CN104311688B - 一种金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法，是以药材金钗石斛为原料，依次经粉碎、过筛、酶解、高压均质、絮凝、超滤膜分离、冷冻干燥等过程，最大化提取金钗石斛多糖和总碱，避免有机试剂的使用，同时有利于金钗石斛深加工技术实现工业化、大规模生产。本发明使用高压均质联合超滤技术在提取金钗石斛多糖与总碱过程中没有使用任何有机试剂，最大程度保护金钗石斛多糖的生物活性，同时在此过程中联合提取石斛总碱，使原材料得以被充分利用。本发明方法得到的金钗石斛多糖含量≥94％,石斛总碱含量≥90％。

Description

一种金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法

一、技术领域

本发明涉及一种提取分离方法，具体地说是一种金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法，属于农业产品深加工领域。

二、背景技术

石斛属属于兰科，为多年生草本植物，全球目前发现的有1500多种，在我国已知的有78种。金钗石斛是中国药典2010版收录名称定义的中药材，是众多石斛属植物中生物总碱含量最高且唯一含有石斛碱的中药石斛品种，其化学成分较复杂，主要是生物碱和多糖类物质。石斛碱具有止痛、解热、降低心率和血压、减慢呼吸、解巴比妥毒等作用；金钗石斛多糖有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、防治白内障及增强机体的免疫力等作用。

金钗石斛作为传统中药，但其大规模种植生产仅有20余年，目前市场上开发的保健品有石斛胶囊、石斛粉和石斛超微粉、石斛冲剂、石斛晶、石斛颗粒、石斛露、石斛茶、石斛酒等，但剂型多半比较简单，国内外市场尚未见到技术含量较高、针对性较强、功效明确的产品。金钗石斛相关产品的开发目前尚处于初级阶段，开发一种简捷高效的金钗石斛深加工技术对于整个产业的发展意义重大。

目前国内外在金钗石斛多糖与生物总碱的提取方面，大都采用分开提取的方法，这样就会使得提取周期长，生产效益低，不利于大规模生产，并且造成了原料的利用率较低的现象。CN101407557公开了一种金钗石斛多糖提取物的制备和应用，该方法经石油醚脱脂、高温提取、乙醇沉淀、Sevage试剂除蛋白、除单糖和寡糖、凝胶柱纯化等步骤实现了对金钗石斛多糖的提取，虽然此法得到的石斛多糖含量较高，但是得率较低，高温可能部分破坏石斛多糖的生物活性，生产复杂，周期长，成本高，污染严重，在工业生产中不易实现。CN101735231A采用高浓度乙醇高温浸提提取石斛生物碱的方法，需要设备要求高，能耗大，效率低，而且使用氯仿和乙醚进行萃取，毒性较大，污染严重。

三、发明内容

本发明旨在提供一种金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法，是通过高压均质联合超滤技术提取金钗石斛多糖和总碱，具有产品纯度高、工艺简捷、生产周期短、提取条件温和、生产成本低的优点。

本发明金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法，包括以下步骤：

1)样品前处理

将粗细均匀、颜色亮黄的金钗石斛茎秆水洗后烘干，粉碎后过60-80目筛得金钗石斛粉料；

2)酶解

将步骤1)制得的金钗石斛粉料加入3-5倍质量的水中，再加入生物酶，通过柠檬酸调pH值至酸性，进行酶解；金钗石斛细胞壁含有大量的纤维素和果胶，不仅会影响石斛多糖和总碱的溶出，还会导致附带产物蛋白质含量的偏高，本申请通过加入生物酶使蛋白、纤维素和果胶质类物质水解、粘度降低，提高了有效物质的溶出率，提高了有效成分的含量。

所述生物酶由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成，按质量百分比构成如下：

纤维素酶10-20％，果胶酶20-40％，蛋白酶30-50％。

所述生物酶的添加量为金钗石斛粉料质量的0.1-1％。

所述酶解的时间为3-10h，温度为35-55℃，较佳pH值为4.0-5.0。

3)高压均质提取

向酶解后得到的固液混合物中补加水使得固液混合物中含水质量为金钗石斛粉料质量的10-30倍，通过柠檬酸调pH值至2.0-5.0，搅拌混匀，高压均质提取后(提取压力为40-80MPa)离心除渣，收集上清液；高压均质提取技术可以在低温下快速提取有效成分，有利于保证化学成分的功效性，缩短了工艺操作时间；

4)絮凝

将步骤3)所得上清液的pH值调至3.0，加入所述上清液质量0.8-1％的絮凝剂，室温下静置20-30min，离心去沉淀；所述絮凝剂为质量浓度1％的壳聚糖溶液。

5)超滤分离

将步骤4)所得滤液用1000Da分子量的超滤膜进行超滤分离，得到透过液与截留液；将所得截留液浓缩后冷冻干燥(-50℃，0.1MPa)，即可得到金钗石斛多糖；将透过液浓缩后冷冻干燥(-50℃，0.1MPa)，即可得到金钗石斛总碱。金钗石斛总碱包括5种已知的倍半萜类生物碱，分子量只有几百，是小分子物质，可以透过超滤膜而留在透过液里面；多糖是天然大分子物质，不能透过超滤膜残留在截流液中。

本发明中，所述金钗石斛为兰科石斛兰属金钗石斛的茎，本领域人员均知，为中国药典2010版收录名称定义的中药材。

除特殊说明外，本发明所用试剂均为分析纯或食品级；调pH值所使用的为柠檬酸和氢氧化钠。

本发明中总糖含量用苯酚-硫酸法测量，总碱含量用紫外分光光度法测量，具体过程如下：1、石斛多糖含量检测方法

①标准品溶液的制备准确称取烘干后的葡萄糖10.0mg溶于100mL水中配制成0.1mg/mL的标准液。

②标准曲线的测定向1-7号试管(10mL试管)中分别加入0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20mL的标准液并分别加水补至2.00mL，再分别向1-7号试管中加入质量浓度6％的苯酚溶液1mL，摇匀后再分别加入5mL浓硫酸(18mol/L)，混匀后煮沸10min，冷却至室温后以1号试管为空白组测定其余组在490nm处的吸光度，以加入标准液体积为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线并获得标准曲线拟合公式y＝ax+b。

③样品多糖含量测定配制0.1mg/mL的样品溶液，取0.80mL样品溶液补水至2mL于10mL试管中，加入质量浓度6％的苯酚溶液1mL，摇匀后再加入5mL浓硫酸(18mol/L)，混匀后煮沸10min，冷却至室温后测定其在490nm处的吸光度。根据标准曲线拟合公式结合样品吸光度计算得到样品多糖含量，样品多糖含量计算公式如下

式中a，b——为标准曲线拟合公式中的常数；

A_样品——为样品在490nm处的吸光度；

C_标——为标准液葡萄糖的浓度(0.1mg/mL)；

C_样——为样品的浓度(0.1mg/mL)；

V_样——为样品添加体积(0.8mL)。

2、石斛总碱含量检测方法

pH 4.5的缓冲液：称取邻苯二甲酸氢钾4.08g，加蒸馏水100mL溶解，用0.2mol/L的NaOH溶液调pH值至4.5即得。

质量分数0.04％的溴甲酚绿溶液：称取溴甲酚绿40.0mg，加pH值4.5的缓冲液100mL溶解，即得。

①标准溶液的制备准确称取石斛碱标准品20.00mg，制成每1.00mL氯仿含0.02mg石斛碱的石斛碱标准液。

②标准曲线的绘制分别量取石斛碱标准液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00mL并分别置于分液漏斗中，用氯仿稀释至10.00mL，分别加入pH 4.5的缓冲液5.00mL和质量分数0.04％的溴钾酚绿溶液1.00mL，剧烈振摇3min，静置30min，滤过。另取氯仿同样操作，作为空白对照样，在415nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、标准液体积为横坐标，绘制标准曲线并获得标准曲线拟合公式y＝ax+b。

③样品中石斛碱含量的测定配制每1.00mL氯仿含有0.01mg样品的样品溶液，量取10.00mL样品溶液并加入pH 4.5的缓冲液5.00mL和质量分数为0.04％的溴钾酚绿溶液1.00mL，剧烈振摇3min，静置30min，取氯仿层置于比色皿中，在415nm处测定吸光度。另取氯仿同样操作，作为空白对照。石斛总碱含量计算公式如下：

式中a，b——为标准曲线拟合公式中的常数；

A_样品——为样品在415nm处的吸光度；

C_标——为标准液石斛碱的浓度(0.02mg/mL)；

C_样——为样品的浓度(0.01mg/mL)；

V_样——为样品添加体积(10mL)。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明采用集成技术提取分离石斛多糖与生物碱，将生物酶催化技术、高压均质提取技术与超滤膜分离技术联用，制备工艺简单易行，便于工业化生产。

1、本发明与传统水提醇沉法提取多糖及高温浸提提取石斛总碱相比，显著特点是高效节能，多糖与总碱提取率(提取率就是100g原料中能提取多少克的多糖或总碱)普遍提高，无需进行长时间高温水提过程与醇沉过夜，大大缩短了多糖提取分离所需时间；提取分离过程中，没有使用有机试剂，显著提高产品的质量与安全性，成本低，对环境污染小。

2、本发明可以同时提取多种天然活性产物，与传统一次提取一种天然产物相比，原材料的利用率高，同时可节约大量时间、溶剂和能源，具有快速、完全、高效等特点。

3、本发明技术工艺整个过程中温度不超过60℃，在分离活性物质的同时，最大的保留了各物质的生物活性，降低能耗。

四、附图说明

图1是本发明金钗石斛多糖和总碱的提取分离技术路线图。

五、具体实施方式

本发明实施例中使用的生物酶购于宁夏和氏璧生物技术有限公司，为提取物专用酶。

本发明实施例中使用的壳聚糖购于国药集团化学试剂公司(等级为：生化试剂BR级)的絮凝专用壳聚糖。

实施例1：

本实施例中金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法如下：

1)样品前处理

将1kg粗细均匀、颜色亮黄的金钗石斛茎秆水洗后烘干，粉碎后过60目筛得金钗石斛粉料；

2)酶解

将步骤1)制得的金钗石斛粉料加入3倍质量的水中，再加入金钗石斛粉料质量0.1％的生物酶，通过柠檬酸调pH值至4.0，55℃下酶解10h；

所述生物酶由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成，其中纤维素酶、果胶酶与蛋白酶的质量比为10:40:50。

3)高压均质提取

向酶解后得到的固液混合物中补加水使得固液混合物中含水质量为金钗石斛粉料质量的10倍，通过柠檬酸调pH值至2.0，搅拌混匀，高压均质提取后离心除渣，收集上清液；

高压均质提取的具体过程为：

将混合物料倒入均质机中，混合物料首先在低压强5MPa条件下循环2次，然后调节阀门压强为80MPa，待压强稳定后，均质1次，均质液离心分离后收集上清液即可；上述高压均质提取过程中高压均质机内部工作温度为4℃。

4)絮凝

将步骤3)所得上清液的pH值调至3.0，加入所述上清液质量1％的絮凝剂，搅拌混匀后室温静置20min，离心去沉淀；所述絮凝剂为质量浓度1％的壳聚糖溶液。

5)超滤分离

将步骤4)所得滤液用1000Da分子量的超滤膜进行超滤分离，得到透过液与截留液；将所得截留液浓缩后于-50℃、0.1MPa下冷冻干燥，即可得到金钗石斛多糖，经测定，粗多糖重量98g(提取率为9.8％)，多糖含量为95％；将透过液浓缩后于-50℃、0.1MPa下冷冻干燥，即可得到金钗石斛总碱2.3g(提取率为0.23％)，含量为90％。

实施例2：

本实施例中金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法如下：

1)样品前处理

将3kg粗细均匀、颜色亮黄的金钗石斛茎秆水洗后烘干，粉碎后过80目筛得金钗石斛粉料；

2)酶解

将步骤1)制得的金钗石斛粉料加入5倍质量的水中，再加入金钗石斛粉料质量1％的生物酶，通过柠檬酸调pH值至5.0，35℃下酶解3h；

所述生物酶由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成，其中纤维素酶、果胶酶与蛋白酶的质量比为20:40:40。

3)高压均质提取

向酶解后得到的固液混合物中补加水使得固液混合物中含水质量为金钗石斛粉料质量的30倍，通过柠檬酸调pH值至5.0，搅拌混匀，高压均质提取后离心除渣，收集上清液；

高压均质提取的具体过程为：

将混合物料倒入均质机中，混合物料首先在低压强10MPa条件下循环2次，然后调节阀门压强为40MPa，待压强稳定后，均质2次，均质液离心分离后收集上清液即可；上述高压均质提取过程中高压均质机内部工作温度为4℃。

4)絮凝

将步骤3)所得上清液的pH值调至3.0，加入所述上清液质量0.8％的絮凝剂，搅拌混匀后室温静置30min，离心去沉淀；所述絮凝剂为质量浓度1％的壳聚糖溶液。

5)超滤分离

将步骤4)所得滤液用1000Da分子量的超滤膜进行超滤分离，得到透过液与截留液；将所得截留液浓缩后于-50℃、0.1MPa下冷冻干燥，即可得到金钗石斛多糖，经测定，粗多糖重量308.8g(提取率为10.3％)，多糖含量为94％；将透过液浓缩后于-50℃、0.1MPa下冷冻干燥，即可得到金钗石斛总碱7.3g(提取率为0.24％)，含量为91％。

实施例3：

本实施例中金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法如下：

1)样品前处理

将1kg粗细均匀、颜色亮黄的金钗石斛茎秆水洗后烘干，粉碎后过60目筛得金钗石斛粉料；

2)酶解

将步骤1)制得的金钗石斛粉料加入4倍质量的水中，再加入金钗石斛粉料质量1％的生物酶，通过柠檬酸调pH值至4.0，45℃下酶解8h；

所述生物酶由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成，其中纤维素酶、果胶酶与蛋白酶的质量比为15:35:50。

3)高压均质提取

向酶解后得到的固液混合物中补加水使得固液混合物中含水质量为金钗石斛粉料质量的20倍，通过柠檬酸调pH值至4.0，搅拌混匀，高压均质提取后离心除渣，收集上清液；

高压均质提取的具体过程为：

将混合物料倒入均质机中，混合物料首先在低压强8MPa条件下循环2次，然后调节阀门压强为60MPa，待压强稳定后，均质2次，均质液离心分离后收集上清液即可；上述高压均质提取过程中高压均质机内部工作温度为4℃。

4)絮凝

将步骤3)所得上清液的pH值调至3.0，加入所述上清液质量0.9％的絮凝剂，搅拌混匀后室温静置25min，离心去沉淀；所述絮凝剂为质量浓度1％的壳聚糖溶液。

5)超滤分离

将步骤4)所得滤液用1000Da分子量的超滤膜进行超滤分离，得到透过液与截留液；将所得截留液浓缩后于-50℃、0.1MPa下冷冻干燥，即可得到金钗石斛多糖，经测定，粗多糖重量102.2g(提取率为10.2％)，多糖含量为94％；将透过液浓缩后于-50℃、0.1MPa下冷冻干燥，即可得到金钗石斛总碱2.3g(提取率为0.23％)，含量为91％。

实施例4：

本实施例中金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法如下：

1)样品前处理

将1kg粗细均匀、颜色亮黄的金钗石斛茎秆水洗后烘干，粉碎后过80目筛得金钗石斛粉料；

2)酶解

将步骤1)制得的金钗石斛粉料加入4倍质量的水中，再加入金钗石斛粉料质量0.5％的生物酶，通过柠檬酸调pH值至4.5，40℃下酶解5h；

所述生物酶由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成，其中纤维素酶、果胶酶与蛋白酶的质量比为20:30:50。

3)高压均质提取

向酶解后得到的固液混合物中补加水使得固液混合物中含水质量为金钗石斛粉料质量的25倍，通过柠檬酸调pH值至2.5，搅拌混匀，高压均质提取后离心除渣，收集上清液；

高压均质提取的具体过程为：

将混合物料倒入均质机中，混合物料首先在低压强5MPa条件下循环2次，然后调节阀门压强为70MPa，待压强稳定后，均质2次，均质液离心分离后收集上清液即可；上述高压均质提取过程中高压均质机内部工作温度为4℃。

4)絮凝

将步骤3)所得上清液的pH值调至3.0，加入所述上清液质量1％的絮凝剂，搅拌混匀后室温静置30min，离心去沉淀；所述絮凝剂为质量浓度1％的壳聚糖溶液。

5)超滤分离

将步骤4)所得滤液用1000Da分子量的超滤膜进行超滤分离，得到透过液与截留液；将所得截留液浓缩后于-50℃、0.1MPa下冷冻干燥，即可得到金钗石斛多糖，经测定，粗多糖重量105.2g(提取率为10.5％)，多糖含量为93％；将透过液浓缩后于-50℃、0.1MPa下冷冻干燥，即可得到金钗石斛总碱2.0g(提取率为0.2％)，含量为92％。

Claims (3)

1.一种金钗石斛多糖和总碱的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1）样品前处理

将粗细均匀、颜色亮黄的金钗石斛茎秆水洗后烘干，粉碎后过60-80目筛得金钗石斛粉料；

2）酶解

将步骤1）制得的金钗石斛粉料加入3-5倍质量的水中，再加入生物酶，通过柠檬酸调pH值至酸性，进行酶解；酶解的时间为3-10 h，酶解温度为35-55 ℃；

所述生物酶由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组成，按质量百分比构成如下：纤维素酶10-20%，果胶酶20-40%，蛋白酶30-50%；所述生物酶的添加量为金钗石斛粉料质量的0.1-1%；

3）高压均质提取

向酶解后得到的固液混合物中补加水使得固液混合物中含水质量为金钗石斛粉料质量的10-30倍，通过柠檬酸调pH值至2.0-5.0，搅拌混匀，高压均质提取后离心除渣，收集上清液；高压均质提取的提取压力为40-80 MPa；

4）絮凝

将步骤3）所得上清液的pH值调至3.0，加入所述上清液质量0.8-1%的絮凝剂，室温下静置20-30 min，离心去沉淀；

5）超滤分离

将步骤4）所得滤液用1000 Da分子量的超滤膜进行超滤分离，得到透过液与截留液；将所得截留液浓缩后冷冻干燥，即可得到金钗石斛多糖；将透过液浓缩后冷冻干燥，即可得到金钗石斛总碱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤2）中通过柠檬酸调pH值至4.0-5.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述絮凝剂为质量浓度1%的壳聚糖溶液。