CN101287481A - 用于治疗肝细胞癌的药物组合物 - Google Patents

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CN101287481A CNA2006800184225A CN200680018422A CN101287481A CN 101287481 A CN101287481 A CN 101287481A CN A2006800184225 A CNA2006800184225 A CN A2006800184225A CN 200680018422 A CN200680018422 A CN 200680018422A CN 101287481 A CN101287481 A CN 101287481A
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Abstract

本发明涉及分离自紫铆花的提取物和组分抗肝细胞癌的抗癌活性。具体说，本发明涉及含有2－9重量％标记的黄酮苷如紫铆甙和异紫铆甙的组合物抗肝细胞癌的抗癌活性，通过以下步骤从紫铆花中分离得到所述组合物：用极性溶剂如乙醇、甲醇、乙醇水溶液或水提取花，用溶剂如氯乙烯、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯研磨该提取物以去除脂族非极性组分，将残留物悬浮于水中，用正丁醇萃取，冻干所述水部分。

Description

用于治疗肝细胞癌的药物组合物
发明领域
本发明涉及用于治疗肝细胞癌的药物组合物。
更具体说，本发明涉及治疗对象的肝细胞癌的方法。
本发明也涉及将获自紫铆(Butea monosperma)的任何植株部分的提取物或其活性组分用于治疗肝细胞癌的应用。
另外，本发明也涉及从紫铆的任何植株部分分离含有紫铆甙和/或异紫铆甙的生物活性组分的方法。
更具体说，本发明涉及将所述生物活性组分以及紫铆甙(butrin)和异紫铆甙(isobutrin)用于治疗肝细胞癌的应用。
本发明的背景和现有技术
紫铆(Lam)(科：豆科)是印度大部发现的中等大小的树木，据报道，它在印度本土医药系统中有多种用途。该植物的花、叶、树皮和根可产生各种药物特性。叶可用作收敛剂、滋补药、利尿剂和壮阳药。它们可用于治疗疖子。据报道，树皮具有收敛、苦、辛、变质、壮阳和驱虫特性。根可用于象皮病和治疗夜盲症。据报道，花具有收敛、净化、壮阳和滋补特性[Chopra，R.N.，Nayar，S.L.和Chopra，I.C.，Glossary of Indian Medicinal Plants(印度药用植物词汇表)，CSIR，新德里，1956，42页；Wealth of India：Raw Material(印度的财富：原料)，CSIR，新德里，(1988)第2B卷，341-46页]。树皮的石油醚和乙酸乙酯提取物具有抗真菌活性。(-)-Medicarpin被鉴定为有效成分[Ratnayake Bandara，B.M.，Savitri Kumar，N.和SwarnaSamaranayake，K.M.，Journal of Ethanopharmacology 25(1)，735(1989)]。种子的热醇提取物在大鼠和兔中分别显示出显著的抗移植和抗排卵活性。它也在小鼠中显示出流产作用[Choudhury，R.R.和Khanna，U.，Indian Journal of Medical Research，56(10)1575，(1968)]。分离自紫铆种子的紫铆黄酮(butin)在大鼠中有抗移植活性[Bhargava，S.K.，Journal of Ethanopharmacology 18，95-101，(1986)]。据报道，分离自花的三萜是在实验室动物中抗惊厥活性的有效成分[Kasture，V.S.，Kasture，S.B.和Chopde，C.T.，Pharmacol.Biochem.Behav.72，965-972(2002)]。体外测试的种子的甲醇提取物显示出显著的驱虫活性[Prashanth，D.Asha，M.K.，Amit，A.和Padmaja，R.Fitoterapia72，421-422(2001)]。据报道，含有紫铆作为成分之一的″阿育吠陀拉萨亚那(AyurvedicRasayana)″(草药)能通过免疫调节治疗贾第虫病，但″拉萨亚那(Rasayana)″在体外对寄生虫没有杀伤作用[Agarwal，A.K.，Singh，M.，Gupta，N.，Saxena，R.，Puri，A.，Verma，A.K.，Saxena R.P.，Dubey，C.B.，Saxena，K.C.Journal of Ethanopharmacology44，143-146(1994)]。异紫铆甙和紫铆甙已被鉴定为来自紫铆花的抗肝毒性成分[Wagner，H.，Geyer，B.，Fiebig，M.，Kiso，Y.和Hikino，H.Planta Medica 77-79(1986)]。已报道紫铆花具有抗紧张活性[Bhatwadekar，A.D.，Chintawar，S.D.，Logade，N.A.，Somani，R.S.，Kasture，V.S.和Kasture，S.B.Indian Journal of Pharmacology，31，153-155(1999)]。据我们所了解，迄今为止没有报道过该植物的任何部分或其分离物/组分有抗癌活性。
已经从这种植物的花中分离到大量黄酮类化合物，即紫铆因(butein)、紫铆黄酮、紫铆甙、异紫铆甙、palasitrin、紫铆因-4-葡糖苷(coreopsin)、异紫铆因-4-葡糖苷(isocoreopsin)、硫磺菊素、monospermoside和樱黄素[Gupta，S.R.，Ravindranath，B.和Seshadri，T.R.，Phytochemisrty 9，2231-35(1970)；Puri，B.和Seshadri，T.R.J.Sci.Ind.Res.(印度)12B，462(1953)；LaI，J.B.和Dutt，S.，J.Ind.Chem.Soc，12，262(1935)]。也报道了几种含氮组分，包括palasonin[Raj，R.K.和Karup，P.A.，Ind.J.Chem.5，86-87(1967)]、monospermin[Mehta，B.K.和Bokadia，M.M.，Chem.& Ind.3，98(1981)]、脲基甲酸衍生物[Porwal，M.，Sharma，S.和Mehta，B.K.，Ind.J.Chem.27B，281-82(1988)]和palasimide[Guha，P.K.，Poi，R.和Bhattacharya，A.Phytochemistry 29，2017(1990)。也有报道称，种子含有α-香树脂醇、β-谷固醇、β-谷固醇葡糖苷[Chandra，S.，LaI，J.和Sabir，M，Ind.J.Pharmacy 35，79-80，1977]和六-花生酸δ-内酯[Bishnoi，P.和Gupta，P.C.Planta Medica 35，286-88，(1979)]。分离自种子的Palasonin显示出驱虫活性[Kaleysa Raj，R.和Karup，P.A.Ind.Jour.Med.Res.56，12，(1968)]。已报道从茎中分离了两种新化合物3α-羟基大戟-25-烯(3α-hydroxyeuph-25-ene)和2，14-二羟基-11，12-二甲基-8-氧代-十八-11-烯基环己烷[Mishra，M.，Shukla，Y.N.和Kumar，S.，Phytochemistry 54(8)，835-38，(2000)]。已报道从种子-紫胶的树脂组分分离了四种酸酯，称为紫草茸醇酸酯I、紫草茸醇酸酯II、紫草茸酸酯I和紫草茸酸酯II[Singh，A.N.，Upadhye，V.，Mhaskar，V.V.和Dev.S.Tetrahedron，30，867-74，(1974)]。
已知该植物能治疗ISM的肝脏疾病。据报道，来自花的活性化合物(紫铆甙和异紫铆甙)具有肝脏保护活性。近年来的一项研究报告，即A.Sehrawat，T H Khan，L.Prasad和S.Sultana所著的题为″紫铆和化学调节：对Wistar大鼠中硫代乙酰胺-介导的肝脏改变的保护作用(Butea monosperma and chemomodulation：Protective roleagainst thioacetamide-mediated hepatic alternations in rats)”(Phytomedicine 13，157-163，2006)，通过硫代乙酰胺诱导的肝脏毒性研究了含有这些化合物的植物提取物的肝脏保护活性。硫代乙酰胺有害、有毒且致癌。在同一份报告中，又研究了两个参数即DOC和H3胸苷掺入，以证明它可能通过抑制这两个参数抑制肿瘤形成。没有证据说明紫铆提取物有直接抗癌作用。即使对照动物没有发生发生癌症并且没有参数显示出对癌症有保护作用，也至多认为它具有化学保护/抗癌发生作用。作者本身总结出″全部结果表明，紫铆的甲醇提取物具有肝脏保护作用，同时，它可通过抑制氧化应激和聚胺生物合成途径来抑制促癌过程(promotion stage)″。
发明目的
本发明的主要目的是提供用于治疗肝细胞癌的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供治疗对象的肝细胞癌的方法。
另外，本发明的另一个目的是提供从紫铆的任何植株部分分离含有紫铆甙和/或异紫铆甙的生物活性组分的方法。
本发明的另一个目的是提供将由紫铆的任何植株部分获得的提取物或其生物活性组分用于治疗肝细胞癌的应用。
本发明的另一个目的是提供将紫铆甙和异紫铆甙用于治疗肝细胞癌的应用。
发明概述
本发明涉及用于治疗对象的肝细胞癌的药物组合物，其中所述组合物含有治疗有效量的由紫铆的任何植株部分获得的提取物或其活性组分，或者治疗有效量的化合物紫铆甙和/或异紫铆甙或者其衍生物或类似物、或者其药学上可接受的盐，任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。另外，本发明也涉及治疗对象的肝细胞癌的方法，以及由紫铆的任何植株部分分离含有紫铆甙和/或异紫铆甙的生物活性组分的方法以及将其用于治疗肝细胞癌的应用。
附图简要说明
图1代表化合物异紫铆甙和紫铆甙的结构通式。
异紫铆甙(1)：m.p.187-89°；M+ 596；1H NMR(200Hz，DMSO-d6)显示信号：δ6.63(2H，m，H-3′，H-5′)，6.90(1H，d，J＝8Hz，H-5)，7.46(1H，d，J＝8Hz，H-6)，7.72(3H，m，H-2，H-α，H-β)，8.23(1H，d，J＝8Hz，H-6′)；IR(KBr)υ(cm-1)：3386，2981，1633，1572，1518，1421，1363，1284，1219，1124，1072，804
紫铆甙(2)；m.p.189-90°；M+ 596；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)显示信号：δ3.18(2H，m，H-3)，5.45(1H，dd，J＝4，12Hz，H-2)，6.68(1H，d，J＝8Hz，H-8)，6.72(1H，d，J＝8Hz，H-6)，6.80(1H，d，J＝8Hz，H-5′)，7.05(1H，d，J＝8Hz，H-6′)，7.30(1H，s，H-2′)，7.73(1H，d，J＝8Hz，H-5)IR(KBr)υ(cm-1)：3362，2925，1667，1613，1574，1523，1443，1281，1085，860，804。
图2代表A.12周和B.20周的x-myc小鼠(对照，未治疗)的肝脏组织学(均为100x)。对照动物的肝脏显示出典型的有丝分裂、发育异常(dyslasia)且失去了正常的肝脏结构。恶性肝细胞索显示出发生多核化并且具有大核的大多形核。
图3代表用紫铆花水提取物治疗的A.12周和B.20周的x-myc小鼠的肝脏组织学(均为100x)，图4代表用紫铆花组分治疗的A.12周和B.20周的x-myc小鼠的肝脏组织学(均为100x)，其中肝脏在治疗后12周和20周外观正常。
发明详述
因此，本发明提供了一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物，其中所述组合物含有治疗有效量的由紫铆的任何植株部分获得的提取物或其活性组分，或者治疗有效量的化合物紫铆甙和/或异紫铆甙或者其衍生物或类似物、或者其药学上可接受的盐，任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的一个实施方式中，所述组合物含有治疗有效量的由紫铆的任何植株部分获得的提取物或其活性组分，任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明另一实施方式中，给予所述组合物的剂量为：至少0.5g/kg体重的单位剂量。
另外，在本发明另一实施方式中，所述组合物含有治疗有效量的化合物紫铆甙和/或异紫铆甙或其衍生物或类似物、或者其药学上可接受的盐，任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的又一实施方式中，给予所述组合物的剂量为：小于0.5g/kg体重的单位剂量。
在本发明的又一实施方式中，用可溶形式，优选悬液形式给予所述组合物的剂量。
在本发明的又一实施方式中，所用载体选自盐水、阿拉伯胶、羧甲基纤维素或任何其他已知的药学上可接受的载体。
在本发明的又一实施方式中，通过全身、口服或任何临床上、医学上接受的方法使用所述组合物。
在本发明的又一实施方式中，给药途径选自：腹膜内、静脉内、肌肉内、口服等。
在本发明的又一实施方式中，所述组合物用于预防和治愈目的。
另外，本发明也提供了治疗对象的肝细胞癌的方法，所述方法包括给予所述对象下述药物组合物的步骤，所述药物组合物含有治疗有效量的由紫铆的任何植株部分获得的提取物或其活性组分，或者治疗有效量的化合物紫铆甙和/或异紫铆甙或者其衍生物或类似物、或者其药学上可接受的盐，任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的一个实施方式中，所述对象选自人或哺乳动物，优选人。
在本发明的一个实施方式中，所述方法包括给予所述对象下述药物组合物的步骤，所述药物组合物含有治疗有效量的由紫铆的任何植株部分获得的提取物或其活性组分，任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明另一实施方式中，给予所述组合物的剂量为：至少0.5g/kg体重的单位剂量。
另外，在本发明另一实施方式中，所述方法包括给予所述对象下述药物组合物的步骤，所述药物组合物含有治疗有效量的化合物紫铆甙和/或异紫铆甙或者其衍生物或类似物、或者其药学上可接受的盐，任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的又一实施方式中，给予所述组合物的剂量为：小于0.5g/kg体重的单位剂量。
在本发明的又一实施方式中，用可溶形式，优选悬液形式给予所述组合物的剂量。
在本发明的又一实施方式中，所用载体选自盐水、阿拉伯胶、羧甲基纤维素或任何其他已知的药学上可接受的载体。
在本发明的又一实施方式中，通过全身、口服或任何临床上、医学上接受的方法使用所述组合物。
在本发明的又一实施方式中，给药途径选自腹膜内、静脉内、肌肉内、口服等。
本发明也提供了将由紫铆获得的提取物和生物活性组分用于治疗肝细胞癌的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述化合物紫铆甙和异紫铆甙的应用是治疗肝细胞癌。
另外，本发明提供了由紫铆的任何植株部分分离含有紫铆甙和/或异紫铆甙的生物活性组分的方法，其中所述方法包括：
a)使所述植物材料粉末化；
b)采用选自乙醇、甲醇、水的一种溶剂或其组合渗滤以提取步骤(a)获得的粉末，获得提取物；
c)在＜50℃的温度下减压浓缩步骤(b)获得的提取物；
d)用选自氯乙烯、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯的溶剂研磨步骤(c)获得的提取物，得到残留物；
e)在水相和有机相之间分配步骤(d)获得的残留物；
f)用已知方法干燥步骤(e)获得的水相部分，得到所需活性组分。
在本发明的一个实施方式中，用于分配残留物的有机相是正丁醇。
分离紫铆活性组分的流程图
Figure A20068001842200091
本发明通过说明的方式给出下述实施例，它们不应限制本发明的范围。
实施例1
将500gm紫铆花干粉浸泡于3L蒸馏水中并用蒸汽浴加热4小时。水提取物经硅藻土过滤，用旋转蒸发器50℃浓缩至250ml。再重复提取步骤三次，合并浓缩的水提取物(1L)并冻干为干燥粉末(145g)。用乙酸乙酯研磨该提取物，将残留物加入水中(750ml)，用正丁醇萃取(4x200ml)。冻干水组分以得到活性组分(88g)。
实施例2
阴干的紫铆花粉末(1kg)浸于精馏酒精中过夜。排出提取物的液体，并用硅藻土过滤。再重复提取步骤三次。减压蒸发精馏酒精得到棕黑色物质，用乙酸乙酯研磨该提取物。将剩余残留物溶解于水并用正丁醇(3x400ml)萃取。冻干水组分以得到活性组分(156g)。
实施例3
阴干的紫铆花粉末(1kg)浸于甲醇中过夜。排出提取物的液体，并用硅藻土过滤。再重复提取步骤三次。减压蒸发甲醇得到棕黑色物质，用乙酸乙酯研磨该提取物。将剩余残留物溶解于水(1L)并用正丁醇(3x400ml)萃取。冻干水组分得到干燥粉末(142g)。
实施例4
活性组分的HPLC分析：
活性组分中异紫铆甙和紫铆甙的含量分别为总提取物重量的2-4.5％和9-12％。
溶剂系统乙腈∶0.001M磷酸(30∶70)，RP18e柱(E.Merck，5μm，4.0x250mm)，柱温30°，流速0.6ml/min，波长254。
实施例5
化合物1和2的鉴定：
用硅胶柱(600g)层析紫铆水提取物的水组分(25g)。用乙酸乙酯∶甲醇(85∶15)洗脱得到150mg异紫铆甙(1)，而后得到1.2g紫铆甙(2)。
异紫铆甙(1)：m.p.187-89°；M+ 596；1H NMR(200Hz，DMSO-d6)显示信号：δ6.63(2H，m，H-3′，H-5′)，6.90(1H，d，J＝8Hz，H-5)，7.46(1H，d，J＝8Hz，H-6)，7.72(3H，m，H-2，H-α，H-β)，8.23(1H，d，J＝8Hz，H-6′)；IR(KBr)υ(cm-1)：3386，2981，1633，1572，1518，1421，1363，1284，1219，1124，1072，804
紫铆甙(2)；m.p.189-90°；M+ 596；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)显示信号：δ3.18(2H，m，H-3)，5.45(1H，dd，J＝4，12Hz，H-2)，6.68(1H，d，J＝8Hz，H-8)，6.72(1H，d，J＝8Hz，H-6)，6.80(1H，d，J＝8Hz，H-5′)，7.05(1H，d，J＝8Hz，H-6′)，7.30(1H，s，H-2′)，7.73(1H，d，J＝8Hz，H-5)IR(KBr)υ(cm-1)：3362，2925，1667，1613，1574，1523，1443，1281，1085，860，804。
实施例6
水提取物和水组分对人癌细胞系的体外细胞毒作用：
本研究使用获自美国弗雷德里克的National Cancer Institute(国立癌症研究所)，或印度浦那的National Center for Cell Science(国立细胞科学中心)的人癌细胞系。用含有完全生长培养基(含2mM谷胺酰胺，100μg/ml链霉素，pH 7.4，过滤除菌的RPMI-1640培养基，用前加入10％胎牛血清和100单位/ml青霉素)的组织培养瓶，在5％ CO2和90％相对湿度的二氧化碳培养箱内37℃培养细胞。用胰酶(0.5％溶于含有0.02％ EDTA的PBS中)从培养瓶中收集处于亚汇合期的细胞来检测细胞毒性。经台盼蓝排斥实验检测活力大于98％的细胞用于实验。用含有庆大霉素(50μg/ml)的完全生长培养基制备所需细胞密度的细胞悬液用于测定细胞毒性。
用蒸馏水配制测试材料的储存液(20mg/ml)。用含有庆大霉素(50μg/ml)的完全生长培养基连续稀释储存液得到所需浓度的工作溶液。
利用96孔组织培养板检测对人癌细胞系的体外细胞毒作用(Monks，A.，Scudiero，D.，Skehan，P.，Shoemaker R.，Paull，K.，Vistica，D.，Hose，C.，Langley，j.，Cronise，P.，Vaigro-Wolff，A.，Gray-Goodrich，M.，Campbell，H.，Mayo，J和Boyd，M.(1991)。Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel ofcultured human tumor cell lines(利用培养的人肿瘤细胞系多样性板块进行高通量抗癌药物筛选的可行性).J.Natl.Cancer Inst.83，757-766.)。96孔组织培养板中每孔加入100μl细胞悬液。孵育细胞24小时。孵育24小时后将完全生长培养基中的测试材料(100μl)加到含细胞悬液的孔中。加入测试材料后继续孵育培养板48小时(90％相对湿度的5％二氧化碳培养箱内37℃培养)后，在所有孔的培养基上方缓慢加入三氯乙酸(TCA 50μl，50％)以终止细胞生长。4℃孵育培养板1小时，以将细胞固定在孔底。小心吸出所有孔中液体并弃去。蒸馏水洗培养板5次去除TCA、生长培养基低分子量代谢物、血清蛋白等，并于空气中干燥。磺酰罗丹明B染料染色以测量细胞生长(P.Skehan，R.Storeng，D.Scudiero，A.Monies，J.McMohan，D.Vistica，J.T.Warren，H.Bokesch，S.Kenney，M.R.Boyd(1990)New colorimetric cytotoxic Assay forAnticancer-Drug Screening(抗癌药物筛选的新比色法细胞毒性实验)Journal of theNational Cancer Institute 82，1107-1112)。将吸附的染料溶解于Tris-缓冲液中(100μl，0.01M，pH 10.4)，在机械振荡器上轻轻振荡该培养板。在ELISA读板机上记录540nm的光密度(OD)。
用实验组的平均OD值减去各空白平均OD值来计算细胞生长。把无任何测试材料存在时的生长当作100％，计算测试材料存在时的生长百分数，并进而计算测试材料存在时的生长抑制百分数。
表1总结了紫铆花的水提取物和水组分对人癌细胞系的体外细胞毒作用(生长抑制百分数)。
表1：紫铆花的提取物和组分对人癌细胞系的体外细胞毒作用(生长抑制百分数)。
  测试材料   提取物   组分   阿霉素  丝裂霉素C   他莫昔芬   5-氟尿嘧啶
  组织   浓度细胞系   100μg/ml   100μg/ml   1x10-5M   1x10-5M   1x10-5M   2x10-5M
  乳腺   MCF-7   6   -   72   -   -   -
  乳腺   T47D   4   0   34   -   -   -
  乳腺   ZR 75-1   0   -   46   -   -   -
  子宫颈   HeLa   9   -   -   -   -   -
  子宫颈   SiHa   0   0   -   -   -   -
  CNS   IMR 32   81   -   87   83   -   -
  CNS   SK N MC   23   2   -   -   27   -
  CNS   SK N SH   43   -   82   -   -   -
  CNS   SNB 78   2   -   20   -   -   -
  结肠   Colo 205   87   0   -   -   -   -
  结肠   SW 620   95   -   59   -   -   -
  结肠   HCT 15   -   0   -   -   -   50
  结肠   HT 29   -   0   69   -   -   -
  肝   Hep-2   51   35   -   -   -   -
  肺   A549   19   11   -   -   17   -
  肺   NCI-H23   0   -   -   59   -   -
  口腔   KB   16   -   -   -   -   9
  卵巢   NIH OVCAR3   0   -   -   31   -   -
  卵巢   NIH OVCAR5   -   27   45   -   20   -
  卵巢   OVCAR5   5   6   -   -   -   -
  前列腺   DU 145   -   -   -   69   -   -
评价紫铆花水提取物浓度为100μg/ml时对数种人癌细胞系的体外细胞毒作用，这些人癌细胞系为乳腺癌(MCF-7、T-47-D和ZR-75-1)、子宫颈癌(HeLa和SiHa)、CNS癌(IMR-32、SK-N-MC、SK-N-SH和SNB-78)、结肠癌(Colo-205和SW-620)、肝癌(Hep-2)、肺癌(A-549和NCI-H23)、口腔癌(KB)、卵巢癌(NIH-OVCAR-3和OVCAR-5)和前列腺癌(DU-145)。显示出高度的生长抑制，即对SW-620、Colo-205和IMR-32人癌细胞系的生长抑制率分别为95、87和81％。对Hep-2、SK-N-SH和SK-N-MC人癌细胞系显示中等效应，抑制率分别为51、43和23％。对A-549(19％)和KB(16％)人癌细胞系呈现低反应。对其余人癌细胞系显示弱反应或无反应。
也评价了紫铆花的水组分在浓度为100μg/ml时对数种人癌细胞系的体外细胞毒作用，这些人癌细胞系为乳腺癌(T-47-D)、子宫颈癌(SiHa)、CNS癌(SK-N-MC)、结肠癌(Colo-205、HCT-15和HT-29)、肝癌(Hep-2)、肺癌(A-549)、口腔癌(KB)和卵巢癌(NIH-OVCAR-5和OVCAR-5)。对Hep-2的生长抑制率最高(35％)，接着为NIH-OVCAR-5(27％)和A-549(11％)。对其余人癌细胞系显示弱反应或无反应。
实施例7
水提取物和水组分的体内抗癌活性：
转基因小鼠：X-myc转基因小鼠的产生过程参见[Kumar，V.，Singh，M.，Totey，S.M.和Anand，R.K.(2001)。(制备)用于产生人肝细胞癌的转基因动物模型系统的含有X-myc转基因的双顺反子DNA构建物，由此产生转基因动物模型系统。美国专利号6,274,788 B1]。按照CPCSEA指南对动物放血并进行护理(项目号VIR-2，ICGEB，2001)。在4周龄时通过基于PCR的基因组尾DNA分析选择转基因阳性动物(Kumar等，2001)。
药物治疗：各动物每两周接受九次腹膜内注射，注射盐水(对照组)或含药盐水(500mg/Kg)(治疗组)。
实施例8
组织病理学研究和其它参数：
对照和治疗组的动物在12或20周龄时处死，记录肝脏的总体外观。在组织病理学检查中，将样品置于10％福尔马林缓冲液中，制备石蜡块。通过光镜检查苏木精和伊红染色的组织切片(厚度2-5mm)，以研究肝脏的形态和细胞学详情。
用小鼠-特异性ELISA试剂盒(Oncogene Research Products，美国，目录号QIA52)测定对照和治疗小鼠的血清中的VEGF水平。按照生产商说明书完成所有操作。VEGF浓度表示为皮克/ml血清；
组织学研究和血清VEGF水平的结果分别参见图1-3和表2。
表2：紫铆花提取物治疗后X-myc小鼠的血清VEGF水平(pg/ml)。
  治疗   对照组   用提取物治疗
  时间   (n＝6)   (n＝6)
  12周   239.6±31.4   76.1±12.9*
  20周   237.3±36.3   136.5±16.7*
正常成年小鼠的水平＝93.7±10.8pg/ml显著性水平＝*，p＜0.001；**，p＜0.01
对照动物的肝脏(图1)显示出非典型的有丝分裂、发育异常且失去了正常的肝脏结构。恶性肝细胞索显示出发生多核化并且具有大核的大多形核。图2和3分别显示了用紫铆花的水提取物(A003)和水组分(F009)治疗的作用，其中肝脏在治疗后12周和20周外观正常。紫铆的抗癌活性似乎与抗血管新生功能有关，因为治疗动物的血清VEGF水平(表2)显著下调(p＜0.001-0.01)″。
实施例9
分离自水组分的化合物对人癌细胞系的体外细胞毒作用：
除储存液浓度为1x10-2M而非20mg/ml外，方法学同实施例6。
评价该化合物浓度为1x10-4、1x10-5和1x10-6M时对数种人癌细胞系的体外细胞毒作用，这些人癌细胞系为子宫颈癌(SiHa)、CNS癌(SK-N-SH)、结肠癌(HT-29、HCT-15、Colo-205和SW-620)、肺癌(HOP-62)。两种化合物在1x10-4M时对所用细胞系产生高度生长抑制作用，即40-99％。1x10-5M的最大生长抑制率为26％。1x10-6M时化合物无活性。
表3总结了该化合物的体外细胞毒作用(生长抑制百分数)。
表3：化合物(紫铆甙和异紫铆甙)对人癌细胞系的体外细胞毒作用(生长抑制百分数)
Figure A20068001842200141
优点：
本发明的主要优点是：
2.本发明涉及分离具有抗肝细胞癌的抗癌活性的新提取物/组分。
3.本发明方法利用了自然资源丰富的高度经济的原料。
4.本发明方法所用的构思使其非常理想并易于进行。

Claims (21)

1.一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物，其中所述组合物含有治疗有效量的由紫铆的任何植株部分获得的提取物和/或其活性组份，或者治疗有效量的化合物紫铆甙和/或异紫铆甙或者其衍生物或类似物、或者其药学上可接受的盐，并任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的由紫铆的任何植株部分获得的提取物和/或其活性组分，并任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，给予所述组合物的剂量为：至少0.5g/kg体重的单位剂量。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的化合物紫铆甙和/或异紫铆甙或者其衍生物或类似物、或者其药学上可接受的盐，并任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，给予所述组合物的剂量为：小于0.5g/kg体重的单位剂量。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，用可溶形式，优选悬液形式给予所述组合物的剂量。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所用载体选自盐水、阿拉伯胶、羧甲基纤维素或任何其他已知的药学上可接受的载体。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述给药途径选自：腹膜内、静脉内、肌肉内、口服等。
9.一种治疗对象的肝细胞癌的方法，其中所述方法包括给予所述对象下述药物组合物的步骤，所述药物组合物含有治疗有效量的由紫铆的任何植株部分获得的提取物和/或其活性组份或治疗有效量的化合物紫铆甙和/或异紫铆甙或者其衍生物或类似物、或者其药学上可接受的盐，并任选地含有一种或多种药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所用对象选自人或哺乳动物。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述对象权利要求2所述药物组合物的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，给予所述组合物的剂量为：至少0.5g/kg体重的单位剂量。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述对象权利要求4所述药物组合物的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，给予所述制剂的剂量为：小于0.5g/kg体重的单位剂量。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，用可溶形式，优选悬液形式给予所述组合物的剂量。
16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所用载体选自盐水、阿拉伯胶、羧甲基纤维素或任何其他已知的药学上可接受的载体。
17.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述给药途径选自：腹膜内、静脉内、肌肉内、口服等。
18.获自紫铆的提取物或生物活性组分用于治疗肝细胞癌的应用。
19.化合物紫铆甙和异紫铆甙用于治疗肝细胞癌的应用。
20.一种由紫铆的任何植株部分分离含有紫铆甙和/或异紫铆甙的生物活性组分的方法，其中所述方法包括：
a)使所述植物材料粉末化；
b)采用选自乙醇、甲醇、水的一种溶剂或其组合渗滤以提取步骤(a)获得的粉末，获得提取物；
c)在＜50℃的温度下减压浓缩步骤(b)获得的提取物；
d)用选自氯乙烯、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯的溶剂研磨步骤(c)获得的提取物，得到残留物；
e)在水相和有机相之间分配步骤(d)获得的残留物；
f)用已知方法干燥步骤(e)获得的水相部分，得到所需活性组份。
21.如权利要求21所述的方法，其特征在于，用于分配所述残留物的所述有机相是正丁醇。
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