CN102977220B - 一种植物与微生物多糖的纯物理制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物与微生物天然多糖的纯物理制备方法，具体过程如下：将样品烘干，粉碎，过60-80目筛；然后将所得粉末加水混匀，物料注入高压均质机，经过一定压力均质，离心取上清液；将所得上清液首先通过截留分子量大于植物或微生物活性多糖分子量2-5倍的超滤膜得透过液，透过液再经截留分子量为植物或微生物活性多糖分子量1/5-1/2的超滤膜分离得截留液，截留液浓缩，冷冻干燥，得样品活性多糖。本发明的突出特点是多糖提取率高，耗时短，脱蛋白效果优于传统sevage法，多糖提取过程中不使用任何有机试剂，生产成本降低，无污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物与微生物多糖的制备方法，具体地说是一种提取植物与微生物多糖的纯物理制备方法。
背景技术
多糖是由二十多个单糖到上万个单糖通过糖苷键连接成的一类重要的大分子物质，生物活性多糖主要分为植物多糖、微生物多糖、动物多糖，其作为一种重要的生物体内大分子，与核酸和蛋白质一样与生物体的机能密切相关。越来越多的研究表明多糖具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗氧化、降血糖和调节免疫等功能，因此，多糖具有较好的开发价值和应用价值。而多糖提取工艺一直是研究者关注的重点，针对目前多糖传统提取工艺的缺陷，本发明提供了一种针对植物多糖与微生物多糖的纯物理制备方法，由于发明中涉及超滤膜的选择，且根据生物种类的不同，多糖分子量呈现出较大差异，分子量范围可由几千到几十万，为获得一定分子量范围的活性多糖，孔径较大的超滤膜截留分子量大于植物或微生物活性多糖分子量的2-5倍，孔径较小的超滤膜截留分子量为植物或微生物活性多糖分子量的1/5-1/2。例如本发明选取植物材料：九华山多花黄精（活性多糖分子量8.9KDa）、霍山细茎石斛（活性多糖分子量28KDa），微生物材料：福建古田猴头菇（活性多糖分子量20KDa）、白茯苓（活性多糖分子量10-40KDa）为代表材料，超滤膜分子量范围为3-50KDa。
目前多糖的提取方法主要采用水提醇沉法，而水提醇沉法存在诸多缺点，例如CN101255199A公开了“一种从黄精中提取黄精多糖的方法”，该方法将黄精加热煎煮0.5-1.5小时，提取多次，醇沉12-36小时，得黄精多糖。该工艺提取时间长，高温煎煮对多糖结构造成破坏，醇沉过程只能作为粗略分级，且消耗大量酒精，增加了生产成本，难以达到高效、绿色工业化生产需求。CN101698684A（一种从人参中提取多糖的方法及应用）和CN101613418A（一种提取双胞蘑菇多糖的方法）等所述，都采用sevage法脱蛋白，需用大量有毒试剂氯仿与正丁醇，操作繁琐，多糖损失严重；醇沉与除蛋白后得到的多糖由于有机试剂的残存，更不能直接应用于食品、医药等领域，而且废液排放还造成环境污染。因此，常规水提醇沉法已日益不适于当今工业化生产需求。本发明采用高压均质技术与超滤技术联用提取多糖，两种技术的联用至今未见文献报道。高压均质技术已广泛应用于食品行业的物料细化与乳化，采用高压均质技术对物料进行超微粉碎，使多糖更容易渗透与扩散，提取率升高，均质过程只需5-10分钟，耗时短，高压均质法提取的同时可将与多糖结合的蛋白分离，脱蛋白效果显著。超滤技术兼有分离、浓缩的功能，具有操作简单、无相变、能对特定分子量范围多糖分离等特点。本发明不使用任何有机试剂，两种技术联用为天然活性多糖提取提供了一条高效、简洁、绿色环保的物理制备方法，非常适合工业化生产，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种提取植物与微生物多糖的纯物理方法，所要解决的问题是通过高压均质技术与超滤技术的联用，使多糖提取率升高，耗时缩短，蛋白含量降低，提取过程无污染。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
植物与微生物多糖的纯物理制备方法，包括以下步骤：
（1）将植物或微生物样品前处理，烘干，根据物料软硬程度，用粉碎机粉碎2-4次，每次30-50秒，得样品粉，将样品粉过60-80目筛；
（2）称取步骤（1）所得粉末放于容器中，加入10-30倍水，搅拌混匀；
（3）调节低温循环泵温度，设置上下限温度，保证高压均质机内部工作温度为4~10℃；
（4）将步骤（2）所得混合物料倒入均质机中，物料首先在低压强5-10MPa条件下循环2-4次，然后调节阀门压强为20-100MPa，待压强稳定后，均质1-3次；
（5）将步骤（4）所得均质液离心15-22min，收集上清液，残渣烘干保存；
（6）将步骤（5）得到的上清液进行超滤分离，分为一次超滤和二次超滤，分别设置两次超滤条件；
（7）一次超滤选用截留分子量大于样品活性多糖分子量2-5倍的超滤膜进行分离，保留透过液，去除截留液；
（8）将步骤（7）所得样品透过液进行二次超滤，超滤膜截留分子量为样品活性多糖分子量的1/5-1/2,保留截留液；
（9）将步骤（8）所得截留液浓缩到原体积的1/9-1/10，冷冻干燥即得样品活性多糖；
（10）检测样品多糖蛋白含量与糖含量。
所述的步骤（1）中烘干温度为40~45℃。
所述的步骤（3）中上限温度为0~-7℃，下线温度为-15~-9℃
所述的步骤（3）中离心转速为3000-4500r/min。
所述的步骤（6）中一次超滤条件为压力0.1-0.2MPa，温度25~35℃，二次超滤条件为压力0.05-0.1MPa，温度25~35℃。
所述的步骤（10）中检测蛋白含量采用考马斯亮蓝法，糖含量检测采用苯酚硫酸法。
本发明使用仪器：AH-PILOT高压均质机(加拿大ATS公司)
与现有多糖水提醇沉技术相比，本发明的有益效果：
本发明采用纯物理方法提取天然活性多糖，将高压均质技术与超滤技术联用，广泛适用于植物与微生物多糖的提取，制备工艺简单易行，为天然活性多糖提取提供了一条高效、绿色无污染通道。本方法与水提醇沉法相比具有以下特点：
（1）本发明与传统水提醇沉法相比，显著特点是高效节能，多糖提取率普遍提高8%以上，无需进行长时间高温水提过程与醇沉过夜，大大缩短了多糖提取分离所需时间；
（2）高压均质技术与超滤技术联用提取多糖，无需乙醇、氯仿、正丁醇等任何有机试剂，特别适合对有机试剂敏感的活性多糖物质提取，显著提高产品的质量与安全性，成本低，对环境无任何污染；
（3）本发明获得的多糖纯度高，高压均质在高效提取多糖的同时，可将与多糖结合的蛋白分离，获得的多糖无需进行传统工艺脱蛋白过程，由于避免了高温提取与有机试剂脱蛋白，因此能够很好地保持多糖的生物活性与结构完整性。
（4）本发明两项技术的联用符合现代工业高效、绿色的生产方式，具有广阔的应用前景。
具体实施方式：
实施例1：植物与微生物活性多糖的制备
新鲜黄精40℃烘干，将烘干黄精用粉碎机粉碎3次，每次30秒。将粉碎的黄精过60目筛，称取过筛后的黄精300g放入容器中，加入20倍水，搅拌均匀。
打开低温循环泵，使高压均质机内部工作环境维持在4~10℃，将混合液投入高压均质机中，首先调节压强为5MPa，物料循环3次，然后调节高压均质机压强为80MPa，均质次数为两次，得均质液。在3000r/min条件下,用离心机离心均质液20分钟，收集上清溶液置于容器中，残渣烘干保存。将上清液通过不同孔径的超滤膜分级纯化，进行一次超滤和二次超滤，一次超滤分离压力为0.2MPa，温度为30℃，二次超滤压力为0.1MPa，温度为25℃。首先上清液透过分子量为30KDa的超滤膜，得透过液，然后将透过液用分子量为3KDa的超滤膜再次分离，保留截留液。截留液旋转蒸发至原体积的1/10，采用真空冷冻干燥机冷冻干燥得黄精多糖85.59g。
新鲜食用菌猴头菇40℃烘干，将烘干猴头菇用粉碎机粉碎2次，每次30秒。将粉碎的猴头菇过80目筛，称取过筛后的猴头菇300g放入容器中，加入30倍水，搅拌均匀。打开低温循环泵，使高压均质机内部工作环境维持在4~10℃，将混合液投入高压均质机中，首先调节压强为5MPa，物料循环3次，然后调节高压均质机压强为50MPa，均质次数为两次，得均质液。在3500r/min条件下,用离心机离心均质液20分钟，收集上清溶液置于容器中，残渣烘干保存。将上清液通过不同孔径的超滤膜分级纯化，进行一次超滤和二次超滤，一次超滤分离压力为0.2MPa，温度为30℃，二次超滤压力为0.1MPa，温度为30℃。首先上清液透过分子量为30KDa的超滤膜，得透过液，然后将透过液用分子量为5KDa的超滤膜再次分离，保留截留液。浓缩至原体积的1/10，冷冻干燥得猴头菇多糖53.49g。
将药店购买的真菌白茯苓用粉碎机粉碎3次，每次30秒。将粉碎的白茯苓过60目筛，称取过筛后的白茯苓200g放入容器中，加入10倍水，搅拌均匀。打开低温循环泵，使高压均质机内部工作环境维持在4~10℃，将混合液投入高压均质机中，首先调节压强为10MPa，物料循环4次，然后调节高压均质机压强为50MPa，均质次数为两次，得均质液。在4000r/min条件下,用离心机离心均质液20分钟，收集上清溶液置于容器中，残渣烘干保存。将上清液通过不同孔径的超滤膜分级纯化，进行一次超滤和二次超滤，一次超滤分离压力为0.2MPa，温度为30℃，二次超滤压力为0.1MPa，温度为25℃。首先上清液透过分子量为50KDa的超滤膜，得透过液，然后将透过液用分子量为3KDa的超滤膜再次分离，保留截留液。浓缩至原体积的1/10，冻干燥得白茯苓多糖24.42g。
植物细茎石斛40℃烘干，将烘干石斛用粉碎机粉碎4次，每次30秒。将粉碎的石斛过60目筛，称取过筛后的石斛400g放入容器中，加入30倍水，搅拌均匀。打开低温循环泵，使高压均质机内部工作环境维持在4~10℃，将混合液投入高压均质机中，首先调节压强为10MPa，物料循环4次，然后调节高压均质机压强为70MPa，均质次数为三次，得均质液。在4500r/min条件下,用离心机离心均质液20分钟，收集上清溶液置于容器中，残渣烘干保存。将上清液通过不同孔径的超滤膜分级纯化，进行一次超滤和二次超滤，一次超滤分离压力为0.2MPa，温度为30℃，二次超滤压力为0.1MPa，温度为30℃。首先上清液透过分子量为30KDa的超滤膜，得透过液，然后将透过液用分子量为3KDa的超滤膜再次分离，保留截留液。截留液旋转蒸发至原体积的1/10，冻干燥得石斛多糖83.16g。
实施例2：植物与微生物多糖蛋白含量检测
考马斯亮蓝G-250溶液的配制：100mg考马斯亮蓝G-250溶于95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，少量去离子水溶解，然后用去离子水稀释至1000ml定容，滤纸过滤。
标准蛋白溶液的配制：精确称取小牛血清白蛋白10.00mg加水溶解，定容至100ml容量瓶中，摇匀，得标准蛋白溶液，浓度为100μg/ml。
标准曲线的绘制：精确移取标准蛋白溶液0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml于9支试管中，加去离子水补至1ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀放置2分钟，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值，以去离子水同法操作为空白，以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的μg数量为横坐标EXCEL绘制标准曲线，得回归方程。
样品溶液的蛋白含量测定：精确配制样品溶液10.00mg/ml，按标准溶液测定方法，测得样品溶液吸光度，由回归方程得样品溶液蛋白含量。黄精、猴头菇、白茯苓、石斛多糖中含蛋白含量分别为0.87%、0.96%、0.91%、1.13%。
实施例3：苯酚硫酸法检测样品糖含量
苯酚溶液的配制：用移液管精确移取6.00ml重蒸酚溶液与100ml容量瓶中，去离子水定容，得6%苯酚使用液。
标准溶液的配制：精确称取烘干至恒重的葡萄糖10.00mg加水溶解，定容于100ml容量瓶中，摇匀，得标准使用液100μg/ml。
标准曲线的绘制：精确移取标准葡萄糖溶液0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml于9支试管中，加去离子水补至1ml，加入6%苯酚溶液1ml，混匀，然后加入5ml浓硫酸，混匀，放置20min以蒸馏水做空白，用紫外-可见光分光光度计在490nm测定吸光度，以A490吸光值为横坐标，葡萄糖的μg数量为纵坐标输入EXCEL绘制标准曲线，并得回归方程。
样品糖含量测定：精确配制样品溶液100μg/ml，按标准曲线绘制方法测吸光度，根据回归方程得样品糖含量。黄精、猴头菇、白茯苓、石斛多糖样品中多糖含量分别为78.73%、77.32%、78.23%、76.64%。
Claims (4)
1.一种植物与微生物多糖的纯物理制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）所选植物与微生物为黄精、石斛、猴头菇或白茯苓；
（2）将所选植物与微生物样品前处理，烘干，根据物料软硬程度，用粉碎机粉碎2-4次，每次30-50秒，得样品粉末，将样品粉末过60-80目筛；
（3）称取步骤（2）所得粉末放于容器中，加入10-30倍水，搅拌混匀；
（4）调节低温循环泵温度，设置上下限温度，保证高压均质机内部工作温度为4-10℃；将步骤（3）所得混合物料倒入均质机中，物料首先在低压强5-10MPa条件下循环2-4次，然后调节阀门压强为20-100MPa，待压强稳定后，均质1-3次；
（5）将步骤（4）所得均质液离心18-22min，收集上清液，残渣烘干保存；
（6）将步骤（5）得到的上清液进行超滤分离，分为一次超滤和二次超滤，一次超滤选用截留分子量大于样品活性多糖分子量2-5倍的超滤膜进行分离，保留透过液，去除截留液；二次超滤，超滤膜截留分子量为样品活性多糖分子量的1/5-1/2，保留截留液；
（7）将步骤（6）所得截留液浓缩到原体积的1/9-1/10，真空冷冻干燥即得样品活性多糖；
（8）检测样品多糖的蛋白含量与糖含量；
所述的步骤（2）中烘干温度为40~45℃；
所述的步骤（4）中上限温度为-7~0℃，下限温度为-15~-9℃。
2.根据权利要求1所述的一种植物与微生物多糖的纯物理制备方法，其特征在于：所述的步骤（5）中离心转速为3000-4500r/min。
3.根据权利要求1所述的一种植物与微生物多糖的纯物理制备方法，其特征在于：所述的步骤（6）中一次超滤条件为压力0.1-0.2MPa，温度25~35℃，二次超滤条件为压力0.05-0.1MPa，温度25~35℃。
4.根据权利要求1所述的一种植物与微生物多糖的纯物理制备方法，其特征在于：所述的步骤（8）中蛋白含量检测采用考马斯亮蓝法，糖含量检测采用苯酚-硫酸法。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Effective date of registration: 20180109 Address after: No. 112, Anhui University Science Park Innovation Building, No. 2, Tianda Road, Hefei high tech Zone, Anhui Province Patentee after: ANHUI YUCUI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 230039 Hefei West Road, Anhui, No. 3 Patentee before: Anhui University |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220510 Address after: 230000 No. 188, Jiulong Road, Taohua Town, Feixi County, Hefei City, Anhui Province Patentee after: Anhui bensentang Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 230088 No. 112, innovation building, Anhui University Science Park, No. 2, Tianda Road, high tech Zone, Hefei, Anhui Province Patentee before: ANHUI YUCUI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151209 Termination date: 20211120 |
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