CN112778432B - 波棱瓜子多糖提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种波棱瓜子多糖提取方法，包括以下步骤：步骤一、取波棱瓜子洗净、干燥、粉碎，加入石油醚水浴回流，离心取固相物，干燥到得固体Ⅰ；步骤二、置于超声袋内，再悬挂于超声容器内，向超声袋内加入蒸馏水，向超声容器内加入超声液Ⅰ，然后器置于超声波下处理，取液相物得合并液；步骤三、取出残渣置于‑1℃和1℃交替循环处理5～8次，再置于超声容器内，加入极性剂Ⅱ和蒸馏水，超声处理,过滤得过滤液；合并合并液和过滤液，浓缩得浓缩液；步骤四、加入Sevag试剂，震荡、离心，收集上层清液；步骤五、加入无水乙醇，静置，抽滤得沉淀，干燥得波棱瓜子多糖。本发明具有显著提升波棱瓜子多糖提取率和纯度的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及波棱瓜子深加工技术领域。更具体地说，本发明涉及一种波棱瓜子多糖提取方法。
背景技术
波棱瓜子是藏药中治疗肝病的首选药物之一，在治疗肝病的过程中得到了广泛的应用。现代药理研究亦表明波棱瓜子多糖对肝病有显著疗效，并且疗效与波棱瓜子多糖的纯度存在一定的关联性，但是要得到高纯度的波棱瓜子多糖需要采用柱层析的方法，提取方法复杂，提取效率低，而且对于普通的肝病也不需要分析纯的纯度要求。而采用回流法和超声法提取的波棱瓜子多糖的纯度在75％以下，会显著影响疗效。因此，研究一种能提高波棱瓜子多糖纯度，以满足疗效并且能够简化提取工艺的方法是极有意义的。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种波棱瓜子多糖提取方法，提取工艺简单，而且可以显著提升波棱瓜子多糖的提取率和纯度。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种波棱瓜子多糖提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取波棱瓜子洗净、干燥、粉碎，加入波棱瓜子质量8～10倍的石油醚，于70～80℃下水浴回流4～5h，离心取固相物，并干燥到得固体Ⅰ；
步骤二、将步骤一中的固体Ⅰ置于超声袋内，将超声袋悬挂于超声容器内，向超声袋内加入蒸馏水，向超声容器内加入超声液Ⅰ，然后将带有固体Ⅰ和超声袋的超声容器置于超声波下处理1～5h，然后提起超声袋，使液相物质全部流入超声容器内，得合并液，其中，超声袋由中空纤维膜制成，超声液Ⅰ包括极性剂Ⅰ和蒸馏水按质量体积比1mg:10～20mL制得，极性剂Ⅰ的分子量大于中空纤维膜的截留分子量；
步骤三、取出步骤二中的超声袋内的残渣置于-1℃下10～20min和1℃下10～20min交替循环5～8次，再置于超声容器内，向超声容器内加入极性剂Ⅱ和蒸馏水，超声处理1～2h,然后过滤得过滤液；
合并合并液和过滤液，并浓缩得浓缩液；
步骤四、向浓缩液中加入Sevag试剂，浓缩液与Sevag试剂的体积比为1:1～8，震荡、离心，收集上层清液；
步骤五、向步骤四中的上层清液中加入无水乙醇，静置12h以上，抽滤得沉淀，干燥即得波棱瓜子多糖。
优选的是，中空纤维膜的截留分子量为8万，极性剂Ⅰ为肌球蛋白或磷酸化酶B。
优选的是，极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白或卵清蛋白。
优选的是，极性剂Ⅱ与蒸馏水的质量体积比为1mg:20～50mL。
优选的是，步骤二中超声袋内加入的蒸馏水与超声容器内的超声液Ⅰ的体积比为1:5～10。
优选的是，步骤三中蒸馏水的质量大于步骤二中的超声袋内的残渣质量的10倍。
优选的是，Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇按体积比为4:1混合制得。
优选的是，步骤二中的超声频率为40KHz，极性剂Ⅰ为肌球蛋白，步骤三中的超声频率为80KHz，极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、提取工艺简单，而且可以显著提升波棱瓜子多糖的提取率和纯度。
第二、极性剂Ⅰ为肌球蛋白，对应的超声频率为40KHz，极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白，对应的超声频率为80KHz，多糖提取率为2.18％，纯度高达82.9％。通过上述试验组也可以知道，极性剂Ⅰ的分子量大小与超声频率存在协同配合作用，分析可能由于波棱瓜子多糖多为极性多糖，极性多糖和同样具有极性的肌球蛋白(分子量为212000)分别位于超声袋两侧，在40KHz超声频率作用下，有可能是触发了类似共振效应的现象发生，从而易使多糖从波棱瓜子内溶出，并穿过截留分子量大于波棱瓜子多糖的超声袋，并且，由于具有极性的肌球蛋白的存在，可以加快波棱瓜子多糖的溶出，从而一方面提高了多糖的溶出量，另一方面又减少了其它杂质的溶出量。
第三、由试验7、11、15的试验数据也可以看出，在二次超声处理中，超声频率80KHz和极性剂Ⅱ牛血清清蛋白(分子量为66200)也发生了显著的相互作用，二者结合同样显著影响了波棱瓜子多糖的提取率和纯度。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
波棱瓜子多糖提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取10g波棱瓜子洗净、干燥、粉碎至20目以下，加入波棱瓜子质量8倍的石油醚，于70℃下水浴回流4h，离心取固相物，并干燥到得固体Ⅰ；
步骤二、将步骤一中的固体Ⅰ置于超声袋内，将超声袋悬挂于超声容器内，向超声袋内加入100ml蒸馏水，向超声容器内加入500ml超声液Ⅰ，然后将带有固体Ⅰ和超声袋的超声容器置于超声频率为40KHz下超声处理1h，然后提起超声袋，使液相物质全部流入超声容器内，得合并液，其中，超声袋由中空纤维膜制成，中空纤维膜的截留分子量为8万，超声液Ⅰ包括极性剂Ⅰ和蒸馏水按质量体积比1mg:10mL制得，极性剂Ⅰ为肌球蛋白，其分子量为212000，极性剂Ⅰ的分子量大于中空纤维膜的截留分子量；
步骤三、取出步骤二中的超声袋内的残渣置于-1℃下10min和1℃下10min交替循环5次，再置于超声容器内，向超声容器内加入10mg极性剂Ⅱ和200ml蒸馏水，于超声频率为80KHz下超声处理1h，然后过滤得过滤液,极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白，其分子量为66200；
合并合并液和过滤液，并浓缩至100ml得浓缩液；
步骤四、向浓缩液中加入Sevag试剂，浓缩液与Sevag试剂的体积比为1:1，剧烈震荡，于5000r/min的转速下离心20min，收集上层清液，Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇按体积比为4:1混合制得；
步骤五、向步骤四中的上层清液中加入无水乙醇，静置12h，抽滤得沉淀，干燥即得波棱瓜子多糖。
<实施例2>
波棱瓜子多糖提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取10g波棱瓜子洗净、干燥、粉碎至20目以下，加入波棱瓜子质量10倍的石油醚，于80℃下水浴回流5h，离心取固相物，并干燥到得固体Ⅰ；
步骤二、将步骤一中的固体Ⅰ置于超声袋内，将超声袋悬挂于超声容器内，向超声袋内加入100ml蒸馏水，向超声容器内加入1000ml超声液Ⅰ，然后将带有固体Ⅰ和超声袋的超声容器置于超声频率为40KHz下超声处理5h，然后提起超声袋，使液相物质全部流入超声容器内，得合并液，其中，超声袋由中空纤维膜制成，中空纤维膜的截留分子量为8万，超声液Ⅰ包括极性剂Ⅰ和蒸馏水按质量体积比1mg:20mL制得，极性剂Ⅰ为肌球蛋白，其分子量为212000，极性剂Ⅰ的分子量大于中空纤维膜的截留分子量；
步骤三、取出步骤二中的超声袋内的残渣置于-1℃下20min和1℃下20min交替循环8次，再置于超声容器内，向超声容器内加入10mg极性剂Ⅱ和500ml蒸馏水，于超声频率为80KHz下超声处理2h，然后过滤得过滤液,极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白，其分子量为66200；
合并合并液和过滤液，并浓缩至100ml得浓缩液；
步骤四、向浓缩液中加入Sevag试剂，浓缩液与Sevag试剂的体积比为1:8，剧烈震荡，于5000r/min的转速下离心20min，收集上层清液，Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇按体积比为4:1混合制得；
步骤五、向步骤四中的上层清液中加入无水乙醇，静置24h，抽滤得沉淀，干燥即得波棱瓜子多糖。
<实施例3>
波棱瓜子多糖提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取10g波棱瓜子洗净、干燥、粉碎至20目以下，加入波棱瓜子质量9倍的石油醚，于75℃下水浴回流4.5h，离心取固相物，并干燥到得固体Ⅰ；
步骤二、将步骤一中的固体Ⅰ置于超声袋内，将超声袋悬挂于超声容器内，向超声袋内加入100ml蒸馏水，向超声容器内加入800ml超声液Ⅰ，然后将带有固体Ⅰ和超声袋的超声容器置于超声频率为40KHz下超声处理3.5h，然后提起超声袋，使液相物质全部流入超声容器内，得合并液，其中，超声袋由中空纤维膜制成，中空纤维膜的截留分子量为8万，超声液Ⅰ包括极性剂Ⅰ和蒸馏水按质量体积比1mg:15m L制得，极性剂Ⅰ为肌球蛋白，其分子量为212000，极性剂Ⅰ的分子量大于中空纤维膜的截留分子量；
步骤三、取出步骤二中的超声袋内的残渣置于-1℃下15min和1℃下15min交替循环6次，再置于超声容器内，向超声容器内加入10mg极性剂Ⅱ和300ml蒸馏水，于超声频率为80KHz下超声处理1.5h，然后过滤得过滤液,极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白，其分子量为66200；
合并合并液和过滤液，并浓缩至100ml得浓缩液；
步骤四、向浓缩液中加入Sevag试剂，浓缩液与Sevag试剂的体积比为1:5，剧烈震荡，于5000r/min的转速下离心20min，收集上层清液，Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇按体积比为4:1混合制得；
步骤五、向步骤四中的上层清液中加入无水乙醇，静置18h，抽滤得沉淀，干燥即得波棱瓜子多糖。
<对比例1>
采用回流法提取波棱瓜子多糖，包括以下步骤：
步骤一、取10g波棱瓜子洗净、干燥、粉碎至20目以下，加入波棱瓜子质量9倍的石油醚，于75℃下水浴回流4.5h，离心取固相物，并干燥到得固体Ⅰ；
步骤二、将步骤一中的固体Ⅰ加入1200mL蒸馏水，100℃水浴加热回流6h，冷却至常温，收集提取液，于5000r/min的转速下离心20min，收集上层清液，取上层清液，过滤得滤液，并浓缩至100mL得浓缩液；
步骤三、向浓缩液中加入Sevag试剂，浓缩液与Sevag试剂的体积比为1:5，剧烈震荡，于5000r/min的转速下离心20min，收集上层清液，Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇按体积比为4:1混合制得；
步骤四、向步骤三中的上层清液中加入无水乙醇，静置18h，抽滤得沉淀，干燥即得波棱瓜子多糖。
<对比例2>
采用超声法提取波棱瓜子多糖，包括以下步骤：
步骤一、取10g波棱瓜子洗净、干燥、粉碎至20目以下，加入波棱瓜子质量9倍的石油醚，于75℃下水浴回流4.5h，离心取固相物，并干燥到得固体Ⅰ；
步骤二、将步骤一中的固体Ⅰ加入1200mL蒸馏水，于超声频率为40KHz下超声处理3.5h，于80KHz下超声处理1.5h，收集提取液，于5000r/min的转速下离心20min，收集上层清液，取上层清液，过滤得滤液，并浓缩至100mL得浓缩液；
步骤三、向浓缩液中加入Sevag试剂，浓缩液与Sevag试剂的体积比为1:5，剧烈震荡，于5000r/min的转速下离心20min，收集上层清液，Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇按体积比为4:1混合制得；
步骤四、向步骤三中的上层清液中加入无水乙醇，静置18h，抽滤得沉淀，干燥即得波棱瓜子多糖。
<对比例3>
波棱瓜子多糖提取方法同实施例3，其中不同的是：步骤二中未加入极性剂Ⅰ。
<对比例4>
波棱瓜子多糖提取方法同实施例3，其中不同的是：步骤三中未加入极性剂Ⅱ。
<波棱瓜子多糖检测结果>
检测和计算实施例1～3和对比例1～4的方法提取的波棱瓜子多糖的提取率和纯度，结果如表1所示：
表1波棱瓜子多糖的提取率和纯度
| 组别 | 提取率％ | 纯度％ |
| 实施例1 | 2.08 | 79.0 |
| 实施例2 | 2.15 | 80.8 |
| 实施例3 | 2.23 | 81.5 |
| 对比例1 | 1.88 | 73.6 |
| 对比例2 | 1.91 | 74.5 |
| 对比例3 | 2.02 | 76.7 |
| 对比例4 | 1.93 | 78.3 |
由表1可知，实施例1～3的方法提取的波棱瓜子多糖不但提取率高，而且纯度也显著高于回流法和纯超声法。
由对比例3和对比例4的数据可以看出，第一步超声处理方法可以显著提高波棱瓜子多糖的纯度，第二步超声处理方法可以显著提升波棱瓜子多糖的提取率。
<单因素试验>
以超声频率(40KHz、60KHz、80KHz、100KHz、)、极性剂Ⅰ(肌球蛋白(分子量为212000)、磷酸化酶B(分子量为97000))、极性剂Ⅱ(牛血清清蛋白(分子量为66200)、卵清蛋白(分子量为44500))三个单因素进行考察，超声频率Ⅰ为步骤二的起声频率，超声频率Ⅱ为步骤三的超声频率，根据正交表安排试验，如表2所示：
表2单因素试验表
正交试验表与结果如表3所示：
表3正交试验表与多糖提取结果
由表3可知，多糖提取率和纯度最佳的工艺条件为1131，即极性剂Ⅰ为肌球蛋白，对应的超声频率为40KHz，极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白，对应的超声频率为80KHz，多糖提取率为2.18％，纯度高达82.9％。通过上述试验组也可以知道，极性剂Ⅰ的分子量大小与超声频率存在协同配合作用，分析可能由于波棱瓜子多糖多为极性多糖，极性多糖和同样具有极性的肌球蛋白(分子量为212000)分别位于超声袋两侧，在40KHz超声频率作用下，有可能是触发了类似共振效应的现象发生，从而易使多糖从波棱瓜子内溶出，并穿过截留分子量大于波棱瓜子多糖的超声袋，并且，由于具有极性的肌球蛋白的存在，可以加快波棱瓜子多糖的溶出，从而一方面提高了多糖的溶出量，另一方面又减少了其它杂质的溶出量。
同样，由试验7、11、15的试验数据也可以看出，在二次超声处理中，超声频率80KHz和极性剂Ⅱ牛血清清蛋白(分子量为66200)也发生了显著的相互作用，二者结合同样显著影响了波棱瓜子多糖的提取率和纯度。
<波棱瓜子多糖含量检测方法>
多糖含量的检测方法参照硫酸-苯酚法，以葡萄糖为标准品检测波棱瓜子多糖含量，计算波棱瓜子多糖纯度。
蒸馏水的密度按1g/mL计。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (6)
1.波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取波棱瓜子洗净、干燥、粉碎，加入波棱瓜子质量8～10倍的石油醚，于70～80℃下水浴回流4～5h，离心取固相物，并干燥到得固体Ⅰ；
步骤二、将步骤一中的固体Ⅰ置于超声袋内，将超声袋悬挂于超声容器内，向超声袋内加入蒸馏水，向超声容器内加入超声液Ⅰ，然后将带有固体Ⅰ和超声袋的超声容器置于超声波下处理1～5h，然后提起超声袋，使液相物质全部流入超声容器内，得合并液，其中，超声袋由中空纤维膜制成，超声液Ⅰ包括极性剂Ⅰ和蒸馏水按质量体积比1mg:10～20mL制得，极性剂Ⅰ的分子量大于中空纤维膜的截留分子量；
步骤三、取出步骤二中的超声袋内的残渣置于-1℃下10～20min和1℃下10～20min交替循环5～8次，再置于超声容器内，向超声容器内加入极性剂Ⅱ和蒸馏水，超声处理1～2h,然后过滤得过滤液；
合并合并液和过滤液，并浓缩得浓缩液；
步骤四、向浓缩液中加入Sevag试剂，浓缩液与Sevag试剂的体积比为1:1～8，震荡、离心，收集上层清液；
步骤五、向步骤四中的上层清液中加入无水乙醇，静置12h以上，抽滤得沉淀，干燥即得波棱瓜子多糖；
中空纤维膜的截留分子量为8万，极性剂Ⅰ为肌球蛋白或磷酸化酶B；
极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白或卵清蛋白。
2.如权利要求1所述的波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于，极性剂Ⅱ与蒸馏水的质量体积比为1mg:20～50mL。
3.如权利要求1所述的波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于，步骤二中超声袋内加入的蒸馏水与超声容器内的超声液Ⅰ的体积比为1:5～10。
4.如权利要求1所述的波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于，步骤三中蒸馏水的质量大于步骤二中的超声袋内的残渣质量的10倍。
5.如权利要求1所述的波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于，Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇按体积比为4:1混合制得。
6.如权利要求1所述的波棱瓜子多糖提取方法，其特征在于，步骤二中的超声频率为40KHz，极性剂Ⅰ为肌球蛋白，步骤三中的超声频率为80KHz，极性剂Ⅱ为牛血清清蛋白。
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