, 본 발명자는 프로테아제 효소전구체를 암 치료에 있어 작용 연관성(working interrelationship)을 제공할 수 있는 하나 이상의 활성제와 조합(combination)하여 포함하는 제형을 조사하였다. 예컨대, 활성제는 E-카데린 및 β-카테닌의 발현에 관하여 종양 세포의 다른 기능에 작용함으로써 효소전구체에 개선된 암 치료 활동을 제공할 수 있고, 전체 결과는 전이 감소 및/또는 종양 세포의 아포프토시스, 면역인식 또는 분화 증가를 포함할 수 있는 향상된 치료를 제공한다. 다시 말하면, 첫 번째 및 두 번째 양상의 약학 조성물은 프로테아제 효소전구체를 활성제와 조합하여 제공하고, 상기 조합은 암 세포 또는 세포를 표적화 또는 치료하는 것에 대한 다세포 또는 다기능 접근법을 가능하게 한다. 예컨대, 효소전구체는 종양 세포의 표면 또는 표면 근처에서 활성화되어 세포 대 세포 부착 분자의 발현을 촉진하고 이에 의해 전이를 감소시키는 한편, 메틸셀레노시스테인 같은 별개의 활성제는 세포 내 수준에서 작동하여 전이 감소, 종양 세포의 분화 또는 사멸(예컨대, 괴사, 아포프토시스, 면역인식)을 도울 수 있다.

프로테아제 효소전구체(Protease Proenzymes)

효소전구체(치모겐(zymogen)으로도 알려짐)는 효소의 특이적 활동(specific activity)을 가지지 않는 효소의 전구체 형태이고, 따라서 효소의 불활성 형태로서 전형적으로 지시된다. 효소전구체는 요구될 때까지 불활성 상태로 유지되어, 원하지 않는 자리에서 효소 활동의 비특이적 효과가 방지되거나 축소된다. 효소전구체는 다른 효소에 의해 상응하는 효소로 활성화될 수 있고, 이것은 다중 효소의 작용 또는 자동 활성화(auto-activation)를 포함하는 활성화의 캐스케이드(cascade)를 초래한다. 효소전구체는 결과적으로 활성 효소에 의해 단백질가수분해를 겪는 암 세포에 의해 선택적으로 활성화되는 것으로 여겨진다.

여기서 사용되는 용어 “프로테아제 효소전구체”는 활성 프로테아제 효소로 제자리에(in situ) 활성화될 수 있는 프로테아제 효소의 전구체 형태를 의미한다. 프로테아제 효소전구체는 인간 또는 동물 기원일 수 있다. 프로테아제 효소는 단백질가수분해, E-카데린 및/또는 β-카테닌의 발현의 상향조절, 아포프토시스, 향상된 면역인식, 그리고 종양 세포 분화를 포함하는 하나 이상의 세포 효과를 제공하도록 작용할 수 있다. 프로테아제 효소는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트(aspartate) 프로테아제, 메탈로프로테아제(metalloprotease), 또는 글루타민산 프로테아제를 포함한다. 상기 프로테아제는 엔도펩티다아제(endopeptidase) 또는 엑소펩티다아제(exopeptidase)일 수 있다. 엔도펩티다아제(또는 엔도프로테이나아제)는, 분자의 단부에서 펩티드 결합을 파괴하는 엑소펩티다아제와 대조적으로, 비말단(non-terminal) 아미노산의 (즉, 분자 내의) 펩티드 결합을 파괴하는 단백질가수분해 펩티다아제이다.

한 구현예에서, 프로테아제 효소전구체는 효소 종류(class) 3.4의 펩티다아제로부터의 효소, 특히 효소 종류 3.4.21의 세린 엔도펩티다아제, 보다 특히 효소 종류 3.4.21.1로부터의 키모트립신, 효소 3.4.21.2로부터의 키모트립신 C 또는 효소 종류 3.4.21.4로부터의 트립신의 전구체이다 (국제생화학 및 분자생물학연맹(IUBMB)의 Nomenclature Committee의 분류에 따라 나뉜 종류임).

한 구현예에서, 프로테아제 효소전구체는 세린 프로테아제 효소전구체이다. 세린 프로테아제 효소전구체는 트립신 또는 키모트립신 타입 형태, 서브틸리신-타입, 알파/베타 가수분해효소, 그리고 신호 펩티다아제를 포함한다. 세린 프로테아제는 다음 세린 엔도펩티다아제를 포함할 수 있다: 키모트립신, 메트리딘(metridin), 트립신, 트롬빈, 응고 인자 Xa, 플라스민, 엔테로펩티다아제, 아크로신, α-리틱(lytic) 엔도펩티다아제, 글루타밀(glutamyl) 엔도펩티다아제, 카텝신 G, 응고 인자 VIIa, 응고 인자 IXa, 쿠쿠미신(cucumisin), 프로릴 올리고펩티다아제(prolyl oligopeptidase), 응고 인자 Xia, 브라키우란(brachyuran), 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인, 췌장 엘라스타아제, 백혈구 엘라스타아제, 응고 인자 XIIa, 키마아제, 활성 보체(activated complement) C1r, 활성 보체 C1s, 고전보체경로(classical-complement-pathway) C3/C5 전환효소, 보체 인자 I, 보체 인자 D, 교대적보체경로(alternative-complement-pathway) C3/C5 전환효소, 세레비신(cerevisin), 하이포더민(hypodermin) C, 리실(lysyl) 엔도펩티다아제, 엔도펩티다아제 La, γ-레닌, 베놈빈(venombin) AB, 류실(leucyl) 엔도펩티다아제, 트립타아제, 스쿠텔라린(scutelarin), 켁신(kexin), 서틸라이징(subtilising), 오리진(oryzin), 펩티다아제 K, 써모마이콜린(thermomycolin), 써미타아제(thermitase), 엔도펩티다아제 So, t-플라스미노젠 활성인자, 단백질 C (활성화됨), 췌장 엔도펩티다아제 E, 췌장 엘라스타아제 II, IgA-특이적 세린 엔도펩티다아제, u-플라스미노젠 활성인자, 베놈빈 A, 퓨린(furin), 마이엘로블라스틴(myeloblastin), 세메노겔라아제(semenogelase), 그란자임(granzyme) A, 그란자임 B, 스트렙토그리신(streptogrisin) A, 스트렙토그리신 B, 글루타밀 엔도펩티다아제 II, 올리고펩티다아제 B, 리뮐루스 응고 인자(limulus clotting factor) C, 리뮐루스 응고 인자 B, 리뮐루스 응고 효소, 억제물질 LexA, 신호 펩티다아제 I, 토가비린(togavirin), 플라비비린(flavivirin), 엔도펩티다아제 Clp, 프로단백질(proprotein) 전환효소 1, 프로단백질 전환효소 2, 뱀독 인자(snake venom factor) V 활성인자, 락토세핀(lactocepin), 어셈블링(assembling), 헤파시비린(hepacivirin), 스퍼모신(spermosin), 세돌리신(sedolisin), 잔쏘모날리신(xanthomonalisin), C-말단 가공 펩티다아제, 피사롤리신(physarolisin), 매넌-결합 렉틴-관련된(mannan-binding lectin-associated) 세린 프로테아제-2, 편능형 프로테아제, 헵신(hepsin), 펩티다아제 Do, HtrA2 펩티다아제, 마트립타아제(matriptase), C5a 펩티다아제, 아쿠알리신(aqualysin) 1, 자리(site)-1 프로테아제, 페스티바이러스 NS3 다단백질 펩티다아제, 말 아테리바이러스(equine arterivirus) 세린 펩티다아제, 전염성 췌장궤사증 비르나바이러스(birnavirus) Vp4 펩티다아제, SpoIVB 펩티다아제, 각질층 키모트립틱(chymotryptic) 효소, 칼리크레인 8, 칼리크레인 13, 오비덕틴(oviductin).

특정 구현예에서, 세린 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐, 키모트립시노겐, 또는 이들의 혼합물이다. 효소전구체 트립시노겐 및 키모트립시노겐은 키모트립신 종류 3.4.21.1 또는 3.4.21.2 또는 종류 3.4.21.4로부터의 트립신으로부터 선택된, 또는 다른 적당한 소스로부터 선택된 효소의 전구체일 수 있다. 이들 효소는 상업적으로 이용 가능하고 소(bovine) 또는 돼지(porcine) 기원일 수 있다.

키모트립시노겐은 타이로신, 트립토판, 페닐알라닌 및 류신인 아미노산에서 단백질을 우선적으로 분할하는 효소 키모트립신의 효소전구체 형태이다. 키모트립신은 키모트립신 A, 키모트립신 B (B1 및 B2 형태를 포함), 키모트립신 C, α-키마로프쓰(chymarophth), 아바자임(avazyme), 키마르(chymar), 키모테스트(chymotest), 엔제온(enzeon), 퀴마르(quimar), 퀴모트라아제(quimotrase), α-키마르, α-키모트립신 A, α-키모트립신으로 지시되거나 포함할 수 있다. 키모트립신 C는 돼지 키모트립시노겐 C 또는 프로카르복시펩티다아제(procarboxypeptidase) A의 소 서브유닛 II로부터 형성될 수 있고, 타이로신, 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 글루타민 및 아스파라긴인 아미노산에서 단백질을 우선적으로 분할한다. 키모트립시노겐은 키모트립시노겐 B1 및 키모트립시노겐 B2를 포함한다.

트립시노겐은 아르기닌 및 라이신(lycine)에서 단백질을 우선적으로 분할하는 트립신의 효소전구체 형태이다. 트립신은 α-트립신, β-트립신, 코쿠나아제, 파엔자임(parenzyme), 파엔자이몰(parenzymol), 트립타르(tryptar), 트리퓨어(trypure), 슈도트립신(pseudotrypsin), 트립타아제(tryptase), 트립셀림(tripcellim), 정자수용체 가수분해효소 β-트립신으로 지시되거나 포함할 수 있고, 한 펩티드 결합의 분할에 의해 트립시노겐으로부터 형성될 수 있다. 또한 펩티드 결합 분할은 α 및 다른 이소(iso)-형태를 생성한다. 다중 양이온 및 음이온 트립신은 많은 척추동물의 췌장으로부터 그리고 가재, 곤충 (코쿠나아제) 및 미생물(Streptomyces griseus)을 포함하는 더 낮은 종(lower species)으로부터 분리될 수 있다. 소화 동안 정상적인 절차에서, 불활성 트립시노겐은 장점막에 존재하는 엔테로펩티다아제에 의해 활성화되어 효소 트립신을 형성하고, 이것은 세린 프로테아제이고 염기성 아미노산/단백질의 카르복실 측에서 펩티드 결합을 분할하는 역할을 한다.

언급된 바와 같이, 효소전구체 형태는 제자리에 (예컨대, in vivo 또는 in vitro 활성화) 활성화되는 효소의 불활성화된 형태를 본질적으로 제공한다. 예컨대, 효소전구체의 활성화(활성 효소로 효소전구체의 전환)는 종양 세포의 표면과 접촉 시 일어날 수 있다. 효소전구체 트립시노겐 및 키모트립시노겐은 건강한 세포와 접촉 시가 아닌 종양 세포와 접촉 시 효소 트립신 및 키모트립신으로 선택적으로 활성화되는 것으로 믿어진다. 효소전구체의 사용은, 종양 세포의 목표 표적에 도달하기 전 효소의 불활성화 또는 원하지 않는 반응 같이, 활성 효소를 제자리에 제공하는 것과 관련된 문제를 감소시킨다.

종양 세포와 관련하여, 프로테아제 효소는 세포벽의 펩티드 사슬에 존재하는 아미드 결합을 분할함으로써 (단백질가수분해) 악성 세포의 세포벽을 분해하도록 행동할 수 있다. 비악성(non-malignant) 세포에 존재하고 세포벽을 분해하는데 있어 효소의 영향을 억제하거나 축소시키는 프로테아제 억제제는 악성 종양 세포에 존재하지 않는 것으로 또한 이해된다. 단백질가수분해 활동을 제공하는 것에 더하여, 프로테아제 효소전구체는 종양 세포에서 β-카테닌 및 E-카데린의 발현을 상향조절할 수 있다. 세포 대 세포 부착은 세포 표면에서 β-카테닌과 E-카데린 간의 결합 또는 복합체 형성에 의해 용이하게 되고, 따라서 β-카테닌과 E-카데린의 증가된 발현은 세포 대 세포 부착을 향상시키고 따라서 종양 세포의 전이를 줄인다. 프로테아제 효소전구체는 증가된 면역인식 또는 분화 같은 다른 세포 활동을 또한 제공할 수 있다.

활성제(Active Agents)

첫 번째 양상, 두 번째 양상, 열두 번째 양상 및 열세 번째 양상의 활성제는 암을 치료하거나 세포 내 활동을 축소시켜 종양 세포의 치료를 향상시키기 위한 것이다.

한 구현예에서 세포 내 활동은 종양 세포 아포프토시스, 괴사, 면역인식 또는 분화이다.

다기능 접근법과 관련하여, 한 구현예에서, 활성제는 암을 치료하는데 있어 프로테아제 효소전구체와 작용 연관성을 제공할 수 있다. 예컨대, 활성제는 E-카데린 및 β-카테닌의 발현과 관련되거나 관련되지 않을 수 있지만 전체 결과는 전이에 있어서 감소 및/또는 종양 세포의 아포프토시스, 면역인식 또는 분화에 있어서 증가 같은 향상된 치료를 제공하는 개선된 암 치료 활동을 제공할 수 있다. 활성제는 종양 세포의 전이 감소, 분열 또는 죽음(예컨대, 괴사, 아포프토시스, 면역인식)을 돕는 세포 내 수준에서 작동할 수 있다.

한 구현예에서, 활성제는 셀레늄 화합물, 바닐로이드 화합물 및 세포질 해당 저감제, 그리고 옵션으로 글리코시드 가수분해효소로 이루어진 그룹의 적어도 하나로부터 선택된다. 예컨대, 활성제는 셀레늄 화합물로 이루어질 수 있거나, 셀레늄 화합물, 바닐로이드 화합물, 글리코시드 가수분해효소 및 세포질 해당 저감제로 이루어진 활성제의 조합일 수 있다.

셀레늄 화합물(Selenium Compound)

한 구현예에서, 용어 “셀레늄 화합물”은 셀레늄의 생물학적으로 이용할 수 있는 소스를 제공할 수 있는 셀레늄을 함유하는 임의의 화합물을 의미한다. 셀레늄 화합물은 아셀렌산염, 셀렌산염을 함유하는 무기물 같은 무기 화합물, 그리고 메틸셀레노시스테인 같은 유기 화합물을 포함할 수 있다. 셀레늄 화합물은 식물 추출물로서 또는 상업적 합성으로부터 공급될 수 있다. 특정 구현예에서, 셀레늄 화합물은 혈장 또는 세포간액으로 몸에 의해 쉽게 흡수될 수 있는 셀레늄의 생물학적 이용 가능한 소스를 제공한다.

한 구현예에서, 용어 “셀레늄 화합물은” 셀레늄 화합물을 함유하는 2가(divalent) 또는 4가(tetravalent) 아미노산을 의미한다. 아미노산은 이소류신, 알라닌, 류신, 아스파라긴, 리신, 아스파테이트, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글루타메이트, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 프롤린, 세린, 타이로신, 아르기닌, 히스티딘으로부터 선택될 수 있다. 2가 또는 4가 셀레늄은 이들 아미노산에서 자연적으로 발생할 수 있는 황 또는 다른 2가 종에 대체하여 아미노산에 또한 존재할 수 있다.

한 구현예에서, 용어 “셀레늄 화합물”은 화학식 I의 2가 셀레늄 화합물 또는 화학식 II의 4가 셀레늄 화합물 또는 이것의 약학적 허용 염을 함유하는 화합물을 의미한다:

R₁ 및 R₃는 각각 H, OH, -C(O)H, -C(O)OH, -C(O)-OR₅, C_1-4알킬 및 C_2-6알케닐로부터 독립적으로 선택됨, 여기서 C_1-4알킬 및 C_2-6알케닐은 할로겐, OH, -NH₂, -C(O)OH, -C(O)-OR₅으로부터 독립적으로 선택된 0-3 치환기로 옵션으로(optionally) 치환됨;

R₂ 및 R₄는 각각 H, OH, -C(O)H, -C(O)OH, -C(O)-OR₅, C_1-12알킬 및 C_2-12알케닐로부터 독립적으로 선택됨, 여기서 C_1-12알킬 및 C_2-12알케닐은 -NH-, -N(C_1-4알킬)-, -NH(CO)-, C(O)-, -C(O)O-, -O- 및 -C(NH₂)H-C(O)O-으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 옵션으로 중단되고(interrupted), 할로겐, -NH₂, -OH, -C_1-4알킬, -C(O)OH, -C(O)H, -C(O)-OR₅, -N(C_1-4알킬)H, -N(C_1-4알킬)₂, -C(NH₂)H-C(O)OH, 시클로알킬, 시클로알케닐 및 아릴로부터 독립적으로 선택된 0-3 치환기로 옵션으로 치환됨; 및

R₅는 알킬, 알케닐, 시클로알킬 및 시클로알케닐, 특히 C_1-12알킬로부터 선택됨.

상기 구현예에서, 다음이 인식될 것이다:

C_1-4알킬 및 C_1-12알킬은 곧은(straight), 분기(branched) 또는 시클로 알킬 사슬, 또는 이들의 조합을 의미하고; 및

C_2-6알케닐 및 C_2-12알케닐은 곧은, 분기 또는 시클로 알케닐 사슬, 또는 이들의 조합을 의미한다.

특정 구현예에서 R₁ 및 R₃는 각각 H, OH 및 C_1-4알킬로부터 독립적으로 선택되고, 보다 특히 메틸이다.

다른 특정 구현예에서, R₂ 및 R₄는 각각 H, OH 및 -C_1-6알킬-C(NH₂)H-C(O)OH로부터 독립적으로 선택되고, 보다 특히 -C_1-3알킬-C(NH₂)H-C(O)OH이다.

다른 구현예에서, 셀레늄 화합물은 메틸셀레노시스테인, 메틸셀레놀(methylselenol) 및 메틸셀레니닉 산(methylseleninic acid), 또는 이들의 약학적 허용 염 또는 혼합물로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 셀레늄 화합물은 메틸셀레노시스테인 또는 이것의 약학적 허용 염이다.

셀레늄 화합물은 암 치료에 대한 작용 연관성 또는 다기능 접근법을 제공함으로써 프로테아제 효소전구체의 치료 효능을 향상시키도록 선택된다. 예컨대, 셀레늄 화합물은 종양 세포 아포프토시스, 면역인식 및/또는 분화에 의해 종양 세포의 치료를 향상시키는 세포 내 활동을 유도할 수 있다.

셀레늄 섭취와 암 사이의 연관성은 수십 년간 알려져 왔다. 셀레늄은 55 마이크로그램의 권장식사허용량(RDA)을 가진 필수 미량 무기물이다. 셀레늄은 산화방지제 글루타티온 페록시다아제, 대사 효소(metabolic enzyme) 티오레독신 환원효소, 그리고 갑상선 호르몬 활성화 효소 요오드티로닌 디이오디나아제(deiodinase) 같은 여러 열쇠(key) 효소를 활성화하기 위해 필수적이다. 셀레늄은 세포 및 간 산화방지제 활동(글루타티온 페록시다아제)의 향상을 통해 또는 환경 발암물질(글루타티온 S-전이효소)의 제거 촉진을 통해 항암 보호를 제공하는 것으로 고려되어 왔다. 셀레노메티오닌 같은 셀레늄의 유기 형태는 하루 약 3500 마이크로그램의 수준에서 유독할 수 있지만, 아셀렌산/셀렌산나트륨(sodium selenite/selenate) 같은 셀레늄의 무기 형태는 약 1500 마이크로그램에서 유독할 수 있다. 암 치료 프로토콜은 일일 약 900 내지 2,000 mcg 셀레늄 범위로 처리할 수 있을지라도, 셀레늄은 약 400 mcg/일 수준에서 투여하는 것이 장기적으로 안전하다.

몇몇 셀레늄 항암 효과는 잠재적으로 유독한 투여량(potentially toxic dose) 수준에 가까운 투여량에서 일어나는 것으로 나타나 왔지만, 셀렌단백질 효소는 최적 항암 투여량을 훨씬 밑도는, 하루에 단지 90 mcg 셀레늄의 식이섭취에서 전형적으로 포화된다 (활동 극대화된다).

아셀렌산염/셀렌산염 같은 무기 형태는 셀레노메티오닌 같은 전형적인 무기 형태보다 암을 치료하는데 보다 효과적인 것으로 나타나 왔다. 아셀렌산염/셀렌산염 형태는 암 세포와 건강한 세포 모두에 유독하고 (아포프토시스와는 대조적으로) 괴사의 보다 덜 선택적이고 보다 더 침습성인 메커니즘을 통해 동작하는 셀렌화수소로 대사된다(metabolized). 셀레노메티오닌은 보다 덜 유독하지만 항암 활동을 가지지 않는 일반 신체 단백질로 대체로 편입된다.

메틸셀레노시스테인(Se-메틸셀레노시스테인으로 또한 알려짐)은 세포 주기 진행 및 전암 상태의 유방 병변(remalignant mammary lesions)의 확산을 저지하고, 매우 낮은 유독성과 신체 축적으로 암 세포계의 아포프토시스를 유도하는 화학방지 작용제(chemopreventive agent)이다. 메틸셀레노시스테인은 고 셀레늄 토양에서 성장한 마늘, 야생 부추, 양파 및 브로콜리를 포함하는 여러 식물에서 자연적으로 형성되고, 메틸셀레노시스테인 풍부 식품은 과도한 조직 축적이나 유독성 없이 좋은 항암 활동을 나타낸다. 메틸셀레노시스테인은 베타-리아제 효소에 의해 메틸셀레놀로 전환된다. 종양 세포에 대한 활동과 관련하여, 메틸셀레놀은 혈관형성(angiogenesis)을 저해하고 아포프토시스를 유발하지만 낮은 유독성을 갖고 신체에 의해 쉽게 제거되는 것으로 알려진다.

다음은 여러 셀레늄 화합물의 화학 구조이다:

상기 구현예에 따른 셀레늄 화합물은 모든 약학적 허용 염, 수화물, 용매 화합물, 결정형, 부분입체이성질체, 형태이성질체 (예컨대, cis 및 trans 이성질체), 호변체, 프로드러그, 대사산물, 그리고 이들의 거울상이성질체(enantiomeric) 형태를 포함할 수 있다.

바닐로이드 화합물(Vanilloid Compound)

한 구현예에서, 용어 “바닐로이드 화합물”은 바닐린(vanillyl) 또는 바닐로일(vanilloyl) 타입 모이어티(moiety) 또는 파마코어(pharmacore)를 함유하는 임의의 화합물을 의미한다. 바닐로이드 화합물은 레진파라노이드(resiniferanoids), 캅사이시노이드(capsaicinoids), 불포화 디알데히드 및 트리프레닐 페놀(triprenyl phenols) 같은 자연적으로 발생하는 바닐로이드의 알려진 화학물질 종류를 포함한다. 예컨대, 이들 알려진 화학물질 종류로부터의 화합물은 레지니페라톡신(resiniferatoxin), 캅사이신, 이소벨레랄(isovelleral) 및 스쿠티게랄(scutigeral)을 각각 포함한다. 다른 바닐로이드 화합물의 예는 바닐린, 바닐산, 노니바미드(nonivamide), 올바닐(olvanil), 디히드로캅사이신 및 바닐만델산을 포함한다. 바닐로이드 화합물은 캅사이신 같은 자연적으로 얻어진 화합물 또는 캅사제핀(capsazepine) 같은 반합성 또는 합성 바닐로이드를 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 용어 “바닐로이드 화합물”은 일반식 III의 화합물 또는 이것의 약학적 허용 염을 의미한다:

R₁ 및 R₂는 각각 H, OH, OCH₃, C(O)H, OC_2-6알킬, OC_2-6알케닐, SH, SC_1-6알킬, NH₂, NHC_1-6알킬 및 N(C_1-6알킬)₂로부터 독립적으로 선택됨;

R₃ 및 R₄는 각각 H, C_1-20알킬, C_2-20알케닐 및 C_2-20알키닐로부터 독립적으로 선택됨, 여기서 C_1-20알킬, C_2-20알케닐 및 C_2-20알키닐은 -NR₆-, -NH(CO)-, C(O)-, -C(O)O-, -O-, -C(NR₆R₆)H-C(O)O-, -C(S)-, -C(S)NR₆- 및 -NR₆-C(S)-NR₆으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 옵션으로 중단되고, 할로겐, -NH₂, -OH, -C_1-4알킬, -C(O)OH, -C(O)OR₅, -C(O)H, -N(C_1-4알킬)H, -N(C_1-4알킬)₂, -C(NH₂)H-C(O)OH, -C(S)-, 옵션으로 치환된 시클로알킬, 옵션으로 치환된 시클로알케닐 및 옵션으로 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택된 0-3 치환기로 옵션으로 치환됨; 및

R₅는 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐로부터 선택되고, 특히 C_1-12알킬임; R₆는 H, C_1-6알킬로부터 선택됨; 그리고 R₃ 및 R₄는 O, S 및 N으로부터 선택된 0 내지 3 헤테로 원자를 포함하는 고리에서 3 내지 8 탄소 원자를 가진 옵션으로 치환된 불포화 또는 포화 고리를 형성하도록 연결될 수 있음.

상기 구현예에서 다음이 인식될 것이다:

C_2-6알킬 및 C_1-20알킬은 곧은, 분기 또는 시클로 알킬 사슬, 또는 이들의 조합을 의미한다;

C_2-6알케닐 및 C_2-20알케닐은 곧은, 분기 또는 시클로 알케닐 사슬, 또는 이들의 조합을 의미한다;

C_2-20알키닐은 곧은, 분기 또는 시클로 알키닐 사슬, 또는 이들의 조합을 의미한다;

옵션으로 치환된 시클로알킬, 옵션으로 치환된 알킬시클로알케닐 및 옵션으로 치환된 아릴은 할로겐, -NH₂, -OH, -C_1-4알킬, -C(O), -C(O)OH, -C(O)OR₅, -C(O)H, -N(C_1-4알킬)H, -N(C_1-4알킬)₂, -C(NH₂)H-C(O)OH, 시클로알킬, 시클로알케닐 및 아릴로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 옵션 치환(optional substitution)을 의미하고, 예컨대 레지니페라톡신을 포함한다.

특정 구현예에서, R₁ 및 R₂는 각각 OH, C(O)H 및 OCH₃로부터 독립적으로 선택되고, 보다 특히 OH 및 OCH₃이다.

다른 특정 구현예에서 R₃는 -C_1-4알킬-NH-C(O)-C_1-12알케닐, -C_1-4알킬-NH-C(O)-C_1-12알킬로부터 선택되고, 보다 특히 -CH₂-NH-C(O)-C₄H₈-CH=CH-CH(CH₃)CH₃이다. 이 구현예에서 알킬 또는 알케닐 사슬은 곧은 또는 분기일 수 있다는 것이 인식될 것이다.

다른 특정 구현예에서 R₃는 -C_1-4알킬-O-C(O)-C_1-12알케닐, -C_1-4알킬-O-C(O)-C_1-12알킬로부터 선택되고, 보다 특히 -CH₂-O-C(O)-C₄H₈-CH=CH-CH(CH₃)CH₃이다. 이 구현예에서 알킬 또는 알케닐 사슬은 곧은 또는 분기일 수 있다는 것이 인식될 것이다.

다른 특정 구현예에서 R₄는 H이다.

바닐로이드 화합물은 캅사이신, 디하이드로캅사이신 및 노르디하이드로캅사이신(nordihydrocapsaicin)으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 바닐로이드 화합물은 캅시에이트, 디하이드로캅시에이트 및 노르디하이드로캅시에이트로부터 선택된다. 한 구현예에서, 바닐로이드 화합물은 캅시에이트이다. 캅시에이트, 디하이드로캅시에이트 및 노르디하이드로캅시에이트는 예컨대 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9%의 순도를 가진, 캅사이신이 실질적으로 없는 형태로 바람직하게 제공된다. 칠리로부터 전형적으로 얻어지는 캅시에이트는 소량의 캅사이신 및 다른 구조적으로 유사한 화합물을 보통 함유하는 것으로 인식될 것이다. 캅사이신은 (많은 국부화된 히스타민 방출을 촉발시킴으로써) 원하지 않는 염증성 반응을 나타낼 수 있고, 따라서 특정 타입의 투여 체제는 특정 화합물에 대해 또는 이들 화합물의 특정 양 또는 순도에 대해 보다 덜 바람직할 수 있고, 특이 요건에 적합하게 맞춰질 수 있다. 고순도 캅시에이트의 한 소스는 Ajinomoto Co.에 의해 공급되는 “CH-19”피망에 의해 제공된다.

다른 구현예에서, 바닐로이드 화합물은 8-메틸-N-바닐릴-6-논-엔아미드(enamide); N-바닐릴노난아미드(vanillylnonanamide); N-(9-데세닐(decenyl))-4-히드록시-3-메톡시-페닐아세트아미드; N-(9Z-도데세닐)-4-히드록시-3-메톡시페닐아세트아미드; N-(9Z-테트라데세닐)-4-히드록시-3-메톡시페닐아세트아미드; N-((4-히드록시-3-메톡시페닐)-메틸)-9-데센아미드; N-((4-히드록시-3-메톡시페닐)-메틸)-9Z-도데센아미드; N-((4-히드록시-3-메톡시페닐)-메틸)-9Z-테트라데센아미드 및 N-((4-(3-페닐-2(S)-2-아미노-1-프로폭시)-3-메톡시페닐)-메틸)-노난아미드로부터 선택된다.

다른 구현예에서, 바닐로이드 화합물은 캅사제핀, 즉, N-[2-(4-클로로페닐)에틸]-7,8-di히드록시-1,3,4,5-테트라히드로-2-벤자제핀(benzazepine)-2-카르보티오미드(carbothiomide)이다.

다른 구현예에서, 바닐로이드 화합물은 캅사제핀, 즉, N-[2-(4-클로로페닐)에틸]-7,8-디히드록시-1,3,4,5-테트라히드로-2-벤자제핀-2-카르보티오미드이다.

다수의 바닐로이드, 특히 캅사이신은 일시적 수용체 포텐셜(transient receptor potential) 바닐로이드 타입 1(TRPV1) 수용체인, 고온 및 산성 pH 같은 유해한 자극에 자연적으로 반응하는 이온 채널에 결합한다. TRPV1에서 행동하는 다른 바닐로이드는 레지니페라톡신 및 올바닐을 포함한다.

바닐로이드 화합물은 캅사이신 및 캅시노이드(capsinoid)로 또한 알려진 캅시에이트를 포함한다. 캅시에이트, 디하이드로캅시에이트 및 노르디하이드로캅시에이트를 포함하는 캅시노이드는 칠리 페퍼에 자연적으로 존재하는 물질이다. 이것들은 고추에서 매움을 야기하는 화합물인 캅사이신과 구조적으로 유사할지라도, 캅시노이드는 이러한 특징이 대체로 없고 캅사이신의 약 1/1000의 추산된“매운맛 역(threshold)”을 갖는다.

캅사이신은 (E)-N-[(4-히드록시-3-메톡시페닐)메틸]-8-메틸-6-노넨아미드(nonenamide), 그리고 캅사이신의 6,7-디하이드로 유도체인 디하이드로캅사이신을 포함하는 이것의 유사체(analog)이다. 전술한 바와 같이, 캅시노이드는 캅시에이트 즉, 4-히드록시-3-메톡시벤질 (E)-8-메틸-6-노네노에이트, 디하이드로캅시에이트 즉, 4-히드록시-3-메톡시벤질 8-메틸노나노에이트, 그리고 노르디하이드로캅시에이트 즉, 4-히드록시-3-메톡시벤질 7-메틸옥타노에이트를 포함한다. 이들 화합물의 몇몇의 화학 구조는 다음과 같다:

캅시에이트는 아포프토시스 및 줄어든 종양 발생률을 제공할 수 있다. 캅시에이트는 세포 미토콘드리아를 통해 세포의 산화환원(redox) 상태에 영향을 미쳐 아포프토시스를 유발하는 것으로 믿어진다.

바닐로이드 화합물은 암을 치료에 작용 연관성 또는 다기능 접근법을 제공함으로써 프로테아제 효소전구체의 치료 효능을 향상시키도록 선택된다. 예컨대, 바닐로이드 화합물은 종양 세포 아포프토시스, 면역인식 및/또는 분화를 통해 종양 세포의 치료를 향상시키기 위한 세포 내 활동을 유발할 수 있다.

다음은 바닐린, 바닐산 및 레지니페라톡신의 화학 구조이다:

상기 구현예에 따른 바닐로이드 화합물은 모든 약학적 허용 염, 수화물, 용매 화합물, 결정형, 부분입체이성질체, 형태이성질체 (예컨대, cis 및 trans 이성질체), 호변체, 프로드러그, 대사산물, 그리고 이들의 거울상이성질체 형태를 포함할 수 있다.

글리코시드 가수분해효소(Glycoside Hydrolase)

한 구현예에서, 용어 “글리코시드 가수분해효소”는 2 이상의 탄수화물 간의, 또는 탄수화물과 비탄수화물 모이어티 간의 글리코시드 결합을 가수분해할 수 있는 임의의 효소를 의미한다. 글리코시드 가수분해효소는 종류 3.2.1로부터의 효소, 특히 종류 3.2.1.1 내지 3.2.1.3으로부터의 효소일 수 있다. 한 구현예에서, 글리코시드 가수분해효소는 아밀라아제이다. 아밀라아제는 α-아밀라아제, β-아밀라아제 및 γ-아밀라아제, 보다 특히 아밀라아제 2, 아밀라아제 알파 1A, 아밀라아제 알파 1B, 아밀라아제 알파 1C, 아밀라아제 알파 2A, 아밀라아제 알파 2B로부터 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 아밀라아제는 α-아밀라아제이다.

아밀라아제는 글리코시드 가수분해효소이고 α-1,4-글리코시드 결합에 작용한다. 아밀라아제는 종양 세포의 표면 당단백질에 존재하는 탄수화물을 분해한다. 아밀라아제는 암 치료에 대한 작용 연관성 또는 다기능 접근법을 제공함으로써 프로테아제 효소전구체의 치료 효능을 향상시키도록 선택된다. 아밀라아제는 인간, 동물, 박테리아 또는 식물 기원일 수 있다. 예컨대, α-아밀라아제는 Aspergillus oryzae, Bacillus licheniformis, 보리누룩, 식용돼지(hog) 췌장, 인간 췌장, 돼지 췌장 및 Triticum aestivum. 중 임의의 것으로부터 얻어질 수 있다.

세포질 해당 저감제(Cytoplasmic Glycolysis Reduction Agent)

한 구현예에서 용어 “세포질 해당 저감제”는 세포질 해당을 저감시킬 수 있는 작용제를 의미한다. 다른 구현예에서, 세포질 해당 저감제는 2-데옥시-D-글루코오스, 또는 이것의 약학적 허용 염, 에스테르, 또는 프로드러그이다.

세포질 해당 저감제는 암 치료에 대한 작용 연관성 또는 다기능 접근법을 제공함으로써 프로테아제 효소전구체의 치료 효능을 향상시키기 위해 선택된다.

세포질 해당 저감제는 해당의 차단제(blocker) 또는 억제제일 수 있고, 예컨대 혐기적 대사작용 세포에 대해 보다 특이적인 옥사메이트(oxamate)이고, 락트산 탈수소효소, 또는, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소에서 해당을 억제할 수 있는 요오드아세테이트를 억제할 수 있다.

해당 억제제는 2-데옥시-D-글루코오스의 친유성 유사체 또는 프로드러그를 포함할 수 있다. 친유성 유사체는 에스테르, 에테르, 인산에스테르 같은 히드록실기의 유도체를 포함한다. 다른 것들은 히드록실기의 제거 및 불소 또는 요오드 같은 할로겐, 또는 티올 또는 티오알킬기로 치환을 포함한다. 리포솜 제형화(liposome formulated) 2-데옥시-글루코오스 및 이것의 유사체, 또는 2-데옥시글루코오스의 효소로 분할 가능한 유도체가 제공될 수 있다. 예는 C-1 위치에 글리코시드가 있는 글루코로나이드(glucoronides)를 포함한다. 2-데옥시-D-글루코오스의 프로드러그로서 작용할 수 있는, 2-데옥시-D-글루코오스의 모노 및 디에스테르(diester) 같은 2-데옥시-D-글루코오스의 친유성 유사체는 발레레이트(valerate), 미리스테이트(myristate) 및 팔미테이트(palmitate) 같은 예를 포함할 수 있다.

해당 억제제는 6-데옥시-D-글루코오스, 6-플루오르-D-글루코오스, 6-O-메틸-D-글루코오스, 6-티오-D-글루코오스, 2-데옥시-D-글루코오스 자신 및 유사체, 2-데옥시-2-할로-D-글루코오스, 예컨대 2-브로모-, 2-플루오르- 또는 2-요오드-D-글루코오스, 3-데옥시 또는 3-플루오르-D-글루코오스 또는 4-데옥시 또는 4-플루오르-D-글루코오스, 2-플루오르 또는 3-플루오르-글리세르알데히드 또는 글리세린산(glycerates), 예컨대, 3-플루오르-2-포스포글리세린산, 2-플루오르-프로피온산 또는 이것의 염, 2,2-디플루오르-프로피온산, 3-할로-피루브산, 3-할로프로피온산, 2,2-티오메틸아세트산, 1-데옥시-D-글루코오스, 5-티오-D-글루코오스, 3-플루오르-D-글루코오스 및 4-플루오르-D-글루코오스, 2-플루오르-, 2-요오드-, 2-티오, 또는 2-메톡시-글리세르알데히드 또는 글리세린산, 3-플루오르-, 3,3-디플루오르-, 엔올라아제 3-요오드-, 3-카르복실로(carboxylo)- 및 3-티오글리세린산을 또한 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 용어 “세포질 해당 저감제”는 화학식 IV의 화합물, 또는 이것의 약학적 허용 염, 프로드러그 또는 에스테르를 의미한다:

X는 O 및 S로부터 선택됨;

R₁은 H, 할로겐, OH, -OC(O)R₆으로부터 선택됨;

R₂ 내지 R₄는 각각 H, 할로겐, OH, -OC(O)R₆으로부터 독립적으로 선택됨;

R₅는 할로겐, OH, SH, -OC(O)R₆으로부터 선택됨; 및

R₆는 C_1-20알킬임.

할로겐은 바람직하게는 F, Br 또는 I, 보다 바람직하게는 F를 의미한다. 다음 여러 구현예 각각은 개별적으로 또는 조합하여 취해질 수 있다. X는 O이다. R₁은 OH이다. R₂는 H 또는 F이다. R₃는 OH 또는 F이다. R₄는 OH 또는 F이다. R₅는 OH, F 또는 SH이다.

다른 구현예에서, X는 O이고, R₁은 OH로부터 선택되고, R₂는 H, Br, F, I, OH, C(O)-OR₆으로부터 선택되고, 여기서 R₆는 C_1-20알킬로부터 선택되고, R₃ 내지 R₅는 OH이다. 바람직하게는, R₂는 H이다.

추가 활성제(Additional Active Agents)

첫 번째 양상, 두 번째 양상, 열두 번째 양상 및 열세 번째 양상의 약학 조성물은 다른 활성제를 더 포함할 수 있다. 이들 활성제의 추가는 암의 치료를 향상시킬 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 각 작용제의 보다 낮은 투여량으로 치료적 효능을 달성할 수 있고, 따라서 불리한 부작용에 대한 가능성을 줄일 수 있다. 또한 원하지 않는 부작용을 줄일 수 있고 보다 높은 투여량의 사용을 가능하게 한다. 추가 활성제는 보충적, 추가적, 또는 향상된 치료적 기능을 제공할 수 있다.

따라서 첫 번째 양상, 두 번째 양상, 열두 번째 양상 및 열세 번째 양사의 약학 조성물은 보충적, 추가적, 또는 향상된 치료 기능을 제공하는 다음 활성제 중 하나 이상을 함유할 수 있다:

ㆍ비타민 C(아스코르브산), 비타민 E(토코페놀, 토코트리에놀), 폴리페놀 산화방지제(레스베라트롤, 플라보노이드), 카로티노이드(리코펜, 카로틴, 루테인)을 포함하는 산화방지제. 레스베라트롤, 특히 인간 유방암 세포 처리에 있어 트랜스-레스베라트롤은 항암 및 화학방지 능력을 나타낸다.

ㆍL-트레아닌(threanine) 즉, 글루타민산 유사체 또는 아미노산 유도체인 감마- 글루타밀에틸마이드 또는 5-N-에틸-글루타민.

ㆍ커큐미노이드(curcuminoids), 커큐민 또는 이들의 유도체.

ㆍ베타 글루칸(1-3, 1-6 베타 글루칸)

ㆍ시안화수소(HCN) - 예컨대, LPO 발생 OSCN 이온은 단백질가수분해를 가속화할 수 있다.

ㆍ플라바놀, 엽황소, 리미노이드(liminoids)를 포함하는 파이토뉴트리언트 추출물

ㆍ프로테아제 효소 억제제, 예컨대, 아프로티닌(aprotinin)은 소의 췌장 트립신 억제제로서 또한 알려짐. 약학 조성물과 조합한 효소 억제제의 사용은 종양 세포에서 떨어져 시스템/몸체에 존재할 수 있는 어떤 프로테아제 효소를 억제하는 것을 가능하게 할 수 있고, 따라서 그러한 활성 효소의 원하지 않는 효과를 줄일 수 있다.

ㆍ성장인자(예: BMPs, TGF-P, FGF, IGF).

ㆍ시토킨(예: 인터류킨 및 CDFs).

ㆍ항생물질

ㆍ종양괴사인자(TNF), 산성 또는 염기성 섬유아세포성장인자(FGF) 또는 간세포성장인자(HGF)의 혈관형성 활동을 억제하거나 중화시킬 수 있는 항체, 조직인자, 단백질 C또는 단백질 S의 응집 활동을 억제하거나 중화시킬 수 있는 항체, HER2 수용체에 결합할 수 있는 항체.

ㆍ암 치료에 유익한 임의의 다른 활성제.

다른 추가 치료제가 첫 번째 및 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체 또는 활성제와 조합하여 사용될 경우, 이들은 의사용 편람(PDR)에 적힌, 그렇지 않으면 통상의 기술자에게 결정되는 양으로 사용될 수 있다.

용어(Terms)

프로테아제 효소전구체에 관하여 “활성화(activation)”는 종양 세포의 세포 대 세포 부착을 향상시킬 수 있거나, 종양 세포의 단백질가수분해를 가져오거나, 종양 세포 아포프토시스, 분화 또는 면역인식을 유발하는 형태로 프로테아제 효소전구체의 in sit (예: in vitro 또는 in vivo) 변환을 의미한다.

“아포프토시스(apoptosis)”는 여러 가지 자극에 의해 유발될 수 있는 세포 자멸의 일반적으로 통제되고 정돈되고 세심한 프로세스이다. 아포프토시스는 주변 조직을 손상시키고 염증을 유발할 수 있는 괴사보다 덜 침습성이다.

“혈관형성(angiogenesis)”은 혈관의 형성, 특히 기존의 혈관으로부터 새로운 모세관의 확산을 나타낸다. 암 세포는 생존하기 위해 정상 세포보다 상당히 많은 혈액 공급을 필요로 하기 때문에, 혈관형성은 암 세포가 종양으로 성장하는데 필요하다. 혈관생성 또는 혈관생성에 관한 이벤트는 다수의 병리학적 프로세스. 특히 종양 성장 및 전이, 당료병성 망막증, 건선 및 관절증 같은 혈관 특히 미세혈관계의 확산이 증가하는 다른 상태에 포함된다.

용어 “주변세포의(pericellular)”는 세포를 둘러싸는 조직에서, 근처에서, 위에서, 또는 내에서를 의미한다. 좀더 특히, 상기 용어는 종양 세포를 둘러싸는 조직에서 또는 내에서를 의미한다.

용어 “세포 내의(intracellular)”는 세포 내에를 의미한다.

용어 “분화(differentiation)”, “분화하다(differentiate)” 또는 이들의 유사한 변형은 여러 기능에 대해 좀더 특수화되는 세포의 능력을 의미한다. 한 수준에서, 악성 종양 세포는 탈분화된(dedifferentiated) 세포인 것으로 고려되는데, 이것은 보다 더 특수화되었던 것들이 보다 덜 특수화되는 것을 의미하고, 프로세스에서, 이들 악성 세포의 성장을 제한하는 신체 능력이 제대로 발휘되지 못하게 되었다는 것을 의미한다. 따라서 종양 세포의 분화는 건강 또는 정상 세포 타입으로 적어도 어느 정도는 악성 세포의 변환(transformation)을 포함하고, 이것은 통제되지 않은 성장, 침입 및/또는 전이 특성을 줄이는 방식으로 악성 세포의 변화를 의미한다.

용어 “면역인식(immunorecognition)”은 면역 체계에 의한 인식 그리고 면역 체계에 의한 그 후의 제거 또는 소거를 의미한다. 면역 체계의 한 역할은 종양을 식별하고 소거하는 것이다. 종양의 변환된 세포(transformed cells)는 정상 세포에서 발견되지 않는 항원을 발현시킨다. 면역 체계에게 이들 항원은 이물질로 나타나고, 이들의 존재는 면역 세포가 변환된 종양 세포를 공격하게 한다. 암 세포의 몇몇 형태는 면역인식을 막거나 줄이는 능력을 또한 갖는다.

용어 “전이(metastasis)”, “전이된(metastasized)” 또는 이들의 유사한 변형은 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 인접하지 않는 기관 또는 부분으로 병의 확산을 나타낸다. 악성 종양 세포와 감염은 전이하는 능력이 있다. 예컨대, 암 세포는 원발성 종양으로부터 달아나거나 탈출하고, 림프관과 혈관으로 들어가고, 혈류를 통해 순환하고, 신체의 다른 곳에서 다시 놓이게 될 수 있다. 전이에 따라서 원발성 종양으로부터 형성된 새로운 종양은 2차 또는 전이 종양으로 불리고, 원발성 또는 원래 종양과 동일한 세포로 구성된다. 예컨대, 폐로 전이한 유방암은 비정상 폐 세포가 아닌 비정상 유방 세포를 포함하는 2차 암을 형성하고, 폐암이 아닌 전이 유방암으로 불린다.

용어 “악성(malignancy)”, “악성의(malignant)” 또는 이들의 유사한 변형은 퇴생(anaplasia), 침습력(invasiveness) 및 전이의 특징적 특성을 포함하는, 성장 및 발달을 계속하는 암 세포의 경향을 나타낸다. 예컨대, 악성 종양은 악성이 그것의 성장에 있어 자체 한정적이지 않고, 인접한 조직으로 침습할 수 있고, 떨어져 있는 조직으로 전파(전이)할 수 있다는 점에서, 암이 아닌 양성 종양과 대조될 수 있고, 양성 종양은 이들 특성 중 어느 것도 갖지 않는다.

“퇴생(anaplasia)”은 세포에서 분화의 복귀를 나타내고, 이것은 악성 종양의 특징이다. 이 용어는 증식의 증가한 용량(capacity)을 커버한다. 퇴생은 분화의 결핍, 증가한 탈분화, 또는 정상 세포에 존재하는 구조적 및 기능적 분화의 증가한 손실을 포함한다.

“단백질가수분해(proteolysis)”는 프로테아제로 불리는 세포 효소에 의한 또는 분자 내 소화에 의한 단백질의 규제된 분해(소화)이다. 좀더 특히, 단백질가수분해는 단백질에서 아미드/펩티드 결합을 가수분해에 의해 분할하는 프로테아제 효소에 의한 단백질의 세분(breaking down)이다.

용어 “세포 대 세포 부착(cell-to-cell adhesion)”, “세포 부착 분자(cell adhesion molecules)” 또는 이들의 유사한 변형은 세포의 외면에 일반적으로 위치하고 한 세포를 다른 세포 또는 세포들과 결합하는데 참여하는 알려진 세포 대 세포 부착 분자의 범위를 나타내고, E-카데린 및 β-카테닌이 이들의 예이다. 여러 세포 타입이 이들 분자의 대안적 형태(alternative forms)일 수 있다. 이들 분자는 세포 밖의 매트릭스와의 부착에 추가적으로 개입될 수 있다. 다른 세포 대 세포 부착 분자는 카데린, 인테그린, 셀렉틴, 그리고 면역글로불린 세포 부착 단백질 패밀리로부터 선택될 수 있다.

용어 “동족체(homologue)” 및 “기능적 등가물(functional equivalent)”은, 재조합 분자에 더하여, 동일한 단백질 패밀리 내의 알려진 분자 같은 다른 단백질 또는 이형(variant)을 포함하도록 취해질 것이다.

“상향조절하는(up-regulating)”에 관하여 말하자면, 이것은 선결된 기준 수준에 관하여 발현 또는 활동의 수준을 증가시키는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이것은 기준 수준보다 위로 적어도 5%의 증가일 수 있다. 그러나 특히 바람직하게는 기준 수준과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상만큼의 상향조절이다. 기준 수준은, 예컨대 처리 전 분자의 발현 또는 활동에 따라서 또는 주어진 세포 타입에 대한 정상 또는 예상 수준에 따라서, 다양한 수단에 의해 결정될 수 있다.

방법 및 용도(Methods and Uses)

다섯 번째 내지 아홉 번째 양상 또는 열네 번째 양상의 사용, 또는 열 번째 양상 또는 열다섯 번째 양상의 방법은 다음 효과 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 악성 종양의 재발 감소, 악성 종양의 전이 감소, 종양의 개수 또는 크기 감소, 종양 세포의 분화, 세포 대 세포 부착 및 전이 감소를 가능하게 하기 위해 종양 세포에서 β-카테닌 및 E-카데린의 발현, 면역인식을 막는 종양 세포의 능력 감소.

한 구현예는 첫 번째 및 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체 및 활성제의 치료적으로 유효한 양을 암 세포에서 분화를 유발하기에 충분한 조건 하에 그리고 시간 동안 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 다섯 번째 및 여섯 번째 양상의 용도와 일곱 번째 양상의 방법은 암 세포의 분화를 포함할 수 있다. 한 특정 구현예에서, 암 세포의 분화는 결장 암종 세포의 분화이다.

한 구현예에서, 다섯 번째 내지 아홉 번째 양상 또는 열네 번째 양상의 용도, 또는 열 번째 양상 또는 열다섯 번째 양상의 방법은 전이 암의 치료를 위해 사용될 때 유익하다. 전이는 병이 신체의 다른 부분으로 전파되는 암의 단계이다. 이 단계는 다른 치료의 성공에 있어 뚜렷한 감소와 대상의 생존에 있어 감소를 수반하기 때문에, 전이의 방지 또는 지연이 특히 중요하다. 다른 구현예에서, 유효량의 첫 번째 및 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체 및 활성제의 대상에 대한 투여를 통해 암 세포에서 세포-세포 부착 분자를 상향조절하여 암 전이를 막거나 지연시키거나 개선하는 안전하고 효과적인 수단이 제공된다.

“치료(처리)하는(treating)” 또는 “치료(처리)(treatment)”는 치료적 처리와 예방의 또는 예방을 위한 수단을 나타내고, 여기서 목적은 암 또는 암의 확산(전이)를 막거나 개선하거나 축소하거나 늦추는 것이다.

“막는(preventing)”, “예방(prevention)”, “예방의(preventative)” 또는 “예방을 위한(prophylactic)”은 질환(condition), 질병, 장애 또는, 이상 또는 증상을 포함하는 표현형의 발생을 저지 또는 방해하거나, 그러한 발생으로부터 방어 또는 보호하는 것을 나타낸다. 예방이 필요한 대상은 질환을 발달시키기 쉬울 수 있다.

용어 “개선하다(ameliorate)” 또는 “개선(amelioration)”은 질환, 질병, 장애, 또는 이상 또는 증상을 포함하는 표현형의 감소, 축소 또는 제거를 나타낸다. 치료가 필요한 대상은 이미 질환을 가지거나, 질환을 가지기 쉽거나, 질환이 예방되어야 하는 대상일 수 있다.

“대상(subject)”은 포유동물을 포함한다. 포유동물은 인간일 수 있거나, 가정(domestic), 동물원 또는 반려동물일 수 있다. 본 발명의 방법이 인간의 의료에 적합하다고 특히 고려될지라도, 개와 고양이 같은 반려동물, 말, 소 및 양 같은 가축, 또는 고양잇과, 갯과, 솟과 동물 및 유제류 같은 동물원 동물의 치료를 포함하는 수의학적 치료에 또한 적용될 수 있다. 대상은 암 또는 다른 장애로 고생할 수 있거나, 고생하지 않을 수 있다(즉, 발견할 수 있는 질병이 없음).

용어 “치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)”은 암 또는 암의 전파(전이)를 치료, 예방 또는 개선할 수 있는, 조성물 또는 조성물 내 작용제 또는 화합물의 양을 나타낸다. 치료적으로 유효한 양은 암 치료에 관하여 경험적으로 그리고 정례적인 방식으로 결정될 수 있고, 증가한 기대 수명을 야기할 것이다.

다섯 번째 내지 아홉 번째 양상 또는 열네 번째 양상의 용도, 또는 열 번째 양상 또는 열다섯 번째 양상의 방법은 신생물(neoplasm) 및 관련 질환, 암, 종양, 악성 및 전이 질환의 치료를 포함할 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체 및 활성제로 치료될 수 있는 고형 종양 및 전이와 연관된 조직 및 기관은 담도, 방관, 혈액, 뇌, 유방, 자궁경부(cervix), 결장, 자궁내막, 식도, 머리, 경부(neck), 신장(kidney), 후두, 간, 폐, 골수, 멜라닌, 난소, 췌장, 전립선, 직장, 신장(renal), 망막, 피부, 위, 고환, 갑상선, 요로 및 자궁을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

다섯 번째 내지 아홉 번째 양상 또는 열네 번째 양상의 용도, 또는 열 번째 양상 또는 열다섯 번째 양상의 방법은 다음 타입의 암 및 전이 암종의 치료에 특히 적합하다: 췌장암, 식도암, 결장암, 장암, 전립선암, 난소암, 위암, 유방암, 악성 흑색종 또는 폐암.

다섯 번째 내지 아홉 번째 양상 또는 열네 번째 양상의 용도, 또는 열 번째 양상 또는 열다섯 번째 양상의 방법은, 예컨대, 종양 세포 아포프토시스, 세포 대 세포 부착, 분화 및 면역원성(면역 체계에 의한 표적화 및 제거)을 증가시켜서, 암 치료에 대한 다중 효과 접근법을 제공할 수 있다. 따라서 면역 체계를 억제하거나 손상시킬 수 있는 어떤 다른 치료가 없는 경우에 치료를 수행하는 것이 유리하다.

한 구현예에서, 다섯 번째 내지 아홉 번째 양상 또는 열네 번째 양상의 용도, 또는 열 번째 양상 또는 열다섯 번째 양상의 방법은 낮은 수준의 E-카데린 및 β-카테닌의 발현을 가진 대상의 치료를 포함한다. 상기 양상의 방법 또는 용도에 따른 치료에 특히 적합한 추가 환자 그룹이 또한 식별될 수 있다.

다섯 번째 내지 아홉 번째 양상 또는 열네 번째 양상의 용도, 또는 열 번째 양상 또는 열다섯 번째 양상의 방법은 증식성 장애(예: 종양)의 치료 또는 예방으로 겨냥된 다른 통상적인 항암 치료적 접근법에 의해 보충될 수 있다. 예컨대, 그러한 방법은 예방을 위한 암 예방, 수술 후 암 재발 및 전이의 방지, 그리고 다른 통상적인 암 치료의 보조제에 사용될 수 있다.

약학 조성물, 제형 및 투여 경로(Pharmaceutical Compositions, Formulations and Routes of Administration)

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은, 약학적 제형 기술에서 잘 알려진 것과 같은 기술에 따라서 원하는 투여 모드에 적절한 타입의 제약 첨가제(예컨대, 부형제, 바인더, 방부제, 안정제, 향미료 등)와 함께, 예컨대 통상적인 고체 또는 액체 비히클 또는 희석제를 써서 제형화될 수 있다.

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은 예컨대, 정제, 캡슐, 과립 또는 분말 같은 형태로 경구로(orally); 설하로(sublingually); 구강으로(buccally); 피하, 정맥, 근육 또는 수조내(intracisternal) 주사 또는 주입 기술(예: 멸균 주사 가능한 수성 또는 비수성 용액 또는 서스펜션) 같은 것에 의해 비경구적으로; 흡입 분무 같은 것에 의해 코로; 크림 또는 연고 같은 형태로 국소로; 좌약 같은 형태로 직장으로; 무독성의 약학적 허용 비히클 또는 희석제를 함유하는 투여량 단위 제형으로, 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 이들은 예컨대 즉시 방출, 또는 예컨대 피하 이식(implant), 캡슐에 넣은 스페로이드 또는 삼투 펌프 같은 장치의 사용에 의한 장기간에 걸친 방출에 적합한 형태로 투여될 수 있다.

인간 같은 영장류에 더하여, 여러 다른 포유동물이 열 번째 양상의 방법에 따라 치료될 수 있다. 예컨대, 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 기니피그, 쥐, 또는 다른 솟과, 양과, 말과, 갯과, 고양잇과, 설치류 또는 쥣과 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물이 치료될 수 있다.

여기서 사용되는 용어 “조성물(composition)”은 프로테아제 효소전구체 및 하나 이상의 활성제, 그리고 옵션으로 하나 이상의 추가 활성제를 포함하는 산물(product), 또한 이것으로부터 직접 또는 간접적으로 발생한 임의의 산물을 포함하는 것으로 의도된다.

여기서 사용되는 용어 “약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)”은 수용자에게 해롭지 않은 캐리어, 희석제 또는 부형제를 의미한다.

용어 “~의 투여(administration of)” 또는 “투여하는(administering)”은 치료가 필요한 개인에게 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물 그리고 이들의 제제 또는 제형은 조성물의 성분 즉, 프로테아제 효소전구체를 셀레늄 화합물 및/또는 바닐로이드 화합물을 포함하는 하나 이상의 활성제와 함께 혼합하여 제조될 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 성분은 여기서 설명된 추가 활성제를 포함할 수 있다. 상기 혼합은 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다.

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은 투여량 단위 형태(dosage unit form)로 통상적으로 존재할 수 있고, 약학 분야에서 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 모든 방법은 활성제와 프로테아제 효소전구체를 하나 이상의 부성분을 구성하는 캐리어와 관련시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 약학 조성물은 활성제 및 프로테아제 효소전구체를 액체 캐리어 또는 미세 분할된 고체 캐리어 또는 양자와 균일하고 친밀하게 관련시키고, 그 다음 필요하면 산물을 원하는 제형으로 만드는 것에 의해 제조된다. 활성제 및 프로테아제 효소전구체는 단일 또는 반복 투여 후 질병의 프로세스 또는 상태에 원하는 효과를 산출하기에 충분한 양의 투여량 단위로 제공된다.

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은 예컨대, 정제, 트로키, 마름모꼴 알약, 수성 또는 유성 서스펜션, 분산성 분말 또는 과립, 에멀션, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르제 같은 경구 사용에 적합한 형태일 수 있다. 경구 사용으로 의도된 조성물은 약학 조성물의 제조에 관한 기술에서 알려진 임의의 방법에 따라 조제될 수 있고, 그러한 조성물은 약학적으로 훌륭하고 입에 맞는 제제를 제공하기 위해 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 정제는 첫 번째 및 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 정제의 제조에 적합한 무독성 약학적 허용 부형제와 혼합으로 함유한다. 이들 부형제는 예컨대, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 젖당, 인산칼슘 또는 인산나트륨 같은 불활성 희석제; 입화제 및 붕해제, 예컨대 콘스타치 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 녹말, 젤라틴 또는 아카시아; 윤활제, 예컨대 스테아린산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크;일 수 있다. 정제는 코팅되지 않거나, 위장관에서 분해 및 흡수를 지연시켜 장기간에 걸친 지효성을 제공하기 위해 알려진 기술에 의해 코팅될 수 있다. 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다. 이들은 방출 조절을 위한 삼투 치료적 정제를 형성하도록 또한 코팅될 수 있다.

경구 사용을 위한 제형은 첫 번째 및 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체 및 활성제가 불활성 고체 희석제 예컨대, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합되어 있는 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 첫 번째 및 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체 및 활성제가 물 또는 기름 매체 예컨대, 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브유와 혼합되어 있는 연질 젤라틴 캡슐로서 또한 존재할 수 있다.

수성 서스펜션은 활성제 및 프로테아제 효소전구체를 수성 서스펜션의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 포함할 수 있다. 그러한 부형제는 서스펜션화제 예컨대, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스 고무 또는 아라비아 고무; 자연발생 인지질, 예컨대 레시틴, 또는 알킬렌옥사이드의 지방산과의 축합체, 예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌옥사이드의 긴 사슬 지방족 알코올류와의 축합물, 예컨대 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol), 또는 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올리에이트(monooleate) 같은 에틸렌옥사이드의 지방산 및 헥시톨 유래 부분 에스테르류와의 축합물, 또는 에틸렌옥사이드의 지방산 및 헥시톨 무수물 유래 부분 에스테르류와의 축합물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비탄 모노올리에이트일 수 있는 분산제 또는 습윤제이다. 수성 서스펜션은 하나 이상의 방부제 예컨대, 에틸, 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 그리고 수크로오스 또는 사카린 같은 하나 이상의 감미제를 또한 포함할 수 있다.

유성 서스펜션은 활성제 및 프로테아제 효소전구체를 식물유 예컨대, 땅콩유, 올리브유, 참기름, 야자유, 또는 액체 파라핀 같은 광유에 부유시켜 조제될 수 있다. 유성 서스펜션은 농조화제 예컨대, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 포함할 수 있다. 전술한 것과 같은 감미제, 그리고 향미제는 입에 맞는 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이들은 아스코르브산 같은 산화방지제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

물 첨가에 의한 수성 서스펜션의 조제에 적합한 분산성 분말 및 과립은 첫 번째 및 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 분산제 또는 습윤제, 서스펜션화제 및 다른 하나 이상의 보존제와의 혼합으로 제공한다. 적절한 분산제 또는 습윤제 및 서스펜션화제는 위에서 이미 언급한 것들이 예가 된다. 추가 부형제 예컨대, 감미제, 향미제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은 또한 수중유적형 에멀션 형태일 수 있다. 유상(oily phase)는 식물유 예컨대 올리브유 또는 땅콩유, 또는 광유 예컨대, 액상 파라핀, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적절한 에멀션화제는 자연발생 고무 예컨대, 아라비아 고무 또는 트래거캔스 고무, 자연발생 인지질 예컨대, 대두, 레시틴, 그리고 지방산 및 헥시톤 무수물 유래 에스테르류 또는 부분 에스테르류 예컨대 소르비탄 모노올리에이트, 그리고 상기 부분 에스테르류의 에틸렌옥사이드와의 축합물 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트일 수 있다. 에멀션은 감미제 및 향미제를 또한 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭시르제는 감미제 예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로오스로 조제될 수 있다. 이들은 완화제, 보존제, 향미제 및 착색제를 또한 함유할 수 있다.

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 서스펜션의 형태일 수 있다. 서스펜션은 전술한 적합한 분산 또는 습윤제 및 서스펜션화제를 사용하여 알려진 기술에 따라 제형화될 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 양상의 약학 조성물은 또한 예컨대 1,3-부탄 디올 내 용액 같은, 무독성 비경구적 허용 희석제 또는 용매에서 멸균 주사 가능한 용액 또는 서스펜션일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 부형제 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장 식염 용액이 있다. 또한, 멸균 고정된 기름이 용매 또는 서스펜션 매체로서 통상적으로 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 완하성 지방유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산 같은 지방산이 주사 가능한 제제에 사용된다.

특정 구현예에서, 첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은 약의 직장 투여를 위한 좌약으로서 제형화된다. 이들 제형은 첫 번째 두 번째 양상의 프로테아제 효소전구체와 활성제를 상온에서 고체이지만 직장 온도에서 액체이고 따라서 직장에서 녹아 약을 방출할 적절한 무자극 부형제와 혼합하여 제조될 수 있다. 그러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 직장 투여는 효소의 경구 투여와 관련된 위장관에서 장간 초회통과효과((entero-hepatic first pass effect)를 제거하기 위해 사용될 수 있다.

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은 리포솜(liposomes)으로 또한 제형화될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 바와 같이, 리포솜은 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 일반적으로 유도된다. 리포솜은 수성 매체에 분산된 모노- 또는 다중박막층(multilamellar) 수화한 액정에 의해 형성된다. 리포솜을 형성할 수 있는 임의의 무독성 생리학적 허용 및 대사 가능한 지질이 사용될 수 있다. 리포솜 제형은 안정제, 보존제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 천연 및 합성인, 인지질 및 포스파티딜 콜린이다. 리포솜을 형성하는 방법은 당해 기술분야에서 알려져 있다.

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물은 투약 지시와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 약학 조성물의 프로테아제 효소전구체 및 활성제, 그리고 옵션으로 추가 활성제는, 다섯 번째 내지 아홉 번째 양상의 용도 또는 열 번째 양상의 방법에서 동시에 또는 다른 시간에 별도로 또는 함께 취해지도록, 용기, 팩 또는 디스펜서에서 분리된 성분으로서 제공될 수 있다.

투여량 및 치료적 유효량(Dosages and Therapeutically Effect Amounts)

첫 번째 및 두 번째 양상, 또는 열두 번째 또는 열세 번째 양상의 약학 조성물의 적당한 투여량 수준은 일반적으로, 단일 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있는, 하루에 kg 환자 체중당 약 0.01 내지 500 mg일 것이다. 하루에 약 0.1 내지 약 250 mg/kg, 또는 하루에 약 0.5 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 적절한 투여량 수준은 하루에 약 0.01 내지 250 mg/kg, 하루에 약 0.05 내지 100 mg/kg, 또는 하루에 약 0.1 내지 50 mg/kg일 수 있다. 이 범위 내에서 투여량은 하루에 0.05-0.5, 0.5-5 또는 5-50 mg/kg일 수 있다. 경구 투여를 위해, 첫 번째 및 두 번째 양상의 약학 조성물은 1.0-4000 밀리그램의 프로테아제 효소전구체와 활성제, 특히 치료될 환자에 대한 증상에 따른 투여량 조절을 위해 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 750.0, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 및 4000 밀리그램의 프로테아제 효소전구체와 활성제를 함유하는 정제 형태로 제공될 수 있다. 여기서 기술되는 약학 조성물은 하루에 1 내지 4회, 하루에 한 번 또는 두 번, 또는 매일 한 번의 처방 계획으로 투여될 수 있고, 투여의 줄어든 요건은 일반적으로 더 중대한 준수로 이어진다.

투여량은 단일 투여 형태의 조성물이 주어지는지 그리고 바닐로이드 화합물이 조성물 또는 정제(또는 다른 투여 형태)에 활성제로서 포함되는지에 따라서 폭넓게 변화될 수 있다. 전형적으로, 캅시에이트 또는 캅사이신 바닐로이드 화합물은 투여당 0.1 내지 5g, 보다 특히 약 1-2g의 비교적 많은 투여량으로 제공될 수 있다.

여기서 설명된 약학 조성물의 구현예에 관한 적절한 단일 투여는 다음을 포함할 수 있다:

ㆍ1-100 mg 사이, 특히 2-50 mg, 보다 특히 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0. 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0 mg 양의 트립시노겐;

ㆍ1-100 mg 사이, 특히 2-50 mg, 보다 특히 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0. 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0 mg 양의 키모트립시노겐;

ㆍ0.01-3 mg 사이, 특히 0.1-1 mg, 보다 특히 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 1.0 mg 양의 셀레늄 화합물;

ㆍ0.1-4000 mg 사이, 특히 0.5-3000 mg, 보다 특히 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 mg의 바닐로이드 화합물;

ㆍ0.1-100 mg 사이, 특히 1-15 mg, 보다 특히 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0 양의 아밀라아제;

ㆍ0.1-100 mg 사이, 특히 1-15 mg, 보다 특히 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0 양의 2-데옥시-D-글루코오스.

그러나 어떤 환자에 대한 특정 투여량 수준 및 투약 빈도는 변화될 수 있고, 사용된 특정 화합물의 활동, 그 화합물의 대사 안정성 및 작용 길이, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이요법, 투여 방식 및 시간, 배설률, 약 조합, 특정 상태의 심각성, 치료 중인 호스트를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것임이 이해될 것이다.

여기서 설명되는 약학 조성물의 구현예의 (존재할 경우) 여러 성분에 대한 적절한 투여량 수준은 다음을 포함할 수 있다:

ㆍ적어도 0.2 mg/kg, 또는 0.2-5 mg/kg 범위, 0.5-2.0 mg/kg 범위, 또는 약 0.8 mg/kg 양의 키모트립시노겐;

ㆍ0.5 mg/kg보다 적은, 또는 0.01-0.4 mg/kg 범위, 또는 0.05-0.20 mg/kg 범위, 또는 약 0.1 mg/kg 양의 트립시노겐;

ㆍ적어도 0.0001 mg/kg, 또는 0.001-0.01 mg/kg 범위, 0.002-0.005 mg/kg 범위, 또는 약 0.003 mg/kg 양의 메틸셀레노시스테인;

ㆍ적어도 1 mg/kg, 또는 5-500 mg/kg 범위, 또는 10-100 mg/kg 범위, 또는 약 30 mg/kg 양의 캅시에이트;

ㆍ적어도 0.001 mg/kg, 또는 0.01-0.1 mg/kg 범위, 0.02-0.05 mg/kg 범위, 또는 약 0.03 mg/kg 양의 아밀라아제;

ㆍ적어도 1 mg/kg, 또는 5-500 mg/kg 범위, 또는 10-100 mg/kg 범위, 또는 약 30 mg/kg 양의 2-데옥시-D-글루코오스.

여기서 설명되는 약학 조성물의 (존재할 경우) 여러 성분에 대한 적절한 wt% 비는 다음을 포함할 수 있다: 200-400:25-75:5-15:5,000-20,000:5,000-20,000:0.1-10, 또는 약 300:50:10:10,000:10,000:1 비율의 키모트립시노겐:트립시노겐:아밀라아제:2-데옥시글루코오스:캅시에이트:메틸셀레노시스테인.

존재할 경우 종양 세포의 표면 또는 그 근처에서 특히 유효할 수 있는, 여기서 설명되는 약학 조성물의 (존재할 경우) 여러 성분에 대한 적절한 농도는 다음을 포함할 수 있다.

ㆍ약 0.5 mg/ml, 또는 1-2 mg/ml 범위 농도의 키모트립시노겐;

ㆍ0.25 mg/ml보다 적은, 또는 0.1-0.2 mg/ml 범위 농도의 트립시노겐;

ㆍ적어도 0.01 mg/ml, 또는 0.02-0.1 mg/ml 범위 농도의 아밀라아제;

ㆍ약 5 mg/ml, 또는 10-20 mg/ml 범위 농도의 바닐로이드 화합물;

ㆍ약 5 mg/ml, 또는 10-20 mg/ml 범위 농도의 2-데옥시-D-글루코오스;

ㆍ0.01 mg/ml 보다 적은, 또는 0.001-0.005 mg/ml 범위 농도의 셀레늄 화합물.

존재할 경우 셀레늄 화합물의 농도 또는 상대량이 특정 범위 내에서 유지되면, 더 향상된 활동이 약학 조성물에 제공될 수 있다. 메틸셀레노시스테인의 농도는 0.01 mg/ml보다 적은, 0.005 mg/ml보다 적은, 0.001 mg/ml보다 적은, 또는 0.0005 mg/ml보다 적은, 또는 0.0005 내지 0.01 mg/ml 범위, 또는 0.001 내지 0.005 mg/ml 범위일 수 있다.

키모트립시노겐/트립시노겐 효소전구체 제형(Chymotrypsinogen/Trypsinogen Proenzyme Formulation)

종양 세포의 세포 대 세포 부착을 향상시키거나, 종양 세포의 단백질가수분해를 초래하거나, 종양 세포 아포프토시스, 분화 또는 면역인식을 유도하기 위해, 종양 세포의 표면 또는 그 근처에서 활성화될 수 있는 제1 및 제2 프로테아제 효소전구체를 포함하는 약학 조성물이 제공되고, 여기서 제1 프로테아제 효소전구체는 키모트립시노겐이고 제2 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐이고, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비는 4:1 내지 8:1 사이의 범위에 있다. 약학 조성물은 전술한 구현예 중 어떤 것에 따른 하나 이상의 활성제를 더 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비는 5:1 내지 7:1 사이의 범위, 바람직하게는 6:1이다.

활성제 제형(Active Agent Formulation)

종양 세포에서 세포 내 활동을 각각 유도할 수 있는 제1 및 제2 활성제를 포함하는 약학 조성물이 제공되고, 여기서 제1 활성제는 셀레늄 화합물이고 제2 활성제는 세포질 해당 저감제다.

한 구현예에서, 세포 내 활동은 종양 세포 아포프토시스, 면역인식 또는 분화이다. 셀레늄 화합물 및/또는 세포질 해당 저감제는 상기 구현예에서 설명된 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 셀레늄 화합물은 메틸셀레노시스테인이고, 바람직하게는, 세포질 해당 저감제는 2-데옥시-D-글루코오스다.

약학 조성물은 전술한 구현예 중 임의의 것에 따른 프로테아제 효소전구체를 더 포함할 수 있다. 약학 조성물은 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 바닐로이드 화합물 및 글리코시드 가수분해효소로부터 선택된 활성제를 더 포함할 수 있다.

선별 및 식별 방법(Screening and Identification Methods)

추가 구현예는 암 세포의 세포-세포 부착 분자의 발현의 상향조절에서 유용한 작용제를 식별하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 암 세포 또는 암 세포의 세포-세포 부착 분자를 전술한 조성물과 접촉시키고, 시험 작용제(test agent)를 첨가하고, 세포-세포 부착의 수준 또는 세포-세포 부착 분자의 발현을 모니터링 또는 측정하고, 시험 작용제의 효과를 평가하는 것을 포함한다. 소형 화합물 화학 라이브러리 선별(small compound chemical library screening)과 항체 디스플레이 패닝(antibody display panning)은 절차를 사용하여 쉽게 평가될 수 있는 시험 작용제의 이용 가능한 소스의 예이다. 예컨대, 고속대량 화학 선별(HTS)이 로봇 공학 및 마이크로역가 플레이트(microtitre plates)를 사용하여 화학물질 또는 항체 같은 수천 개의 분자를 선별하기 위해 쉽게 이용될 수 있다. 그러한 선별을 발전시키기 위해서, 선별 동안 수행될 적합한 선별 분석(screening assay)을 제공하는 것이 필요하다. 이러한 선별 분석은 세포-세포 부착 분자 또는 전이 암 세포 같은 암 세포를 포함할 것이다. 상기 분석은 기준 세포를 포함하고, 시험 화합물, 효소전구체 및 선택 효소의 첨가의 비교를 옵션으로 제공한다. 유사하게, 파지(phage) 디스플레이 기술이 암 세포의 세포-세포 부착 분자의 발현의 상향조절에서 유용한 잠재적 작용제의 평가를 위한 고속대량 방법을 제공하기 위해 쉽게 이용될 수 있다.

일반적 사항(General Points)

본 명세서에 포함된 문서, 법령, 재료, 장치, 물품 등의 모든 논의는 단지 본 발명의 정황을 제공하기 위한 목적이다. 이들 임의의 또는 모든 내용이 선행 기술 기반의 일부를 형성하거나 이 출원의 각 청구항의 우선일 전에 호주에서 존재한 본 발명에 관련된 분야에서 주지의 일반적 지식이었다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않는다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 여기에 참조로서 통합된다.

대략적으로 설명된 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 구현예에 나타난 발명에 대해 수많은 변화 및/또는 변경이 행해질 수 있음이 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 따라서 본 발명의 구현예는 모든 점에 있어서 제한적인 것이 아닌 예시적인 것으로서 고려되어야 한다.

명세서에서 사용된 바와 같이 단수형은 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않으면 복수형 언급을 포함한다. 따라서 예컨대 “용매”에 대한 언급은 용매들의 혼합물을 포함하고, “작용제”에 대한 언급은 둘 이상의 그러한 작용제의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 선행하는 설명을 뒤따르는 청구항에서, 뚜렷한 표현이나 필연적 함축으로 인해 문맥이 달리 요구하는 경우를 제외하고는, 단어 “포함한다”또는 “포함하다”또는 “포함하는” 같은 변형은 포괄적인 의미로 즉, 기재된 특징의 존재를 명시하지만 발명의 다양한 구현예에 있는 추가적인 특징의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 것으로 사용된다.

재료 및 방법

본 발명의 본질이 보다 명확하게 이해될 수 있도록, 발명의 바람직한 형태가 다음의 제한적이지 않은 실험과 예를 참조하여 이제 설명될 것이다.

실험 1: 효소전구체 작용의 메커니즘의 식별

트립시노겐 및 키모트립시노겐을 포함하는 약학 조성물을 사용한 암 세포계 치료와 연관된 효과 및 메커니즘의 조사가 세 가지 다른 타입의 세포계에 수행되었다. 사용된 세포계는 Panc1: 인간 췌관 암종 세포계, Caco2: 인간 결장 선암 세포계, 그리고 OE33: 식도 선암 세포계였다.

모든 세포계는 5% CO₂를 함유하는 가습 분위기(humidified atmosphere)에서 37℃에서 T 75 배양 플라스크에서 유지되었다. 배양에서 세포를 유지하는데 사용된 배지는 다음과 같다: Panc1에 대해 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM); Caco2에 대해 Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM) 그리고 OE33에 대해 RPMI Medium 1640(Invitrogen, Merelbeke, Belgium). 모든 배지에는 10% 우태혈청(FBS; Invitrogen), 100 IU/ml 페니실린(Invitrogen), 100 μg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen) 및 2 mM L-글루타민(Sigma)이 추가되었다.

트립시노겐(Try) 및 α-키모트립시노겐(Chy)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구입할 수 있고 소 췌장 기원으로 얻어질 수 있다. 제형은 인산완충액(PBS, Sigma)에 제공되었고 10% 우태혈청으로 인해 필요하여 희석되었다.

다양한 제형(formulation)이 조제되고 시험되었고, 아래의 표 1에 따라 부호화되었다.

표 1: 제형 부호(Formulation Codes)

세포 생존력(viability)에 영향을 주는 제형의 농도의 이해를 얻기 위해 다양한 농도로 조제되었다. 1X으로 지정된 각 혼합물의 최초 출발 농도에 기초하여, 각 제형의 여섯 가지 다른 희석물(dilution)이 하기 표 2에 나타난 바와 같이 부호화되고 조제되었다.

표 2: 효소 농도(Enzyme Concentrations)

최적 밀도와 세포 수 사이의 상관관계를 얻기 위해, 확인된 세포 수가 파종되었고, 세포가 부착된 후에 세포는 술포로다민 B(SRB)로 착색되었다. 이 방법은 착색 후 세포의 흡광도 또는 광학밀도의 데이터를 제공하였고, 흡광도를 도 1에 도시된 바와 같은 각 세포 타입에 대한 세포 수로 전환하는 표준 곡선의 전개를 가능하게 하였다.

시험 세포계(test cell lines)에 대한 제형의 효과

시험 세포계에 대한 제형의 세포독성 효과를 알아내기 위해서, 세포는 평판 배양되고 제형으로 처리되었다. 효과는 단백질 분석 및 현미경에 의해 평가되었다.

SRB 단백질 착색이 세포 증식에 대한 여러 제형의 효과를 시험하기 위해 사용되었다. 염색제(dye)는 세포 단백질의 염기성 아미노산에 결합하고 비색 평가를 통해 세포 수에 관련된 총 단백질 질량의 추정치를 제공한다. 반최대 저지 농도(IC₅₀) 값은 각 제형에 대한 로그-선형 투여량-반응 곡선(log-linear dose-response curves)으로부터 측정되었다.

1일: 세포는 24웰(well) 배양 접시에 저밀도(세포 타입에 따라 웰당 1000-3000 세포)로 파종되었다. 사용된 세포계는 Panc1: 인간 췌관 암종 세포계, Caco2: 결장암 세포계, OE33: 식도암 세포계 및 HEK293이었다. HEK293은 인간 배아 신장으로부터 유래한 형질전환 세포계이다. 각 세포계에 대해 하나의 24웰 배양 플레이트가 여러 조합의 제형 각각을 시험하기 위해 사용되었다. 제형 희석물 각각은 네 개의 웰에서 시험되었다. 각 세포계에 대해 한 24웰 배양 플레이트가 대조구(control)로서 사용되었고, 동수의 세포가 파종되었고 배지는 처리된 세포로서 교체였다.

2일: 배지는 제거되었고 제형의 다른 농도의 희석물을 함유하는 신선한 배지가 세포에 추가되었다.

5일: 배지는 다시 제거되었고 다른 농도의 희석물을 함유하는 신선한 배지가 세포에 추가되었다.

6일 또는 7일: 세포는 10% 차가운(4℃) 트리클로로초산(TCA)으로 고정되었다. 배지의 온화한 흡인(gentle aspiration) 후에, TCA가 웰에 추가되었다. 플레이트는 4℃에서 30분 동안 방치되었고, 탈이온수로 3회 세척되었고 적어도 24시간 동안 실온에서 건조되게 방치되었다.

고정된 세포는 SRB로 다음과 같이 착색되었다. 1 ml의 0.4 SRB(w/v 1% 아세트산 용액 내)이 각 웰에 첨가되었고 20분 동안 실온에서 방치되었다. SRB는 제거되었고 플레이트는 공기 건조 전에 1% 아세트산으로 3회 세척되었다. 결합된 SRB는 50 ml의 10 mM 트리스(Tris-base) 용액으로 가용화되었고, 적어도 10분 동안 플레이트 셰이커 상에서 두었다. 100 ml의 각 웰은 96-웰 플레이트로 옮겨졌고, 이것은 24-웰 플레이트의 웰당 3회 행해졌다. 흡광도는 492 nm에서 96-웰 플레이트 리더에서 판독되었다.

식도암 세포계(OE33) 생존력에 대한 제형의 효과

OE33 세포는 3000 세포/ml의 밀도로 파종되었다 (1일). 세포는 0.25x, 0.5x, 1x, 1.25x, 2.5x 및 5x의 서로 다른 제형으로 2일 및 5일에 처리되었다. 세포는 7일에 고정되었다.

미시적으로, 제형 B로 처리는 세포가 둥근 형태(rounded morphology)를 나타내게 했고, 세포 수축 및 증가한 분리를 야기했다. 따라서 48시간 배양 후에, 약간의 세포만이 부착되어 남아 있었고, 세포 잔해 및 부동 세포가 배지에서 보였다 (도 2).

광학 현미경으로 관측된 결과는 SRB 단백질-착색 분석에 의해 확실하게 하였다. 표 3은 각 처리의 4 반복 웰(replicate wells)의 평균값을 나타내고, 제형 B의 세포사에 대한 효과는 농도에 의존하였다; 2.5x 및 5x는 웰 내의 모든 세포를 죽게 함. IC₅₀ 값은 도 3에 도시된 바와 같이, 흡광도를 농도에 대해 플롯팅하여 얻어졌다.

농도 0에 대한 OD로서 나타낸 대조구는 24 반복 웰의 평균이었다. 고정 당시, 대조구 플레이트의 모든 24웰은 완전히 융합성(confluent)이었다.

표 3: OE33 세포에 대한 여러 농도의 제형 B의 효과

인간 췌관 암종(Panc1) 세포에 대한 제형의 효과

Pan1 세포가 20,000 세포/ml의 밀도로 파종되었다 (1일). 세포는 0.25x, 0.5x, 1x, 1.25x, 2.5x 및 5x의 서로 다른 제형으로 2일 및 4일에 처리되었다. 세포는 5일에 고정되었다. 시험된 농도에서 대조구 제형 C는 Panc1 세포 생존력에 아무런 영향을 주지 못했다 (데이터 미제시). 미시적으로, 제형 B, J 및 T는 세포 생존력에 대한 영향을 나타내었고, 이들 제형의 2.5x 및 5x로 처리된 세포는 둥그레졌고(rounded up) 죽었다 (데이터 미제시)

광학 현미경에 의해 관측된 결과는 SRB 단백질 착색 분석에 의해 확실하게 하였다. 표 4는 사용된 제형의 각 농도의 4 반복 웰에 대한 평균값을 나타낸다. 제형 B, J 및 T의 세포사에 대한 효과는 농도에 종속하였다; 2.5x 및 5x는 도 4에 도시된 바와 같이 웰 내의 모든 세포를 죽게 함. IC₅₀ 값은 도 4에 나타난 바와 같이 흡광도를 농도에 대하여 플롯팅함으로써 얻어졌다. 농도 0에 대한 OD로서 나타낸 대조구는 24 반복 웰의 평균이었다.

표 4: Panc1 세포에 대한 제형 B, J 및 T의 효과

결장암 세포(Caco2)에 대한 제형의 효과

Caco2 세포는 20,000 세포/ml의 밀도로 파종되었다 (1일). 세포는 0.25x, 0.5x, 1x, 1.25x, 2.5x 및 5x의 서로 다른 제형으로 2일 및 4일에 처리되었다. 세포는 5일에 고정되었다. 시험된 농도에서 제형 C는 Caco2 세포 생존력에 아무런 영향을 주지 못했고, 처리 후 5일에 세포는 융합성 및 건강한 단층(monolayer)을 나타냈다 (데이터 미제시).

SRB 단백질 착색 분석(표 5)은 사용된 제형의 각 농도의 4 반복 웰에 대한 평균값을 나타내고, 제형 B, J 및 T의 세포사에 대한 영향은 농도에 의존하였다: 2.5x 및 5x는 도 5에 도시된 바와 같이 웰 내의 모든 세포를 죽였다. 이들 세 제형의 보다 낮은 농도는 세포 생존력에 영향을 주지 않았고, 기록된 광학밀도(OD)는 대조구 그룹과 주목할 만큼 다르지 않았다. 대조구는 24 반복 웰의 평균이었고, 고정 당시 대조구 플레이트의 모든 24웰은 완전히 융합성이었다.

표 5: Caco2 세포에 대한 제형 B, J 및 T의 효과

처리 B, J, 및 T는 시험된 세포 타입 모두에 독성 효과가 있다. 세포 생존력에 영향을 나타내는 제형 B, J 및 T의 농도는 2.5x 및 5x이었다. 처리 후 세포는 둥근 형태, 세포 수축 및 증가한 분리를 나타낸다.

제형의 IC₅₀의 측정

각 제형의 IC₅₀ 값은 흡광도를 농도에 대하여 플롯팅함으로써 얻어졌다. 서로 다른 제형의 IC₅₀이 세포계 Caco2, Panc1 및 OE33에 대해 일주일에 두 번 투여되었을 때 얻어졌다. (상응하는 실제 mg/ml 농도로) 최종 IC₅₀ 값은 이후의 세포 분석에서 사용되었다.

표 6A: Panc1에 대한 제형의 IC₅₀

표 6B: OE33세포에 대한 제형의 IC₅₀

표 6C: Caco2 세포에 대한 제형의 IC_{5 0}

세포-세포 부착 마커(marker)의 발현

제형 J 및 T의 IC₅₀ 농도로 처리 후 세포-세포 부착 마커 β-카테닌 및 E-카데린의 발현에 있어 변화가 Panc1, OE33 및 Caco2세포에서 조사되었다.

세포는 제형의 IC₅₀ 농도로 처리되었다. 세포는 채취되었고, 인산완충액(PBS)으로 3회 세척되었고, 30분 동안 PBS에서 4% 파라포름알데히드로 고정되었다. 세포는 PBS로 3회 세척되었고, -20℃에서 5분간 얼음같이 차가운 아세톤/메탄올(1:1)로 후고정되었다. 세포는 PBS에서 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 2% 차단완충액(blocking buffer solution)에서 차단되었다. 그 다음 세포는 4℃에서 차단완충액에서 희석된 1차 항체에서 밤새 배양되었다. 세포는 PBS에서 3회 세척된 후 차단완충액에서 2차 항체로 2시간 동안 배양되었다. 세포는 PBS에서 3회 세척되었고 실온에서 (핵 착색을 보여주기 위해) DAPI/PBS에서 15분 배양되었다. 커버슬립(coverslip)이 봉입제(mounting media)와 함께 슬라이드 상에 올려졌다. 대조구는 무처리 세포로 수행되었다.

간접 면역항체법이 E-카데린(Transduction Labs BD Biosciences Clone 36) 및 β-카테닌(Transduction Labs BD Biosciences Clone 14)으로 올려진 단일클론 항체를 사용하여 수행되었다. 사용된 2차 항체는 말 항-마우스(anti-mouse) 플루오레세인(Vector Labs FI2000)이다.

시험된 제형으로 처리 후 β-카테닌 및 E-카데린 발현의 증가는 형광현미기술로 샘플의 형광강도를 측정하여 정량화되었고, 동일한 샘플의 여러 필드가 측정되었고, 강도 수집의 평균을 표 7에 나타낸다.

표 7: 제형 J 및 T로 처리된 세포의 형광강도의 평균

요약

제형 J 및 T의 IC₅₀ 농도로 처리되었을 때 Panc1, Caco2 and OE33 세포는 무처리 세포와 비교하여 면역형광법의 강도에 있어서 증가를 나타냈다. 이것은 도 6 내지 13에 도시된 바와 같이 대조구 세포와 비교하여 암 세포 상의 β-카테닌 및 E-카데린 발현의 증가와 관련이 있다. β-카테닌 및 E-카데린은 녹색으로 도시되고 핵은 청색으로 도시된다.

실시예 1: 향상된 효소전구체 제형

트립시노겐(pT), 키모트립시노겐(pC) 및 α-아밀라아제(A)를 포함하는 효소전구체 제형(JBp1으로 지시되는 제형)의 24 암 세포계의 성장에 대한 영향을 측정하기 위한 연구가 수행되었다. 이러한 초기 연구에서 발생된 IC50 및 최대 저지 농도값에 기초하여, JBp1에서 3개의 각 성분의 암 세포 성장에 대한 영향을 더 이해하기 위해 3개의 세포계가 선택되었다. 연구는 JBp1의 세 성분: α-아밀라아제, 트립시노겐 및 키모트립시노겐 간의 상호작용을 이해하기 위해 이소볼로그래픽 방법을 사용하였다. 얻어진 결과에 기초하여, 향상된 제형(JBp1vP)이 제시되었고 2-데옥시-D-글루코오스(D), 캅시에이트(C) 및 메틸셀레노시스테인(M)을 포함하는 두 번째 제형과 함께 이소볼로그래픽 연구에서 시험되었다.

요약

효소전구체 제형 JBp1의 세포 성장 저지 특성이 24 인간 암 세포계의 패널(panel)에서 연구되었다. 이 패널에서 대다수의 세포계에 대한 IC50 값이 얻어졌다. IC50 값과 최대 성장 저지에 기초하여, 3개의 세포계 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2가 이소볼로그래픽 방법을 사용하여 추가적인 조합 연구를 위해 선택되었다. 이소볼로그램(isobologram)의 사용은 JBp1의 3가지 개개의 성분: α-아밀라아제, 트립시노겐 및 키모트립시노겐 간의 상호작용의 수준의 연구를 가능하게 한다. 서로 조합하고 두 성분을 혼합하여 개개의 성분의 성장 저해 활동을 연구함으로써, JBp1 제형의 향상된 조성이 확인되었고 “JBp1vP”라고 지시된다. 이 향상된 제형은 2-데옥시-D-글루코오스(D), 캅시에이트(C) 및 메틸셀레노시스테인(M)을 포함하는 제2의 제형과 조합 분석에서 시험되었고, 제2 제형은 DCM로 지시되고 제1 및 제2 제형의 조합은 JBp1vP-DCM으로 지시된다. JBp1vP과 DCM 간의 상호작용의 이소볼로그래픽 분석은, 특히 낮은 농도의 DCM에서, 상승적으로 작용하는 가능성을 나타내었다 (도 14 및 표 8에서 MIAPaCa-2 세포계에 관한 결과 참조).

표 8: A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 키모트립시노겐, 트립시노겐, α-아밀라아제 그리고 이중 조합에 관한 이소볼로그래픽 분석의 요약

이소볼로그래픽 방법

작용제의 투여량-반응 관계가 조합물의 예상된 효과를 제공하는 모델을 구성하는데 사용될 수 있다. 약(drug) A 및 B의 조합물은 (da, db)로 칭해지고, 여기서 da 및 db는 A 및 B의 투여량이다. 효과는 수학 함수 E(d_a,d_b)로서 처리된다. E는 종종 분수 효과(fractional effect)로서 표현되고, 따라서 생존 분수는 S이고: S=1-E이다. 마지막으로, Da 및 Db는 별도로 주어진 약 A 및 B의 투여량이고, 이들은 조합물과 등효과(isoeffective) 결과를 산출한다. 조합물에 사용된 약 사이의 상호작용이 없다는 가정에 기초하여 이소볼(isobole)(등효과 곡선)이 구성될 수 있다. 조합물(da, db)은 개개의 약의 투여량을 나타내는 축을 가진 그래프 상의 포인트에 의해 표현된다. 약이 상호작용을 하지 않을 경우, 이 포인트는 조합물(da, db)과 등효과인 투여량(Da 및 Db)을 나타내는 값 사이의 두 축을 연결하는 직선(이소볼) 상에 속할 것으로 예상된다. 두 화합물에 관한 영의 상호관계에 대한 방정식은

조합물에서 화합물의 수가 n인 경우, 방정식은

조합물에서 약이 개개의 투여량과 등효과인 경우, 이소볼은 직선이다. 그러나 조합물의 효과가 개개의 투여량-반응 곡선으로부터 예상된 것보다 크다면, 보다 적은 양의 d_a 및/또는 d_b가 D_a 및 D_b(둘 다 불변)와 효력이 같은 효과를 산출하기 위해 필요하고, 따라서

이 비율은 또한 g 값으로 칭해졌고, 상호작용의 타입을 결정하는데 사용되었다. 이 경우 계산된 이소볼은 오목(concave)이다. 길항작용(antagonism)은 반대 방향으로 효과를 산출하므로 이러한 타입의 상호작용을 나타내는 이소볼은 오목일 것이다.

요약하면, g 값은 다음과 같을 수 있다:

새로운 제형 JBp1의 세 성분(α-아밀라아제, 트립시노겐 및 키모트립시노겐) 간의 상호작용이 연구되었다. 또한, 이소볼로그래픽 방법이 이 제형의 세 성분의 향상된 비율을 결정하기 위해 사용되었다. 그 다음 향상된 JBp1 제형은 제2의 제형 DCM과 조합하여 연구되었다.

재료 및 방법

멸균 평저 96-웰 세포 배양 플레이트가 Becton-Dickinson(North Ryde, NSW, Australia)로부터 입수되었고; RPMI 1640 및 DMEM 세포 배양 배지, FBS, GlutaMax, 페니실린-스트렙토마이신, 소듐 피루브산(sodium pyruvate), HEPES, HAM’s, FCS 및 DPBS가 Invitrogen Australia(Mt Waverley, VIC, Australia)로부터 입수되었고; 트리판블루가 Sigma-Aldrich(Castle Hill, NSW, Australia)으로부터 입수되었고; CellTiter-Blue^® Cell Viability Assay가 Promega (Madison, WI, USA)로부터 입수되었고; SpectraMax Gemini XPS 형광계가 Molecular Devices(Sunnyvale, CA, USA)로부터 입수되었다.

이 연구에서 사용되는 모든 세포계는 인간 기원이었고 American Type Culture Collection(ATCC)(Rockville, MD, USA)로부터 공급받았다.

다음 표 9는 모든 IC50 측정 및 조합 분석에서 사용된 웰당 세포에 있어서 성장 조건 및 초기 세포 파종 밀도(seeding density)를 나타낸다. 세포는 95% 공기/5% CO₂가 공급된 가습 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 배양되었다.

표 9: IC50 연구 및 조합 분석에 관한 성장 조건 및 파종 밀도

시험 품 ( t est a rticles) 및 제형

시험품(test article) 1은 Applichem(Darmstadt, Germany)에 의해 공급된 트립시노겐이었다. 시험품 2는 BBI Enzymes(Gwent, UK)에 의해 공급된 키모트립시노겐이었다. 시험품 3은 Annecis Ltd(Lancaster, UK)에 의해 공급된 α-아밀라아제이었다. 시험품 4는 Sigma-Aldrich(Castle Hill, NSW, Australia)에 의해 공급된 2-데옥시글루코오스이었다. 시험품 5는 Propanc Pty Ltd에 의해 공급된 캅시에이트이었다. 시험품 6은 Sigma-Aldrich(Castle Hill, NSW, Australia)에 의해 공급된 메틸셀레노시스테인이었다.

α-아밀라아제, 트립시노겐 및 키모트립시노겐은 인산완충액(PBS)에 용해되었고, 즉시 사용되거나 추가 사용을 위해 4℃에서 보관되었다. 시험품 DCM은 1:1:0.0001 비율의 2-데옥시글루코오스, 캅시에이트 및 메틸셀레노시스테인으로 구성된다. 이들 세 성분은 이 비율로 함께 혼합되었고, PBS에서 재부유되었고(resuspended), 제조 후 즉시 사용되었다.

세포 성장 분석(cell growth assays)

IC50 분석에 관하여, 시험품은 파종 24 시간 후 세포에 추가되었다. 시험품 농도는 각 세포계에 대해 세 개 한 조로 시험되었다. 시험품 첨가 72시간 후 모든 플레이트에서 CellTiter-Blue^® Assay가 수행되었다.

조합 분석에 관하여, 각 실험의 반복을 위해 두 개의 96웰 플레이트가 각 세포계 및 시험품 조합에 대해 파종되었다. 시험품은 다음 피펫팅(pipetting) 계획에 따라서 파종 24시간 후 세포에 추가되었다 (범위 A3:G11 내의 세포는 2행 H열에 주어진 농도로 두 약의 조합을 함유한다).

각 세포에서 각 화합물의 초기 농도는 각 약에 대한 IC50이 희석 시리즈 내의 농도에 들어가는 방식으로 계산된 IC50에 기초하여 결정되었다. CellTiter-Blue^® 분석은 시험품 첨가 72시간 후 모든 플레이트에서 수행되었다.

시험품-함유 배지에서 세포 배양에 후속하여, 10 μL의 CellTiter-Blue^®이 각 웰에 첨가되었고 4시간까지 동안 세포를 배양하였다. 형광은 Spectramax Gemini XPS 형광계를 사용하여 측정되었다. 모든 데이터는 기록되었고 해석을 위해 Microsoft^® Excel 스프레드시트에 입력되었다.

CellTiter-Blue^® 분석으로부터 수집된 데이터는 IC50 측정을 위해 용량 반응 곡선으로서, 그리고 시험품 조합 간의 상호작용의 타입을 평가하기 위해 이소볼로그램(isobologram)으로서 플롯팅되었다. IC50 측정에 관하여, 성장 저지가 계산되었고 화합물 농도에 대하여 플롯팅되었다. 이들 플롯에서, X-축(화합물 농도)은 대수 눈금으로 표현되었다. IC50 농도는 Mac OSX용 GraphPad Prism 5.0 버전(GraphPad Software, San Diego California, USA)을 사용하여 각 화합물에 대하여 반최대(50%) 저지 농도(IC)로서 계산되었다.

조합 연구에 관하여, 이소볼로그래픽 분석이 vivoPharm의 독점 분석 템플릿(proprietary analysis template)을 사용하여 수행되었다. 이소볼로그래픽 분석은 두 화합물 사이에서 일어나는 상호작용 타입(즉, 상승적, 부가적 또는 길항적)의 척도를 제공한다. 상호작용의 타입을 규정하는 한 파라미터는 g 값이다. 전술한 바와 같이 1.0을 넘는 g 값은 길항적 상호작용을 나타내고 1.0 아래의 g 값은 상승적 상호작용을 나타낸다. 각각의 이소볼로그래픽 분석은 9 g 값이 되고, 조합물에서 제2 화합물(분석 템플릿에서 화합물 B)의 각 농도에 대해 하나이다. 이 연구에 관하여, 두 화합물 간의 상호작용은 세 그룹으로 분류되었다: 1.0 아래로 7보다 큰 g 값을 나타낸 광범위 상승적 상호작용, 1.0 아래로 3 내지 7 g 값이 된 협범위 상승적 상호작용, 1.0 아래로 3보다 작은 g 값을 산출한 상승적이지 않은 상호작용. 표 5는 이 연구에서 분석된 모든 상호작용의 요약을 나타낸다.

이 연구의 수행에 사용된 모든 절차는 표준작업 절차서에 따라서 수행되었다.

결과

IC50 측정 분석이 24 암 세포계에서 JBp1에 대해 수행되었다. 표 10에서 보는 바와 같이, IC50 값은 15 세포계((A2780, HOP-92, BxPc-3, HT-29, KYSE-30, MIAPaCa-2, OE-33, A549, HCT-15, OE-21, NCI-H82, HCT-116, MDA-MB468, NCI-H460 및 BT474)에 대해 얻어졌다. 나머지 세포계는 이 연구에서 시험된 JBp1의 농도 범위 내의 IC50 값의 측정을 감안하지 않았던 최대 저지 값 또는 용량 반응 곡선을 나타냈다. 표 10은 24 세포계에 관한 IC50 및 최대 성장 저지 값을 최대 성장 저지로부터 감소하는 순서로 나타낸다.

24 세포계에 대해 얻어진 IC50 및 최대 저지 값 그리고 후속 동물 연구를 위한 각 세포계의 적합성에 기초하여, 3개의 세포계가 이소볼로그래픽 연구를 위해 선택되었다. 이들 세포계 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2는 표 10에서 굵은 글자로 강조된다.

표 10: 24 세포계에서 JBp1관한 IC50 값의 요약

화합물 간의 상호작용 연구를 위한 이소볼로그래픽 방법은 조합 분석을 진행하기 전에 이들 성분에 대한 IC50 값의 측정을 요한다. 따라서 IC50 측정 분석이 3개의 선택된 세포계 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2에서 JPb1의 3개의 각 성분 즉, 트립시노겐, 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제에 대해 수행되었다. 표 11에 보는 바와 같이, 트립시노겐은 3개의 세포계 모두에서 0.23 내지 0.41 mg/mL 범위의 IC50 값을 나타냈다. α-아밀라아제 및 키모트립시노겐은 시험된 농도 범위 내에서 IC50 값을 나타내지 않았다.

표 11: A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2에서 트립시노겐, 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제에 관한 IC50 값 및 최대 성장 저지의 요약

이소볼로그래픽 분석은 두 화합물 간에 일어나는 상호작용 타입(즉, 상승적, 부가적 또는 길항적)의 척도를 제공한다. 상호작용의 타입을 규정하는 한 파라미터는 g 값이다. 전술한 바와 같이 1.0을 넘는 g 값은 길항적 상호작용을 나타내고 1.0 아래의 g 값은 상승적 상호작용을 나타낸다. 각각의 이소볼로그래픽 분석 결과는 9 g 값이고, 조합물에서 제2 화합물(분석 템플릿에서 화합물 B)의 각 농도에 대한 하나이다. 이 연구에 관하여, 두 화합물 간의 상호작용은 세 그룹으로 분류되었다: 1.0 아래로 7보다 큰 g 값을 나타낸 광범위 상승적 상호작용, 1.0 아래로 3 내지 7 g 값이 된 협범위 상승적 상호작용, 그리고 1.0 아래로 3보다 작은 g 값을 산출한 비상승적 상호작용. 표 8은 이 연구에서 분석된 모든 상호작용의 요약을 나타낸다

α-아밀라아제 및 키모트립시노겐에 대해 얻어진 IC50 값이 없었다는 사실에도 불구하고, 서로 간의 그리고 트립시노겐과의 상호작용이 조합 분석에서 연구되었는데, 이들 성분은 제2 화합물과 조합될 때 그럼에도 상호작용하는 것으로 이해되기 때문이다. 도 15-17은 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 α-아밀라아제, 트립시노겐 및 키모트립시노겐 간의 조합 분석으로 기인한 이소볼로그램을 나타낸다.

도 15 및 표 8에서 보는 바와 같이, 트립시노겐 및 키모트립시노겐은 A-549 및 MIAPaCa-2 세포에서 광범위의 상승적 상호작용과 일치하는 이소볼로그래픽 결과를 나타냈다. HCT-15 세포에서, 이소볼로그래픽 프로파일은 길항적이지 않은 상호작용과 일치하였다 (이소볼로그래픽 라인이 X-축 상에 거의 놓이게 위치하고 도면에서 명확히 구별되지 않을 것이다). 세 가지 선택된 세포계에서 조합 분석의 전체 결과에 기초하여, 제형에서 트립시노겐 및 키모트립시노겐의 향상된 비율이 6:1(키모트립시노겐:트립시노겐)로 설정되어야 한다고 규정되었다. 이 비율은 다음에 의해 뒷받침된다: 1) A-549 및 MIAPaCa-2 세포에서 1및 2 mg/mL의 키모트립시노겐에서 매우 낮은 g 값에 의해 반영된, 보다 높은 농도의 키모트립시노겐은 성장 저지 효과를 상당히 증가시켰다; 2) 0.25 mg/mL보다 높은 트립시노겐의 농도는 추가적인 저지 효과를 더하지 않았다. 따라서 키모트립시노겐의 최고 두 농도의 평균(1.5 mg/mL)이 트립시노겐의 농도(0.25 mg/mL)로 나뉘어 1.5 대 0.25 또는 6:1의 비율이 얻어졌다.

도 16은 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 트립시노겐과 α-아밀라아제 간의 상호작용에 관한 이소볼로그램을 나타낸다. 이들 두 화합물의 조합 결과는 A-549, 및 MIAPaCa-2 세포에서 상승적 상호작용으로 HCT015 세포에서 비상승적 상호작용으로 나타났다 (표 8). 긍정적인 상호작용은 MIAPaCa-2 세포에서 광범위 타입 그리고 A-549 세포에서 협범위 타입이었다. 3종의 시험된 세포계에서 이러한 상호작용에 대해 관측된 반응 범위를 고려해 볼 때, 이들 데이터는 JBp1 제형에서 이들 두 성분 간의 비율을 결정하는데 사용되지 않았다.

도 17은 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 키모트립시노겐과 α-아밀라아제 간의 상호작용에 관한 이소볼로그램을 나타낸다. 이들 두 화합물의 조합 결과는 MIAPaCa-2 세포에서 상승적 상호작용으로, A-549 및 HCT-15 세포에서 비상승적 상호작용으로 나타났다. 키모트립시노겐의 세포 성장 저지 효과에 대한 α-아밀라아제의 부정적인 영향을 고려해 볼 때, JBp1의 다른 두 성분에 대한 이 성분의 비율을 원래 농도(1:0.25, 키모트립시노겐:α-아밀라아제 )로 두기로 결정하였다.

요컨대, 제1 라운드의 조합 분석 후에, 키모트립시노겐:트립시노겐의 비율은 6:1로 설정되고 키모트립시노겐: α-아밀라아제 및 트립시노겐:α-아밀라아제의 비율은 1:0.25의 원래 농도로 사용되기로 결정되었다.

조합 연구의 제2 라운드에 관하여, 한 쌍의 화합물과 앞서 규정된 비율이 다음과 같은 새로운 시험 화합물로서 다시 규정되었다:

- 키모트립시노겐:트립시노겐(6:1)=TC

- 키모트립시노겐:α-아밀라아제(1:0.25)=CA

- 트립시노겐:α-아밀라아제(1:0.25)=TA

IC50 측정 분석이 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 이들 재정립된 화합물에 대하여 수행되었다. 표 12는 이들 선택된 세포계에서 3개의 화합물에 대한 용량 반응 곡선 그리고 계산된 IC50 값 및 최대 성장 저지를 나타낸다. IC50 값은 3종의 세포계 모두에서 TC 및 TA에 대하여 얻어졌다. 그러나 IC50 값은 시험된 농도 범위 내에서 CA에 대하여 찾아내지 못했다.

표 12: A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 TC, TA 및 CA에 대한 IC50 값 및 최대 성장 저지의 요약

TC, CA 및 TA에 대한 IC50 값의 측정 후에, 조합 분석이 이들 세 성분과 JBp1 제형에서 상응하는 제3 성분 간에 수행되었다 (즉, TA 대 키모트립시노겐, CA 대 트립시노겐, TC 대 α-아밀라아제).

도 18은 TA와 키모트립시노겐 간의 조합물에 대한 이소볼로그램을 나타낸다. 이들 두 화합물의 조합 결과는 A-549 및 MIAPaCa-2 세포에서 상승적 상호작용을, HCT-15 세포에서 비상승적 상호작용이었다.

도 19는 CA와 트립시노겐 간의 조합물에 대한 이소볼로그램을 나타낸다. 이들 두 화합물의 조합 결과는 HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 상승적 상호작용을, A-549 세포에서 비상승적 상호작용이었다. 종합적으로, 관측된 경향은 이들 두 성분에 대하여 긍정적인 상호작용으로 향하였고, 키모트립시노겐과 트립시노겐 간에 관측된 상승적 상호작용과 일관되었다. 이들 결과는 앞서 논의된 결과에 기초한 6:1(키모트립시노겐:트립시노겐) 비율을 또한 뒷받침한다.

도 20은 TC와 α-아밀라아제 간의 상호작용에 대한 이소볼로그램을 나타낸다. 이 조합에 대해 관측된 전반적인 경향은 비상승적 상호작용과 일관되었다. TC의 성장 저지 효과에 대한 α-아밀라아제의 이러한 부정적인 효과를 더 분석하기 위해, TC에 대한 IC50 값이 이소볼로그래픽 분석 템플릿으로부터 추출되었고 α-아밀라아제의 상응하는 농도에 대해 플롯팅되었다. 값은 3종의 세포계 모두에서 α-아밀라아제의 농도에 비례하여 증가하였다. 이들 결과는 JBp1 제형에서 α-아밀라아제의 수준이, 키모트립시노겐 및 트립시노겐과의 잠재적인 길항적 효과를 피하기 위해서, 낮게 유지되어야 하는 것을 시사한다.

상기 표 8은 서로에 대한 개개의 그리고 이중 성분에 관한 조합 결과 모두를 요약한다.

전술한 조합 연구에 기초하여, JBp1 제형에서 키모트립시노겐, 트립시노겐 및 α-아밀라아제의 비율이 6:1:0.25(키모트립시노겐:트립시노겐:α-아밀라아제)로 규정되었다. 이러한 향상된 JBp1 제형은 원래 JBp1 제형과 구별 짓기 위해서 접미사 “vP”에 의해 식별되었다.

IC50 값이 향상된 제형 JBp1vP에 대해 측정되었고 원래 제형 JBp1에 대해 얻어진 값과 비교되었다. 표 13은 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 이들 두 제형에 대한 용량 반응 곡선, IC50 값 및 최대 성장 저해를 나타낸다. 이들 결과가 나타내는 바와 같이, 향상된 JBp1vP 제형은 A-549 및 HCT-15 세포에서 보다 더 낮은 IC50 값을, MIAPaCa-2 세포에서 유사한 IC50 값을 나타냈다. 중요하게는, JBp1vP는 3종의 세포계 모두에서 JBp1보다 더 높은 최대 성장 저지를 나타냈다.

표 13: A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 JBp1, JBp1vP 및 DCM에 대한 IC50 값 및 최대 성장 저지의 요약

JBp1vP는 시험 화합물 DCM과 조합하여 세포 성장을 저지하는 이것의 능력에 대해 조사되었다. 조합 분석 전에, DCM의 IC50이 A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2 세포에서 측정되었다. 표 8 및 13에 나타낸 바와 같이, DCM은 3종의 세포계 모두에 대해 0.15 내지 1.5 mg/mL 범위의 IC50 값 그리고 92%를 넘는 최대 성장 저지값을 나타냈다.

도 14는 JBp1vP과 DCM 간의 조합에 대한 이소볼로그램을 나타낸다. 이소볼로그래픽 분석은 이들 두 성분 간의 상호작용이 A-549 및 HCT-15 세포에서 상승적이지 않았다는 것을 나타낸다. MIAPaCa-2 세포에서, JBp1vP과 DCM의 조합 결과는, 특히 낮은 농도의 DCM에서, 협폭 상승적 상호작용이었다. 이 조합 연구에 대한 g 값은 DCM의 최저 두 농도에 대해 1.0을 훨씬 밑돌았다.

M은 JBp1에 대해 길항적 효과를 제공할 수 있다고 믿어졌던 것을 감안하면, 이들 결과는 DCM이 JBp1과 조합하여 유효하다는 것을 예상 외로 나타냈다.

요약하면, JBp1vP과 DCM는 낮은 농도의 DCM에서 상승적으로 상호작용하고, JBp1vP는 JBp1 제형에 비해 in vitro 향상된 암 세포 성장 저지 효과를 또한 나타내고, JBp1vP와 DCM는 암 세포 성장을 저지하기 위해서 in vitro 협력 작용한다.

실시예 2: 향상된 효소전구체 제형의 i n v ivo 연구

단독으로 또는 보조제 DCM(각각 30.55 mg/kg, 29.12 mg/kg, 0.003 mg/kg의 2-데옥시글루코오스, 캅시에이트 및 메틸셀레노시스테인)과 조합하여, 0.13 mg/kg, 0.78 mg/kg 및 0.03 mg/kg으로 각각 투여된 JBp1(트립시노겐, 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제)의 in vivo 항혈관형성 효능을 측정하기 위한 연구가 수행되었고,vivoPharm's AngioChamber™ 분석을 사용하여 조사되었다. 상기 AngioChamber™ 분석은 이식된 챔버(implanted chamber) 주위에서 섬유피막 형성을 촉진하기 위해 상처 치유의 정상의 생리학적 프로세스를 이용한다 (Wood, J.M., Bold, G., Buchdunger, E., Cozens, R., et al. PTK787/ZK 222584, a Novel and Potent Inhibitor of Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinases, Impairs Vascular Endothelial Growth Factor-Induced Responses and Tumour Growth After Oral Administration. Cancer Research, 60 (8):2178-2189 (2000)). 챔버 내 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF)의 포함은 혈관 발달을 유도하는 동안 섬유피막 형성을 지원한다. 따라서 이 시스템은 섬유피막 형성(말단에서 피막의 습윤 중량)을 측정함으로써 항혈관형성 처리의 효능을 평가하는데 사용된다.

요약

50마리의 암컷 FvB 마우스 각각이, bFGF와 함께 또는 없이, 피하 이식 AngioChamber™를 받았다. 10마리의 마우스가 랜덤으로 선택되고 bFGF 없이 챔버로 이식되었다. bFGF를 함유하는 챔버로 이식된 40 마리의 마우스는 연구 0일에 10 마리 마우스의 4개의 처리 그룹으로 체중에 의해 임의 추출되었다.

JpB1은 0.13 mg/kg, 0.78 mg/kg 및 0.03 mg/kg으로 각각 투여된, 트립시노겐, 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제로 이루어졌다. DCM은 각각 30.55 mg/kg, 29.12 mg/kg, 0.003 mg/kg의 2-데옥시글루코오스, 캅시에이트 및 메틸셀레노시스테인으로 이루어졌다. 각 그룹의 마우스는 비히클 컨트롤(vehicle control)(NMP:PEG300(1:9, v/v), p.o., 5 mL/kg), JBp1(i.p., 10 mL/kg 투여량), JBp1-DCM(i.p., 10 mL/kg 투여량) 또는 소라페니브(sorafenib)(60 mg/kg, p.o., 5 mL/kg 투여량)로 매일 처리(0 내지 4일)를 받았다. 비히클 컨트롤은 두 그룹에 투여되었고, 그 중 하나는 bFGF 없이 로딩된 AngioChambers™(기준선 대조구)로 이식되었고, 다른 하나는 bFGF를 가진 AngioChambers™(유도 대조구)로 이식되었다. 화합물 처리 그룹은 bFGF로 로딩된 AngioChambers™으로 이식되었다.

체중 측정은 제1 처리일(0일)에 모든 동물에 대해 기록되었고, 연구의 종료일(5일)까지 기록되었다.

모든 그룹 내 마우스는 처리 시작 후 즉시 체중이 감소되었고, 수술 절차의 예상된 결과이다. (bFGF를 가진) 비히클 컨트롤 JBp1 및 JBp1-DCM으로 처리된 마우스는 연구의 남은 기간에 걸쳐 체중이 회복되었고, 종료일에 평균 체중의 의미 있는 손실이 없었다. (bFGF 없는) 비히클 컨트롤 및 소라페니브로 처리된 마우스에서는 체중이 회복되지 않았고, 두 그룹 모두 연구 종료 시 상당한 체중 손실이 있었고, 이것은 NMP:PEG300으로 처리된 마우스에서 흔하다.

AngioChambers™은 최종 처리(5일) 후 24 시간 각 마우스로부터 삭제되었다. 챔버 주위의 섬유피막은 제거되었고 습윤 중량이 기록되었다.

연구 종료일에 피막 습윤 중량에 의해 나타낸 바와 같이, 모든 처리는 유도 대조구와 비교하여 bFGF-유도된 혈관형성의 상당한 저지를 야기했다. 효과적인 혈관형성 약 비교기인 JBp1-DCM 및 소라페니브로 처리는 JBp1 단일치료와 비교하여 혈관형성을 축소시켰다. JBp1-DCM와 소라페니브 간에는 항혈관형성 활동에 있어 의미 있는 차이가 없었다. 따라서, 이 모델에서, JBp1 및 JBp1-DCM 모두는 섬유피막 형성의 저지에 효능이 있었다. JBp1 제형에 DCM의 첨가는 JBp1 단독과 비교하여 향상된 저지를 가져왔다. JBp1-DCM의 처리는 이 모델에서 소라페니브만큼 유효하였다.

재료 및 방법

헤파린, NMP, PBS 및 PEG300을 Sigma-Aldrich(Castle Hill, NSW, Australia)로부터 입수하였다. 0.22 μM Acrodisc 필터는 Pall Corporation(Sydney, NSW, Australia)으로부터 입수되었다. 재조합 인간 bFGF는 Shenandoah Biotechnology(Warwick, PA, USA)로부터 입수되었다. AngioChambers™는 Angst + Pfister AG(Stuttgart, Germany)에 의해 공급되었다. 아가로스는 Omnigel Lo.M(Edwards Instruments Co., NSW, Australia)에 의해 공급되었다.

시험 시스템은 50마리의 암컷 FvB 마우스를 포함하였고, 그룹당 10 마리의 연구 그룹이었다 (2 대조구 및 3 처리 그룹). 표준 환경 및 식이요법(regimes)이 동물 관리를 위해 사용되었다.

퍼플루오르(perfluoro)-알콕시-테플론(Teflon®-PFA, 21 mm x 8 mm 직경, 550 μL 부피)으로 만들어지고 80개의 규칙적으로 간격을 둔0.8 mm 구멍이 천공된 다공성 조직 챔버(AngioChambers™)가 사용되었다. 양단은 동일한 재료로 된 제거 가능한 뚜껑으로 밀봉되었다. 챔버는 4 μg/mL bFGF를 넣거나 넣지 않은, 20 IU/mL 헤파린을 함유하는 0.8% 아가로스로 멸균 상태에서 충전되었다. 아가로스 용액은 챔버를 충전하기 전에 37℃로 유지되었다.

챔버 이식에 관하여, 마우스는 이소플루란 흡입에 의해 마취되었다. 작은 절개가 각 마우스의 중앙 등 부분의 피부에 행해졌고 챔버가 피하로 삽입되었고 견갑골 사이에 위치하였다. 상처는 2개의 1.4 mm 상처 클립(Michel Clip)으로 봉해졌다.

시험 화합물 및 제형

비히클 컨트롤은 NMP:PEG300(1:9 v/v)이었다. JpB1는 시험품 1이었고, 0.13 mg/kg, 0.78 mg/kg 및 0.03 mg/kg으로 각각 투여된, 트립시노겐, 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제로 이루어졌다. DCM은 시험품 2였고, 각각 30.55 mg/kg, 29.12 mg/kg, 0.003 mg/kg의 2-데옥시글루코오스, 캅시에이트 및 메틸셀레노시스테인으로 이루어졌다. 각 화합물은 PBS에 개별적으로 용해되었다. 모액(stock solution)은 여과(0.22 μM)에 의해 멸균되었다. 매 투여일에, 모액은 절절한 조합물로 혼합되었다.

소라페니브는 기준 화합물이었고, 200 mg 활성 소라페니브를 함유하는 315 mg 정제로서 공급되었다. 정제는 분쇄되고 NMP에 용해되어 활성 소라페니브의 모액을 조제하였고, 이것은 최종 NMP:PEG300 비율이 1:9인 요구되는 투여량 농도를 얻기 위해 PEG300으로 희석되었다.

10마리의 마우스는 임의로 선택되었고 bFGF 없는 챔버로 이식되었다. 40 마리의 마우스는 bFGF를 함유하는 챔버로 이식되었고, 연구 0일에 체중에 의해 4개의 10마리 마우스의 처리 그룹으로 임의 추출되었다. 처리는 0일(마우스가 수술에서 회복 된 후 2시간)에 시작되었고 연이어 5일(0일에서 4일) 동안 계속되었다.

비히클 컨트롤(NMP:PEG300(1:9 v/v))(그룹 1 및 2) 및 소라페니브(60 mg/kg; 그룹 5)는 5 mL/kg.의 투여량으로 경구로(p.o.) 투여되었다. JBp1(각각 0.13 mg/kg, 0.78 mg/kg 및 0.03 mg/kg의 트립시노겐, 키모트립시노겐 및 α-아밀라아제)은 단독으로(그룹 3) 그리고 DCM(각각 30.55 mg/kg, 29.12 mg/kg, 0.003 mg/kg의 2-데옥시글루코오스, 캅시에이트 및 메틸셀레노시스테인)(그룹 4)과 조합하여 투여되었다. 양자는 10 mL/kg의 투여량으로 복강 내 주사(i.p.)에 의해 투여되었다. JBp1 및 DCM이 조합하여 투여된 경우, 모든 6종의 화합물이 제형화되었고 하나의 주사에서 함께 투여되었다.

각각의 동물의 체중이 투여 직전에 측정되었다. 각 동물에 투여된 투여액의 용량은 개개의 체중에 기초하여 계산되고 조절되었다.

동물은 연구 0일에 AngioChamber™를 이식하는 수술로부터 마우스가 회복된 2시간 후에 시작하여 전술한 스케줄에 따라 처리되었다. AngioChamber™는 종료일(5일)에 사후의 모든 마우스로부터 제거되었다. 각 챔버 주위에 형성된 혈관성(vascularised) 섬유피막은 주의하여 제거되었고 즉시 습윤 중량이 기록되었다.

임의의 동물의 처리는 그것의 체중이 연구 시작 시 체중의 85% 아래로 떨어졌다면 중단된다. 이것이 발생하였다면, 체중 측정은 단기간 동안 계속된다. 체중에서 증가가 측정되지 않았다면, 동물은 도태된다. 처리에 대한 심각한 거부 반응이 관찰되었다면, 동물은 또한 도태된다. 거부 반응의 정도는 증상과 수반 점수(부록 2에 주어진 지표)를 열거한 임상 점수표 서식(pro-forma clinical score sheet)을 사용하여 평가되었다. 관측된 증상의 조합 및 그에 따른 합산된 점수는 동물의 복지와 관련하여 취해져야 할 행동방침을 결정하였다.

시험품에 의한 혈관형성 저지(%)는 다음 식을 사용하여 계산되었다:

%저지 = [(A-B)/(A-C) x 100]

여기서 A는 성장인자를 함유하고 비히클 컨트롤로 처리된 AngioChambers™가 이식된 마우스로부터의 평균 피막 중량이고 (그룹 2),

B는 성장인자를 함유하고 시험품으로 처리된 AngioChambers™가 이식된 마우스로부터의 평균 피막 중량이고 (그룹 3-5),

C는 성장인자가 없고 비히클 컨트롤로 처리된 AngioChambers™가 이식된 마우스로부터의 평균 피막 중량이다 (그룹 1).

모든 통계적 계산은 SigmaStat 3.0(SPSS Australasia, North Sydney, NSW, Australia)을 사용하여 수행되었다. 대응표본 T-검정(paired t-test)이 0일과 연구 종료일 사이의 처리 그룹 내 체중 변화에 있어 중요성을 결정하기 위해 사용되었다. 데이터가 정규성 검정(Normality Test)을 통과하지 않은 경우, Wilcoxon Signed Rank Sum Test가 수행되었다. 나머지 통계학적 분석의 목표는 기준 화합물, 소라페니브 및 시험품이 bFGF에 의해 섬유피막의 유도를 현저하게 억제하였다는 것을 보여주기 위함이었다. bFGF에 의한 섬유피막 형성의 현저한 유도는 연구 결과를 수락하는데 필수적인 것으로 고려된다. 일원분산분석(One-Way ANOVA)이 연구 종료 시 피막 중량 데이터에 대해 수행되었다. 의미 있는 차이가 발견되었을 경우, 모든 쌍별 다중비교(Pairwise Multiple Comparison) 및 다중비교 대 대조구 그룹 절차(Holm-Sidak Method)가 수행되었다. 0.05 보다 작은 p 값은 의미 있는 것으로 고려되었다.

이 연구의 수행에서 사용된 모든 절차는 vivoPharm 의 표준작업 절차서에 따라서, 특히 SOP # vP_EF0317 "혈관형성 연구에 대한 일반적 절차"를 참조하여, 수행되었다. 표준작업 절차서는 vivoPharm의 안전시설에 철해져 유지된다.

결과 및 논평

모든 그룹 내 모든 마우스는 연구 기간 중에 입모(piloerection)를 나타냈다. 비히클 컨트롤(bFGF 유, 그룹 2)로 처리된 한 마우스는 연구 1일에, 아마도 수술 합병증으로 인해, 죽은 것으로 발견되었다. 비히클 컨트롤(bFGF 무, 그룹 1)로 처리된 한 마우스는 4일에 오른쪽 뒷다리가 복부 털에 부착되었다. 이것은 흡입 마취제 하에 분리되었다.

모든 그룹의 마우스는 처리 시작 직후, 아마도 수수 절차로 인해, 체중이 줄었다. 비히클 컨트롤(bFGF 유, 그룹 2), JBp1(그룹 3) 및 JBp1-DCM(그룹 4)로 처리된 마우스는 연구의 나머지 기간에 걸쳐 체중이 꾸준히 회복되었고, 종료일에 평균 체중의 의미 있는 감소가 없었다.

비히클 컨트롤(bFGF 무, 그룹 1) 및 소라페니브(그룹 5)로 처리된 처리된 마우스에서는 체중이 회복되지 않았고, 두 그룹은 연구의 종료 시 상당한 체중 감소(각각 5.5% 및 5.6%)가 있었다.

섬유피막의 습윤 중량은 AngioChambers™ 내에 포획된 bFGF에 의해 그리고 그 후에 내생의 VEGF의 자극에 의해 유도된 혈관형성의 정도에 의해 주로 추진된다. 작은 또는 가벼운 섬유피막은 작은 정도의 혈관형성 및 그러므로 특정 처리에 의한 혈관형성의 보다 높은 저지와 연관된다.

이 연구에서, 절단된 피막(excised capsules)의 섬유피막 형성은 bFGF가 챔버에 로딩되지 않은 비히클 컨트롤(그룹 1, 기준선 대조구)에서보다 bFGF가 챔버에 로딩된 비히클 컨트롤(그룹 2, 유도 대조구)에서 상당히 더 많았고 (도 21), bFGF가 피막 형성을 충분히 그리고 상당히 자극했다는 것을 나타낸다.

모든 처리 그룹에서 bFGF가 챔버 내로 로딩되었으므로, 이후에 논의되는 비히클 컨트롤 그룹에 대한 모든 비교는 유도 대조구, 그룹 2(챔버 내 bFGF 로딩됨)를 나타낸다.

도 21은 그룹 1-5에 대한 시험 결과를 나타낸다. 그룹 1은 bFGF 없는 비히클 컨트롤(NMP:PEG300(1:9, v/v))이다. 그룹 2는 bFGF 있는 비히클 컨트롤(NMP:PEG300(1:9, v/v))이다. 그룹 3은 bFGF 있는 JBp1*이다. 그룹 4는 bFGF 있는 JBp1-DCM*이다. 그룹 5는 bFGF 있는 소라페니브 60 mg/kg이다. 참조 부호 “a”는 유도 대조구(bFGF 유 비히클 컨트롤(그룹 2))와 상당히 다름을 의미한다 (p<0.05: 일원분산분석). 참조 부호 “b”는 JBp1 단일치료(bFGF 유)(그룹 3)와 상당히 다름을 의미한다 (p<0.05: 일원분산분석). 모든 처리는 5일(0-4일) 동안 매일 한 번 투여되었다.

JBp1, JBp1-DCM 및 소라페니브(각각 그룹 3, 4 및 5)로 처리는, 피막 중량의 차이에 의해 나타난 바와 같이, 유도 대조구(그룹 2)과 비교하여 혈관형성에 있어 현저한 감소를 가져왔다 (도 21). JBp1-DC 및 소라페니브(각각 그룹 4 및 5)으로 처리는 JBp1 단일치료(그룹 3)와 비교하여 혈관형성을 현저하게 감소시켰다.

JBp1 단독(그룹 3)으로 처리된 마우스로부터 채취된 챔버는 JBp1-DCM(그룹 4)으로 처리된 것보다 섬유피막과 챔버 사이의 공간에 더 많은 자유 혈액(free blood)이 있었다. JBp1-DCM(그룹 4)로 처리된 마우스로부터 채취된 챔버 주위의 섬유피막은 비히클 컨트롤(bFGF 무 및 유; 각각 그룹 1 및 2)로 처리된 것보다 더 뻣뻣하였다.

결론

단독으로 그리고 DCM(2-데옥시글루코오스(30.55 mg/kg), 캅시에이트(29.12 mg/kg) 및 메틸셀레노시스테인(0.003 mg/kg))과 조합하여 투여된, JBp1 JBp1(트립시노겐(0.13 mg/kg), 키모트립시노겐(0.78 mg/kg) 및 α-아밀라아제(0.03 mg/kg))으로 복강 내 치료의 in vivo 항혈관형성 효능이 vivoPharm's AngioChamber™ 분석을 사용하여 암컷 FvB 마우스에서 조사되었다. 시험품의 효과는 기준 화합물, 소라페니브(60 mg/kg, p.o.)의 효과와 비교되었다.

이 연구에서, 모든 처리는, 연구 종료일에 피막 습윤 중량에 의해 나타낸 바와 같이, 유도 대조구와 비교하여 bFGF-유도된 혈관형성의 상당한 저지를 가져왔다. 기준 화합물 소라페니브, 그리고 JBp1-DCM의 조합 모두는 JBp1 단일치료와 비교하여 혈관형성을 상당히 감소시켰다. 따라서 JBp1-DCM은 혈관형성을 저감시키는데 있어서 효과적인 것으로 나타난다.

실시예 3: 효소전구체 제형의 in vitro 연구

메틸셀레노시스테인(M), 캅시에이트(C) 또는 2-데옥시글루코오스(D)의 활성제와 함께 트립시노겐(pT), 키모트립시노겐(pC) 및 α-아밀라아제(A)(JBp1vP로서 지칭되는 제형)를 포함하는 효소전구체 제형의 효과를 측정하기 위한 연구가 수행되었다. 상기 연구는 이들 성분 간의 상호작용을 이해하기 위해 이소볼로그래픽 방법을 적용하였다.

요약

이들 효소 전구체 제형의 세포 성장 저지 특성이 검토되었다. IC50 값 및 최대 성장 저지에 기초하여, 3개의 세포계, A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2가 이소볼로그래픽 방법을 사용하는 조합 연구를 위해 선정되었다. 이소볼로그램의 사용은 3개의 개개의 성분과 JBp1vP 사이의 상호작용의 수준의 연구를 가능하게 했다. 서로 조합하여 그리고 JBp1vP과의 혼합물로서 개개의 성분의 성장 저지 활동을 검토함으로써 향상된 제형이 발견되었다. 이들 향상된 제형의 결과는 도 22-24에 나타나고, 이것은 HCT-15 세포에서 JBp1vP 그리고 개개의 M, C 및 D 각각에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.

실시예 4: 2-데옥시글루코오스 및 메틸셀레노시스테인을 함유하는 제형의 in vitro 연구

메틸셀레노시스테인(M) 및 2-데옥시글루코오스(D)를 포함하는 제형의 효과를 측정하기 위한 연구가 착수되었다. 상기 연구는 이들 성분 간이 상호작용을 이해하기 위해 이소볼로그래픽 방법을 사용하였다.

요약

이들 효소전구체 제형의 세포 성장 저지 특성이 검토되었다. IC50 값 및 최대 성장 저지에 기초하여, 3종의 세포계, A-549, HCT-15 및 MIAPaCa-2가 이소볼로그래픽 방법을 사용하는 조합 연구를 위해 선택되었다. 이소볼로그램의 사용은 이들 두 성분 사이의 상호작용 수준의 연구를 가능하게 한다. 개개의 성분 및 서로 간의 조합물에서 성장 저지 활동을 검토함으로써, 향상된 제형이 확인되었다. 향상된 제형의 결과는 도 25에 나타나고, 이것은 HCT-15 세포에서 M 및 D 조합에 대한 이소볼로그래픽 분석을 제공한다.

Claims (37)

1. 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 조성물은 암 치료를 위한 다기능 접근법을 제공할 수 있고, 여기서 상기 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐 및 키모트립시노겐 중 적어도 하나로부터 선택되고, 상기 활성제는 셀레늄 화합물, 바닐로이드 화합물 및 세포질 해당 저감제, 그리고 옵션으로 글리코시드 가수분해효소 중 적어도 하나로부터 선택되는 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐 및 키모트립시노겐인 약학 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비가 4:1 내지 8:1의 범위인 약학 조성물.
4. 제3항에 있어서, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비가 5:1 내지 7:1의 범위인 약학 조성물.
5. 제4항에 있어서, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비가 6:1 인 약학 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀레늄 화합물은 화학식 I 또는 화학식 II 의 화합물, 또는 이것의 약학적 허용 염인 약학 조성물:
   

   

   
   R₁ 및 R₃는 각각 H, OH, -C(O)H, -C(O)OH, -C(O)-OR₅, C_1-4알킬 및 C_2-6알케닐로부터 독립적으로 선택됨, 여기서 C_1-4알킬 및 C_2-6알케닐은 할로겐, OH, -NH₂, -C(O)OH, -C(O)-OR₅으로부터 독립적으로 선택된 0-3 치환기로 옵션으로 치환됨;
   R₂ 및 R₄는 각각 H, OH, -C(O)H, -C(O)OH, -C(O)-OR₅, C_1-12알킬 및 C_2-12알케닐로부터 독립적으로 선택됨, 여기서 C_1-12알킬 및 C_2-12알케닐은 -NH-, -N(C_1-4알킬)-, -NH(CO)-, C(O)-, -C(O)O-, -O- 및 -C(NH₂)H-C(O)O-으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 옵션으로 중단되고, 할로겐, -NH₂, -OH, -C_1-4알킬, -C(O)OH, -C(O)H, -C(O)-OR₅, -N(C_1-4알킬)H, -N(C_1-4알킬)₂, -C(NH₂)H-C(O)OH, 시클로알킬, 시클로알케닐 및 아릴로부터 독립적으로 선택된 0-3 치환기로 옵션으로 치환됨; 및
   R₅는 알킬, 알케닐, 시클로알킬 및 시클로알케닐로부터 선택됨.
7. 제6항에 있어서, R₁ 및 R₃은 각각 H, OH 및 C_1-4알킬로부터 독립적으로 선택되는 약학 조성물.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, R₂ 및 R₄는 각각 H, OH 및 -C_1-6알킬-C(NH₂)H-C(O)OH로부터 독립적으로 선택되는 약학 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀레늄 화합물은 메틸셀레노시스테인 또는 이것의 약학적 허용 염인 약학 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바닐로이드 화합물은 화학식 III의 화합물 또는 이것의 약학적 허용 염인 약학 조성물:
    

    

    
    R₁ 및 R₂는 각각 H, OH, OCH₃, C(O)H, OC_2-6알킬, OC_2-6알케닐, SH, SC_1-6알킬, NH₂, NHC_1-6알킬 및 N(C_1-6알킬)₂로부터 독립적으로 선택됨;
    R₃ 및 R₄는 각각 H, C_1-20알킬, C_2-20알케닐 및 C_2-20알키닐로부터 독립적으로 선택됨, 여기서 C_1-20알킬, C_2-20알케닐 및 C_2-20알키닐은 -NR₆-, -NH(CO)-, C(O)-, -C(O)O-, -O-, -C(NR₆R₆)H-C(O)O-, -C(S)-, -C(S)NR₆- 및 -NR₆-C(S)-NR₆으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 옵션으로 중단되고, 할로겐, -NH₂, -OH, -C_1-4알킬, -C(O)OH, -C(O)OR₅, -C(O)H, -N(C_1-4알킬)H, -N(C_1-4알킬)₂, -C(NH₂)H-C(O)OH, -C(S)-, 옵션으로 치환된 시클로알킬, 옵션으로 치환된 시클로알케닐 및 옵션으로 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택된 0-3 치환기로 옵션으로 치환됨; 및
    R₅는 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐로부터 선택됨; R₆는 H, C_1-6알킬로부터 선택됨; 그리고 R₃ 및 R₄는 O, S 및 N으로부터 선택된 0 내지 3 헤테로 원자를 포함하는 고리에서 3 내지 8 탄소 원자를 가진 옵션으로 치환된 불포화 또는 포화 고리를 형성하도록 연결될 수 있음.
11. 제10항에서,
    R₁ 및 R₂는 각각 OH, C(O)H 및 OCH₃으로부터 독립적으로 선택됨;
    R₃는 H, C_1-20알킬, C_2-20알케닐 및 C_2-20알키닐로부터 선택됨, 여기서 C_1-20알킬, C_2-20알케닐 및 C_2-20알키닐은 -NR₆-, -NH(CO)-, C(O)-, -C(O)O-, -O-, -C(NR₆R₆)H-C(O)O-, -C(S)-, -C(S)NR₆- 및 -NR₆-C(S)-NR₆으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 옵션으로 중단되고, 할로겐, -NH₂, -OH, -C_1-4알킬, -C(O)OH, -C(O)OR₅, -C(O)H, -N(C_1-4알킬)H, -N(C_1-4알킬)₂, -C(NH₂)H-C(O)OH, -C(S)-, 옵션으로 치환된 시클로알킬, 옵션으로 치환된 시클로알케닐 및 옵션으로 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택된 0-3 치환기로 옵션으로 치환됨; 및
    R₄는 H인 약학 조성물.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, R₃는 -C_1-4알킬-NH-C(O)-C_1-12알케닐, -C_1-4알킬-NH-C(O)-C_1-12알킬, -C_1-4알킬-O-C(O)-C_1-12알케닐 및 -C_1-4알킬-O-C(O)-C_1-12알킬로부터 선택되는 약학 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바닐로이드 화합물은 캅시에이트 즉, 4-히드록시-3-메톡시벤질 (E)-8-메틸-6-노네노에이트로부터 선택되는 약학 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코시드 가수분해효소는 α-아밀라아제인 약학 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포질 해당 저감제는 2-데옥시-D-글루코오스인 약학 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성제는 메틸셀레노시스테인, 캅시에이트, α-아밀라아제 및 2-데옥시-D-글루코오스로 이루어진 그룹에서 적어도 하나로부터 선택되는 약학 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 활성제는 메틸셀레노시스테인, 캅시에이트, α-아밀라아제 및 2-데옥시-D-글루코오스로 이루어진 약학 조성물
18. 종양 세포의 세포 대 세포 부착을 향상시키거나, 종양 세포의 단백질가수분해를 가져오거나, 종양 세포 아포프토시스, 분화 또는 면역인식을 유도하기 위해 종양 세포의 표면에서 또는 표면 근처에서 활성화 가능한 제1 및 제2 프로테아제 효소전구체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 제1 프로테아제 효소전구체는 키모트립시노겐이고 상기 제2 프로테아제 효소전구체는 트립시노겐이고, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비가 4:1 내지 8:1의 범위인 약학 조성물.
19. 제18항에 있어서, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비가 5:1 내지 7:1의 범위인 약학 조성물.
20. 제19항에 있어서, 키모트립시노겐:트립시노겐의 중량비가 6:1 인 약학 조성물.
21. 제18항 내지 제20항에 있어서, 상기 약학 조성물은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 규정된 활성제를 더 포함하는 약학 조성물.
22. 각각 종양 세포에서 세포 내 활동을 유도할 수 있는 제1 및 제2 활성제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 제1 활성제는 셀레늄 화합물이고 상기 제2 활성제는 세포질 해당 저감제인 약학 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 셀레늄 화합물 및 상기 세포질 해당 저감제는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 규정된 것인 약학 조성물.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 규정된 프로테아제 효소전구체를 더 포함하는 약학 조성물.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 규정된 바닐로이드 화합물 및 글리코시드 가수분해효소로부터 선택된 활성제를 더 포함하는 약학 조성물.
26. 암 치료용 작용제로서, 상기 작용제는 암 치료를 위한 다기능 접근법을 함께 제공할 수 있는 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 포함하고, 상기 프로테아제 효소전구체 및 상기 활성제는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 규정된 것인 작용제.
27. 암 치료를 위한 활성제를 포함하는 약제의 제조에 사용되는 프로테아제 효소전구체로서, 상기 프로테아제 효소전구체 및 상기 활성제는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 규정된 것인 프로테아제 효소전구체.
28. 암 치료를 위한 프로테아제 효소전구체를 포함하는 약제의 제조에 사용되는 활성제로서, 상기 프로테아제 효소전구체 및 상기 활성제는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 규정된 것인 활성제.
29. 암 치료용 약제의 제조에 사용되는 프로테아제 효소전구체 및 활성제로서, 상기 프로테아제 효소전구체 및 상기 활성제는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 규정된 것인 프로테아제 효소전구체 및 활성제.
30. 활성제로 처리되는 대상에서 암 치료용 약제의 제조에 사용되는 프로테아제 효소전구체로서, 상기 활성제 및 프로테아제 효소전구체는 함께 종양 세포에 작용할 수 있고, 옵션으로 상기 활성제는 상기 프로테아제 효소전구체의 영향을 향상시키는 세포 내 활동을 유도할 수 있고, 상기 프로테아제 효소전구체 및 상기 활성제는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 규정된 것인 프로테아제 효소전구체.
31. 프로테아제 효소전구체로 처리되는 대상에서 암 치료용 약제의 제조에 사용되는 활성제로서, 상기 활성제 및 프로테아제 효소전구체는 함께 종양 세포에 작용할 수 있고, 옵션으로 상기 활성제는 상기 프로테아제 효소전구체의 영향을 향상시키는 세포 내 활동을 유도할 수 있고, 상기 프로테아제 효소전구체 및 상기 활성제는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 규정된 것인 활성제.
32. 치료적으로 유효한 양의 프로테아제 효소전구체 및 활성제를 대상에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법으로서, 상기 프로테아제 효소전구체 및 상기 활성제는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 규정된 것인 치료 방법.
33. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물, 또는 이것의 제제 또는 제형을 조제하는 방법으로서, 상기 프로테아제 효소전구체를 상기 활성제와 혼합하여 조제하는 방법.
34. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 암 치료용 약학 조성물.
35. 암 치료용 약제의 제조에 사용되는 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물.
36. 치료적으로 유효한 양의 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법.
37. 치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 포함하는 좌약.

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